ES2233118B1 - Sistema de administracion no intravenosa de un ligando especifico de celulas de epitelios, detectable por tecnicas de imagen y sus aplicaciones. - Google Patents
Sistema de administracion no intravenosa de un ligando especifico de celulas de epitelios, detectable por tecnicas de imagen y sus aplicaciones.Info
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Abstract
Sistema de administración no intravenosa de un ligando específico de células de epitelios, detectable por técnicas de imagen y sus aplicaciones. Se describe un sistema para la semicuantificación no invasiva, mediante pruebas de imagen, de subtipos celulares en epitelios humanos o animales, que utiliza ligandos específicos de moléculas de superficie características de dichas células, opcionalmente conjugados a sustancias intensificadoras de imagen, y dispensados a la zona epitelial mediante vehículos no intravenosos. Este sistema puede ser aplicado a la detección de células tumorales en epitelios de difícil acceso, u otras células asociadas a diversos procesos alérgicos, autoinmunes, rechazo de transplantes, etc. Los ligandos pueden utilizarse además con fines terapéuticos y experimentales. Se describe la aplicabilidad de este sistema en la detección y semicuantificación, mediante resonancia magnética, de linfocitos intraepiteliales intestinales con TcR-gamma/delta tras la ingesta de cápsulas que contienen anticuerpos anti-TcR-gamma/delta, para el diagnóstico no invasivo de la Enfermedad Celíaca.
Description
Sistema de administración no intravenosa de un
ligando específico de células de epitelios, detectable por técnicas
de imagen y sus aplicaciones.
Esta invención se encuadra en el sector técnico
de la Medicina (Inmunología, Gastroenterología), Medicina Física,
Sector Farmacéutico, Investigación Biomédica, Diagnóstico por
imagen.
La invención se refiere a un sistema de
administración no intravenosa de un ligando específico de células
de epitelios, susceptible de detección por técnicas de imagen, y a
sus aplicaciones con fines experimentales, de diagnóstico o
terapéuticos.
Los epitelios son las zonas más externas de las
mucosas, que son las áreas anatómicas de interfase entre dos
tejidos o entre el organismo y el medio externo. Existen numerosas
patologías que afectan a las mucosas, tanto en humanos como en
animales, patologías que se asocian a alteraciones celulares
características o específicas, y que muchas veces tienen una
patogenia o un componente inmunológico. Así, en las alergias,
enfermedades autoinmunes, neoplasias, infecciones, rechazo de
transplantes, etc., pueden frecuentemente reconocerse alteraciones
de elementos celulares de la mucosas y/o del epitelio. Por ejemplo,
respecto a entidades gastrointestinales humanas, se reconocen
alteraciones celulares en enfermedades neoplásicas de las mucosas
(las células aberrantes malignas, tanto linfoides como epiteliales,
y la respuesta celular característica que generan), en enfermedades
autoinmunes/autoagresivas (alteraciones en los Linfocitos
Intraepiteliales (LIE) y de la lámina propia en la Enfermedad
Celíaca (EC), en la Enfermedad Inflamatoria Intestinal, en el
rechazo de trasplante intestinal, en la enfermedad de injerto
contra hospedador (EICH)), en infecciones, en alergias alimentarias,
etc.
No sólo la mucosa digestiva se ve afectada por
entidades con implicación inmunológica (autoinmunes, alérgicas,
infecciosas, cancerosas), sino también el resto de las mucosas:
respiratoria (asma, rinitis, alergias por inhalación, carcinomas,
neumonías, etc.), génito-urinaria (endometriosis,
salpingitis, etc.), auditiva, ocular, etc.
En el diagnóstico de estas enfermedades, suele
recurrirse a un doble abordaje: un primer estudio indirecto y poco
invasivo que genera un primer diagnóstico de presunción o de
sospecha, y un segundo estudio directo de la mucosa.
Las pruebas iniciales de cribaje para obtener el
diagnóstico de sospecha consisten, generalmente, en la
determinación de marcadores asociados a cada enfermedad en fluidos
de acceso sencillo, como heces, orina, esputo o sangre (ejemplos:
autoanticuerpos en las enfermedades autoinmunes, marcadores séricos
de malignidad, etc.). Por ejemplo, para el diagnóstico de
presunción de la EC se determina la presencia sérica de anticuerpos
y autoanticuerpos, como los anti-gliadinas y
anti-endomisio (EMA), cuyo autoantígeno ha sido
recientemente caracterizado como la enzima transglutaminasa tisular
[Dieterich 1997], permitiendo el establecimiento de técnicas
específicas de detección de anticuerpos
anti-transglutaminasa (ATG) [León 2001a].
A pesar de la gran especificidad y sensibilidad
de algunos de estos estudios [León 2001b], en último término suele
ser necesario el estudio directo de la mucosa para detectar
alteraciones tisulares y/o celulares (células cancerosas,
alteraciones en la arquitectura de los tejidos, etc.) y establecer
un diagnóstico de confirmación. En ocasiones, la localización
anatómica de la mucosa a estudiar brinda un acceso sencillo a la
misma (nasal, oral, ocular, rectal, uretral, cervical uterina,
etc.), pero otras veces el estudio se complica por una
accesibilidad restringida: tubo digestivo, aparato respiratorio,
génito-urinario, etc. Para acceder a estas mucosas
y obtener muestras de las mismas, se realizan estudios endoscópicos
(introducción de un tubo flexible por orificios naturales del cuerpo
para poder visualizar y/o biopsiar zonas de difícil acceso),
laparoscópicos (introducción de instrumentos diagnósticos por
pequeños orificios realizados en la piel) e incluso intervenciones
quirúrgicas.
En la actualidad, existen pruebas de diagnóstico
por imagen (resonancia magnética nuclear (RMN), tomografía axial
computerizada (TAC), tomografía de emisión de positrones (PET),
radiología de rayos X, gammagrafía, etc.) que permiten la
visualización precisa de estructuras anatómicas, pero no ofrecen
información acerca de las características de las células que
integran los tejidos estudiados. Un avance hacia la especificidad de
estas pruebas lo ha constituido la utilización, fundamentalmente en
patología tumoral, de ligandos (generalmente anticuerpos) de
células cancerosas, marcados radiactivamente e inyectados por vía
intravenosa, que permiten la localización del tumor mediante
técnicas radiológicas. Este procedimiento presenta la desventaja de
someter al paciente a radiación de forma sistémica (afectando a la
totalidad del organismo al vehiculizarse los isótopos por vía
sanguínea).
La Enfermedad Celíaca (EC) es la patología
digestiva crónica más frecuente. Es muy prevalente en Occidente
(1/100-1/200 en Europa, 1/250 en Norteamérica) y es
asintomática en el 60% de los casos, por lo que se encuentra muy
infradiagnosticada. Se debe a una intolerancia frente al gluten,
componente importante de cereales habituales en la dieta occidental
(trigo, centeno, cebada). Esta intolerancia tiene consecuencias de
diversa índole, desde nutricionales por mal absorción, hasta
linfoma intestinal y de otras localizaciones
[Walker-Smith 1999]. También se denomina
Enteropatía Sensible al Gluten ya que este concepto engloba mejor a
las alteraciones inducidas por gluten de escasa repercusión
intestinal, como la Dermatitis Herpetiforme. En esta enfermedad, el
diagnóstico precoz es muy importante para evitar complicaciones, ya
que el correcto tratamiento (la retirada del gluten de la dieta)
elimina por completo la enteropatía y la susceptibilidad a las
complicaciones asociadas. El diagnóstico consta de un primer
estudio de cribaje (serológico, mediante la determinación de
autoanticuerpos [León 2001c]) y de una posterior confirmación
(mediante estudio histológico), que se requiere ya que un
diagnóstico de EC tiene una gran repercusión en la calidad de vida
del paciente al implicar la retirada del gluten de por vida. El
estudio histológico de la biopsia intestinal
(duodeno-yeyunal) de un celíaco muestra una
enteropatía característica: atrofia vellositaria con hiperplasia
críptica e incremento de la celularidad linfoplasmocitaria en la
lámina propia. Pero este cuadro no es en absoluto específico de la
EC, y muchas otras patologías lo pueden producir, como alergias,
infecciones, inflamaciones, etc. Es por ello que el diagnóstico de
confirmación de la EC puede requerir hasta de tres o más biopsias
del intestino delgado, para demostrar relación
causa-efecto entre la ingesta de gluten y la
enteropatía [Revised Criteria de la ESPGAN, 1990]. Estas biopsias
(al diagnóstico, tras una dieta sin gluten, tras una reintroducción
voluntaria del gluten con fines diagnósticos) han de ser practicadas
mediante cápsula duodenal o mediante endoscopia. El primero de estos
procedimientos supone la irradiación del paciente. El segundo es
muy molesto y no exento de
morbilidad.
morbilidad.
En un intento por aumentar la especificidad de
estos estudios histológicos, se han estudiado los Linfocitos
Intraepiteliales (LIE) de la mucosa duodeno-yeyunal
de pacientes celíacos, observándose alteraciones características de
esta enfermedad. Mediante técnicas de inmunohistoquímica y de
citometría de flujo [Eiras 1998, 2000], se ha constatado el aumento
de LIE totales y el descenso de LIE NK like, ambos dependientes de
la actividad de la enfermedad, y el incremento de la proporción de
LIE gamma-delta (\gamma\delta) [Spencer 1989,
Halstensen 1989], que es constante, es decir, presente en todas las
fases de la EC [Camarero 2000]. Las diferencias entre controles
sanos y pacientes celíacos en cuanto a LIE \gamma\delta son muy
apreciables. En términos relativos, respecto al total celular
epitelial, la media de LIE \gamma\delta en el epitelio
duodeno-yeyunal es <0,5% en sanos frente a un 6%
en celíacos activos, valores calculados mediante el análisis
fluorocitométrico de las células aisladas a partir de epitelio de
intestino delgado [León 2001c]. Mediante técnicas de
inmunohistoquímica se han evaluado también los valores absolutos,
apreciándose incluso mayores diferencias: 3 LIE
\gamma\delta/mm^{2} de epitelio en sanos (rango
0-8,5) frente a 42 en celíacos activos con atrofia
total (rango 15-83) [Kolho 1998]. Estas diferencias
tienen lugar en ambos sexos y tanto en la infancia [Eiras 1998,
Camarero 2000, León 2001c] como en la edad adulta [León 2001c], ya
que los valores de LIE \gamma\delta se mantienen relativamente
constantes con el desarrollo del individuo.
