ES2234017T3

ES2234017T3 - Composiciones farmaceuticas que contienen polimero de polieter alcohol alquilarilico.

Info

Publication number: ES2234017T3
Application number: ES97922426T
Authority: ES
Inventors: Thomas P. Kennedy
Original assignee: Charlotte Mecklenburg Hospital
Current assignee: Charlotte Mecklenburg Hospital
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-23
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2017-04-23
Also published as: EP0910390A1; AU2809697A; EP0910390B1; CA2251656C; ATE285782T1; JP2001504438A; DE69732109D1; DE69732109T2; US5849263A; US6165445A; CA2251656A1; WO1997039758A1

Abstract

SE SUMINISTRAN NUEVAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN TILOXAPOL COMO INGREDIENTE ACTIVO. ESTAS FORMULACIONES COMPRENDEN TILOXAPOL EN UNA CONCENTRACION POR ENCIMA DEL 0,125%, PREFERIBLEMENTE ENTRE EL 0,25% Y EL 5,0%. ADEMAS, LA INVENCION COMPRENDE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE TIENEN UNA HIPERTONICIDAD REDUCIDA, LAS COMPOSICIONES COMPRENDEN TILOXAPOL EN SOLUCIONES FARMACOLOGICAMENTE ACEPTABLES SIN CONCENTRACIONES SIGNIFICATIVAS DE AGENTES HIPERTONICOS U OTROS INGREDIENTES ACTIVOS DE NAHCO 3 , O FOSFOLIPIDOS ACTIVOS, TALES COMO DPPC. LAS FORMULACIONES MENOS HIPERTONICAS PERMITEN QUE SE OBTENGAN TODAS LAS VENTAJAS DEL TILOXAPOL COMO INGREDIENTE ACTIVO TAL COMO SU TOXICIDAD REDUCIDA Y SU VIDA MEDIA MEJORADA, MIENTRAS QUE SE EVITAN O SE REDUCEN AGENTES COLATERALES, TALES COMO BRONCOESPAMOS, ASOCIADOS CON LOS DIFERENTES AGENTES HIPERTONICOS U OTROS AGENTES UTILIZADOS COMO INGREDIENTES ACTIVOS.

Description

Composiciones farmacéuticas que contienen polímero de poliéter alcohol alquilarílico.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen un polímero de poliéter alcohol alquilarílico. De manera más específica, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen el polímero tyloxapol de poliéter alcohol alquilarílico para el tratamiento de la inflamación respiratoria.

Técnica anterior Exposición de la lesión mediada por el oxidante

El oxígeno da vida a las plantas aeróbicas y a los animales que dependen de él para el metabolismo de la energía. También puede resultar letal para esos mismos organismos cuando es alterado desde su estado de dioxígeno (O_{2}) estable en cualquiera de las tres especies reducidas parcialmente: a) la forma anión superoxido reducida con un electrón (O_{2}^{-}); b) la forma peróxido de hidrógeno reducida con dos electrones (H_{2}O_{2}); o la forma reducida radical hidroxilo (^{\bullet}OH) mortal con tres electrones. En los sistemas biológicos O y H_{2}O_{2} son subproductos metabólicos de un huésped de enzimas (oxigenasas) que utilizan oxígeno como cofactor. H_{2}O_{2} se produce también a partir de O_{2}^{-} mediante la acción enzimática de las superóxido dismutasas.

Sin embargo, ^{\bullet}OH se produce en general únicamente cuando O_{2}^{-} y H_{2}O_{2} interactúan con iones de transición de metales tales como hierro y cobre en reacciones redox cíclicas peligrosas:

Fe^{3+} + \ ^{\bullet}O_{2}{}^{-}

\hskip0.5cm

\rightarrow

\hskip0.5cm

Fe^{2+}+O_{2}

Fe^{2+}+H_{2}O_{2}

\hskip0.5cm

\rightarrow

\hskip0.5cm

Fe^{3+} + \ ^{\bullet}OH + -OH

Las reacciones anteriores se denominan reacción de Fenton conducida por superóxido frecuente en los sistemas biológicos. La reacción de Fenton puede ser iniciada también por otras sustancias reductoras tales como ascorbato en presencia de ión férrico y H_{2}O_{2}.

Mientras que ^{\bullet}O_{2}^{-} y H_{2}O_{2} son tóxicos para los sistemas biológicos, ^{\bullet}OH (y su forma hipotética alternativa el producto intermedio ferrilo FeO^{2+}) es una especie muy reactiva que puede oxidar lípidos insaturados de la membrana, dañar proteínas celulares y producir roturas de la cadena mutágena en el ADN. Para prevenir la lesión por la especie O_{2} parcialmente reducida en condiciones normales, las células han desarrollado un sistema elaborado de enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa) y moléculas antioxidantes (glutatión, alfa-tocoferol, beta-caroteno). Sin embargo, cuando la producción de la especie O_{2} parcialmente reducida supera la capacidad de las defensas celulares antioxidantes para contenerlas, tiene lugar la lesión por el oxidante.

En la actualidad, se cree que un número creciente de entidades de la enfermedad en mamíferos está relacionado con la superproducción de la especie O_{2} parcialmente reducida, incluyendo el infarto de miocardio con síndromes de lesión por reperfusión y la embolia cerebral, el síndrome disneico agudo del adulto, la toxicidad por oxígeno del pulmón, la lesión pulmonar por asbestos, la enfermedad de Parkinson, las quemaduras térmicas y solares de la piel y la lesión del aparato digestivo por agentes no esteroideos antiinflamatorios (véase Tabla IV, página 60, Halliwell B. y Gutteridge JMC, Methods in Enzymology (1990) 186:1-85). El tratamiento de estas enfermedades está dirigido cada vez más hacia estrategias que impiden la producción enzimática de la especie O_{2} parcialmente reducida y a la introducción de compuestos antioxidantes exógenos que reestablecen el equilibrio oxidante-antioxidante en los sistemas biológico y químico. Más recientemente, como se indica a continuación, el tratamiento de la inflamación en muchas de estas enfermedades ha estado dirigido hacia la activación de la interrupción de los factores de transcripción que median la expresión genética de las citocinas pro-inflamatorias importantes en la patogénesis de estas enfermedades.

Exposición de factores de transcripción y citocinas

Los factores de transcripción son proteínas celulares que se fijan a las secuencias reguladoras de los genes y aumentan o disminuyen la velocidad de transcripción del gen. Al afectar la velocidad de transcripción del gen, los factores de transición desempeñan una función crítica en la regulación de la función celular durante la salud y la enfermedad. Entre los factores de transcripción más importantes en la enfermedad están los que regulan la expresión de los genes para las citocinas proinflamatorias. Estas citocinas son proteínas celulares segregadas que afectan drásticamente el comportamiento de otras células. Como ejemplos, la citocina TNF-\alpha produce pérdida de peso en pacientes con tumores o infecciones crónicas, produce la muerte celular y se cree que es un mediador importante del choque séptico. La citocina IL-1\beta media en la fiebre y comparte muchas de las propiedades de TNF. La citocina IL-8 (y sus parientes próximos tal como RANTES) es una señal quimiotáctica potente que ayuda en la regeneración de las células inflamatorias tales como los neutrófilos. GM-CSF señaliza la médula ósea al producir más células inflamatorias, activa estas células una vez producidas y alarga su supervivencia. Estas citocinas desempeñan funciones importantes en la mediación de la patogénesis de dichas enfermedades inflamatorias como la fibrosis quística, la bronquitis crónica, el asma y las infecciones víricas, entre muchas otras (T.L. Bonfield, et al. "Inflammatory cytokines in cystic fibrosis lungs". American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine (1996) en imprenta; N.G. McElvaney, et al.
"Modulation of airway inflammation in cystic fibrosis. In vivo suppression of interleukin-8 levels on the respiratory epithelial surface by aerosolization of recombinant secretory leukoprotease inhibitor". Journal of Clinical Investigation
(1992) 90:1296-1301; K.D. Pfeffer, et al. "Expression and regulation of tumor necrosis factor in macrophages from cystic fibrosis patients". American Journal of Respiratory, Cell and Molecular Biology (1993) 9:511-519; G. Williams y B.P. Giroir. "Regulation of cytokine gene expression: Tumor necrosis factor, interleukin-1, and the emerging biology of cytokine receptors". New Horizons (1995) 3:276-287; C.A. Dinarello. "Role of interleukin-1 and tumor necrosis factor in systemic responses to infection and inflammation". En Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates,
segunda edición. J.I. Gallin, I.M. Goldstein y R. Snyderman, editores Raven Press, Ltd., Nueva York (1992) pág. 211-232; W.C. Greene. "The interleukins". En Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, segunda edición. J.I. Gallin, I.M. Goldstein y R. Snyderman, editores, Raven Press, Ltd., Nueva York (1992) pág. 233-245; M. Baggiolini, et al., "Interleukin-8 and related chemotactic cytokines". En Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, segunda edición. J.I: Gallin, I.M. Goldstein y R. Snyderman, editores Raven Press, Ltd., Nueva York (1992) pág. 247-263; D.W. Golde y G.C. Baldwin. "Myeloid growth factors". En Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, segunda edición. J.I. Gallin, I.M. Goldstein y R. Snyderman, editores, Raven Press, Ltd., Nueva York (1992) pág. 291-301; R.J. Horwitz y W.W. Busse. "Inflammation and asthma". Clinics in Chest Medicine (1995) 16:583-602).

