ES2221164T3 - Sintesis y actividad de la inmunodeficiencia humana y antivirus de la hepatitis b de nucleosidos de 1,3-oxaselenolano. - Google Patents

Abstract

Se describe un procedimiento y una composición para el tratamiento de infección por VIH, infección por VHB, o proliferación celular anormal en humanos y otros animales huésped, que incluye la administración de una cantidad eficaz de un nucleósido de 1,3- oxaselenolano o una sal farmacéuticamente aceptable de éste, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Síntesis y actividad de la inmunodeficiencia humana y antivirus de la hepatitis B de nucleósidos de 1,3-oxaselenolano.

El gobierno de los Estados Unidos tiene los derechos sobre esta invención, resultantes de las ayudas a la investigación del U.S. Public Health Service Research del National Institute of Allergy and Infectious Diseases y del Department of Veterans Affairs, que aportaron parcialmente los fondos para la investigación que condujo a esta invención.

Esta invención pertenece al área de los nucleósidos sintéticos, y está específicamente dirigida a los nucleósidos de 1,3-oxaselenolano y a sus usos farmacéuticos, composiciones, y procedimiento de preparación.

En 1981, se identificó el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) como una enfermedad que ponía en peligro severamente el sistema inmunológico humano, y que casi sin excepción causaba la muerte. En 1983 se determinó que la causa etiológica del SIDA era el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

En 1985, se informó que el nucleósido sintético 3'-azido-3'-deoxitimidina (AZT) inhibía la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana. Desde entonces, numerosos nucleósidos sintéticos, entre los que se incluyen 2',3'-dideoxiinosina (DDI), 2',3'-dideoxicitidina (DDC), 2',3'-dideoxi-2',3'-didehidrotimidina (D4T), y (1S,4R)-4-[2-amino-6-ciclopropil-amino-9H-purina-9-il]-2-ciclopenteno-1-metanol succinato ("159U89"), han demostrado ser efectivos frente al VIH. En general, después de la fosforilación celular del 5'-trifosfato por las quinasas celulares, estos nucleósidos sintéticos se incorporan a una cepa en crecimiento del ADN viral, causando la terminación de la cadena debido a la ausencia del grupo 3'-hidroxil. También se puede inhibir de forma alternativa el enzima viral transcriptasa inversa o la ADN polimerasa.

El éxito de diversos nucleósidos sintéticos en la inhibición de la replicación del VIH in vivo o in vitro ha conducido a numerosos investigadores a diseñar y ensayar nucleósidos en los que se sustituye con un heteroátomo el átomo de carbono de la posición 3' del nucleósido. Norbeck y col., describen que (\pm)-1-[(2\beta, 4\beta)-2-(hicroximetil)-4-dioxolanil] timina (denominado como (\pm)-dioxolano-T) exhibe una modesta actividad frente al VIH (EC_{50} de 20 \muM en células ATH8) y no es tóxico para las células de control no infectadas a una concentración de 200 \muM. Tetrahedron Letters 30 (46), 6246, (1989). La Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 0 337 713 y Patente de los Estados Unidos Nº 5.041.449, transferida a BioChem Pharma, Inc., describe compuestos racémicos 2-sustituidos-4-sustituidos-1,3-dioxolanos que exhiben actividad antivírica. Las solicitudes PCT publicadas PCT/US91/09124 y PCT/US93/08044 describen \beta-D-1,3-dioxolanil nucleósidos purificados para el tratamiento de la infección por VIH. Las PCT describen el uso de \beta-D-1,3-dioxolanil nucleósidos purificados para el tratamiento de la infección por VBH.

La PCT/US95/11464 describe que (-)-(2S, 4S)-1-(2-hidroximetil-1,3-dioxolan-4-il) citosina es útil en el tratamiento de tumores y otras proliferaciones anormales de células.

La Patente de los Estados Unidos Nº 5.047.407 y la Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 0 382 562, ambas de BioChem Pharma, Inc., describen que numerosos compuestos racémicos de 2-sustituido-5-sustituido-1,3-oxatiolano nucleósidos, tienen actividad antiviral, y específicamente informan que la mezcla racémica de 2-hidroximetil-5-(citosina-1-il)-1,3-oxatiolano (denominada a partir de ahora como BCH-189) tiene aproximadamente la misma actividad frente al VIH que el AZT, con menor toxicidad. La Patente de los Estados Unidos Nº 5.539.116 de Liotta, y col., dirigida al enantiómero (-) del BCH-189, conocido como 3TC, se vende comercialmente en la actualidad para el tratamiento del VIH en humanos en los Estados Unidos.

Se ha descrito también que el cis-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosina-1-il)-1,3-oxatiolano ("FTC") tiene una potente actividad VIH. Schinazi y col., "Selective Inhibition of Human Immunodeficiency viruses by Racemates and Enantiomers of cis-5-Fluoro-1-[2-(Hidroxymethyl)-1,3-Oxatiolane-5-yl] Cytosine" Antimicrobial Agents and Chemoterapy, Noviembre de 1992, páginas 2423-2431. Ver también Patente de los Estados Unidos Nº 5.210.085; Patente de los Estados Unidos Nº 5.204.466, Documento WO 91/11186, y Documento WO 92/14743.

Otros virus que causan serios problemas de salud en los seres humanos es el virus de la hepatitis B (denominado a partir de ahora como "VBH"). El VBH es la segunda causa, después del tabaco, del cáncer humano. El mecanismo por el cual el VBH induce el cáncer es desconocido. Se postula que puede provocar directamente el desarrollo del tumor, o provocar indirectamente el desarrollo del tumor a través de la inflamación crónica, cirrosis, y regeneración celular asociada con la infección.

Después de dos a seis meses de periodo de incubación, en el que el huésped desconoce la infección, la infección por VBH puede provocar hepatitis aguda y daños al hígado, lo que causa dolor abdominal, ictericia y elevados niveles en sangre de ciertos enzimas. El VBH puede causar la hepatitis fulminante, una forma rápidamente progresiva y a menudo fatal de la enfermedad, en la que se destruyen secciones masivas del hígado.

Los pacientes generalmente se recuperan de la hepatitis aguda. En algunos pacientes, sin embargo, persisten altos niveles de antígeno viral en la sangre durante un periodo extenso, o indefinido, causando una infección crónica. Las infecciones crónicas pueden provocar la hepatitis persistente crónica. Los pacientes infectados con el VBH persistente crónico son más frecuentes en países en vías de desarrollo. A mediados de 1991, existían aproximadamente 225 millones de portadores crónicos de VBH sólo en Asia, y en el mundo, cerca de 300 millones de portadores. La hepatitis persistente crónica puede causar fatiga, cirrosis del hígado, y carcinoma hepatocelular, un cáncer de hígado principal.

En los países occidentales industrializados, los grupos de alto riesgo para la infección por VBH incluyen aquellos que están en contacto con portadores de VBH o sus muestras de sangre. La epidemiología del VBH es muy similar a la del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, de lo que se deduce que la infección por VBH es común entre pacientes con SIDA o complejos relacionados con SIDA. Sin embargo, el VBH es más contagioso que el VIH.

Tanto el FTC como el 3TC exhiben actividad frente al VBH. Ver Furman y col., "The Anti-Hepatitis B Virus Activities, Cytotoxicities, and Anabolic Profiles of the (-) y (+) Enantiomers of cis-5-Fluoro-1-[2-(Hydroxymetyl)-1,2-oxathiolane-5-yl]-Cytosine" Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Diciembre de 1992, páginas 2686-2692; y Cheng y col., Journal of Biological Chemistry, Volumen 267 (20), 13938-13942 (1992).

Se ha desarrollado una vacuna derivada del suero humano para inmunizar a los pacientes frente al VBH. Sin embargo, más recientemente, se han producido vacunas mediante ingeniería genética que son ampliamente usadas actualmente. Desafortunadamente, las vacunas no pueden ayudar a aquellos ya infectados con el VBH. El tratamiento diario con \alpha-interferón, una proteína producida mediante ingeniería genética, se ha demostrado también prometedora, pero esta terapia es sólo satisfactoria en un tercio de los pacientes tratados. Además, el interferón no se puede administrar oralmente.

Puesto que los 1,3-dioxalano y 1,3-oxatiolano han resultado prometedores por sus actividades antivíricas y anticancerosa, era de interés sintetizar una clase isostérica de compuestos, 1,3-oxaselenolano nucleósidos, en la investigación de nucleósidos de interés biológico. A pesar de su similaridad estructural con los nucleósidos 3'-heteroátomo sustituidos, la síntesis de los 1,3-oxaselenolano nucleósidos ha sido difícil de realizar ya que la construcción del anillo de oxaselenolano es difícil. Por esta razón, parece que no se ha informado nunca de los 1,3-oxaselenolano nucleósidos.

A la luz del hecho de que el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, complejos relacionados con el SIDA y el virus de la hepatitis B han alcanzado niveles epidémicos mundiales, y que tienen trágicos efectos sobre el paciente infectado, sigue existiendo una fuerte necesidad de proporcionar nuevos agentes farmacéuticamente efectivos para tratar estas enfermedades.

Por tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento y composición para el tratamiento de pacientes humanos infectados con VIH.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento y composición para el tratamiento de los pacientes humanos u otros huéspedes animales infectados con VBH.

Es, además, un objetivo de la invención proporcionar un procedimiento para la síntesis de 1,3-oxaselenolanil nucleósidos.

Es, además, un objetivo adicional de la invención proporcionar 1,3-oxaselenolanil nucleósidos y composiciones farmacéuticas que incluyan 1,3-oxaselenolanil nucleósidos.

Resumen de la invención

Se describe un procedimiento y composición para el tratamiento de la infección por VIH o VBH en humanos y otros huéspedes animales que incluye la administración de una cantidad efectiva de un 1,3-oxaselenolano nucleósido o una sal farmacéuticamente aceptable adecuada para lo mismo, de forma opcional en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización, el 1,3-oxaselenolano nucleósido tiene la fórmula:

1

en la que B es una base púrica o pirimidínica, y R es hidrógeno, acilo o un éster fosfato, que incluye monofosfato, difosfato, o trifosfato. En otra forma de realización, el 1,3-oxaselenolanil nucleósido se proporciona como un profármaco lipófilo o hidrófilo como se describe con más detalle a continuación. En otra forma de realización alternativa, el átomo de selenio se oxida en la molécula. Los 1,3-oxaselenoanil nucleósidos preferidos son aquellos que exhiben actividad frente al VIH o VBH a una concentración de menos de, aproximadamente, 10 micromolar, y más preferiblemente, aproximadamente 5 micromolar o menos en un ensayo in vitro, tal como el que se describe con detalle en esta aplicación. Para el tratamiento del VIH y VBH, se prefiere también que el 1,3-oxaselenolanil nucleósido exhiba una toxicidad DL_{50} en un ensayo in vitro tal como la descrita en la presente invención mayor de 50 micromolar, y más preferiblemente, aproximadamente 100 micromolar, o mayor.

