ES2232819T3 - Metodo de examen clinico basado en las estructuras de oligosacaridos unidos a inmunoglobina g. - Google Patents
Metodo de examen clinico basado en las estructuras de oligosacaridos unidos a inmunoglobina g.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO METODO DE EXAMINACION CLINICA QUE CONSISTE EN ANALIZAR LA ALTERACION EN LA CANTIDAD DE UN COMPONENTE ESPECIFICO EN OLIGOSACARIDOS DE INMUNOGLOBULINA G. SE EXAMINAN ENFERMEDADES HUMANAS TALES COMO ENFERMEDADES DEL HIGADO, HIPERTENSION MALIGNA, NEUROPATIA DE INMUNOGLOBULINA A, TRASTORNOS PEDIATRICOS, ETC EN TERMINOS DE ALTERACION BISECCIONANDO OLIGOSACARIDOS QUE CONTIENEN NACETILGLUCOSAMINA EN INMUNOGLOBULINA G DE UNA MANERA APLICABLE A OPERACION PRACTICA PARA EXAMINACION DE ENFERMEDADES DEL HIGADO, ENFERMEDADES ALERGICAS, HIPERTENSION MALIGNA, NEUROPATIA DE INMUNOGLOBULINA A, TRASTORNOS PEDIATRICOS, ASI COMO VARIACIONES DEPENDIENTES DE LA EDAD Y EL EFECTO TERAPEUTICO DEL INTERFERON.
Description
Método de examen clínico basado en las
estructuras de oligosacáridos unidos a inmunoglobina G.
La presente invención se refiere a un método para
el examen clínico de una enfermedad que comprende examinar la
alteración en la cantidad de oligosacáridos unidos a la
glicoproteína inmunoglobina G en tejido o humor.
La importancia de la información sobre materiales
vitales que contienen oligosacáridos ha llegado a ser objeto de
atención con el incremento en los últimos años del conocimiento
bioquímico y médico, y se ha intentado el examen de la alteración en
la cantidad de trazas de oligosacáridos para algunos materiales
vitales tales como lectina, anticuerpo, etc. Sin embargo, dichos
exámenes presentan inconvenientes, tal como una pobre cuantificación
y una difícil detección de la alteración en una cantidad de traza y,
además, las glicoproteínas (por ejemplo,
alfa-fetoproteína y gonadotropina coriónica), es
decir, un grupo de materiales vitales que contienen oligosacáridos
que se sabe que experimentan alteraciones con el progreso de
enfermedades, son difíciles de obtener de pacientes en una cantidad
suficiente para su análisis en métodos de alta cuantificación. Si se
supone que la alteración de la cantidad de un tipo específico de
oligosacárido es atribuible a la enfermedad en cuestión y, por
tanto, cabe esperar que la enfermedad pueda ser examinada
clínicamente por análisis del oligosacárido, es difícil purificar
una muestra de un paciente y analizarla con detalle respecto al
oligosacárido. Bajo tales circunstancias, los presentes inventores
han estudiado de forma extensiva la aplicación clínica de
oligosacáridos de inmunoglobina G (IgG), es decir, la glicoproteína
más abundante en suero, y han llegado a una invención que marcará
época y que permite determinar con detalle la cantidad relativa de
cada oligosacárido de IgG y ello sin agobiar aún más al paciente con
la extracción de varios cientos de microlitros de suero como ocurre
con el resto de la sangre recogida para utilizarse en el examen
clínico conven-
cional.
cional.
Las células inmunocompetentes del sistema vital
se clasifican en términos generales como monocitos/macrofagos,
linfocitos T y linfocitos B. La superficie de su membrana celular
porta receptores de unión a antígenos con una especificidad antígena
a una amplia variedad de antígenos. En particular, los linfocitos B
producen 5 clases de inmunoglobina (M, G, A, E y D) para separar los
antígenos de un modo eficaz.
Alrededor de la mitad de las glicoproteínas en
suero son inmunoglobinas, de las cuales la IgG asciende al 80%
aproximadamente del total de inmunoglobinas. La IgG tiene un peso
molecular de 150.000 con 1,4% de carbohidrato, conteniendo cada
molécula dos oligosacáridos. Los oligosacáridos de IgG se unen a
dominios Fc de la molécula de inmunoglobina. En el caso de suero
normal, la cantidad relativa de cada oligosacárido en IgG es siempre
constante y se han comprobado 16 o más estructuras de oligosacáridos
en asialo oligosacáridos. En un informe anterior, los presentes
inventores pudieron aislar los 16 tipos de oligosacáridos de IgG de
un modo casi homogéneo y en una sola etapa mediante cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) en una columna de
ODS-sílice (Takahashi et al., Biochemistry,
26, 1137-1144 (1987)).
En IgG humana, existen 16 clases de
oligosacáridos A-P y su modelo de elución es como el
mostrado en la figura 1 ("Seibutukagaku Jikkenho" (Experimental
Methods in Biological Chemistry), Method for Study of
Oligosaccharides of Glycoprotein, vol. 23, p. 144, publicado por
Gakkai Shuppan Center (1989) y recopilado por Noriko Takahashi; y
Takahashi et al., Biochemistry, 26,
1137-1144 (1987)). En base a este modelo, los
oligosacáridos de IgG se pueden dividir en los siguientes 4
grupos:
- (1)
- un grupo de oligosacáridos de tipo complejo que no contiene enlace \alpha1-6 de fucosa o N-acetilglucosamina bisectante [grupo I (A, B, C, D)];
- (2)
- un grupo de oligosacáridos de tipo complejo que contiene enlace \alpha1-6 de fucosa [grupo II (E, F, G, H)];
- (3)
- un grupo de oligosacáridos de tipo complejo que no contiene enlace \alpha1-6 de fucosa pero que contiene N-acetilglucosamina bisectante [grupo III (I, J, K, L)]; y
- (4)
- un grupo de oligosacáridos de tipo complejo que contiene enlace \alpha1-6 de fucosa y N-acetilglucosamina bisectante [grupo IV (M, N, O, P)].
Cada uno de estos grupos contiene también un
oligosacárido que contiene 0, 1 ó 2 moléculas de galactosa, siendo
la proporción de cada grupo aproximadamente constante en IgG de
suero normal. La cantidad relativa de cada oligosacárido de IgG es
siempre constante en el caso de personas sanas.