Estas citocinas comparten la regulación de su expresión por el factor nuclear kappa-B (NF-\kappaB) del factor de transcripción, un factor de transcripción particularmente importante que media los sucesos inflamatorios (U.
Siebenlist, G. Granzuso y R. Brown. "Structure, regulation and function of NF-\kappaB". Annual Review of Cell Biology (1994) 10:405-455). NF-\kappaB es también un importante regulador de transcripción de quimiocinas tales como RANTES (U. Siebenlist, G. Granzuso y R. Brown. "Structure, regulation and function of NF-\kappaB". Annual Review of Cell Biology (1994) 10:405-455) y de la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) (P.J. Nelson, et al. "Genomic organisation and transcriptional regulation of the RANTES chemokine gene". Journal of Immunology (1993) 151:2601-2612), la enzima que produce óxido nítrico (NO\cdot), un producto químico oxidante crítico producido como parte de la patogénesis del choque séptico. NF-\kappaB está presente en el citoplasma en una forma inactiva acomplejada con una proteína inhibidora I\kappaB. Un número de sucesos, que todavía deben ser caracterizados completamente, dan lugar a que I\kappaB se disocie en NF-\kappaB en el citoplasma. NF-\kappaB libre se localiza a continuación en el núcleo, donde se une a un punto de reconocimiento \kappaB específico en la zona activadora de los genes diana, acelerando su expresión. NF-\kappaB es activada por numerosos estímulos, incluyendo las propias citocinas, y por el lipopolisacárido (LPS) (U. Siebenlist, G. Granzuso y R. Brown. "Structure, regulation and function of NF-\kappaB". Annual Review of Cell Biology (1994) 10:405-455). NF-\kappaB es también activada por oxidantes tal como el peróxido de hidrógeno (M. Meyer, R. Schreck y P.A. Baeverie. "H_{2}O_{2} and antioxidants have opposite effects on the activation of NF-\kappaB and AP-1 in intact cells: AP-1 as secondary antioxidant response factor". EMBO Journal (1993) 12:2005-2015), lo que sugiere que puede ser un factor de transcripción sensible a la agresión por el oxidante. En cambio, algunos de los inhibidores más potentes de la activación de NF-\kappaB son compuestos que pueden actuar también como antioxidantes. Unos pocos antioxidantes, pero no la mayoría, impiden la activación de NF-\kappaB por LPS, impiden que aumente en los correspondientes ARN mensajeros para las citocinas inflamatorias y disminuye las concentraciones de TNF y de IL-1 en la circulación tras la inyección de LPS (E.M. Eugui, et al. "Some antioxidants inhibit, in a coordinate fashion, the production of tumor necrosis factor á, IL-1\beta and IL-6 by human peripheral blood mononuclear cells". International Journal of Immunology (1993) 6:409-422; R. Schreck, et al. "Dithiocarbamates as potent inhibitors of nuclear factor \kappaB activation in intact cells". Journal of Experimental Medicine (1992) 175:1181-1194). Sin embargo, los pocos antioxidantes conocidos que inhiben la activación de NF-\kappaB comparten la similitud estructural no frecuente distinguiéndolos de los antioxidantes que no pueden impedir la activación de NF-\kappaB (véase Eugui, anteriormente), impidiendo que un experto en la materia prediga qué compuestos antioxidantes reducirán favorablemente y cuáles no la activación de NF-\kappaB como estrategia de mejora de los sucesos inflamatorios en la enfermedad.

Otra clase de compuestos conocidos que inhiben la activación de NF-\kappaB son los corticosteroides antiinflamatorios. Los corticosteroides actúan por combinación en el citoplasma con una proteína intracelular denominada receptor glucocorticoide (GR). Anteriormente, la acción antiinflamatoria de los corticosteroides se creía que tenía lugar exclusivamente como resultado del paso del complejo GR-esteroide al núcleo, en el que el complejo se une e influye en las zonas reguladoras del gen denominadas elementos glucocorticoides sensibles (GRE). Sin embargo, hace poco se ha demostrado que un mecanismo principal de actividad antiinflamatoria glucocorticoide es la inhibición de NF-\kappaB (I.M. Adcock, et al. "Effects of glucocorticoids on transcription factor activation in human peripheral blood mononuclear cells". American Journal of Physiology (1995) 268 (Cell Physiology 37):C331-C338). El complejo GR-esteroide impide la activación de NF-\kappaB interactuando directamente con NF-\kappaB libre en el citoplasma, impidiendo que NF-\kappaB se traslade al núcleo (A. Ray y K.E. Prefontaine. "Physical association and functional antagonism between the p65 subunit of transcription factor NF-\kappaB and the glucocorticoid receptor". Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (1994) 91:752-756). Sin embargo, el complejo GR-esteroide lleva a cabo la inhibición de NF-\kappaB mediante represión mutua. Al combinarse con NF-\kappaB libre en el citoplasma, impide también que se transponga en el núcleo para regular por incremento otros sucesos antiinflamatorios. De hecho, se cree que la represión mutua que explica en parte el fenómeno de la resistencia esteroide en asmáticos graves. IL-1, IL-6, TNF y otras citocinas pro-inflamatorias segregadas en las vías respiratorias durante un ataque de asma aumenta la activación celular de NF-\kappaB, proporcionando más subunidades NF-\kappaB que se unen a los complejos GR-esteroide, reduciendo la cantidad de complejo GR-esteroide disponible para trasladarse al núcleo (P.J. Barnes, A.P. Greening y G.K. Crompton. "Glucocorticoid resistance in asthma". American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine (1995) 152:S125-
S142).

Exposición de los polímeros del poliéter alcohol alquilarílico, incluyendo tiloxapol

Los antioxidantes son compuestos que se pueden oxidar fácilmente a formas químicas estables. Pueden proteger sistemas químicos y biológicos sacrificándose a la oxidación con preferencia a la oxidación de moléculas químicas y biológicas críticamente importantes. No todos los compuestos oxidables pueden realizar la función antioxidante. Para proteger con éxito los sistemas químicos y biológicos de los oxidantes, el antioxidante debe tener una reactividad mayor para el oxidante que la molécula química o biológica que intenta proteger. Para proteger el sistema químico y biológico deseado de la oxidación, es asimismo necesario para el oxidante que la propia partición adyacente a la molécula esté protegida. A título de ejemplo, una molécula que se debe proteger dentro de la bicapa de lípido del plasma, del endosoma o de las membranas nucleares puede protegerse mejor mediante un antioxidante con, al menos en parte, una estructura lipófila, de modo que esté repartida en o cerca de la parte del lípido de la membrana, adyacente a la molécula que necesita protección de la oxidación.

Se ha demostrado recientemente que una clase de fármacos conocida anteriormente, los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico, son potentes antioxidantes útiles en el tratamiento de las enfermedades de los mamíferos (patente U.S. nº 5.474.760 concedida en 1995 a Ghio, Kennedy y Piantadosi, asignados a la Universidad de Duke y documento U.S. nº de serie 08/039/732). Los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico se utilizan comercialmente como detergentes tensioactivos y agentes humectantes (patente U.S. nº 2.454.541, concedida en 1948 a Bock y Rainey, asignados a Rohm & Haas). El mejor conocido de esta clase es tiloxapol, un polímero de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenol con formaldehído e oxirano. Sin embargo, otros compuestos en su clase, que comparten las propiedades de tiloxapol, son bien conocidos en la técnica (J.W. Cornforth, et al. "Antituberculous effect of certain surface-active polyoxyethylene ethers in mice". Nature (1951) 168:150-153).

Un polímero de poliéter alcohol alquilarílico utilizado anteriormente en las formulaciones de aerosol farmacológicas es tiloxapol o Triton WR-1339 (M.L. Tainter, et al. "Alevaire as a mucolytic agent". New England Journal of Medicine (1955) 253:764-767). Composición comercializada por Winthrop Laboratories (division de Sterling Drug, Inc.) y por Breon Laboratories (sucursal de Sterling Drug, Inc.) bajo la denominación comercial ALEVAIRE®, que contiene SUPERINONE® acuoso al 0,125% (marca de tiloxapol) en combinación con bicarbonato de sodio al 2% y glicerina al 5%, ha sido comercializado durante aproximadamente 30 años para el tratamiento de las secreciones mucosas en los pacientes con enfermedades y trastornos tales como bronquitis crónica, difteria, tosferina y poliomelitis. Véase, por ejemplo, un folleto del producto titulado "ALEVAIRE® Detergent Aerosol for Inhalation" (noviembre de 1961) distribuido por Breon Laboratorios).

En ese momento la solicitud de nuevo fármaco (NDA) de la formulación ALEVAIRE se aprobó al principio de la década de 1950, la Federal Food, Drug, and Cosmetic Art (FDA Act) no requiere que la FDA considere la eficacia en el proceso de aprobación del fármaco. En 1962, se enmendó el FDA Act para requerir que la FDA considerase la eficacia y para autorizar a la agencia a sacar del mercado los fármacos con las NDA aprobadas si existen pruebas abundantes de que el fármaco era ineficaz para la utilización a la que se destina. Para cumplir con este último mandato legislativo, la FDA estableció el estudio de la Drug Efficacy Study Implementation (DESI). Se consideró a ALEVAIRE en el estudio de DESI y se observó que era ineficaz. En julio de 1968, la FDA lo notificó a su patrocinador, Sterling Drug. Sterling apeló a las observaciones de la FDA (Sterling Drug, Inc., v. Weinberger, 503F.2d 675 (2d cir. 1974), 384 F supl. 675 (S.D.N.Y. 1974), y 509 F.2d 1236 (2d cir. 1975)). La batalla legal duró 13 años. No fue hasta 1981, después de una audiencia pública probatoria formal, que la FDA publicó una "decisión final" desfavorable sobre ALEVAIRE que no fue apelada por Sterling (ALEVAIRE; Final Decision Following Formal Evidentiary Public Hearing in Adjudicatory Proceeding, 46 Fed. Reg 56043 (13 nov. de 1981)).

La FDA descubrió que no existen pruebas de que el tiloxapol en ALEVAIRE® presentara algún efecto en las secreciones en el pulmón de enfermedades tales como la bronquitis crónica aparte del agua en las secreciones fluidas por simple dilución y que las comunicaciones en la bibliografía del fabricante se basaban en la impresión clínica y no reflejaban controles adecuados. Véase, la carta fechada el 27 de mayo de 1994 al Dr. Thomas Kennedy, uno de los co-inventores de la presente solicitud, de Ms. Carolan W. Hooton, Jefe, Freedom of Information Office, Center for Drug Evaluation and Research, Department of Health & Human Services, Public Health Service, Food and Drug Admimistration, Rockville, Maryland). Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico de la clase tipificada por tiloxapol, son potentes antioxidantes, inhibidores de la activación de NF-\kappaB (véase Ejemplo IV más adelante) e inhibidores de la producción celular de citocinas pro-inflamatorias (véase el Ejemplo V más adelante).

