ES2224823A1 - Inhibidores de proteasas, acidos nucleicos que codifican para dichos inhibidores y aplicaciones. - Google Patents
Inhibidores de proteasas, acidos nucleicos que codifican para dichos inhibidores y aplicaciones.Info
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Abstract
Inhibidores de proteasas, ácidos nucleicos que codifican para dichos inhibidores y aplicaciones. Se describen unas proteínas con actividad inhibidora de proteasas, secuencias de nucleótidos que codifican para dichas proteínas, y construcciones de ADN que comprenden dichas secuencias de nucleótidos. Dichas proteínas son útiles para prevenir, combatir o reducir el daño causado en las plantas por agentes fitopatógenos o por agentes causantes de plagas. La incorporación de las secuencias de nucleótidos codificantes de dichas proteínas en genomas de plantas y su expresión proporciona plantas que presentan una susceptibilidad reducida al daño por agentes fitopatógenos o por agentes causantes de plagas en plantas.
Description
Inhibidores de proteasas, ácidos nucleicos que
codifican para dichos inhibidores y aplicaciones.
Esta invención se refiere a proteínas con
actividad inhibidora de proteasas, a secuencias de nucleótidos que
codifican para dichas proteínas, a construcciones de ADN que
comprenden dichas secuencias de nucleótidos, así como a la
incorporación de dichas secuencias de nucleótidos en genomas de
plantas y a la expresión de dichas secuencias codificantes en
plantas en donde dichas plantas presentan una susceptibilidad
reducida al daño por agentes fitopatógenos o por agentes causantes
de plagas en plantas. La invención también se refiere a un método
para la producción de dichas proteínas con actividad inhibidora de
proteasas, a composiciones que contienen dichas proteínas y al
empleo de dichas proteínas para prevenir, combatir o reducir el
daño causado en las plantas por agentes fitopatógenos o por agentes
causantes de plagas.
Se conocen numerosos agentes, tanto fitopatógenos
como causantes de plagas, que causan tremendos daños en los
cultivos de plantas. Para controlar el daño causado por dichos
agentes o enemigos de las plantas se ha recurrido tradicionalmente
al empleo de compuestos químicos y, en menor medida, al empleo de
sistemas de control biológico. Sin embargo, el empleo de compuestos
químicos no es deseable desde un punto de vista medioambiental y el
empleo de sistemas de biocontrol no está todo lo desarrollado que
seria deseable.
Las proteínas PR o proteínas relacionadas con la
patogenicidad, se definen como proteínas vegetales inducidas en
situaciones patológicas. Se observaron por primera vez, en 1970, en
hojas de tabaco atacadas por el virus del mosaico de tabaco (TMV,
tobacco mosaic virus). Generalmente están presentes en pequeñas
cantidades; sin embargo, se acumulan en concentraciones elevadas en
los espacios intercelulares en respuesta al ataque de un patógeno o
al estrés abiótico (inductores químicos, stress osmótico, luz UV,
heridas, etc.). Estas proteínas pueden ser expresadas de manera
constitutiva en determinados órganos (raíces y hojas) o durante
fases específicas del desarrollo de la planta (algunas de estas
proteínas tienen diversas funciones en la maduración del polen y la
floración).
Entre las características que tienen en común la
mayoría de las proteínas PR están: (i) acidez o basicidad extrema,
por lo que resultan altamente solubles y reactivas; (ii)
estabilidad y resistencia a los enzimas proteolíticos, también a
los endógenos; (iii) masas moleculares relativamente pequeñas (entre
8 y 50 kDa); (iv) localización intercelular, vacuolar o en la pared
celular; y (v) vida relativamente larga, lo que favorece su
acumulación.
Las proteínas PR se han clasificado en 11
familias (Tabla 1) según su función, características serológicas,
secuencia aminoacídica, peso molecular y otras propiedades
biológicas (Van Loon, 1985). Entre estas cabe destacar diferentes
tipos tales como enzimas (glucanasas, proteasas, lisozimas,
proteinasas, quitinasas, peroxidasas), inhibidores de proteasas,
proteínas ricas en glicina y cisteína, taumatina, osmotina y
proteínas similares, existiendo varias isoformas para cada tipo.
Las primeras cinco familias (PR-1,
PR-2, PR-3, PR-4,
PR-5) son las más estudiadas. Cada una de estas
familias presenta dos subfamilias: una básica o de localización
vacuolar y una ácida o de localización exocelular (Kitajima &
Sato, 1999).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La proteolisis es un proceso metabólico esencial
en el procesamiento de las proteínas (Ryan &
Walker-Simmons, 1981). Las proteasas son enzimas con
capacidad para mediar en la degradación de las proteínas de
conservación, con el fin de permitir la asimilación de nitrógeno en
los caminos biosintéticos durante la germinación; pero están
también implicadas en procesos de desarrollo, tales como la muerte
celular programada (Minami & Fukuda, 1995), y en las
interacciones entre las plantas y otros organismos. Estos enzimas,
por lo tanto, resultan fundamentales en los procesos de infección
de los patógenos y en las digestiones de las proteínas vegetales
por parte de los herbívoros. Una característica interesante de
estos enzimas, proteasas, es su capacidad de adaptación a los
sustratos presentes en los tejidos de los hospedadores. Los hongos
fitopatógenos pueden producir una batería de enzimas exocelulares
capaces de degradar los polímeros, carbohidratos y proteínas,
presentes en los tejidos vegetales (Walton, 1994); por tanto, desde
el p unto de vista de la planta es fundamental controlar el proceso
proteolítico durante la interacción con el patógeno, sea a nivel
endo- o exocelular.
Los inhibidores de proteasas (PIs) de naturaleza
proteica son ubicuos en la naturaleza y están generalmente
agrupados en base al tipo de proteasas que son capaces de inhibir
(Ryan, 1990) (Tabla 2).
Hasta ahora se han identificado 4 tipo de
proteasas, clasificadas como serín-, cistein-, aspartil- y
metalo-proteasas, en base al aminoácido activo en
su centro de reacción. Algunos inhibidores de serín proteasas de
plantas son bifuncionales y presentan típicamente actividad
inhibidora tanto de la tripsina como de las
\alpha-amilasas. Aunque existen también PIs que
poseen más de un dominio, teniendo cada uno de ellos una actividad
inhibidora de una proteasa específica.
Los inhibidores de proteasas más estudiados son
los inhibidores de serín proteasas (serín PIs), habitualmente
subdivididos en 8 familias en función de su secuencia aminoacídica
primaria. A pesar de sus diferencias topológicas y relativas a su
secuencia primaria, el mecanismo de catálisis y la estructura del
sitio de reacción de las serin PIs de plantas están bastante
conservados, con la excepción de la subfamilia de las serpinas. La
presencia de PIs está confirmada en una amplia variedad de
animales, plantas y microorganismos (Green & Ryan, 1971;
Richardson, 1977; Taguchi et al., 1992). Cabe destacar la
elevada homología (en análisis Blast), aminoacídica y nucleotídica,
que presentan los inhibidores de la familia de las serin proteasas.
Ello ocurre entre inhibidores de la misma familia, con el mismo o
distinto origen en el Reino Vegetal; así como entre inhibidores de
esta familia con inhibidores pertenecientes a otras. En este
sentido, merece la pena destacar la existencia de un gen que
codifica para una serin proteasa tipo Kunitz de patata
(AF492359) el cual presenta homologías, en la secuencia
nucleotídica, en torno al 95-97% con otros
inhibidores de patata tipo Kunitz, tales como aquéllos con números
de acceso U30814, AF492769, AF495585, D17329, AF495582 ó D17332; una
homología de un 87% con un inhibidor de aspartil proteasas
(AY089959), y del 89% con un inhibidor catepsina D, ambos de
patata; e incluso, una homología del 81% con un inhibidor catepsina
D (AJ295638) de tomate. La secuencia aminoacídica de la proteína
codificada por dicho gen (AF492359) presenta homologías superiores a
un 95% con proteínas inhibidoras tipo Kunitz, tales como aquéllas
con números de acceso AF495585, S66277, D173301 ó AF492769, todas
ellas de patata, y de un 94% con una aspartil proteasa (S25314),
también de patata; y de un 69% con una catepsina D (AJ295638) con
otro origen vegetal (tomate).
En las plantas, los PIs, tienen la función tanto
de proteínas de reserva como de proteínas reguladoras de la
actividad enzimática endógena. Está comprobado que heridas,
infecciones bacterianas, aplicaciones de elicitores fúngicos y
ataques por parte de insectos producen un incremento de la
concentración de estos inhibidores en las plantas, motivo por el
cual, los PIs se han asociado a menudo con las respuestas de
defensa de las plantas frente a insectos, animales y
microorganismos (Rickauer et al., 1989). Una evidencia de que
estos compuestos estaban implicados en los mecanismos de defensa de
las plantas, se puso de manifiesto con la expresión del gen
inhibidor de tripsina de variedades de guisante (Vigna
unguiculata) en plantas de tabaco, las cuales mostraron una
mayor resistencia frente a insectos herbívoros (Hilder et
al., 1987). Posteriormente, en el trabajo de Schuler et
al., (1998), se confirmó la capacidad de estos genes para
reforzar los mecanismos de defensa de las plantas durante el ataque
de un patógeno, 16 genes diferentes que codifican para PIs o
\alpha-amilasas se expresaron en 20 cultivos
distintos y se consiguió un aumento de la resistencia de estas
plantas a los insectos. Menos conocidos son los efectos de este
tipo de compuestos, PIs, frente a hongos y otros microorganismos.