Sin embargo, en el caso de pacientes, la cantidad
relativa de cada oligosacárido de IgG varía con los cambios en el
entorno intracelular y extracelular, dando lugar a una alteración
del modelo de elución de oligosacáridos en cromatografía en columna
de fase inversa. Por tanto, el examen eficaz de varias enfermedades
resultará factible mediante análisis cuantitativo de modelos de
elución de oligosacáridos de IgG en pacientes enfermos. Se ha
comprobado que la proporción de residuos de fucosa y galactosa pero
no de residuos de N-acetilglucosamina bisectada
difieren entre individuos normales y pacientes con leucemia (Kondo
et al., Biochemistry and Molecular Biology International,
32, 897-902 (1994)). Sin embargo, desde un
punto de vista práctico, el examen o agrupamiento de ciertas
enfermedades en términos de la cantidad de un solo oligosacárido de
IgG conduce frecuentemente a una evaluación imprecisa. Los presentes
inventores han comprobado que las enfermedades se pueden agrupar en
términos de las cantidades relativas de dos o más oligosacáridos de
IgG mediante el uso de las áreas de sus correspondientes picos en
HPLC. Este método se puede emplear clínicamente para una diagnosis
más exacta de enfermedades.
Al contrario que la proteína, el oligosacárido
está relacionado en gran medida con diversas enfermedades puesto que
es controlado no solo por el gen sino también por el entorno
existente alrededor de las células. Por ejemplo, se sabe que ocurre
una alteración importante en las cantidades relativas de los
oligosacáridos de IgG en pacientes, por ejemplo, con artritis
reumatoide, y se presenta también una alteración importante en el
contenido en galactosa de los oligosacáridos
(EP-A-0189388).
La hepatitis es una de las principales
enfermedades humanas en la actualidad. En particular, la hepatitis
de tipo C es causada por infección por vía de una transfusión y
procede desde una hepatitis crónica, pasando por cirrosis hepática,
hasta carcinoma hepatocelular.
Aunque se han llevado a cabo estudios extensivos
sobre el examen y diagnóstico clínicos de la hepatitis por medios
bioquímicos convencionales, la precisión del diagnóstico no es
todavía muy elevada, oscilando desde 60-70% a
30-50%. Por este motivo, el diagnóstico de esta
enfermedad se ha efectuado en combinación con otros métodos, pero
resulta difícil de obtener información precisa sobre los cambios
patológicos extremadamente complicados en el sistema vital. Por
tanto, se ha convertido en una tarea emergente y extremadamente
importante el poder desarrollar métodos de examen de muy alta
precisión.
Las enfermedades alérgicas tales como polinosis,
dermatitis atópica, etc, resultantes de factores tales como los
modernos y diversos hábitos de comida, el polen de las plantas, el
estrés, etc, se ha convertido en un problema principal. Se asume que
la enfermedad alérgica es una anormalidad del sistema de
inmunorreacción. Los oligosacáridos de IgG son esenciales en el
sistema inmunológico para la transmisión de una serie de información
tal como actividad de complemento y, si una alteración en su
estructura es causada por la influencia de una enfermedad alérgica,
dicha alteración se puede emplear para el diagnóstico de la
enfermedad alérgica.
La hipertensión constituye un factor principal de
otras enfermedades del sistema circulatorio, incluyendo enfermedad
cardiaca y apoplejía. El número de pacientes con hipertensión
aumenta a medida que avanza la edad de la población. Se estima que
los números de pacientes hospitalizados y pacientes ambulatorios con
hipertensión han incrementado en alrededor de 5 y 4 veces,
respectivamente, en los últimos 30 años. La hipertensión maligna es
una enfermedad con una presión de sangre diastólica muy elevada (por
encima de 140 mm de Hg) y retinopatía hipertensiva
(Keith-Wagener III o IV), y puede presentarse en
hipertensión tanto primaria como secundaria. El diagnóstico de la
enfermedad se lleva a cabo mediante examen de la presión sanguínea y
examen de la retina. El estado de la enfermedad es controlado
mediante exámenes del progreso cardiaco y vascular derivado de la
enfermedad. Entre los mismos son importantes las pruebas de la
función renal que incluyen examen químico de la creatinina en suero
y urinalisis. Básicamente, para el diagnóstico se emplea la medición
de la presión sanguínea causal en pacientes ambulatorios y se
prefiere la esfigmomanometría durante 24 horas, si ello es posible.
Sin embargo, normalmente resulta difícil examinar todo el estado
incluyendo la presión sanguínea durante el sueño y en actividad.
La nefropatía de inmunoglobina A (referida de
aquí en adelante como "nefropatía de IgA") es un tipo de
enfermedad glomerular mediante la cual se depositan específicamente
IgA y complemento C3 en el riñón. Se ha comprobado que la IgG se
deposita también en una cantidad relativamente grande en nefropatía
de IgA. Aunque se conocen las técnicas de urinálisis y examen
histológico para el diagnóstico de la nefropatía de IgA, la
urinalisis presenta inconvenientes, incluyendo la recogida molesta
de orina y la aplicación difícil de orina guardada, por ejemplo, a
sedimentos de orina, al tiempo que el examen histológico, tal como
la biopsia renal, da lugar a dolores y agobios en los pacientes.
Al contrario que en las enfermedades de adultos,
los trastornos pediátricos incluyen un gran número de enfermedades,
cuyas causas no han sido todavía elucidadas, existiendo otras
enfermedades que se presentan de manera exclusiva en niños. Por
tanto, en los trastornos pediátricos se incluye un gran número de
enfermedades conocidas como "síndrome". El diagnóstico de los
trastornos pediátricos se efectúa convencionalmente empleando examen
de la sangre, urinálisis o diagnóstico por imágenes en combinación
con examen del síntoma aparente. Sin embargo, en muchos casos, es
difícil encontrar el examen y tratamiento adecuados de los
trastornos.
Bajo tales circunstancias, el objeto de la
presente invención consiste en proporcionar nuevos métodos para el
examen clínico mediante análisis de una alteración en la cantidad de
un componente específico en oligosacáridos de IgG.
En consecuencia, la presente invención
proporciona un método para el examen de una enfermedad humana
seleccionada entre enfermedad hepática, hipertensión maligna,
nefropatía de inmunoglobulina A y un trastorno pediátrico,
comprendiendo el método detectar una alteración en la relación de la
cantidad de oligosacáridos que contienen
N-acetilglucosamina bisectante del grupo IV (M, N, O
y P) a la cantidad de oligosacáridos libres de
N-acetilglucosamina bisectante del grupo II (E, F, G
y H) de oligosacáridos de inmunoglobulina G en un humor recogido,
para compararla con la correspondiente relación en controles
sanos.