Aún antes de su retirada del mercado, se publicaron pruebas de que la formulación ALEVAIRE de tiloxapol estaba asociada a efectos secundarios en algunos individuos. Paez y Miller estudiaron ALEVAIRE en 20 pacientes con pneumonía obstructiva crónica (Paez, P.N. y W.F. Miller. 1971. Surface active agents in sputum evacuation: a blind comparison with normal saline solution and distilled water. Chest 60:312-317). La función pulmonar no cambió después que los pacientes inhalaran soluciones de solución salina normal, agua o Tergemist (2-etilexil sulfato de sodio al 0,125% y yoduro de potasio al 0,1%), pero cuatro pacientes desarrollaron pruebas de aumento de la obstrucción de las vías respiratorias después de inhalar ALEVAIRE. Posteriormente, Fevrier y Bachofen, utilizando un diseño doble a ciegas con cruce, estudiaron el efecto de ALEVAIRE o de la solución salina como soluciones de vehículo para la inhalación de beta agonistas en 24 pacientes con asma (Fevrier, D., y H. Bachofen. 1975. Vergleich von tyloxapol (Tachoquin, ALEVAIRE) mit physiologischer koschsalzlosung als inhalationstragerluscungen. Schweiz. med Wschr. 195:810-815). Los autores midieron la conductancia específica en las vías respiratorias (la inversa de la resistencia en las vías respiratorias) durante un periodo de 2 horas tras la inhalación de 3 ml de solución de ensayo. La solución ALEVAIRE sin broncodilatador beta agonista produjo una disminución del 20% en la conductancia específica a los 20 minutos (p<0,05) que se resolvió completamente en 60 minutos. Así pues, la formulación de ALEVAIRE produjo claramente broncoespasmo tras la inhalación por individuos sensibles tales como los que padecen asma o reactividad de las vías respiratorias.

La presente formulación de aerosol que contiene tiloxapol es EXOSURF®NEONATAL, aprobada por la FDA en 1990 y comercializada por Glaxo Welcome como suspensión instilada por vía intratraqueal para el tratamiento del síndrome de la disnea aguda neonatal. EXOSURF es una formulación de 108 mg de cadena de dipalmitoilfosfatidilo (DPPC), 12 mg de alcohol cetílico, 8 mg de tiloxapol y 47 mg de cloruro de sodio, redisuelta con 8 ml de agua esterilizada. DPPC se cree que es el componente funcional principal. Como agente dispersante se añade tiloxapol de modo que DPPC puede permanecer en emulsión cuando se redisuelve. Cuando se redisuelve, la solución de EXOSURF contiene 13,5 mg/ml de DPPC, 1,5 mg/ml de alcohol cetílico y 1 mg/ml de tiloxapol en NaCl 0,1 N. El producto se utiliza tanto para tratamiento profiláctico como de recuperación de lactantes. Los neonatos tratados profilácticamente se recomienda que reciban 3 dosis de 5 ml/kg en intervalos de 12 horas después del nacimiento. Tras la administración de EXOSURF se observa ocasionalmente, un número de efectos desfavorables principales incluyendo el reflujo de EXOSURF en el tubo endotraqueal después de la administración intratraqueal, congestión de mocos poco después de la administración, hemorragia pulmonar en lactantes de bajo peso en el nacimiento y desnaturalización del oxígeno arterial (EXOSURF Neonatal. 1995. Physicians Desk Reference. Medical Economics, Montvale, NJ. 758-762). EXOSURF también ha experimentado una prueba para el síndrome de la disnea aguda del adulto provocado por la septisemia en adultos (Weg, J.G., R.A. Balk, et al. 1994. Safety and potencial efficacy of an aerosollized surfactant in human sepsis-induced adult respiratory distress syndrome. J.A.M.A. 727:1433-1438). Los pacientes recibieron EXOSURF en aerosol contínuamente durante 12 ó 24 horas, respectivamente en un periodo de hasta 5 días (568,4 \pm 53,6 gramos en el grupo de 12 horas y 1.128,4 \pm 99,3 gramos en el grupo de EXOSURF de 24 horas). Debido al componente DPPC del lípido, la formulación en aerosol de la emulsión de EXOSURF tendía a acumularse y ocluir el filtro bacteriano de exhalación en el respirador mecánico. Un paciente sufrió un neumotórax (desgarro pulmonar) como consecuencia de esta oclusión, cuando la presión en el circuito del respirador crece y no podría escapar debido a que se bloqueó una válvula de exhalación por la emulsión de lípido acumulada.

Sinopsis de la exposición anterior

La inflamación en muchas de las enfermedades está mediada por la activación del factor de transcripción NF-\kappaB, que a su vez produce un aumento en la producción celular de las citocinas pro-inflamatorias tales como TNF, IL-1, IL-6, IL-8 y el factor de crecimiento GM-CSF, y un aumento de enzimas celulares críticas, tal como la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS). El tratamiento actual disponible para impedir la activación de NF-\kappaB y la posterior secreción de citocina consiste en glucocorticoides antiinflamatorios. Recientemente se ha descubierto que unos pocos antioxidantes, pero no la mayoría, inhiben también a NF-\kappaB.

Teóricamente es posible sintetizar muchos compuestos con propiedades antioxidantes. Sin embargo, no existe similitud estructural previsible entre los pocos agentes que demuestran impedir la activación de NF-\kappaB. Así pues, la demostración de que un compuesto presenta actividad antioxidante no prediría, por sí misma, que el mismo compuesto inhibiese además la activación de NF-\kappaB y la secreción de citocinas pro-inflamatorias. Asimismo, el factor que limita la utilización de antioxidantes como tratamientos en sistemas biológicos es la toxicidad inherente de muchos de los propios compuestos antioxidantes. Asimismo, los corticosteroides antiinflamatorios son potentes inhibidores de NF-\kappaB, pero su utilización como tales está limitada de forma severa por los efectos secundarios bien conocidos de los corticosteroides, incluyendo la intolerancia a la glucosa, la hipertensión, la reabsorbción ósea, la ganancia de peso y las cataratas. Por lo tanto, la ventaja principal consiste en descubrir que una clase de ingredientes utilizados frecuentemente y no tóxicos en las preparaciones farmacológicas medicinales no sean únicamente potentes antioxidantes, sino además potentes inhibidores de la activación de NF-\kappaB. No se pueden utilizar únicamente dichos compuestos en tratamientos para enfermedades en los que pudiera predecirse que los antioxidantes son valiosos, sino que se pueden utilizar en tratamientos para enfermedades inflamatorias mediadas por NF-\kappaB sin producir ellos mismos toxicidad en los sistemas biológicos.

Los descubrimientos presentados en los diversos ejemplos que siguen demostrarán que tiloxapol es un potente antioxidante que impide también la activación de NF-\kappaB y suprime la secreción de citocinas inflamatorias. Estas características de tiloxapol le convertirían en una estrategia útil de tratamiento con fármaco antiinflamatorio para varias enfermedades de mamíferos, especialmente enfermedades del aparato respiratorio. Sin embargo, las formulaciones actuales de tiloxapol, ALEVAIRE y EXOSURF, presentan características indeseables, tales como la resistencia creciente en las vías respiratorias en los asmáticos, en el caso de ALEVAIRE, o la producción de congestión de las vías respiratorias y de los circuitos de respiración, en el caso de EXOSURF.

Sumario de la invención

La invención en la presente solicitud describe una nueva formulación del polímero de poliéter alcohol alquilarílico, tiloxapol. El objetivo de esta nueva formulación es eliminar las características indeseables de las formulaciones de tiloxapol utilizadas hasta la fecha. Estas características limitan actualmente la utilidad terapéutica de tiloxapol debido a los efectos secundarios no de tiloxapol sino asociados a las composiciones de las propias formulaciones. La presente invención describe cómo los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico, tales como tiloxapol, se pueden colocar en una formulación no tóxica que no tenga las características indeseables de las formulaciones anteriores. La administración de las nuevas formulaciones puede ser similar a las descritas en la patente U.S. nº 5.474.760 y nº 5.512.270 y en la patente U.S. nº de serie 08/632.275 presentado el 15 de abril de 1996, (que describen cómo los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico son útiles como antioxidantes en el bloqueo de las reacciones oxidantes y en la lesión biológica de la especie O_{2} parcialmente reducida y son útiles como agentes de tratamiento para inhibir la activación del factor de transcripción NF-\kappaB y como inhibores de secreción celular de las citocinas TNF, IL-1, IL-6 e IL-8 y el factor de crecimiento GM-CSF) y se repite a continuación para una mayor claridad.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una nueva formulación del polímero de poliéter alcohol alquilarílico, tiloxapol, para el tratamiento con aerosol de las enfermedades respiratorias.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para inhibir las reacciones químicas oxidantes producidas por la especie O_{2} parcialmente reducida.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para proteger los tejidos del mamífero contra la especie O_{2} parcialmente reducida.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento y un medicamento para proteger de lesión por HOCl/OCl las vías respiratorias, que por comodidad, se denomina en la presente memoria también HOCl.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para inhibir las reacciones químicas oxidantes producidas por la especie O_{2} parcialmente reducida mediante tratamiento con aerosol con el agente terapéutico.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento y un medicamento para la inhibición de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB (mejorando de este modo los sucesos celulares proinflamatorios provocados por los genes de activación controlados por esta proteína celular reguladora).

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento y un medicamento para la inhibición de las citocinas TNF, IL-1, IL-6 e IL-8 y el factor de crecimiento GM-CSF.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento y un medicamento para impedir la resistencia glucocorticoide en el asma y en otras enfermedades bloqueando la activación del factor de transcripción NF-\kappaB, impidiendo de este modo la fijación y la represión mutua del complejo receptor glucocorticoide mediante la NF-\kappaB activa presente en el citoplasma.

Una ventaja de la presente invención consiste en que el agente terapéutico está formulado para eliminar ingredientes nocivos encontrados en las formulaciones comercializadas anteriormente.

Una ventaja de la presente invención consiste en que el agente terapéutico se formula en una concentración más elevada, terapéuticamente más eficaz que la disponible anteriormente.

Una ventaja de la presente invención consiste en que el agente terapéutico se produce a partir de una clase caracterizada toxicológicamente de compuestos con bajo potencial toxicológico para los sistemas biológicos.