El 1,3-oxaselenolano nucleósido es, preferiblemente, bien un \beta-L-nucleósido o un \beta-D-nucleósido, como un enantiómero aislado. En una forma de realización, el nucleósido es un \beta-L- ó \beta-D-nucleósido en forma sustancialmente pura, es decir, sustancialmente en ausencia del correspondiente \beta-D- o \beta-L-nucleósido.

Compuestos preferidos son 2-hidroximetil-4-(N-5'-citosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano y 2-hidroximetil-4-(N-5'-
fluorocitosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano. Se ha descubierto que los enantiómeros (-)-\beta-L- aislados de estos nucleósidos son más potentes que sus contrapartes \beta-D. Los enantiómeros (+) de estos compuestos no son tóxicos para las células CEM.

En otra forma de realización, se puede administrar el compuesto activo o su derivado o sal que puede administrarse en combinación o alternancia con otro agente antiviral, tal como otro agente anti-VIH o agente anti-VBH, como se describe con más detalle en la Sección IV. En general, durante la terapia alternante se administra una dosis efectiva en serie de cada uno de los agentes, mientras que en la terapia en combinación, se administra de forma conjunta una dosis efectiva de dos o más agentes. Las dosis dependerán de las velocidades de absorción, inactivación y excreción del fármaco, así como de otros factores conocidos por aquellos que sean expertos en la técnica. Se ha señalado que los valores de la dosis variarán con la severidad de la dolencia a aliviar. Se comprende además que, para cualquier sujeto particular, los regímenes específicos de dosificación y los calendarios se ajustarán temporalmente de acuerdo a las necesidades individuales y al juicio profesional de la persona administradora o supervisora de la administración de las composiciones.

Los compuestos se pueden usar también para tratar el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), el virus de la inmunodeficiencia felina, y el virus de la inmunodeficiencia de los simios (Wang S., Montelaro, R., Schinazi, R.R., Jagerski, B. y Mellors, J.W.: Activity of nucleoside and non nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTI) against equine infectious anemia virus (EIAV). First National Conference on Human Retroviruses and Related Infections, Washington, DC, Dec. 12-16, 1993; Sellon D.C., Equine Infectious Anemia, Vet. Clin. North Am. Equine Pract. United States, 9: 321-336, 1993; Philpott, M.S., Ebner, J.P., Hoover, E.A, Evaluation of 9-(2-phosphonylmethoxyethil) adenine therapy for feline inmunodeficiency virus using a quantitative polymerase chain reaction, Vet. Immunol. Immunopathol. 35:155166,1992.)

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una ilustración de un proceso para la preparación de un 1,3-oxaselenolanil nucleósido de acuerdo a la presente invención, tal como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 2 es una ilustración de un proceso para la preparación de \beta-D y \beta-L 1,3-oxaselenolanil nucleósidos de acuerdo con la presente invención, tal como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 3 es la estructura cristalina mediante rayos x de [2-(1'R, 2S, 5'R)-mentilo-(5-ona-1,3-oxaselenolano)]-L-carboxilato.

La Figura 4 es una ilustración de las estructuras de los enantiómeros de (+)-\beta-Se-ddC, (-)-\beta-Se-ddC, (+)-\beta-Se-FddC y (-)-\beta-Se-FddC.

Descripción detallada de la invención

Tal y como se usa en la presente invención el término "enantiómero aislado" se refiere a una composición de nucleósido que incluye al menos aproximadamente de un 95% a 100%, o más preferiblemente, sobre un 97% de un enantiómero simple de este nucleósido.

El término "forma sustancialmente pura" se refiere a una composición de nucleósido de un enantiómero que incluye no más de aproximadamente un 5% en peso del otro enantiómero, más preferiblemente no más de aproximadamente un 2%, y más preferiblemente, está presente menos de aproximadamente un 1% en peso.

El término base púrica o pirimidínica, incluye, pero no está limitado a, N^{6}-alilpurinas, N^{6}-acilpurinas, N^{6}-benzilpurina, N^{6}-halopurina, N^{6}-vinilpurina, purina N^{6}-acetilénica, N^{6}-acil purina, N^{6}-hidroxialquil purina, N^{6}.tioalquil purina, N^{2}-alquilpurinas, N^{4}-alquilpirimidinas, N^{4}-acilpirimidinas, N^{4}-benzilpurina, N^{4}-halopirimidinas, N^{4}-vinilpirimidinas, pirimidinas N^{4}-acetilénicas, N^{4} acil pirimidinas, N^{4}-hidroxialquil pirimidinas, N^{6}-tioalquil pirimidinas, timina, citosina, 6-azapirimidina, que incluye 6-azacitosina, 2- y/o 4-mercaptopirimidina, uracilo, C^{5}-alquilpirimidinas, C^{5}-benzilpirimidinas, C^{5}-halopirimidinas, C^{5}-vinilpirimidina, pirimidina C^{5}-acetilénica, C^{5}-acil pirimidina, C^{5}-hidroxialquil purina, C^{5}-amidopirimidina, C^{5}-cianopirimidina, C^{5}-nitropirimidina, C^{5}-aminopirimidina, N^{2}-alquilpurinas, N^{2}-alquil-6-tiopurinas, 5-azacitidinilo, 5-azauracililo, trazolopiridinilo. imidazolopiridinilo, pirrolopiririmidinilo, y pitrazolopirimidinilo. Pueden protegerse el oxígeno funcional y los grupos nitrógeno si se estima necesario o deseable. Los grupos protectores adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, e incluyen trimetisililo, dimetilhexilsililo, t-butildimentilsililo, y t-butildifenilsililo, tritilo, grupos alquilo, grupos acilo tales como acetilo y propionilo, metasulfonilo, y p-toluensulfonilo. Las bases preferidas incluyen citosina, 5-fluorocitosina, uracilo, timina, adenina, guanina, xantina, 2,6-diaminopurina, 6-aminopurina, y 6-cloropurina.

El término alquilo, tal como se usa en la presente invención, a no ser que se especifique otra cosa, se refiere a una cadena saturada, ramificada o cíclica, de hidrocarburo primario, secundario, o terciario, típicamente de C_{1} a C_{18}, y que de forma específica incluye, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, y 2,3-dimetilbutilo. El grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido con una o más fracciones seleccionadas entre el grupo que consiste de hidroxilo, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fofónico, fosfato, o fosfonato, bien no protegido, o protegido si se considera necesario como saben aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se muestra en Greene, y col., "Protective Groups in Organic Synthesis," John Wiley and Sons, Secod Edition, 1991, incorporado en el presente documento como referencia.

El término alquilo bajo, tal como se usa en la presente invención, a no ser que se especifique otra cosa, se refiere a un grupo alquilo saturado de cadena lineal o ramificada con C_{1} a C_{4}.

El término "protegido", tal como se usa en el presente documento, y a no ser que se indique otra cosa, se refiere a un grupo que se añade a un átomo de oxígeno, nitrógeno, o fósforo para evitar sus reacciones posteriores o con otros objetivos. Se conoce una amplia variedad de grupos protectores del oxígeno y nitrógeno para aquellos expertos en la técnica de la síntesis orgánica.

El término arilo, tal como se usa en el presente documento, y a no ser que se indique otra cosa, se refiere a fenilo, bifenilo, o naftilo, y preferiblemente fenilo. El grupo arilo se puede sustituir opcionalmente con una o más fracciones seleccionadas entre el grupo que consiste de hidroxilo, halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, amino, alquilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato, o fosfonato, bien sin proteger, o protegido si se considera necesario, como conocen aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se enseña en Greene y col., "Protective Groups in Organic Síntesis," John Wiley and Sons, Secon Edition, 1991.

El término alcarilo o alquilarilo se refiere a un grupo alquilo con un sustituyente arilo.

El término aralquilo o arilalquilo se refiere a un grupo arilo con un sustituyente alquilo.

El término halo, como se usa en el presente documento, incluye cloro, bromo, yodo, y fluoro.

El término acilo se refiere a una fracción de fórmula -C(O)R', en la que R' es alquilo, arilo, alcarilo, aralquilo, heteroaromático, alcoxialquilo que incluye metoximetilo; arialquilo que incluye benzilo; ariloxialquilo tal como fenoximetilo; arilo que incluye fenilo opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C_{1} a C_{4} o alcoxi C_{1} a C_{4}, o el residuo de un aminoácido.

Tal como se usa en el presente documento, un grupo saliente significa un grupo funcional que salta de la molécula a la que está unido bajo condiciones apropiadas.

El término aminoácido incluye aminoácidos naturales y sintéticos, e incluye pero no está limitado a, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenilalaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, sirinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminilo, aspartoilo, glutaroilo, lisinilo, argininilo, y histidinilo.

El término heteroarilo o heteroaromático, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una fracción aromática que incluye al menos un átomo de azufre, oxígeno, o nitrógeno en el anillo aromático. Ejemplos no limitantes son furilo, piridilo, pirimidilo, tienilo, isotiazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, quinolilo, isoquinolilo, benzotienilo, isobenzofurilo, pirazolilo, indolilo, isoindolilo, benzimidazolilo, purinilo, carbazolilo, oxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, 1,2,4-tiadozolilo, isooxazolilo, pirrolilo, quinazonililo, piridazinilo, pirazinilo, cinnolinilo, eftalazinilo, quinoxalanilo, xantinilo, hipoxantinilo, y pteridinilo. Se pueden proteger el oxígeno funcional y los grupos nitrógeno de la base heterocíclica, si se considera necesario o deseable. Se conocen bien los grupos protectores adecuados por aquellos expertos en la técnica, e incluyen trimetilsililo, dimetilhexilsililo, t-butildimetilsililo, y t-butildifenilsililo, tritilo o tritilo sustituido, grupos alquilo, grupos acilo tales como acetilo y propionilo, metanosulfonilo, y p-toluenosulfonilo.

El término profármaco lipófilo se refiere a un 1,3-oxaselenolanil nucleósido que contiene un sustituyente covalente que se puede eliminar de la posición 5'-hidroxilo, que vuelve el nucleósido más lipófilo que el nucleósido padre con un grupo 5'-hidroxilo.

El término profármaco hidrófilo se refiere a un 1,3-oxaselenolanil nucleósido que contiene un sustituyente covalente en la posición 5'-hidroxilo que vuelve el nucleósido más hidrófilo que el nucleósido padre con un grupo 5'-hidroxilo.