Por otro lado, el método de la invención puede
comprender además detectar cualquier alteración en la relación de la
cantidad de oligosacáridos que contienen galactosa a la cantidad de
oligosacáridos libres de galactosa de oligosacáridos de
inmunoglobulina G presentes en un humor recogido, para compararla
con la correspondiente relación en controles sanos. Preferentemente,
la relación es la relación de oligosacáridos que contienen galactosa
de tipo F, G, H, N, O y P a oligosacáridos libres de galactosa de
tipo E y M o la relación de oligosacáridos que contienen galactosa
de tipo H a oligosacáridos libres de galactosa de tipo E.
En una modalidad, el método de la invención
comprende purificar inmunoglobulina G a partir de humor recogido,
separar los oligosacáridos de la inmunoglobulina G purificada,
marcar los oligosacáridos separados y someter los oligosacáridos
marcados a cromatografía líquida de alta resolución en una columna
de cromatografía de fase inversa, para detectar cualquier alteración
en dicha relación de las cantidades de oligosacáridos que contienen
N-acetilglucosamina bisectante a oligosacáridos
libres de N-acetilglucosamina bisectante, basado en
el modelo de elución.
Además, el método de la invención puede
comprender purificar inmunoglobulina G a partir del humor recogido,
separar los oligosacáridos de la inmunoglobulina G purificada,
marcar los oligosacáridos separados y someter los oligosacáridos
marcados a cromatografía líquida de alta resolución en una columna
de cromatografía de fase inversa, para detectar cualquier alteración
en dicha relación de las cantidades de oligosacáridos que contienen
galactosa a oligosacáridos libres de galactosa, basado en el modelo
de elución.
La columna de cromatografía de fase inversa puede
ser una columna de octadecilsilil(ODS)sílice.
El trastorno pediátrico consiste habitualmente en
un retraso del desarrollo, síndrome de malformación múltiple,
hiperamonemia, retardo mental, trastornos neurodegenerativos,
homocistinuria, deficiencia de la hormona de crecimiento, enfermedad
de Gaucher, síndrome de Prader-Willi, enfermedad de
Wilson, mucopolisacaridosis, fenilcetonuria, síndrome de Proteus,
cistinosis, síndrome de Aicardi, mala absorción de grasas,
disgénesis renal, hipoplasia cerebelar, enfermedad de almacenamiento
de glicógeno, disfunción motora de causas desconocidas, autismo,
nefropatía asociada con cirrosis hepática, síndrome de Down,
enfermedad de la orina de jarabe de arce, esclerosis glomerular
focal, arteritis de Takayasu y el síndrome de encefalopatía
progresiva con edema, hiparritmia y síndrome de atrofia óptica
(PEHO).
La enfermedad hepática es habitualmente
hepatitis, cirrosis hepática o carcinoma hepatocelular.
El humor recogido empleado en la presente
invención puede ser un fluido corporal elegido entre sangre, semen,
fluido cerebroespinal, fluido amniótico o linfa.
En los dibujos adjuntos:
La figura 1 muestra un modelo de elución de
oligosacáridos de IgG marcados con 2-aminopiridina
en una columna de ODS sílice, junto con las correspondientes
estructuras de oligosacáridos.
La figura 2 muestra las cantidades de
oligosacáridos de IgG que contienen
N-acetilglucosamina bisectante de los controles
sanos y de pacientes (hepatitis, cirrosis hepática y carcinoma
hepatocelular).
La figura 3 muestra las cantidades de
oligosacáridos de IgG que contienen galactosa de los controles sanos
y de pacientes (hepatitis, cirrosis hepática y carcinoma
hepatocelular).
La figura 4 muestra el modelo de elución de los
oligosacáridos de IgG de un control sano en una columna de
ODS-sílice. "F" y "G" son las
designaciones de los picos.
Las figuras 5A y 5B muestran modelos de elución
de una columna OPD y de una columna de ODS-sílice,
respectivamente, en donde las muestras aplicadas fueron los
oligosacáridos de IgG del control sano y de un paciente con
hipertensión maligna. Se muestra un modelo de elución de
oligosacáridos de IgG de un paciente de 3 pacientes examinados con
hipertensión maligna. "E"; "F", "G", "H",
"M", "N", "O" y "P" son las designaciones de
picos.
La figura 6 muestra las alteraciones en las
cantidades de oligosacáridos que contienen galactosa en abscisas y
de oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina
bisectante en ordenadas, en donde la muestra empleada procedía de
IgG de pacientes con hipertensión maligna. Las alteraciones en sus
cantidades se determinan como sigue:
Alteración de la cantidad de oligosacáridos que
contienen galactosa = pico H/pico E.
Alteración de la cantidad de oligosacáridos que
contienen N-acetilglucosamina bisectante = área
total de picos M-P/área total de picos
E-H. Las designaciones de los picos siguen las
designaciones de los picos en la figura 5.
La figura 7 muestra un modelo de elución de una
columna de ODS-sílice en donde la muestra aplicada
consistió en oligosacáridos de IgG de un paciente con nefropatía de
IgA. "E" y "H" son las designaciones de picos.
La figura 8A muestra una comparación entre un
grupo de pacientes con nefropatía de IgA y un grupo de controles
sanos respecto a la alteración en la cantidad de oligosacáridos que
contienen galactosa. La figura 8B muestra una comparación entre un
grupo de pacientes con nefropatía de IgA y un grupo de controles
sanos respecto a la alteración en la cantidad de oligosacáridos que
contienen N-acetilglucosamina bisectante.
La figura 9 muestra modelos de elución de una
columna de ODS-sílice en donde las muestras
aplicadas fueron oligosacáridos de IgG de pacientes con (1) uno o
más trastornos neurodegenerativos de causas desconocidas, (2)
enfermedad de Gaucher, (3) síndrome de Takayasu y (4) síndrome de la
enfermedad de Down, respectivamente.
La figura 10 muestra modelos de elución de una
columna de ODS-sílice en donde las muestras
aplicadas fueron oligosacáridos de IgG de pacientes con (1)
disfunción motora de causas desconocidas, (2) síndrome de
malformación múltiple y (3) síndrome de Proteus,
respectivamente.
A continuación, la presente invención será
descrita de manera detallada.
El método según la presente invención comprende
detectar una alteración en las estructuras de oligosacáridos unidos
a IgG en humor recogido, tal como suero, con el fin de determinar si
existen o no ciertas enfermedades humanas. Las enfermedades humanas
a las que se hace referencia aquí en la presente invención incluyen,
pero no de forma limitativa, trastornos hepáticos, tales como
hepatitis, cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular, hipertensión
maligna, nefropatía de IgA y trastornos pediátricos.
