ES2223215A1 - Metodo para la deteccion e identificacion rapido de bacillus cereus mediante la reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real. - Google Patents
Metodo para la deteccion e identificacion rapido de bacillus cereus mediante la reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real.Info
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Abstract
Método para la detección e identificación rápida de Bacillus cereus mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. El método comprende (i) preparar un conjunto de tubos conteniendo cada tubo una mezcla de reacción específica para la bacteria a detectar (B. cereus), (ii) programar un aparato para el control simultáneo de múltiples amplificaciones de ácido nucleico que comprende un termociclador, una fuente de luz y un sensor para obtener un conjunto de señales, (iii) interpretar las señales obtenidas,, y (iv) determinar simultáneamente la presencia o ausencia de dicha bacteria en las muestras ensayadas, mediante el empleo, de oligonucleótidos (iniciadores y sondas marcadas) específicos para cada bacteria. De interés especial en la industria agro-alimentaria y de distribución de alimentos, para la detección de bacterias que deterioran alimentos tales como Bacillus cereus.
Description
Método para la detección e identificación rápida
de bacillus cereus mediante la reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real.
La invención se relaciona, en general, con la
detección e identificación de bacterias que deterioran alimentos,
tales como Bacillus cereus, mediante la reacción en cadena
de la polimerasa en tiempo real.
La detección de bacterias que deterioran
alimentos, tales como Bacillus cereus (B. cereus)
tiene mucho interés en la industria agroalimentaria, tanto la
productora como la distribuidora de productos alimenticios (materias
primas y/o productos elaborados), por lo que se han descrito
diversos métodos para su detección e identificación.
El Código Alimentario Español establece una
normativa en la que, para cada alimento, se especifican los
microorganismos cuya presencia debe ser detectada, así como las
técnicas recomendadas para estos análisis. En general, estas
técnicas utilizan metodologías convencionales basadas en el
cultivo del microorganismo, que requieren el
pre-enriquecimiento en caldo durante
24-48 horas, el sub-cultivo en
medios selectivos durante otras 24-48 horas, y,
finalmente, realizar una identificación bioquímica y de
serotipación, lo que requiere otras 24-48 horas;
es decir, en total deben transcurrir entre 72 y 96 horas antes de
obtener un resultado. Por otra parte, dicha metodología basada en
el cultivo del microorganismo no es totalmente fiable ya que
muchos microorganismos son difíciles de cultivar y, más aún, de
cuantificar, y, por el tiempo que emplea, requiere largos períodos
de almacenamiento de las materias primas y de los productos
elaborados, con su correspondiente impacto en los costes y posible
disminución de competitividad tanto a nivel nacional como
internacional. Lo mismo ocurre con las empresas de distribución,
en especial con las grandes superficies, que deben almacenar
grandes cantidades de productos, algunos de ellos perecederos, así
como con las empresas de hostelería que, en numerosas ocasiones,
se ven perjudicadas por el retraso en el control de los alimentos
que sirven. Por estos motivos, existe la necesidad de aumentar la
sensibilidad y al mismo tiempo la fiabilidad y rapidez en la
detección de los microorganismos que pueden llegar a deteriorar los
alimentos, en particular, los alimentos procesados.
En algunos casos será necesario sólo aumentar la
sensibilidad del método para detectar de forma fiable y rápida la
presencia o ausencia del microorganismo, mientras que, en otros
casos será necesario, además, cuantificar los microorganismos
eventualmente presentes con el fin de establecer los límites de
concentración a partir de los cuales la presencia del
microorganismo puede representar un problema para la estabilidad del
producto alimenticio.
En comparación con los métodos de cultivo de
microorganismos tradicionales, las técnicas moleculares,
especialmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [Saiki,
R.K., et al., 1988. Science 239: 487-491] se están
revelando como un método fácil, sensible y ventajoso en su
relación costo-beneficio para detectar la presencia
de microorganismos. Estos métodos están desplazando rápidamente a
los métodos convencionales en el diagnóstico de múltiples
enfermedades, aunque en el área alimenticia están desarrollando sus
primeros avances con un valor únicamente cualitativo.
La patente norteamericana US 6.087.104 describe
unos oligonucleótidos útiles para la detección de B. cereus
mediante PCR, utilizando termocicladores convencionales, cuyo
tiempo para la realización de cada ciclo es superior al minuto, y
requieren, además, una detección post-amplificación
del producto amplificado, lo que incrementa el tiempo necesario
para obtener el resultado final y hace más compleja la técnica. No
existen métodos comerciales para la amplificación de estos
microorganismos.