La invención, tal como se describe en el presente documento, es un procedimiento y composición para el tratamiento de la infección por VIH o VBH, y otras infecciones de virus que se replican de la misma forma, en seres humanos u otros huéspedes animales, que incluye la administración de una cantidad efectiva de un 1,3-oxaselenoanil nucleósido con un grupo 5' saliente, incluyendo un derivado acilado o fosforilado o una sal farmaceúticamente aceptable adecuada para lo mismo, opcionalmente en un vehículo farmaceúticamente aceptable. Los compuestos de esta invención poseen bien actividad antiviral, tal como anti-VIH-1, anti-VIH-2, anti-VBH, o actividad antivirus de la inmunodeficiencia de simios (anti-VIS) por sí mismos, o bien se metabolizan a un compuesto que exhibe actividad antiviral.

Los compuestos descritos o sus derivados o sales farmaceúticamente aceptables o formulaciones farmaceúticamente aceptables que contienen estos compuestos son útiles en la prevención y tratamiento de las infecciones por VIH y otras dolencias relacionadas, tales como complejos relacionados con el SIDA (ARC), linfoadenopatía generalizada persistente (PGL), dolencias neurológicas relacionadas con el SIDA, condiciones anticuerpo anti-VIH positivo y VIH-positivo, sarcoma de Kaposi, trombocitopenia purpúrea e infecciones oportunistas. De manera adicional, estos compuestos o formulaciones se pueden usar profilácticamente para evitar o retardar la progresión de la enfermedad clínica en individuos que son anticuerpo anti-VIH o VIH-antígeno positivo, o que han sido expuestos a VIH.

El compuesto o sus derivados o sales farmacéuticamente aceptables, o las formulaciones farmaceúticamente aceptables que contienen el compuesto o sus derivados o sales, son también útiles en la prevención y tratamiento de infecciones por VBH y otras dolencias relacionadas, tales como condiciones anticuerpo positivo anti-VIH y VBH-positivo, inflamación crónica del hígado causada por VBH, cirrosis, hepatitis aguda, hepatitis fulminante, hepatitis persistente crónica, y fatiga. Estos compuestos o formulaciones se pueden usar también profilácticamente para evitar o retardar la progresión de la enfermedad clínica en individuos que son anticuerpo anti-VBH o VBH antígeno positivo, o que se han expuesto a VBH.

El compuesto se puede convertir en un éster farmacéuticamente aceptable mediante reacción con agentes esterificantes apropiados, por ejemplo, un haluro de ácido o un anhídrido. El compuesto o su derivado farmacéuticamente aceptable se puede convertir en una sal farmacéuticamente aceptable adecuada para lo mismo de una manera convencional, por ejemplo, mediante tratamiento con una base apropiada. El éster o sal del compuesto se puede convertir en el compuesto padre, por ejemplo, por hidrólisis.

En resumen, la presente invención incluye las siguientes características:

(a)

1,3-oxaselenolano nucleósidos como se ha mencionado anteriormente, y derivados y sales farmacéuticamente aceptables adecuados para lo mismo ;

(b)

1,3-oxaselenolano nucleósidos, y derivados y sales farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso en terapia médica, por ejemplo para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH o VBH;

(c)

el uso de 1,3-oxaselenolano nucleósidos y derivados y sales farmacéuticamente aceptables adecuadas para lo mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por VIH o VBH;

(d)

las formulaciones farmacéuticas que comprenden 1,3-oxaselenolano nucleósidos o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable adecuado para lo mismo junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable;

(e)

los procesos para la preparación de 1,3-oxaselenolano nucleósidos; y

(f)

el uso de 1,3-oxaselenolanil nucleósidos en el tratamiento de infecciones virales mediante administración en combinación o alternancia con otro agente antiviral.

I. Compuesto activo, derivados, y sales fisiológicamente aceptables adecuados para lo mismo

Los compuestos activos descritos en el presente documento son 1,3-oxaselenolano nucleósidos, en forma racémica o como enantiómeros aislados.

El compuesto activo se puede administrar como cualquier derivado que, tras administración al paciente, sea capaz de proporcionar de manera directa o indirecta, el compuesto padre, o bien que exhiba actividad por sí mismo. Ejemplos no limitantes son las sales farmacéuticamente aceptables (denominadas alternativamente como "sales fisiológicamente aceptables") y los derivados 5' y N^{4} pirimidina o N^{6}-purina acilada o alquilada del compuesto activo (denominados alternativamente como "derivados fisiológicamente activos"). En una forma de realización, el grupo acilo es un éster de ácido carboxílico, en el que la fracción no carbonílica del grupo éster se selecciona entre una de alquilo u alquilo bajo cadena ramificada o cíclica, alcoxialquilo que incluye metoximetilo, aralquilo que incluye benzilo, ariloxialquilo tal como fenoximetilo, arilo que incluye un fenilo opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C_{1} a C_{4} alcoxi C_{1} a C_{4}, ésteres sulfonato tales como alquilo o aralquilo sulfonilo que incluye metanosulfonilo, fosfato, que incluye pero no se limita al éster mono, di o trifosfato, tritilo o monometoxitritilo, benzilo sustituido, trialquisililo (por ejemplo, dimetil-5-butilsililo) o difenilmetilsililo. Los grupos arilo de los ésteres comprenden opcionalmente un grupo fenilo.

Las modificaciones del compuesto activo, y especialmente en las posiciones N^{4} pirimidinilo o N^{6} purina y 5'-O, pueden afectar a la biodisponibilidad y velocidad del metabolismo de las especies activas, proporcionando de esta manera el control sobre la distribución de las especies activas. Además, las modificaciones pueden afectara a la actividad antiviral del compuesto, aumentando en algunos casos la actividad del compuesto padre. Esto puede evaluarse fácilmente mediante la preparación de los derivados y ensayando su actividad antiviral de acuerdo a los procedimientos descritos en el presente documento, o con otros procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica

Profármacos de nucleótido

Cualquiera de los nucleótidos descritos en el presente documento se puede administrar como profármaco de nucleótido para aumentar la actividad, biodisponibilidad, estabilidad y alterar de cualquier forma las propiedades del nucleósido. Se conocen numerosos ligandos de profármacos de nucleótido. En general, la alquilación, acilación, u otras modificaciones lipófilas del mono, di o trifosfato del nucleósido modificarán la estabilidad del nucleótido. Ejemplos de grupos de sustituyentes que pueden reemplazar uno o más hidrógenos en la fracción fosfato son alquilo, arilo, esteroides, carbohidratos, incluyendo azúcares, 1,2-diacilglicerol y alcoholes. Muchos son descritos por R. Jones y N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1-17. Cualquiera de estos se puede usar en combinación con los nucleósidos descritos para conseguir un efecto deseado.

En una forma de realización, el 1,3-oxaselenolanil se proporciona como un profármaco lipófilo de 5'-hidroxilo. Ejemplos no limitantes de las patentes de los Estados Unidos que describen sustituyentes lipófilos adecuados que pueden incorporarse de forma covalente en el nucleósido, preferiblemente en la posición 5'-OH del nucleósido o preparaciones lipófilas, incluyen las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.149.794 (22 de Septiembre de 1992, Yatvin y col.); Nº 5.194.654 (16 de Marzo de 1993, Hostetler y col.); 5.223.263 (29 de Junio de 1993, Hostetler y col.); 5.256.641 (26 de Octubre de 1993, Yatvin y col.); 5.411.947 (2 de Mayo de 1995, Hostetler y col.); 5.463.092 (31 de Octubre de 1995, Hostetler y col.); 5.543.389 (6 de Agosto de 1996, Yatvin y col.); 5.543.390 (6 de Agosto de 1996, Yatvin y col.); 5.543.391 (6 de Agosto, 1996, Yatvin y col.); y 5.554.728 (10 de Septiembre de 1996, Basava y col.) todas las cuales se incorporan en el presente documento como referencia.

Las solicitudes de patentes extranjeras que describen sustituyentes lipófilos que pueden ligarse a los 1,3-oxaselenolanil nucleósidos de la presente invención, o las preparaciones lipófilas, incluyen los Documentos WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4 y WO 91/19721.

Ejemplos adicionales no limitantes de derivados de 1,3-oxaselenolanil nucleósidos son aquellos que contienen sustituyentes como los que se describen en las siguientes publicaciones. Estos 1,3-oxaselenolanil nucleósidos derivatizados se pueden usar para las indicaciones descritas en el texto o de otra forma como agentes antivirales, que incluyen agentes anti-VIH o anti-VBH. Ho, D.H.W. (1973) Distribution of Kinase and deaminase of 1 \beta-D-arabinofuranosylcytosine in tissues of man and mouse. Cancer Res. 33, 2816-2820; Holy, A. (1993) Isopolar phosphorous-modified nucleotide analogues. In: De Clercq (ed.), Advances in Antiviral Drug Design, Vol. 1, JAl Press, pp. 179-231; Hong, C.I., Nechaev, A., and West, C.R. (1979a) Synthesis and antitumor activity of 1 \beta-3-arabinofuranosylcytosine conjugates of cortisol and cortisone. Biochem. Biophys. Rs. Commun. 88, 1223-1229; Hong, C.I., Nechaev, A., Kirisits, AJ. Buchheit, DJ. and West, C.R. 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Un profármaco de fosfato preferido es el grupo S-acil-2-tioetilo, también conocido como "SATE".

II. Preparación de los compuestos activos

Los 1,3-oxaselenolanil nucleósidos no se han producido hasta la fecha debido a las dificultades que se encuentran en la construcción del anillo de 1,3-oxaselenolano. Se proporciona ahora en la presente invención un proceso para la producción de este anillo. En la Figura 1 se ilustra una forma de realización del proceso. Se proporcionan también procesos para la preparación de \beta-D (es decir, 2S, 5R) y \beta-L 1,3-oxaselenolanil (es decir, 2R, 5S) nucleósidos aislados. En la Figura 2 se ilustra un ejemplo de este proceso. En la Figura 1 se proporciona el esquema numerado de los compuestos usados en los Ejemplos que se encuentran a continuación.

Ejemplo 1 Preparación del anillo de 1,3-oxaselenlolano

Se preparó selenocianato por el procedimiento de Kirby con un rendimiento excelente. En la primera etapa, se hizo reaccionar bromoacetato de etilo (BrCH_{2}CO_{2}Et) con acetato de selenil potasio en alcohol para formar selenocianato 2.

