ES2216043T3 - Dispositivo de inspeccion optica de un fluido, especialmente para analisis hematologicos. - Google Patents

Abstract

COMPRENDE UN ESPACIO DE MEDICION (8) QUE LLEVA UN PASO OBLIGADO (15) PARA EL FLUIDO, UNA FUENTE DE LUZ MONOCROMATICA (31) QUE EMITE UN HAZ (F1) A MEDIOS OPTICOS (6, 32, 34) QUE COMPRENDEN UN PRIMER ELEMENTO OPTICO DE DIFRACCION (32) QUE PRESENTA UNA RED DE DIFRACCION (38) PREDETERMINADA EN FUNCION POR UNA PARTE DE LAS CARACTERISTICAS DE LA FUENTE Y POR OTRA PARTE DE CARACTERISTICAS GEOMETRICAS Y ESPECTRALES ELEGIDAS PARA LA ILUMINACION DEL PASO OBLIGADO, Y DESTINADO A INDUCIR LA FLUORESCENCIA DE UNA PARTE AL MENOS DEL FLUIDO, Y PRIMEROS (1920) SEGUNDOS (34-36) Y TERCEROS (40) MEDIOS OPTOELECTRONICOS DESTINADOS A RECOGER RESPECTIVAMENTE UN HAZ TRANSMITIDO, LA FLUORESCENCIA Y UN HAZ DIFRACTADO, Y DESTINADOS A TRANSMITIR A UNA UNIDAD DE ANALISIS (24) SEÑALES RELATIVAS A LOS CONTENIDOS DE DICHOS HACES. UNO AL MENOS DE DICHOS HACES PROCEDE DE UN SEGUNDO ELEMENTO OPTICO DE DIFRACCION (42) QUE PRESENTA UNA SEGUNDA RED DE DIFRACCION PREDETERMINADA EN FUNCION DE UNA FUNCION DE TRANSFERENCIA FRECUENCIAL Y GEOMETRICA DE UNO AL MENOS DE LOS MEDIOS OPTOELECTRONICOS.

Description

Dispositivo de inspección óptica de un fluido, especialmente para análisis hematológicos.

La invención se refiere a la inspección óptica de partículas de un fluido gaseoso o líquido y, más en concreto, la conformación de haces luminosos utilizados en los aparatos de cómputo de partículas, especialmente en la citometría de flujo, la hematología y el diagnóstico médico.

Ciertos aparatos actuales distinguen automáticamente las partículas del fluido según su familia de pertenencia, y en ciertos casos la pertenencia a subvariedades de una familia. Estas distinciones requieren ya sea varios dispositivos diferentes capaces de efectuar cada uno una parte del análisis deseado, ya sea un dispositivo equipado de varias zonas (o cámaras) de análisis puestas en serie.

Un dispositivo capaz de efectuar una parte de este tipo de análisis se describe en la Patente francesa FR-A-2653885 de la Solicitante. Comprende un espacio de medida (o cuba) que consta de un paso obligado para el fluido, unos medios ópticos superiores adecuados para recoger la luz emitida por una fuente y enviar esta luz recogida al nivel de paso obligado según las características geométricas y espectrales elegidas y de primeros medios sensores adecuados para enviar a una unidad de análisis señales ("primeras señales") representativas de informaciones ("primeras informaciones") transportadas por una luz, de características geométricas y espectrales elegidas, recogida por primeros medios ópticos inferiores después de la travesía del paso obligado.

Se entiende por características espectrales tanto la intensidad como la longitud de onda de la fuente de luz o de la luz obtenida después de la interacción con el fluido al nivel del paso obligado, y por características geométricas la forma general y la topología de la zona iluminada o de la zona de medida del sensor correspondiente.

Por otra parte, se entiende por medios ópticos la óptica de recogida de la luz superior o inferior del paso obligado (por ejemplo, un objetivo de microscopio), y por medios sensores, elementos electrónicos de detección de tipo diodo, fotomultiplicador u otro sensor análogo.

Una de las dificultades de estas medidas reside en el hecho de que las partículas del fluido que se deben inspeccionar, que atraviesan el paso obligado bajo iluminación, deben recibir una misma intensidad luminosa en un mismo intervalo de tiempo. En otros términos, el reparto de luz por toda la superficie definida por el paso obligado debe ser uniforme. Esto requiere una conformación previa del haz enviado por la fuente de luz y destinado a iluminar dicho paso obligado.

Por otra parte, a causa de las características geométricas y espectrales de la luz obtenida después de la interacción entre el fluido y el haz de luz procedente de la fuente, es necesario actualmente utilizar medios ópticos numerosos y voluminosos.

En resumen, los dispositivos actuales presentan un cierto número de inconvenientes como, por ejemplo, las dimensiones totales, la complejidad, los márgenes de incertidumbre relativamente importantes que afectan a los resultados de las medidas o la imposibilidad de diferenciar las subvariedades de una familia determinada. Se volverá más tarde, y en detalle, sobre estos inconvenientes.