Los efectos observados sobre los hongos, cuando son tratados con
PIs purificados de planta, incluyen: inhibición del crecimiento
fúngico, disminución de las ramificaciones, reducción del
enroscamiento de hifas y salida del contenido citoplasmático de las
mismas (Lorito et al., 1994). El mecanismo de acción a nivel
molecular, sin embargo, no se ha aclarado todavía. Una actividad
antifúngica de estos compuestos se ha observado con inhibidores de
tripsina derivados de cultivos tales como el maíz (Huynh et
al., 1992) y la cebada (Terras et al., 1993). Una
actividad antifúngica directa de los PIs de planta ha sido
publicada por Lorito et al., (1994), quienes describen que 4
PIs proteicos, aislados de hojas jóvenes de repollo, inhibían la
germinación de las esporas y el alargarmiento del tubo germinativo,
en ensayos in vitro, de los hongos fitopatógenos Botrytis
cinerea y Fusarium solani. En lo que se refiere al
mecanismo de acción, esta mezcla de PIs de repollo demostró ser
capaz de inhibir la actividad proteolítica responsable de la
activación del complejo enzimático de la síntesis de
\beta-D-glucanos, con la
consiguiente reducción del proceso de incorporación de los glucanos
y de la formación de las paredes celulares en B. cinerea. La
mayoría de los estudios con PIs referidos a hongos se han realizado
con un rango relativamente pequeño de hongos. Recientemente, un PI
(inhibidor de tripsina) caracterizado por unos elevados niveles de
expresión en genotipos de maíz resistentes a la infección por
Aspergillus flavus, ha mostrado una fuerte actividad frente
a un grupo de hongos taxonómicamente diversos, pertenecientes tanto
a los grupos de Hifomicetos como de Zigomicetos (Chen et al.,
1999); este trabajo sugiere que los PIs pueden ser considerados
como una nueva familia de compuestos antifúngicos, clasificables
como proteínas PR, y que pueden ser utilizados para desarrollar
nuevas biotecnologías para el control de enfermedades fúngicas.
Aunque se han descrito diversas enzimas con
actividad inhibidora de proteasas en diferentes organismos, sigue
existiendo la necesidad de incrementar el arsenal de medios
implicados en la defensa de las plantas frente a agentes
fitopatógenos, causantes de enfermedades en plantas, y frente
agentes causantes de plagas en plantas, con el fin de reforzar los
mecanismos defensivos de las plantas en respuesta a los ataques de
tales agentes.
La invención proporciona una solución a la
necesidad existente basada en el descubrimiento de nuevas proteínas
con actividad inhibidora de proteasas. Dichas proteínas, y las
secuencias de ADN que codifican para dichas proteínas con actividad
inhibidora de proteasas, pueden ser utilizadas para aumentar la
resistencia de las plantas frente a agentes fitopatógenos o frente a
agentes causantes de plagas, contribuyendo de este modo a evitar,
de forma sencilla y eficaz, las pérdidas causadas por dichos
agentes.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con una proteína con actividad inhibidora de proteasas
que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID.
Nº: 1 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga y
funcionalmente equivalente a dicha secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC. ID. Nº.: 1. La producción y aplicaciones de dicha
proteína constituyen un aspecto adicional de esta invención. En una
realización particular, la invención se relaciona con el empleo de
dicha proteína con actividad inhibidora de proteasas para, prevenir,
combatir o reducir el daño causado en las plantas por agentes
fitopatógenos o por agentes causantes de plagas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína con
actividad inhibidora de proteasas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
construcciones de ADN y vectores que comprenden dicha secuencia de
nucleótidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
método para controlar un agente fitopatógeno o un agente causante
de plagas, en una planta, que comprende producir plantas
modificadas genéticamente con susceptibilidad reducida al daño
causado por dicho agente mediante un procedimiento que comprende
insertar en el genoma de una célula vegetal una construcción de ADN
proporcionada por esta invención, obtener células vegetales
transformadas y regenerar, a partir de dichas células vegetales,
plantas genéticamente transformadas con susceptibilidad reducida al
daño causado por dicho agente fitopatógeno o causante de
plagas.
El método para controlar agentes fitopatógenos o
causantes de plagas puede también incluir el empleo de
microorganismos colonizadores de plantas que han sido transformados
previamente con el gen que codifica para dicha proteína con
actividad inhibidora de proteasas proporcionada por esta invención y
en el que dichos microorganismos se introducen en la planta en la
que se desea controlar dicho agente fitopatógeno o causante de
plagas y en donde dicho gen se expresa en una cantidad
efectiva.
La invención incluye la propagación o
regeneración de una planta genéticamente transformada así como el
empleo de material vegetal, por ejemplo, células y tejidos
vegetales, semillas, etc., para producir una progenie que muestra
una susceptibilidad reducida al daño por agentes fitopatógenos o
causantes de plagas. La progenie obtenida por propagación o
regeneración constituye un aspecto adicional de esta invención.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "agente fitopatógeno" incluye a cualquier entidad
macromolecular, microorganismo u organismo causante de enfermedades
en plantas, por ejemplo, virus, viroides, fitoplasmas, bacterias,
hongos, nematodos, etc. Asimismo, el término "agente causante de
plagas" incluye a cualquier microorganismo u organismo capaz de
causar plagas en plantas, incluyendo los vectores de transmisión de
agentes fitopatógenos, por ejemplo, insectos, ácaros, artrópodos,
etc.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición que comprende dicha proteína con actividad
inhibidora de proteasas. En una realización particular, la
invención se relaciona con el empleo de dicha composición para
prevenir, combatir o reducir el daño causado en las plantas por
agentes fitopatógenos o causantes de plagas.
Otros aspectos y realizaciones particulares de la
invención resultarán evidentes para un experto en la materia a la
vista de la descripción detallada de la invención.
La Figura 1 es un diagrama de barras que recoge
la absorbancia (ordenadas), en unidades de absorbancia, producida
por la actividad hidrolítica de 0,4 \mug de quimiotripsina, 0,4
\mug de tripsina o 20 \mul de filtrado fúngico sobre los
sustratos TEE, BTEE, TAME, pNGB y pNA. Con el sustrato azocaseína se
utilizaron 2,5 \mug de tripsina y 5 \mug de quimiotripsina. Los
datos son valores medios de tres repeticiones.
La Figura 2 es un diagrama de barras que muestra
el efecto inhibidor (en %) de PIs, a dos dosis diferentes (véase la
Tabla 3), sobre la actividad proteásica producida por la
quimiotripsina o los filtrados fúngicos en la reacción de
hidrólisis del sustrato pNA (CI: quimiotripsina, FI: filtrados
fúngicos, PIs: inhibidores de proteasas, pNA:
N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe
p-nitroanilida).
La Figura 3 es un diagrama de barras que recoge
los valores (0 a 5) de las áreas necrosadas en ensayos sobre hoja
inoculadas con esporas de B. cinerea B05.10. Las hojas se
inocularon sólo con esporas del patógeno (control) o con una mezcla
de esporas y PIs (Tabla 3). Los valores son una media de cuatro
experimentos (dos en hoja de tabaco y dos en hoja de judía) con
indicación en forma de barra de los errores estándar.
La Figura 4 es una gráfica que muestra el perfil
de elución, en una cromatografia de intercambio amónico, de un
extracto proteico de brotes de tubérculo de patata. Las fracciones
se eluyeron con tampón fosfato sódico 20 mM en un gradiente de 0 a
0,5 M de cloruro sódico. La absorbancia se monitorizó a 280 nm (los
valores se indican a la izquierda de la gráfica). Las diferentes
alícuotas (fracciones) se analizaron por su capacidad de inhibir
tripsina (TI) y quimiotripsina (CI) (los valores se indican a la
derecha de la gráfica) usando azocaseína como sustrato.
La Figura 5 muestra el resultado de
SDS-PAGE de las muestras PI-16 y
PI-10, que posteriormente fueron retiradas del gel
y secuenciadas (carril 2). En los carriles 1 y 3 está el marcador
de masa molecular (LWM, Pharmacia).
La Figura 6 muestra el modelo electroforético en
gel de agarosa de los productos de amplificación por PCR obtenidos
con los cebadores NSP (SEC. ID. Nº: 12) & RP (SEC. ID. Nº: 13)
(carriles 2 y 3) y SP (SEC. ID. Nº: 11) & RP (SEC. ID. Nº: 13)
(carriles 4 y 5), con ADN genómico de patata. Carril 1: marcados de
masas moleculares 100 pb ladder (Promega).
La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos
de 729 pares de bases (pb) amplificada a partir del DNA de patata
con los oligonucleótidos SP (SEC. ID. Nº: 11) & RP (SEC. ID.
Nº: 13). Esta secuencia incluye el gen PKI1, de 667 pb de
longitud, con los codones de inicio (ATG) y parada de traducción
(TAA), con la secuencia del péptido señal de 93 pb (representado con
subrayado simple) y la secuencia de un intrón putativo, de 222 pb
de longitud (presentado en cursiva), con las secuencias de
procesamiento de los extremos 5' y 3' del mismo (presentado con
doble subrayado y cursiva).
En un aspecto, la invención se relaciona con una
proteína con actividad inhibidora de proteasas, en adelante
inhibidor de proteasas (o PI) de la invención, seleccionada
entre:
- a)
- una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. Nº.: 1,
- b)
- una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a dicha SEC. ID. Nº: 1 y funcionalmente equivalente a la proteína definida en a); y
- c)
- un fragmento de la proteína definida en a) o en b), en donde dicho fragmento es funcionalmente equivalente a la proteína definida en a).
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente similar" significa que las
secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad
de, al menos, un 50%, preferentemente de, al menos, un 70%, y, más
preferentemente de, al menos, un 95%. Dentro del contexto de esta
invención, dos secuencias de aminoácidos tienen un grado de
identidad (similaridad) de al menos un 50% cuando tienen al menos
un 50% de restos de aminoácidos idénticos o que constituyen
sustituciones conservativas en las mismas posiciones cuando se
alinean de forma óptima. Las proteínas con secuencias de aminoácidos
sustancialmente similares a dicha SEC. ID. Nº: 1 pueden ser
obtenidas mediante sustituciones conservativas de restos de
aminoácidos.
Asimismo, la expresión "funcionalmente
equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que la
proteína en cuestión tiene, al menos, actividad inhibidora de
proteasas. La actividad inhibidora de proteasas puede ser ensayada
mediante el protocolo descrito en los apartados 2.1 y 3.1 del
Ejemplo que acompaña a esta descripción.
Los fragmentos de la proteína definida en a) o en
b), funcionalmente equivalentes a la proteína definida en a) pueden
ser obtenidos por métodos genéticos o químicos convencionales de
eliminación de, por ejemplo, restos de aminoácidos del extremo
carboxilo y/o amino terminal.
En una realización particular, el inhibidor de
proteasas de la invención comprende o está constituido por la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 1. Dicha
proteína tiene actividad inhibidora de proteasas, en particular de
serín proteasas, un peso molecular de 16,2 kDa aproximadamente, un
punto isoeléctrico (pI) de 7,62 y una carga de +0,89.