En un primer aspecto la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su utilización en el tratamiento de los trastornos respiratorios que comprende aproximadamente entre 0,25 y aproximadamente 5,0% en peso de tiloxapol y 0,1% de glicerol y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha composición es isotónica con el fluido que recubre las vías respiratorias de un paciente con un trastorno respiratorio, estando dicha composición sustancialmente exenta de bicarbonato de sodio y de cromogluconato de sodio.

La presente invención comprende nuevas composiciones farmacéuticas de formulaciones que comprenden tiloxapol como ingrediente activo. Estas formulaciones comprenden tiloxapol en concentraciones mayores que cualquiera conocida por el solicitante que han sido utilizadas en una formulación farmacéutica anteriormente. Tal como se describe en la presente memoria, tiloxapol se empleó anteriormente en composiciones a concentraciones de 0,125%. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden concentraciones de tiloxapol o de otros polímeros de poliéter alcohol alquilarílico, aproximadamente 0,125%, preferentemente desde aproximadamente 0,25% hasta aproximadamente 5,0%.

Además, la invención abarca composiciones farmacéuticas con hipertonicidad reducida cuyas composiciones comprenden tiloxapol en soluciones farmacéuticamente aceptables sin concentraciones significativas de agentes hipertónicos o de otros ingredientes activos. Por ejemplo, las formulaciones con hipertonicidad reducida no contienen los agentes hipertónicos tales como NaHCO_{3}, o fosfolípidos activos, tales como DPPC, cada uno de los cuales se utilizan en las formulaciones anteriores. Las formulaciones menos hipertónicas permiten derivar todos los beneficios del ingrediente activo tiloxapol, de modo que reducen la toxicidad y aumentan la vida media, mientras que impiden o reducen los efectos secundarios, tales como broncoespasmos, asociados a varios agentes hipertónicos o a otros agentes del ingrediente activo.

Además, las nuevas formulaciones de la presente invención que comprenden unas concentraciones elevadas de tiloxapol permiten al médico intervenir de manera más eficaz o tratar las enfermedades identificadas en la presente memoria. Por ejemplo, con la composición de mayor concentración la administración es menos frecuente y más rápida. Las formulaciones con altas concentraciones permiten también un tratamiento agresivo y eficaz con excelente distribución dentro del pulmón mientras que dichas concentraciones no son posibles con las formulaciones anteriores que contienen tiloxapol.

Las composiciones o formulaciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar a un paciente afectado por CF según el siguiente programa de dosificación: una o dos veces al día en las concentraciones descritas anteriormente. Debe reconocerse que el médico o internista del tratamiento sabrá cómo ajustar la dosis o el régimen de dosificación para un determinado paciente dependiendo de la gravedad de la enfermedad o de la respuesta del paciente. Evidentemente, estas nuevas composiciones o formulaciones que contienen grandes concentraciones de tiloxapol que están exentas de NaHCO_{3}, DPPC y concentraciones significativas de NaCl proporcionan una capacidad única y mejorada para tratar CF y otros trastornos respiratorios.

En las formas de realización preferidas de la invención, el medicamento se instila directamente en el sistema respiratorio y se administra por aerosolización. En la presente forma de realización, el medicamento comprende preferentemente un vehículo fisiológicamente aceptable que se puede seleccionar de entre el grupo constituido por solución salina tamponada fisiológicamente, solución salina isotónica y solución salina normal, con la concentración de solución salina ajustada a aproximadamente 300 mOsm. El pH del polímero de poliéter alcohol alquilarílico y de la mezcla de vehículo es preferentemente mayor a 6,0 pero igual o menor a 7,4.

La consideración de la memoria, incluyendo varias figuras y ejemplos siguientes, permitirá a un experto en la técnica determinar objetos y ventajas adicionales de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La referencia a la descripción detallada siguiente puede ayudar a explicar mejor la invención a partir de los dibujos, en los que:

La Figura 1 presenta un gráfico del efecto inhibidor de tiloxapol en la generación de ^{\bullet}OH mediante la reacción de Fenton, medido por hidroxilación de salicilato;

la Figura 2 presenta un gráfico del efecto inhibidor de tiloxapol en la generación de ^{\bullet}OH mediante la reacción de Fenton, medido por hidroxilación del azúcar, 2-desoxirribosa;

la Figura 3 presenta las proporciones de peso húmedo-seco de pulmón en ratas expuestas al oxígeno al 100% y tratadas con solución salina normal, tiloxapol y tiloxapol más alcohol cetílico;

la Figura 4 presenta la acumulación de fluido pleural en ratas expuestas a oxígeno al 100% y tratadas con solución salina normal, tiloxapol y tiloxapol más alcohol cetílico;

las Figuras 5A y 5B presentan el efecto de tiloxapol en la lesión pulmonar mediada por HOCl en ratas;

la Figura 6 presenta la activación del factor de transcripción NF-\kappaB por IL-1 y H_{2}O_{2} y la inhibición de esta activación por tiloxapol;

la Figura 7 presenta la secreción inicial de IL-8 por monocitos humanos no estimulados con y sin tratamiento con tiloxapol;

la Figura 8A presenta la secreción humana de monocitos de TNF-\alpha con y sin tratamiento con tiloxapol;

la Figura 8B presenta la secreción humana de monocitos de IL-1\beta con y sin tratamiento con tiloxapol;

la Figura 8C presenta la secreción humana de monocitos de IL-6 con y sin tratamiento con tiloxapol;

la Figura 8D presenta la secreción humana de monocitos de IL-8 con y sin tratamiento con tiloxapol; y

la Figura 8E presenta la secreción humana de monocitos de GM-CSF con y sin tratamiento con tiloxapol.

Descripción detallada de la invención

Los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico pueden ser sintetizados en general condensando alcoholes de alquilarilo con formaldehído, tal como describen Bock y Raney en la patente U.S. nº 2.454.541 (1948, asignada a Rohm & Haas). La presente invención proporciona un medicamento para la inhibición de los efectos nocivos de la especie O_{2} parcialmente reducida en sistemas químicos y biológicos que comprende una cantidad eficaz para el tratamiento de polímeros de poliéter alcohol alquilarílico de fórmula:

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1

en la que R = etileno, R' = alquilo C_{4} a C_{14} lineal o ramificado, x es mayor de 1, e y = 2 a 18, eficaz para inhibir reacciones químicas oxidantes producidas por la especie oxidante en el mamífero, tratando de este modo las entidades de la enfermedad del mamífero. Todos los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico descritos en esta patente deberían operar en la presente invención. Varios polímeros de poliéter alcohol alquilarílico pueden sintetizarse fácilmente por los procedimientos descritos anteriormente (J.W. Conforth, et al. "Antituberculous effect of certain surface-active polyoxyethylene ethers in mice". Nature (1951) 168:150-153). El compuesto prototipo de esta clase, tiloxapol, se puede adquirir cómodamente con pureza farmacológicamente aceptable en Nycomed, Inc., 33 Riverside Ave., Rensselaer, NY 12144.

El tratamiento de los pacientes para secuestrar la especie O_{2} parcialmente reducida y otros oxidantes y la inhibición de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB y la producción de las citocinas TNF-\alpha, IL-1\beta, IL-6, IL-8 y del factor de crecimiento GM-CSF con polímeros de poliéter alcohol alquilarílico, en particular tiloxapol, es esencialmente el mismo que la administración descrita en las patentes U.S. nº 5.474.760 y nº 5.512.270.

Más particularmente, para el tratamiento de las enfermedades respiratorias en mamíferos relacionadas con la sobreproducción de la especie O_{2} parcialmente reducida y otros oxidantes y para la inhibición de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB y la producción de las citocinas TNF-\alpha, IL-1\beta, IL-6, IL-8 y del factor de crecimiento GM-CSF, el polímero de poliéter alcohol alquilarílico se disuelve en NaCl 0,85 a 0,9% esterilizado y agua para inyectables y se ajusta el pH a aproximadamente 7,0 mediante adición de NaOH o HCl.

Por otra parte, para estabilizar el tamaño de las gotitas de aerosol y proporcionar un sabor agradable, se puede añadir una concentración 0,1% (v/v) de glicerol a la formulación y se reduce la concentración de NaCl entre 0,8 y 0,85 (p/v) para mantener la formulación dentro del intervalo isotónico con respecto a los fluidos corporales extracelulares (aproximadamente 300 mOsm). Se puede añadir un alcohol alquílico o arílico no polimérico tal como alcohol cetílico (hexadecanol) entre 1 y 1,5 veces el peso de tiloxapol para aumentar la eficacia de la mezcla en la protección contra la agresión oxidante. Si se añade alcohol cetílico, se disminuye proporcionalmente la concentración de NaCl, para proporcionar una formulación que sea isotónica. Como ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden concentraciones de tiloxapol u otros polímeros de poliéter alcohol alquilarílico por encima de 0,125%, preferentemente desde aproximadamente 0,25% a 2,5% (p/v) solución de NaCl 0,9% esterilizada y agua para preparar una solución isotónica de aproximadamente 300 mOsm. La concentración de tiloxapol se puede aumentar desde aproximadamente 2,5% a aproximadamente 5,0% (p/v) y la isotonicidad de la solución resultante se puede mantener disminuyendo la concentración de NaCl a 0,85%. Si se añade además glicerol al 0,1%, la concentración de NaCl se disminuye además a 0,85% para las soluciones de menor concentración y a 0,8% para las soluciones de mayor concentración de tiloxapol.

Esta mezcla se administra a continuación al pulmón por instilación directa en el sistema respiratorio. La mezcla se puede administrar también por aerosolización utilizando un nebulizador actuado a presión positiva clínicamente disponible que produzca partículas respirables de menos de 5 micras de diámetro mediano de masa. Los sistemas nebulizadores de aerosol a chorro que resultan útiles para la administración de tiloxapol en las vías respiratorias incluyen el nebulizador Pari-LC Jet Plus (Richmond, VA), el nebulizador T-Updraft II Nebumist (Hudson, Irvine, CA) y el nebulizador Marquest Acorn II (Marquest Medical Products, Inc., Englewood, CO). Las concentraciones mayores de tiloxapol (0,25 a 5,0%) están favorecidas para la aerosolización para administrar una cantidad eficaz de fármaco a las vías respiratorias. Debido a que tiloxapol presenta una vida media prologada de 5 a 6 días cuando se administra en el pulmón (DeAngelis R.L., y J.W. Findlay. 1993. Metabolism of synthetic surfactants. Clin. Perinatol. 20:697-710; Sachs, S., y S.L. Young. 1995. Pharmacokinetics of intratracheally instilled tyloxapol in the rat: localization of protection against hyperoxic injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 151:A645), las concentraciones más altas permiten también administrar tiloxapol como terapia una vez al día, proporcionando de este modo a una mayor facilidad de tratamiento para el paciente y mayor satisfacción del paciente con la terapia prescrita.