Un objeto de la invención es, por tanto, procurar un dispositivo de inspección óptica de partículas de un fluido, del tipo descrito en la introducción, que no presente los inconvenientes de los dispositivos de la técnica anterior, especialmente en términos de rendimiento, de dimensiones totales, de complejidad y de coste.

Según la invención, uno al menos de los medios ópticos superiores y los primeros medios ópticos inferiores comprenden al menos un primer elemento óptico difractivo destinado, según su posición con respecto al paso obligado, a la conformación geométrica y/o espectral, ya sea del haz de luz enviado por la fuente, ya sea de la luz obtenida después de la interacción entre el fluido y la luz fuente.

Este elemento posee al menos una superficie que interactúa con la luz que recoge, y presenta un primer patrón tridimensional predeterminado adecuado para realizar una interacción predeterminada entre la luz que recoge y la luz que envía, teniendo en cuenta las características respectivas de estas dos luces.

Se entiende por elemento óptico difractivo un componente una de cuyas caras al menos presenta un patrón que realiza una estructura capaz de hacer interferir de forma constructiva, según las leyes de la óptica difractiva, los fotones emitidos por una fuente de características conocidas.

De este modo, la conformación puede referirse al haz superior del espacio de interacción entre el fluido y la luz fuente y/o por abajo de esta.

Según un aspecto de la invención, las características geométricas y espectrales elegidas, requeridas para la iluminación del paso obligado, comprenden una iluminación uniforme, de la longitud de onda elegida, de una superficie prácticamente plana, cerrada y de geometría determinada.

Se ha observado que, sustituyendo una parte al menos de los medios ópticos destinados en la técnica anterior a conformar la luz emitida por la fuente por un único elemento óptico difractivo de dimensiones totales muy pequeñas y adaptado específicamente, por una parte, a la fuente y, por otra parte, a las características geométricas y espectrales requeridas para la iluminación del fluido a analizar, es posible reducir notablemente las dimensiones totales del dispositivo y, sobre todo, mejorar muy notablemente la precisión y la resolución de las medidas.

Ninguna óptica geométrica convencional de dimensiones totales pequeñas y de coste moderado puede permitir la obtención de una iluminación que verifique tales características.

Igualmente, ningún medio óptico convencional de dimensiones totales pequeñas y de coste moderado puede permitir recoger la luz procedente de la interacción entre el fluido y la luz fuente con tanta eficacia permitiendo al mismo tiempo un filtrado geométrico y/o espectral de esta luz recogida.

Según otra característica de la invención, la fuente de luz es una fuente de radiación prácticamente monocromática cuya longitud de onda de emisión se elige de manera que induzca la fluorescencia de una parte al menos del fluido que atraviesa el paso obligado. Por otra parte, se prevén segundos medios sensores destinados a recoger una parte al menos de la fluorescencia emitida por el fluido y a enviar, a la unidad de análisis, señales (segundas señales) representativas de informaciones (segundas informaciones) transportadas por esta fluorescencia recogida.

El fluido a inspeccionar es tratado previamente por un medio citoquímico apropiado que consiste en colorear específicamente ciertas subvariedades de las partículas que contiene por medio de un colorante fluorescente.

Sustituyendo la fuente de la técnica anterior, de tipo lámpara, por una fuente monocromática, como por ejemplo un diodo láser, es posible adaptar el dispositivo al fluido a analizar a fin de que la longitud de onda emitida por esta fuente pueda provocar la fluorescencia de las subvariedades coloreadas.

Se pueden considerar varios modos de realización del dispositivo según la invención. Un primer modo en el que se utiliza un solo elemento óptico difractivo superior del paso obligado para la conformación de la luz fuente, efectuándose la recogida de la luz procedente de la interacción entre el fluido y la luz fuente de forma convencional por medios ópticos refractivos. Un segundo modo en el que no se utiliza uno o varios elementos ópticos difractivos más que para recoger la luz procedente de la interacción entre el fluido y la luz fuente, efectuándose la conformación de la luz fuente de forma convencional por medios ópticos refractivos. Un tercer modo en el que se utiliza un elemento óptico difractivo superior del paso obligado para la conformación de la luz fuente y uno o varios elementos ópticos difractivos para recoger la luz procedente de la interacción entre el fluido y la luz fuente.

En el primer modo de realización, la cooperación de la fuente monocromática con un elemento óptico difractivo, situado por arriba del paso obligado y concebido para trabajar con esta fuente concreta, refuerza notablemente la calidad de la iluminación, en el plano de la definición de la superficie iluminada y sobre todo de la uniformidad de la intensidad de la iluminación sobre el conjunto del área de dicha superficie.

En el segundo modo de realización, el dispositivo puede integrar una pluralidad de técnicas de análisis diferentes y no destructivas y, especialmente, las técnicas de análisis de la fluorescencia, de análisis por transmisión y de análisis de difracción a diferentes ángulos, en un volumen más restringido que en los dispositivos de la técnica anterior. Además, estos análisis pueden ser realizados al mismo tiempo y con una única muestra.