Existe, por tanto, la necesidad de disponer de un
método rápido, que proporcione resultados en menos de 24 horas,
preciso y fiable, que permita la detección cualitativa y, si se
desea, cuantitativa, de microorganismos contaminantes eventualmente
presentes en una muestra de ensayo, y que permita detectar e
identificar simultáneamente uno o más microorganismos
patógenos.
Este objetivo puede obtenerse mediante el empleo
de una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en
tiempo real), que comprende amplificar el número de copias de un
fragmento del genoma de un microorganismo y la detección del
producto obtenido en cada paso de la reacción, empleando para ello
un aparato termociclador rápido con detección a tiempo real que
incorpora una conexión a un ordenador en el que se encuentra el
software necesario para el control de todos los procesos paso a
paso. Se trata de una técnica reciente cuya principal
característica reside en que la amplificación y el análisis ocurren
en el mismo tubo de reacción y se obtiene información durante todo
el tiempo en que transcurre la técnica sin necesidad de tener que
utilizar isótopos o geles de electroforesis, lo que permite reducir
el tiempo de detección de ácidos nucleicos de 5 horas a 20
minutos.
\newpage
La invención se enfrenta, en general, con el
problema de desarrollar un método rápido, preciso y fiable, que
permita detectar e identificar, bacterias causantes del deterioro
de alimentos, tales como B. cereus, basado en el empleo de
técnicas moleculares.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en el diseño y desarrollo de una serie de reactivos
(oligonucleótidos iniciadores y sondas específicos) que, en
determinadas condiciones de reacción, permiten amplificar un
fragmento del genoma específico de B. cereus, y detectar la
presencia o ausencia de dicha bacteria en una muestra de ensayo
mediante PCR en tiempo real.
Brevemente, el método proporcionado por esta
invención para detectar e identificar B. cereus, en una
muestra de ensayo, mediante PCR en tiempo real, comprende la
extracción del ADN eventualmente presente en dicha muestra de
ensayo, la amplificación de una secuencia definida de ese ADN
mediante PCR y la detección continua de los productos amplificados.
Para realizar dicha amplificación y detección es necesario utilizar
una serie de reactivos y oligonucleótidos (iniciadores y sondas)
específicos. Por tanto, para amplificar y detectar dicho
microorganismo se ha diseñado, por una parte, una pareja de
iniciadores que permiten amplificar una secuencia de nucleótidos
diana presente en el genoma bacteriano que se desea poner de
manifiesto, y, por otra parte, una pareja de sondas que permiten
identificar con certeza dicha secuencia diana, siendo dichas sondas
complementarias a una región presente en los productos de
amplificación y estando marcadas, una de ellas, con un fluoróforo y
la otra con un colorante que captura la energía liberada por el
fluoróforo y la emite a su vez en otra longitud de onda detectable
por el sistema. El termociclador rápido con detección a tiempo
real, en cada paso de la reacción realiza la duplicación del
fragmento de ADN mediante los iniciadores y una polimerasa
termorresistente y a cada uno de los dos fragmentos resultantes se
unen las sondas. Estas sondas adheridas al fragmento de ADN
emitirán energía a una determinada longitud de onda al ser
excitadas. Este proceso (unión de los iniciadores, duplicación del
fragmento de ADN, unión de las sondas, detección energía emitida)
se repite un número determinado de veces, típicamente unas 30
veces, obteniéndose al final gran cantidad del producto
amplificado. Con todas las medidas realizadas, se realiza un
análisis estadístico que determina el tipo de ADN amplificado, por
ejemplo, mediante análisis de la Temperatura de Hibridación (Tm) y,
si se desea, la concentración del mismo.
Para la puesta en práctica del método
proporcionado por esta invención, se requiere un termociclador
rápido a tiempo real, el cual, en una realización particular, está
unido a un sistema de detección por fluorescencia, lo que permite
la monitorización en tiempo real del proceso de amplificación tras
cada ciclo. Además, el análisis del producto final de PCR se
realiza una vez terminado el proceso de amplificación sin necesidad
de ninguna manipulación. Su integración junto con un ordenador
permite diseñar los programas de amplificación, detección y
análisis de los productos.
Un método como el proporcionado por esta
invención presenta la ventaja de que permite la detección e
identificación rápida, típicamente en menos de 24 horas, precisa y
fiable, B. cereus, en una muestra de ensayo, así como la
cuantificación de los microorganismos eventualmente presentes en
dicha muestra de ensayo.
Un objeto de esta invención lo constituye un
método para la detección e identificación de B. cereus,
mediante PCR en tiempo real. Los oligonucleótidos (iniciadores y
sondas marcadas) utilizados en la realización de dicho método, así
como los kits que los contienen constituyen objetos adicionales de
esta invención.