Con el fin de construir la lactona 5, se intentó inicialmente reducir el selenocianato 2 con NaBH_{4} e hidrolizar el éster resultante con una solución acuosa de NaOH hasta el ácido selenol acético, que se usaría para la construcción del sistema del anillo de oxaselenolano 5. Sin embargo, el ácido selenol acético se descompone durante la acidificación con HCl a pH 2. Se ha informado que los selenoles se pueden oxidar fácilmente mediante oxígeno en el aire a dímeros estables que se pueden volver a reducir a selenoles mediante H_{3}PO_{2}. Se descubrió que la reducción del bis (ácido selenoacético) así como la ciclación pueden tener lugar en un recipiente de reacción sin aislamiento de los intermedios. De esta manera, se preparó el dímero 3 con un rendimiento del 81% mediante reflujo de 1 con KSeCN en etanol durante 1 hora, seguido de reducción con NaBH_{4} a 0ºC durante 20-30 minutos. En comparación con los procedimientos informados recientemente para la preparación de diselénidos, este procedimiento tiene las ventajas de condiciones de reacción suaves, un rendimiento alto y una obtención sencilla. Se preparó entonces la lactona 5 con un rendimiento del 33% mediante hidrólisis de 3 calentando a reflujo una solución acuosa de ácido acético (50%) durante 24 horas seguida, por la reducción a ácido selenol acético con H_{3}PO_{2}, que se condensó in situ con 2-benzoiloxiacetaldehído en presencia de H_{3}PO_{2} bajo nitrógeno. Para la reducción de la lactona 5, se encontró que el DIBAL-H puede reducir selectivamente la lactona sobre el éster en THF, aunque no se observó selectividad en el tolueno. De esta manera, se preparó el acetato del azúcar 7 mediante la reducción con DIBAL-H del 5 en THF, seguida por la acetilación in situ con anhídrido acético. La condensación del acetato 7, sin purificación, con bases siladas en presencia de SnCl_{4} ó TMSOTf dio mezclas inseparables de los \alpha- y \beta-isómeros 8a y 8b. La eliminación del grupo protector benzoilo de 8a y 8b mediante metilamina o amoníaco en metanol [produce] el nucleósido final como una mezcla \alpha/\beta. Se obtuvo el nucleósido de \alpha-citosina mediante recristalización repetida de la mezcla \alpha/\beta en MeOH/ Et_{2}O y después metanol, mientras que se obtuvo el nucleósido \beta-citosina (9a) mediante separación con HPLC del licor madre (Columna-C_{18}, MeOH al 20% en H_{2}O). Se obtuvieron los nucleósidos \beta y \alpha-5-fluoro-citosina mediante separación cromatográfica en sílica gel de la mezcla \alpha/\beta. Se confirmaron las estructuras de los selenolano nucleósidos sintetizados mediante análisis elemental, RMN de ^{1}H y ^{13}C. Se determinaron las asignaciones estereoquímicas en función de los experimentos 2D-NOESY en los que se observo una correlación entre el 2'-H y el 5'-H del \beta-isómero 9b mientras que se señaló el \alpha-isómero 10b en ausencia de esta correlación. Se confirmó también la asignación de la estereoquímica mediante los desplazamientos químicos del 2'-H en 9a y 9b en comparación con los de 10a y 10b debido a la rotura mediante las bases heterocíclicas.

Estereoquímica

Puesto que los carbonos 1' y 4' de la fracción 1,3-oxanoslenolanilo del nucleósido son quirales, sus sustituyentes no hidrogenados (la base púrica o pirimidínica y los grupos CHOR, respectivamente) pueden ser bien cis (en el mismo lado) o trans (en lados opuestos) con respecto al sistema del anillo del azúcar. Por tanto, los cuatro isómeros ópticos se representan por las configuraciones siguientes (cuando la fracción del azúcar se orienta en un plano horizontal de tal manera que el átomo de oxígeno quede en la parte de atrás: cis (con ambos grupos "por encima", que corresponden a la configuración de los nucleósidos que se producen naturalmente), cis (con ambos grupos "por debajo", que es una configuración que se produce de manera no natural), trans (con el sustituyente C2' "por encima" y el sustituyente C4' "por debajo"), y trans (con el sustituyente C2' "por debajo" y el sustituyente C4' "por encima"). Los "D-nucleósidos" son cis nucleósidos con una configuración natural, mientras que los L-nucleósidos son cis nucleósidos en la configuración que no se produce de forma natural.

Se obtuvieron los enantiómeros del 1,3-oxaselenolanil nucleósido de dos formas; mediante cromatografía quiral del nucleósido como se describe en el Ejemplo 2, y mediante cristalización fraccionada de los L-mentol diastereómeros de 1,3-oxaselenolano, seguida por condensación del 1,3-oxaselenolanil resuelto con la base deseada en presencia de un ácido de Lewis que no racemiza el anillo de oxaselenolano.

Ejemplo 2 Resolución de los \beta-D y \beta-L enantiómeros del 2-hidroximetil-4-(n-5'-citosina-1'-il) 1,3-oxaselenolano y del 2-hidroximetil-4-(n-5'-fluorocitosina 1'-il) 1,3-oxaselenolano por cromatografía quiral

Se resolvieron el 2-hidroximetil-4-(N-5'-citosina-1'-1l) 1,3-oxaselenolano y el 2-hidroximetil-4-(N-5'-fluorocitosina-1'-il) 1,3-oxaselenolano mediante cromatografía quiral. Se disolvió el compuesto (racémico, circa 2 mg) en una cantidad mínima (circa 400 \muL) de metanol (calidad HPLC). Se usaron las siguientes condiciones para la resolución: sistema HPLC Waters; Columna: Chiralpak AS 4,6 x 250 mm; Fase móvil: 2-propanol, Caudal: 0,80 mL/min; Detector: UV-260 nm; Sparge gas; Helio; Sparge velocidad: 25 mL/ min/depósito de disolvente; Cantidad inyectada: 20 \muL de la solución cada vez; Tiempos de retención; (-)-(2S, 5R)-\beta-L-2', 3'-dideoxi-3'-seleno-citidina, 5,50 min; (+)-(2R, 5S)-\beta-D-2',3'-dideoxi-3'-seleno-citidina, 6,92 min; (-)-(2S, 5R)-\beta-L-2', 3'-dideoxi-5-fluoro-3'-seleno-citidina, 5,97 min; (+)-(2R, 5S)-\beta-D-2'.3'-dideoxi-5-fluoro-3'-seleno-citidina, 9,62 min. Las purezas ópticas de los compuestos resueltos fueron > 95% ee.

Ejemplo 3 Resolución de los intermedios de \beta-D y \beta-L enantiómeros de 1,3-oxaselenolanilo por conversión de los diasterómeros seguida por separación de los diasterómeros mediante cristalización fraccionada

(-)-L-Mentolcarboxial. Se añadió p-TsOH (5 g) a una mezcla de (-)-L-mentol (30 g, 0,2 mol) y ácido gluoxílico (36,8 g, 0,4 mol) en tolueno (1.000 ml) y se agitó la mezcla de reacción a 100ºC durante 3 horas. Cuando la reacción finalizó se neutralizó el p-TsOH con Et_{3}N y se evaporó hasta sequedad. Se disolvió el residuo en CHCl_{3} (500 ml), se lavó con agua (3 x 500 ml), se recogió la capa orgánica, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. Se cristalizó el aceite procedente del petróleo bien para dar 20 g (50%) de (-)-L-mentolcarboxial en forma de cristales blancos: pf 82ºC; RMN ^{1}H (CHCl_{3}) \delta 9,40 (s, IR, CHO), 4,78 (dt, J = 4,45, 11 Hz, 1H, 1-H), 0,75-2,03 (m, 19H); RMN ^{1}C (CHCl_{3}) \delta 184,41, 170,22, 87,13, 46,79, 40,40, 34,00, 31,42, 26,11, 23,28, 21,94, 20,68, 16,15, análisis calculado para el C_{12}H_{20}O: C, 67,89; H, 9,50; Encontrado: C, 67,65; H, 9,67, M/S m/e 212,3 (M+),

[2-(1'R, 2'S, 5'R)-Mentil (5-ona-1,3-oxalselenolano)]-L-carboxilato (11) y [2-(1'R, 2'S, 5'R)-Mentil-(5-ona-1,3-oxaselenolano)]-D-carboxilato

Se añadió a una solución de (-)-L-mentolcarboxial (6,4 g, 30 mmol) en tolueno (100 ml) (SeCH_{2}COOH)_{2} (4,15 g, 15 mmol) y se calentó suavemente la mezcla de reacción a 100ºC en una atmósfera de argón con agitación. Se añadió gota a gota ácido hipofosforoso (solución al 50% en agua, 2,7 ml) durante una hora. A continuación la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante una hora con agitación vigorosa en atmósfera de argón. Se evaporó la mezcla de reacción hasta 20 ml, se diluyó con EtOAc (250 ml), y se lavó con agua (3 x 500 ml). Se recogió la capa orgánica, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre SiO_{2} usando la mezcla EtOAc-Hex (1:10, V/V) como eluyente, para dar 11 en forma de 3,9 g de sólido (77,6%). La cristalización a temperatura ambiente de los compuestos de la mezcla realizada en hexanos dio 11 como finas agujas incoloras; pf 106,5ºC; [\alpha]^{25}_{D} = 59,86º (c 0,5, CHC_{13}); RMN ^{1}H (CHCl_{3}) \delta 5,83 (s, 1H, 2'-H), 4,77 (dt, J = 4,45, 12 Hz, 1H, 1-H), 3,97 (d, J = 15,34 Hz, 1H, 4'-H_{b}), 3,67 (dt, J = 15,35 Hz, ^{4}J=21,17 Hz, 1H, 4'-H_{a}), 0,75-2,03 (m, 19H); RMN ^{13}c (CHCl_{3}) \delta 173,97, 168,67, 76,88, 63,84, 47,07, 40,46, 34,02, 31,38, 26,07, 23,23, 22,65, 21,93, 20,71, 16,11, análisis calculado para el C_{14}H_{22}O_{4}Se: C, 50,45; H, 6,65; encontrado: C, 50,65; H, 6,62 MS m/e 333 (M+), Líquido madre de cristalización a -5ºC; [\alpha]^{25}_{D} = -111,71º (c 0,5, CHC13); RMN ^{1}H (CHCl_{3}) \delta 5,83 (s, 1H, 2'-H), 4,78 (dt, J = 4,45, 12 Hz, 1H, 1-H), 3,95 (d, J = 15,41 Hz, IH, 4'-H_{a}), 3,68 (dt, J = 15,45 Hz, ^{4}J = 19,35 Hz, IH, 4'-H_{a}), 0,75-2,03 (m, 19H); RMN ^{13}C (CHCl_{3}) \delta 173,98, 168,63, 76,15, 63,76, 46,95, 39,88, 34,01, 31,32, 26,22, 23,24, 22,98, 21,94, 20,74, 16,14; análisis calculado para el C_{14}H_{22}O_{4}Se: C, 50,45; H, 6,65; encontrado: C, 50,47; H, 6,63 MIS m/e 333 (M+),

1-\beta-L-(2'-Hidroximetil-1,3'-oxaselenolano-5'-il)-5-fluorocitosina (15) y 1-\alpha-L-(2'-hidroximetil-1',3'-oxaselenolano-5'-il)-5-fluorocitosina (16)