Se puede igualmente considerar la separación entre varias longitudes de onda contenidas en un haz de entrada para formar varios haces monocromáticos no colineales, y focalizar cada haz en un lugar dado predeterminado con una geometría concreta. Pero se puede igualmente efectuar un filtrado espectral y/o geométrico.

En el tercer modo de realización, se puede en adelante prescindir de todos o parte de los elementos ópticos tradicionales, de tipo objetivo de microscopio o lente convergente.

Muy ventajosamente, los patrones tridimensionales primero y segundo son redes difractivas primera y segunda grabadas en sustratos transparentes a la longitud de onda de la luz fuente y/o la longitud de onda de fluorescencia.

Se podría considerar realizar las redes difractivas por holografía clásica, inmovilizando franjas de interferencia en una emulsión fotosensible. Pero estas redes no presentan siempre la estabilidad temporal deseada, y su fabricación industrial es más difícil que la de una red difractiva grabada.

Estas redes difractivas grabadas pueden realizarse por microlitografía, por ejemplo, por haz de electrones o ablación láser. El sustrato puede elegirse en función de la longitud de onda de emisión y de la longitud de onda de fluorescencia de manera que sea el menos absorbente posible, permitiendo así reforzar la eficacia de difracción del elemento óptico difractivo.

Según otro aspecto de la invención, la primera y segunda redes difractivas son de tipo numérico con modulación de relieve, representando dicha modulación una función predeterminada capaz de acción difractiva coherente sobre la fase y/o la amplitud, respectivamente, de la luz emitida por la fuente y de la luz obtenida después del paso obligado.

Cada función se determina con la ayuda de una calculadora, tomando en cuenta las características de la luz a recoger (fuente o haz transmitido y fluorescencia) y de la superficie a iluminar (fluido o superficie de detección de o de los detectores), después se transforma numéricamente en elementos de base que forman una red difractiva. Cada elemento posee una posición determinada y una altura determinada, lo que justifica la denominación de red difractiva de modulación de relieve.

Según otra característica de la invención, cada red difractiva posee una modulación de relieve de al menos dos niveles y, preferiblemente, dieciséis niveles.

Realizándose la modulación numéricamente, la altura de cada elemento está codificada de forma binaria. Se puede, por tanto, asociar un nivel a cada altura. El número de niveles de modulación varía, en consecuencia, según las potencias de 2. Este número, por tanto, no puede tomar en principio más que los valores 2, 4, 8, 16...

La eficacia de la difracción de cada red va a depender del grado de similitud entre la función difractiva calculada y el patrón tridimensional grabado. Este grado de similitud depende, en cuanto a él, del paso entre dos niveles consecutivos o, en otros términos, del número de niveles que definen el máximo en amplitud de la función difractiva.

Cuanto más importante sea el número de niveles, mayor será la eficacia de la difracción. Pero se puede demostrar que esta eficacia crece rápidamente hasta aproximadamente el 95%, cuando la intensidad máxima de la función se convierte en 16 niveles, después tiende muy lentamente hacia una asíntota correspondiente al 100% de la eficacia. Sin embargo, los costes de fabricación de una red de modulación de relieve crecen de forma prácticamente exponencial con el número de niveles. En consecuencia, una modulación de más de 16 niveles acarrea costes suplementarios muy importantes para una ganancia de eficacia muy pequeña.

Los elementos ópticos difractivos pueden ser del tipo denominado de Fourier o del tipo denominado de Fresnel. Por supuesto, uno puede ser del tipo Fresnel mientras que el otro (o uno de los otros) es del tipo Fourier, o inversamente.

Se entiende por óptica de Fourier un elemento que envía un haz de ondas cuyos órdenes +1 y -1 con reales, lo que permite dos variantes. Una primera variante denominada "centrada" (o, en inglés, "on axis") en la que los dos órdenes +1 y -1 se recubren sobre el eje óptico del elemento. Una segunda variante denominada "descentrada" (o, en inglés, "off axis") en la que los dos órdenes +1 y -1 están repartidos simétricamente de parte a parte del eje óptico del elemento, sin recubrirse. La segunda variante permite ciertamente obtener un modo más adecuado pues seleccionando uno de los órdenes +1 ó -1 descentrados se prescinde del orden central residual O, pero eso divide el rendimiento de difracción por dos puesto que la energía aportada por cada orden ya no se suma. Este tipo de elemento envía una imagen del objeto en campo lejano, lo que quiere decir que la imagen del objeto está nítida en el infinito.

Se entiende por óptica de Fresnel un elemento que envía un haz de ondas cuyo orden +1 es real y el orden -1 es virtual, lo que no permite más que una posibilidad. Una óptica de este tipo es equivalente, por tanto, a una lente en óptica geométrica convencional. Este tipo de elemento envía una imagen del objeto en campo próximo.