En otra realización particular, el inhibidor de
proteasas de la invención es una proteína de 10 kDa
aproximadamente, que corresponde a un fragmento de la proteína de
16,2 kDa cuya secuencia de aminoácidos es la mostrada en la SEC.
ID. Nº: 1, en donde dicho fragmento presenta, además, actividad
inhibidora de proteasas.
El PI de la invención puede obtenerse a partir de
un organismo productor del mismo, por ejemplo, a partir de brotes
de tubérculos de patatas (Solana tuberosum), mediante
cultivo del organismo productor bajo condiciones apropiadas para la
expresión de dicho PI y, posteriormente, recuperar dicho inhibidor
de proteasas, y, si se desea, purificarlo, tal como se describe, por
ejemplo, en los apartados 2.3 y 3.2 del Ejemplo que acompaña a esta
descripción.
A partir del PI de la invención se puede
identificar y aislar la secuencia de ADN que codifica para dicho PI
por métodos convencionales, por ejemplo, mediante un procedimiento
que comprende la creación de genotecas de ADN genómico (ADNg) o de
ADN copia (ADNc) de organismos productores del PI de la invención;
la secuenciación del extremo amino y/o carboxilo de dicho PI de la
invención y/o de fragmentos internos del mismo; el diseño de
oligonucleótidos adecuados para la amplificación, mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de una región del ADNc
de los organismos productores del PI de la invención que sirva para
obtener sondas destinadas a escrutar dichas genotecas; y el análisis
y selección de los clones positivos. Todas estas etapas se
describen con más detalle en los apartados 2.4 y 3.3 del Ejemplo
que acompaña a esta descripción, donde se ilustra la donación de
una secuencia de ADNc que codifica para un inhibidor de proteasas
proporcionado por esta invención que codifica para un PI de 16 kDa
aproximadamente de S. tuberosum.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con una molécula de ADN, aislada, que codifica para el PI
de la invención, que comprende:
- a)
- la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 2; o
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a) que
- i)
- es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos definida en a); y/o
- ii)
- codifica para un péptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos definida en a).
La SEC. ID. Nº.: 2 corresponde a la secuencia de
nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEQ. ID. Nº: 1.
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de
nucleótidos que codifica para una proteína con actividad inhibidora
de proteasas que tiene las propiedades i)-ii) arriba
mencionadas. Típicamente, dicha secuencia de nucleótidos análoga se
puede aislar de un organismo que produce dicha proteína con
actividad inhibidora de proteasas en base a la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 2, o bien se construye en
base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 2,
por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de
nucleótidos conservativas, es decir, que no dan lugar a una
secuencia de aminoácidos distinta a la de la proteína con actividad
inhibidora de proteasas codificada por la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEC. ID. Nº.: 2, pero que corresponde al empleo de
codones del organismo hospedador destinado a la producción de dicha
proteína, o bien mediante la introducción de sustituciones de
nucleótidos que dan lugar a una secuencia de aminoácidos diferente
y, por tanto, posiblemente, a una estructura proteica diferente que
pudiera dar lugar a una proteína con actividad inhibidora de
proteasas con propiedades diferentes a las de la proteína nativa.
Otros ejemplos de posibles modificaciones incluyen la inserción de
uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más
nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la
deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el
interior de la secuencia. Por ejemplo, dicha secuencia de
nucleótidos análoga puede ser una sub-secuencia de
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº.: 2.
En general, dicha secuencia de nucleótidos
análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos
que codifica para un PI de la invención, por ejemplo, la SEC. ID.
Nº.: 2, es decir, presenta una homología a nivel de nucleótidos de,
al menos, un 50%, preferentemente, al menos un 80%, o más
preferentemente, al menos, un 95% respecto a cualquiera de las
secuencias mencionadas previamente.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
PI de la invención puede proceder de cualquier organismo productor
de forma nativa de dicha proteína o bien de un organismo hospedador
transformado con dicha secuencia de nucleótidos.
Alternativamente, la secuencia de nucleótidos que
codifica para el PI de la invención puede ser aislada, mediante
técnicas convencionales, a partir de un ácido nucleico de un
organismo mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos
preparados a partir de la información sobre la secuencia de
nucleótidos proporcionada en esta descripción, o mediante
iniciadores (por PCR).
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
PI de la invención puede formar parte de una construcción de ADN
que comprende dicha secuencia de nucleótidos operativamente unida a
un promotor que dirige su expresión. Dicha construcción de ADN
también puede contener, operativamente unidos, unos elementos
reguladores de la expresión funcionales en plantas, por ejemplo,
una secuencia de terminación de la transcripción, etc.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
PI de la invención, o la construcción de ADN que la contiene, puede
ser insertada en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto,
la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de
expresión, que comprende dicha secuencia de nucleótidos, o una
construcción de ADN que la contiene. La elección del vector
dependerá de la célula hospedadora en la que éste se va a
introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se
introduce dicha secuencia de nucleótidos puede ser un plásmido o un
vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se
integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el
cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado.
La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrok
et al., 1989).
En una realización particular, el vector
proporcionado por esta invención comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para el PI de la invención conectada
operativamente a un promotor y a una secuencia terminadora. Dicho
vector puede contener, además, unos marcadores que faciliten la
selección de transformantes. El promotor puede ser cualquier
secuencia de nucleótidos que muestra una actividad transcripcional
en la célula hospedadora elegida y puede derivar bien de genes que
codifican para proteínas homólogas o heterólogas de la célula
hospedadora. Los procedimientos utilizados para ligar la secuencia
de nucleótidos que codifica para el PI de la invención al promotor y
a la secuencia terminadora, respectivamente, y para insertar dicha
construcción de ADN en un vector son bien conocidos por los
técnicos en la materia y han sido descritos, por ejemplo, por
Sambrook et al., 1989.
La invención también proporciona una célula que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el PI de
la invención, o una construcción de ADN que contiene a dicha
secuencia, o bien el vector definido más arriba. Las células
hospedadoras que se pueden transformar o transfectar con la
secuencia de nucleótidos que codifica para el PI de la invención
pueden ser células procarióticas, por ejemplo, bacterias, o
eucarióticas, por ejemplo, células vegetales. Dichas células
transformadas o transfectadas constituyen un aspecto adicional de
la presente invención.
La transformación de células vegetales con la
secuencia de nucleótidos que codifica para el PI de la invención, o
con una construcción de ADN o un vector que comprende dicha
secuencia de nucleótidos, puede ser muy interesante desde diversos
puntos de vista, por ejemplo, para aumentar la resistencia a
organismos fitopatógenos.
La transformación o transfección de células
vegetales puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales.
Como es bien conocido, pueden utilizarse múltiples sistemas tales
como vectores plasmídicos, liposomas, electroporación, micro
inyección, difusión, bombardeo de partículas (gene gun),
coprecipitación con fosfato de calcio, empleo de vectores virales,
etc. Para una revisión de la transferencia génica a plantas,
incluyendo vectores, métodos de transferencia de ADN, etc., véase,
por ejemplo, el libro titulado "Ingenieria genética y
transferencia génica", de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999),
en particular, el capítulo 9, titulado "Transferencia génica a
plantas", páginas 283-316.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede
ser utilizada para manipular genéticamente plantas con el fin de
introducir en ellas alguna caracteristica deseable, por ejemplo,
resistencia a agentes fitopatógenos y/o causantes de plagas. En
principio, prácticamente cualquier planta de interés agronómico u
hortícola puede ser transformada con la secuencia de nucleótidos que
codifica para el PI de la invención o con una construcción de ADN o
un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos. La
biotecnología agrícola ha experimentado un importante avance en los
últimos años y se dispone de un gran número de sistemas de
transformación genética de plantas, lo que permite introducir genes
en cultivos muy diversos (Val Giddins, 1996). En una realización
particular, los cultivos de mayor consumo en la alimentación humana,
tales como arroz, patata, maíz y trigo, son los principales
candidatos a ser receptores de la secuencia de nucleótidos
proporcionada por esta invención. En otra realización particular,
otros cultivos de interés, tales como tabaco, tomate y otras
plantas hortícolas son candidatos susceptibles de ser transformados
con la secuencia de nucleótidos de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para producir una planta transgénica que comprende
transformar dicha planta con una secuencia de nucleótidos que
codifica para el PI de la invención o con una construcción de ADN o
un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos. Dicha planta
transgénica puede presentar una mayor resistencia a agentes
fitopatógenos o causantes de plagas o bien una susceptibilidad
reducida al daño causado por dichos agentes.
En otro aspecto, la invención proporciona una
célula transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica para el PI de la invención, o una construcción de ADN que
la contiene, integrada en su genoma, así como una planta
transgénica que comprende, al menos, una de dichas células
transgénicas.
La proteína con actividad inhibidora de proteasas
de la invención puede ser utilizada para prevenir, combatir o
reducir el daño causado por agentes fitopatógenos, por ejemplo,
virus, viroides, fitoplasmas, bacterias, hongos, nematodos, etc., o
por agentes causantes de plagas, por ejemplo, insectos, ácaros,
artrópodos, etc. Por tanto, el PI de la invención puede utilizarse
en el control de agentes fitopatógenos y/o causantes de plagas en
plantas. En el sentido utilizado en esta descripción, el término
"controlar" incluye la reducción o paralización del
crecimiento y/o de la germinación que puede resultar en la
eliminación de dichos agentes fitopatógenos o causantes de plagas o
en la disminución de los daños causados por éstos.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un método para controlar un agente fitopatógeno o
causante de plagas, en una planta, que comprende producir plantas
modificadas genéticamente con susceptibilidad reducida al daño
causado por dicho agente mediante un procedimiento que comprende
insertar en el genoma de una célula de tejido vegetal una
construcción de ADN proporcionada por esta invención, obtener
células vegetales transformadas y regenerar, a partir de dichas
células vegetales plantas genéticamente transformadas con
susceptibilidad reducida al daño causado por dicho agente
fitopatógeno o causante de plagas.
Virtualmente cualquier planta de interés
agronómico u hortícola puede ser modificada genéticamente con la
secuencia de nucleótidos que codifica para el PI de la invención o
con una construcción de ADN o un vector que comprende dicha
secuencia de nucleótidos y regenerada. No obstante, en una
realización particular, dichas plantas incluyen plantas de arroz,
patata, maíz, trigo, tabaco, tomate, etc. Las técnicas de
transformación y regeneración son técnicas conocidas por los
técnicos en la materia [véase Ritchie & Hodges, pp
147-178, en Kung & Wu, Transgenic Plantas, Vol.
