ES2228660T3 - Complejacion de arn, especialmente de ribozimas, con polietileniminas para su estabilizacion e introduccion celular. - Google Patents
Complejacion de arn, especialmente de ribozimas, con polietileniminas para su estabilizacion e introduccion celular.Info
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Abstract
Uso de un complejo de ribozima con polietilenimina (PEI), que opcionalmente está modificada con polímeros hidrófilos acoplados a ella, para la protección de la ribozima frente a la degradación intra o extracelular, enzimática o no enzimática, presentando la PEI un peso molecular en el intervalo de 700 a 25.000 Dalton.
Description
Complejación de ARN, especialmente de ribozimas,
con polietileniminas para su estabilización e introducción
celular.
La invención se refiere a la estabilización extra
e intracelular de moléculas de ARN modificadas o no modificadas,
especialmente de ribozimas, frente a la degradación enzimática y no
enzimática, por medio de complejación con macromoléculas basadas en
polietilenimina (PEI), así como a la introducción de estos complejos
en células con la liberación subsiguiente de moléculas de ARN
biológicamente activas.
En el documento
WO-A-96/02655 se describen complejos
de ácido desoxirribonucleico (ADN) con polietileniminas con un peso
molecular medio de 50 kDa u 800 kDa y su uso en la terapia
génica.
En el documento
WO-A-98/59064 se describen complejos
de ADN con polietileniminas modificadas con un peso molecular medio
de 800 kDa y su uso para la transferencia génica en células de
mamíferos.
En M.A. Reynolds (Exogenous Delivery of Ribozymes
[Administración exógena de ribozimas], en: Scanlon, K.J. y
Kashani-Sabet, M. (editores) Ribozymes in the
Gene Therapy of Cancer [Ribozimas en la terapia génica del
cáncer], págs. 41-60. R.G. Landes Company, 1998) se
hace referencia a la observación no publicada de que con el uso de
ribozimas marcadas con colorante fluorescente, no descritas en
detalle, en el cultivo celular con una PEI no descrita en detalle
pudo obtenerse una marcación fluorescente nuclear de las células de
más del 70%.
Los ácidos ribonucleicos llevan a cabo varias
funciones en la célula y se denominan de manera correspondiente,
entre otros, como ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia
(ARNt), ARN ribosómico (ARNr).
Determinadas moléculas especializadas de ARN, las
denominadas ribozimas, tienen una importancia especial desde el
punto de vista biomédico. Las ribozimas son moléculas de ARN
pequeñas, catalíticamente activas, que pueden escindir, de manera
específica en cuanto a la secuencia, otras moléculas de ARN
importantes para funciones celulares esenciales. Con ello se
produce la regulación por disminución de la expresión del gen
respectivo, es decir, la inhibición de funciones del gen
específicas. En función de su estructura, función, actividad y
tamaño pueden diferenciarse distintas ribozimas o clases de
ribozimas (véase la tabla 1). En lo anterior, los componentes
proteicos asociados opcionalmente sirven para la estabilización y
el aumento de la eficacia y no son el propio portador de la
actividad catalítica.
\newpage
Ribonucleasa (5'OH) representa una actividad
ribonucleasa, que produce un extremo 5'-OH y un
resto 2'-3'-fosfato cíclico,
ribonucleasa (5'P) representa una reacción, en la que se producen
un extremo 5'-fosfato y un extremo
3'-OH.
Las ribozimas hammerhead pertenecen a las
moléculas de ARN catalíticas más pequeñas y mejor investigadas y
pueden escindir otras moléculas de ARN de manera específica en
cuanto a la secuencia. La ribozima hammerhead utilizada más
frecuentemente se deriva de la ribozima original según
Haseloff-Gerlach (Nature 334, 585-59
(1988)), que se modificó y se redujo a un centro catalítico que
comprende 22 nucleótidos. Esta secuencia central, cuya estructura
tridimensional y catalíticamente activa se produce por el
apareamiento de bases de Watson-Crick, está
flanqueada por dos brazos, que también hibridan específicamente,
debido a un apareamiento de bases de Watson-Crick,
con el segmento complementario de la secuencia del ARN diana y, con
ello, llevan a la zona catalíticamente activa de la ribozima a una
proximidad espacial suficiente respecto al punto de escisión del
ARN diana. Por medio de la escisión específica con degradación
celular subsiguiente de las moléculas de ARN de determinados genes,
las ribozimas pueden utilizarse de esta manera, entre otras cosas,
para la inhibición diagnóstica y terapéutica de funciones génicas
específicas.
Los mayores obstáculos, que deben salvarse hasta
el momento para el uso de las ribozimas, son la alta
susceptibilidad de las moléculas frente a la degradación enzimática
mediante enzimas con presencia ubicua, intra y extracelulares, que
degradan el ARN (ribonucleasas, RNasas), así como la mala
penetración de las ribozimas en las células.
Mientras que las moléculas de ARN naturales (por
ejemplo ARNm y ARNt), producidas intracelularmente, disponen en la
célula intacta al menos de una estabilidad limitada en determinadas
condiciones, mediante propiedades específicas de la estructura y
modificaciones celulares, las moléculas de ARN sintéticas, tales
como las ribozimas, sólo pueden protegerse frente a esta
degradación rápida por medio de modificaciones químicas. Sin
embargo, estas modificaciones químicas están afectadas por
desventajas esenciales:
- limitación de la función, hasta la pérdida
total de actividad de la ribozima
- formación de ribozimas modificadas con
propiedades desfavorables, especialmente citotóxicas
- complejidad muy alta para el desarrollo de
estas modificaciones químicas y su transformación química
A pesar de esto, debido a la importancia
terapéutica potencialmente destacable de las ribozimas se han
realizado numerosos esfuerzos para la estabilización por medio de
modificaciones químicas (por ejemplo, Heidenreich et al., J.
Biol. Chem. 269, 2131-2138 (1994); Pieken et
al., Science 253, 314-317 (1991)). Sin embargo,
también aquí es válido que estas modificaciones, en primer lugar,
llevan normalmente a la inactivación de la ribozima, y en segundo
lugar, requieren una síntesis muy compleja y cara.
En resumen puede decirse que un procedimiento
eficaz que
- proteja a las moléculas de ARN frente a la
degradación y que, sin embargo,
- varíe la estructura de las moléculas lo menos
posible, así como
- que no influya en lo posible en su función,
es de gran interés científico y económico,
orientado a los principios y al uso.