Preferiblemente, el elemento óptico difractivo, encargado de la conformación del haz superior del paso obligado, comprende una única superficie que consta de un patrón difractivo de tipo Fresnel con dieciséis niveles.

Esta solución es preferida actualmente pues, como se indicó anteriormente, la óptica de Fresnel envía una imagen del objeto en campo próximo. Por consiguiente, el elemento difractivo puede por sí solo realizar a la vez una distribución uniforme de la energía contenida en el haz incidente y focalizar esta energía en un sitio dado, como, por ejemplo, en la parte frontal de un objetivo, o directamente al nivel del paso obligado, sin que sea necesario interponer una lente de focalización, como es el caso para las ópticas de Fourier. Eso permite, por tanto, reducir todavía un poco más las dimensiones totales del dispositivo de inspección.

De forma igualmente preferible, el elemento óptico difractivo, encargado de la conformación de la luz por abajo del paso obligado, comprende una única superficie que consta de un patrón difractivo de tipo Fourier de dieciséis niveles.

Esta solución es preferida actualmente pues, como se indicó anteriormente, la óptica de Fourier emite una imagen del objeto en campo lejano y puede funcionar en modo centrado permitiendo así enviar la imagen nítida del haz transmitido y/o de la fluorescencia sobre una superficie de detección relativamente alejada, sin apelar a otros elementos ópticos y perder un mínimo de señal luminosa.

En la descripción que sigue, hecha a título de ejemplo, se hace referencia a los dibujos anexos, en los que:

Figura 1 es un esquema que ilustra un dispositivo según la invención en un primer modo de realización;

Figura 2 es una ampliación de una parte central de la zona de interacción entre el haz calibrado de análisis y el fluido del dispositivo de la figura 1;

Figuras 3A y 3B ilustran respectivamente una parte de un elemento óptico difractivo visto en corte transversal para una modulación con 2 niveles (A) y con 16 niveles (B);

Figura 4 es un ejemplo de imagen de red difractiva de tipo Fresnel con dos niveles de fase;

Figura 5 es un esquema que ilustra un dispositivo según la invención en un segundo modo de realización;

Figura 6 es un ejemplo de imagen de red difractiva de tipo Fourier con dos niveles de fase;

Figura 7 es un esquema que ilustra una variante parcial y simplificada del dispositivo de la figura 5; y

Figura 8 es un esquema que ilustra un dispositivo según la invención en un tercer modo de realización.

Los dibujos anexos constan de numerosos elementos de cierto carácter, que es difícil de definir completamente mediante el texto. En consecuencia, forman por esta razón parte integrante de la descripción y podrán contribuir a la definición de la invención.

Se hace referencia primero a las figuras 1 y 2 para describir un primer modo de realización del dispositivo según la invención.

El dispositivo comprende una fuente de luz monocromática de consumo eléctrico muy pequeño y cuya longitud de onda de emisión se elige en función de la banda espectral de excitación del colorante fluorescente elegido para colorear ciertas subvariantes de partículas del fluido a analizar. Preferiblemente, esta fuente es un diodo láser, pero puede ser un láser o más generalmente una fuente cuya longitud de onda y la potencia de emisión permitan la fluorescencia de subvariedades coloreadas a analizar.

El diodo láser 31 emite un haz F1, de sección recta prácticamente elíptica y cuya energía presenta un reparto gausiano, en dirección a un elemento óptico difractivo 32 sobre el que se volverá ulteriormente. Este elemento 32 posee una superficie delantera 33, enfrente del diodo activo, que actúa sobre el haz F1 enviado por este diodo 31 de manera que presenta características geométricas y espectrales elegidas al nivel de un paso obligado 15 del espacio de medida 8, que aquí es una cuba. Se denomina FC al haz tratado por el elemento óptico difractivo 32.

Las características geométricas llevan a la forma del haz FC y a sus dimensiones en el paso obligado 15, las cuales deben ser prácticamente iguales a las dimensiones transversales del flujo. En el ejemplo descrito, el haz posee una forma rectangular de dimensiones por ejemplo 100 µm x 30 µm. Por supuesto, en otras aplicaciones, o bien si el espacio de medida no es una cuba, la forma del haz FC al nivel del paso obligado podrá ser diferente de un rectángulo. Y lo mismo con las dimensiones. Casi todas las formas de haz se pueden considerar puesto que el elemento difractivo se realiza en función de las características de la fuente y de las características que debe presentar el haz al nivel del paso obligado 15 en el espacio de medida 8.

Por otra parte, las características espectrales llevan al reparto energético al nivel del paso obligado, el cual debe ser cuasi uniforme (preferiblemente con desvíos inferiores al 5%) en el conjunto del rectángulo descrito anteriormente, y a la monocromaticidad del haz, la cual está asegurada directamente por la fuente.