La cuantificación de LIE \gamma\delta,
mediante inmunohistoquímica o citometría de flujo (más sensible y
específica), si bien no evita la realización de una primera biopsia
para diagnosticar la EC, sí permite reducir la necesidad de
biopsias ulteriores [León 2001c], dada la gran capacidad predictiva
positiva de la EC de este parámetro, del 88% en niños y del 82% en
adultos [León 2001c]. Además, el incremento de LIE \gamma\delta
es el primer evento detectable en la EC, siendo previo al incremento
de LIE totales, al descenso de LEE NK-like y a todas
las alteraciones posteriores de la arquitectura vellositaria [León
2001c]. En ocasiones muy infrecuentes, se ha observado un aumento de
LIE \gamma\delta en otro tipo de patología, como la alergia
alimentaria [Kokkonen 2000], la enfermedad inflamatoria intestinal o
alguna parasitosis. En estos casos la serología suele ser suficiente
para el diagnóstico diferencial, porque esas entidades no presentan
positividad de anti-endomisio. Aún así, la
determinación de LIE NK-like puede ser también de
mucha utilidad, ya que su presencia en el epitelio prácticamente
descarta una EC por su gran valor predictivo negativo, de >95%
[León 2001c]. A pesar de la gran especificidad del incremento de LIE
\gamma\delta y de la gran sensibilidad del descenso de LIE
NK-like, en el diagnóstico de la EC, estos datos no
se utilizan aún habitualmente en el diagnóstico clínico al no evitar
la realización de una biopsia intestinal.
La combinación de los avances serológicos y
celulares en el diagnóstico de la EC permite alcanzar un alto grado
de eficacia (sensibilidad y especificidad del 99%) mediante la
determinación de tan sólo dos parámetros: la presencia de EMA/ATG y
la cuantificación de LIE \gamma\delta [León 2001c].
Por tanto, un objeto de la presente invención es
proporcionar una técnica que permita la
semi-cuantificación de los LIE \gamma\delta de
forma no invasiva, permitiendo el diagnóstico mínimamente invasivo
de la EC. Para ello, se emplearían ligandos específicos de los LIE
\gamma\delta, marcados con intensificadores de imagen y
administrados vía oral en vehículos protectores. Esta misma
tecnología puede ser útil para la
semi-cuantificación de cualquier tipo celular
presente en el epitelio intestinal u otros epitelios. Así, en el
diagnóstico de la EC, también sería de utilidad la detección de LIE
NK-like, en los casos de neoplasia, se podrían
detectar las células tumorales, y en los casos de alergia, rechazo
de transplantes, EICH o enfermedades autoinmunes se podría
identificar la presencia de células asociadas a estas entidades, por
ejemplo, la presencia de la isoforma de 130 kDa de CD43 en la EICH
murina [Bagriacik 1993].
Además, el acceso no invasivo a estas células
podría ser de utilidad terapéutica en el futuro, mediante la
conjugación de los ligandos a toxinas. Por ejemplo, en la EC si se
confirman las hipótesis que implican a los LIE \gamma\delta en
su patogenia [León 2001c]. Este abordaje podría emplearse en la
destrucción de cualquier tipo celular epitelial deseado en patología
autoinmune, alérgica o tumoral.
Cada día cobra mayor relevancia el uso de
anticuerpos en el diagnóstico y la terapéutica de patología humana.
En el campo del diagnóstico, existen múltiples anticuerpos, tanto
policlonales como monoclonales, con aplicación en técnicas in
vitro de inmunohistoquímica, ELISA, RIA, citometría de flujo,
etc., tras su conjugación a moléculas fluorescentes o a enzimas que
producen color al actuar sobre un sustrato. En la vertiente
terapéutica, comienzan a utilizarse con éxito anticuerpos
monoclonales (generados en ratón en la mayoría de las ocasiones),
más o menos "humanizados" mediante ingeniería genética para
evitar reacciones heterólogas. Estos anticuerpos se preparan
generalmente para reconocer moléculas características de células
tumorales, e inducen una reacción inmunológica frente a las mismas.
En otras ocasiones, son conjugados a productos tóxicos y casi
siempre se trata de preparados endovenosos. No se conocen aún
antígenos específicamente tumorales, por lo que estos anticuerpos
tienen efectos secundarios derivados de su actuación sobre células
sanas (se distribuyen por todo el organismo al ser administrados por
vía intravenosa), además de las complicaciones propias de esta vía
de administración (reacciones anafilácticas o por inmunocomplejos,
etc.). Existen ejemplos del uso de anticuerpos monoclonales en el
diagnóstico médico in vivo, que se ha centrado en la
detección de metástasis tumorales mediante anticuerpos conjugados a
compuestos radiactivos, tal como se describe a continuación.
Existen aplicaciones de ligandos magnéticos y
radiactivos para la detección in vitro de antígenos, y
también métodos que aplican estos conjugados al diagnóstico por
imagen in vivo, siendo en su mayor parte compuestos
radiactivos (radionúclidos) inyectados por vía intravenosa o
intrarterial para su localización en áreas tumorales. Los
anticuerpos policlonales se vienen usando desde los años 60, y los
monoclonales desde los 80. La mayoría son anticuerpos frente a
antígenos de membrana, aunque también existen frente a moléculas
intracelulares [Epstein Allan 1999, US5882626]. Otros son
específicos de un tejido, como los descritos para la visualización
de tejido linfático [Goldenberg 1992, US5101827].
Respecto al uso de anticuerpos susceptibles de
ser detectados por resonancia magnética, se han descrito, por
ejemplo, partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos para
facilitar el reconocimiento in vitro de antígenos
específicos [Loeligher 1994, DE42228395], anticuerpos
ferromagnéticos para ser inyectados como contraste de RMN [Oehr
et al, DE3744518], y también se ha descrito el uso de
anticuerpos marcados para el rastreo por RMN de células previamente
tratadas con esos anticuerpos y reinfundidas a un ser humano in
vivo [Bulte et al, WO 00/71169 A2]. En esta última
patente se reivindica el uso intravenoso de anticuerpos dirigidos
contra moléculas de superficie internalizables, conjugados a
compuestos súper-paramagnéticos para poder
monitorizar por resonancia magnética la localización de las células
diana [Bulte et al, WO 00/71169 A2]. Con esta técnica se han
detectado in vivo, sobre animales de laboratorio, células
marcadas en cantidades tan bajas (respecto al total de un organismo
de un mamífero) como de 10^{5} células.
En la actualidad existe un desarrollo industrial
de vehículos de administración no intravenosa como cápsulas
(gelatinosas o de otra composición) capaces de proteger su
contenido (un fármaco generalmente) durante el paso gástrico, y
liberarlo en el intestino delgado. Por ejemplo, cápsulas que se
gelifican a pH neutro tras mantenerse sólidas durante su contacto
con el medio ácido gástrico [Omura T, EP1053752]. También existen
aerosoles y otras formas de dosificación que permiten la
administración de sustancias al árbol bronquial, etc.
Es conocido que en la EC existe una aumento de
LIE \gamma\delta muy característico [Camarero 2000, León
2001c], y que esta frecuente enfermedad precisa hoy en día de
técnicas diagnósticas invasivas. La (semi)cuantificación de
LIE \gamma\delta (cuya densidad es 12-20 veces
mayor en celíacos que en no celíacos) mediante técnicas no invasivas
permitiría, en combinación con la determinación de anticuerpos
séricos asociados a la EC, alcanzar el diagnóstico en un 99% de los
pacientes celíacos. Para ello se describen ligandos específicos de
moléculas de superficie de estos LIE, marcados con intensificadores
de imagen y administrables vía oral para su detección por
Resonancia Magnética Nuclear.
Esta metodología podría aplicarse también a la
detección de otros tipos celulares o fenotipos particulares
asociados a situaciones y enfermedades concretas, como la alergia,
el cáncer, el rechazo de transplantes, la EICH, infecciones, etc.,
y, también, para vehiculizar agentes farmacológicos hacia una
localización preferida, con selectividad para la célula diana a
eliminar.
Por tanto, la invención proporciona un sistema de
administración no intravenosa de un ligando específico de moléculas
de membrana características de células de cualquier epitelio, con
propiedades susceptibles de detección por técnicas de imagen (o
conjugados a partículas con dichas propiedades) que comprende dicho
ligando vehiculizado en un vehículo de administración no
intravenosa.
El ligando, además, no debe ejercer un efecto
biológico indeseado sobre la célula diana (por ejemplo, el ligando
no debe ser activador o inductor de proliferación si la diana es una
célula maligna o efectora de un proceso autoinmune). La conjugación
del ligando al intensificador de imagen puede realizarse por
diversos métodos químicos y bioquímicos en función al ligando y
conjugado empleados.
En una realización particular, dicho ligando es
un anticuerpo (monoclonal, policlonal) o un fragmento del mismo, u
otro tipo de molécula, por ejemplo, un polímero, una
biomacromolécula, etc., y, en general, cualquier sustancia no tóxica
capaz de ser acoplada a los intensificadores de imagen por sus
propiedades reactivas (con grupos amino terminales, etc...).