Como una anormalidad de la estructura de una
mitad azúcar en glicoproteína causada por enfermedad hepática
humana, se considera una anormalidad en la estructura de
oligosacáridos en alfa-fetoproteína causada por
carcinoma hepatocelular. Esta glicoproteína es producida a un nivel
extremadamente bajo en suero de adulto normal, pero en suero de
pacientes con enfermedades hepáticas es producida a un nivel alto y
se mantiene en una alta concentración. En particular, se sabe que el
suero de pacientes con carcinoma hepatocelular contiene una mayor
cantidad de un oligosacárido no presente en suero de pacientes con
otras enfermedades hepáticas, tales como hepatitis, cirrosis
hepática, enfermedad hepática benigna, etc. Sin embargo, el examen
de carcinoma hepatocelular mediante la mera detección de una
cantidad de traza de alfa-fetoproteína presente no
es suficiente y la exactitud de este examen es de alrededor del 70%
en carcinoma hepatocelular con un pequeño tamaño de alrededor de 1
cm. Por tanto, para mejorar la precisión se efectúan
convencionalmente otros exámenes tal como biopsia hepática y
diagnóstico por imágenes. Sin embargo, la biopsia hepática causa
dolor en los pacientes, mientras que el diagnóstico con imágenes
requiere instalaciones grandes específicas de manera que el número
de exámenes factibles no quede limitado. En consecuencia, existe la
demanda de un método de diagnóstico simple que mejore fácilmente la
precisión del examen de carcinoma hepatocelular.
Los exámenes clínicos convencionales de
enfermedades son como sigue:
El examen convencional de hepatitis comienza con
una prueba de la función del hígado. Esta prueba mide las
actividades de enzimas tales como transaminasa (sAST, sALT, etc) y
lactato dehidrogenasa (LDH) en sangre. El inicio de hepatitis se
estima cuando estos valores son elevados (no menos de 40 IU/l sAST,
no menos de 50 IU/l sALT y no menos de 500 IU/l LDH). Sin embargo,
incluso si el valor retorna a un nivel normal en la prueba funcional
hepática, es posible que aparezca de nuevo hepatitis debido a que
todavía sigue existiendo virus de hepatitis y, de este modo, deberá
efectuarse un examen adicional en combinación con otros métodos
clínicos. La inflamación como resultado de la hepatitis induce una
anormalidad de inmunorreacción y luego conduce a una anormalidad de
las estructuras de oligosacáridos de IgG. La alteración de sus
estructuras, causada por dicha anormalidad, puede ser examinada con
mayor precisión mediante el método de la presente invención.
El diagnóstico convencional de hipertensión
maligna incluye el examen químico de sangre con respecto a
creatinina en suero, nitrógeno de urea, etc, además de
esfigmomanometría, rayos X del tórax, electrocardiograma y
urinálisis. La hipertensión maligna es una enfermedad que acompaña a
los trastornos funcionales renales y más de la mitad de los
pacientes fallecen en el plazo de un año. Los métodos disponibles
para la diagnosis de esta enfermedad en la actualidad son en general
la esfigmomanometría y el examen de la retina. Incluso en el caso de
que el valor de glomérulos en el riñón disminuya al 50%, la
creatinina en suero y el nitrógeno de urea a examinar en el examen
químico de sangre suelen permanecer dentro de un intervalo normal,
de manera que el examen carece de sensibilidad y tales puntos no
quedan establecidos como un indicador de referencia de la
hipertensión maligna en la prueba bioquímica. Debido a que se ha
comprobado que la IgG patológica de pacientes con hipertensión
maligna es evidentemente diferente de la IgG normal en las
estructuras de oligosacáridos de IgG, el examen de oligosacáridos de
IgG puede servir como el diagnóstico útil de la hipertensión maligna
en combinación con el examen convencional. Los presentes inventores
encontraron que los oligosacáridos de IgG de pacientes con
hipertensión maligna se han alterado debido a una subida anormal de
la presión sanguínea y que el análisis de esta alteración es de
utilidad para el descubrimiento precoz de la hipertensión
maligna.
El diagnóstico convencional de la nefropatía de
IgA se efectúa en base a los hallazgos en urinálisis, medición de
IgA en suero y biopsia renal. En particular, el urinálisis y la
biopsia renal se consideran todavía como importantes aunque el
primero presenta desventajas tal como la recogida incómoda de orina
y la difícil adquisición de datos cuando se emplea orina almacenada,
y la última causa dolor y agobio en los pacientes. Los presentes
inventores han encontrado, por primera vez, la alteración de la
cantidad de oligosacáridos específicos de IgG en pacientes con
nefropatía de IgA y, por otro lado, han comprobado la correlación
existente entre la cantidad de los oligosacáridos con la nefropatía
de IgA. Por tanto, el método de la presente invención permite
diagnosticar la nefropatía de IgA en ausencia de dolor para el
paciente en combinación con el método de diagnóstico
convencional.
Al contrario que las enfermedades en adultos, los
trastornos pediátricos incluyen un gran número de enfermedades,
cuyas causas todavía no han sido elucidadas. Existen también
enfermedades que se presentan de manera exclusiva en niños. Sin
embargo, el número de medios eficaces que se pueden aplicar a dichos
trastornos queda limitado a pesar de la estimación de que los
trastornos pediátricos de causas desconocidas aumentarán con la
diversificación social. Los presentes inventores han comprobado que
una amplia variedad de dichos trastornos pediátricos se pueden
agrupar en términos de la alteración de la cantidad de
oligosacáridos de IgG. El presente método proporciona un número
limitado de exámenes convencionales con una media de trastornos
pediátricos agrupados para promover la exactitud del diagnóstico.
Los trastornos pediátricos agrupados por el presente método incluyen
trastornos neurodegenerativos, arteritis de Takayasu, síndrome de
Down, síndrome de malformación múltiple, enfermedad de Gaucher,
síndrome de Proteus y disfunción motora de causas desconocidas.
El método de la presente invención fue completado
para una información más exacta sobre cambios patológicos y
establecido como un método altamente preciso en donde no solo se
examina la alteración cualitativa de oligosacáridos específicos de
IgG en sangre de pacientes, sino también su alteración cuantitativa
mediante el uso de una amplia variedad de perfiles de oligosacáridos
IgG.
En la presente invención, los oligosacáridos de
IgG son purificados a partir de suero y luego analizados
estructuralmente.
Como medio para identificar las estructuras de
oligosacáridos, se pueden mencionar la espectroscopía de resonancia
magnética nuclear protónica (^{1}H-NHR) y la
espectrometría de masas, así como la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC), entre las cuales se emplea preferentemente la
HPLC en una columna de cromatografía en fase inversa.
La cromatografía típica en fase inversa hace uso
de una columna con unión de grupos octadecilo, una columna con unión
de grupos octilo, una columna con unión de grupos butilo, etc.