En el modo de realización ilustrado, el elemento difractivo 32 envía de hecho un haz FC de reparto energético uniforme y rectangular, pero de dimensiones superiores a las descritas precedentemente, al nivel de la parte frontal de un primer objetivo de microscopio 6 (x20), lo cual reduce las dimensiones del haz rectangular de manera que sean iguales a las requeridas al nivel del paso obligado 15 (aquí, 100 µm x 30 4m). Hay por tanto, cooperación entre el elemento difractivo y el primer objetivo 6 para enviar el haz FC al nivel de la cámara de medida 16. Pero es claro que se puede pasar de una cooperación de este tipo, siendo concebido entonces el elemento difractivo para enviar el haz de características elegidas directamente al nivel de paso obligado 15 de la cuba 8.

Por otra parte, en el ejemplo ilustrado, el haz F1 procedente del diodo 31 está orientado perpendicular al eje óptico de análisis. En consecuencia, para alcanzar el primer objetivo 6, el haz F1 experimenta una reflexión a 90° sobre una lámina dicroica 34 centrada en el eje óptico de análisis.

Más allá del primer objetivo, el haz FC atraviesa el paso obligado 15 de la cuba de medida 8. Se transforma entonces en un haz transmitido F1 por interacción con el fluido, después penetra en un segundo objetivo de microscopio 18 (x20), idéntico al primero 8, que lo conforma y lo dirige hacia un cubo separador 19 que lo refleja perpendicularmente hacia un fotodiodo de recogida 20. Este fotodiodo está situado a una distancia del paso obligado 15 igual a la que separa el elemento difractivo 32 de este mismo paso obligado. Así, las dimensiones del haz transmitido FT al nivel del fotodiodo 20 son prácticamente iguales a las que presenta el haz a la salida del elemento difractivo 32. El segundo objetivo 18, el cubo separador 19 y el fotodiodo 20 forman los primeros medios optoelectrónicos.

El fotodiodo 20 mide la intensidad del haz transmitido FT, el cual es más o menos absorbido por las diferentes subvariedades de partículas del fluido con las que interactúa. Esta fluctuación de la absorbancia, que permite diferenciar las subvariedades de partículas, es debida no solamente a sus diferentes volúmenes, sino también a sus particularidades internas. Esta medida se transforma en señales que son dirigidas a una unidad de análisis 24, donde son eventualmente correlacionadas con otras señales procedentes de otro camino 23 con vista a un cómputo de subvariedades de partículas. Esta última técnica, así como otras que permiten efectuar medidas por resistividad y por transmisión son perfectamente conocidas por el experto en la técnica y son detalladas en la Patente francesa precitada.

Se puede prever igualmente un camino de puesta a punto de los objetivos prácticamente en el eje del haz transmitido FT. Comprende un esmerilado 21 que permite formar la imagen superpuesta del haz FC al nivel del paso obligado 15 y del fluido y una lente divergente 22 interpuesta entre el esmerilado 21 y el cubo separador 19 destinado a aumentar la imagen superpuesta precitada.

El dispositivo propuesto comprende igualmente segundos medios optoelectrónicos (medios ópticos y sensores) para recoger otras informaciones en la cuba de medida.

En efecto, la longitud de onda de emisión del diodo láser 31 se elige a fin de inducir la fluorescencia de ciertas subvariedades de partículas contenidas en el fluido a analizar y previamente coloreadas por un colorante fluorescente apropiado. Sometido a una radiación luminosa incidente determinada, el colorante contenido en las partículas coloreadas absorbe esta radiación y remite cuasi instantáneamente (10^{-8} s) y de forma isótropa una radiación de longitud de onda superior a la radiación incidente. Esta remisión se denomina fluorescencia. Es posible, por tanto, recuperar una parte de la fluorescencia, ya sea a 90° del eje óptico de análisis, ya sea paralelamente a este eje (epifluorescencia). El dispositivo de la figura 1 ilustra una medida de epifluorescencia a 0° (fluorescencia recogida paralelamente al eje óptico en la dirección opuesta al haz F1 procedente del diodo 31).

La fluorescencia a recoger atraviesa el primer objetivo 6, después la lámina dicroica 34 y se dirige hacia un filtro interferencial 35 que selecciona solo la longitud de onda de fluorescencia de las partículas fluorescentes, lo que permite rechazar todas las demás longitudes de onda parásitas como, por ejemplo, la del diodo láser. Después, una vez filtrada, la fluorescencia es recogida por un tubo fotomultiplicador 36 conectado a la unidad de análisis 24. La intensidad medida por el tubo 36, en un intervalo de tiempo dado, está correlacionada con las otras medidas por transmisión y por resistividad, lo que permite deducir informaciones sobre ciertas subvariedades de partículas y especialmente sobre sus números respectivos.

Es claro que se pueden perfectamente invertir las posiciones respectivas del tubo fotomultiplicador y del diodo láser acoplado al elemento difractivo. Igualmente, se puede realizar el dispositivo según la invención colocando el diodo láser, acoplado al elemento difractivo, paralelamente al eje óptico de análisis y situando los segundos medios optoelectrónicos de recogida de la fluorescencia (tubo fotomultiplicador y filtro interferencial) enfrente del espacio de medida 8 a fin de recoger la fluorescencia a 90° de este eje óptico de análisis.