1, 1993, Academia Press]. Las células de tejido vegetal incluyen
células y tejidos diferenciados y no diferenciados, por ejemplo,
raíces, hojas, polen, formas de agregaciones incluyendo callos,
semillas, etc.
Las plantas transformadas con la secuencia de
nucleótidos que codifica para el PI de la invención presentan una
susceptibilidad reducida frente a agentes fitopatógenos o causantes
de plagas, especialmente frente a prácticamente cualquier hongo
oomiceto, ascomiceto o basidiomiceto.
El método para controlar agentes fitopatógenos
y/o causantes de plagas proporcionado por esta invención, que
comprende exponer a dicho a gente a una cantidad efectiva de un PI
de la invención, también puede incluir el empleo de microorganismos
colonizadores de plantas o suelos, por ejemplo, bacterias u hongos,
que han sido transformados previamente con el gen que codifica para
dicha proteína con actividad inhibidora de proteasas de la invención
y en el que dichos microorganismos se introducen en la planta en la
que se desea controlar la infección por un agente fitopatógeno o
causante de plagas y en donde dicho gen se expresa en una cantidad
efectiva como resultado de una manipulación genética. En este caso,
el control de dichos agentes fitopatógenos o causantes de plagas
transcurre a través de la ingesta, por parte de dichos agentes
fitopatógenos o causantes de plagas, bien de la planta o bien del
organismo colonizador de planta o suelo.
La invención también se refiere a la propagación
o regeneración de una planta genéticamente transformada así como el
empleo de material vegetal, por ejemplo, células y tejidos
vegetales, semillas, etc., para producir una progenie que muestra
una susceptibilidad reducida al daño causado por dichos agentes
fitopatógenos o causantes de plagas. La progenie obtenida por
propagación o regeneración constituye un aspecto adicional de esta
invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para la producción de un PI de la invención, que comprende
cultivar una célula hospedadora que contiene la secuencia de
nucleótidos que codifica para el PI de la invención bajo
condiciones que permiten la producción de dicha proteína con
actividad inhibidora de proteasas y recuperar dicha proteína. El
medio utilizado para cultivar las células hospedadoras
transformadas puede ser cualquier medio adecuado para cultivar
tales células. La proteína con actividad inhibidora de proteasas
expresada puede ser, ventajosamente, secretada al medio de cultivo,
de donde puede ser recuperada mediante un procedimiento como el
descrito en el apartado 2.3 del Ejemplo que acompaña a esta
descripción, o bien mediante cualquier otro procedimiento
convencional de aislamiento de proteínas.
El PI de la invención puede ser utilizado en
numerosas aplicaciones. En una realización particular, dicho PI de
la invención puede ser utilizado para prevenir, combatir, o reducir
el daño causado en las plantas por agentes fitopatógenos o
causantes de plagas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con una composición que comprende dicha proteína con
actividad inhibidora de proteasas (PI de la invención). En una
realización particular, la invención se relaciona con el empleo de
dicha composición para prevenir, combatir o reducir el daño causado
en las plantas por agentes fitopatógenos o causantes de plagas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con una composición que comprende un PI de la invención y
un vehículo aceptable desde un punto de vista agrícola. Dicha
composición es particularmente útil para prevenir, combatir o
reducir el daño causado por agentes fitopatógenos, por ejemplo,
virus, viroides, fitoplasmas, bacterias, hongos, nematodos, etc., o
por agentes causantes de plagas, por ejemplo, insectos , ácaros,
artrópodos, etc.
La composición proporcionada por la invención
comprende una cantidad eficaz para prevenir, combatir o reducir el
daño causado en plantas por agentes fitopatógenos o causantes de
plagas, de un PI de la invención. En una realización particular,
dicha composición comprende entre 0,01% y 100% en peso de dicho PI
de la invención. La composición proporcionada por esta invención
puede ser una composición de componente único o bien una composición
que comprende, además de un PI de la invención, una o más
actividades diferentes. Prácticamente cualquier actividad puede ser
incorporada en la composición proporcionada por esta invención. No
obstante, en una realización particular, la composición
proporcionada por la invención incluye, además de un PI de la
invención, una o más actividades enzimáticas diferentes útiles para,
por ejemplo, modificar o degradar las paredes celulares de agentes
fitopatógenos, tales como enzimas con actividad lítica,
celulolítica, mananolítica, quitinolítica o proteolítica, por
ejemplo, celulasas, \beta-(1,6)-glucanasas,
\beta-(1,3)-glucanasas, mananasas, endo- o exo-
quitinasas, quitosanasas, proteasas, \alpha- o
\beta-manosidasas, mutanasas, etc.
En una realización particular, la composición
proporcionada por esta invención es particularmente útil para
prevenir, combatir o reducir el daño causado en las plantas por
hongos fitopatógenos. En este caso, dicha composición puede
contener, si se desea, además de un PI de la invención, un fungicida
biológico o químico. Como fungicida químico puede utilizarse
cualquiera de los usados habitualmente, preferentemente, un
fungicida químico seleccionado del grupo formado por compuestos que
afectan a la membrana, compuestos que afectan a la síntesis de la
pared celular, y sus mezclas. Como fungicida biológico puede
utilizarse cualquiera de los conocidos por los expertos en la
materia.
La composición proporcionada por esta invención
puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en
cualquier forma de presentación apropiada. Dicha composición puede,
opcionalmente, contener aditivos, por ejemplo, estabilizantes que
prolonguen la estabilidad de la misma.
La dosificación de la composición proporcionada
por esta invención y sus condiciones de uso pueden ser determinados
en base a los métodos conocidos en la técnica.
El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la
presente invención y no debe ser considerado como limitativo del
alcance de la misma. En particular, la invención se ilustra
mediante la búsqueda de proteínas con actividad inhibidora de
proteasas (PIs) con actividad antifúngica en muestras de diferentes
orígenes. Los escrutinios d e actividades inhibitorias (inhibición
de tripsina, quimiotripsina, actividad proteásica fúngica,
germinación de esporas y necrosis en hoja) se realizaron sobre los
siguientes extractos proteicos vegetales:
- -
- hojas de tabaco, superiores e inferiores, tomadas a los 0, 2 y 15 días de inducir PIs mediante heridas en las hojas inferiores de las plantas de tabaco;
- -
- hojas de patata, tomadas a los 0, 2 y 15 días de dañar las hojas inferiores de las plantas;
- -
- hojas de judía, tomadas a los 0, 2 y 15 días de dañar las hojas inferiores;
- -
- hojas de tabaco recogidas 2 meses después de haber inoculado Oidium tabaci en hojas inferiores de plantas de tabaco; y
- -
- túberos y brotes de túberos de patata intactos.
El extracto proteico de brotes de tubérculo de
patata se seleccionó para realizar las posteriores purificaciones
de PIs.
Los Materiales y Métodos utilizados para realizar
estos Ejemplos, así como los Resultados obtenidos, se mencionan a
continuación.
Los hongos fitopatógenos utilizados han sido: la
cepa B05.10 de B. cinerea, aislado de vida; la cepa F de
Alternaria alternata, aislada de patata; y la cepa Fop 1 de
F. oxysporum, aislada de judía. También se ha utilizado la
cepa P1 de Trichoderma atroviride, aislada de madera, que
posee actividad de biocontrol contra varios hongos patógenos in
vivo.
Las cepas bacterianas usadas son cepas
comerciales de Escherichia coli (Promega).
Los conidios de B. cinerea se recogieron
de cultivos crecidos en medio MEP [20 g/l de Malt Extract Broth
(Sigma) y 10 g/l de Mycological Peptone (Oxoid)] con agar al 1,5%,
y los de A. alternata y F. oxysporum de cultivos
crecidos en PDA (patata dextrosa agar) (Sigma), a una temperatura de
25ºC. Los conidios se resuspendieron en agua estéril y se filtraron
para retirar fragmentos de hifas.
B. cinerea B05.10 se creció en los
siguientes medios: SM (Salt Medium, pH 6,6, constituido por
KH_{2}PO_{4} 680 mg/l, K_{2}HPO_{4} 870 mg/l, KC1 200 mg/l,
NH_{4}NO_{3} 1000 mg/l, CaCl_{2} 200 mg/l, MgSO_{4},
7H_{2}O 200 mg/l, FeSO_{4} 2 mg/l, MnSO_{4} 2 mg/l, ZnSO_{4}
2 mg/l) con sacarosa al 1%, añadido después de autoclavar; PDB
(Potato Dextrose Broth) (Sigma) al 0,1%;
SM-Sacarosa al 1% más hojas de judía trituradas
(0,5%); PDB al 0,1% más caseína (0,1%) (Sigma); PDB al 0,1% más
hojas de tomate trituradas (0,5%); y, PDB al 0,1% más hojas de
tomate trituradas (5%).
A. alternata F y F. oxysporum Fopl
se crecieron en: PDB al 0,1% más hojas de tomate trituradas (0,5%);
PDB al 0,1% más hojas de tomate trituradas (5%); PDB al 0,1% más
hojas de judía trituradas (0,5%); PDB al 0,1% mas hojas de judía
trituradas (5%); PDB al 0,1% más hojas de patata trituradas (0,5%);
y, PDB al 0,1% más hojas de patata trituradas (5%).
T. atroviride P1 se creció en los medios:
SMSC y SMSC con glucosa, sacarosa, quitina o paredes celulares de
Botrytis (Lorito et al., 1994).
Los cultivos se mantuvieron a 22ºC en un agitador
orbital a 120 r.p.m. durante 9 días. Se tomaron alícuotas de 10 ml
a los 1, 4, 7 y 9 días de inocular el medio, se filtraron a través
de filtros de 0,22 ó 0,45 \mum (millipore) y se dializaron, en
agua destilada, a 4ºC durante dos días, en membranas con
cut-off de 10 kDa. Los filtrados se concentraron
10X en un Speed-Vac.
Los filtrados de hongos se utilizaron para
analizar las actividades proteásica e inhibidora de proteasas.
Las cepas de E. coli se crecieron a 37ºC
en medio LB (Luria-Bertani) (0,5% extracto de
levadura, 1% Bacto peptone, 1% NaCl, pH 7), en las condiciones
descritas por Sambrook et al. (1989).