Dichas columnas se pueden clasificar de acuerdo con el número de
carbonos unidos a un soporte como la fase sólida. Como la columna
con unión de grupos octadecilo (columna DS) desarrollada hasta
ahora, se puede mencionar una columna de ODS-sílice,
es decir, una columna de cromatografía de fase inversa de tipo
sílice con un grupo octadecilsililo (ODS) unido a un soporte de gel
de sílice, y una columna ODP, es decir, una columna de cromatografía
de fase inversa de tipo polímero con un grupo octadecilo unido a un
soporte de polímero de alcohol vinílico. La columna de
ODS-sílice se puede preparar enlazando
covalentemente un grupo ODS a gel de sílice con un diámetro de 5
\mum. Entre las columnas de cromatografía de fase inversa
anteriores, la columna de ODS-sílice permite en
particular una separación superior de oligosacáridos y, de este
modo, esta columna se emplea preferentemente en el análisis de la
presente invención. También se pueden emplear columnas de
ODS-sílice comercialmente disponibles, tales como
Nakanopak ODS-A (Nakano Viniegra Co., Ltd.),
Shim-pack HRC-ODS (Shimadzu Corp.,
Kyoto, Japón) y Cosmosil 15C_{18} (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto,
Japón).
Se pueden separar una amplia variedad de
oligosacáridos en un tiempo corto mediante HPLC en las columnas
antes indicadas y la comparación entre los perfiles cromatográficos
de oligosacáridos de IgG patológica y normal proporciona los
oligosacáridos de IgG relacionados con la enfermedad con información
patológica en medicina
clínica.
clínica.
Los oligosacáridos se pueden liberar de IgG por
digestión con enzima o disociación química con hidrazina anhidra
para su examen. Aunque preferentemente se emplea el antiguo método
enzimático debido a que el examen se puede efectuar fácilmente en
ausencia de una sustancia química venenosa, tal como hidrazina
anhidra, se puede emplear cualquier método sin efectos adversos
sobre los resultados analíticos. En la presente invención, se puede
emplear también un aparato comercialmente disponible para liberar
oligosacáridos.
El marcaje convencional de los oligosacáridos
incluye el marcaje con fluorescencia con
2-aminopiridina o el marcaje con radioisótopos con
tritio. Debido a que la 2-aminopiridina es fácil de
manipular y detectar en HPLC en laboratorios convencionales, en la
presente invención se emplea preferentemente el marcaje con
fluorescencia con 2-aminopiridina. Como un método de
marcaje con fluorescencia con 2-aminopiridina, se
puede mencionar el método de Hase et al. en donde se emplea
una solución de 2-aminopiridina/HCl como agente
marcador de fluorescencia y cianoborohidruro sódico como agente
reductor (Hase et al., Biochem. Biophys. Res. Común.
85, 257-263 (1978)), así como el método de
Kondo et al. en donde se emplea una solución de
2-aminopiridina/anhídrido acético como agente
marcador de fluorescencia y un complejo de
borano-dimetilamina como agente reductor (Kondo
et al., Agric. Biol. Chem. 54,
2169-2170 (1990)). Se puede emplear cualquiera de
los métodos sin efectos adversos sobre los resultados analíticos. El
método de Hase et al. resulta ventajoso ya que el
procedimiento se puede efectuar fácilmente con menos aparatos. En el
método de Kondo et al., se puede emplear un aparato
comercialmente suministrado por Takara Shuzo Co., Ltd. El
oligosacárido marcado por fluorescencia es estable y es analizado
convenientemente mediante HPLC de alta resolución en un tiempo
corto.
La fracción de oligosacáridos así preparada se
analiza mediante HPLC de la siguiente manera. En primer lugar, se
prepara el disolvente y se pone en marcha el cromatógrafo en fase
líquida de alta resolución y tanto la bomba como la columna se
equilibran con el disolvente. Se inyecta una mezcla de
oligosacáridos marcados por fluorescencia estándar, de manera que se
confirmen las condiciones del aparato y de la columna y entonces la
muestra es inyectada y analizada. La espectroscopía de resonancia
magnética nuclear protónica se lleva a cabo mediante una unidad de
resonancia magnética nuclear de alta resolución en donde se examinan
la constante de unión espín-espín en la molécula en
solución, los cambios químicos y la amplitud de líneas de cada
señal. Los datos sobre los oligosacáridos en la muestra son
comparados con aquellos de oligosacáridos auténticos, de manera que
pueden identificarse sus estructuras. En la espectroscopía de masas,
la muestra es ionizada bajo vacío mediante bombardeo electrónico y
los iones son separados de acuerdo con su número/carga de masa y se
examina su modelo de fragmentación espectral de masa.
A continuación, se describirá de forma breve el
método de la presente invención.
La sangre recogida de un examinado se aplica a
una columna Protein G (Pharmacia Biotech). A partir de la columna,
la IgG es eluída, concentrada, disuelta en 0,01 N HCl (pH 2) y
calentada para la separación de ácido siálico. La muestra es
digerida con proteasa y luego con glicoamidasa A para liberar
oligosacáridos. Los oligosacáridos son desalificados y purificados
en resinas de intercambio catiónico y aniónico, respectivamente, y
luego marcadas por fluorescencia con
2-aminopiridina. Los oligosacáridos son purificados
adicionalmente a través de una columna Sephadex
G-15. La muestra así obtenida es analizada entonces
por HPLC de acuerdo con la presente invención.
La presente invención proporciona una información
altamente precisa y de un modo aplicable a una operación práctica
para el examen de enfermedades, tales como enfermedades hepáticas,
enfermedades alérgicas, hipertensión maligna, nefropatía de IgA y
trastornos pediátricos. Además, el método de la presente invención
puede lograr una precisión aún mayor en combinación con otros
exámenes y resulta extremadamente útil como un método de examen
clínico.
La presente invención se describe con mayor
detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos los cuales,
sin embargo, no deberán ser considerados como limitativos del
alcance de la invención.
Los oligosacáridos de IgG fueron purificados a
partir de suero humano para analizar la alteración en la cantidad de
oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina
bisectante en HPLC.
Para la preparación de IgG, se aplicaron 250
\mul de suero humano a una columna Protein G (un producto de
Pharmacia Biotech) y se eluyó con tampón A (20 mM fosfato sódico, pH
7) y tampón B (50 mM ácido acético, pH 3) para proporcionar
alrededor de 3,3 mg de IgG, y el eluyente se concentró.