La invención proporciona un método para la
detección e identificación rápida de B. cereus, en una o
más muestras de ensayo, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en tiempo real, en adelante método de la
invención, que comprende:
- a)
- extraer el ADN presente en dicha muestra o muestras de ensayo;
- b)
- preparar un conjunto de tubos conteniendo cada tubo una mezcla de reacción específica para dicha bacteria a detectar e identificar, comprendiendo cada mezcla de reacción los reactivos necesarios para la amplificación enzimática de ADN e identificación de la bacteria a detectar e identificar;
- c)
- programar un aparato para el control simultáneo de múltiples amplificaciones de ácido nucleico que comprende (i) un termociclador que incluye un elemento que contiene una pluralidad de orificios en los que se introducen dichos tubos que contienen la mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN e identificación de la bacteria a detectar e identificar, (ii) una fuente de luz ópticamente acoplada a dicho termociclador y adaptada para distribuir luz sobre dicha pluralidad de orificios, y (iii) un sensor adaptado para detectar simultáneamente la luz emitida desde dicha pluralidad de orificios, con el fin de obtener un conjunto de señales;
- d)
- interpretar dichas señales; y
- e)
- determinar simultáneamente la presencia o ausencia de dicha bacteria en dicha muestra o muestras ensayadas;
caracterizado
porque
- i)
- la mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN e identificación específica de B. cereus comprende un par de iniciadores identificados como SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID. N°: 2, una sonda identificada como SEQ. ID. N°: 3 unida a un fluoróforo y una sonda identificada como SEQ. ID. N°: 4 unida a un colorante que captura la energía emitida por la activación del fluoróforo y la emite a una longitud de onda diferente; y
- ii)
- la presencia o ausencia de dicha bacteria en dicha muestra o muestras ensayadas se determina por la aparición de una curva de fusión específica de cada producto amplificado, obteniéndose dicha curva de fusión por hibridación de las sondas específicas para la identificación de dicha bacteria con el producto de amplificación obtenido en cada tubo, y, si se desea, determinar la temperatura de fusión característica de cada producto amplificado.
El método proporcionado por esta invención
permite detectar, identificar y, si se desea, cuantificar,
bacterias causantes del deterioro de alimentos, tales como B.
cereus, en una o más muestras de ensayo, mediante PCR en tiempo
real. La muestra de ensayo puede ser cualquier muestra que
contiene ADN en la que se desea conocer la posible contaminación por
dicha bacteria. En una realización particular, dicha muestra de
ensayo es una muestra de un producto alimenticio, por ejemplo, una
muestra de una materia prima utilizada en la producción de
alimentos o una muestra de un producto alimenticio procesado.
Antes de poner en contacto el ADN de las
bacterias eventualmente presentes en dicha muestra o muestras de
ensayo a analizar con la mezcla de reacción para la amplificación
enzimática de ADN, se procede a extraer la totalidad o parte del ADN
presente en las muestras de ensayo. La extracción del ADN se puede
realizar mediante métodos convencionales, incluyendo aquéllos que
no precisan una purificación del ADN extraído. En una realización
particular, la extracción del ADN se realizó utilizando la resina
Chelex 100 (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción).
Para la puesta en práctica del método de la
invención se prepara un conjunto de tubos, en el que cada tubo
contiene una mezcla de reacción específica para la bacteria a
detectar e identificar, comprendiendo cada mezcla de reacción los
reactivos necesarios para la amplificación enzimática de ADN e
identificación de la bacteria a detectar e identificar. En
general, dicha mezcla de reacción contiene los reactivos necesarios
para la realización del método de la invención, por ejemplo, agua
calidad PCR, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), un tampón adecuado
para la reacción de amplificación enzimática, una ADN polimerasa
termoestable, una sal magnésica, etc., junto con un par de
iniciadores y un par de sondas marcadas específicos para la
bacteria a ensayar.
Los iniciadores utilizados en el método de la
invención permiten amplificar una secuencia de nucleótidos diana o
fragmento específico del genoma bacteriano que se desea poner de
manifiesto. En general, puede amplificarse cualquier fragmento del
genoma bacteriano que permita la identificación de una bacteria, a
nivel de género o especie, correspondiente. La pareja de sondas
marcadas permite identificar con certeza dicho fragmento específico
del genoma bacteriano a detectar y comprenden una secuencia de
nucleótidos complementaria a una región presente en los productos
de amplificación y un marcador. En una realización particular, una
de dichas sondas está marcada con un fluoróforo que actúa como
donador de energía y la otra sonda con un colorante que captura la
energía liberada por el fluoróforo y la emite a su vez en otra
longitud de onda detectable por el sistema presente en el aparato
para la puesta en práctica del método de la invención.