Como ejemplo, se prepara una solución de tiloxapol 0,25 a 5,0% en NaCl 0,85 a 0,9% esterilizada y agua desionizada dos veces destilada en vidrio para hacerla isotónica con respecto a las secreciones respiratorias. El pH se ajusta a aproximadamente 7,0 para prevenir el broncoespasmo en los extremos de acidez o alcalinidad. Esta mezcla se esteriliza por filtración al vacío mediante un filtro Millipore de 0,22 micras y se envasan 3,3 ml de cada una en viales de vidrio de 5 ml de dosis unitaria con tapones de goma cerrados con sellos encajados de "apertura por desgarro". Se puede añadir opcionalmente a la mezcla anterior una concentración de glicerol al 0,1% para estabilizar el tamaño de la gotita durante la aerosolización, pero la concentración de NaCl debe reducirse más, como se describió anterior-
mente.

Para aumentar la eficacia de la terapia, se puede añadir a la formulación una cantidad eficaz para el tratamiento de un glucocorticoide antiinflamatorio frecuentemente disponible, tal como metilprednisolona (1 a 5 mg), triamcinolona (1 a 5 mg), dipropionato de beclometasona (1 a 4 mg), flunisolida (200 a 400 \mug) o dexametasona (200 a 400 \mug, ya sea como dexametasona o su congénere soluble fosfato sódico de dexametasona). La combinación de un polímero de poliéter alcohol alquilarílico y un glucocorticoide antiinflamatorio proporciona un medio para reducir la resistencia del glucocorticoide en el asma y otras enfermedades, aumentando de este modo la eficacia del glucocorticoide. Esto se lleva a cabo bloqueando, con adición del polímero de poliéter alcohol alquilarílico, la activación del factor de transcripción NF-\kappaB, impidiendo de este modo la fijación y por consiguiente la represión mútua del complejo receptor glucocorticoide por el NF-\kappaB activo presente en el citoplasma. Una ventaja adicional de la formulación combinada es que los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico, como agentes tensioactivos, ayudarán a la solubilización de los glucocorticoides antiinflamatorios insolubles en agua tales como triamcinolona, dipropionato de beclometasona, flunisolida o dexametasona, favoreciendo de este modo su distribución eficaz en las vías respiratorias.

Para la administración de dosis eficaces para el tratamiento a los pulmones y a las vías respiratorias bronquiales, se inhala 3 ml de solución esterilizada de tiloxapol como aerosol una vez al día utilizando un nebulizador actuado por presión positiva clínicamente disponible tales como los dispositivos descritos anteriormente. Como alternativa, se puede nebulizar la mezcla en el circuito respiratorio de administración de un respirador mecánico. Se puede mezclar un broncodilatador agonista beta simpático (tal como 1,25 a 2,5 mg de albuterol) con la solución de tiloxapol y nebulizar de la forma correspondiente, si se desea disminuir el tiempo de tratamiento total si el paciente está recibiendo también terapia independiente con broncodilatadores beta agonistas. Se puede añadir también a la solución de tiloxapol para el mismo objeto un derivado de amonio cuaternario de atropina tal como ipratoprio (500 \mug) o glicopirrolato (200 a 1000 \mug).

Para la administración de dosis eficaces para el tratamiento a las vías respiratorias nasales, la solución esterilizada de tiloxapol o la solución de tiloxapol que contiene los corticoesteroides antiinflamatorios anteriores se coloca en una botella escurrida de 10 ml disponible en el comercio o un dispositivo similar que genere una niebla fina. Para el alivio de la rinitis nasal, de la rinosinusitis o de otra inflamación, se inhala 1 a 4 pulverizaciones de este dosificador en cada fosa nasal una o dos veces al día.

Con el fin de facilitar una comprensión adicional de la invención, los ejemplos siguientes ilustran en primer lugar determinados detalles más específicos de la misma.

El Ejemplo I demuestra la potente actividad de los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico como secuestradores de ^{\bullet}OH en sistemas químicos. El Ejemplo II demuestra la ventaja terapéutica de utilizar polímeros de poliéter alcohol alquilarílico para impedir la lesión pulmonar del mamífero por exposición a oxígeno al 100%. El Ejemplo III demuestra la potente actividad de los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico como secuestradores de HOCl en los sistemas químicos. El Ejemplo IV demuestra la inhibición de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB. El Ejemplo V demuestra la supresión de citocina y la producción de GM-CSF. El Ejemplo VI demuestra la naturaleza extremadamente hipertónica de la formulación original ALEVAIRE y cómo resuelve este problema la formulación descrita en la presente memoria.

Ejemplo I Inhibición de los oxidantes generados por la reacción de Fenton

El primer sistema químico utilizado para determinar la actividad antioxidante de polímeros de poliéter alcohol alquilarílico empleó salicilato como molécula diana de los oxidantes. El radical hidroxilo reacciona con el ácido salicílico (ácido 2-hidroxibenzoico) para producir dos productos de ácido dihidroxibenzoico, ácido 2,3- y 2,5-dihidroxibenzoico. Estos productos hidroxilados proporcionan pruebas de la generación de ^{\bullet}OH (R.A. Floyd et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods (1984) 10:221-235; R.A. Floyd et al. Journal of Free Radicals in Biology & Medicine (1986) 2:13-18).

La detección del ácido 2,3- y 2,5-dihidroxibenzoico se realizó utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento con detección electroquímica. Se emplearon suspensiones de FeCl_{3} 10 \muM, H_{2}O_{2} 1 mM, ascorbato 1,0 mM y ácido salicílico 10,0 \muM para generar y detectar ^{\bullet}OH. Se añadió 1,0 ml de solución salina normal o tiloxapol (concentraciones finales de 0,0 a 10 mg/ml). Se incubaron las mezclas de reacción a 45ºC durante 30 min y se centrifugaron a 1200 g durante 10 min. Se centrifugó el sobrenadante (Beckman Microfuge E) a través de un filtro con tubo de microcentrífuga de 0,22 \muM (PGC Scientific nº 352-118) a 15.000 g.

Se inyectó una muestra de 100 \mul del eluido en una columna C18 RP HPLC (250 \times 4,7 mm, Beckman nº 235329). Se cuantificaron los productos hidroxilados del salicilato con un detector electroquímico Coulochem (modelo 5100 A de ESA) con el detector ajustado a un potencial de reducción de -0,40 VDC. La celda de seguridad (utilizada como tamiz) se ajustó a un potencial de oxidación de +0,40 VDC. Se hicieron mediciones por duplicado. La Figura 1 demuestra que la adición de tiloxapol a la mezcla de reacción inhibió la generación de ^{\bullet}OH en función de la concentración.

El segundo sistema químico utilizado para determinar la actividad antioxidante de los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico empleó 2-desoxirribosa como molécula diana de los oxidantes. Este azúcar de pentosa reacciona con oxidantes para dar una mezcla de productos. En el calentamiento con ácido tiobarbitúrico (TBA) a bajo pH, estos productos forman un cromóforo rosa que se puede medir por su absorbancia a 532 nm (B. Halliwell y J.M.C. Gutteridge. Methods in Enzymology (1990) 186:1-85).

El sistema químico empleado para generar oxidantes consistió en una mezcla de reacción conteniendo FeCl_{3} 10,0 \muM, ascorbato 1,0 mM, H_{2}O_{2} 1,0 mM y desoxirribosa 1,0 mM en solución salina equilibrada de Hanks. Este sistema resulta útil para medir la generación de ^{\bullet}OH específica en el punto en moléculas biológicas, tal como describen Halliwell y Gutteridge en la referencia inmediatamente anterior. Se añadieron 0,1 ml de solución salina normal o tiloxapol (concentraciones finales de 0,0 a 10,0 mg/ml).

Se incubaron las mezclas de reacción a 45ºC durante 30 min y se centrifugaron a 1200 g durante 10 min. Se añadieron un ml tanto de TBA al 1,0% (p/v) como de ácido tricloroacético al 2,8% (p/v) a 1,0 ml de sobrenadante, se calentó a 100ºC durante 10 min, se enfrió en hielo y se determinó el cromóforo por triplicado por su absorbancia a 532 nm. La Figura 2 demuestra que la adición de 10 mg/ml de tiloxapol a la mezcla de reacción produce una inhibición marcada de la oxidación de desoxirribosa, medida por la absorbancia de la reacción oxidante producida a 532 nm.

El tercer sistema utilizado para determinar la actividad antioxidante de los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico empleó asbestos como fuente de hierro para la generación oxidante y 2-desoxirribosa como molécula diana de oxidantes. La generación de oxidantes por asbestos ha sido descrita anteriormente (A.J.Ghio et al. American Journal of Physiology (Lung Cellular and Molecular Physiology 7) (1992) 263:L511-L518). La mezcla de reacción, en un volumen total de 2,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) contenía los reactivos siguientes: desoxirribosa 1,0 mM, H_{2}O_{2} 1,0 mM, ascorbato 1,0 mM y 110 mg/ml de asbestos de crocidolita. Se incubó la mezcla a 37ºC durante 1 h con agitación y a continuación se centrifugó a 1.200 g durante 10 min.

Se evaluó la generación de oxidante midiendo los productos de desoxirribosa reactivos con TBA detallados en el párrafo anterior. Se hicieron mediciones por triplicado. La TABLA I a continuación demuestra que la adición de tiloxapol inhibió la generación de oxidantes por asbestos en función de la concentración, medida por absorbancia del producto de la reacción oxidante a 532 nm.