Se añadió gota a gota a una solución de tri-tert-butoxialuminohidruro de litio (6 mmol, 6 ml de solución 1M en THF) de la solución de lactona 11 (1g, 3,33 mmol) en 5ml de THF a 10ºC durante una hora, con agitación en atmósfera de argón. A continuación se añadió lentamente anhídrido acético (2 g, 20 mmol) con agitación a -5 - 0ºC. La mezcla de reacción se agitó de manera adicional durante una hora, se diluyó con EtOAc (100 ml), se lavó con agua (3 x 100 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}), y se concentró hasta sequedad para dar 5'-acetato 13 impuro. Se disolvió el acetato de azúcar 13 en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y se añadió lentamente a la fluorocitosina-5 sililada preparada por agitación de la mezcla (0,34 g, 2,63 mmol), 2,4,6-collidina (0,8 ml 6,61 mmol) y tert-butildimetilsililo trifluorometanosulfonato (1,32 g, 5,08 mmol) durante una hora en atmósfera de argón. A la mezcla resultante se añadió iodotrimetilsilano (0,35 g, 1,75 mmol) agitado a temperatura ambiente durante 18 horas, se diluyó con CHCl_{3} (100 ml), se purificó en una solución acuosa de Na_{2}S_{2}O_{3} (100 ml), se lavó con agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró hasta sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía súbita sobre sílica gel usando CHCl_{3} como eluyente para dar el compuesto 13 impuro como un sólido (0,15 g, 11,2%). RMN ^{1}H (CHCl_{3}) \delta 8,35 (d, J = 6,3 Hz, 1H, 6-H), 7,55, 7,53 (2xbr s, 2H, NH_{2}), 6,45 (m, 1-h, 2'-H), 6,14 (m, 1H, 2'-H), 4,79 (m, 1H, 1-H), 3,66 (m, 2H, 6'-H_{ab})'. [Se mantuvo] una solución del compuesto 14 (0,15 g, 0,33 mmol) en THF (10 ml) a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante una hora. La mezcla de reacción se agitó de manera adicional durante 1 hora, se detuvo bruscamente con MeOH (5 ml) y se aplicó la mezcla resultante a una columna corta de sílica gel. Se eluyó la columna con la mezcla de EtOAc-Hex-MeOH (1:1:1, V/V, 100 ml). Se concentró el eluyente hasta sequedad, dando como resultado un sólido purificado sobre SiO_{2} usando CHCl_{3}-EtOH (20:1, V/V) como eluyente para dar la mezcla de 0,033 g (34%) de \beta-L-(15) y \alpha-L-nucleósidos (16) en forma de sólido blanco. Se volvió a separar la mezcla mediante columna sobre SiO_{2} usando como eluyente una mezcla de cuatro solventes EtOAc-Hex-CHCl_{3}-EtOH (5:5:2:1, V/V).

1-\beta-L-(2'-Hidroximetil-1,3'-oxaselenolano-5'-il)-fluorocitosina (15)

Sólido blanco (0,01 g, 10,2%); pf 186 - 189ºC (MeOh); [\alpha]^{25}_{D} = -55,69º (c 0,35, MEOH); UV (H_{2})) \lambda_{max} 280,0 nm (\varepsilon 10.646, pH 2), 280,0 nm (\varepsilon 7.764, pH 11); RMN ^{1}H (DMSO-d_{5}) \delta 8,07 (d, J = 7,1 Hz, 1H, 6-H), 7,92, 7,67 (2xbr s, 2H, NH_{2}, D_{2}O intercambiable), 6,06 (t, J = 2,96 Hz, 1-H, 5'-H), 5,42,(t, J = 4,82 Hz, 1H, 2'-H), 5,34 (t, J = 5,68 Hz, 1R, OH, D_{2}O intercambiable), 3,81 (m, 1H, 6'-H_{a}), 3,68 (m, 1H, 6'-H_{b}), 3,39 (dd, J = 4,84 Hz, 1H, 4'-H_{b}), 3,08 (dd, J = 8,11 Hz, 1H, 4'-H_{a}); RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 157,7 (C=O), 153,3 (4-C), 137,6 (6-C), 135,2 (5'-C), 88,3 (5'-C), 78,2 (2'-C), 64,0 (6'-C), 28,9 (4'-C); análisis calculado para el C_{8}H_{10}O_{3}N_{3}FSe: C, 32,67, H, 3,43, N, 14,29; encontrado: C, 32,62; H, 3,51, N, 14,41; M/S m/e 295 (M+),

1-\alpha-L(2'-Hidroximetil-1',3'-oxaselenolano-5'-il)-5-fluorocitosina (16)

Sólido blanco (0,013 g, 13,2%); pf 193 - 195ºC (MeOR); [[\alpha]^{25}_{D} = +84,20º (c 0,26, MeOH); UV (H_{2}O) \lambda_{max} 279,5 nm (\varepsilon 7.638, pH 7), 287,5 nm (\varepsilon 9.015, pH 2), 281,0 nm (\varepsilon 6.929, pH 11); RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,91 (d, J = 7,1 Hz, 1H, 6-H), 7,88, 7,63 (2xbr s, 2H, NH_{2}, D_{2}O, intercambiable), 6,35 (t, J = 4,95 Hz, 1-H, 5'-H), 5,63 (dd, J = 4,83 Hz, 1H, 2'-H), 5,28 (t, J = 5,67 Hz, 1H, OH, D_{2}O intercambiable), 3,70 (m, 1H, 6'-H_{a}), 3,53 (m, IR, 6'-H_{b}), 3,47 (dd, J = 4,82 Hz, 1H, 4'-H_{a}), 3,24 (dd, J = 7,88 Hz, 1H, 4'-H_{b}); RMN ^{13}C (DMSO- d_{6}) \delta 157,8 (C=O), 153,2 (4-C), 137,3 (6-C), 134,9 (5-C), 88,6 (5'-C), 80,9 (2'-C), 65,5 (6'-C), 29,4 (4'-C); análisis calculado para el C_{8}H_{10}O_{3}N_{3}FSe: C, 32,67, H, 3,43, N, 14,29; encontrado: C, 32,59; H, 3,49, N, 14,20; M/S m/e 295 (M+), La síntesis de los nucleósidos 8 y 9 se ha llevado a cabo de la misma forma que la lactona 3 (1 g, 3,33 mmol) para dar 1-\beta-D-(2'-hidroximetil-1',3'-oxaselenolano-5'-il)-5-fluorocitosina 8. Sólido blanco (0,007 g, 8,5%); pf 186-189ºC (MeOH); [\alpha]^{25}_{D} = +56,21º (c 0,33, MeOR); UV (H_{2}O) \lambda_{max}: 280,0 nm (\varepsilon 8.576, pH 7), 289,0 nm (\varepsilon 10.456, pH 2), 280,0 nm (\varepsilon 7.795, pH 11): RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 8,07 (d, J = 7,1 Hz, 1H, 6-H), 7,92, 7,67 (2xbr s, 2H, NH_{2}, D_{2}O intercambiable), 6,06 (5, J = 2,96 Hz, 1-H, 5'-H), 5,42 (5, J = 4,82 Hz, 1-H, 2'-H), 5,34 (5, J = 5,68 Hz, 1H, OH, D_{2}O intercambiable), 3,81 (m, 1H, 6'-H_{a}), 3,68 (m, 1H, 6'-H_{b}), 3,39 (dd, J = 4,84 Hz, 1H, 4'-H_{b}), 3,08 (dd, J = 8,11 Hz, 1H, 4'-H_{a}); RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 157,7 (C=O), 153,3 (4-C), 137,6 (6-C), 135,2 (S-C), 88,3 (5'-C), 78,2 (2'-C), 64,0 (6'-C), 28,9 (4'-C); análisis calculado para el: C_{8}H_{10}O_{3}N_{3}FSe: C, 32,67, H, 3,43, N, 14,29; encontrado: C, 32,57; H, 3,39, N, 14,35; M/S m/e 295 (M+).

1-\alpha-D(2'-Hidroximetil-1',3'-oxaselenolano-5'-il)-5-fluorocitosina 9

Sólido blanco (0,01 g, 10%); mp 193 - 195ºC (MeOH); [\alpha]^{25}_{D} = -85,49º (c 0,3 1, MeOH); UV (H_{2}O) \lambda_{max} 279,5 nm (\varepsilon 7.644, pH 7), 287,5 nm (\varepsilon 9.067, pH 2), 281,0 nm (\varepsilon 6.983, pH 11); RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,91 (d, J = 7,I Hz, 1H, 6-H), 7,88, 7,63 (2xbr s, SH, NH_{2}, D_{2}O intercambiable), 6,35 (5, J = 4,95 Hz, 1-H, 5'-H), 5,63 (dd, J = 4,83 Hz, 1H, 2'-H), 5,28 (5, J = 5,67 Hz, 1H, OH, D_{2}O intercambiable), 3,70 (m, 1H, 6'-H_{a}); RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 157,8 (C=O), 153,2 (4-C), 137,3 (6-C), 134,9 (5-C), 88,6 (5'-C), 80,9 (2'-C), 65,5 (6'-C), 29,4 (4'-C); análisis calculado para el C_{8}H_{10}O_{3}N_{3}FSe: C, 32,67, H, 3,43, N, 14,29; encontrado: C, 32,67; H, 3,48; N, 14,47; M/S m/e 295 (M+),

La Tabla 1 proporciona los resultados de la separación de los (+)-\beta-Se-FddC, (-)-\beta-Se-FddC, (+)-\alpha-Se-FddC, (-)-\alpha-Se-FddC y (-)-\beta-Se-ddC y compara los tiempos de retención y las longitudes de onda de absorción de estos compuestos con (-)-\beta-FTC y (+)-\beta-FTC.

TABLA 1 Resultados de la separación

2

La Tabla 2 proporciona los factores de resolución y separación de los compuestos separados sobre ChiralPak AS. El factor de separación se define como el tiempo de retención del segundo isómero eluido menos el tiempo muerto por la diferencia entre el tiempo de retención del primer isómero eluido y el tiempo muerto. El factor de resolución se define como dos veces la diferencia del tiempo de retención de los isómeros (+) y (-) por el ancho de banda de los dos picos.

TABLA 2 Comparación de las separaciones sobre ChiralPak As. Condiciones cromatográficas: fase móvil; 2-propanol; se inyectaron, 100 \mug en 10 \mul de metanol; detección UV a 254 nm; Caudal en ml/min

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}  Factor de separación (tiempo de retención del segundo
isómero eluido    -    tiempo muerto) / (tiempo
de\cr  retención del primer isómero eluido - tiempo muerto).\cr 
 ^{b}  factor de resolución = 2 x [ diferencia del tiempo de
retención de los  isómeros (+) y (-)] / (el ancho de\cr  banda de
dos
picos).\cr}

La Tabla 3 proporciona los efectos de distintas relaciones de solventes y el caudal de separación quiral del \beta-Se-ddC racémico.