Semillas de plantas de tabaco (Nicotiana
tabacum var. AC-S), limpiadas con una solución
de hipoclorito sódico al 1%, se dejaron germinar en medio
Murashinge and Skoog (ICN Biomedicals) adicionado con sacarosa al 3%
y agar al 0,8%, en placas Petri, durante 21 días. Las plántulas
desarrolladas se pasaron a suelo estéril. Las plantas de judía
(Phaseolus vulgaris) y de patata (Solanum tuberosum
var. Desireé) se propagaron de semillas y de túberos,
respectivamente, plantados en suelo estéril. Las plantas se
mantuvieron en una cámara de crecimiento (Bertagnin®) a 22ºC, 40%
de humedad y un ciclo de luz: oscuridad de 24 h, durante 1 semana
(judía) y 8 semanas (tabaco y patata).
Se recogieron hojas de judía, patata y también de
plantas no controladas de tomate (Lycopersicon esculentum
Mill.), para preparar medios de cultivo; brotes de tubérculo de
patata, para extraer Pls; y hojas de tabaco y judía para realizar
los ensayos biológicos.
Se han utilizado como referencia en los ensayos 8
PIs sintéticos, PMSF de Sigma y el resto de Boehringer Mannheim; un
inhibidor de tripsina de soja (Sigma) y una mezcla de cuatro PIs
derivados de repollo (Lorito et al., 1994a). Los solventes y
las dosis utilizadas están recogidos en la Tabla 3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
- E-64: L-trans-epoxisuccinil-leucilamide-(4-guanidino)-butano
- EDTA: ácido etilendiamino tetraacético
- PMSF: fenilmetilsulfonil fluoruro
- DMSO: dimetilsulfóxido (Sigma)
Se han utilizado los ensayos descritos por Brock
et al., (1962) y Peng y Black (1976), con algunas
modificaciones.
Se ha determinado la actividad para inhibir los
enzimas, tripsina e quimiotripsina, sobre azocaseína y sobre
sustratos sintéticos específicos. La azocaseína se utilizó al 1% y
en un rango de absorbancia de 0,4-0,7. Los
sustratos sintéticos ensayados fueron: TEE
(L-tirosina etil éster), BTEE
(N-\alpha-benzoil-L-tirosina
etil éster), TAME
(N-\alpha-p-tosil-L-arginina
metil éster), p-NGB
(p-nitrofenil-p'-guanidino
benzoato) y pNA
(N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe
p-nitroanilide). Los sustratos se han preparado a
una concentración de 3 mM en dimetilformamida, y se han utilizado
sucesivamente a 0,15 mM, diluyendo con tampón fosfato sódico 0,1 M
pH 6,9 (Sigma); en un volumen de reacción de 175 µl. La tripsina y
la quimiotripsina se incubaban durante 5 minutos a temperatura
ambiente con o sin los PIs, y durante 1 h con o sin los filtrados
de hongos, los extractos crudos de planta o fracciones purificadas
de los extractos de plantas. Se incluyeron controles de las
proteasas solas, los sustratos solos o los extractos crudos solos.
La capacidad de una muestra para inhibir, tripsina o
quimiotripsina, se determinó como la diferencia de absorbancia a
450 nm en ausencia y en presencia de esa muestra. Los ensayos se
realizaron en placas ELISA, usando el lector de placas Microplate
Reader (Bio-Rad). También, se analizó la influencia
del pH y la concentración del tampón de reacción, utilizando
fosfato sódico 1 M pH 6,9 o fosfato sódico 0,1 M pH 5 y pH 9,5 como
tampón en los ensayos.
La actividad antifúngica del extracto crudo de
los brotes de tubérculo de patata y de las fracciones obtenidos
después de la purificación se analizaron en bioensayos de esporas y
de hoja.
Para los bioensayos de esporas se usaron
conidios de B. cinerea B05.10 y A. alternata F,
siguiendo el protocolo de Lorito et al. (1993), con algunas
modificaciones. La mezcla (90 \mul) contenía 500 conidios de los
hongos ensayados en la solución (30 mM fosfato sódico pH 6,8 tampón
y PDB 1% medio). Los conidios se mezclaron con 10 pl del extracto
crudo o con 5 ó 10 \mul de las fracciones proteicas. Las mezclas
se incubaron en placas ELISA a 25ºC, situadas en una cámara húmeda.
Las placas se observaron a diferentes tiempos en un microscopio
invertido para determinar el efecto, de los extractos, sobre la
germinación de esporas y la elongación de los tubos germinativos de
los hongos diana. Se midió la longitud de al menos 20 hifas,
tomadas al azar, y la germinación de 50 conidios. Cada experimento
se realizó por duplicado, en 2 días por separado, con 2 réplicas
para cada muestra. Se hizo la media de todos los datos.
Para los bioensayos de hoja, se utilizaron
conidios de B. cinerea B05.10 y A. alternata F, y
hojas de plantas de tabaco o judía. Las hojas procedían de plantas
de 2 meses, para tabaco, y 1 semana para judías; los peciolos se
insertaron en espuma, previamente humedecida. Las hojas así
dispuestas se situaron en una cámara húmeda que contenía de 3 a 5
cm de agua. Cada hoja se inoculó en 3 a 6 puntos con aplicación de
una gota que contenía 10^{5} - 10^{7} esporas/ml para B.
cinerea o 10^{5} - 10^{7} esporas/ml para A.
alternata en 15 \mul de la solución de germinación (20 mM
glucosa y 20 mM fosfato potásico). También se inocularon los
conidios en presencia de 1 a 10 \mul del extracto de la planta o
de 5 \mul de las fracciones obtenidas en diversas condiciones de
puruficación. La cámara húmeda se situó dentro de una cámara de
crecimiento que se mantuvo a 22ºC, 40% humedad y ciclos de
luz-oscuridad de 24 h. A los 4 días de inoculación
se anotó cualquier respuesta de hipersensibilidad en la hoja. Las
lesiones necróticas se valoraron desde 0 (ausencia de reacción)
hasta 5, a medida que se producía un incremento gradual en la
intensidad de la reacción. Cada combinación
patógeno-muestra se ensayó en 2 hojas diferentes, y
cada experimento se repitió al menos 2 veces. En todos los
experimentos se incluyeron controles con sólo esporas, disolventes
y tampones, a las concentraciones finales que se habían utilizado.
Los datos representan el valor medio de cuatro experimentos.
1 gramo (peso fresco) de brotes de patata (S.
tuberosum var. Desireè) se pulverizó en un mortero, en
presencia de nitrógeno líquido, y se recogió con 3 ml de una
solución del tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6,8, manteniéndose en
hielo durante 1 h, con agitaciones ocasionales. La mezcla se filtró
a través de 4 capas de papel Miracloth y el líquido resultante se
centrifugó a 50.000xg y 4ºC, durante 1 h (Beckman
L7-65 Ultracentrifuge). Se recogió el sobrenadante y
se fraccionó a través de una columna Centricon SR3 (Amicon) (3 kDa
cut-off); y las 2 fracciones fueron conservadas a
4ºC para posteriores ensayos enzimáticos o purificaciones.
Para la purificación de los extractos proteicos
con actividad PIs se utilizaron 2 procedimientos, A o B:
Procedimiento
A
La muestra (extracto proteico de brotes de
tubérculo de patata) se cargó en una columna cromatográfica de
intercambio aniónico (Macro Prep® Q Anion (2,5 per 20 cm)
(Bio-Rad)) equilibrada con tampón fosfato sódico 20
mM pH 6,8. La columna se lavó con este tampón y, posteriormente, la
muestra se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (de 0 a 0,5 M).
Las fracciones activas, de PIs, se dializaron con agua destilada a
4ºC, durante 2 días, con un cut-off de 10 kDa y se
purificaron, de nuevo, por cromatografia líquida de alta resolución
(HPLC), usando la columna de gel de filtración
G-oligo-PW (TSK-Gel®
HPLC Column, Pharmacia). Las muestras se eluyeron con agua o con
una solución de NaCl 50 mM. Se utilizaron como estándar de
calibración, los siguientes azúcares (Sigma): glucosa (Pm 180,16),
lactosa (Pm 360,32), rafinosa (Pm 594,5), estaquiosa (Pm 666,6),
\alpha-solanina (Pm 868,9) y
\alpha-ciaconina (Pm 852,7).
Procedimiento
B
La muestra (extracto proteico de brotes de
tubérculo de patata) se incluyó en una columna de afinidad
cromatográfica (Affigel-Gel®-10 Gel). Previamente
se preparó la matriz; para ello, 3 m1 de gel se equilibraron con
NaHCO_{3} 0,1 M, pH 7,5, y se incubaron, durante 12 h, con 200 mg
de quimiotripsina. Se preparó la columna con esta matriz y se lavó
con, NaHCO_{3} 0,1 M, pH 7,5, hasta que el valor de absorbancia,
a 280 nm, dio cero. La muestra se concentró 4X, previamente en un
Speed-Vac, y se cargó en la columna, que se lavó
con NaHCO_{3} 0,1 M, pH 7,5, hasta que la absorbancia dio un valor
0. Se eluyeron varias fracciones, de 1 ml, con glicina 0,1 M pH 3 y
se hizo un seguimiento de su contenido proteico a 280 nm. Se
seleccionaron las fracciones relativas a los picos proteicos; y
alícuotas de las mismas se analizaron para la actividad inhibidora
de hongos.
La actividad inhibidora de las fracciones
proteicas se ensayó a diferentes pH con los tampones fosfato sódico
100 mM, pH 4,5, 6,8 y 9. También se emplearon para la
caracterización tratamientos con proteinasa K (Sigma) y peptidasa
(Sigma).
El tamaño y pureza de los PIs se analizó
electroforéticamente en la unidad de electroforesis LK
B-PhastSystem electrophoresis unit (Pharmacia). Se
utilizaron un gel Phast-Gel® Homogeneous 20 y tiras
de tampón Phast-Gel™ SDS, bajo condiciones
desnaturalizantes, según el método de Laemmli (Laemmli, 1970). Se
utilizó el marcador de pesos moleculares LWM de Pharmacia. Los geles
se tiñeron con plata según el protocolo de Oakley et al.
(1980). El contenido proteico se determinó espectrofotométricamente
o mediante el método de Bradford (Bradford, 1976), utilizando
seroalbúmina bovina como estándar.