La célula diana, en una realización particular,
es de estirpe linfoide (como los LIE \gamma\delta) o de otra
estirpe celular epitelial, como los enterocitos, incluyéndose
también como dianas, a efectos de la presente invención, a bacterias
y virus.
Las mucosas sobre las que puede aplicarse la
invención pueden ser tanto humanas como animales.
El ligando, o los compuestos conjugados a él,
pueden ser (i) magnéticos, paramagnéticos o
súper-paramagnéticos; (ii) radionúclidos; o (iii)
compuestos radio-opacos. En general, cualquier
compuesto cuyas propiedades induzcan una intensificación
("enhancing") de la señal detectable por técnicas de imagen,
preferentemente, no radiantes.
El vehículo de administración no intravenosa
puede ser una cápsula (por ejemplo, de protección frente a un pH
extremo y liberación a un pH predeterminado), una pastilla, un
líquido ingerible, una suspensión inhalable, un supositorio, una
espuma, etc.
Las técnicas de imagen para su detección pueden
ser: RMN, TAC, PET, fluoroscopia, radiografía convencional,
ecografía, escintigrafía con gammacámaras o SPECT, ecografía,
ultrasonido, Doppler, etc.
En una realización particular, terapéutica, de
esta invención, se contempla la posibilidad de conjugar dicho
ligando a una toxina y/o un agente farmacológico para el tratamiento
de aquellas patologías que esta técnica permite diagnosticar,
siempre que sea conocida la célula responsable, lo que ya ocurre
con carcinomas, linfomas, etc.
En una realización particular y preferida, la
invención proporciona un anticuerpo monoclonal
anti-TcR gammadelta (u otra estructura de membrana
específica de linfocitos gammadelta humanos), no estimulante,
conjugado a partículas súper-paramagnéticas,
vehiculizado en cápsulas de protección gástrica.
La Figura 1 ilustra la detección de LIE
\gamma\delta mediante marcaje intra-biopsia con
anti-TcR \gamma\delta. El panel A muestra una
representación biparamétrica ("dot plot") de
tamaño/granularidad (FSC/SSC) y CD45/SSC de las células obtenidas
por desepitelización tras el marcaje intrabiopsia. El marcaje con
CD45 permite la correcta identificación de los LIE y el trazado de
una ventana de análisis sobre la cual se realizarán los cálculos
posteriores. En el panel B se muestran unos histogramas de la
intensidad de la fluorescencia emitida por los LIE de la ventana de
análisis del panel A, en el canal FL 1 (para detectar el fluorocromo
FITC), tras la tinción con el anticuerpo irrelevante IgGl y el
anti-TcR \gamma\delta marcados ambos
intra-biopsia. Se aprecia la tinción específica de
los LIE \gamma\delta.
La Figura 2 ilustra la detección de LIE
\gamma\delta mediante marcaje intra-biopsia con
anti-TcR \gamma\delta conjugado a un polímero
paramagnético. El panel A muestra una representación biparamétrica
("dot plot") de tamaño/granularidad (FSC/SSC) y CD45/SSC de las
células obtenidas por desepitelización tras el marcaje
intrabiopsia. En el panel B se muestran unos histogramas de la
intensidad de la fluorescencia emitida por los LIE en el canal FL1
(para detectar el fluorocromo FITC), tras la tinción con el
anticuerpo irrelevante IgGl y el anti-TcR
\gamma\delta conjugado a polímeros paramagnéticos, marcados
ambos intra-biopsia. Se aprecia la tinción
específica de los LIE \gamma\delta con este reactivo.
La invención proporciona un sistema de
administración no intravenosa de un ligando que comprende un
ligando específico de células de epitelios, susceptible de detección
por técnicas de imagen vehiculizado en un vehículo de
administración no intravenosa.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "ligando específico de células de epitelios, susceptible
de detección por técnicas de imagen", en adelante ligando de la
invención, se refiere a una molécula capaz de interaccionar
específicamente con otra molécula de una célula epitelial,
detectable por técnicas de imagen, bien por sus propiedades
intrínsecas, o bien por estar conjugado a sustancias
intensificadoras de imagen que posean esas propiedades.
A modo ilustrativo, el ligando de la invención es
un anticuerpo o un fragmento del mismo, o cualquier otro tipo de
compuesto que satisfaga las condiciones mencionadas previamente, y,
en general, cualquier sustancia no tóxica capaz de ser acoplada,
opcionalmente, a una sustancia intensificadora de imagen.
En una realización particular, el ligando de la
invención es un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico de
células de epitelio, de cualquier tipo (monoclonal o policlonal) y
de cualquier clase (por ejemplo, IgG o cualquier otra clase o
subtipo), opcionalmente conjugado a una sustancia intensificadora
de imagen. Los anticuerpos útiles para la puesta en práctica de la
presente invención pueden ser generados por cualquiera de las
técnicas convencionales de obtención de anticuerpos policlonales o
monoclonales frente a antígenos de superficie [Current Protocols in
Immunology 1997]. En general, el antígeno contra el que se quiere
generar el anticuerpo se purifica a partir de células diana, por
ejemplo, LIE \gamma\delta, LIE NK-like o células
tumorales, o bien se genera in vitro por tecnología
recombinante. Los anticuerpos monoclonales, preferidos frente a los
policlonales, pueden ser generados en el bazo de animales de
laboratorio (por ejemplo, ratones) inmunizados con el antígeno en
cuestión (por ejemplo, TcR-\gamma\delta, o
CD122 en el caso de los LIE NK-like), tras lo cual
los esplenocitos se fusionan con células de mieloma, creándose un
hibridoma. Estas células fusionadas se cultivan selectivamente en un
medio de cultivo y los sobrenadantes se evalúan en función a su
contenido de anticuerpos específicos, siendo expandidos los cultivos
positivos. Los anticuerpos policlonales también se pueden obtener
mediante inmunización y posterior purificación a partir del plasma
del animal inmunizado. Los fragmentos de anticuerpos, como los
F(ab')2, que no activan el sistema del complemento, pueden
ser generados mediante la digestión con pepsina de los anticuerpos y
separados de estos mediante cromatografía.
La clase de inmunoglobulina preferida para la
invención es la G (IgG), pero cualquier clase o subtipo de
inmunoglobulina puede ser válido si poseen la suficiente afinidad y
capacidad de difusión a través del moco intestinal.
En general, se prefieren anticuerpos
"humanizados" o quiméricos, por su menor capacidad
inmunogénica.
En una realización particular de esta invención,
el ligando de la invención es un anticuerpo monoclonal
anti-TcR \gamma\delta, opcionalmente conjugado a
una sustancia intensificadora de la imagen, útil para el diagnóstico
de EC.
Alternativamente, el ligando de la invención
puede ser cualquier otro tipo de compuesto no tóxico, específico de
células de epitelio, susceptible de detección por técnicas de
imagen, opcionalmente conjugado a una sustancia intensificadora de
imagen, por ejemplo, un polímero, una hormona, una enzima, un
nutriente, una biomacromolécula, un lípido, etc., y, en general,
cualquier sustancia no tóxica capaz de ser acoplada a una sustancias
intensificadora de imagen por sus propiedades reactivas (por
ejemplo, con grupos mino terminales, etc.). En una realización
particular, dicho ligando de la invención puede ser un ligando
específico dependiente del receptor o molécula selectivo de las
células a estudiar, por ejemplo, el lipoarabinomanano para los
linfocitos \gamma\delta, lectinas, tetrámeros de HLA con un
péptido, etc.
El ligando de la invención puede ser un ligando
natural (aunque no necesariamente) de un antígeno diana. El ligando
de la invención no debe ejercer ningún efecto biológico indeseado
sobre las células diana, por ejemplo, el ligando de la invención no
debe ser activador ni inductor de proliferación si la célula diana
es una célula maligna o efectora de un proceso autoinmune,etc.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "célula diana" de un ligando de la invención incluye
tanto a células humanas o animales, normales o alteradas (por
ejemplo, tumoral o maligna), epiteliales en cuanto a su
localización (en cualquier epitelio, tal como digestivo (en
cualquier región del tracto digestivo), respiratorio,
génito-urinario, auditivo, ocular, etc.), pero
pudiendo pertenecer a cualquier estirpe celular (linfoide, mieloide,
estromal, etc.), como a cualquier microorganismo, por ejemplo,
bacterias (comensales o patógenas), virus, priones, etc. Es
importante que los ligandos de la invención no sean estimuladores de
las células diana. En el caso de células cancerosas y
autorreactivas, por motivos obvios, y en el caso de la EC, porque el
conocimiento actual de su patogenia no permite saber si los LIE
\gamma\delta son protectores o patogénicos. Por ello, los
ligandos de la invención deben evaluarse in vitro sobre LIE u
otras células diana aisladas y sobre biopsias, previamente a su uso
in vivo.
Las moléculas diana de los ligandos de la
invención se encuentran, en general, en la membrana celular de las
células diana (por ejemplo, TcR \gamma\delta o CD122), aunque
también pueden encontrarse en el interior del citoplasma de forma
simultánea o alternativa, y pueden ser de cualquier tipo de antígeno
fisiológico (por ejemplo, receptores hormonales o de otro tipo,
lipoarabinomanano, lectinas, etc.), o de antígenos característicos
de un estado celular (por ejemplo, antígenos de activación, de
memoria, etc.), o de antígenos aberrantes o expresados de forma
aberrante (por ejemplo, un antígeno tumoral, etc.), o combinaciones
de antígenos (por ejemplo, HLA con un péptido, antígenos
conformacionales formados por varias moléculas de membrana,
etc.).