La IgG concentrada se disolvió en 0,01 N HCl (pH
2), se ajustó a pH 2 y se calentó a 90ºC durante 1 hora para separar
el ácido siálico enlazado en un terminal no reductor del
oligosacárido, y luego se digirió enzimáticamente con pepsina. La
solución de reacción se ajustó a un pH de 4 a 6 y los oligosacáridos
se liberaron con una enzima, glicoamidasa A. La muestra fue
centrifugada para separar sólidos. El sobrenadante fue desalificado
a través de resinas de intercambio catiónico y de intercambio
aniónico equilibradas con agua desionizada, respectivamente.
Se añadieron 100 \mul de reactivo de reacción
(2-aminopiridina/HCl, pH 6,8) a 100 nmol de los
oligosacáridos secos y se calentó a 100ºC durante 20 minutos. Se
añadió entonces una solución de agente reductor y se dejó reaccionar
a 90ºC durante 12 horas. Los oligosacáridos fueron purificados a
través de una columna Sephadex G-15. La fracción de
2-aminopiridina-oligosacárido fue
recogida, secada y analizada mediante HPLC.
- \text{*}
- Disolvente A: 10 mM dihidrogenofosfato sódico, pH 3,8.
- \text{*}
- Disolvente B: disolvente A más 0,5% n-butanol.
- \text{*}
- Detector fluorométrico: Shimadzu RF-550 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japón).
- \text{*}
- Detección: detección de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 320 nm, longitud de onda de emisión: 400 nm).
- \text{*}
- Velocidad de flujo: 1 ml/min.
- \text{*}
- Temperatura de la columna: 55ºC.
- \text{*}
- Elución de oligosacáridos: después de la inyección, la proporción de disolvente B se aumentó linealmente desde 20% a 50% en 60 min.
Las muestras de oligosacáridos empleadas se
prepararon a partir de IgG derivada de suero humano de 8 controles
sanos y de 21 pacientes con enfermedades hepáticas (8 pacientes con
hepatitis, 6 pacientes con cirrosis hepáticas y 7 pacientes con
carcinoma hepatocelular). La figura 1 muestra un modelo de elución
obtenido en HPLC bajo las condiciones anteriormente descritas. Este
perfil de elución refleja la versatilidad estructural entre las
afinidades ligeramente diferentes de los oligosacáridos de IgG para
la columna de ODS-sílice. Como se ha indicado
anteriormente, la relación de las cantidades de oligosacáridos de
IgG normal es constante. Por tanto, se determinó la siguiente
relación para evaluar la alteración en la cantidad de oligosacáridos
que contienen N-acetilglucosamina bisectante.
Alteración en la cantidad de oligosacáridos que
contienen N-acetilglucosamina bisectante = la
relación del área total de los picos E, F, G y H (grupo II) al área
total de los picos M, N, O y P (grupo IV).
Como se muestra en la figura 2, resultó ser
estadísticamente importante (p<0,001) la diferencia en las
cantidades de los oligosacáridos que contienen
N-acetilglucosamina bisectante de los controles
sanos y de los pacientes con hepatitis. Entre los picos de elución
A-P de la columna de ODS-sílice, la
relación de picos M-P/picos E-H
viene indicada en ordenadas, y los controles sanos y los pacientes
con cada enfermedad hepática vienen indicados en abscisas en la
figura 2. Por "n" se representa el número total de examinados y
uno de ellos viene indicado como un punto negro con la relación
correspondiente. Como se muestra en la figura 2, la cantidad de los
oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina
bisectante de IgG patológica es mayor que la de IgG normal. Por
tanto, el análisis de oligosacáridos de IgG proporciona información
útil para el diagnóstico de hepatitis.
Para examinar la alteración en la cantidad de
oligosacáridos de IgG que contienen galactosa, se analizaron, de la
misma manera que en el ejemplo 1, oligosacáridos de IgG humana de
controles sanos y de pacientes con hepatitis. Las muestras empleadas
fueron las mismas que en el ejemplo 1.
Se determinó la siguiente relación para evaluar
la alteración en la cantidad de oligosacáridos que contienen
galactosa:
Alteración en galactosa = la relación del área
total de picos E+M al área total de picos de oligosacáridos que
contienen galactosa (es decir, [E + M]/[F + G + 2H + N + O + 2P].
Como se muestra en esta ecuación, el área de cada uno de los picos H
y P se multiplicó por 2 debido a que existen 2 moléculas de
galactosa en el oligosacárido de cada uno de los picos H y P).
Las alteraciones en las cantidades de
oligosacáridos que contienen galactosa de cada IgG se muestran en la
figura 3, en donde la relación de picos E+M a los picos que
contienen galactosa (galactosa (-)/galactosa (+)) viene indicada en
ordenadas y los controles sanos y los pacientes con cada enfermedad
hepática se indican en abscisas. Por "n" se representa el
número total de examinados y uno de ellos se muestra como un punto
negro con la relación correspondiente. La diferencia entre los
controles sanos y los pacientes con hepatitis resultó ser
estadísticamente importante (p<0,05). Por otro lado, se presentó
una diferencia importante entre los pacientes con cirrosis hepática
y aquellos con cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular
(p<0,001). Los resultados anteriores indicaron que en cada IgG
patológica está contenida una cantidad de oligosacáridos que
contienen galactosa que es más pequeña que en IgG normal. Por tanto,
el análisis de oligosacáridos de IgG proporciona información útil
para el diagnóstico de pacientes con enfermedades hepáticas.
Ejemplo de
referencia
Se examinaron los oligosacáridos de IgG de 6
controles sanos.
La figura 4 muestra los modelos de elución en
HPLC. El perfil cromatográfico revela que el pico F es más pequeño
con respecto al área del pico G en IgG normal.
Los oligosacáridos de IgG de 3 pacientes con
hipertensión maligna fueron analizados de la misma manera que en el
ejemplo 1, excepto que se emplearon dos tipos de columnas HPLC
(columna ODS y columna ODS-sílice).
- \text{*}
- Disolvente A: 10 mM dihidrogenofosfato sódico, pH 3,8.
- \text{*}
- Disolvente B: disolvente A más 0,5% n-butanol.
- \text{*}
- Detector fluorométrico: Shimadzu RF-550 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japón).
- \text{*}
- Detección: detección fluorométrica (longitud de onda de excitación: 320 nm, longitud de onda de emisión: 400 nm).
- \text{*}
- Velocidad de flujo: 1 ml/min.
- \text{*}
- Temperatura de la columna: 55ºC.
- \text{*}
- Condiciones de elución de oligosacáridos:
- columna ODP \cdot\cdot\cdot Una vez inyectada la muestra, la proporción de disolvente B se aumentó linealmente desde 0% a 15% en 60 min.