En la presente invención se describe que las
moléculas de ARN, especialmente las ribozimas, pueden protegerse
por medio de la complejación con macromoléculas basadas en
polietilenimina (PEI) frente a la degradación enzimática y no
enzimática, extra e intracelularmente. Incluso las ribozimas, que
siempre están sujetas a una degradación especialmente rápida, se
protegen con ello completamente frente a la degradación, sin que
tenga lugar una pérdida de actividad. Los complejos de
ribozima-PEI son estables incluso en medios
biológicos que contienen suero. Además se produce un complejo con
baja toxicidad que puede introducir ribozimas en forma
funcionalmente activa, de manera muy eficiente, en células vivas y
con ello manipular procesos celulares en la forma deseada. Más allá
de las ribozimas, la complejación de ARN permite finalmente un uso
mucho más amplio y variado para la estabilización de las moléculas
de ARN más diversas.
Representado a modo de resumen, el método es
adecuado de esta manera
\sqbullet para la estabilización de moléculas
de ARN, especialmente ribozimas, frente a la degradación enzimática
y no enzimática in vitro e in vivo, extracelular e
intracelularmente,
\sqbullet para la estabilización de moléculas
de ARN, especialmente ribozimas, durante el almacenamiento
\sqbullet para la estabilización de moléculas
de ARN, especialmente ribozimas, durante el transporte
\sqbullet para la estabilización de moléculas
de ARN, especialmente ribozimas, durante su uso en experimentos de
laboratorio
\sqbullet como vector para moléculas de ARN,
especialmente para ribozimas en usos de transferencia génica in
vivo (terapia génica)
\sqbullet como vector para moléculas de ARN,
especialmente para ribozimas, para el uso en experimentos de
cultivo celular.
Por tanto, la invención se refiere a complejos de
ARN, especialmente ribozimas, y polietilenimina (PEI), en los que
la PEI presenta un peso molecular de 700, preferiblemente de 1.400
a 25.000 Da, especialmente de 1.600 a 15.000 Da. Se prefieren los
complejos según la invención, en los que la relación molar de los
átomos de nitrógeno en la PEI respecto a los átomos de fósforo en el
ARN (valor de N/P) es de 1 a 100, preferiblemente de 2 a 40,
especialmente de 3 a 10.
En los complejos según la invención, la PEI puede
estar modificada por medio de ligandos celulares. Esta modificación
puede tener lugar antes o después de la complejación del ARN.
También puede tener lugar una modificación por medio de polímeros
hidrófilos, como, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), con un peso
molecular de 100 a 10.000.000 g/mol, preferiblemente de 1.000 a
100.000 g/mol y especialmente de 5.000 a 50.000 g/mol. En lo
anterior, una PEI puede estar modificada por medio de uno o varios
polímeros hidrófilos o un polímero hidrófilo puede estar modificado
por medio de una o varias PEI. En la solicitud internacional
PCT/EP00/06214 están descritos este tipo de PEI modificadas y
procedimientos para su producción.
El ARN que debe protegerse puede ser cualquier
ARN, especialmente un ARN mensajero (ARNm), un ARN ribosómico
(ARNr), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN del núcleo (ARN
nuclear), una ribozima de ARN, un ARN transcrito in vitro o
un ARN sintetizado químicamente, con lo que todas las moléculas de
ARN mencionadas pueden estar modificadas químicamente. En lo
anterior, el ARN puede presentar de 10 a 10.000 nucleótidos,
preferiblemente de 15 a 1.500 nucleótidos, especialmente de 20 a
1.000 nucleótidos. En el caso de las ribozimas se prefieren
longitudes de cadena de 20 - 600 nucleótidos, especialmente de 35 -
80 nucleótidos.
Se prefieren los complejos en los que el ARN es
una ribozima, especialmente una ribozima hammerhead o hairpin, o en
los que se trata de aptámeros de ARN o secuencias antisentido.
Además se prefieren complejos en los que el ARN codifica completa o
parcialmente para un péptido o una proteína terapéuticamente
eficaces o para un gen celular suicida.
Además, la invención se refiere a un
procedimiento para la producción de un complejo según la invención,
en el que el ARN se compleja por medio del mezclado de las
disoluciones diluidas con la PEI modificada opcionalmente por medio
de ligandos celulares o por medio de otros polímeros.
La producción de los complejos según la invención
se realiza técnicamente como sigue:
Para la complejación de ARN, especialmente de
ribozimas, con PEI se prepara una disolución acuosa del ARN. El ARN
puede estar modificado químicamente o no modificado. Se prefieren
los procedimientos según la invención en los que la concentración
de ARN es preferiblemente de 0,1 - 100 \mug/ml, especialmente de
10 - 40 \mug/ml.
Como reactivos de complejación son adecuados los
preparados comerciales de PEI modificadas o no modificadas, así
como las PEI no comerciales modificadas o no modificadas, como, por
ejemplo, PEI LMW (Low Molecular Weight, de bajo peso molecular)
(Fischer et al. Pharm. Res. 16, 1273-9
(1999)). Para la producción de la disolución madre respectiva, la
PEI correspondiente se disuelve en agua bidestilada y se ajusta el
valor de pH con una disolución de HCl aproximadamente 100 mM hasta
un valor de pH neutral, preferiblemente de entre 7 y 8,
prefiriéndose especialmente un pH de 7,4.
Directamente antes de la realización de la
reacción de complejación, la disolución madre de PEI (en cuanto a
la cantidad utilizada véanse las tablas 2 y 3 que se encuentran a
continuación) se ajusta al volumen deseado con una disolución de
NaCl acuosa, neutral, aproximadamente 150 mM, con pH de 7 a 8,
preferiblemente de 7,4, y se incuba algún tiempo, preferiblemente al
menos 10 min a temperatura ambiente.
El ARN (en cuanto a la cantidad utilizada véanse,
por ejemplo, las tablas 2 y 3 que se encuentran a continuación) se
lleva al volumen deseado, prefiriéndose especialmente el mismo
volumen que la disolución de PEI, con una disolución de NaCl
acuosa, aproximadamente 150 mM, con pH de 7 a 8, preferiblemente de
7,4, y se incuba algún tiempo, preferiblemente al menos 10 min a
temperatura ambiente.
A continuación se mezclan las disoluciones de PEI
y de ARN (en cuanto a las relaciones de mezcla véanse, por ejemplo,
las tablas 2 y 3 que se encuentran a continuación), y se incuban
algún tiempo, preferiblemente al menos 10 min a temperatura
ambiente. En lo anterior, la mezcla puede agitarse o tratarse en un
vórtex una vez o varias veces.
La composición del complejo y la carga neta se
calculan en base al fósforo de ARN respecto al nitrógeno de PEI y
se indican como relación de nitrógeno-fósforo
(relación de N/P, véase lo expuesto anteriormente) según Boussif
et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 92,
7297-7301 (1995)) o relación de
fósforo-nitrógeno.
