ES2231766T3 - Procedimiento para la preparacion de una solucion de fibrinogeno estable. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UNA SOLUCION FIBRINOGENA, QUE ES APROPIADA PARA SU UTILIZACION EN PEGAMENTO DE TEJIDO Y PUEDE SER ALMACENADA CUATRO SEMANAS SIN PERDIDA DE SU FUNCIONABILIDAD, ESPECIALMENTE SIN MODIFICACION ESENCIAL DE LA CONSISTENCIA Y DE LAS PROPIEDADES DE COAGULACION, Y UN PROCESO PARA SU FABRICACION.

Description

Procedimiento para la preparación de una solución de fibrinógeno estable.

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una solución de fibrinógeno estable, que es apropiada para su uso en un adhesivo tisular y puede ser almacenada a temperatura ambiente al menos cuatro semanas sin perder su funcionalidad, en particular sin una modificación esencial de la consistencia y propiedades de coagulación.

La adhesión tisular y hemostasia con fibrina se llevan a cabo desde hace mucho. Por ejemplo, se utilizan para la detención de hemorragias de grandes superficies, reunión tisular en órganos parenquimatosos, adhesión de tejido conjuntivo o aseguramiento de sutura y hemostasia tras diversas intervenciones quirúrgicas. La ventaja esencial frente a otros métodos (p. ej. adhesión con adhesivos tisulares sintéticos) es el uso de sustancias del propio cuerpo, que muestran una buena compatibilidad e influyen positivamente sobre la curación de heridas. En la adhesión tisular se consuma la última fase de la coagulación: el fibrinógeno, que contiene factor XIII, se pone en contacto en la superficie a adherir con trombina e iones calcio. La trombina disocia del fibrinógeno los fibrinopéptidos, formándose monómeros de fibrina, que forman un coágulo soluble de fibrina. Al mismo tiempo, mediante trombina e iones calcio, se activa el factor XIII transglutaminasa, que estabiliza el coágulo mediante reticulación de los monómeros de fibrina. Se puede conseguir una elevada resistencia del coágulo frente a la fibrinolisis, en caso de que se desee, mediante la adición de un inhibidor de plasmina al concentrado de fibrinógeno.

Para la adhesión tisular con adhesivos de fibrina se dispone por una parte de preparados comerciales, por otra parte los adhesivos de fibrina también pueden ser preparados por el usuario en el momento en que los necesite (documento WO 86/01814).

Los adhesivos de fibrina adquiribles comercialmente son adhesivos de dos componentes, conteniendo el primer componente fibrinógeno, factor XIII y aprotinina, y conteniendo el segundo trombina e iones calcio. Los componentes se presentan congelados o liofilizados. Una desventaja de estos preparados es la preparación requerida del adhesivo listo para el uso, ya que tanto la descongelación y el calentamiento a la temperatura de aplicación, como también la disolución de los liofilizados condicionada por la alta concentración de fibrinógeno de aprox. 6-10% requieren relativamente mucho tiempo. Otra desventaja esencial es la relativamente corta conservación (aprox. 4 horas) de los componentes del adhesivo listo para el uso. En caso de retrasos imprevistos entre preparación y aplicación, el adhesivo de fibrina puede entonces pasar a ser inservible o perder eficacia.

Los concentrados de fibrinógeno también se pueden preparar por el propio usuario conforme a diversos procedimientos en el momento en que los necesite, y se pueden combinar con preparados de trombina adquiribles comercialmente para formar un adhesivo tisular. Esta forma de proceder adolece, no obstante, de las siguientes desventajas importantes: para excluir la posibilidad de transmisión de virus, sólo la sangre del paciente a tratar puede ser utilizada para la obtención del concentrado de fibrinógeno. Puesto que la preparación del concentrado es laboriosa y consume tiempo, el uso en urgencias no es posible. Además, por el uso de sangre de un donante particular no se garantizan la invariabilidad en la composición y la calidad del concentrado de fibrinógeno.

En la solicitud de patente europea 0 014 333 A1 se describe, entre otros, procedimientos en los que se une fibrinógeno a gel de sílice coloidal (Aeorosil®) y se eluye de él.

Debido a las mencionadas desventajas tanto de los concentrados de fibrinógeno comerciales como también de aquellos que el propio usuario prepara, existe una demanda de un concentrado de fibrinógeno que en la forma lista para el uso (descongelado o disuelto) presente una capacidad de conservación tan larga como sea posible. El concentrado de fibrinógeno según la invención soluciona las dos desventajas de los anteriores adhesivos tisulares. Una ventaja en este caso es una más rápida disponibilidad, puesto que desaparece el tiempo requerido para descongelar o disolver el componente fibrinógeno. Otra ventaja adicional es que el componente fibrinógeno disuelto permanece funcional un mayor período de tiempo y no se tiene que desechar cuando no se lleva a cabo una adhesión prevista.

Es misión de la invención, por tanto, la puesta a disposición de un procedimiento para la preparación de un concentrado de fibrinógeno, que es almacenable al menos durante 4 semanas a +4 hasta +25ºC sin pérdida de funcionalidad. Tal solución debe ser utilizable especialmente en un adhesivo tisular.

El documento EP 0 085 923 describe la preparación de un concentrado de fibrinógeno que contiene arginina, que permanece estable durante un día de trabajo.

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora un procedimiento para la preparación de una solución de fibrinógeno que puede ser almacenada a lo largo de un período de tiempo mayor, sin perder sustancialmente coagulabilidad y, por tanto, perder su aptitud para una adhesión tisular. El procedimiento se caracteriza porque una solución de fibrinógeno se somete al menos a dos etapas de adsorción.