- columna ODS-sílice \cdot\cdot\cdot Una vez inyectada la muestra, la proporción de disolvente B se aumentó linealmente desde 20% a 50% en 60 min.
- \text{*}
- Columna:
- columna ODP \cdot\cdot\cdot Asahipak ODS-50 (4,6 \phi x 150 mm) (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.).
- columna ODS-sílice \cdot\cdot\cdot Nakanopak-ODS (6,0 \phi x 150 mm) (Kakano Viniegra Co., Ltd).
Los resultados se muestran en las figuras 5A y
5B. La comparación entre las figuras 5A y 5B indica que ambas
columnas muestran una clara diferencia en oligosacáridos entre IgG
normal e IgG patológica y, de este modo, resultan de utilidad en
este examen.
Como se pone de manifiesto en la figura 5B, el
pico E es más pequeño que el pico H en IgG normal, mientras que, en
IgG patológica, el pico E es más grande que el pico H y se aumenta
la relación de oligosacáridos que contienen
N-acetilglucosamina bisectante a los otros
oligosacáridos. Además, la IgG patológica muestra la tendencia de
aumentar las áreas de los picos principales (picos E, F, G y H) y
disminuir las áreas de los oligosacáridos que contienen
N-acetilglucosamina bisectante (picos M, N, O y P)
con el volumen de elución, respectivamente. Este modelo de los picos
es característico de los oligosacáridos de IgG de pacientes con
hipertensión maligna. En la figura 6 se muestran de manera
bidimensional las alteraciones en oligosacáridos que contienen
galactosa y oligosacáridos que contienen
N-acetilglucosamina bisectante. Se determinaron las
siguientes relaciones:
Alteración en la cantidad de oligosacáridos que
contienen galactosa = pico H/pico E.
Alteración en la cantidad de oligosacáridos que
contienen N-acetilglucosamina bisectante = picos
M-P/picos E-H.
Como se muestra en la figura 6, la IgG normal y
la IgG patológica se pueden distinguir claramente en base a ambas
alteraciones en oligosacáridos que contienen galactosa y
oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina
bisectante. Por tanto, el examen de oligosacáridos de IgG
proporciona un indicador de la hipertensión maligna.
De la misma manera que en el ejemplo 1, se
examinaron los oligosacáridos de IgG de 5 pacientes con nefropatía
de IgA.
La figura 7 muestra un modelo de elución en
nefropatía de IgA en HPLC. Las figuras 8A y 8B muestran las
alteraciones en oligosacáridos que contienen galactosa y
oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina
bisectante, respectivamente. Dichas alteraciones se determinaron de
la misma manera que en el ejemplo 3. La relación pico H/pico E viene
indicada en ordenadas y los controles sanos y los pacientes con
nefropatía de IgA se indican en abscisas. Por "n" se representa
el número total de examinados, y uno de ellos se muestra como un
punto negro con la correspondiente relación pico H/pico E.
El resultado indicó que existe una mayor cantidad
de oligosacáridos que contienen galactosa en pacientes con
nefropatía de IgA que en los controles sanos, siendo la diferencia
entre los mismos importante desde el punto de vista estadístico
(p<0,05). Se examinó entonces la alteración en la cantidad de
oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina
bisectante. La relación (área total de picos
M-P/área total de picos E-H) viene
indicada en ordenadas y los controles sanos y los pacientes con
nefropatía de IgA se indican en abscisas. Uno de los examinados
viene indicado como un punto negro con la correspondiente relación
de picos M-P/picos E-H.
De acuerdo con los resultados, la diferencia
entre la IgG normal y la IgG patológica fue importante
estadísticamente (p<0,001). Por tanto, el análisis de los
oligosacáridos de IgG proporciona información útil para el
diagnóstico de pacientes con nefropatía de IgA.
De la misma manera que en el ejemplo 1, se
examinaron los oligosacáridos de IgG de niños con los siguientes
trastornos pediátricos típicos diagnosticados por un pediatra.
Las enfermedades examinadas son: retraso del
desarrollo, síndrome de malformación múltiple, hiperamonemia,
retardo mental, trastornos neurodegenerativos, homocistinuria,
deficiencia de la hormona de crecimiento, enfermedad de Gaucher,
síndrome de Prader-Willi, enfermedad de Wilson,
mucopolisacaridosis, fenilcetonuria, síndrome de Proteus,
cistinosis, síndrome de Aicardi, mala absorción de grasas,
disgénesis renal, hipoplasia cerebelar, enfermedad de almacenamiento
de glicógeno, disfunción motora de causas desconocidas, autismo,
nefropatía asociada con cirrosis hepática, síndrome de Down,
enfermedad de la orina de jarabe de arce, esclerosis glomerular
focal, arteritis de Takayasu y el síndrome de encefalopatía
progresiva con edema, hiparritmia y síndrome de atrofia óptica
(PEHO).
Las figuras 9 y 10 muestran modelos de elución en
HPLC en oligosacáridos de IgG de pacientes con trastornos
neurodegenerativos, arteritis de Takayasu, síndrome de Down,
síndrome de malformación múltiple, enfermedad de Gaucher, síndrome
de Proteus y disfunción motora de causas desconocidas, que difieren
del perfil de modelos de elución en los controles sanos de la figura
4. En contraste con este perfil de IgG normal, las figuras 9 y 10
revelan que el pico E es más grande que el pico H en cada IgG
patológica, indicando ello que la cantidad de oligosacáridos libres
de galactosa es mayor que la de oligosacáridos que contienen
galactosa en cada uno de los casos.
La cantidad de oligosacáridos que contienen
galactosa en cada cromatograma se utilizó para realizar una
comparación entre controles sanos (10 personas) y pacientes con
trastornos neurodegenerativos, arteritis de Takayasu, síndrome de
Down, enfermedad de Gaucher y disfunción motora de causas
desconocidas. Los resultados se muestran en la tabla 1. Además, la
cantidad de oligosacáridos que contienen
N-acetilglucosamina bisectante en cada cromatograma
se utilizó para realizar una comparación entre los controles sanos y
pacientes con síndrome de Down, síndrome de malformación múltiple y
arteritis de Takayasu. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Para la evaluación de las cantidades, se determinaron las siguientes
relaciones:
Alteración en la cantidad de oligosacáridos que
contienen galactosa = relación del área total de picos E y M al área
total de los picos que contienen galactosa (galactosa (-)/galactosa
(+)).