El elemento óptico difractivo 32 (ver figuras 3A, 3B y 4) comprende en su cara delantera 33, enfrente del diodo láser 31, un patrón tridimensional formado por yuxtaposición de elementos de base 37 prácticamente cuadrados y de altura variable. Esta yuxtaposición forma una red difractiva 38 de modulación de relieve. La altura de cada elemento de base se obtiene por transformación numérica de una función capaz de acción difractiva coherente sobre la fase y/o la amplitud de la luz emitida por la fuente.

El cálculo de la función difractiva puede ser realizado por Establecimientos como el Laboratorio de Sistemas Fotónicos de la Escuela Nacional Superior de Física de Estrasburgo, la cual procede igualmente a la transformación numérica de cada función de manera que se pueda controlar la máquina destinada a realizar el patrón difractivo correspondiente a dicha función.

Este cálculo es realizado con la ayuda de un programa informático de concepción de sistemas ópticos asistido por ordenador. Conociendo las características de las ondas del haz F1 enviado por el diodo láser 31 y las características que deben presentar las ondas del haz al nivel de la parte frontal del objetivo 6 es posible, asimilando el elemento óptico difractivo 32 a una matriz de transferencia y utilizando un algoritmo de cálculo iterativo capaz de resolver las ecuaciones de Maxwell, calcular una función difractiva capaz de transformar el haz procedente del diodo en un haz de análisis. Por supuesto, aunque el algoritmo sea iterativo, puede ser necesario efectuar aproximaciones sucesivas para determinar una función difractiva.

Un cierto número de algoritmos pueden ser utilizados para el cálculo, como, por ejemplo, los conocidos bajo los nombres: "algoritmo de recocido simulado", "algoritmo de Gerchberg-Saxton en campo próximo", "algoritmo de difusión de errores complejos" o "algoritmo de genética basado en la teoría de la evolución de Darwin". Estos algoritmos toman igualmente en cuenta las características del sustrato en el que el elemento difractivo está realizado, la técnica de fabricación de la red difractiva sobre este elemento y el tipo de esta red (Fourier o Fresnel). La red de Fresnel es preferible pues, proporcionando imágenes en campo próximo, no requiere la utilización de una lente convergente.

Una vez calculada la función difractiva, es necesario transformarla numéricamente, a fin de que se pueda transformar en un fichero informático representativo de un patrón numérico que forma red difractiva. Este fichero es generalmente bajo la forma de una matriz 1.024 x 1.024 elementos, codificando cada elemento una parte del patrón.

Para eso se asocia un valor binario (o un nivel) al valor de la función en un punto dado. Siendo la codificación binaria, su precisión depende, por tanto, del paso existente entre dos valores consecutivos. Para obtener un paso muy pequeño, es necesario que la amplitud máxima de la función corresponda a un número de niveles lo más importante posible.

Por razones materiales, no es posible definir aquí de manera exhaustiva, en 1.024 x 1.024 puntos, una red difractiva por ejemplo de tipo Fresnel con dos niveles de fase. Por defecto, una imagen con dos niveles (negro y blanco) de un ejemplo de una red difractiva de este tipo se ilustra en la figura 4.

Como se explicó en la introducción, más allá de 16 niveles el rendimiento de difracción del elemento óptico aumenta muy lentamente mientras que su coste de fabricación crece muy rápidamente. En consecuencia, un elemento óptico difractivo con 16 niveles, que da un rendimiento de difracción de aproximadamente el 95%, es suficiente para permitir la obtención de un haz de análisis de homogeneidad constante con cerca de aproximadamente el 5%.

Se puede ver respectivamente en las figuras 3A y 3B un corte transversal de un elemento difractivo 32 cuyos elementos de base 37 de su red difractiva 36 son binarios (A) o con 16 niveles (B).

Estando regida la acción del elemento difractivo 32 por las leyes de la difracción, cada elemento de base 37 posee dimensiones prácticamente iguales o inferiores a la longitud de onda de emisión del diodo 31. En consecuencia, para realizar estos elementos de base, es indispensable utilizar una técnica cuya resolución sea del orden de la decena de nanómetros. Actualmente, la mejor técnica es la microlitografía y, más en concreto, la que utiliza una máscara de cromo con "niveles de gris binarios".

La máscara de cromo está realizada bajo la forma de niveles de gris codificados de forma binaria, a la imagen de una degradación de gris realizada por una impresora de tipo láser. Esta máscara está depositada por encima de una capa de protector que está ella misma depositada sobre un sustrato. La máscara está iluminada por una luz ultravioleta, que bajo el efecto de los diferentes niveles de dicha máscara va a provocar la impresión del protector según las dosis variables. El protector que contiene una imagen del relieve a transferir se revela entonces, lo que revela dicho relieve. Después, se efectúa la transferencia del relieve del protector revelado hacia el sustrato por fabricación reactiva fónica selectiva (más conocida en inglés bajo el acrónimo RIBE).