En una realización particular, la mezcla de
reacción para la amplificación enzimática de ADN e identificación
específica de B. cereus comprende un par de iniciadores
identificados como SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID. N°: 2, una sonda
identificada como SEQ. ID. N°: 3 unida a un fluoróforo y una sonda
identificada como SEQ. ID. N°: 4 unida a un colorante que captura
la energía emitida por la activación del fluoróforo y la emite a
una longitud de onda diferente. Dicho par de iniciadores SEQ. ID.
N°: 1 y SEQ. ID. N°: 2 permite la amplificación de un fragmento de
284 pares de bases (pb) del gen csp F de B.
cereus.
Como fluoróforo puede utilizarse cualquier grupo
o sustancia fluorescente capaz de donar energía tras ser activado,
y como colorante puede utilizarse cualquier compuesto capaz de
capturar la energía emitida por la activación del fluoróforo y
emitirla a una longitud de onda diferente. En una realización
particular, dicho fluoróforo es fluoresceína y dicho colorante que
captura la energía emitida por la activación del fluoróforo y la
emite a una longitud de onda diferente es el colorante Red640.
Ejemplos adicionales de fluoróforos y colorantes
que pueden utilizarse para la puesta en práctica del método de la
invención se recogen en la Tabla 1.
Marcador | |
Fluoróforo | Fluoresceína |
SybrGreen | |
TAMRA | |
Colorante | LC Red 640 |
LC Red 705 | |
Fluoresceína | |
Cy5 |
El método de la invención se realiza en un
aparato para el control simultáneo de múltiples amplificaciones de
ácido nucleico que comprende (i) un termociclador que incluye un
elemento que contiene una pluralidad de orificios en los que se
introducen dichos tubos que contienen la mezcla de reacción para
la amplificación enzimática de ADN e identificación de la bacteria
a detectar e identificar, (ii) una fuente de luz ópticamente
acoplada a dicho termociclador y adaptada para distribuir luz
sobre dicha pluralidad de orificios, tal como una fuente de
radiación láser; y (iii) un sensor adaptado para detectar
simultáneamente la luz emitida desde dicha pluralidad de orificios,
con el fin de obtener un conjunto de señales, tal como un detector
de fluorescencia. Dichos aparatos son conocidos [véase, por
ejemplo, la solicitud de patente europea EP 640 828 A].
El termociclador rápido con detección a tiempo
real, en cada paso de la reacción realiza la duplicación de un
fragmento de ADN (secuencia diana presente en el genoma bacteriano
que se desea detectar) mediante el empleo de los iniciadores
correspondientes y de una polimerasa termorresistente y, a cada
uno de los dos fragmentos resultantes, se unen las sondas marcadas.
Estas sondas adheridas al fragmento de ADN emitirán energía a una
determinada longitud de onda al ser excitadas. Este proceso (unión
de los iniciadores, duplicación del fragmento de ADN, unión de las
sondas, detección energía emitida) se repite un número determinado
de veces, típicamente unas 30 veces, obteniéndose al final gran
cantidad del producto amplificado. Con todas las medidas
realizadas, se realiza un análisis estadístico que determina el
tipo de ADN amplificado, por ejemplo, mediante análisis de la
Temperatura de Hibridación (Tm) y, si se desea, se determina la
concentración del mismo.
En una realización particular, el aparato
utilizado para la puesta en práctica del método de la invención
comprende un termociclador rápido a tiempo real unido a un sistema
de detección por fluorescencia, lo que permite la monitorización en
tiempo real del proceso de amplificación tras cada ciclo, tal como
el termociclador LightCycler (Roche Biochemiclas) [véase el Ejemplo
que acompaña a esta descripción]. En este caso, el análisis del
producto final de PCR se realiza una vez terminado el proceso de
amplificación sin necesidad de ninguna manipulación. Su
integración junto con un ordenador permite diseñar los programas de
amplificación, detección y análisis de los productos.
Tras interpretar las señales obtenidas se puede
determinar la presencia o ausencia de B. cereus. En una
realización particular, la presencia o ausencia de dicha bacteria
en dicha muestra o muestras ensayadas se determina por la aparición
de una curva de fusión específica de cada producto amplificado,
obteniéndose dicha curva de fusión por hibridación de las sondas
específicas para la identificación de dicha bacteria con el producto
de amplificación obtenido en cada tubo. Adicionalmente, si se
desea, se puede determinar la temperatura de fusión característica
de cada producto amplificado así como la concentración del
mismo.
El método de la invención permite detectar,
identificar y, si se desea, cuantificar, bacterias que deterioran
alimentos, tales como B. cereus, en muestras de ensayo,
mediante PCR en tiempo real. Por tanto, dicho método se puede
aplicar al análisis microbiológico de todos los alimentos
susceptibles de ser deteriorados por dichas bacterias, permitiendo
su detección en pocas horas, generalmente en menos de 24 horas,
colaborando de este modo en garantizar la estabilidad del producto
alimenticio y acortando el tiempo de almacenamiento previo a la
comercialización del mismo.