Una solución tratada de esta manera permite, incluso tras descongelación del estado congelado o tras disolución del estado liofilizado, un almacenamiento a lo largo de un mayor período de tiempo sin perder su funcionalidad.

Es objeto de la invención, por tanto, un procedimiento para la preparación de una solución de fibrinógeno concentrada con 1,5% hasta 15% de proteína plasmática coagulable que puede ser almacenada al menos durante cuatro semanas a +4 hasta +25ºC, sin perder su funcionalidad, tratando un material de partida que contiene fibrinógeno, que contiene proteína plasmática coagulable, es tratado al menos dos veces con un agente de adsorción, siendo el agente de adsorción Al(OH)_{3}, un intercambiador de aniones o la sal poco soluble de un metal alcalinotérreo y obteniéndose en cada caso el sobrenadante.

Como solución de fibrinógeno se puede usar una solución de un crioprecipitado. Una solución de este tipo puede contener 1,5-15, preferentemente 5-11%, de proteína plasmática coagulable.

La concentración de la sal alcalinotérrea o del hidróxido de aluminio en la adsorción se encuentra entre 0,05 y 2,5% (peso/vol.), preferentemente 0,05-0,5% (peso/vol.) y la cantidad empleada de intercambiador de iones es 0,05-20 g, preferentemente 3-10 g por kg de crioprecipitado.

La solución de fibrinógeno se puede eventualmente purificar a continuación por procedimientos (por ej. documento EP 0 103 196) conocidos por el especialista. La solución de fibrinógeno, así obtenida, puede ser almacenada en forma líquida, congelarse o liofilizarse. El almacenamiento de la solución de fibrinógeno o de una solución de fibrinógeno obtenida tras congelar y descongelar la solución o disolver una solución secada puede tener lugar a una temperatura de +1ºC hasta +37ºC. Preferentemente se almacena a una temperatura de +4ºC hasta +25ºC. Una solución según la invención es estable al menos durante 4 semanas.

Una solución estable, preparada según el procedimiento según la invención puede usarse como componente de un adhesivo de fibrina.

Los siguientes ejemplos explican la invención.

Ejemplo 1 Preparación de un concentrado de fibrinógeno

Se disolvió un crioprecipitado de plasma al citrato en solución isotónica de sal común (2,8 l/kg). Después se añadió 5% (vol./vol.) de una suspensión de hidróxido de aluminio (1,5% peso/vol.) y la mezcla se agitó durante 15 min. El hidróxido de aluminio se separó por centrifugación y al sobrenadante se le añadió otra vez la misma cantidad de hidróxido de aluminio así como 5,25 g de QAE-Sephadex A-50 por kg de crioprecipitado. Tras 15 min se centrifugó de nuevo. Se añadió al sobrenadante glicina bajo agitación hasta una concentración final de 2,7 mol/l, el precipitado originado se separó por centrifugación y se disolvió en una solución isotónica de sal común (1,5 l/kg). La solución se mezcló con glicina (concentración final 1,15 mol/l) y se agitó durante 30 min. Después se centrifugó y se desechó el residuo. El sobrenadante se trató con glicina (concentración final 2,15 mol/l) y se agitó durante 30 min. El precipitado se separó por centrifugación, se recogió en 0,05 mol/l de NaCl, 0,005 mol/l de citrato trisódico, 0,02 mol/l de arginina, pH 7,5 y se dializó frente al mismo tampón.

Ejemplo 2 Preparación de un concentrado de fibrinógeno con contenido en factor XIII

El concentrado de fibrinógeno del Ejemplo 1 se trató con 20 U/ml de factor XIII del plasma y 3,3 mg/ml de albúmina humana. La solución se ajustó a una densidad óptica (280 nm) de 35-37 y se liofilizó.

Ejemplo 3 Estabilidad de concentrados de fibrinógeno en solución con contenido en factor XIII a +4-8ºC

Los concentrados de fibrinógeno liofilizados se disolvieron con 1 ml de una solución de 1000 UIC/ml de aprotinina en una solución fisiológica de sal común y se almacenaron a +4-8ºC. La concentración del fibrinógeno coagulable se determinó con el ensayo según Clauss, la actividad del factor XIII con un ensayo cromógeno (factor XIII ^{R}Berichrom).

1

	A) Concentrado de fibrinógeno del Ejemplo 1 con factor XIII plasmático
	B) Crioprecipitado no adsorbido como concentrado de fibrinógeno
	1) Fibrinógeno (mg/ml)
	2) Factor XIII (U/ml)
	3) No vuelve a licuarse por calentamiento

Ejemplo 4 Estabilidad del concentrado de fibrinógeno en solución con contenido en factor XIII a 20ºC

Un concentrado de fibrinógeno liofilizado según la invención se disolvió en 1 ml de una solución de 1000 UIC/ml de aprotinina en una solución fisiológica de sal común y se almacenó a +20ºC. La concentración del fibrinógeno coagulable se determinó con el ensayo según Clauss, la actividad del factor XIII con un ensayo cromógeno (factor XIII ^{R}Berichrom).

2

Claims (3)

1. Procedimiento para la preparación de una solución concentrada de fibrinógeno con 1,5% hasta 15% de proteína plasmática coagulable, que puede ser almacenada al menos durante cuatro semanas a +4 hasta +25ºC sin perder su funcionalidad, caracterizado porque el material de partida con contenido en fibrinógeno, que contiene proteína plasmática coagulable, se trata al menos dos veces con un agente de adsorción, siendo el agente de adsorción Al(OH)_{3}, un intercambiador de aniones o la sal poco soluble de un metal alcalinotérreo y obteniéndose en cada caso el sobrenadante.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como solución de partida apropiada se toma un crioprecipitado.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque se trata dos veces con Al(OH)_{3} y una vez con QAE-Sephadex® A-50.