En general, respecto a dichas moléculas diana, se
prefieren aquellas moléculas diana específicas de la estirpe
celular a semicuantificar (por ejemplo, el TcR \gamma\delta de
los LIE \gamma\delta) o aquellas que son muy características de
la célula diana (por ejemplo, el CD 122 de los LIE
NK-like), o bien un determinado subtipo de HLA para
detectar células en virtud de su reactividad funcional, un antígeno
tumoral (aquellos sobreexpresados en neoplasias), moléculas de
activación, variantes de splicing de moléculas de superficie,
etc.
Una característica del ligando de la invención es
que es susceptible de detección por técnicas de imagen, ya sea por
sus propiedades intrínsecas, por ejemplo, anticuerpos
ferromagnéticos, o por estar conjugado a sustancias, tales como
sustancias o moléculas intensificadoras de imagen, que posean esas
propiedades. En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "sustancias o moléculas intensificadoras de imagen" se
refieren a unas sustancias o moléculas que, al ser conjugadas al
ligando de la invención, se convierten en un "contraste
dirigido". A modo ilustrativo, dichas sustancias intensificadoras
de imagen pueden ser:
- a)
- sustancias intensificadoras de la señal de RMN: que incluyen cualquier compuesto que alargue el "tiempo de relajación" del agua o de otra molécula susceptible de ser utilizada en RMN, por ejemplo, (i) sustancias magnéticas, que pueden ser detectadas por RMN, tras ser conjugadas a los ligandos, en forma preferiblemente organometálica: gadolinio y hierro (los más empleados), cobre, cromo, etc., (ii) sustancias paramagnéticas y súper-paramagnéticas, preferibles por ser inocuas, de las que existen varios tipo descritos e incluso algunos comercializados; en una realización particular, dichas sustancias son intensificadoras de la señal de RMN se seleccionan entre micropartículas de óxido ferroso súper-paramagnéticas [Weissleder 1990], nanocompuestos microcristalinos de óxido ferroso [Shen 1993] y otros compuestos ferrosos [Molday 1982, Hasewaga et al EP 0656368 A1]; en general, estos compuestos tienen un potente efecto de reducción del tiempo de relajación spin-spin (T_{2}*), disminuyendo la intensidad de la señal en T_{2}* MRI ("magnetic resonance imaging");
- b)
- radiomarcadores: aunque éstos tienen la desventaja de la radiación del paciente; cualquier radionúclido de uso médico, por ejemplo, Tc-99m, I-123, I-125, In-111, In-113m, Ga-67, u otros emisores gamma, puede utilizarse en la puesta en práctica de la presente invención; o
- c)
- materiales radio-opacos: por ejemplo, compuestos y derivados de iodo, bario, galio, talio, etc.
La conjugación de dichas sustancias
intensificadoras de imagen al ligando de la invención puede
realizarse por técnicas convencionales. Se conocen diversas técnicas
para la conjugación de anticuerpos y otros ligandos a marcadores o
trazadores (utilizados en diagnóstico y localización de células) y
a agentes farmacológicos (utilizados en terapias dirigidas). Aunque
están comercializados diversos kits que permiten la unión de una
sustancia paramagnética a un anticuerpo, generalmente mediante un
"puente" constituido por otro anticuerpo intermediario (su uso
se ilustra en los ejemplos de la invención), estos sistemas no son
los preferidos y se prefiere la conjugación directa del anticuerpo
o ligando a la sustancia intensificadora de imagen.
En función del ligando y conjugado empleados, se
utilizará la técnica de conjugación adecuada para cada combinación.
A modo ilustrativo, la conjugación del ligando de la invención a
sustancias magnéticas o paramagnéticas puede realizarse mediante la
activación de dichas sustancias intensificadoras de imagen con
p-tolueno sulfonil cloruro, que permite la unión
química a proteínas. Esta es la técnica que se utiliza para conjugar
ciertas esferas paramagnéticas a anticuerpos de forma industrial
(Dynal AS, Noruega). La conjugación del ligando de la invención a
radionúclidos y contrastes puede realizarse mediante iodinación,
para conjugar radionúclidos o para conseguir radiopacidad [Milis
1986, Pimm 1982], o mediante la conjugación con
benzil-EDTA o -DPTA de radionúclidos, etc. Asimismo,
la conjugación a enzimas, proteínas y otras moléculas se puede
conseguir mediante ésteres reactivos intermedios (por ejemplo, la
conjugación de metotrexato a anticuerpos [Deguchi 1986]), mediante
el empleo de un pH adecuado (por ejemplo, para la unión de
clorambucil a anticuerpos [Ghose 1975]), etc. La técnica de imagen,
en función de la sustancia intensificadora de imagen, puede ser, por
ejemplo, Resonancia Magnética Nuclear (en cualquiera de sus
variantes, como imagen o espectroscopia), Tomografía Computerizada,
Tomografía de emisión de positrones, fluoroscopia, radiografía o
radiología de rayos X, ecografía, gammagrafía, escintigrafía con
gammacámaras o SPECT, ecografía, ultrasonido, Doppler, etc.
La intensidad de la señal producida por la
sustancia intensificadora de imagen, tras la unión de los ligandos
de la invención a las moléculas para las que son específicos será
proporcional a la presencia de las células diana en el epitelio
estudiado. El tiempo y modalidad de adquisición de datos variará en
función a la técnica de imagen utilizada, el territorio estudiado,
la vía de administración y la cinética de distribución del ligando
en el epitelio, etc. En función a la sustancias intensificadora de
imagen elegida, podrá detectarse específicamente la presencia de las
células deseadas o del fenotipo asociado a una enfermedad, mediante
las siguientes técnicas: RMN (la preferida por no ser radiante), TAC
convencional y helicoidal, PET, fluoroscopia, radiografía
convencional, ecografía, escintigrafía con gammacámara o SPECT,
ecografía, ultrasonido, Doppler, etc.
La técnica preferida es la RMN. En los últimos 2
anos se han descrito varios métodos de imagen por RMN (MRI,
magnetic resonance imaging), más sensibles y resolutivos
espacialmente que otra técnica también utilizada, la Espectroscopia
por Resonancia Magnética (MRS), y que han permitido investigar
sistemas biológicos intactos (ex vivo o in vivo con
modelos animales) [Weissleder 2000, Louie 2000, LeWin 2000, Zhao
2001].
Para obtener una medición puede sustraerse una
imagen negativa, producida con un agente de contraste inespecífico,
de otra positiva producida con el agente específico. O bien, en la
modalidad preferida, se usaría sólo el trazador específico y se
fijaría un umbral mediante el análisis de sujetos control.
Los datos se adquieren en un lapso breve de
tiempo, aunque algo mayor en el caso de la RMN frente a otras
técnicas más rápidas como la TAC que, sin embargo, ofrece menor
resolución espacial que la MRI. Pueden medirse los tiempos de
relajación en T1 o en T2, por ejemplo mediante secuencias de
spin-echo de Hahn o CPMG, para medir T2 (el tiempo
de relajación más afectado por las partículas ferromagnéticas).
Tras la adquisición de datos, se procesarían en una estación de
análisis mediante un software específico que corrigiese los errores
inducidos por el movimiento peristáltico de la pared intestinal,
para producir una cifra (semi)cuantitativa de LIE
\gamma\delta o de cualquiera que fuese la célula o marcador
diana.
El alto grado de sensibilidad obtenido en la
detección de células específicas (por ejemplo, apoptóticas) en
modelos animales con MRI de alto campo [Zhao 2001] hace prever que
la presente invención es técnicamente viable con los anillos
convencionales de campo clínico, y que el aumento previsto de su
potencia en el futuro contribuirá a incrementar su sensibilidad.
El ligando de la invención puede utilizarse,
además de para fines experimentales o de diagnóstico, con fines
terapéuticos. En este caso, el ligando de la invención puede
conjugarse a toxinas y/o a agentes farmacológicos en lugar de (o
además de) a trazadores o sustancias intensificadoras de imagen,
para la administración selectiva, no intravenosa, de dichos agentes
a las células diana. En esta realización particular de la invención,
dado que los agentes farmacológicos y/o las toxinas empleadas son
generalmente tóxicas, este abordaje permitiría la eliminación
selectiva de las células diana, minimizando el efecto secundario
sistémico de las toxinas. A modo ilustrativo, no limitativo, dichas
toxinas o agentes farmacológicos pueden ser agentes antineoplásicos
(por ejemplo, inhibidores de folatos, análogos de nucleósidos,
agentes alquilantes, antibióticos, otros agentes
antiproliferativos, etc.), toxinas (por ejemplo, tetánica,
diftérica, etc.), modificadores de respuesta biológica
(IL-2 y otras interleucinas, factores de necrosis
tumoral, interferones y otras citocinas, vasodilatadores, etc.),
compuestos radiosensibilizantes, radionúclidos \alpha o
\beta-emisores,
etc.
etc.
El vehículo en el que se vehiculiza el ligando de
la invención ejerce una función protectora de dicho ligando además
de una función de administración del mismo. En general, dicho
vehículo puede ser cualquier vehículo de administración no
intravenosa aplicable sobre una mucosa o epitelio. Dicho vehículo
se elige en función de la mucosa donde se desee aplicar el ligando
de la invención, por ejemplo, se pueden utilizar cápsulas,
supositorios, espumas, etc. si se desea administrar dicho ligando
en la mucosa gastro-intestinal; cremas para la
mucosa génito-urinaria; soluciones para la mucosa
ocular; suspensiones inhalables para la mucosa respiratoria
(nebulizadas), etc.