Como base de cálculo sirve la siguiente
fórmula:
1 \mug de ARN
= 3 nmol de
fósforo
así
como
1 \mul de
disolución de PEI = 10 nmol de
nitrógeno
La relación de mezcla básica de una mezcla básica
estándar con 2 \mug de ARN y las cantidades correspondientes de
PEI se resumen en las siguientes tablas utilizando como ejemplo dos
preparados de PEI (sin embargo, véanse también las realizaciones
más extensas a continuación):
\newpage
Después de realizada la incubación, los complejos
están listos para su uso o pueden utilizarse en otras
modificaciones químicas.
La invención se refiere a los procedimientos
representados para la protección del ARN, especialmente de
ribozimas, frente a la degradación enzimática y no enzimática, en
las que las moléculas de ARN se estabilizan en el complejo con PEI
modificadas o no modificadas, así como a procedimientos en los que
las ribozimas de ARN se protegen de la degradación mediante
nucleasas.
Otro aspecto de la invención son procedimientos
para la introducción de ARN, especialmente ribozimas, en células,
preferiblemente en células eucariotas, y su liberación intracelular
en una forma biológicamente activa.
Además, la invención se refiere a composiciones,
que contienen una cantidad eficaz de al menos un complejo de
ARN-PEI según la invención, con lo que el ARN puede
encontrarse en cualquier concentración subtóxica, o al menos aún no
citotóxica de manera duradera en el caso de un tratamiento de varias
horas, para células o para el organismo respectivo.
Además, la invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de al menos un
complejo de ARN-PEI según la invención y uno o
varios vehículos fisiológicamente inofensivos.
La relación de ARN / PEI puede indicarse a través
de la relación molar de los átomos de nitrógeno en la PEI respecto
a los átomos de fósforo en el ARN (valor de N/P). El valor de N/P
no puede ser demasiado bajo para una complejación completa del
ARN.
Sin embargo, el valor de N/P de los complejos
puede variar ante todo hacia arriba en un amplio intervalo, puede
encontrarse en el intervalo de aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 100. Preferiblemente, la relación es de
aproximadamente 2 a aproximadamente 40, de manera especialmente
preferida la relación es de 3 a 10.
Mediante ensayos previos pueden determinarse
valores de N/P óptimos para el caso de aplicación especial, por
ejemplo para el tipo de ARN respectivo, especialmente para
ribozimas, para PEI de determinadas masas molares o para el tipo de
célula respectivo. En ello, en el caso del aumento gradual de la
relación en condiciones por lo demás idénticas, los parámetros más
importantes son el alcance de la protección del ARN, especialmente
de la ribozima, la eficacia de la transferencia de ARN,
especialmente de la transferencia de ribozima, la actividad
intracelular de la ribozima y la exclusión de efectos tóxicos del
complejo o de componentes individuales, opcionalmente también el
ahorro de material o las cinéticas temporales.
La PEI utilizada aquí para la complejación
presenta pesos moleculares de entre 700 y 1.000.000 Da. A lo largo
del intervalo completo de pesos moleculares, así como
independientemente del grado de ramificación, todas las moléculas de
PEI son adecuadas, modificadas o no modificadas, para la protección
de moléculas de ARN, especialmente de ribozimas, pero presentan
diferencias en cuanto a la absorción celular de los complejos. Las
moléculas de PEI grandes muestran ya en el caso de relaciones de
N/P bajas una eficacia óptima en la absorción celular, pero son más
tóxicas que las moléculas de PEI pequeñas. Éstas últimas requieren
una relación de N/P más elevada para la complejación con igual
cantidad de ARN, especialmente cantidad de ribozima, sin ser tóxicas
en una medida comparable. En ensayos previos puede determinarse qué
molécula de PEI se utiliza en cada caso individual.
Pueden describirse, por ejemplo, por medio de la
fórmula I estructural,
en la que R es un resto de fórmula
II,
en la que R' significa hidrógeno, p
es un número entero positivo, q es 0 o un número entero positivo y
(p + q) es 15
- 25.000, preferiblemente 30 - 600, especialmente 35 - 400. Además, II también puede estar ramificada. Entonces R' es un resto de una PEI, que tiene una estructura análoga a la fórmula II.
- 25.000, preferiblemente 30 - 600, especialmente 35 - 400. Además, II también puede estar ramificada. Entonces R' es un resto de una PEI, que tiene una estructura análoga a la fórmula II.
En el marco de la presente invención se prefieren
las moléculas de PEI en el intervalo de pesos moleculares de entre
1.400 y 25.000.
Para ello es adecuada la PEI LMW ("low
molecular weight PEI", PEI de bajo peso molecular), que se
produce a partir de aziridina (monómero de etilenimina) por medio
de la polimerización por apertura de anillo en disolución acuosa con
catálisis ácida. La síntesis se describe en Fischer et al.,
Pharm. Res. 16, 1273-9 (1999).
Además pueden utilizarse preparados de PEI que
pueden obtenerse comercialmente con diferentes pesos moleculares.
Ejemplos son PEI 700 Da, PEI 2000 Da y PEI 25000 Da (empresa
Aldrich), así como, ofrecidas por la empresa BASF bajo el nombre de
marca Lupasol®, 800 Da (Lupasol® FG), 1300 Da (Lupasol® G20
anhidro), 1300 Da (Lupasol® G 20), 2000 Da (Lupasol® G 35) y 25000
Da (Lupasol® WF).
La PEI puede estar modificada por medio de un
ligando celular, a continuación denominado "Q". Por un ligando
celular se entiende un grupo que lleva a cabo una función biológica
específica o no específica, especialmente que representa un ligando
para la interacción con receptores u otras proteínas celulares. La
modificación con un ligando sirve especialmente para la absorción,
específica en cuanto a la célula diana, de un complejo de
ARN-PEI-Q en células superiores
eucariotas y sus núcleos celulares, con lo que el ARN
preferiblemente es una ribozima (Gentargeting, "gene
targeting", reconocimiento génico).
Por tanto, Q también puede ser un ligando para
una interacción específica y para la absorción preferida de los
complejos de ARN-PEI-Q en células,
tejidos u órganos diana. Ejemplos de Q son proteínas,
especialmente
\sqbullet anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos, tales como Fab, F(ab_{2}), scFv, o
\sqbullet citocinas o linfocinas, tales como
interleucina (IL-2 a X), interferón,
GM-CSF (factor estimulador de colonias de
granulocitos y macrófagos), o
\sqbullet factores de crecimiento, tales como
EGF, PDGF, FGF, EPO, o
\sqbullet integrinas, tales como ICAM, VCAM,
o
\sqbullet glucoproteínas, tales como lectinas o
proteínas glicosiladas (véase lo descrito anteriormente), o
\sqbullet lipoproteínas, tales como LDL, HDL,
o
\sqbullet proteínas transportadores, tales como
transferrina, o
\sqbullet péptidos, tales como
LH-RH, calcitonina, oxitocina, insulina,
somatostatina, IGF, RGD, o
\sqbullet hidratos de carbono, tales como
galactosa, manosa, glucosa, lactosa, u
\sqbullet hormonas, tales como esteroides, THR,
o
\sqbullet vitaminas, tales como vitamina B12,
ácido fólico.