En una realización particular, el método de la
invención se utiliza en la detección rápida (cualitativa y
cuantitativa) en alimentos del genoma de bacterias que causan
deterioro en alimentos (B. cereus). Los alimentos que pueden
ser analizados pueden ser tanto materias primas, por ejemplo,
leche, huevos, carnes, verduras, etc., como sus derivados,
alimentos procesados o no, aceites, salsas, etc., tanto en las
empresas productoras como en las distribuidoras y hostelería.
Un método para la detección e identificación de
bacterias que deterioran alimentos como el proporcionado por esta
invención presenta, entre otras, las siguientes ventajas:
\newpage
- a)
- requiere un tiempo sustancialmente inferior a los métodos habitualmente utilizados, típicamente 24 horas en comparación con los métodos convencionales que requieren entre 72 y 96 horas;
- b)
- una vez realizado el pre-enriquecimiento y la extracción del ADN, todo el proceso se lleva a cabo en el mismo tubo, evitando manipulaciones y contaminaciones externas;
- c)
- es un método cuantitativo, que no sólo detecta e identifica las bacterias eventualmente presentes en una muestra de ensayo sino que permite, además, si se desea, determinar la concentración de dichas bacterias presentes en la muestra de ensayo;
- d)
- es posible su automatización completa; y
- e)
- permite realizar la detección de varias bacterias simultáneamente.
La invención también proporciona un
oligonucleótido para la detección e identificación de bacterias
causantes de deterioro en alimentos, tales como B. cereus, en
adelante oligonucleótido de la invención, que tiene una secuencia
de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias
identificadas como SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3 y
SEQ. ID. N°: 4.
Asimismo, la invención proporciona una sonda
marcada, en adelante sonda marcada de la invención, que comprende
(i) un oligonucleótido, seleccionado del grupo formado por los
oligonucleótidos identificados como SEQ. ID. N°: 3 y SEQ. ID. N°: 4,
y (ii) un marcador, tal como un fluoróforo, por ejemplo,
fluoresceína, o un colorante capaz de capturar la energía emitida
por la activación del fluoróforo y emitirla a una longitud de onda
diferente, por ejemplo, el colorante Red640. En una realización
particular, dicha sonda marcada de la invención se selecciona del
grupo formado por:
- el
- oligonucleótido identificado como SEQ. ID. N°: 3 unido a fluoresceína,
- el
- oligonucleótido identificado como SEQ. ID. N°: 4 unido al colorante Red640, y sus mezclas.
La invención también proporciona un kit para la
detección e identificación rápida de B. cereus, en una o más
muestras de ensayo, mediante PCR en tiempo real, que comprende, al
menos, un oligonucleótido de la invención o una sonda marcada de la
invención. En una realización particular, dicho kit comprende los
oligonucleótidos identificados como SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID. N°:
2, y las sondas marcadas compuestas por el oligonucleótido SEQ. ID.
N°: 3 unido a fluoresceína y el oligonucleótido SEQ. ID. N°: 4
unido al colorante Red640.
En general, los kit de la invención contienen la
pareja de iniciadores correspondientes a la bacteria a detectar en
un tubo individualizado, al igual que la pareja de sondas marcadas
para dicha bacteria, con el fin de poder elegir entre realizar la
detección de dicha bacteria (usando solo el tubo de sus
iniciadores y el de sus sondas marcadas), o bien para la detección
de simultánea de dicha bacteria y otra bacteria que deteriora
alimentos, por ejemplo, Lactobacillus plantarum, dependiendo
de las necesidades.
Los kits proporcionados por esta invención pueden
presentarse en forma de estuche conteniendo, además de unos
recipientes con uno o más de dichos oligonucleótidos y/o sondas
marcadas mencionados previamente, unos recipientes con la totalidad
o parte del resto de reactivos necesarios para la realización del
método en cuestión, por ejemplo, agua ultrapura, dNTPs (dATP,
dCTP, dGTP y dTTP), un tampón adecuado para la reacción de
amplificación enzimática, una ADN polimerasa termoestable (por
ejemplo, ADN polimerasa Taq), una sal magnésica (por ejemplo,
cloruro magnésico), etc. Adicional y opcionalmente, los kits
proporcionados por esta invención pueden incluir unos recipientes
con ADN de B. cereus, para su empleo como controles
positivos.
El siguiente ejemplo ilustra la invención y no
debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.
El equipo diagnóstico diseñado para la detección
de B. cereus en productos alimenticios consiste en varios
tubos conteniendo cada uno de ellos los iniciadores, sondas
marcadas, ADN polimerasa termoestable, solución de MgCl_{2} y
agua bidestilada estéril, necesarios para llevar a cabo el método
de amplificación diseñado para dicho equipo. En este caso concreto,
el equipo utilizado incluye todos los componentes básicos para la
realización de la amplificación de hasta 100 muestras y controles.