A modo ilustrativo, no limitativo, dicho vehículo
de protección y administración del ligando de la invención puede
ser un vehículo de liberación controlada, una cápsula (de cualquier
tipo y composición; por ejemplo, de protección de pH extremo y
liberación a pH predeterminado), una pastilla, un liposoma, un
líquido ingerible, una suspensión inhalable, un supositorio, una
espuma, una crema, un aerosol, etc., en general, cualquier vehículo
de administración no parenteral, preferentemente, un vehículo de
administración enteral (oral o rectal). En una realización
particular, dicho vehículo es una cápsula que gelifica a pH neutro
tras mantenerse sólida durante su contacto con el medio ácido
gástrico [Omura et al, EP1053752].
El sistema de administración de la invención
puede contener, además del ligando de la invención, un tampón de
conservación, por ejemplo, un tampón convencional a pH fisiológico,
por ejemplo, tampón fosfato salino (PBS), pero sin la presencia de
azida u otro preservativo tóxico, por lo que los ligandos de la
invención habrán de mantenerse en condiciones estériles.
El sistema de administración de la invención
puede ser utilizado con fines experimentales, de diagnóstico y/o
terapéutico, de patologías humanas o animales con repercusión
epitelial, en particular, la EC o enteropatía sensible al gluten (en
cualquiera de sus formas), pero también otros procesos autoagresivos
(como la enfermedad inflamatoria intestinal), así como en la
detección de células tumorales u otras células asociadas a procesos
alérgicos, autoinmunes, infecciosos, rechazo de transplantes,
etc.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit
que comprende un sistema de administración de la invención. En una
realización particular, dicha sistema de administración de la
invención comprende un anticuerpo conjugado a una sustancia
súper-paramagnética, o a un magnetodendrímero, etc.
El kit proporcionado por esta invención puede incluir, además,
soluciones, agentes preservativos, contenedores estériles, etc.
En una realización particular y preferida, el
sistema de la invención comprende un ligando de la invención
seleccionado entre un anticuerpo monoclonal anti-TcR
\gamma\delta, una molécula específica de linfocitos
\gamma\delta humanos y una molécula característica de linfocitos
\gamma\delta humanos, no estimulante, conjugado a partículas
súper-paramagnéticas de óxido ferroso (por ejemplo,
MION-46L) y vehiculizado en cápsulas de protección
gástrica, útil en el diagnóstico de la EC mediante RMN.
La invención también proporciona un método para
la semicuantificación no invasiva, mediante pruebas de imagen, de
subtipos celulares en epitelios humanos u animales, mediante el
empleo de un sistema de administración de la invención que contiene
un ligando de la invención, comprendiendo dicho ligando un
compuesto específico de moléculas de superficie características de
los elementos celulares a estudiar (células de epitelio),
opcionalmente, conjugado a una sustancia intensificadora de imagen.
El ligando de la invención se dispensa sobre la zona epitelial a
estudiar mediante vehículos no intravenosos adecuados, y, tras la
unión específica del ligando a la célula o moléculas diana, estas
pueden ser semi-cuantificadas mediante técnicas de
imagen, por ejemplo RMN u otras citadas previamente. Este método
puede ser aplicado a la detección de células tumorales en epitelios
de difícil acceso, u otras células asociadas a diversos procesos
alérgicos, autoinmunes, rechazo de transplantes, etc. El método de
la invención también puede ser utilizado con fines terapéuticos o
experimentales. Más adelante se describe con detalle la
aplicabilidad de la metodología proporcionada por esta invención en
la detección y semicuantificación, mediante RMN, de linfocitos
intraepiteliales intestinales con
TcR-\gamma\delta tras la ingesta de cápsulas
conteniendo anticuerpos
anti-TcR-\gamma\delta, para el
diagnóstico no invasivo de la EC.
Partiendo del conocido incremento de LIE
\gamma\delta en el epitelio del intestino delgado proximal
(duodeno, yeyuno) en la EC, casi patognomónico, y aprovechando
también la mayor densidad de moléculas de
TcR-\gamma\delta en los LIE \gamma\delta de
celíacos respecto a controles (observación personal), el modo de
realización preferido de la presente invención se refiere al uso de
anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, conjugados a
compuestos súper-paramagnéticos para su
administración por vía oral.
Se pueden generar anticuerpos monoclonales
anti-TcR \gamma\delta mediante inmunización de
ratones con moléculas purificadas de TcR \gamma\delta^{+}. A
continuación, se seleccionan aquellos clones no estimulantes de los
LIE TcR, \gamma\delta^{+}. mediante ensayos que demuestren que
el contacto de los LIE con los anticuerpos no induce activación (por
ejemplo, mediante la constatación de la ausencia de expresión de
moléculas de activación) ni proliferación de los LIE (por ejemplo,
mediante ensayos de incorporación de timidina tritiada) [Taguchi
1991, Hirose 1998]. Posteriormente se procede a generar hibridomas
mediante fusión con líneas de mieloma, o a generar bibliotecas en
fagos. A continuación, se obtienen los sobrenadantes de los cultivos
y se seleccionan y purifican los que presenten una afinidad adecuada
(mayor). Alternativamente, se pueden generar fragmentos
F(ab') a partir de estos anticuerpos por técnicas
convencionales.
En general, se prefiere la conjugación directa de
los anticuerpos a polímeros microscópicos
súper-paramagnéticos que induzcan la suficiente
alteración del tiempo de relajación del agua como para ser
detectados en un aparato de RMN de uso clínico.
Con ello se consigue su liberación a pH
duodeno-yeyunal, protegiendo el contenido durante
el tránsito gástrico. El hecho de que en la EC se produzca una
atrofia de las vellosidades intestinales favorecería el contacto
entre el anticuerpo y los LIE.
Debe realizarse en un lapso de tiempo breve tras
la ingesta de la cápsula, por el rápido recambio de los LIE y la
posible internalización de las moléculas que han sido objeto del
estudio, tras su interacción con el ligando conjugado. Así, el
tiempo recomendable sería aproximadamente una hora tras la
administración, pero habrá de ser fijado para cada reactivo y
localización a estudiar, siendo recomendable la realización de
estudios seriados en el tiempo.
El procesamiento informático de los datos
permitirá la generación de imágenes o gráficas, con sustracción de
imágenes negativas y con comparación con controles. Asimismo,
deberán ser corregidos, mediante técnicas informáticas, los
problemas derivados de la motilidad intestinal, diafragmática,
etc., para obtener imágenes nítidas.
En caso de obtener un valor de LIE
\gamma\delta intermedio que no permita establecer el
diagnóstico, se puede esperar unos días hasta la metabolización y
eliminación de los anticuerpos anti-TcR
\gamma\delta, para realizar un segundo estudio con
anti-CD 122 (u otra molécula característica de LIE
NK-like), conjugada a compuestos
(súper)paramagnéticos, para mejorar la especificidad del
estudio gracias al valor predictivo negativo de su detección. Otra
posibilidad sería utilizar anti-CD122 marcados con
sustancias cuya detección no se viese interferida por la presencia
del trazador unido a los anti-TcR \gamma\delta,
con lo cual ambos estudios podrían ser realizados de forma
simultánea o correlativa.
La presente invención aporta numerosas ventajas.
Aunque las siguientes ventajas de la invención se ejemplifican con
respecto al diagnóstico no invasivo de la EC, también son válidas
para otras aplicaciones, por ejemplo, la detección de células
autorreactivas en enfermedades autoinmunes, o de células malignas
en procesos cancerosos.
- A)
- No invasividad, la principal solución técnica de esta invención, que permitiría potencialmente el diagnóstico de la patología digestiva crónica más frecuente, evitando los miles de estudios invasivos (molestos, con efectos secundarios y que no son específicos) que se realizan a diario en todo el mundo para el diagnóstico de la EC. En los EE.UU. se achaca la menor cifra de EC reconocida respecto a Europa a la reticencia de los pacientes asintomáticos a someterse a exploraciones invasivas [Talal 1997].
- B)
- Especificidad, esta invención permite no sólo el diagnóstico de la EC (por la gran especificidad del aumento de LIE \gamma\delta casi patognomónico) sino que proporciona además información valiosa para el diagnóstico diferencial de otras enteropatías mediante el estudio de los marcadores adecuados para cada caso (ej. CD4 y CD25 en la enteropatía autoinmune).
- C)
- Sensibilidad: al ser la proporción de LIE \gamma\delta el único parámetro constantemente alterado en todas las fases de la EC [Leon 2001c], su semi-cuantificación permite diagnosticar no sólo a los celíacos con presentaciones clásicas de la enfermedad, sino también a los que padecen EC Latente y EC Potencial (ambos tipos sin atrofia o enteropatía intestinal) o EC Silente (sin síntomas clínicos), pacientes en los que la serología es menos sensible que en las formas sintomáticas. Estas formas no clásicas de EC, que en la actualidad superan a las formas clásicas en una proporción 2 a 1 (el "iceberg" de la EC [Catassi 1994], Figura 1) suponen en muchos casos un reto diagnóstico que retrasa la adopción de las medidas terapéuticas adecuadas. Además de en estas formas de EC, la semicuantificación de LIE \gamma\delta resulta también de especial utilidad en los casos en los que la serología no resulta fiable; por ejemplo, en el Déficit de IgA, que es la inmunodeficiencia primaria más frecuente (1/500 en caucásicos) y que se asocia además a la EC (un 5% de los celíacos presentan déficit de IgA), la determinación de anti-endomisio o anti-transglutaminasa no resulta válida al ser estos anticuerpos de clase IgA, por lo que la prueba resulta en un falso negativo; otro ejemplo lo representan los casos de existencia de anticuerpos anti-músculo liso en un paciente con sospecha de EC, ya que estos anticuerpos dificultan la interpretación de los anti-endomisio; por último, también existen casos de falsos positivos de anti-endomisio, sobre todo en alérgicos alimentarios y en diabéticos, representando esto último un problema al estar la Diabetes Mellitus asociada a la EC [León 2001a].