Cada elemento de base 37 está grabado así en un sustrato 39, transparente a la longitud de onda de emisión del diodo láser 31. Este sustrato está realizado en un material de tipo cuarzo o BK7.

Por supuesto, se puede prever numerosos otros tipos de sustrato. Igualmente, los procedimientos de fabricación no se limitan a lo descrito anteriormente. Cualquier otro procedimiento capaz de realizar una red difractiva del tipo descrito antes podrá ser considerado. Así, se podrá utilizar una técnica de grabación en relieve como es el caso en el dominio de los discos compactos de audio.

Se hace ahora referencia a la figura 5 para describir un modo de realización preferible de la invención, el cual comprende la integridad de los elementos del dispositivo de la figura 1, con la excepción del objetivo de microscopio 18 que se sustituye por un segundo elemento óptico difractivo 42 que recibe en su cara de entrada 43 el haz transmitido FT procedente de la cuba 8 y lo transforma en un haz transmitido tratado FTT y un haz difractado tratado FDT.

El dispositivo comprende, por tanto, primeros medios optoelectrónicos 19 y 20, instalados por abajo de la cuba 8 y del segundo elemento óptico difractivo 42, para efectuar análisis por transmisión utilizando el haz transmitido tratado FTT, así como segundos medios optoelectrónicos 34-36 para efectuar análisis de fluorescencia, estando instalados igualmente estos segundos medios superiores del paso obligado 15 a fin de recoger la epifluorescencia.

En este modo de realización, se prevé igualmente, por abajo del paso obligado 15 y del segundo elemento óptico difractivo 42, de terceros medios optoelectrónicos para efectuar análisis de difracción a diferentes ángulos sobre el haz difractado tratado FDT. Esta técnica de análisis, que es bien conocida para el experto en la técnica, permite obtener informaciones sobre el estado de superficie, la morfología (forma) y el contenido de ciertas partículas, en función del ángulo dé difracción que presenta el haz difractado FD procedente de la interacción entre el fluido y una parte del haz de luz F1 procedente de la fuente.

Estos terceros medios optoelectrónicos comprenden un detector 40 que permite enviar a la unidad de análisis 24, a la que está conectado, señales analógicas (pero pueden ser igualmente numéricas) representativas de informaciones transportadas por la luz difractada tratada FDT. El detector 40 comprende, por ejemplo, una o varias galletas microcanales o una pluralidad de microcélulas fotoeléctricas que permiten detectar precisamente las coordenadas planas de un fotón difractado que lo alcance.

A la recepción de una señal procedente del detector 40, la unidad de tratamiento 24 está en condiciones de deducir precisamente el ángulo de difracción. Esta señal puede estar correlacionada con otras señales procedentes de otros caminos de análisis (20, 36, 23) a fin de deducir informaciones sobre la subvariedad de partícula que ha provocado esta difracción.

Se hace referencia ahora a las figuras 3A, 3B y 6 para describir el segundo elemento óptico difractivo 42, la cual puede estar realizada de la misma forma que el primer elemento óptico difractivo 32, por ejemplo por grabado. Solo su patrón difractivo tridimensional y, por tanto, su red difractiva 38 con modulación de relieve, es totalmente diferente del primero. En consecuencia, estas diferentes partes llevan las mismas referencias que los del primer elemento, aumentadas en 10.

Sin embargo, en un modo de realización diferente de este, en el que la fluorescencia será recogida por abajo de la cuba (a 0°), su sustrato puede igualmente no ser idéntico al del primer elemento, en la medida que debe ser transparente no solamente a la longitud de onda de la luz emitida por la fuente, sino igualmente a la longitud de onda de fluorescencia.

Su patrón tridimensional está formado por yuxtaposición de elementos de base 47 prácticamente
cuadrados, y de altura variable, formando esta yuxtaposición la red difractiva 48 con modulación de relieve grabado sobre la cara anterior 43, enfrente del paso obligado 15.

El cálculo del patrón tridimensional está realizado igualmente con la ayuda del programa informático de concepción de sistemas ópticos asistido por ordenador. El elemento óptico se asimila a una función de transferencia entre las dos entradas constituidas por haces transmitidos FT y difractados FD procedentes de la cuba 8 y las salidas constituidas por caminos de análisis por transmisión y por difracción. De hecho, hace falta que la función de transferencia permita la focalización sin pérdida de información, por una parte, del haz transmitido sobre la superficie de detección del fotodiodo 20 y, por otra parte, del haz difractado sobre la superficie de detección del detector 40 de manera que a un ángulo de difracción dado a la salida de la cuba 8 corresponde un elemento de detección sobre dicho detector 40.

Los parámetros de este cálculo son, por tanto, a la entrada, la longitud de onda (o la frecuencia) de la luz fuente, la geometría del haz transmitidc FT y la geometría de los haces difractados FD y, a la salida, la geometría del haz transmitido tratado FTT al nivel de la superficie de detección del diodo 20 y la geometría del haz difractado transmitido FDT al nivel de la superficie de detección del detector 40.