Se secuenciaron el extremo
amino-terminal y péptidos internos de 2 muestras
(PI-16 y PI-10), previamente
separadas por electroforesis SDS-PAGE con un 16% de
poliacrilamida, teñidas con azul Coomassie, lavadas con una solución
de metanol 45% y ácido acético 10% y cortadas del gel. La obtención
de los péptidos internos se realizó por digestión enzimática con
tripsina, y posterior extracción y purificación mediante
RP-HPLC. El proceso de secuenciación se llevó a
cabo siguiendo el método de degradación de Edman en un secuenciador
automático Applied Biosystems modelo 494 conectado en fase con un
aparato de RP-HPLC para la identificación de los
PTH-aminoácidos liberados.
Se partió de 50 mg de hoja de patata que se
congelaron en un micro tubo bajo nitrógeno líquido y se
pulverizaron con un bastoncillo metálico. El polvo se resuspendió
en 250 \mul de tampón de extracción [0,5 ml de tampón 1, 2X, pH
7,5 (NaCl 0,6 M, Tris 100 mM, EDTA 40 mM, 4% sarcosil y 1% SDS), 0,4
ml de urea 12 M, 0,05 m1 de fenol y 0,05 ml de H_{2}O]. Se
mezclaron con otros 250 \mul del tampón de extracción. La
suspensión se extrajo dos veces con 400 \mul de una solución
fenol/cloroformo-alcohol isoamilico (24:1; v:v),
mezclando cuidadosamente. La fase acuosa se transfirió a un micro
tubo limpió y se añadieron 0,8 volúmenes de isopropanol,
manteniendo la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. El
ADN se recogió por centrifugación durante 10 minutos, se lavó con
etanol al 70%, y se secó en Speed-Vac. El ADN
precipitado se resuspendió en 80 \mul del tampón Tris 10 mM -
EDTA 1 mM, pH 8; se añadieron 10 \mug/ml de RNasa (Sigma) y se
conservó a 4ºC.
De la muestra PI-16 se obtuvieron
las siguientes secuencias aminoacídicas: EFECKGKLQWPELIGVP [SEC.
ID. Nº: 3], procedente del extremo N-terminal; y
DNPLDISFK [SEC. ID. Nº: 4], procedente de la fracción 17, y
LFDNILGVVVDMPV [SEQ. ID. Nº: 5], procedente de la fracción 35,
obtenidas todas ellas por HPLC tras una digestión con tripsina.
Teniendo en cuenta la homología de la SEC. ID.
Nº: 3 con el extremo N-terminal del inhibidor de
quimiotripsina I cadena \beta de patata, se diseñaron los
cebadores EF, EFDEG y EFRDEG. EF, se ha diseñado en base a la zona
PELIGVP, y EFDEG, en base a la zona WPELIGVP; mientras que EFRDEG
se diseñó sobre QIPRVA (zona conservada en el extremo
C-terminal en el alineamiento de varios inhibidores
de quimiotripsina).
EF: 5' CCAGAACTTATTGGTGTACCA 3' (directo) [SEC.
ID. Nº: 6]
EFDEG: 5' CAATGGCCWGARCTTATYGG 3' (directo) [SEC.
ID. Nº: 7]
EFRDEG: 5' DGCMACYCTWGGRATYTGMAC 3' (inverso)
[SEC. ID. Nº: 8]
En base a la homología del péptido de la SEC. ID.
Nº: 4 con una porción del inhibidor de aspartil proteasa (1.304 pb)
y de un inhibidor tipo Kunitz (1.336 pb), ambos de patata, se
diseñaron los oligonucleótidos Asp2 y Asp6. Asp2 se diseñó sobre el
péptido de la SEC. ID. Nº: 4, mientras que Asp6 se diseñó sobre el
extremo 3' del gen que codifica para el inhibidor de aspartil
proteasa. También se han diseñado, sobre la secuencias del
inhibidor de aspartil proteasa, los cebadores: SP y NSP, en el
extremo 5' del gen, para amplificar el gen de aspartil proteasa con
el péptido señal o sin el mismo, respectivamente, y RP, en el
extremo 3' del gen, y que comprende el codón de parada TAA.
Asp2:
5'-GTGCGTTAGGTGG-3' (directo) [SEC.
ID. Nº: 9]
Asp6:
5'-ACTGGACTTGCTTG-3' (inverso) [SEC.
ID. Nº: 10]
SP:
5'-TTCGTTAGTGTAGAGGAGTC-3' (directo)
[SEC. ID. Nº: 11]
NSP:
5'-GATGCTACTCCAGTACTTGA-3' (directo)
[SEC. ID. Nº: 12]
RP:
5'-TTACTGGACTTGGCTTGAAGG-3'
(inverso) [SEC. ID. Nº: 13]
En base a la homología del péptido de la SEC. D.
Nº: 5 con el extremo N-terminal del gen que codifica
para el inhibidor de proteinasas tipo I de Lycopersicon
esculentum, se diseñaron los cebadores LFF, LFF2, LF y LFDEG.
Los cebadores LFF y LFF2 se diseñaron sobre la zona altamente
conservada en el extremo 5' de los dos genes, de patata y tomate.
El cebador LF, se diseñó sobre la zona LFDNILG; y LFDEG, sobré
LFDNILGV.
LFF: 5'-ATGGAGTCAAAGTTTGCTCA 3'
(directo) [SEC. ID. Nº: 14]
LFF2: 5'-CAAATTCACTCAATTCCTTCT 3'
(directo) [SEC. ID. Nº: 15]
LF: 5'-ACCCAAGATGTTATCAAAAAG 3'
(inverso) [SEC. ID. Nº: 16]
LFDEG: 5'-ACMACMACDCCVARRATGT 3'
(inverso) [SEC. ID. Nº: 17]
Las reacciones de amplificación se llevaron a
cabo en un termociclador Perkin-Elmer Cetus
(Perkin-Elmer) en un volumen de reacción de 50
\mul. Se añadieron 20 ng de ADN genómico de patata a una mezcla
de reacción de PCR con una composición final de 1 X de tampón del
enzima, 40 pmoles de cada uno de los cebadores, dNTPs 150 \muM,
cloruro de magnesio 2 mM y 1 U de Taq polimerasa. Las
reacciones se incubaron durante 5 minutos a 94ºC (desnaturalización
inicial), posteriormente se programaron 32 ciclos, que comenzaron
con desnaturalización (45 segundos a 94ºC), seguido de la
hibridación de los 2 oligonucleótidos cebadores (50 segundos a
diferentes temperaturas según los cebadores) y la extensión del ADN
en dirección 3' (90 segundos a 72ºC). Después de los 32 ciclos se
realizó una extensión final, de 10 minutos a 72ºC, para completar
las hebras. Las temperaturas de hibridación, según las distintas
parejas de cebadores, fueron: 46ºC para Asp2-Asp6;
58ºC para NSP-RP (SEC. ID. Nº: 12 - SEC. ID. Nº:
13) y SP-RP (SEC. ID. Nº: 11 - SEC. ID. Nº: 13);
56ºC para LFF-LF (SEC. ID. Nº: 14 - SEC. ID. Nº:
16), LFF-LFDEG (SEC. ID. Nº: 14 - SEC. ID. Nº: 17),
LFF2-LF (SEC. ID. Nº: 15 - SEC. D. Nº: 16) y
LFF2-LFDEG (SEC. ID. Nº: 15 - SEC. ID. Nº: 17); y
60ºC para EF-EFRDEG (SEC. ID. Nº: 6 - SEC. ID. Nº:
8) y EFDEG-EFRDEG (SEC. ID. Nº: 7 - SEC. ID. Nº:
8).
Los fragmentos amplificados se separaron mediante
electroforesis en geles de agarosa al 0,8-1%, en
tampón TAE 1 X (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8),
en los que se incluyó bromuro de etidio, y se visualizaron en un
transiluminador con luz UV.
Se utilizó el plásmido pGEM®-T Easy (Promega)
para clonar los fragmentos amplificados por PCR. Los plásmidos se
utilizaron en la transformación, mediante electroporación, de las
células competentes DH5\alpha (E. coli). Se empleó el
electroporador Gene-Pulser de
Bio-Rad. Las células bacterianas se crecieron a
37ºC en el medio LB (0,5% extracto de levadura, 1% Bacto peptona, 1%
NaCl, ajustado a pH 7), suplementado con ampicilina para la
selección cuando fue necesaria. Los fragmentos de ADN que iban a
ser clonados, se recuperaron de los geles de agarosa y se
purificaron utilizando el sistema QIAEX II Agarose Gel Extraction
kit (QIAGEN). Los procedimientos utilizados en cada una de las
etapas están descritos en Sambrook et al. (1989). Para las
digestiones con el enzima EcoR I (Promega), ligaciones
(Promega) y purificaciones de ADN plasmídico con el kit QIAPrep
Spin kit (QIAGEN), se siguieron las recomendaciones de las casas
comerciales. Las 2 cadenas de los productos de PCR clonados fueron
secuenciadas por NEA-BIOGEN (Genelab, Florencia,
Italia), usando los cebadores T7 y SP6. Las comparaciones de las
secuencias de ADN y proteínas se realizaron con el programa de
análisis de secuencias BLAST de la base de datos NCBI (National
Center for Biotechnology Information) con la dirección
/www.ncbi.nlm.nih.gov/.
ADN genómico (20 \mug) de patata se digerió con
los enzimas Nsi I o BamH I, y se separó en un gel de
agarosa al 0,7%, transfiriéndose después a una membrana
Hybond-N+ (Amersham). El ADN se fijó por luz UV
usando un Stratalinker (Stratagene). La membrana se hibridó con la
sonda (gen PKI1), a 42ºC. Las hibridaciones y los lavados se
hicieron en condiciones de alta homología. La detección se realizó
mediante el sistema DIG de Boehringer Mannheim. Los protocolos para
cada etapa están descritos en Sambrook et al., 1989.
Azocaseína y péptidos sintéticos se utilizaron
como sustratos para medir, en ensayos in vitro, la actividad
proteásica fúngica. Interesantemente, sólo se detectó una actividad
proteásica elevada en filtrados de B. cinerea, A.
alternata y F. oxysporum crecidos en un medio de cultivo
adicionado de material vegetal, encontrándose la actividad máxima
en filtrados de T. atroviride crecida en presencia de
paredes celulares o quitina. Filtrados tomados de cultivos de 4
días, de los hongos patógenos crecidos en el medio PDB 0,1% +
material vegetal 5%, se seleccionaron como actividades proteásicas
diana. Los filtrados fúngicos mostraron una reacción muy débil con
los sustratos TEE, BTEE, TAME y p-NGB y su
comportamiento con el pNA fue similar al que se detectó con
quimiotripsina sobre este sustrato (Figura 1). Por todo lo expuesto
y por la rapidez y sensibilidad del ensayo, realizado en placas
ELISA, el pNA fue seleccionado como sustrato para medir actividades
proteásicas e inhibidoras de proteasas. Las actividades proteásicas
detectadas fueron ligeramente superiores (10-18%) a
pH 6,8 que a pH 4 ó 9.