En relación a una alta eficacia de transferencia
génica, para determinados usos in vivo se requiere que los
complejos según la invención estén presentes en alta concentración.
Los complejos según la invención presentan la ventaja de que pueden
llevarse a la alta concentración requerida a partir de disoluciones
diluidas, por ejemplo, por medio de métodos físicos, tales como
ultracentrifugación, ultrafiltración o diálisis a presión, sin que
tenga lugar una formación de agregados digna de ser mencionada u
otra alteración de los complejos, que afectaría la eficacia de la
transferencia génica.
Especialmente, la composición se encuentra en
forma de una composición farmacéutica. En esta conformación, la
composición no sólo sirve para la protección del ARN, sino también
para la transferencia de ARN a células, especialmente células
eucariotas, prefiriéndose especialmente células de mamíferos, in
vivo o in vitro. Contiene como principio activo un
complejo, que contiene un ARN terapéuticamente eficaz, especialmente
una ribozima o varias ribozimas. Con la ayuda de la composición
farmacéutica según la invención, en el caso de la aplicación local
puede conseguirse una alta concentración de ARN terapéuticamente
eficaz en las células diana, o en el caso de experimentos in
vivo en el tejido diana. En el caso de la aplicación sistémica,
la composición tiene la ventaja de que los complejos no se someten
ni a una unión no específica ni a una degradación inducida por el
sistema inmunológico debido a la inhibición de la opsonización.
Por medio de la inhibición o la disminución de
las uniones no específicas con la introducción simultánea de
ligandos que se unen a la célula (específicos en cuanto al tipo de
célula) en los complejos, puede conseguirse un "targeting"
(reconocimiento) específico respecto a determinadas células, órganos
o tejidos y, con ello, una expresión génica dirigida a la diana
(por ejemplo, en tejidos tumorales) u otro efecto, después de la
administración sistémica.
En tejidos con una permeabilidad vascular
aumentada o con daños vasculares, los complejos de
ARN-PEI según la invención pueden salir de la
circulación sanguínea hacia los tejidos circundantes y acumularse
allí. Las zonas en las que tiene lugar de manera marcada un
"targeting pasivo" de este tipo son, por ejemplo, tumores bien
irrigados, así como zonas de inflamación. Entonces, en algunos de
estos casos se conseguirá ya una selectividad de la diana
suficientemente alta, de manera que la unión de PEI con ligandos
específicos de la célula diana puede no tener lugar.
Entre otros, la composición farmacéutica puede
utilizarse ventajosamente para la terapia de enfermedades
tumorales, para administrar ARN, especialmente ribozimas. de manera
intratumoral o sistémica.
Otro uso en el que surten efecto las ventajas de
la composición según la invención es la denominada vacunación
tumoral genética. En lo anterior, los complejos utilizados
contienen ARN, que codifica para uno o varios antígenos tumorales o
fragmentos de los mismos.
La composición farmacéutica del complejo según la
invención se encuentra preferiblemente como producto liofilizado,
opcionalmente con la adición de azúcar, tal como sacarosa o
dextrosa, en una cantidad tal que en la disolución lista para
utilizar tenga como resultado una concentración fisiológica. La
composición según la invención también puede existir ultracongelada
(crioconservada) o como disolución enfriada y puede contener otros
aditivos.
Las composiciones según la invención pueden
existir opcionalmente en forma de un kit, con lo que los
componentes individuales ARN, especialmente ribozimas, por un lado,
y PEI, a la que opcionalmente está acoplado un ligando, por otro
lado, se encuentran en recipientes separados.
Los siguientes ejemplos sirven para explicar la
invención, sin que ésta se limite a ellos.
Protección de oligonucleótidos de ARN (37
nucleótidos) no modificados, sintetizados químicamente, frente a la
degradación enzimática, por medio de la complejación con
PEI.
La complejación hasta el momento no descrita en
la bibliografía entre ribozimas hammerhead y PEI se analizó en
relación a la estabilidad de la ribozima frente a la degradación
mediante nucleasas del suero. Una prolongación de la vida media
biológica en presencia de suero, conseguida de esta manera, haría
posible una aplicación sistémica de ribozimas no modificadas, que
son superiores a sus análogos químicamente modificados en relación
a la actividad catalítica y los costes de producción.
Para los ensayos se utilizaron dos disoluciones
de polietilenimina con diferentes pesos moleculares. PEI HMW se
adquirió como disolución acuosa al 50% de la empresa Fluka
(Neu-Ulm) con un peso molecular de
600-1000 kDa (indicación del fabricante,
determinado mediante viscosimetría). Para la preparación de la
disolución madre se disolvieron 9,0 mg de PEI HMW en 8 ml de agua
bidestilada, el valor de pH se ajustó a 7,4 con una disolución de
HCl 0,1 N y se completaron los 10,0 ml con agua bidestilada.
La PEI LMW se preparó a partir de aziridina
(monómero de etilenimina) por medio de polimerización por apertura
de anillo en disolución acuosa con catálisis ácida. El peso
molecular \leq 10 kDa se determinó mediante medición de luz
dispersa de un láser de la empresa Wellensieck (Minden), (Fischer
et al., Pharm. Res. 16, 1273-9
(1999)). Para la preparación de la disolución madre se disolvieron
9,0 mg de PEI LMW en 8 ml de agua bidestilada, el valor de pH se
ajustó a 7,4 con una disolución de HCl 0,1 N y se completaron los
10,0 ml con agua bidestilada.
En cuanto al oligonucleótido de ARN se trata de
una ribozima hammerhead con un largo de 37 bases, que estaba dotado
de un grupo protector
5'-O-DMT-ON-2'-Ofpmp
(empresa MWG-Biotech GmbH, Ebersberg). Para los
análisis de estabilidad, el grupo protector se escindió mediante un
kit de eliminación de grupo protector también suministrado (empresa
Cruachem, Glasgow) por medio de hidrólisis ácida y el ARN
desprotegido se obtuvo mediante precipitación en etanol.
La complejación de los oligonucleótidos con PEI
se realizó según las instrucciones descritas anteriormente.
Se eligieron para PEI HMW cinco y para PEI LMW
siete relaciones de oligonucleótido-PEI diferentes.
La selección tuvo lugar en base a los ensayos de complejación entre
PEI HMW y LMW y el plásmido cMV-nlacZ (Fischer,
Nichtvirale Vektoren zur Gentherapie: Kationische Polymere als
Vektorsysteme für den Transfer von DNA [Vectores no virales para la
terapia génica: Polímeros catiónicos como sistemas de vectores para
la transferencia de ADN], Cuvillier Verlag (editorial), Göttingen,
1ª edición (1998)).