TABLA 3 Los efectos de distintas relaciones de solventes y el caudal de separación quiral del \beta-Se-ddC racémico

4

Se pueden preparar derivados de mono, di y trifosfato de los nucleósidos activos como se describe de acuerdo con los procedimientos publicados. El monofosfato se puede preparar de acuerdo al procedimiento de Imai, y col., J. Org. Chem., 34(6), 1547-1550 (Junio de 1969). El difosfato se puede preparar de acuerdo al procedimiento de Davisson y col., J. Org. Chem., 52(9), 1794-1801 (1987). El trifosfato se puede preparar de acuerdo al procedimiento de Orad y col., J. Am. Chem. Soc., 87(8), 1785-1788 (1965).

III. Terapias de combinación y alternantes

Se ha reconocido que pueden emerger variantes de VIH y VBH resistentes a los fármacos después del tratamiento prolongado con un agente antiviral. La resistencia más típica a los fármacos se produce por mutación de un gen que codifica un enzima en el ciclo de vida viral, y más típicamente en el caso del VIH, la transcriptasa inversa, proteasa, o DNA polimerasa, y en el caso del VBH, la DNA polimerasa. Recientemente se ha demostrado que la eficacia de un fármaco frente a la infección del VIH se puede prolongar, aumentar, o restaurar mediante la administración del compuesto en combinación o alternancia con un segundo, y quizás un tercer compuesto antiviral que induce una mutación diferente de la causada por el fármaco principal. De manera alternativa, la farmacocinética, biodistribución, u otros parámetros del fármaco se puede alterar mediante tal terapia de combinación o alternancia. En general, se prefiere típicamente la terapia de combinación sobre la terapia alternante debido a que ésta induce estrés simultáneo múltiple sobre el virus.

El segundo agente antiviral para el tratamiento del VIH en una forma de realización puede ser un inhibidor de la transcriptrasa inversa (un "RTI") que puede ser bien un nucleósido sintético (``un "NRTI") o un compuesto no nucleósido (un "NNRTI"). En una forma de realización alternativa, en el caso del VIH, el segundo (o tercer) agente antiviral puede ser un inhibidor de la proteasa. En otras formas de realizació n, el segundo (o tercer) compuesto puede ser un análogo del pirofosfato, o un inhibidor de la función enlazante. Se encuentra una lista recopilando los datos de resistencia in vitro e in vivo para numerosos compuestos antivirales en Scinazi y col., "Mutations in retroviral genes associated with drug resistance," International Antiviral News, Volumen 1 (4), International Medical Press,
1996.

Los compuestos preferidos para la terapia de combinación o alternante para el tratamiento del VBH incluyen el FTC (el (-)-enantiómero o el racemato), L-FMAU, interferón, \beta-D-dioxolanil-guanina (DXG), \beta-D-dioxolanil-2,6-diaminopurina (DAPD), y \beta-d-dioxolanil-6-cloropurina (ACP), famciclovir, penciclovir, BMS-200475, PMEA bienlazado, (adefovir, dipivoxil); lobucavir, ganciclovir, y ribavarin.

Los ejemplos preferidos de agentes antivirales que se pueden usar en combinación o alternancia con los compuestos descritos en el presente documento para la terapia del VIH incluyen 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosina-1-il)-1,3-oxatiolano (FTC); el (-)-enantiómero de 2-hidroximetil-5-(citosina 1-il)-1,3-oxatiolano (3TC); carbovir, aciclovir, interferón, AZT, DDI, DDC, D4T, CS-92 (3'-azido-2',3-dideoxi-5-metil-citidina), y \beta-D-dioxolano nucleósidos tal como \beta-D-dioxolanil-guanina (DXG), \beta-dioxolanil-6-cloropurina (ACP), y MKC-442 (6-benzil-1-(etoximetil)-5-isopropil uracilo.

Los inhibidores de la proteasa preferidos incluyen crixovan (Merck), nelfinavir (Agouron9, ritonavir (Abbot), saquinavir (Roche), y DMP-450 (DuPont Merck).

Entre los ejemplos no limitantes de compuestos que pueden administrarse combinados o de forma alterna con cualquiera de los 1,3-oxaselenolenil nucleósido se incluyen (1S,4R)-4-[2-amino-6-ciclopropil-amino)-9H-purín-9-il)-2-ciclopentano-1-metanol succinato ("1592", un análogo del carbovir; de Glaxo Wellcome); 3TC: (-)-\beta-L-2',3'-dideoxi-3'-tiacitidina (de Glaxo Wellcome); a-APA R18893: -nitro-anilino-fenilacetamida; A-77003; un inhibidor de la proteasa C2 basado en la simetría (de Abbott); A-75925: un inhibidor de la proteasa C2 basado en la simetría (de Abbott); AAP-FAP: un análogo de la bisheteroarilpiperazina (de Ubjohn); ABT-538: un inhibidor de la proteasa C2 basado en la simetría (de Abbott); AzddU: 3'-azido-2',3'-dideoxiuridina; AZT: 3'-azido-3'-deoxitimidina (de Glaxo Wellcome); AZT-p-ddl: ácido 3'-azido-3'-deoxitimidilil-(5''5')-2',3-'dideoxiinosínico (de Ivax): BHAP bisheteroaril piperazina; BILA 1906: N-{1S-{{{3-[2S-{(1,1-dimetiletil) amino] carbonil}-4R-] 3-piridinilmetil) tio]-1-piperidinil]-2R-hidroxi-1S-(fenilmetil)-propil] amino) carbonil]-2-metilpropil}-2-quinolincarboxamida (de Bio Mega/ Boehringer-Ingelheim); BILA 2185: N-(1-dimetiletil)-1-[2S-[[2-2,6-dimetifenoxi)-1-oxoetil] anilino] 2-R-hidroxi-4-fenilbutil] 4R-piridiniltio-2-piperidinacarboxamida (de Bio Mega / Boehringer Ingelheim); BM+51.0836: derivado de la tiazolo-isoindolinona; BMS 186,318: derivado de aminodiol del inhibidor de la proteasa de VIH-l (de Bristo-Miers-Squibb); d4AP1: 9-[2,5-dihidro-5-(fosfonometoxi)-2-furano] adenina] (de Gilead); d4C: 2',3'-didehidro-2',3'-dideoxicitidina; d4T: 2',3'-didehidro-3'-deoxitimidina (de Bristol-Miers-Squibb); ddC; 2',3'-dideoxicitidina (Roche); ddl: 2',3'-dideoxiinosina (de Bristol-Miers-Squibb); DMB-266: 1 1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona; DMB-450: bismesilato de [4R-( 4-a,5-a,6-b, 7-b)]-hexahidro-5,6-bis(hidroxi)-1,3-bis(3-amino) fenil] metil)-4, 7-bis(fenilmetil)-2H-l,3-diazibin-2-ona} (de Avid); DXG: (-)-B-D-dioxolano-guanosina (de Triangle); EBU-dM: 5-etil-1-etoximetil-6-(3,5-dimetilbenzil) uracilo; E-EBU: 5-etil-l-etoximetil-6-benziluracilo; DS: dextrano sulfato; E-EPSeU: 1-(etoximetil)-(6-fenilselenil)-5-etiluracilo; E-EPU: 1-(etoximetil)-(6-fenil-tio)-5-etiluracilo; FTC: \beta-2',3'-dideoxi-5-fluoro-3'-tiacitidina (de Triangle); HBY097: S-4-isopropoxicarbonil-6-metoxi-3-(metiltio-metil)-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-tiona; HEPT: 1-[2-hidroxietoxi)metil] 6-(feniltio) timina; virus de la inmunodeficiencia humana VIH-1: tipo 1; JM2763: 1,1'-(1,3-propanedil)-bis-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (de Johnson Mattei); JM3100: 1,1'-[1,4-fenilenbis-(metileno)]-bis-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (de Johnson Mattei); KNI-272: ácido (2S,3S)-3-amino-2-hidroxi-4-fenilbutírico conteniendo tripéptido; L-697.593; 5-etil-6-metil-3-(2-ftalimido-etil)piridina-2(1H)-ona; L-735.524: hidroxi-aminopentano amida, inhibidor de la proteasa del VIH-I (de Merck); L-697.661: 3-{[(4,7-dicloro-1,3-benzoxazol-2-il)metil]amino}-5-etil-6-metil piridina- 2(1H)-ona; L-FDDC: (0)-\betaL-5-fluoro-2',3'-dideoxicitidina; L-FDOC: (-)-\beta-L-5-fluoro-dioxolano citosina; MKC-442: 6-benzil-l-etoximetil-5-isopropil uracilo (1-EBU: de Triangle/ Mitsubishi); Nevirabine: 11-ciclopropil-5,1-dihidro-4-metil-6H-dipiridol [3,2-b : 2',3'-e]diazepin-6-ona (de Boehringer Ingelheim); NSC648400: 1-benziloximetil-5-etil-6-(alfa-piridiltio)uracilo (E-BPTU); B9941: [2-piridilacetil-IlePheAla-y (CHOH)]2 (de Dupont Merck); PFA: fosfonoformiato (foscanlet; de Astra); PMEA: 9-(2-fosfonilmetoxietil)adenina (de Gilead); PMBA: (R)-9-(2-fosfonilmetoxipropil)adenina (de Gilead); Ro 31-8959: derivado de hidroxietilamina del inhibidor de la proteasa del VIH-1 (de Roche); RBI-312: inhibidor de la peptidil proteasa, 1-[(3S)-3-(n-alfa-benziloxicarbonil)-1-asparginil)-amino-2-hidroxi-4-fenilbutiril]-n-tert-butil-1-bromoanilina; 2720: 6-cloro-3,3-dimetil-4-(isopropeniloxicarbonil)-3,4-dihidro-quinoxalina-2(1H) tiona; SC-52151: inhibidor de la proteasa de la hidroxietilurea isostera (de Searle); SC-55389A: inhibidor de la proteasa de la hidroxietilurea isostera (de Searle); TIBO R82150: (+)-(5S)-4,5,6, 7-tetrahidro-5-metil-6-(3-metil-2-butenil) imidazo [4,5,1-jk] [1,4]-benzodiazepin-2(1H)-tiona (de Janssen); TSAO 82913: (+)-(5S)-4,5,6,7-tetrahidro-9-cloro-5-metil-1-6-(3-metil-2-butenil) imidazo-[4,5,1-jk]-[1,4] benzo-diazepin-2(1H)-tiona (de Janssen); TSAO-m3T: [2',5'-bis-O-(tert-butildimetilsilil)-3'-spiro-5'-(4'-amino-l',2'-oxatiol-2',2'-dióxido))-b-D-bentofuranosil-N3-metiltimina; V90152: 1-[3-[l-metiletil)-amino]-2-piridinil]-4-[[5-[(metilsulfonil)-amino]-1H-indol-2il]carbonil] piperazina; DC: derivados de la tiocarboxanilida (de Uniroyal); VC-781 = N-[4-cloro-3-(3-metil-2-buteniloxi)fenil]-2-metil-3-furanocarbotioamida; UC-82 =N-[4-cloro-3-(3-meti1-2-buteniloxi)fenil)-2-metil-3-tiofenocarbotioamida; VB 11.328: inhibidor de la proteasa de la hidroxietil sulfonamida (de Vertex); VS-478: inhibidor de la proteasa de la hidroxietil sulfonamida (de Vertex); XM 323: inhibidor de la proteasa de la urea cíclica (de Dupont Merck).