La Figura 2 recoge los resultados obtenidos, en
donde puede apreciarse que:
- -
- la hidrólisis del pNA, por 0,4 \mug de quimiotripsina, fue marcadamente inhibida por 400 \mug/ml de la mezcla de PIs de repollo, 100 \mug/ml de Pefabloc, 25 \mug/ml de Chymostatina y 1 mM de PMSF; los cuales son inhibidores de serina, serina, quimiotripsina y serín-cisteín-metaloproteasas, respectivamente;
- -
- la Aprotinina, Leupeptina y el PI de soja (inhibidores de serín-, serín- y cisteín-, y serín- proteasas, respectivamente), dieron un valor de 70-80 % de inhibición de quimiotripsina, cuando se utilizaron a 1,5, 3 y 100 \mug/ml, respectivamente, y valores por debajo del 30% de inhibición de la actividad proteásica fúngica cuando se utilizaron a 30, 30 y 100 \mug/ml, respectivamente;
- -
- la Antipaina, inhibidor de tripsina, papaína y catepsina A y B, produjo valores de 40-50% de inhibición de la quimiotripsina y de la actividad proteásica fúngica, usada a 50 y 100 \mug/ml;
- -
- el EDTA-Na_{2}, un inhibidor específico de metaloproteasas, usado a 200 \mug/ml, inhibió débilmente las actividades de quimiotripsina y de proteinasas fúngicas; sin embargo, a 500 \mug/ml, no inhibía las proteinasas fúngicas pero sí inhibió, sobre un 60%, la actividad de la quimiotripsina; y
- -
- E-64, un cisteín-inhibidor, dio inhibiciones inferiores al 25% para quimiotripsina y proteinasas fúngicas.
Merece la pena destacar que la Chymostatine, un
inhibidor específico de quimiotripsina, inhibió casi en un 100% la
actividad proteásica fúngica (Figura 2).
Se ensayó la capacidad de inhibir la germinación
de esporas de B. cinerea y A. alternata de los PIs de
la Tabla 1. Se observó una inhibición de un 100% con 25 \mug/ml
de Chymostatine, 1 mg/ml de Pefabloc y 1 mM de PMSF. Valores
inferiores a un 2% con 82-\mug/ml de
E-64 y 0,1 mg/ml de Pefabloc. Para el resto de los
PIs ensayados no se observó inhibición en el ensayo de esporas.
Se seleccionaron las dosis de 5 x 10^{5}
conidios de B. cinerea B05.15 y 1 x 10^{6} de A.
alternata F porque producían necrosis, observables después de 4
días, en todos los puntos de inoculación en hojas de judía y
tabaco. No se observaron diferencias significativas en los dos tipos
de hojas. El mayor efecto inhibidor se observó con 100 \mug/ml de
Chymostatine, ya que inhibió en 88,7% y 62,5% las lesiones
necróticas producidas por B. cinerea y A. alternata,
respectivamente; Leupeptina, a 30 \mug/ml, inhibió el 12% y el
18%; y, Pefabloc, a 1 mg/ml, inhibió las lesiones de A.
alternata en un 26% pero no las de B. cinerea. Los PIs
de repollo y de soja, no inhibieron las lesiones de ninguno de los
dos patógenos. Para el resto de los PIs de la Tabla 1, las
inhibiciones fueron del 30-50% para ambos patógenos
(Figura 3).
Después de analizar los resultados obtenidos en
todos los ensayos de actividad realizados, in vitro e in
vivo , se concluyó lo siguiente:
- a)
- la actividad proteásica fúngica diana sería la producida por 20 \mul de un filtrado, procedente de un cultivo de 4 días de incubación del patógeno B. cinerea B05.10 en el medio PDB 0,1% + material vegetal al 5% (hojas de tomate, judía o patata), sobre el sustrato pNA, en las condiciones que se realizó el ensayo (estos filtrados dan valores de absorbancia de 0,4-0,7; y
- b)
- la actividad inhibidora de proteasa que sería el objetivo de la búsqueda, en distintos extractos vegetales, correspondería a serín PIs.
El extracto proteico obtenido de brotes de
tubérculo de patata se fraccionó en una columna cromatográfica de
intercambio aniónico. Todas las fracciones fueron ensayadas por su
capacidad para inhibir la actividad de tripsina sobre azocaseína y
de quimiotripsina sobre pNA; encontrándose alta capacidad
inhibitoria en varias fracciones (fracciones activas) (Figura 4).
Tres fracciones (fracciones 3, 4 y 5), de todas las fracciones
activas ensayadas, mostraron inhibición de B. cinerea en
bioensayos de esporas y de hoja.
La fracción 3 inhibió, un 31%, la actividad
proteásica de B. cinerea y, un 100%, la germinación de
esporas de este patógeno; la fracción 4 inhibió, un 3,1%, la
actividad proteásica fúngica y un 76% la germinación de esporas; y
la fracción 5 inhibió, un 8% la actividad proteásica fúngica y un
41% la germinación de esporas. Las tres fracciones inhibieron un
100% las lesiones necróticas causadas por este patógeno en hojas de
tabaco. En las tres fracciones se detectaron 2 bandas de 16 kDa y
10 kDa, de masa molecular, en geles de poliacrilamida, y también en
las tres fracciones se detectó, por espectroscopia de masas, la
presencia de alcaloides.
La fracción 3, seleccionada para futuras
purificaciones, se separó en una columna de filtración en gel,
obteniéndose las fracciones 1.3, 2.3 y 3.3. Cuando se analizaron
por espectroscopía de masas, sólo se observó la ausencia de
glicoalcaloides únicamente en la fracción 1.3. No obstante, esta
fracción, la 1.3, mantenía sus capacidades de inhibición. Esta
capacidad inhibitoria se perdió cuando la fracción 1.3 se calentaba
a 100ºC durante 10 minutos, o se trataba con 100 µg/ml de
proteinasa K o de peptidasa (Sigma).
Debido al gran número de etapas necesitados para
la purificación de dicha fracción 1.3, las cantidades obtenidas
fueron muy pequeñas. Debido a que, tras todos los ensayos de
actividad, realizados in vitro e in vivo, se había
orientado la búsqueda hacía "PIs específicos para
quimiotripsina", se optó por utilizar columnas de afinidad como
sistema de purificación (Procedimiento de purificación B). Los PIs
presentes en el extracto de brotes de tubérculo de patata, se
purificaron con una columna de afinidad en la que se incluyó
quimiotripsina. Así, los extractos proteicos de patata se
concentraron 4X, y se cargaron en una columna de afinidad. Se
seleccionó la fracción activa, de todas las recogidas, por sus
actividades inhibitorias. Estas actividades se redujeron
significativamente cuando las fracciones se calentaron a 100ºC
durante 10 minutos. Se detectaron 2 bandas, en la fracción activa,
después de teñir con azul Coomassie, con movilidades relativas
correspondientes a 16 kDa y 10 kDa, en geles de poliacrilamida, en
condiciones desnaturalizantes (Figura 5). Las bandas se cortaron y
separaron del gel y se procedió a secuenciar el extremo
N-terminal y algunos péptidos internos de las dos
proteínas.
Se obtuvo la secuencia aminoacídica del extremo
N-terminal y de péptidos internos, de las dos
muestras denominadas PI-16 y PI-l0,
correspondientes a las dos bandas con movilidad relativa en geles
de poliacrilamida de 16 kDa y 10 kDa, respectivamente. En ambas
muestras se detectó la presencia de más de una proteína (dato
observado por isoelectroenfoque) y también se apreció una
elevadísima homología entre las secuencias aminoacídicas de ambas
muestras, lo que permite suponer que la banda correspondiente a
PI-10 es, en realidad, un producto de la
degradación de PI-16, catalizada por proteasas que
pudieran estar en la mezcla.
La secuencia de aminoácidos del extremo
N-terminal de PI-16,
EFECKGKLQWPELIGVP (SEC. ID. Nº: 3), mostró una homología del 100%,
con la porción N-terminal del inhibidor de
quimiotripsina de tipo I, cadena \beta, de patata (número de
acceso S07233). Después de la digestión de PI-16 con
tripsina, y la posterior separación por HPLC preparativa, se
obtuvieron dos péptidos, denominados 17 y 35.
La secuencia del péptido 17, DNPLDISFK (SEC. ID.
Nº: 4), mostró una homología del 100% con una porción aminoacídica
en el extremo C-terminal de dos inhibidores de
patata, un PI tipo Kunitz (AF492359) y un inhibidor de aspartil
proteasa (S25314).
La secuencia del péptido 35, L FDNILGVVVDMPV
(SEC. ID. N º: 5), mostró una homología de un 90% con una porción
del extremo C-terminal de un PI tipo I de tomate
(A24048) y de un PI tipo I de patata (S07233).
Se utilizaron 3 hipótesis de trabajo para la
clonación de los genes relativos:
- 1)
- que las tres secuencias aminoacídicas (SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 4 y SEC. ID.Nº: 5) pertenecieran a la misma proteína (no se encontró en análisis Blast, ningún grado de homología con una sola proteína presente en bases de datos);
- 2)
- que cada secuencia pertenezca a una proteína PI diferente; y
- 3)
- que la SEC. ID. Nº: 4 pertenezca a un inhibidor de la familia de las serín proteasas (tipo Kunitz) o de las aspartil proteasas, y que las SEC. ID. N º: 3 y SEC. ID. Nº: 5 pertenezcan, ambas, a los inhibidores de la familia de las serín proteasas.
En el diseño de cebadores necesarios para clonar,
mediante PCR, los genes relativos a las PIs, se siguieron las
hipótesis 2 y 3 (véase el apartado "Diseño de oligonucleótidos
cebadores"). Se realizaron amplificaciones con 8 parejas de
cebadores, de los 12 diseñados, sobre ADN genómico de patata. Se
obtuvieron varios productos de amplificación, de entre 200 y 1.400
pares de bases (pb), que fueron clonados y secuenciados.