TABLA I Efecto de tiloxapol en la generación oxidante de asbestos

		Absorbancia a 532 nm
	0,0 mg/ml de tiloxapol	0,93 \pm 0,02
	0,1 mg/ml de tiloxapol	0,89 \pm 0,04
	1,0 mg/ml de tiloxapol	0,75 \pm 0,01
	10,0 mg/ml de tiloxapol	0,53 \pm 0,04

Ejemplo II Protección de la lesión pulmonar del mamífero por oxígeno al 100%

Para determinar si los polímeros de poliéter alcohol alquilarílico podrían proteger contra la agresión oxidante a sistemas biológicos intactos, se estudió este tratamiento en un modelo bien demostrado de toxicidad por oxígeno en el pulmón (J.F. Turrens, et al. Journal of Clinical Investigation (1984) 73:87-95). Se instilaron por vía traqueal ratas Sprague-Dawley macho de sesenta días de vida (Charles River, Inc., Wilmington, MA) con 0,5 ml de solución salina normal, tiloxapol (6,0 mg) o tiloxapol (6,0 mg) y alcohol cetílico (hexadecanol, 11,0 mg). Se expusieron a continuación estas ratas (n=10 en cada grupo de tratamiento) a aire o a oxígeno al 100% en cámaras de plexiglás a un caudal de 10 litros/min.

El porcentaje de oxígeno se controló mediante un electrodo polarográfico y se mantuvo en continuo por encima del 98%. La temperatura se mantuvo entre 20 y 22ºC. Se determinaron los tiempos de supervivencia comprobando los animales cada 4 horas. Se expusieron grupos separados de ratas tratadas del mismo modo (n=10 en cada grupo de tratamiento) a oxígeno al 100% durante 61 horas, y a continuación se les practicó la eutanasia con 100 mg/kg de pentobarbital por vía intraperitoneal. Se midió el volumen de fluido pleural aspirando el fluido pleural desde la cavidad torácica a través de una pequeña incisión en el diafragma. Se calcularon las proporciones en peso de pulmón húmedo/seco del pulmón izquierdo después de secar el tejido durante 96 horas a 60ºC. En la TABLA II a continuación se presentan los datos de supervivencia.

Las ratas que recibieron tiloxapol por vía intratraqueal presentaban una supervivencia notablemente mejorada en comparación con los animales de referencia con placebo instilados con solución salina. El efecto protector de tiloxapol se aumentó además combinándolo con alcohol cetílico.

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TABLA II

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Efecto de tiloxapol en la toxicidad por oxígeno en ratas

2

Las proporciones en peso de pulmón húmedo/seco fueron sustancialmente menores en las ratas tratadas con tiloxapol o con tiloxapol y alcohol cetílico (Figura 3), demostrando que tiloxapol o la combinación de tiloxapol y alcohol cetílico protege contra la formación de edema de la agresión oxidante. Las ratas tratadas con tiloxapol o con la combinación de tiloxapol y alcohol cetílico presentaban también menos acumulación de fluido pleural que las referencias tratadas con solución salina (Figura 4).

Estos resultados demuestran la capacidad de polímeros de poliéter alcohol alquilarílico, tal como tiloxapol para proteger contra la agresión oxidante al tejido. Los estudios de supervivencia (TABLA II) demuestran además que el efecto protector del medicamento aumenta combinándolo con alcoholes tal como alcohol cetílico.

Ejemplo III Antioxidación de HOCl

La actividad de tiloxapol para antioxidar OCl^{-} se determinó estudiando su capacidad para impedir la conversión oxidante mediada por OCl^{-} de dietanolamina en su correspondiente cloramina estable ("Determination of HOCl Production by Myeloperoxidase", Robert A. Greenwald, editor, Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press, Boca Raton, Florida (1987), página 300).

La mezcla de reacción comprendía 0,9 ml de dietanolamina 10,0 mM en tampón de acetato de sodio 0,1 N, pH 4,5. A ésta se añadió 100 \mul de NaCl 0,1 M o tiloxapol en NaCl 0,1 M y se leyó la absorbancia de referencia a 280 nm. Se añadió NaOCl hasta una concentración final de 10 mM.

Se incubó 15 min la mezcla de reacción y se midió la absorbancia a 280 nm. La diferencia en A_{280} antes y después de la adición de NaOCl se utilizó como una medida de concentración de la cloramina estable. Se realizaron los experimentos por triplicado. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla III.

TABLA III Efecto de tiloxapol en la formación de cloramina producida por HOCl

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Microlitos de tiloxapol (10 mg/ml)	Absobancia
	(Media \pm SD)
0	0,505 \pm 0,002
25	0,468 \pm 0,008
50	0,444 \pm 0,023
75	0,377 \pm 0,010
100	0,319 \pm 0,025

Para demostrar que tiloxapol es también un antioxidante de HOCl eficaz in vivo, se estudió la capacidad de tiloxapol para proteger contra la lesión pulmonar de HOCl en ratas Sprague-Dawley macho de 60 días de vida (n=6 por grupo de tratamiento) pesando 250 a 300 g (Charles River Breeding Labs, Wilmington, MA). Tras la anestesia con halotano (2 a 5%) se inyectaron las ratas por vía intratraqueal con 0,3 ml de NaOCl 2,0 mM en solución salina normal (tamponada a pH 6,0) o con solución salina normal sola. Se dejó que se recuperaran las ratas y una hora después se les suministraron dosis por vía intratraqueal de 6,0 mg de tiloxapol en solución salina normal o de solución salina normal. Veinticuatro horas después de la instilacion de NaOCl, se practicó la eutanasia a todas las ratas con pentobarbital sódico. Se canularon las tráqueas y se lavaron los pulmones con solución salina normal (35 ml/kg de peso corporal). Después de la tinción del fluido de lavado con un tinte de Wright modificado (tinte Diff-Quick, ASP, McGraw Park, IL), se determinaron los diferenciales celulares en 500 células/muestra. Se expresaron los valores en porcentaje de células totales recuperadas. Se midió la proteína de lavado utilizando el procedimiento Bio-Rad para la determinación de proteínas totales modificadas para su utilización en el analizador centrífugo.

La instilación intratraqueal de NaOCl produjo lesión pulmonar aguda como se demuestra mediante un aumento notable en la concentración de proteínas y del % de neutrófilos (% PMN) en el fluido de lavado del pulmón (Figura 5). El tratamiento tras la exposición con tiloxapol redujo de forma significativa la concentración de proteína de lavado
(p < 0,001) y % PMN (p < 0,01), demostrando que tiloxapol también protege contra la citotoxicidad mediada por HOCl in vivo.

Así pues, tiloxapol es un potente inhibidor de la actividad oxidante de HOCl y debería ser útil para prevenir la lesión oxidante de las vías respiratorias mediada por HOCl. La administración de tiloxapol por instilación traqueal a pacientes con enfermedades de las vías respiratorias mediadas por neutrófilos tales como la fibrosis quística y la bronquitis crónica deberían inhibir el HOCl producido en estos pacientes y por consiguiente protegerlos de la agresión oxidante. El resultado debería ser incluso mejor si se mezcla algo de alcohol cetílico con el tiloxapol. Preferentemente, se añade alcohol cetílico de 1 a 1,5 veces el peso de tiloxapol.

La preparación de muestras para la administración al paciente debería ser la misma que la descrita anteriormente en el apartado "Descripción detallada de la invención" en la presente memoria, más preferentemente la inhalación de 3 ml de una solución isotónica de tiloxapol 0,25 a 5,0% en NaCl y agua mediante aerosol a chorro una vez al día.

Ejemplo IV Inhibición de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB por tiloxapol

Como se expuso al principio, el control de la expresión genética de las proteínas celulares está controlado por las proteínas denominadas factores de transcripción que se unen a las secuencias reguladoras de ADN e influyen en la producción del producto de la proteína del gen regulado. Un factor de transcripción importante para la inflamación es NF-\kappaB, que favorece la transcripción del ARN mensajero para las citocinas inflamatorias y los factores de crecimiento. Para determinar si tiloxapol inhibe la activación del factor de transcripción NF-\kappaB, se ensayó tiloxapol en ensayos de desplazamiento con gel con mobilidad electroforética realizados en células epiteliales A549 cultivadas de pulmón humano. Se cultivaron células epiteliales A549 pulmonares humanas en medio F-12 de Ham enriquecido con suero de ternero fetal inactivado térmicamente al 10% (2mM), L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y anfotericina B (250 \mug/ml). Se estimularon las células confluentes con 10 U/ml de Il-1\beta o H_{2}O_{2} 100 \muM. En algunos cultivos se añadió 100 \mug/ml de tiloxapol al mismo tiempo que los estimulantes. Después de 2 horas de incubación, se aislaron los extractos nucleares como describe Dignam et al. (J.D. Dignam, R.M. Lebovita y R.G. Roeder. "Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei" Nucleic Acid Research (1983) 11:1475-1489), con modificaciones menores (C.V. Gunther y B.J. Graves "Identification of ETS domain proteins in murine Tlymphocytes that interact with the Moloney murine leukaemia virus enhancer" Molecular and Cellular Biology (1994) 14:7569-7580). En resumen, después de la eliminación del sobrenadante, se rasparon las células suavemente en 20 a 30 ml de PBS conteniendo fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y ditiotreitol (DTT) 1 mM. Se centrifugó la suspensión celular y se volvieron a poner en suspensión los sedimentos y se incubaron durante 15 min en 1 ml de tampón A conteniendo HEPES 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 10 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, \beta-glicerolfosfato 10 mM, benzamidina 2,5 mM, NaF 1 mM, NaVO_{4} 1mM, 1 mg/ml de leupeptina y 1 mg/ml de pepstatina A, se cortaron a continuación mediante el paso de la suspensión 5 veces a través de una aguja 25 G. Tras la centrifugación se pusieron en suspensión los sedimentos y se agitaron durante 30 min en tampón C conteniendo 25 % de glicerol vol/vol, NaCl 0,25 M, MgCl_{2} 1,5 mM, ácido etilendiamintetraacético 0,2 mM (EDTA), PMSF 1 mM, DTT 1 mM, \beta-glicerolfosfato 10 mM, benzamidina 2,5 mM, NaF 1 mM, NaVO_{4} 1 mM, 1 mg/ml de leupeptina y 1 mg/ml de pepstatina A. Después de la centrifugación, se obtuvieron extractos nucleares por diálisis de los sobrenadantes en tampón D conteniendo HEPES 20 mM, 20% vol/vol de glicerol, KCl 100 mM, EDTA 0,2 mM, PMSF 1 mM y DTT 1 mM. Utilizando las secuencias de consenso naturales para AP-1 (W. Lee, P. Mitchell y R. Tijan "Purified transcription factor AP-1 interacts with TPA-inducible enhancer elements" Cell (1987) 49:742-752) y los locus de NF-\kappaB (R. Sen y D. Baltimore. "Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences" Cell (1986) 46:705-716) se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos (puntos de fijación subrayados):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 AP-1: \+
5'-TTCCGGC TGACTCA TCAAGCG-3'\cr
 \+ 3'-AAGGCCGACTGAGTAGTTCGC-5'\cr 
NF- \kappa B: \+
5'-AGTTGAG GGGACTTTCC CAGGC-3'\cr
 \+
3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5'\cr}