- D)
- Selectividad celular, aprovechando la compartimentalización de la distribución de los linfocitos 78 en el organismo, ya que la mayoría de estas células asientan en el epitelio del intestino delgado, como LIE \gamma\delta. Un celíaco representativo, con 30 LIE \gamma\delta por mm^{2} de epitelio y una superficie de intestino delgado de 300 m2, presentaría aproximadamente 10^{10} LIE \gamma\delta7, una cifra similar e incluso superior a la del total de linfocitos \gamma\delta en todo el torrente sanguíneo, donde representan <5% de los linfocitos; por tanto, la acción de los anticuerpos o ligandos de los LIE \gamma\delta que pudiesen acceder al torrente sanguíneo estaría limitada a esta minoría celular. Por otro lado, la difusión de los anticuerpos a la lámina propia de la mucosa intestinal, adyacente al epitelio, tampoco tendría gran repercusión, al ser mínima o indetectable la presencia de linfocitos \gamma\delta en la lámina propia.
- E)
- Minimización de efectos sistémicos, 1) por la selectividad celular ya comentada, que limita su acción sistémica; 2) porque el paso a sangre representará una fracción mínima de lo administrado, gracias a la administración oral, que hace que los ligandos que no hayan reaccionado con los LIE \gamma\delta sean en su mayor parte eliminados por las heces; y 3) porque se evitan las posibles reacciones adversas de las infusiones intravenosas.
- F)
- Posibilidad de acción terapéutica: como se ha comentado, la administración selectiva no parenteral conseguida con esta técnica puede aplicarse de forma terapéutica.
Adicionalmente, la invención soluciona una serie
de problemas comunes a otras técnicas actualmente utilizadas para
estos fines, entre los que se encuentran:
- A)
- Evita la invasividad de las técnicas alternativas habituales de estudio de las mucosas no accesibles directamente desde el exterior (digestivas, respiratorias, génito-urinarias), tales como la endoscopia, laparoscopia, laparotomías u otras intervenciones quirúrgicas, etc... que permiten obtener las muestras de mucosa necesarias para posteriores análisis histológicos, inmunohistoquímicos o de citometría de flujo. En el caso de la EC, la alternativa es el estudio histológico seriado de biopsias duodeno-yeyunales (al diagnóstico, tras una dieta sin gluten y tras una reintroducción voluntaria del gluten con fines diagnósticos), que han de ser practicadas mediante cápsula duodenal (con irradiación del paciente) o mediante la molesta endoscopia. El estudio de los linfocitos intraepiteliales intestinales (sobre todo si se realiza por citometría de flujo) permite reducir el número de biopsias, pero al menos ha de practicarse una, cuando no dos o incluso tres en caso de inconsistencia del estudio.
- B)
- Evita falsos positivos en el diagnóstico de la EC, por su mayor especificidad, frente al estudio histológico de la mucosa, que se ve afectado por numerosas patologías. La alternativa más específica, el estudio fluorocitométrico de los LIE, requiere de maniobras invasivas para obtener la muestra. Alternativas no invasivas, como los estudios serológicos, requieren de una posterior confirmación histológica. Las pruebas de imagen (resonancia magnética, tomografía axial computerizada, tomografía de emisión de positrones, radiología de rayos X, gammagrafía, etc...) si bien no invasivas, no permiten obtener información celular a menos que se combine su uso con el empleo de isótopos radiactivos, con los riesgos asociados al uso de estos compuestos.
- C)
- Evita falsos negativos en el diagnóstico de la EC, por su mayor sensibilidad frente al estudio histológico de la mucosa, al permitir la detección de formas atípicas de la EC (latente, potencial) y ser útil en situaciones en las que es difícil o imposible interpretar las pruebas serológicas (déficit de IgA, sobre todo), pruebas que además requerirían de posterior confirmación. La alternativa más sensible, el estudio fluorocitométrico de los LIE, requiere de maniobras invasivas para obtener la muestra.
- D)
- Evita efectos secundarios sistémicos por su selectividad celular y por su administración no intravenosa. Otras técnicas no invasivas basadas en el uso de ligandos con intensificadores de imagen requieren del uso radionúclidos o, en otros casos no radiactivos, la administración intravenosa de los compuestos [Bulte et al, WO0071169], mientras que la administración en los vehículos propuestos en la presente invención limita su difusión sistémica. Por otro lado, la mayor parte de estas técnicas requieren de la internalización del compuesto por parte de las células a estudiar [Bulte et al, WO0071169], lo que requiere de un tiempo de interacción prolongado.
\newpage
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la
misma.
Este ejemplo ilustra que los LIE \gamma\delta
pueden ser cuantificados mediante la aplicación de
anti-TcR \gamma\delta directamente sobre un
epitelio, lo que constituye el primer requisito para el desarrollo
de la presente invención. Los anticuerpos atraviesan el moco
epitelial y las uniones entre enterocitos tras ser administrados
directamente sobre la mucosa del intestino delgado ex vivo (a
diferencia de la técnica de inmunohistoquímica, en la que la
detección de los LIE \gamma\delta ha de ser realizada in
vitro sobre cortes ultra-finos realizados con
un microtomo a partir de una muestra escindida de la mucosa). La
posibilidad de detección de LIE \gamma\delta ex vivo
ilustrada en este ejemplo, junto a la gran sensibilidad de otras
técnicas de MRI in vivo, permiten pronosticar la
aplicabilidad in vivo de la presente
invención.
invención.
Para demostrar esta primera premisa de la
invención, se incubaron fragmentos de epitelio duodenal humano
ex vivo con anticuerpos anti-TcR
\gamma\delta conjugados con fluorocromos (lo que será denominado
"marcaje intra-biopsia"). Tras un breve período
de incubación, se comprobó que los anticuerpos habían reaccionado de
forma específica con los LIE \gamma\delta, mediante la
individualización de las células de la biopsia y su análisis por
citometría de flujo tras un segundo "marcaje in vitro"
para confirmar la naturaleza de las células marcadas ex
vivo.
Se obtuvieron muestras de mucosa duodenal de 3
pacientes celíacos, con positividad para los anticuerpos
anti-endomisio, y de 2 "controles de
enfermedad", pacientes no celiacos en estudio por otras causas.
A estos 5 pacientes se les había indicado un estudio histológico por
parte de sus facultativos respectivos para estudiar el proceso
sospechado. A los pacientes se les habían practicado biopsias
duodenales mediante endoscopia, tras su consentimiento escrito para
la intervención. Del material sobrante para el estudio histológico
rutinario, se escindieron tres pequeños fragmentos por paciente, de
1 mm^{2} cada uno. La escisión, practicada con un sacabocados en
fresco, se realizó inmediatamente después de la obtención de las
biopsias.
Los fragmentos de mucosa se incubaron en fresco
con 0,5-1 \mug/ml de anticuerpo monoclonal
anti-TcR \gamma\delta y de anticuerpo control,
tal y como se describe: un fragmento de cada muestra se incubó con
un anticuerpo anti-TcR \gamma\delta (clon 11F2,
Becton Dickinson Immunocytometry Systems, BDIS, EE.UU.) y otro
fragmento con un anticuerpo control, del mismo isotipo pero
especificidad irrelevante (BDIS), conjugados ambos con
isotiociananto de fluoresceína (FITC). Las incubaciones se
realizaron en 500 \mul de medio RPMI 1640 (Gibco, Life
Technologies, Alemania), en tubos de poliestireno de 4 ml de
capacidad, en agitación muy suave en un rotor orbital, durante
5-10 minutos, a temperatura ambiente (TA). Estas
condiciones de agitación suave y de deliberada brevedad de la
incubación (menor del recomendado para el marcaje de células
individualizadas) se eligieron para simular el tipo de contacto de
los anticuerpos con el epitelio tras ser liberados por cápsulas en
el intestino delgado proximal, donde los movimientos peristálticos
inducen movimiento del contenido luminal en sentido caudal.
Tras el marcaje
"intra-biopsia", las células del epitelio
fueron extraídas de cada muestra mediante agitación intensa durante
1 h. en un rotor, a TA, se lavaron en suero salino y se marcaron
(ya individualizadas) con anti-CD45, un marcador
pan-leucitario que permite distinguir los LIE de
otras células epiteliales [Eiras 1998], conjugado con el fluorocromo
PerCP (BDIS) [Figura 1, panel A]. Tras 30 minutos de incubación a
4ºC y un lavado en suero salino, las células se analizaron por
citometría de flujo para determinar el porcentaje de los LIE
\gamma\delta del epitelio que habían sido marcadas ex
vivo intra-biopsia, es decir, antes de la
desepitelización. El tercer fragmento de cada biopsia se utilizó
para obtener una referencia del porcentaje de LIE \gamma\delta
real en el epitelio mediante la determinación convencional de la
proporción de LIE \gamma\delta in vitro por citometría de
flujo tras la desepitelización mediante el uso de DTT y EDTA [Eiras
1998] y posterior marcaje con los mismos anticuerpos monoclonales
que se usaron ex vivo. Así pues, tras los marcajes ex
vivo (intra-biopsia) e in vitro (en
células individualizadas), se compararon las proporciones de LIE
\gamma\delta obtenidos por ambas técnicas, para determinar la
eficacia del marcaje intra-
biopsia.
biopsia.