El ADN control provisto está compuesto por una mezcla del ADN
extraído de cepas de laboratorio de todas las bacterias a
detectar.
La pareja de iniciadores correspondientes a la
bacteria a detectar (B. cereus) se presenta en un tubo
individualizado, al igual que la pareja de sondas marcadas para
dicha bacteria.
Para la realización del método se ha utilizado
una microcentrífuga, un termociclador LightCycler (Roche
Biochemicals), unas micropipetas y unas puntas de micropipetas con filtro.
Biochemicals), unas micropipetas y unas puntas de micropipetas con filtro.
La planificación del método se recoge en la Tabla
2. Aunque el tiempo de manipulación se ha calculado para una sola
muestra, se pueden manipular varias muestras simultáneamente sin
apenas incrementar los tiempos.
Paso | Manipulación (min) | Tiempo (min) |
Preparación mezcla de reactivos y tubos de la | 5 | 10 |
reacción. Colocación en el termociclador | ||
Reacción PCR | 20-40 | 30-50 |
Análisis de datos | 0-5 | 5-10 |
Tiempo total del ensayo | 45-60 |
El método puede realizarse siguiendo el protocolo
estándar que se describe a continuación:
- 1.
- Toma de muestra (25 g del producto) y preparación mediante pre-enriquecimiento en agua de peptona tamponada durante 20-24 horas a 37°C.
- 2.
- Extracción del ADN mediante su extracción con un método fiable, por ejemplo, usando la resina Chelex 100.
- 3.
- Amplificación y detección: Se prepara un capilar conteniendo los componentes necesarios para la reacción, ADN polimerasa termoestable, los cuatro dNTPs, MgCl_{2}, ADN extraído de la muestra, iniciadores y sondas marcadas específicos para la bacteria que se desea detectar. Adicionalmente, se prepara un tubo con el ADN control y los iniciadores y sondas de la(s) bacteria(s) a detectar.
- 4.
- Colocar los capilares preparados en el termociclador a tiempo real y programar la realización del proceso de amplificación y detección: temperatura, tiempo, número de ciclos y momento de lectura según el esquema.
- 5.
- Iniciar el programa (véase la Tabla 3).
Parámetros | Valores | ||
Ciclos | 45 | ||
Tipo | Cuantificación | ||
Segmento 1 | Segmento 2 | Segmento 3 | |
Temperatura (ºC) | 95 | 55 | 72 |
Tiempo incubación (s) | 0 | 1-10 | 10-20 |
Velocidad cambio | 20 | 20 | 20 |
Temperatura (ºC/s) | |||
Modo lectura | Ninguno | Individual | Ninguno |
Valores de lectura | F1 = 1; F2 = 10; F3 = 10 |
- 6.
- Al finalizar el programa, se analizan los resultados comenzando por el control positivo, continuando el análisis en caso de que éste fuera correcto. En caso contrario, se descarta el ensayo.
- 7.
- La presencia o ausencia de una bacteria se determina por la aparición de una curva de fusión específica entre las sondas y el amplicón de la bacteria buscada. En el capilar correspondiente a dicha bacteria, las sondas marcadas específicas se unirán sólo con el amplicón derivado de la bacteria buscada si ésta se encuentra presente y la curva de fusión que se produce al final del protocolo, tendrá una Tm concreta y única para ese mismo microorganismo. En las condiciones ensayadas, utilizando las parejas de iniciadores identificados como SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID. N°: 2 para la detección de B. cereus; y las parejas de sondas marcadas compuestas por el oligonucleótido con la SEQ. ID. N°: 3 unido a fluoresceína y el oligonucleótido con la SEQ. ID. N°: 4 unido al colorante Red640, para la detección de B. cereus, las Tm correspondientes se recogen en la Tabla 4.
Microorganismo | Iniciadores | Tm amplicón \pm SD (°C) | Tm sondas \pm SD (°C) |
B. cereus | SEQ. ID. N°: 1/ | 81,70 \pm 0,2 | 65,90 \pm 0,3 |
SEQ. ID. N°: 2 |
Se realizó este ensayo para ilustrar la eficacia
del método de la invención en el análisis de un alimento para
poner de manifiesto una posible contaminación. Concretamente, se
describe el ensayo de una muestra de arroz cocido en la que se
pretende detectar una posible contaminación con Bacillus
cereus.