Se purificaron los oligonucleótidos por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizado seguido del paso por columnas Sep-Pak C18. se marcó el extremo en cada cadena complementaria por fosforilación con [\Upsilon^{32}P]-ATP y T4 polinucleótido cinasa. Se generaron sondas de ADN de doble cadena hibridando las cadenas complementarias de oligonucleótido marcadas en el extremo, hirviendo durante 3 min y enfriando lentamente a temperatura ambiente en un baño de agua. Se eliminaron los radionucleótidos no incorporados mediante cromatografía en columna Sephadex G-25. Se realizaron las reacciones de fijación durante 20 min en hielo con 5 a 10 \mug total de proteína en un volumen de 20 \mul conteniendo 300 ng de albúmina de suero bovino (BSA), 1 a 2 \mug de poli(dI-dC), DTT 50 mM, PMSF 0,5 mM y 1 a 2 \times 10^{4} c.p.m. de sondas marcadas con ^{32}P. Además, se utilizó una concentración de MgCl_{2} 6 mM para las reacciones de fijación a AP-1. En las muestras seleccionadas se incluyó un exceso 100 veces molar de sonda de ADN no marcada en la reacción de fijación con el fin de confirmar la especificidad de las interacciones ADN-proteína. Se separaron los complejos ADN-proteína de la sonda ADN no unida en geles de poliacrilamida al 4,5% en condiciones de fuerza iónica elevada en tris (hidroximetil)aminometano (Tris) 50 mM, glicina 0,4 M, EDTA 2 mM y 2,5% vol/vol de glicerol, pH 8,5.

Se realizó la electroforesis a 4ºC en una corriente continua de 20 mA. Se secaron los geles al vacío y se expusieron a la película a -70ºC durante 6 a 24 h en una pantalla intensificadora.

Como se muestra en la Figura 6, tiloxapol impide que la fijación de NF-\kappaB producida por IL-1\beta o H_{2}O_{2}, pero no la de AP-1 a los extractos nucleares. Se incubaron células epiteliales pulmonares A549 humanas confluentes sin (banda 1) o con 10 U/ml de IL-1\beta (bandas 2 y 3) o con H_{2}O_{2} 100 \muM (bandas 4 y 5). Se añadió tiloxapol (100 \mug/ml, bandas 3 y 5) al mismo tiempo que los estimulantes. Después de 3 horas de incubación, se prepararon extractos nucleares. Se incubaron alícuotas de los extractos con oligonucleótidos específicos para NF-\kappaB y para AP-1 marcados con ^{32}P y se analizaron en ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética como se detalló anteriormente. La posición de los complejos específicos ADN-proteína se indica con la punta de flecha. Un exceso molar de cien veces de sonda de ADN no marcada apropiada se incluyó en las reacciones de fijación para las muestras mostradas en las bandas de competición.

Así pues, tiloxapol inhibe la activación del factor de transcripción NF-\kappaB. Esta acción es específica, ya que la activación de otro factor de transcripción importante, AP-1, no fue afectada. El bloqueo de la activación de NF-\kappaB tendría la ventaja de reducir la producción celular de las citocinas pro-inflamatorias y de los factores de crecimiento, mejorando de este modo la inflamación en el tejido tratado.

Ejemplo V Supresión de la producción de citocinas por tiloxapol

La inhibición de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB es de esperar que reduzca la secreción de las citocinas pro-inflamatorias influida por NF-\kappaB. Como ejemplos, la caquexia y/o la anorexia prominente en pacientes con la enfermedad pulmonar fibrosis quística grave se produce por un aumento de la velocidad de transcripción génica de TNF y de la secreción por macrófagos de la fibrosis quística. (Véase K.D. Pfeffer, et al. "Expression and regulation of tumor necrosis factor in macrophages from cystic fibrosis patients". American Journal of Respiratory, Cell and Molecular Biology. (1993) 9:511-519). TNF es también un mediador importante en la patogénesis del asma (R.J. Horwitz y W.W. Busse. "Inflammation and asthma". Clinics in Chest Medicine (1995) 16:585-602). Tiloxapol debería mejorar los efectos desfavorables de TNF en la patofisiología de la fibrosis quística y asmática cuando se administra a pacientes de fibrosis quística o asmáticos porque, como se demuestra más adelante, es un potente supresor de la secreción de TNF por las líneas celulares monocito-macrófago. Al inhibir la secreción de TNF, tiloxapol debería también disminuir la resistencia corticosteroide en el asma producida en parte por esta citocina (P.J. Barnes, et al. "Glucocorticoid resistance in asthma". American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine (1995) 152:S125-S142). Asimismo, IL-8 es un potente quimioatrayente para los neutrófilos polimorfonucleares y desempeña una función prominente en la patogénesis de diversas enfermedades tales como la fibrosis quística, la bronquitis crónica, el síndrome disneico agudo del adulto y la psoriasis (véase, H. Nakamura et al. "Neutrophil elastase in respiratory epithelial lining fluid of individuals with cystic fibrosis induces interleukin-8 gene expression in a human bronquial epithelial cell line". Journal of Clinical Investigation (1992) 89:178-1484; N.G. McElvaney, et al. "Modulation of airway inflammation in cystic fibrosis". In vivo supresión of interleukin-8 levels on the respiratory epithelial surface by aerosolization of recombinant secretory leukoprotease inhibitor. Journal of Clinical Investigation (1992) 90:1296-1301; M. Baggiolini, et al. "Interleukin-8 and related chemotactic cytokines". En Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, segunda edición. J.I. Gallin, I.M. Goldstein y R. Snyderman, editores. Raven Press, Ltd., Nueva York (1992) págs. 247-263). Al inhibir la secreción de IL-8, tiloxapol debería mejorar la influencia de los neutrófilos en el tejido inflamado en estas enfermedades. Por último, GM-CSF es un factor de crecimiento importante que activa y prolonga la duración de la vida de los eosinófilos en el asma (D.W. Golde y G.C. Baldwin. "Myeloid growth factors". En Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, segunda edición. J.I. Gallin, I.M. Goldstein y R. Snyderman, editores. Raven Press, Ltd., Nueva York (1992) pág. 291-301; R.J. Horwitz y W.W. Busse. "Inflammation and asthma". Clinics in Chest Medicine (1995) 16:583-602). Al reducir la secreción de GM-CSF, tiloxapol debería ayudar a reducir la eosinofilia y sus consecuencias en las vías respiratorias de los asmáticos.

Para probar el efecto del tiloxapol sobre la secreción de citocinas, se prepararon monocitos por decantación centrífuga a partir de leucocompresas obtenidas de donantes sanos humanos. Se pusieron en suspensión monocitos purificados en 2 \times 10^{6} células en RPMI-1640 enriquecido con 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, 1% de aminoácidos MEM no esenciales, ácido N-2-hidroxietil-ierazina-N'-etansulfónico 25 mM (HEPES) y 196 Nutridoma (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y suero AB humano inactivado térmicamente, al 5% mezclado (Pel-freeze, Brown Deer, WI). Se añadió medio ml de esta suspensión celular a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido con fondo plano de 48 pocillos. Se añadieron los materiales de ensayo (diluidos en medio completo a 4 X de la concentración final deseada) en volúmenes de 250 \mul a cada pocillo. Los pocillos de referencia recibieron 250 \mul de medio completo o 250 \mul de IL-4 (diluido a 4 X de la concentración final deseada de 50 \mug/ml). Se determinó el tiloxapol por triplicado en cuatro concentraciones en presencia o ausencia de 100 ng/ml de lipopolisacárido de Salmonella typhosa (LPS, 250 \mul de la concentración final deseada 4X añadida) y se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% humectado durante 16 horas. En este momento se aspiraron los sobrenadantes del cultivo y las células no atacadas y se eliminaron los residuos celulares por filtración. Se determinó la liberación de TNF-\alpha, IL-1\beta, IL-6 e IL-8 y el factor de crecimiento GM-CSF en los sobrenadantes exentos de células utilizando análisis por captura ELISA. La concentración de endotoxina en todos los tampones y en tiloxapol fue inferior al nivel de detección (25 pg/ml). Las incubaciones de monocitos en concentraciones de tiloxapol iguales o inferiores a 100 \mug/ml se asociaron a aumentos significativos en la concentración de LDH en el sobrenadante, soportando una falta de citotoxicidad por tiloxapol y sugiriendo que la inhibición de la secreción de citocina observada más adelante no era debida a un efecto detergente nocivo en los monocitos.

Tolixapol no tuvo efecto sobre la liberación inicial de ningún mediador excepto para IL-8, pero la secreción de IL-8 disminuyó de forma significativa en las células no estimuladas (Figura 7). Sin embargo, la liberación de varios mediadores por los monocitos estimulados por LPS disminuyó de forma significativa a bajas concentraciones de tiloxapol. La secreción de TNF-\alpha, IL-1\beta, IL-6, IL-8 y GM-CSF disminuyó de forma significativa (p< 0,01) por tiloxapol en función de la dosis (Figura 8), con concentraciones eficaces para 50% de inhibición (oscilando EC_{50} entre 30 y 70 \mug/ml (Tabla IV, a continuación). Sin embargo, tiloxapol no cambió la liberación de PAF en monocitos estimulados por LPS, proporcionando pruebas adicionales de que el efecto de tiloxapol era selectivo en las citocinas influidas por NF-\kappaB.