IV. Capacidad de los 1,3-oxaselenolanil nucleósidos para inhibir la replicación del VIH y el VBH

Se puede medir la capacidad de los nucleósidos para inhibir el VIH mediante diversas técnicas experimentales. La técnica usada en el presente documento, y descrita en detalle a continuación, mide la inhibición de la replicación viral en la fitohemaglutinina estimulada humana (PHA) de células sanguíneas mononucleares periféricas (PBM) infectadas con VIH-1 (cepa LAV). La cantidad de virus producida se determina midiendo el virus codificado por el enzima transcriptasa inversa. La cantidad de enzima producido es proporcional a la cantidad de virus producida.

Ejemplo 4 Actividad anti-VIH de los 1,3-oxaselenolanil nucleósidos

Se ensayaron el 2-hidroximetil-4(N-5'-citosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano y el 2-hidroximetil-4-(N-5'-fluorocitosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano para la actividad anti-VIH.

Se infectaron células PBM fitohemaglutinina estimuladas de tres días de antigüedad (10^{6} células/ml) procedentes de donantes sanos seronegativos frente a la hepatitis B y VIH-1 con VIH-1 (cepa LAV) a una concentración de aproximadamente 100 veces la dosis que provoca el 50% de infecciones en el tejido de cultivo (TICD 50) por ml, y se cultivaron en presencia y ausencia de diversas concentraciones de compuestos antivirales.

Aproximadamente una hora después de la infección, se añadió a los matraces (5 ml; volumen final 10 ml) el medio, con el compuesto a ensayar (2 veces la concentración final en el medio), o sin compuesto. Se usó AZT como un control positivo.

Se expusieron las células al virus (aproximadamente 2 x 10^{5} dpm/ml, como se determinó mediante el ensayo de la transcriptasa inversa) y seguidamente se colocaron en un incubador de CO_{2}. Se obtuvo VIH-1 (cepa LAV) procedente del Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. Los procedimientos usados para el cultivo de las células PBM, cosechado el virus y determinada la actividad de la transcriptasa inversa, fueron los descritos por McDougal y col., (J. Immun. Meth. 76, 171-183, 1985) y Spira y col (J. Clin. Meth. 25, 97-99, 1987), excepto que no se incluyo en el medio la fungizone (ver Schinazi y col., Antimicrob. Agents Chemother. 32, 1784-1787 (1988); Id., 34:1061-1067 (1990)).

El día 6, las células y el sobrenadante se transfirieron a un tubo de 15 ml y se centrifugaron a aproximadamente 900 g durante 10 minutos. Se eliminaron cinco ml del sobrenadante y el virus se concentró por centrifugación a 40.000 rpm durante 30 minutos (un Ti rotor Beckman 70.1). La briqueta de virus solubilizado se procesó para la determinación de los niveles de transcriptasa inversa. Los resultados se expresaron en dpm/ml de sobrenadante muestreado. El virus procedente de volúmenes más pequeños de sobrenadante (1 ml) se pueden concentrar también por centrifugación de manera previa a la solubilización y determinación de los niveles de transcriptasa inversa.

Se determinó la concentración media efectiva (EC_{50}) mediante el procedimiento del efecto medio (Antimicrob. Agents Chemother. 30, 491-498 (1986). Brevemente, el porcentaje de inhibición del virus, como se determinó a partir de las medidas de la transcriptasa inversa, se representa gráficamente frente a la concentración mi limolar del compuesto. El EC_{50} es la concentración del compuesto a la cual hay un 50% de inhibición del crecimiento viral.

Se cultivaron células PBM humanas sin infectar mitógenas estimuladas (3,8 x 10^{5} células/ml) en presencia y ausencia del fármaco bajo condiciones similares a aquellas usadas para el ensayo antiviral descrito anteriormente. Se contaron las células después de 6 días usando un hemacitómetro y el procedimiento de exclusión azul tripán, como describen Schinazi y col., (Antimicrobial Agents and Chemoterapy, 22(3), 499 (1982)). El IC_{50} es la concentración de compuesto que inhibe el 50% del crecimiento celular normal.

La Tabla 4 proporciona los valores de EC_{50} (concentración de nucleósido que inhibe la replicación del virus en un 50% en células PBM, estimando un factor de error del 10%) y valores de IC_{50} (concentración del nucleósido que inhibe un 50% del crecimiento de las células PBM humanas sin infectar mitógenas estimuladas, células CEM, y en células Vero) del 2-hidroximetil-4-(N-5'-citosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano y 2 hiroximetil-4-(N-5'-fluorocitosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano.

TABLA 4 Actividades anti-VIH de los oxaselenolanos nucleósidos

5

La Tabla 5 proporciona el porcentaje de pureza, valores de EC_{50}, valores de EC_{90} (\muM) y valores de IC_{50} en células PBM del \beta-Se-ddC, sus isómeros (+) y (-) y para el \beta-Se-FddC, sus isómeros (+) y (-).

TABLA 5 Actividad anti-VIH y citotóxica de los racematos y enantiómeros de Oxaselenolano citosina nucleósidos

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Se ensayó la actividad anti-VIH del \beta-Se-ddC, sus isómeros (+) y (-) y el \beta-Se-FddC racémico y sus isómeros (+) y (-) en células PBM infectadas con VIH que exhiben una mutación en el codón 184 en el gen de la transcriptasa inversa. En la Tabla 6 se proporcionan los resultados. Como se indicó, el compuesto racémico y el isómero (-)-\beta-Se-ddC exhiben una actividad significativa frente al virus mutado.

TABLA 6 Efecto de los oxaselenolano citosina nucleósidos frente al VIH-1 M184 clonado

7

Ejemplo 5 Actividad anti-VBH de los 1,3-oxaselenolanil nucleósidos

Se puede evaluar la capacidad de los compuestos activos para inhibir el crecimiento del virus en cultivos celulares 2.2.15 (células HepG2 transformadas con el virión de la hepatitis) como se describe en detalle a continuación.

Se ha descrito un resumen y descripción del ensayo de los efectos antivirales en este sistema de cultivo y el análisis del ADN del VBH (Korba y Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217. Las evaluaciones se realizan en dos conjuntos diferentes de células. Todos los pocillos en todas las placas se sembraron con la misma densidad y en el mismo momento.

Debido a las variaciones inherentes en los niveles del ADN intracelular y extracelular sólo las depresiones superiores al valor 3,5 (para el ADN del virión VBH) o valor 3,0 (para los intermediarios de la replicación del ADN del VBH) de los niveles medios de estas formas de ADN del VBH en células no tratadas por ser significativas estadísticamente (P < 0,05). Los niveles del ADN integrado del VBH en cada preparación de ADN celular (que permanece constante por célula base en estos experimentos) se usan para calcular los niveles de las formas del ADN intracelular del VBH, asegurando de esa manera que se comparan cantidades iguales de ADN celular entre muestras separadas.

Los valores típicos del ADN extracelular del virión VBH en células no tratadas varían desde 50 a 150 pg/ml del medio de cultivo (con un promedio de aproximadamente 76 pg/ml). Los intermediarios de la replicación del ADN intracelular del VBH en células no tratadas varían desde 50 a 100 \mug/pg de ADN celular (con un promedio de aproximadamente 74 pg/\mug de ADN celular). En general, las depresiones en los niveles del ADN intracelular del VBH debidas al tratamiento con compuestos antivirales son menos pronunciadas, y se producen más lentamente, que las depresiones en los niveles de ADN del virión VBH (Korba y Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217).

La manera en la que se realizan los análisis de hibridación de estos experimentos da como resultado una equivalencia de aproximadamente 1,0 pg de ADN intracelular del VBH para 2-3 copias genómicas por célula y 1,0 pg/ml de ADN extracelular del VBH para 3 x 10^{5} partículas virales/ml.

Se pueden realizar análisis de toxicidad para evaluar si cualquier efecto antiviral observado es debido a un efecto general sobre la viabilidad celular. Un procedimiento que se puede usar es la medida de la captación del colorante rojo neutro, un ensayo estándar y ampliamente usado para determinar la viabilidad celular en una variedad desistemas hospedadores de virus, que incluyen VSH y VIH. Los análisis de toxicidad se realizan en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos con fondo plano. Las células para los análisis de toxicidad, se cultivan y tratan con los compuestos de ensayo con el mismo calendario, como el que se describe a continuación para las evaluaciones antivirales. Cada compuesto se ensaya a 4 concentraciones, cada una en cultivos por triplicado (pocillos "A", "B", y "C"). La captación del colorante rojo neutro se usa para determinar el nivel relativo de toxicidad. Para el análisis cuantitativo se usa la absorbancia del colorante internalizado a 510 nm (A_{sin}). Los valores se presentan como un porcentaje de los valores medios A_{sin} en 9 cultivos separados de células no tratadas que se mantienen en los mismos 96 pocillos de las placas que los compuestos de ensayo.

Ejemplo 6 Uso de 1,3-oxaselenolanil nucleósidos para tratar la proliferación celular anormal

Algunos de los 1,3-oxaselenolanil nucleósidos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar la proliferación celular anormal, que incluye tumores y cáncer. Se puede evaluar fácilmente la extensión de la actividad antiproliferativa ensayando el compuesto de acuerdo al procedimiento que se describe a continuación en una célula CEM u otro tumor o línea de ensayo celular proliferativa. Las células CEM son células de linfoma humano (una línea celular de un linfoblastoide-T que se obtiene de ATCC, Rockvill, MD). La toxicidad de un compuesto respecto de células CEM proporciona información útil en cuanto a la actividad del compuesto frente a los tumores. (La toxicidad se mide como IC_{50} micromolar). El IC_{50} se refiere a la concentración del compuesto de ensayo que inhibe el crecimiento del 50% de células del tumor en el cultivo. Cuanto menor sea el IC_{50} el compuesto es más activo como agente antitumoral. En general, un 1,3-oxaselenolanil nucleósido exhibe actividad antitumoral y se puede usar en el tratamiento de la proliferación anormal de células si exhibe una toxicidad en CEM u otra línea celular tumoral inmortalizada de menos de 10 micromolar, más preferiblemente, menos de aproximadamente 5 micromolar, y más preferiblemente, menos de 1 micromolar.