Se recogen 25 g de la muestra de arroz cocido y
se disgregan en un estomacher introducidos en bolsa estéril con 225
ml de agua de peptona tamponada (pH 7,2) y el líquido sobrenadante
se incuba a 37°C en agitación durante 20 horas. Transcurridas 20
horas de incubación, para extraer el ADN eventualmente presente en
la muestra de ensayo, se extrae una alícuota de 300 \mul con una
resina Chelex 100, para lo cual, se añaden 300 \mul de una
suspensión al 10% en agua de Chelex 100, se agita vigorosamente, se
incuba durante 45 minutos a 45°C con agitación periódica de los
tubos para evitar la precipitación de la resina, se calienta a 95°C
durante 5 minutos y se centrifuga durante 5 minutos a 13.000 x g,
retirándose el sobrenadante que se utiliza en el siguiente paso
(Amplificación y detección).
El ADN extraído tal como se ha indicado
previamente se utilizará directamente para la amplificación y
detección, lo que se realiza en un tubo capilar cerrado con un
volumen total de 20 \mul. Para ello, en cada capilar se añaden los
componentes apropiados de la mezcla de amplificación en las
cantidades indicadas en la Tabla 5.
Volumen (\mul) | Concentración final | |
Light Cycler-DNA Master | 2 | 1X |
Solución de MgCl_{2} | 2,4 | 4 mM |
Iniciadores (10 \muM de cada uno) (a) | 1 + 1 | 0,5 \muM |
Sondas de hibridación (2 \muM) (b) | 1 + 1 | 0,1 \muM |
H_{2}O (PCR) | 9,6 | - |
ADN extraído | 2 | - |
Volumen total | 20 | - |
(a): SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID. N°: 2
(b): SEQ. ID. N°: 3 unido a fluoresceína y SEQ.
ID. N°: 4 unido a Red640
Una vez que se añadieron todos los componentes,
se mezclaron mediante un pulso en una microcentrífuga. A
continuación, los capilares se colocaron en el carrusel del
termociclador LightCycler (Roche Biochemicals) y fueron sometidos
al proceso de amplificación y detección, lo que requiere unos 30
minutos aproximadamente. Las condiciones para la PCR son las
siguientes:
Desnaturalización durante 10 segundos a 98°C
Protocolo de Amplificación:
Parámetros | Valores |
Ciclos | 45 |
Tipo | Cuantificación |
Segmento 1 | Segmento 2 | Segmento 3 | |
Temperatura (°C) | 95 | 55 | 72 |
Tiempo de incubación (s) | 0 | 5 | 10 |
Velocidad cambio T^{a} (°C/s) | 20 | 20 | 20 |
Modo de lectura | Ninguno | Individual | Ninguno |
Valores de lectura | F1 = 1 F2 = 10 F3 = 10 |
Tras la amplificación se aplicó un programa para
calcular la Tm, incrementando lentamente la temperatura (0,1°C/s) y
midiendo la fluorescencia de forma continua. Las condiciones
fueron las siguientes:
Parámetros | Valores |
Ciclos | 1 |
Tipo | Fusión (melting) |
Segmento 1 | Segmento 2 | Segmento 3 | |
Temperatura (°C) | 95 | 50 | 95 |
Tiempo de incubación (s) | 10 | 10 | 0 |
Velocidad cambio T^{a} (°C/s) | 20 | 20 | 0,1 |
Modo de lectura | Ninguno | Ninguno | Continuo |
Valores de lectura | F1 = 1 F2 = 10 F3 = 10 |
Finalmente se enfrió a 40°C.
Para interpretar los resultados, el software del
sistema analiza automáticamente los datos obtenidos, ofreciendo
los resultados en forma de curva de integración, permitiendo de
este modo obtener la Temperatura de Fusión (Tm) característica de
cada producto amplificado. En este caso, para la detección de
B. cereus. en las condiciones ensayadas, la Tm sondas es de
65,9°C.
Los valores de sensibilidad y especificidad
obtenidos en el termociclador LightCycler utilizando las parejas
de iniciadores seleccionadas para dicha bacteria (B. cereus)
se recogen en la Tabla 6.
Microorganismo | Iniciadores | Sensibilidad (%) | Especificidad (%) |
B. cereus | SEQ. ID. N°: 1/ | 100 | 99,1 |
SEQ. ID. N°: 2 |
Asimismo, los valores de sensibilidad y
especificidad obtenidos en el termociclador LightCycler utilizando
las parejas de sondas marcadas seleccionadas para cada bacteria se
recogen en la Tabla 7.