Las relaciones de mezcla básica de una mezcla
básica estándar con 2 \mug de oligonucleótidos y las cantidades
de PEI transformadas con ello se resumen en las siguientes
tablas:
Para una primera orientación sobre si las PEI
protegen a las ribozimas frente a la degradación mediante nucleasas
del suero, se seleccionaron los complejos de PEI HMW 1 + 13,3 y PEI
LMW 1 + 66,6 y se incubaron durante 5 y 15 minutos a 37ºC en 100%
de FCS. La selección de estos dos complejos tuvo lugar debido a las
altas velocidades de transfección descritas de complejos de
plásmidos en comparación con los otros complejos de PEI HMW y LMW
(Fischer et al., Pharm. Res. 16,
1273-9 (1999)). Después de realizada la incubación,
las proteínas del suero se desnaturalizaron mediante inactivación
por calor, incubando las mezclas básicas durante 30 min en un baño
de agua a 70ºC. Por medio de la adición de 8 \mul de una
disolución de SDS al 10% se destruyeron las enzimas aún activas y
simultáneamente se liberaron las ribozimas de los complejos con
PEI. Las mezclas se separaron a continuación electroforéticamente y
las bandas de ARN intactas se detectaron mediante un colorante de
cianina fluorescente (SYBR-Gold®, empresa MoBiTech,
Göttingen), que se une al ARN o ADN mono o bicatenario.
Al contrario que las ribozimas no complejadas,
que ya se habían degradado completamente después de 5 min, las
ribozimas complejadas con PEI HMW o PEI LMW se protegieron casi
completamente a lo largo de una duración de la incubación de 15 min
frente a la degradación mediante las nucleasas contenidas en el
suero.
Ahora se prepararon complejos de PEI HWM y PEI
LMW en las relaciones de nitrógeno-fosfato
analizadas previamente y se incubaron durante 15-120
min en 10% de suero de manera análoga al ensayo anterior. Para
controlar los resultados del ensayo, junto a las ribozimas no
complejadas también se aplicaron las ribozimas en los complejos con
PEI HMW (1 + 1) y PEI LMW (1 + 2), en los que no tiene lugar una
complejación completa, como se conoce de los ensayos previos, y que
por tanto no deberían ofrecer ninguna protección al ARN frente a la
degradación. Tanto las ribozimas no complejadas, como también los
oligonucleótidos de ARN, que se complejaron con PEI en relaciones de
nitrógeno-fosfato demasiado bajas se habían
degradado completamente según lo esperado tanto después de 60 min
como también después de 120 min mediante las nucleasas del suero.
Los otros dos complejos (PEI HMW 1 + 13,3 y PEI LMW 1 + 66,6), que
debido a una complejación completa de la ribozima por medio de PEI
ya habían mostrado un efecto de protección frente a la degradación
enzimática mediante las nucleasas del suero a lo largo de un
periodo de tiempo de 30 min, también estabilizaron la ribozima a lo
largo de 60 min y 120 min.
Por tanto, finalmente puede retenerse que PEI HMW
y PEI LMW son capaces de proteger a las ribozimas de ARN
complejadas a partir de relaciones de
nitrógeno-fosfato de 1 + 6,67 (PEI HMW) y 1 + 13,3
(PEI LMW) frente a la degradación mediante nucleasas del suero
durante un periodo de tiempo de al menos 120 min. Esta prolongación
de la vida media biológica de unos pocos minutos a más de dos horas
hace posible utilizar ribozimas de ARN no modificadas tanto para
experimentos de transfección in vitro, como también in
vivo.
Protección de moléculas de ARN (300 - 800
nucléotidos) no modificadas, transcritas in vitro frente a
la degradación enzimática por medio de la complejación con
PEI.
Como se mostró en el ejemplo 1, las moléculas de
ARN más cortas, que según su longitud se corresponden con moléculas
de ARNt o ribozimas hammerhead, pudieron estabilizarse por medio de
complejación con PEI. En un segundo paso se analizó si también las
moléculas de ARN más largas (de hasta 1000 nucleótidos), que se
corresponden con moléculas de ARNm, se protegen de la misma manera.
Puesto que las moléculas de ARN tan largas no pueden sintetizarse
químicamente, aquí se utilizó el método de la transcripción in
vitro (kit de trascripción in vitro de la empresa
Promega). En lo anterior, una plantilla de ADN (ADN de plásmido) se
transcribió mediante ARN-polimerasa in vitro
en ARN. Este ARN es similar en su longitud y su estructura al ARNm
celular, aunque faltan elementos estabilizadores importantes, como
la estructura 5'-Cap y la
3'-poly-A-Tail
(cola de poli A en el extremo 3'). Por tanto, el ARN transcrito
in vitro es más sensible frente a la degradación mediante
ribonucleasas que el ARNm celular natural. Para una mejor
representación y cuantificación, el ARN se marcó radiactivamente por
medio de la introducción de nucleótidos marcados con ^{32}P. Para
los ensayos se produjeron dos moléculas diferentes de ARN, que
tenían una longitud de 300 u 800 nucleótidos.
Las moléculas de ARN marcadas radiactivamente,
complejadas con PEI LMW frente a las no complejadas, se incubaron o
bien con RNasa A recombinante (concentración final de 20 ng/ml) o
suero bovino fetal (concentración final del 1% - 40%) durante
diferentes intervalos de tiempo (0 - 120 minutos). Después de la
incubación, el ARN se separó electroforéticamente sobre un gel
desnaturalizante de formaldehído-agarosa, y el ARN
se transfirió a continuación mediante la técnica de
Northern-blot sobre una membrana de nylon que se une
a ARN. Para la valoración cualitativa, sobre la membrana seca se
expusieron películas radiográficas durante 2 - 8 d, en parte
utilizando un sistema amplificador (BioMax). Para cuantificar, se
registraron las señales radiactivas sobre las membranas de nylon a
través de un Phosphorimager de la empresa Molecular Dynamics y se
valoraron mediante un software de análisis de la misma empresa.
Los resultados se resumen en la figura 1.
Mientras que después de la incubación con RNasa A (concentración
final de 20 ng/ml) el ARN no complejado, según lo esperado, ya está
casi completamente degradado después de 15 minutos, más del 60% de
las moléculas de los ARN complejados con PEI están intactas incluso
después de 2 horas de incubación. Una cinética muy similar resulta
también después de la incubación con suero bovino fetal (figura 2).
Aquí, el ARN no complejado está completamente degradado después de
aproximadamente 30 minutos, después de la incubación con un 1% de
suero bovino fetal, mientras que los ARN complejados con PEI aún
están completamente intactos, incluso después de 120 minutos.