Alteración en la cantidad de oligosacáridos que
contienen N-acetilglucosamina bisectante = área
total de picos M-P/área total de picos
E-H.
| galactosa (-)/(+) | |
| controles normales n = 10 | 0,231 \pm 0,032 |
| enfermedad neurodegenerativa | 0,548 |
| \hskip1cm arteritis de Takayasu | 0,452 |
| \hskip1cm síndrome de Proteus | 0,597 |
| \hskip1cm enfermedad de Gaucher | 0,753 |
| disfunción motora de causas desconocidas | 0,475 |
| área total de picos M-P/área total de picos E-H | |
| controles normales n = 10 | 0,128 \pm 0,009 |
| \hskip1cm síndrome de Down | 0,218 |
| \hskip1cm síndrome de malformación múltiple | 0,234 |
| \hskip1cm arteritis de Takayasu | 0,189 |
La IgG patológica de pacientes con las
enfermedades anteriores mostró una clara diferencia respecto de la
IgG normal en términos de dos factores, es decir, alteraciones en
las cantidades de oligosacáridos que contienen galactosa y
oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina
bisectante. Por tanto, el uso de los dos factores proporciona un
examen para determinar trastornos pediátricos a los cuales se puede
aplicar un número limitado de métodos de examen.
Claims (10)
1. Método de examen de una enfermedad humana
seleccionada entre enfermedad hepática, hipertensión maligna,
nefropatía de inmunoglobulina A y un trastorno pediátrico,
comprendiendo el método analizar una alteración en la relación de la
cantidad de oligosacáridos que contienen
N-acetilglucosamina bisectante del grupo IV (M, N, O
y P) a la cantidad de oligosacáridos libres de
N-acetilglucosamina bisectante del grupo II (E, F, G
y H) de oligosacáridos de inmunoglobulina G en un humor recogido,
para compararla con la correspondiente relación en controles
sanos.
2. Método según la reivindicación 1, en donde el
trastorno pediátrico es retraso del desarrollo, síndrome de
malformación múltiple, hiperamonemia, retardo mental, trastornos
neurodegenerativos, homocistinuria, deficiencia de la hormona de
crecimiento, enfermedad de Gaucher, síndrome de
Prader-Willi, enfermedad de Wilson,
mucopolisacaridosis, fenilcetonuria, síndrome de Proteus,
cistinosis, síndrome de Aicardi, mala absorción de grasas,
disgénesis renal, hipoplasia cerebelar, enfermedad de almacenamiento
de glicógeno, disfunción motora de causas desconocidas, autismo,
nefropatía asociada con cirrosis hepática, síndrome de Down,
enfermedad de la orina de jarabe de arce, esclerosis glomerular
focal, arteritis de Takayasu y el síndrome de encefalopatía
progresiva con edema, hiparritmia y síndrome de atrofia óptica
(PEHO).
3. Método según la reivindicación 1, en donde la
enfermedad hepática es hepatitis, cirrosis hepática o carcinoma
hepatocelular.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el humor es un fluido corporal
elegido entre suero, sangre, semen, fluido cerebroespinal, fluido
amniótico o linfa.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende purificar inmunoglobulina
G a partir de humor recogido, separar los oligosacáridos de la
inmunoglobulina G purificada, marcar los oligosacáridos separados y
someter los oligosacáridos marcados a cromatografía líquida de alta
resolución en una columna de cromatografía de fase inversa, para
analizar cualquier alteración en dicha relación de las cantidades de
oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina
bisectante a oligosacáridos libres de
N-acetilglucosamina bisectante, basado en el modelo
de elución.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además analizar una
alteración en la relación de la cantidad de oligosacáridos que
contienen galactosa a la cantidad de oligosacáridos libres de
galactosa de oligosacáridos de inmunoglobulina G presentes en el
humor recogido en comparación con la correspondiente relación en
controles sanos.
7. Método según la reivindicación 6, en donde la
relación es la relación de oligosacáridos que contienen galactosa de
tipo F, G, H, N, O y P a oligosacáridos libres de galactosa de tipo
E y M.
8. Método según la reivindicación 6, en donde la
relación es la relación de oligosacárido que contiene galactosa de
tipo H a oligosacárido libre de galactosa de tipo E.
9. Método según la reivindicación 6, 7 u 8, que
comprende purificar inmunoglobulina G a partir del humor recogido,
separar los oligosacáridos de la inmunoglobulina G purificada,
marcar los oligosacáridos separados y someter los oligosacáridos
marcados a cromatografía líquida de alta resolución en una columna
de cromatografía de fase inversa, para analizar cualquier alteración
en dicha relación de las cantidades de oligosacáridos que contienen
galactosa a oligosacáridos libres de galactosa, basado en el modelo
de elución.
10. Método según la reivindicación 5 ó 9, en
donde la columna de cromatografía de fase inversa es una columna de
octadecilsilil-sílice.
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| DE10016117A1 (de) * | 2000-03-31 | 2001-10-04 | Glenn Rolus Borgward | Universales digitales Mobilgerät |
| PT1495328E (pt) * | 2002-04-16 | 2014-09-09 | Vlaams Interuniv Inst Biotech | Um marcador para medir cirrose hepática |
| EP1583968B1 (en) * | 2003-01-14 | 2015-04-22 | VIB, vzw | A serum marker for measuring liver fibrosis |
| WO2005015200A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Shionogi Co., Ltd. | 血清を用いた簡易疾患診断およびテーラーメイド治療 |
| JP4621592B2 (ja) * | 2003-09-08 | 2011-01-26 | 塩野義製薬株式会社 | 簡易疾患診断およびテーラーメイド治療 |
| US7129049B2 (en) * | 2003-12-22 | 2006-10-31 | Regents Of The University Of Minnesota | Method of detecting equine glycogen storage disease IV |
| WO2007136001A1 (ja) | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Osaka University | 炎症性腸疾患の鑑別判断方法 |
| US7910518B2 (en) | 2008-03-10 | 2011-03-22 | Sd Lizenzverwertungsgesellschaft Mbh & Co. Kg | Geometrically sized solid shaped carrier for olefin epoxidation catalyst |
| US8349765B2 (en) * | 2008-07-18 | 2013-01-08 | Scientific Design Company, Inc. | Mullite-containing carrier for ethylene oxide catalysts |
| CA2766839A1 (en) | 2009-07-30 | 2011-02-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Enzymatic antibody processing |
| JP5737761B2 (ja) * | 2009-09-18 | 2015-06-17 | 大学共同利用機関法人自然科学研究機構 | 肝細胞癌マーカー |
| US8586769B2 (en) | 2010-06-04 | 2013-11-19 | Scientific Design Company, Inc. | Carrier for ethylene oxide catalysts |
| WO2012045671A1 (en) | 2010-10-05 | 2012-04-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies against human tweak and uses thereof |
| WO2013050335A1 (en) | 2011-10-05 | 2013-04-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for antibody g1 glycoform production |
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