Microorganismo | Iniciadores | Sensibilidad (%) | Especificidad (%) |
B. cereus | SEQ. ID. N°: 3/ | 100 | 100 |
SEQ. ID. N°: 4 |
\vskip0.333000\baselineskip
<110> Universidad de Sevilla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Método para la detección e
identificación rápida de Bacillus cereus mediante la
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador BcaPF2
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagatttaaa tgagctgtaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador BcaPR
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttyttggcc ttcttctaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido BcaFL
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgcaacccc tgaggagatt taaca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido BcaLC
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctatcctc ctcggaagtt acagc
\hfill25
Claims (11)
1. Un método para la detección e identificación
rápida de Bacillus cereus, en una o más muestras de ensayo,
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo
real, que comprende:
- a)
- extraer el ADN presente en dicha muestra o muestras de ensayo;
- b)
- preparar un conjunto de tubos conteniendo cada tubo una mezcla de reacción específica para dicha bacteria a detectar e identificar, comprendiendo cada mezcla de reacción los reactivos necesarios para la amplificación enzimática de ADN e identificación de la bacteria a detectar e identificar;
- c)
- programar un aparato para el control simultáneo de múltiples amplificaciones de ácido nucleico que comprende (i) un termociclador que incluye un elemento que contiene una pluralidad de orificios en los que se introducen dichos tubos que contienen la mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN e identificación de la bacteria a detectar e identificar, (ii) una fuente de luz ópticamente acoplada a dicho termociclador y adaptada para distribuir luz sobre dicha pluralidad de orificios, y (iii) un sensor adaptado para detectar simultáneamente la luz emitida desde dicha pluralidad de orificios, con el fin de obtener un conjunto de señales;
- d)
- interpretar dichas señales; y
- e)
- determinar simultáneamente la presencia o ausencia de dicha bacteria en dicha muestra o muestras ensayadas;
caracterizado
porque
- i)
- la mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN e identificación específica de Bacillus cereus comprende un par de iniciadores identificados como SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID. N°: 2, una sonda identificada como SEQ. ID. N°: 3 unida a un fluoróforo y una sonda identificada como SEQ. ID. N°: 4 unida a un colorante que captura la energía emitida por la activación del fluoróforo y la emite a una longitud de onda diferente; y
- ii)
- la presencia o ausencia de dicha bacteria en dicha muestra o muestras ensayadas se determina por la aparición de una curva de fusión específica de cada producto amplificado, obteniéndose dicha curva de fusión por hibridación de las sondas específicas para la identificación de dicha bacteria con el producto de amplificación obtenido en cada tubo, y, si se desea, determinar la temperatura de fusión característica de cada producto amplificado.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra o muestras de ensayo es una muestra de una materia
prima utilizada en la producción de alimentos o un producto
alimenticio procesado.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho fluoróforo es fluoresceína y dicho colorante que captura la
energía emitida por la activación del fluoróforo y la emite a una
longitud de onda diferente es el colorante Red640.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha fuente de luz ópticamente acoplada a dicho termociclador y
adaptada para distribuir luz sobre dicha pluralidad de orificios es
una fuente de radiación láser.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho sensor adaptado para detectar simultáneamente la luz emitida
desde dicha pluralidad de orificios es un detector de
fluorescencia.
6. Un oligonucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias
identificadas como SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3 y
SEQ. ID. N°: 4.
7. Una sonda marcada que comprende (i) un
oligonucleótido, seleccionado del grupo formado por los
oligonucleótidos identificados como SEQ. ID. N°: 3 y SEQ. ID. N°:
4, y (ii) un marcador.
8. Sonda según la reivindicación 7, en el que
dicho marcador es un fluoróforo o un colorante capaz de capturar la
energía emitida por la activación de un fluoróforo.
9. Sonda según la reivindicación 7, seleccionada
del grupo formado por:
el oligonucleótido identificado como SEQ. ID. N°:
3 unido a fluoresceína,
el oligonucleótido identificado como SEQ. ID. N°:
4 unido al colorante Red640, y sus mezclas.
10. Un kit para la detección e identificación
rápida de Bacillus cereus, en una o más muestras de ensayo,
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo
real, que comprende, al menos, un oligonucleótido según la
reivindicación 6, o, al menos, una sonda marcada según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9.
\newpage
11. Kit según la reivindicación 10, que comprende
los oligonucleótidos identificados como SEQ. ID. N°: 1 y SEQ. ID.
N°: 2, y las sondas marcadas compuestas por el oligonucleótido con
la SEQ. ID. N°: 3 unido a fluoresceína y el oligonucleótido con la
SEQ. ID. N°: 4 unido al colorante Red640.
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US6387652B1 (en) * | 1998-04-15 | 2002-05-14 | U.S. Environmental Protection Agency | Method of identifying and quantifying specific fungi and bacteria |
EP1409738A4 (en) * | 2001-06-22 | 2005-03-30 | Marshfield Clinic | METHOD AND OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTING SALMONELLA SP., E.COLI O157: H7 AND LISTERIA MONOCYTOGENES |
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