También en el caso del aumento de la concentración al 40% de suero
bovino fetal, el ARN complejado con PEI es claramente más estable
frente al ARN no complejado. Los resultados fueron idénticos para
las moléculas de ARN de diferentes longitudes. Los datos de los
gráficos son promedios de dos experimentos independientes.
En resumen puede afirmarse que las moléculas de
ARN (300 - 800 nucleótidos de longitud) no complejadas, transcritas
in vitro, se degradaron según lo esperado en un plazo corto
de tiempo por mediante las ribonucleasas. Por medio de la
complejación con PEI de bajo peso molecular (PEI LMW) pudo
prolongarse la vida media biológica del ARN en suero bovino fetal
(de hasta un 40% de concentración final) a por encima de dos
horas.
Se introducen ribozimas de ARN no modificadas,
sintetizadas químicamente, por medio de complejación con PEI LMW en
células tumorales y escinden su ARN diana con gran
eficacia.
Una vez demostrada en los primeros dos ejemplos
la estabilización de diferentes moléculas de ARN por medio de PEI
LMW, se analizó si el ARN complejado con PEI LMW llega a las
células y si no está afectado intracelularmente en su función
bioquímica.
Con este fin se utilizaron las ribozimas
hammerhead sintetizadas químicamente, descritas en el ejemplo 1.
Estas ribozimas están dirigidas contra el ARNm humano de una
proteína que se une a factor de crecimiento fibroblástico
(FGF-BP) (Czubayko et al., Nature Med.
3 (10), 1137-1140 (1997)). La proteína
FGF-BP se expresa en muchos tumores humanos y en
líneas celulares tumorales derivadas de éstos. La funcionalidad de
las ribozimas pudo demostrarse en experimentos anteriores porque,
después de la transfección estable de los vectores de expresión de
la ribozima eucarióticos en células tumorales
(ME-180 línea celular de carcinoma de cérvix,
LS174T línea celular de carcinoma de colon) se redujo claramente el
gen diana a nivel del ARNm y de las proteínas (Czubayko et
al., Nature Med. 3 (10), 1137-1140,
(1997)).
Mientras que este método de transferencia génica
es completamente inadecuado para alcanzar y tratar, por ejemplo,
tumores o metástasis sólidos in vivo, los complejos de
ribozima-PEI LMW podrían ofrecer aquí una excelente
alternativa. A partir de los datos previos de otros grupos se sabe
que PEI LMW media muy eficazmente, con baja toxicidad, la recepción
celular de ácidos desoxirribonucleicos.
Para los experimentos aquí descritos se
utilizaron las ribozimas sintetizadas químicamente, dirigidas
contra las FGF-BP (1,0 y 0,1 \mug; aproximadamente
10 o 1 nmol de concentración final) y se introdujeron en células
tumorales ME-180 mediante PEI LMW. Las dos
cantidades diferentes de ribozima se complejaron además en dos
diferentes relaciones con PEI LMW (relaciones de P/N de 1:13 y
1:53). Estos complejos de ribozima-PEI se colocaron
durante 4 horas en 10 ml de medio IMDM sin suero (empresa PAA)
sobre aproximadamente 1x10^{6} células ME-180, que
crecían como capa única sobre placas de cultivo celular de 10 cm.
Como control para efectos no específicos se trataron células
ME-180 con la misma cantidad de PEI LMW sin
ribozima complejada. Después se aspiró el medio de transfección y
las células se colocaron nuevamente sobre medio de crecimiento
normal (IMDM con 10% de FCS). En diferentes momentos después de
comenzar la transfección (6 - 36 horas) se lisaron las células y se
aisló la totalidad del ARN celular según el protocolo estándar
(reactivo Trizol, empresa Sigma). El ARN obtenido de esta manera se
analizó mediante Northern-blot, con lo que como
sonda se utilizó un ADNc de FGF-BP marcado
radiactivamente con ^{32}P. La detección de ARNm de
FGF-BP se realizó y cuantificó con la ayuda de
autorradiogramas y Phosphorimager. Como se desprende de las figuras
3 - 5, la transfección con PEI LMW-ribozimas llevó
a una reducción muy fuerte de la expresión génica de
FGF-BP, específica de la ribozima.
La reducción máxima fue de aproximadamente el 70%
en comparación con las células de control. Ambas relaciones de
ribozima-PEI, de 1:13 y 1:53, mostraron una
eficacia similar. De manera interesante, la dosis más baja de
ribozima de 0,1 \mug fue en ambas relaciones de PEI un poco más
eficaz, de manera que puede partirse de la base de que incluso
dosis más bajas ya pueden ser muy eficaces.
Esta inhibición marcada de la expresión génica de
FGF-BP de un máximo del 70% después de 24 horas es
aún más notable si se la mira en el contexto de investigaciones
comparativas. En estudios de transfección transitoria con
diferentes vectores de transferencia génica (por ejemplo, ADN de
plásmido, vectores adenovirales, diferentes vesículas lipídicas) no
pudieron observarse inhibiciones de más del 25% ni con ribozimas ni
con oligonucleótidos de ADN. Especialmente, con moléculas híbridas
de ARN/ADN-ribozima estabilizadas químicamente (se
ven como criterio de referencia), que fueron puestas a disposición
por la empresa líder en este campo (Ribozyme Pharmaceuticals,
Boulder, Colorado, EE.UU.), no se detectó ninguna reducción del ARN
diana (datos no publicados).
Es decir que puede retenerse que esta combinación
de PEI LMW y ribozimas de ARN no modificadas es un agente nuevo y
extraordinariamente eficaz para la reducción selectiva de la
expresión de genes a elección.
Las ribozimas de ARN complejadas con PEI LMW,
no modificadas, sintetizadas químicamente, llevan a una inhibición
específica del crecimiento de xenotrasplantes de melanoma humano
tras la aplicación intraperitoneal en ratones desnudos
atímicos.
Una vez mostradas en los tres primeros ejemplos
la estabilización de diferentes moléculas de ARN por medio de PEI
LMW, así como la actividad biológica de las ribozimas complejadas
con PEI LMW en células tumorales humanas en experimentos de cultivo
celular, se analizó si la aplicación sistémica de ribozimas
complejadas con PEI LMW puede inhibir el crecimiento de
xenotrasplantes de células tumorales humanas en ratones desnudos
atímicos.