TABLA IV Concentraciones eficaces de tiloxapol para la inhibición al 50% EC_{50} de liberación de citocina por monocitos

Citocina	EC_{50} (\mug/ml)
TNF-\alpha	30
IL-1\beta	60
IL-6	30
IL-8	70

Así pues, tiloxapol es un potente inhibidor de la secreción de citocinas pro-inflamatorias, resultado esperado de un agente terapéutico que inhibe el factor de transcripción NF-\kappaB. Como tal, es de esperar que tiloxapol ayude a mejorar la caquexia y/o anorexia de TNF, por ejemplo, en pacientes con fibrosis quística. Es de esperar también que tiloxapol en aerosol reduzca la lesión de las vías respiratorias de enfermedades de las vías respiratorias, tales como la fibrosis quística, el asma y la bronquitis crónica y difunda la inflamación y la lesión pulmonar, como por ejemplo en el síndrome disneico agudo del adulto, inhibiendo la producción local de los quimioatrayentes IL-8, TNF, IL-1, IL-6 y GM-CSF. Es de esperar que el tiloxapol tópico mejore las enfermedades inflamatorias de la piel tales como la psoriasis y la respuesta a la quemadura solar o térmica reduciendo la producción solar de las mismas citocinas. El resultado sería aún mejor si el tiloxapol se mezclase en una formulación con glucocorticoides, ya que inhibiendo NF-\kappaB por un mecanismo diferente que lo hace el complejo receptor glucocorticoide-GR, tiloxapol reduciría la resistencia a glucocorticoides antiinflamatorios relacionada con NF-\kappaB que produce citocinas, como se expuso anteriormente. La reducción de la resistencia esteroide potenciaría, a su vez, la actividad antiinflamatoria general de los glucocorticoides y potenciaría la mejora de la inflamación del compartimento corporal tratado. Tiloxapol actuaría asimismo incluso mejor si se mezcla algo de alcohol cetílico, añadido en 1 a 1,5 veces el peso de tiloxapol. La preparación de las muestras para la administración al paciente debería ser la misma que la descrita anteriormente, más preferentemente la inhalación de 3 ml de una solución isotónica 0,25 a 5,0% de tiloxapol en NaCl y agua, con o sin glucocorticoide antiinflamatorio mezclado mediante aerosol a chorro una vez al día.

Ejemplo VI

La formulación de ALEVAIRE de tiloxapol al 0,125%, NaHCO_{3} al 2% y glicerol al 5% en agua esterilizada fue ideada originalmente por Miller como un vehículo para la administración de estreptomicina por inhalación en niños con tuberculosis (Miller, J.B., H.A. Abramson y B. Ratner. 1950. Aerosol streptomycin treatment of advanced pulmonary tuberculosis in children. Am. J. Dis. Child. 80:207-237), se basó en el descubrimiento de que la combinación de bicarbonato de sodio y tiloxapol aumentaba la sensibibilidad a la estreptomicina in vitro. Miller y Boyer observaron entonces un efecto mucolítico de la primera formulación en un grupo de pacientes adultos con tuberculosis de quienes se describió que sus secreciones de las vías respiratorias difíciles de expectorar, espesas y viscosas se habían vuelto casi inmediatamente fluidas y acuosas durante la terapia con la formulación de tiloxapol/glicerol/bicarbonato de sodio (Miller, J.B. y E.H. Boyer: 1952. A nontoxic detergent for aerosol use in dissolving viscid bronchopulmonary secretions. J. Pediat. 40:767-771). A partir de este comienzo, la formulación de 0,125% de tiloxapol, 2% de NaHCO_{3} y 5% de glicerol, redenominada ALEVAIRE, difundió su utilización en la terapia mucolítica y recibió un NDA para esta utilización al principio de la década de 1950 (Tainter, M.L., F.C. Nachod y J.G. Bird. 1955. ALEVAIRE as a mucolytic agent. N. Engl. J. Med. 253:764-767). Como se describió al principio, la formulación fue retirada del mercado de los Estados Unidos en 1981.

Aún antes de su retirada del mercado, se publicaron pruebas de que la formulación ALEVAIRE de tiloxapol estaba asociada a efectos secundarios en algunos individuos. Páez y Miller estudiaron ALEVAIRE en 20 pacientes con pneumonía obstructiva crónica (Páez, P.N. y W.F. Miller. 1971. Surface active agents in sputum evacuation: a blind comparison with normal saline solution and distilled water. Chest 60:312-317). La función pulmonar no cambió tras inhalar los pacientes soluciones de salmuera normal, agua o Tergemist (2-etilexil sulfato de sodio al 0,125% y yoduro de potasio al 0,1%), pero cuatro pacientes desarrollaron pruebas de aumento de la obstrucción de las vías respiratorias después de inhalar ALEVAIRE. Posteriormente, Fevrier y Bachofen, utilizando un diseño doble a ciegas con cruce, estudiaron el efecto de ALEVAIRE o solución salina como soluciones de vehículo para la inhalación de beta agonistas en 24 pacientes con asma (Fevrier, D., y H. Bachofen. 1975. Vergleich von tyloxapol (Tacholiquin, ALEVAIRE) mit physiologischer koschsalzlosung als inhalationstragerluscungen. Schweiz. med Wschr. 195:810-815). Los autores midieron la conductancia específica en las vías respiratorias (la inversa de la resistencia en las vías respiratorias) durante un periodo de 2 horas tras la inhalación de 3 ml de solución de ensayo. La solución ALEVAIRE sin broncodilatador beta agonista produjo una disminución del 20% en la conductancia específica a los 20 minutos (p<0,05) que se resolvió completamente en 60 minutos. Así pues, la formulación de ALEVAIRE produjo claramente broncoespasmo después de la inhalación por individuos sensibles tales como los que padecen asma o reactividad de las vías respira-
torias.

Las soluciones hipertónicas de cloruro de sodio producen broncoconstricción en individuos asmáticos (Kivity, S., J. Greif, et al. 1986. Bronchial inhalation challenge with ultrasonically nebulized saline; comparison to exercise-induced asthma. Ann. Allergy 57:355-358). La inhalación de una solución de cloruro de sodio al 4% o cloruro de sodio al 1% y dextrosa al 18,3% (1.232 mOsm) puede producir también broncoconstricción (sibilancias) en pacientes normales (Eschenbacher, W.L., H.A. Boushey, et al. 1983. The effect of osmolarity and ion content of nebulized solutions on cough and bronchoconstriction in human subjects. Am. Rev. Respir. Dis. 1983:127:240). En los anillos bronquiales diseccionados del tejido pulmonar humano fresco, tampón hiperosmolar de Krebs-Henseleit (450 mOsm, más cloruro de sodio añadido) provoca una respuesta bifásica: una fase de relajación rápida (pico después de 5 min.) seguido de una fase de contracción lenta (pico después de 25 min.), con un aumento neto global en el tono de las vías respiratorias hasta aproximadamente dos veces el valor inicial (Jongejan, R.C., J.C. de Jongste, et al. 1991. Effect of hyperosmolarity on human isolated central airways. Br. J. Pharmacol. 102:931-937). La osmolaridad calculada de la solución original de ALEVAIRE es 1.019 mOsm, no diferente de la de la solución que se observa que produce broncoconstricción en pacientes normales (véase Eschenbacher, anteriormente). De la osmolaridad total, el NaHCO_{3} al 2% contribuye por cálculo a 476 mOsm, el 5% de glicerol contribuye a 548 mOsm y 0,125% de tiloxapol contribuye solamente a 0,2 mOsm. Para confirmar esto, se prepararon formulaciones de NaHCO_{3} al 2% y glicerol al 5% en agua, con y sin tiloxapol al 0,125%. Se midió la osmolaridad de estas soluciones directamente por la disminución del punto de congelación utilizando un micro-osmómetro de Advanced (Advanced Instruments, Norwood, MA). Ambas soluciones, con y sin tiloxapol midieron aproximadamente 985 mOsm. Así pues, tiloxapol, debido a su gran naturaleza y tamaño polimérico, contribuye poco a la osmolaridad de la solución a concentraciones farmacológicamente
útiles.

Las fórmulas de la presente invención se diseñaron, p. ej., para eliminar la hipertonicidad de la formulación original de Alevaire, utilizando en parte tiloxapol en NaCl entre el 0,8 y el 0,9%. Para aumentar su eficacia como terapia antioxidante y antiinflamatoria, se aumentaron las concentraciones de tiloxapol a concentraciones por encima de 0,125% desde aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5,0%.

La otra formulación en aerosol que contiene tiloxapol es EXOSURF Neonatal (Glaxo-Welcome). Cuando se redisuelve en agua esterilizada, EXOSURF contiene 13,5 mg/ml de DPPC, 1,5 mg/ml de alcohol cetílico y 1 mg/ml de tiloxapol en NaCl 0,1 N (una solución al 0,1% de tiloxapol). DPPC se elimina de las formulaciones de la presente invención. No es necesario para el antioxidante farmacológico para la acción antiinflamatoria de tiloxapol y, como se describió al principio, está relacionado con efectos secundarios indeseables que incluyen, pero no se limitan a, congestión mucosa de las vías respiratorias y obstrucción de los circuitos del respirador.

Las reivindicaciones adjuntas indican varias características nuevas y útiles de la invención.

Claims

1. Composición farmacéutica para su utilización en el tratamiento de trastornos respiratorios que comprende aproximadamente entre 0,25 y aproximadamente 5,0% en peso de tiloxapol y aproximadamente 0,1% de glicerol y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha composición es isotónica con el fluido que recubre las vías respiratorias de un paciente con un trastorno respiratorio, estando dicha composición sustancialmente exenta de bicarbonato de sodio y de cromogluconato de sodio.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho vehículo farmacéuticamente aceptable comprende aproximadamente entre 0,8 y aproximadamente 0,9% de cloruro de sodio en una solución tamponada o sin tamponar.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición presenta un pH comprendido entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7,4.

4. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además alcohol cetílico en una concentración entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1,5 de concentración de tiloxapol.

5. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una cantidad eficaz de un glucocorticoide para aumentar la eficacia del tratamiento.

6. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está sustancialmente exenta de dipalmitoilfosfatidilcolina.

7. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición está destinada al tratamiento de la inflamación producida por una enfermedad de las vías respiratorias y del pulmón.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que dicha enfermedad es la fibrosis quística, el asma, la bronquitis crónica o el síndrome de distrés respiratorio del adulto.

9. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composición está destinada al tratamiento de la inflamación producida por una enfermedad de la nasofaringe.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, en la que dicha enfermedad es la rinitis o la rinosinusitis.