Las soluciones de fármacos, que incluyen cicloheximida como control positivo, se cultivan por triplicado en 50 \mul de medio de crecimiento a 2 veces la concentración final y se tienen en cuenta para equilibrar a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5%. Se añaden células en fase logarítmica en 50 \mul de medio de crecimiento hasta una concentración final de 2,5 x 10^{3} (CEM y SK-MEL-28), 5 x 10^{3} (MNAN, MDA-MB-435s, SKMES-1, DU-145, Lncap), o 1 x 10^{4} (PC-3, MCF-7) células/pozillo incubadas durante 3 (DU-145, PC-3, MNAN), 4 (MCF-7, SK-MEL-28, CEM), ó 5 (SK-MES-1, MDA-MB-435s, LNCaP) días a 37ºC bajo una atmósfera de aire y CO_{2} al 5%. Los pocillos de control incluyen medio solamente (blanco) y células más medio sin fármaco. Después del período de crecimiento, se añaden 15 \mul de una solución del colorante de ensayo del kit Cell Tite 96 (Promega, Madison, WI) a cada pocillo y las placas se incuban 8 h a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5%. Se añade la solución de parada del ensayo del kit Promega Cell Titer 96 a cada pocillo y se incuba 4-8 h en el incubador. Se lee la absorbancia a 570 nm, haciendo el blanco con los pocillos de sólo medio usando un lector de placas Biotek Biokinetics (Biotek, Winooski, VT). Se calcula el porcentaje medio de inhibición del crecimiento en comparación al control no tratado. Se calcula la pendiente de IC_{50}, IC_{90} y el valor r por el procedimiento de Chou y Talaly. Chou T-C, Talaly P. Quantitative analysis of dose effects relatioships: The combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul. 1984; 22:27-55.

IV. Preparación de las composiciones farmacéuticas

Los humanos que padecen de enfermedades causadas por cualquiera de las enfermedades descritas en el presente documento, entre las que se incluyen infección por VIH, infección por VBH, o proliferación celular anormal, se pueden tratar administrando al paciente una cantidad efectiva de un 1,3-oxaselenolanil nucleósido opcionalmente en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los materiales activos se pueden administrar por cualquier ruta apropiada, por ejemplo, oralmente, parenteralmente, intravenosamente, intradérmicamente, subcutáneamente, o tópicamente, en forma líquida o sólida.

El compuesto activo se incluye en el vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para dar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de compuesto para inhibir la replicación viral in vivo, especialmente la replicación del VIH y VBH, sin causar efectos tóxicos serios en el paciente tratado. Por "cantidad inhibitoria" se entiende una cantidad de ingrediente activo suficiente para ejercer un efecto inhibitorio como se mide, por ejemplo, mediante un ensayo tal como uno de los descritos en el presente documento.

Una dosis preferida del compuesto para todas las condiciones mencionadas anteriormente estará en el intervalo entre aproximadamente 1 a 50 mg/kg, preferiblemente 1 a 20 mg/kg, de peso corporal por día, más generalmente 0,1 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal del recipiente por día El intervalo de la dosis efectiva de los derivados farmacéuticamente aceptables se puede calcular en función del peso del nucleósido padre que a proporcionar. Si el derivado exhibe actividad en sí mismo, se puede estimar la dosis efectiva como se ha hecho anteriormente usando el peso del derivado, o por otros medios conocidos por aquellos expertos en la técnica.

El compuesto se administra convenientemente en dosis unitarias o en cualquier forma de dosificación, que incluye pero no se limita a una que contiene 7 a 3.000 mg, preferiblemente 70 a 1.400 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. Usualmente es conveniente una dosificación oral de 50-1.000 mg.

Idealmente, se deberá administrar el ingrediente activo para conseguir concentraciones punta en el plasma del compuesto activo de entre aproximadamente 0,2 a 70 pM, preferiblemente aproximadamente 1,0 a 10 \muM. Esto se puede conseguir, por ejemplo, por inyección intravenosa de una solución de entre 0,1 a 5% del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina, o administrado como un bolo de ingrediente activo.

La concentración del compuesto activo en la composición del fármaco dependerá de las velocidades de adsorción, inactivación y excreción del fármaco, así como de otros factores conocidos para aquellos expertos en la técnica. Se debe señalar que los valores de dosificación variarán con la severidad de la dolencia que se va a aliviar. Se debe además comprender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específica deberán ajustarse en el tiempo de acuerdo a la necesidad individual y al juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración establecidos y así sucesivamente en el presente documento son sólo ejemplares y no se desea que limiten el alcance o práctica de la composición reivindicada. El ingrediente activo se puede administrar de una sola vez, o se puede dividir en varias dosis pequeñas para ser administradas a intervalos variantes de tiempo.

Un modo preferido de administración del compuesto activo es el oral. Las composiciones orales incluirán generalmente un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden estar incluidas en cápsulas de gelatina o comprimidas en comprimidos. Para el objeto de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipiente y usar en forma de comprimidos, píldoras para disolver en la boca, o cápsulas. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales coadyuvantes como parte de la composición.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas, píldoras para disolver en la boca y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un ligante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un ligante tal como dióxido de silicona coloidal; un agente endulzante tal como sucrosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo, o aroma de naranja. Cuando la unidad de dosificación está en forma de cápsula, ésta puede contener, de manera adicional al material del tipo anterior, un vehículo líquido tal como un aceite graso. De manera adicional, las formas unitarias de dosificación pueden contener otros materiales diversos que modifican la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma, u otros agentes entéricos.

El compuesto se puede administrar como un componente de un elixir, suspensión, jarabe, galleta, goma de mascar o similares. Un jarabe puede contener, de manera adicional a los compuestos activos, sucrosa como agente endulzante y ciertos preservativos, tintes y colorantes y aromas.

El compuesto o derivado o la sal farmacéuticamente aceptable adecuada para lo mismo, se puede mezclar también con otros materiales activos que no perjudican la acción deseada, o con materiales que suplementan la acción deseada, tales como antibióticos, antifúngicos, antiinflamatorios inhibidores de la proteasa, u otros agentes antivirales nucleósidos o no nucleósidos, como se ha descrito con más detalle anteriormente. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradermal, subcutánea, o tópica pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilén glicoles, glicerina, propilén glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilén diamino tetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. La preparación parenteral puede estar incluida en ampollas, jeringas deshechables o viales de dosis múltiples fabricados en vidrio o plástico.

Si se administra intravenosamente, los vehículos preferidos son suero fisiológico salino o solución salina tamponada de fosfato (PBS).

En una forma de realización preferida, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la rápida eliminación por el cuerpo, tal como una formulación para liberación de manera controlada, que incluye implantes y sistemas microencapsulados de liberación controlada. Se pueden usar polímeros biocompatible biodegradables, tales como acetato de vinil etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctilo Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Los materiales se pueden obtener también comercialmente de Alza Corporation.

Se prefieren también las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales de antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas se pueden preparar de acuerdo a los procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.522.811 (que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad). Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar disolviendo el(los) lípido(s) apropiado(s)
tal(es) como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina, y colesterol en un disolvente inorgánico que se evapora, dejando tras de sí una película delgada de lípido seco sobre la superficie del contenedor. Una solución acuosa del compuesto activo o sus derivados monofosfato, difosfato, y/o trifosfato se introduce entonces en el contenedor. El contenedor se agita entonces con la mano para liberar el material lípido de las caras del contenedor y dispersar los agregados lípidos, formando por tanto, la suspensión liposomal.

Claims (28)

1. Un 1,3-oxaselenolano nucleósido de la fórmula:

8

en la que B es una citosina o 5-fluorocitosina, y R es hidrógeno, acilo, un éster mono, di o trifosfato, un fosfato estabilizado o un éter lípido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que el acilo se refiere a una fracción de la fórmula -C(O)R', en la que R' es alquilo, arilo, alcarilo, aralquilo, compuesto heteroaromático, alcoxialquilo que incluye metoximetilo, arilalquilo que incluye benzilo, ariloxialquilo que incluye fenoximetilo, arilo que incluye fenilo opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C_{1} a C_{4} o alcoxi C_{1} a C_{4}, o el residuo de un aminoáci-
do.

2. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que R es hidrógeno.

3. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que R es acilo.

4. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que R es un monofosfato.

5. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que R es un difosfato.

6. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que R es un trifosfato.

7. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que R es un fosfato estabilizado.

8. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que R es un éter lípido.

9. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que B es citosina.

10. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, en el que B es 5-fluorocitosina.

11. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, que es 2-hidroximetil-4-(N-5'-citosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

12. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, que es 2-hidroximetil-4-(N-5'-fluorocitosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

13. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que es bien el enantiómero \beta-L ó el \beta-D, como un enantiómero aislado.

14. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que es bien el enantiómero \beta-L ó el \beta-D en forma sustancialmente pura.

15. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, que es (-)-\beta-L-2-hidroximetil-4-(N-5'-citosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

16. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 1, que es (-)-\beta-L-2-hidroximetil-4-(N-5'-fluorocitosina-1'-il)-1,3-oxaselenolano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

17. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de las reivindicaciones 15 ó 16, en el que el enantiómero \beta-L está en forma aislada.

18. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de la reivindicación 15 ó 16, en el que el enantiómero \beta-L está en forma sustancialmente pura.

19. Una composición farmacéutica para el tratamiento de la infección por VIH o VBH en seres humanos y otros huéspedes animales, que comprende una cantidad efectiva de un 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición farmacéutica para el tratamiento de las infecciones virales en seres humanos y otros huéspedes animales, que comprende una cantidad efectiva de un 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en combinación con otro agente antiviral, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección por VIH en seres humanos y otros huéspedes animales, que comprende una cantidad efectiva de un 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en combinación con otro agente antiviral, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección por VBH en seres humanos y otros huéspedes animales, que comprende una cantidad efectiva de 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en combinación con otro agente antiviral, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. El 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para uso como un medicamento.

24. El uso de un 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la infección por VIH.

25. El uso de un 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la infección por VBH.

26. El uso de un 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación o alternancia con otro agente antiviral, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las infecciones virales en un huésped.

27. El uso de un 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación o alternancia con otro agente antiviral, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por VIH en un huésped.

28. El uso de un 1,3-oxaselenolano nucleósido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable adecuado para lo mismo, en combinación o alternancia con otro agente antiviral, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por VBH en un huésped.