Con este fin se utilizaron ribozimas hammerhead
sintetizadas químicamente, que están dirigidas contra el ARNm
humano de un factor de crecimiento que se une a heparina
(Pleiotrofina = PTN), (Czubayko et al., PNAS 93,
14753-14758 (1996)). La proteína PTN se expresa en
muchos tumores humanos y en líneas de células tumorales derivadas
de éstos. La funcionalidad de las ribozimas contra PTN pudo
demostrarse en experimentos anteriores porque, después de la
transfección estable de los vectores de expresión de la ribozima
eucarióticos en células tumorales (1205 línea celular de melanoma)
se redujo claramente el gen diana a nivel de ARNm y de las
proteínas (Czubayko et al., PNAS 93,
14753-14758 (1996)). Además, el crecimiento de los
xenotrasplantes de células tumorales 1205 en ratones desnudos
atímicos era claramente reducido en las líneas celulares
transfectadas con ribozima. Una reducción de la cantidad de
proteína PTN del 25% llevó ya a una inhibición del crecimiento
tumoral en ratones desnudos de aproximadamente el 33%. Estos datos
previos hicieron que este modelo tumoral fuera especialmente
adecuado para demostrar la eficacia de nuevos métodos de
reconocimiento génico in vivo, puesto que a partir de la
inhibición del crecimiento tumoral puede deducirse directamente el
alcance de la reducción de la expresión de PTN mediada por la
ribozima.
Mientras que los métodos estables y transitorios
de transferencia génica de ADN de plásmido son completamente
inadecuados para alcanzar y tratar, por ejemplo, tumores o
metástasis sólidos in vivo, los complejos de PEI
LMW-ribozima podrían ofrecer aquí una excelente
alternativa.
En primer lugar, en ensayos previos en el cultivo
celular se comprobó que una relación de ribozima / PEI LMW de
1:66,66 en células 1205 da como resultado óptimos resultados de
transfección. Para el ensayo con animales se fijó una dosis de 8
\mug de ribozima por inyección por ratón. En el caso de un peso
total de 20 g por ratón, esto da como resultado una dosis de
ribozima de 0,4 mg/kg de peso corporal. Esta dosis tenía que
aplicarse cada dos días durante tres semanas a los animales de
experimentación por vía intraperitoneal (i.p.). Los complejos de
ribozima / PEI LMW se prepararon nuevos conforme al ejemplo 1,
respectivamente en la mañana antes de la inyección.
Para el ensayo con animales se indujeron en 15
animales de experimentación en total, respectivamente dos
xenotrasplantes de células tumorales 1205 en los flancos de los
animales por medio de la inyección subcutánea de 1x10^{6} células
tumorales. Una vez que los tumores hubieron crecido después de tres
días hasta un tamaño visible y palpable de aproximadamente 2x2 mm,
los animales se dividieron de manera aleatoria en un grupo de
tratamiento y un grupo de control. En el grupo de tratamiento se
inyectaron por vía i.p. a 8 animales, complejos de ribozima / PEI
LMW (relación de N/P = 1:66,66; 8 \mug de ribozima / inyección)
en intervalos de 2 días. En el grupo de control se inyectó por vía
i.p. a 7 animales la misma cantidad de PEI LMW (72 \mug por
inyección) sin ribozima con igual intervalo de tiempo. Después de
un total de 7 inyecciones se mataron los animales, tres días después
de la última inyección, se extirparon los tumores subcutáneos y se
determinó el volumen de los tumores. En el grupo de control (7
animales = 14 tumores) resultó un tamaño medio de tumor de 2061
\pm 481 mm^{3} (valor medio y desviación estándar), mientras
que en el grupo de tratamiento (8 animales = 16 tumores) se presentó
un tamaño medio de tumor de 1066 \pm 195 mm^{3} (valor medio y
desviación estándar). Esta inhibición específica, mediada por la
ribozima, del crecimiento del xenotrasplante tumoral 1205, en un
48% fue significativa en la prueba t pareada (p<0,05).
Esta inhibición marcada del crecimiento del tumor
1205 de aproximadamente el 50% después de 20 días es aún más
notable si se observa en el contexto de investigaciones
comparativas. En ensayos con animales similares con moléculas
híbridas de ARN/ADN-ribozima estabilizadas
químicamente (se ven como criterio de referencia), que fueron
puestas a disposición por la empresa líder en este campo (Ribozyme
Pharmaceuticals, Boulder, Colorado, EE.UU.), pudo detectarse
únicamente una reducción del crecimiento tumoral de 1205 de
aproximadamente el 20% (datos no publicados).
Es decir que puede retenerse que esta combinación
de PEI LMW y ribozimas de ARN no modificadas es un agente nuevo y
extraordinariamente eficaz para la reducción selectiva de la
expresión de genes in vivo en ensayos con animales.
Figura 1 Degradación de ARN de
FGF-BP (800 nucleótidos) en 20 ng/ml de RNasa A
(con / sin complejación con polietilenimina (PEI) LMW): mientras en
la incubación con RNasa A (concentración final de 20 ng/ml) el ARN
no complejado, según lo esperado, ya está casi completamente
degradado después de 15 minutos, más del 60% de las moléculas de
ARN complejadas con PEI están intactas incluso después de 2 horas
de incubación.
Figura 2 Degradación de ARN de
FGF-BP (800 nucleótidos) en 1% de FCS (con / sin
complejación con polietilenimina (PEI) LMW):
Una cinética muy similar a la de la figura 1
resulta también después de la incubación con suero bovino fetal
(figura 2). Aquí, el ARN no complejado está completamente degradado
después de aproximadamente 30 minutos, después de la incubación con
un 1% de suero bovino fetal, mientras que los ARN complejados con
PEI aún están completamente intactos, incluso después de 120
minutos. También en el caso del aumento de la concentración al 40%
de suero bovino fetal, el ARN complejado con PEI es claramente más
estable frente al ARN no complejado. Los resultados fueron
idénticos para las moléculas de ARN de diferentes longitudes. Los
datos de los gráficos son promedios de dos experimentos
independientes.
Figura 3 Ribozimas de FGF-BP
complejadas con PEI de bajo peso molecular inhiben la expresión de
ARNm de FGF-BP en células de carcinoma epidermoide
ME-180 después de la transfección transitoria.
Figura 4 Ribozimas de FGF-BP
complejadas con PEI de bajo peso molecular (relación de N/P de
1:13) inhiben la expresión de ARNm de FGF-BP en
células de carcinoma epidermoide ME-180 después de
la transfección transitoria.
Figura 5 Ribozimas de FGF-BP
complejadas con PEI de bajo peso molecular (relación de N/P de
1:53) inhiben la expresión de ARNm de FGF-BP en
células de carcinoma de epidermoide ME-180 después
de la transfección transitoria.
Como se desprende de las figuras 3 - 5, la
transfección con PEI LMW-ribozimas llevó a una
reducción muy fuerte de la expresión génica de
FGF-BP, específica de la ribozima.
La reducción máxima fue de aproximadamente el 70%
en comparación con las células de control. Ambas relaciones de
ribozima-PEI, de 1:13 y 1:53, mostraron una
eficacia similar. De manera interesante, la dosis más baja de
ribozima de 0,1 \mug fue en ambas relaciones de PEI un poco más
eficaz, de manera que puede partirse de la base de que incluso
dosis más bajas ya pueden ser muy eficaces.