Tras realizar la ventana de análisis que se
describe en la Figura 1, se analizó el % de LIE \gamma\delta
detectables mediante ambos abordajes [Tabla 1].
| Muestras | % de LIE marcados por anti- | % de LIE marcados por anti- | % de LIE marcados por el |
| TcR \gamma\delta tras la desepitelización | TcR \gamma\delta intrabiopsia | anticuerpo control | |
| con DTT/EDTA | intrabiopsia | ||
| E. Celíaco 1 | 2,8 | 2,9 | 1 |
| E. Celíaco 2 | 10 | 8 | Nd |
| E. Celíaco 3 | 5,2 | 4 | Nd |
| control 1 | 1 | 0,55 | 0,1 |
| control 2 | 0,5 | 0,54 | 0,1 |
Notas a la Tabla
1
Se indican las proporciones de LIE totales que
resultaron marcados con los tres anticuerpos: a)
anti-TcR \gamma\delta, marcado tras la
individualización celular con DTT/EDTA (columna 1); b)
anti-TcR \gamma\delta marcado
intra-biopsia (columna 2); c) control de isotipo de
especificidad irrelevante, intra-biopsia (columna
3). Nd, no realizado.
Como puede comprobarse, el marcaje de LIE
\gamma\delta intrabiopsia, en sólo 5-10 minutos
y en agitación suave, es capaz de detectar entre un 55% y un 80% de
los LIE \gamma\delta realmente presentes en el epitelio [Figura
1, panel B]. La brevedad del contacto permitido puede explicar que
no todos los LIE \gamma\delta sean marcados (el tiempo de
contacto real in vivo sería mayor). Esta detección parcial de
los marcadores celulares se observó también con otros marcajes
intra-biopsia, como con el de
CD3-FITC, anticuerpo que marcó un 60% de los LIE T
realmente presentes (no se muestra). A pesar de esta limitación
técnica que probablemente se minimice in vivo, las
diferencias de proporción de LIE \gamma\delta entre sanos y
pacientes celíacos se mantuvieron en el marcaje
intra-biopsia (3-4 veces más LIE
\gamma\delta en celíacos). Este hecho resulta fundamental para
la aplicabilidad de la invención. El control con anticuerpo
irrelevante no presentó apenas positividad [Figura 1, panel B], lo
que muestra la escasa influencia de una posible reactividad
inespecífica en el marcaje del anti-TcR
\gamma\delta intrabiopsia.
Las células marcadas
intra-biopsia por el anti-TcR
\gamma\delta eran además positivas (en el marcaje tras la
individualización celular) para CD45, CD103 (la integrina
característica de los LIE), CD3 (antígeno de linfocito T), y el
propio TcR \gamma\delta (marcado de nuevo tras la
individualización celular), confirmando que las células marcadas
como LIE \gamma\delta intra-biopsia eran
realmente tales. La posibilidad de marcar el TcR \gamma\delta
por segunda vez tras la desepitelización, estando ya marcado
intra-biopsia con el mismo clon, confirma que el
marcaje intrabiopsia no saturó los TcR, existiendo receptores libres
de anticuerpo, lo que implica que la eficacia de este marcaje es
susceptible de
mejora.
mejora.
También se realizaron marcajes
intra-biopsia con anti-TcR
\gamma\delta conjugado a PE (n=2), obteniéndose un mayor
porcentaje de los LIE \gamma\delta marcados
intra-biopsia, posiblemente porque el menor tamaño
de la ficoeritrina permita una mejor difusión del anticuerpo en el
epitelio. Como se ha comentado, en la realización preferida de esta
invención, los anticuerpos no están conjugados a fluorocromos, sino
a una sustancia intensificadora de imagen (preferentemente un
compuesto detectable por RMN), que, por su menor tamaño, evitará el
posible efecto deletéreo que sobre la afinidad y especificidad de
los anticuerpos puede tener la conjugación a una molécula de gran
tamaño.
Este ejemplo demuestra que el marcaje
intra-biopsia (ex vivo, directamente sobre el
tejido) ilustrado previamente, no se ve impedido por la conjugación
de un polímero súper-paramagnético al anticuerpo,
premisa también necesaria para el desarrollo de la invención.
Se obtuvieron tres fragmentos de mucosa
intestinal de cada uno de 3 sujetos "controles de enfermedad"
(no celíacos y sin patología del intestino delgado), en las
condiciones ya referidas. Dos de los fragmentos se procesaron de
igual forma al ejemplo anterior, es decir, mediante el marcaje
intra-biopsia (sobre el tejido, ex vivo) con
un anti-TcR \gamma\delta y un anticuerpo
irrelevante de control, en las mismas condiciones de incubación
detalladas. El tercer fragmento se incubó siguiendo un protocolo
idéntico, pero con un anti-TcR \gamma\delta
acoplado previamente a un polímero
súper-paramagnético.
Para preparar este reactivo, se incubó 1 \mug
de anti-TcR \gamma\delta-FITC
(BDIS), durante 20-30 minutos (a 4ºC y en suero
salino), con 10 \mu de microesferas
súper-paramagnéticas recubiertas de anticuerpos
monoclonales anti-FITC (esta cantidad es la
recomendada para incubar l0 \mul células totales por el
fabricante, Miltenyi Biotec, EE.UU.). De este modo se obtuvo un
anti-TcR \gamma\delta acoplado a un polímero
súper-paramagnético, mediante el puente de un
anticuerpo secundario.
Se realizó el marcaje
intra-biopsia en las condiciones del ejemplo
anterior (10 min, TA, agitación suave), con anticuerpo irrelevante,
anti-TcR \gamma\delta y anti-TcR
\gamma\delta conjugado a polímeros
súper-paramagnéticos. Tras ello, los fragmentos de
mucosa se desepitelizaron por agitación y las células
individualizadas se marcaron in vitro con
anti-CD45-PerCP. Como puede
observarse en la Tabla 2, el anti-TcR
\gamma\delta súper-paramagnético resultó eficaz
para el marcaje intra-biopsia [Figura 2, panel B],
si bien el proceso de conjugación a los polímeros mediante un
anticuerpo intermedio introdujo una mayor dispersión de los
resultados.
| Muestras | % de LIE marcados por | % de LIE marcados | % de LIE marcados | % de LIE marcados |
| anti-TcR \gamma\delta tras | intra-biopsia con anti- | intra-biopsia con anti- | intra-biopsia por el | |
| desepitelización con | TcR \gamma\delta-FITC | TcR-\gamma\delta+ polímero | anticuerpo control | |
| DTT/EDTA | súperparamagnét. | |||
| Control 1 | 1 | 0,55 | 1,65 | 0 |
| Control 2 | 1,5 | 1,1 | 0,7 | Nd |
| Control 3 | 0,74 | Nd | 1,26 | Nd |
Notas a la Tabla
2
Se indican las proporciones de LIE totales que
resultaron marcados con los diferentes abordajes: a)
anti-TcR \gamma\delta, marcado tras la
individualización celular con DTT/EDTA (columna 1); b)
anti-TcR \gamma\delta marcado
intra-biopsia (columna 2); c)
anti-TcR \gamma\delta conjugado previamente a
polímeros súper-paramagéticos (columna 3); d)
control de isotipo de especificidad irrelevante (columna 4). Nd, no
realizado.
Esta dificultad técnica queda soslayada en la
versión preferida de esta invención, en la que los anticuerpos
están directamente conjugados a la sustancia intensificadora de
imagen (preferentemente un compuesto detectable por RMN), sin
mediación de un anticuerpos secundario, evitando su posible efecto
deletéreo sobre la afinidad y especificidad del reactivo.
En un estudio piloto se observó que polímeros
súper-paramagnéticos acoplados a anticuerpos
(disponibles de forma comercial) son detectables por espectroscopia
de Resonancia Magnética (MRS), lo que constituye una prueba
adicional de la aplicabilidad de la presente invención.
Se utilizaron 10 \mul, la misma cantidad usada
para el marcaje intra-biopsia, de microesferas
súper-paramagnéticas recubiertas de anticuerpos
monoclonales anti-FITC (Miltenyi Biotec, EE.UU.),
suspendidas en 250 \mul de suero salino alojado en una microsonda
constituida por un capilar de vidrio, situada en el interior de un
anillo de RMN de 8 Teslas de potencia. Se midió el acortamiento del
tiempo de relajación del agua inducido por los polímeros
súper-paramagnéticos, comparado con un control
consistente en suero salino. El tiempo de adquisición de datos fue
de 15 minutos por muestra, utilizándose la técnica de Eco de Hahn.
Las microesferas súper-paramagnéticas indujeron un
descenso medio del tiempo de relajación T_{2} del agua de 74
milisegundos (ms) (salino) a 25 ms (microesferas) (n=2).
Este experimento no pudo realizarse sobre
fragmentos de biopsia, porque su masa resultó insuficiente para ser
detectable por MRS, por lo que se realizó sobre biopsias completas
sobrantes de estudios histológicos. Cuatro biopsias de 2 sujetos
"controles de enfermedad" fueron incubadas durante 10 minutos,
a TA en agitación suave en presencia y en ausencia (control) de 10
\mul de anti-TcR \gamma\delta conjugado a
microesferas súper-paramagnéticas (Miltenyi), como
se detalló en el Ejemplo 2. Tras ser lavadas, las biopsias se
introdujeron en capilares de 0,5 mm de diámetro para medir, mediante
la técnica de CPMG, el tiempo de relajación del agua por MRS. De
media, este tiempo fue de 833 ms en el capilar control con suero
salino, de 779 ms en las 2 biopsias sin marcar, y de 682 ms en las 2
biopsias marcadas con anti-\gamma\delta
FITC/anti-FITC-microesferas. Si bien
se precisa de mayor casuística y controles, estos experimentos
apoyan la viabilidad in vivo de la presente invención.