Utilizando las parejas de cebadores
SP-RP (SEC. ID. Nº: 11 - SEC. ID. Nº: 13) y
NSP-RP (SEC. ID. Nº: 12 - SEC. ID. Nº: 13), se
amplificaron dos bandas, de aproximadamente 730 y 650 pb (Figura
6), respectivamente, denominadas SPK1 y NSPK1.
Las bandas, SPK1 y NSPK, una vez cortadas y
separadas del gel, se clonaron en pGem-T Easy y se
secuenciaron. Las secuencias eran exactamente de 729 y 650 pb de
longitud. El análisis BlastX reveló que ambas secuencias presentaban
una elevada homología con un inhibidor de serín proteasas de tipo
Kunitz (98% con el PI tipo Kunitz de patata, P1H5), cuya secuencia
aminoacídica ....DNPLDIVSFK.. se diferencia de la secuencia
B (el PI con actividad antifúngica) en una valina adicional
(subrayada).
Utilizando los cebadores EFDEG y LFDEG (SEC. ID.
Nº: 7 - SEC. ID. Nº: 17), se ha aislado un fragmento génico de 162
pb, denominado PPI162 (potato proteinase inhibitor 162). El
análisis de su secuencia, mediante el programa BlastX, reveló un
90% de homología con el PI tipo I de patata. Asimismo, el análisis
BlastX reveló la presencia de las secuencias aminoacídicas
QWPELIGVP y LFDNILGW.
Las dos secuencias amplificadas con las parejas
de cebadores SP-RP (SEC. ID. Nº: 11 - SEC. ID. Nº:
13) y NSP-RP (SEC. ID. Nº: 12 - SEC. ID. Nº: 13)
tenían una longitud de 729 y 636 pb, respectivamente. La diferencia
entre ambas secuencia es un péptido señal de 93 pb que está
presente en el fragmento de 729 pb (Figura 7). El análisis BlastX
de estas dos secuencias reveló una alta homología con varios PIs
depositados en bases de datos. En la secuencia del fragmento de 729
pb se encuentra la secuencia completa de un gen, denominado
PKI1 en esta descripción, de 667 pb de longitud. Este gen
posee una secuencia que codifica para un péptido señal (93 pb),
responsable, putativamente, de la localización apoplástica del
inhibidor. También se ha localizado, sobre la secuencia de
PKI1, un intrón de 222 p b de longitud, cuya secuencia se
adecua con exactitud a las secuencias consenso de procesamiento de
intrones (Rambosek y Leach, 1987). La secuencia consenso del
extremo 3' descrita en otros microorganismos, PiAG (Pi representa
cualquier base pirimidínica), está presente en el intrón del gen
PKI1 (TAG) y, como en la mayoría de los intrones, el extremo
5' está flanqueado por la secuencia GT, que forma parte de la
presunta secuencia 5' de procesamiento GTAAGT. Esta secuencia
coincide con la secuencia de procesamiento del extremo 5' típica de
eucariotas superiores, GTAAGT (Leerner et al., 1990).
La secuencia codificante de PKI1, sería de
445 pb de longitud, y codifica putativamente para una proteína de
16,2 kDa de masa molecular, punto isoeléctrico 7,62 y carga +0,89,
cuya secuencia de aminoácidos se recoge en la SEC. ID. Nº: 1.
En un análisis BlastX, el producto de PKI1
dio una homología en un 98% con una región de 187 aminoácidos de un
inhibidor de S. tuberosum (AF492359) [este gen codifica para
un putativo precursor de un inhibidor de proteinasas tipo Kunitz
(P1H5)] y un valor de homología del 94% con una región de 189
aminoácidos de un inhibidor tipo Kunitz de patata (AF492769). Cabe
destacar que los elevadísimos niveles de homología (a veces
superiores al 95%) son encontrados entre otros miembros de la
familia de inhibidores de las serín proteasas; por lo que las
homologías descritas, tanto en nucleótidos como en aminoácidos, son
habituales entre proteínas de esta familia.
Finalmente, mediante un análisis Southern,
utilizando ADN de patata y el gen PKI1 como sonda, se
confirmó la presencia de una sola copia de este gen en el genoma de
patata (datos no mostrados).
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<120> Inhibidores de proteasas, ácidos
nucleicos que codifican para dichos inhibidores y aplicaciones
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<160> 17
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 147
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<212> PRT
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<213> Solanum tuberosum
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
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<211> 729
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<212> ADN
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<213> Solanum tuberosum
\newpage
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<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
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<211> 17
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<212> Péptido
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<213> Extremo
N-terminal
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
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\sa{Glu Phe Glu Cys Lys Gly Lys Leu G1n Trp Pro
Glu Leu Ile Gly Val Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 9
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<212> Péptido
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<213> Fragmento interno
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
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\sa{Asp Asn Pro Leu Asp Ile Ser Phe Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
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<211> 14
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<212> Péptido
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<213> Fragmento interno
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
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\sa{Leu Phe Asp Asn Ile Leu Gly Val Val Val Asp
Met Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador EF
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagaactta ttggtgtacc a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido iniciador EFDEG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatggccwg arcttatygg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 8
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Oligonucleótido iniciador EFRDEG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipdgcmacyctw ggratytgma c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 13
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador Asp2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgcgttagg tgg
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 14
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido iniciador Asp6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactggacttg cttg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Oligonucleótido iniciador SP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcgttagtg tagaggagtc
\hfill20
Claims (15)
1. Una proteína con actividad inhibidora de
proteasas, seleccionada entre:
- a)
- una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. Nº.: 1,
- b)
- una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a dicha SEC. ID. Nº: 1 y funcionalmente equivalente a la proteína definida en a); y
- c)
- un fragmento de la proteína definida en a) o en b), en donde dicho fragmento es funcionalmente equivalente a la proteína definida en a).
2. Proteína según la reivindicación 1,
caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC. ID. Nº: 1.
3. Proteína según la reivindicación 2,
caracterizada porque tiene actividad inhibidora de
serin-proteasas, un peso molecular de 16,2 kDa
aproximadamente determinado por SDS-PAGE, un punto
isoeléctrico (pI) de 7,62 y una carga de +0,89.
4. Proteína según la reivindicación 1,
caracterizada porque tiene actividad inhibidora de
serín-proteasas, un peso molecular de 10 kDa
aproximadamente determinado por SDS-PAGE y cuya
secuencia de aminoácidos es un fragmento de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 1.
5. Una secuencia de nucleótidos, aislada, que
codifica para una proteína con actividad inhibidora de proteasas
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 5, seleccionada entre:
- a)
- la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 2; y
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a) que
- i)
- es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos definida en a); y/o
- ii)
- codifica para un péptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos definida en a).
7. Una construcción de ADN que comprende una
secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 5
ó 6.
8. Construcción de ADN según la reivindicación 7,
que comprende, además, un promotor y/o unos elementos reguladores de
la expresión de dicha secuencia de nucleótidos funcionales en
plantas.
9. Un vector que comprende una secuencia de
nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, o una
construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u
8.
10. Un procedimiento para producir una planta
transgénica que comprende transformar dicha planta con una secuencia
de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, o una
construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8,
o con un vector según la reivindicación 9.
11. Una célula transgénica que comprende una
secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 5
ó 6, o una construcción de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, integrada en el genoma de dicha célula.
12. Una planta transgénica que comprende, al
menos, una célula transgénica según la reivindicación 10.
13. Un método para producir plantas modificadas
genéticamente con susceptibilidad reducida al daño causado por un
agente fitopatógeno o causante de plagas, que comprende
- a)
- insertar en el genoma de una célula de tejido vegetal una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, con una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, o con un vector según la reivindicación 9;
- b)
- obtener células vegetales transformadas; y
- c)
- regenerar, a partir de dichas células vegetales plantas genéticamente transformadas con susceptibilidad reducida al daño causado por dicho agente fitopatógeno o causante de plagas.
14. Un método para controlar un agente
fitopatógeno o causante de plagas que comprende exponer a dicho
agente a una cantidad efectiva de una proteína según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína es expresada en
una planta o en un microorganismo colonizador de plantas o suelos
como resultado de una manipulación genética.
15. Una composición que comprende una proteína
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo
aceptable desde un punto de vista agrícola.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200202740A ES2224823B1 (es) | 2002-11-28 | 2002-11-28 | Inhibidores de proteasas, acidos nucleicos que codifican para dichos inhibidores y aplicaciones. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200202740A ES2224823B1 (es) | 2002-11-28 | 2002-11-28 | Inhibidores de proteasas, acidos nucleicos que codifican para dichos inhibidores y aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2224823A1 true ES2224823A1 (es) | 2005-03-01 |
| ES2224823B1 ES2224823B1 (es) | 2007-03-01 |
Family
ID=34354755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200202740A Withdrawn - After Issue ES2224823B1 (es) | 2002-11-28 | 2002-11-28 | Inhibidores de proteasas, acidos nucleicos que codifican para dichos inhibidores y aplicaciones. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2224823B1 (es) |
-
2002
- 2002-11-28 ES ES200202740A patent/ES2224823B1/es not_active Withdrawn - After Issue
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BARLIC-MAGANJA D. et al. "Isolation and sequence analysis of the genomic DNA fragment encoding an aspartic proteinase inhibitor homologue from potato (Solanum tuberosum)". Plant Mol. Biol., 1992, 20:311-313. * |
| HEIBGES, A. et al. "Putative Kunitz-type proteinase inhibitor PIH5". 1 junio 2002, EMBL UNIPROT DATABASE [en linea] [recuperado el 12.01.2005]. Accession n‘ Q8S380. * |
| HEIBGES, A. et al. "Putative Kunitz-type proteinase inhibitor PIH5". 1 junio 2002, EMBL UNIPROT DATABASE [en línea] [recuperado el 12.01.2005]. Accession nº Q8S380. * |
| ISHIKAWA A. et al. "A family of potato genes that encode Kunitz-type proteinase inhibitors: structural comparisons and differential expression". 1994, Plant Cell Physiol. 35(2):303-312. * |
| MARES M. et al. "Primary structure of cathepsin D inhibitor from potatoes and its structure relationship to soybean trypsin inhibitor family". FEBS Lett., 1989, 251:94-98. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2224823B1 (es) | 2007-03-01 |
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|
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