Figura 6 Ribozimas de Pleiotrofina (PTN)
complejadas con PEI de bajo peso molecular (relación de N/P de
1:66,66) inhiben el crecimiento de trasplantes de células tumorales
de melanoma humano (células 1205) en ratones desnudos atímicos
después de la aplicación sistémica.
En los flancos de ratones desnudos atímicos se
inyectaron por vía subcutánea células tumorales 1205 (1x10^{6}
células / inyección), y a éstos se inyectaron ribozimas de PTN
complejadas con PEI LMW (8 \mug de ribozima / inyección) por vía
intraperitoneal (i.p.) con intervalos de dos días (grupo de
tratamiento = 8 animales), o sólo se trataron con PEI LMW a igual
intervalo de tiempo (grupo de control = 7 animales). Después de 20
días se mostró una inhibición específica del crecimiento tumoral,
mediada por ribozima, de aproximadamente el 50%.
Claims (32)
1. Uso de un complejo de ribozima con
polietilenimina (PEI), que opcionalmente está modificada con
polímeros hidrófilos acoplados a ella, para la protección de la
ribozima frente a la degradación intra o extracelular, enzimática o
no enzimática, presentando la PEI un peso molecular en el intervalo
de 700 a 25.000 Dalton.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la ribozima se protege antes de la
degradación intra o extracelular mediante nucleasas.
3. Uso según una de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque la ribozima se libera intracelularmente
del complejo en forma activa después de su introducción en la
célula y puede llevar a cabo funciones biológicas.
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque la ribozima se selecciona del grupo que
está compuesto por ribozima hammerhead, ribozima hairpin, ribozima
de VHD, RNasa P, ribozima de grupo intrón 1, ribozima de grupo
intrón 2 y mezclas de los mismos.
5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque la ribozima presenta de 20 a 600
nucleótidos, preferiblemente de 35 a 80 nucleótidos.
6. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque la ribozima es una ribozima no
modificada.
7. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque la PEI no está modificada con polímeros
hidrófilos acoplados a ella.
8. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 7,
caracterizado porque la PEI está modificada con uno o varios
polímeros hidrófilos acoplados a ella.
9. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 8,
caracterizado porque el polímero hidrófilo está modificado
con una o varias PEI acopladas a él.
10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6 y
8 a 9, caracterizado porque el polímero hidrófilo es
polietilenglicol (PEG).
11. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 10,
caracterizado porque la PEI presenta un peso molecular de
1.400 a 25.000 Da, especialmente de 1.600 a 15.000 Da.
12. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 11,
caracterizado porque la relación molar de los átomos de
nitrógeno en la PEI respecto a los átomos de fósforo en la ribozima
(valor de N/P) es de 1 a 100, preferiblemente de 2 a 40,
especialmente de 3 a 10.
13. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado porque la PEI está modificada por medio de un
ligando celular.
14. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 13,
caracterizado porque la concentración de ribozima es de 0,01
- 1000 \mug/ml, preferiblemente de 1 - 100 \mug/ml,
prefiriéndose especialmente de 10 - 40 \mug/ml.
15. Complejo de ribozima y polietilenimina (PEI),
caracterizado porque la PEI está modificada opcionalmente
con polímeros hidrófilos acoplados a ella, y porque la PEI presenta
un peso molecular en el intervalo de 700 a 25.000 Dalton.
16. Complejo según la reivindicación 15,
caracterizado porque la ribozima se selecciona del grupo que
está compuesto por ribozima hammerhead, ribozima hairpin, ribozima
de VHD, RNasa P, ribozima de grupo intrón 1, ribozima de grupo
intrón 2 y mezclas de los mismos.
17. Complejo según la reivindicación 15 ó 16,
caracterizado porque la ribozima presenta de 20 a 600
nucléotidos, preferiblemente de 35 a 80 nucléotidos.
18. Complejo según una de las reivindicaciones 15
a 17, caracterizado porque la ribozima es una ribozima no
modificada.
19. Complejo según una de las reivindicaciones 15
a 18, caracterizado porque la PEI no está modificada con
polímeros hidrófilos acoplados a ella.
20. Complejo según una de las reivindicaciones 15
a 18, caracterizado porque la PEI está modificada con uno o
varios polímeros hidrófilos acoplados a ella.
\newpage
21. Complejo según una de las reivindicaciones 15
a 18 y 20, caracterizado porque el polímero hidrófilo está
modificado con una o varias PEI acopladas a él.
22. Complejo según una de las reivindicaciones 15
a 18 y 20 a 21, caracterizado porque el polímero hidrófilo
es polietilenglicol (PEG).
23. Complejo según una de las reivindicaciones 15
a 22, caracterizado porque la PEI presenta un peso molecular
de 1.400 a 25.000 Da, especialmente de 1.600 a 15.000 Da.
24. Complejo según una de las reivindicaciones 15
a 23, caracterizado porque la relación molar de los átomos
de nitrógeno en la PEI respecto a los átomos de fósforo en la
ribozima (valor de N/P) es de 1 a 100, preferiblemente de 2 a 40,
especialmente de 3 a 10.
25. Complejo según una de las reivindicaciones 15
a 23, caracterizado porque la PEI está modificada por medio
de un ligando celular.
26. Procedimiento para la producción de un
complejo según una de las reivindicaciones 15 a 25,
caracterizado porque la ribozima se compleja por medio del
mezclado de disoluciones diluidas con la PEI modificada
opcionalmente por medio de un ligando celular u opcionalmente por
medio de otro polímero.
27. Procedimiento según la reivindicación 26,
caracterizado porque la concentración de ribozima es de 0,01
- 1000 \mug/ml, preferiblemente de 1 - 100 \mug/ml,
prefiriéndose especialmente de 10 - 40 \mug/ml.
28. Composición farmacéutica que contiene una
cantidad eficaz de al menos un complejo según una de las
reivindicaciones 15 a 25 y uno o varios vehículos fisiológicamente
inofensivos.
29. Composición según la reivindicación 28,
caracterizada porque la ribozima está presente en una
concentración subtóxica, o al menos aún no citotóxica de manera
duradera en el caso de un tratamiento de varias horas, para las
células o para el organismo respectivo.
30. Composición según la reivindicación 28 ó 29
para el uso en la terapia génica.
31. Uso de un complejo según una de las
reivindicaciones 15 a 25 para la protección de ribozimas frente a
la degradación enzimática o no enzimática durante el almacenamiento
o durante el transporte de las ribozimas, modificadas o no
modificadas, en disoluciones acuosas, o durante el uso de ribozimas,
modificadas o no modificadas, en experimentos de laboratorio.
32. Uso de un complejo según una de las
reivindicaciones 15 a 25 para la producción de una composición
farmacéutica para introducir ribozimas en células, preferiblemente
en células eucariotas, y para su liberación celular en forma
biológicamente activa.
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