En otra serie similar de experimentos con
biopsias, se comprobó que esferas
súper-paramagnéticas de mayor susceptibilidad
magnética y tamaño (Dynal, Noruega) -micras en lugar de nanómetros
(Miltenyi)- si bien inducían una mayor disminución del tiempo de
relajación, presentaban una menor especificidad en el marcaje
intra-biopsia, posiblemente debido a su
atrapamiento por su mayor tamaño. Tampoco resultaron eficaces
anticuerpos acoplados a haptenos y microesferas acopladas a
anti-haptenos (Miltenyi), puesto que dichos haptenos
resultaban captados inespecíficamente por células epiteliales
intestinales. Estas limitaciones técnicas quedarían solucionadas en
la versión preferida de esta invención, mediante el uso de
anticuerpos directamente conjugados a las sustancias para-
magnéticas.
magnéticas.
- 1.
- Todos los componentes de esta invención son susceptibles de fabricación industrial. La producción de anticuerpos (de todo tipo, también monoclonales) es una técnica utilizada hoy en día por varias compañías farmacéuticas, al igual que la conjugación de anticuerpos y otros ligandos a moléculas intensificadoras de imagen como las partículas súper-paramagnéticas. Los anticuerpos monoclonales se utilizan en la actualidad para tratamiento de patología humana, tras haber superado rigurosos estudios de seguridad farmacológica. Las tecnologías de administración no intravenosa de productos (como las cápsulas de liberación a pH determinado) son de uso rutinario en la clínica. El desarrollo y la utilización de técnicas diagnósticas de imagen se encuentra en constante expansión, sobre todo las no-radiantes, como la RMN, y su capacidad de resolución espacial va pareja a los adelantos técnicos, previéndose un incremento a corto plazo de la potencia de los anillos de RMN que se utilizan en la práctica hospitalaria, tras haberse comprobado su eficacia en modelos animales. Con la potencia actual, se pueden detectar por RMN cantidades tan bajas como 10^{5} células marcadas [Bulte 2001, WO 00/71169] (cifra muy inferior a los \approx 10^{10} LIE \gamma\delta existentes en el epitelio intestinal).
- 2.
- Los riesgos y efectos secundarios de la aplicación de la presente invención son menores que los de otras alternativas (invasivas y/o radiantes y/o intravenosas). La técnica proporcionada por esta invención minimiza las molestias para los pacientes, al no ser invasiva y al acortar el tiempo de estudio necesario hasta llegar al diagnóstico: por ejemplo, para la EC sólo se requeriría un estudio frente a los tres estudios clásicos, con lo que el diagnóstico se alcanzaría en un plazo temporal muy inferior, de semanas frente a los 3 años que puede demorarse el diagnóstico definitivo de un niño celíaco, según los criterios de la ESPGAN, sobre todo si la EC se presenta antes de los 2 años de edad o si las manifestaciones son atípicas. Este diagnóstico precoz conllevaría la consiguiente instauración temprana de tratamiento y la minimización de complicaciones.
- 3.
- La demanda potencial de aplicación de la técnica proporcionada por esta invención es enorme, por la posibilidad de aplicación al diagnóstico, incluso a la terapia, de multitud de patologías epiteliales humanas y animales. Aún limitada a la versión preferida de la invención, es necesario tener en cuenta que la EC es la enfermedad crónica digestiva más frecuente y la segunda enfermedad infantil más frecuente, afectando al 1% de la población europea [Kiren 2001, Catassi 1994, Csizmadia 1999] y al 0,5% de la norteamericana [Not 1998, Guillet 2001]. Esta técnica permitiría diagnosticar no sólo a enfermos celíacos sintomáticos sino también a los silentes, latentes y potenciales. Estos últimos, al presentar rasgos que los hacen susceptibles a ser celíacos pero no presentar la enfermedad de forma definida, requieren de múltiples estudios hasta que aparecen alteraciones histológicas, lo que podría evitarse con un único estudio de LIE \gamma\delta. No sólo los nuevos diagnósticos podrían beneficiarse de esta invención, sino que muchos pacientes diagnosticados hace años, cuando no existían o no se habían extendido las técnicas serológicas, podrían beneficiarse de una revisión de su caso si se les ofrece de forma no invasiva y exenta de riesgos. Es habitual encontrar pacientes sometidos de por vida a los rigores de una dieta sin gluten y al estigma psicológico y social de la EC, que resultan no padecer esta enfermedad tras un estudio de sus LIE o de su HLA, que no fue realizado en su momento al no estar disponible.
- 4.
- La técnica proporcionada por esta invención abarataría el coste global del estudio de la EC y otras enfermedades. El coste de un estudio de LIE por esta técnica será superior al de un estudio histológico convencional, pero éste carece de especifidad, por lo que el acto diagnóstico ha de ser repetido en varias ocasiones y ha de ser complementado con otras pruebas, lo que se evitaría mediante el estudio de los LIE. La producción en serie de los ligandos específicos (por ejemplo, mediante la producción de anticuerpos por tecnología recombinante) abarataría los costes.
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Claims (22)
1. Un sistema de administración no intravenosa de
un ligando que comprende un ligando específico de células de
epitelios, susceptible de detección por técnicas de imagen,
vehiculizado en un vehículo de administración no intravenosa.
2. Sistema según la reivindicación 1, en el que
dicho ligando se selecciona entre un anticuerpo o un fragmento del
mismo, opcionalmente conjugado a una sustancia intensificadora de
imagen.
3. Sistema según la reivindicación 2, en el que
dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
4. Sistema según la reivindicación 2, en el que
dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal
anti-TcR \gamma\delta, no estimulante.
5. Sistema según la reivindicación 1, en el que
dicho ligando se selecciona entre un polímero, un lípido o
lipoarabinomanano, una lectina y un tetrámero de HLA con péptido,
opcionalmente conjugado a una sustancia intensificadora de
imagen.
6. Sistema según la reivindicación 1, en el que
dicha célula diana se selecciona entre células humanas o animales,
normales o alteradas, epiteliales en cuanto a su localización,
pertenecientes a cualquier estirpe celular, y microorganismos.
7. Sistema según la reivindicación 1, en el que
la molécula diana de dicho ligando se encuentra en la membrana
celular de las células diana y/o en el interior del citoplasma.
8. Sistema según la reivindicación 7, en el que
dicha molécula diana se selecciona entre TcR \gamma\delta, CD
122 y un subtipo de HLA.
9. Sistema según la reivindicación 1, en el que
dicho ligando es susceptible de detección per se por
técnicas de imagen.
10. Sistema según la reivindicación 9, en el que
dicho ligando es un anticuerpo ferromagnético.
11. Sistema según la reivindicación 1, en el que
dicho ligando comprende una sustancia intensificadora de
imagen.
12. Sistema según la reivindicación 11, en el que
dicha sustancia intensificadora de imagen se selecciona entre (i)
sustancias magnéticas, paramagnéticas y
súper-paramagnéticas, (ii) radiomarcadores, y (iii)
materiales radio-
opacos.
opacos.
13. Sistema según la reivindicación 11, en el que
dicha sustancia intensificadora de imagen se selecciona entre (i)
sustancias magnéticas, paramagnéticas y
súper-paramagnéticas de gadolinio, hierro, cobre o
cromo; (ii) radionúclidos seleccionados entre
Tc-99m, I-123,
I-125, In-111,
In-113m y Ga-67; y (iii) compuestos
radio-opacos, seleccionados entre compuestos y
derivados de iodo, bario, galio y talio.
14. Sistema según la reivindicación 1, en el que
dicha técnica de imagen susceptible de ser utilizada para detectar
dicho ligando se selecciona entre Resonancia Magnética Nuclear,
Tomografía Computerizada, Tomografía de Emisión de Positrones,
fluoroscopia, radiografía o radiología de rayos X, ecografía,
gammagrafía, escintigrafía con gammacámaras o SPECT, ecografía,
ultrasonido y Doppler.
15. Sistema según la reivindicación 1, que
comprende, además, una toxina y/o un agente farmacológico, para la
administración selectiva, no intravenosa, de dicha toxina y/o agente
farmacológico a una célula diana.
16. Sistema según la reivindicación 1, en el que
dicho vehículo de administración no intravenosa es un vehículo de
administración tópica aplicable sobre una mucosa o epitelio.
17. Sistema según la reivindicación 16 en que
dicho vehículo de administración no intravenosa es un vehículo de
administración enteral.
18. Sistema según la reivindicación 16, en el que
dicho vehículo de administración de dicho ligando se selecciona
entre vehículos de liberación controlada, cápsulas opcionalmente
recubiertas con recubrimientos protectores, pastillas, liposomas,
líquidos ingeribles, suspensiones inhalables, supositorios, espumas,
cremas y aerosoles.
19. Sistema según la reivindicación 16, que
comprende, además, un tampón de conservación.
20. Sistema según la reivindicación 1, en el que
dicho ligando es un anticuerpo monoclonal anti-TcR
\gamma\delta conjugado a partículas
súper-paramagnéticas de óxido ferroso y vehiculizado
en cápsulas de protección gástrica.
21. Un kit que comprende un sistema de
administración de un ligando según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19.
22. Un kit según la reivindicación 21, en el que
dicho sistema comprende un ligando que es un anticuerpo monoclonal
anti-TcR \gamma\delta conjugado a partículas
súper-paramagnéticas de óxido ferroso y vehiculizado
en cápsulas de protección gástrica.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200200211A ES2233118B1 (es) | 2002-01-30 | 2002-01-30 | Sistema de administracion no intravenosa de un ligando especifico de celulas de epitelios, detectable por tecnicas de imagen y sus aplicaciones. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200200211A ES2233118B1 (es) | 2002-01-30 | 2002-01-30 | Sistema de administracion no intravenosa de un ligando especifico de celulas de epitelios, detectable por tecnicas de imagen y sus aplicaciones. |
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|---|---|
| ES2233118A1 ES2233118A1 (es) | 2005-06-01 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2233118A1 (es) | 2005-06-01 |
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