Por supuesto, si el segundo elemento óptico difractivo debiera igualmente tratar la fluorescencia, su función de transferencia deberá igualmente tomar en cuenta, a la entrada, la longitud de onda y el reparto geométrico de la fluorescencia y, a la salida, la geometría del "haz" de fluorescencia transmitido al nivel del filtro interferencial 35.

La red de Fourier es preferible para este segundo elemento óptico difractivo 42 pues, por una parte, permite, cuando está en modo centrado, limitar al máximo las pérdidas de información y, por otra parte, proporcionando imágenes de campo lejano, permite localizar directamente los haces en detectores alargados sin apelar a una lente convergente. Por supuesto, se podría considerar grabar una red de Fresnel, pero haría falta entonces acoplar el segundo elemento a una lente convergente.

Preferiblemente, la modulación del relieve de la segunda red es de 16 niveles, lo que permite obtener un rendimiento de difracción de aproximadamente el 95%. Un rendimiento de este tipo se vuelve indispensable por el número muy pequeño de fotones difractados, por ejemplo.

Por razones materiales, no es posible definir aquí de manera exhaustiva, en 1.024 x 1.024 puntos, una red difractiva por ejemplo de tipo Fourier con dos niveles de fase. Por defecto, una imagen con dos niveles (negro y blanco) de un ejemplo de una red difractiva de este tipo se ilustra en la figura 6.

Aunque la invención haya sido descrita con referencia a un dispositivo de análisis hematológicos, puede servir para otras aplicaciones comparables, con o sin fluorescencia, encontrándose en el marco de las reivindicaciones a continuación.

Es, por ejemplo, el caso del dispositivo ilustrado parcialmente en la figura 7 y que constituye una variante simplificada del dispositivo de la figura 5. Esta variante toma los elementos descritos con referencia a la figura 5, con excepción de los (34-36) que constituían el camino de recogida de la fluorescencia, del objetivo de focalización (6) y del detector de recogida de la luz difractada (40).

El elemento difractivo 42 focaliza sobre la cara de detección del fotodetector 20 la imagen en campo próximo de la luz al nivel del paso obligado 15. Para hacer esto, el elemento difractivo 42 consta sobre su cara de recogida 43 de un patrón difractivo de tipo Fresnel. Por otra parte, a causa de la supresión del camino de recogida de la fluorescencia, la fuente de luz 31 (diodo) puede estar instalada en el eje del camino de análisis.

Los dos elementos difractivos 32 y 42 pueden estar adheridos a las paredes de la cuba 8. En este caso, es preferible que el patrón difractivo 33 del elemento difractivo 32 sea igualmente de tipo Fresnel. Se realiza así un dispositivo de dimensiones totales muy pequeñas, de realización en concreto simple y de coste reducido.

Por otra parte, se han descrito modos de realización en los que el dispositivo comprende ya sea un solo elemento óptico difractivo para la conformación de la luz fuente, ya sea un elemento óptico difractivo para la conformación de la luz fuente y un elemento óptico difractivo para recoger la luz procedente de la interacción entre el fluido y la luz fuente. Pero, por supuesto, otros modos de realización pueden ser considerados como, por ejemplo, un modo en el que no se utilice (n) más que uno (o varios) elemento (s) óptico (s) difractivo(s) con vista de la recogida de la luz procedente de la interacción entre el fluido y la luz fuente.

Un modo de realización de este tipo se ilustra en la figura 8. Toma los elementos descritos con referencia a la figura 5, con la excepción del elemento óptico difractivo (32) que se sustituye por un conjunto de colimación 50 del haz de luz F1 enviado por la fuente de luz 31 y por un diafragma 51 de sección preferiblemente rectangular.

La fuente 31 es, por ejemplo, un diodo láser que envía un haz F1, de sección elíptica, divergente y de reparto gausiano. El diafragma 51 selecciona la parte central de la gausiana a fin de asegurar un reparto homogéneo de la potencia luminosa enviada al nivel del paso obligado 15.

Un dispositivo de este tipo asocia, por tanto, una óptica de conformación del haz de tipo refractor a una óptica de recogida de la luz, enviada por la interacción entre el fluido y la luz fuente, de tipo difractivo.

Otros modos de realización pueden considerarse todavía como, por ejemplo, un modo en el que se utiliza un elemento óptico difractivo para la conformación de la luz fuente y varios elementos ópticos difractivos con vista a la recogida de la luz procedente de la interacción entre el fluido y la luz fuente.

Realizaciones de este tipo pueden ser útiles cuando el dispositivo está destinado especialmente a la separación de haces de longitudes de onda diferentes. Para hacer esto, se puede poner en paralelo a la salida de una red dispersiva o un prisma de dispersión, situado él mismo a la salida del espacio de medida (el cual puede ser un recinto casi cerrado, como en el ejemplo descrito, o bien una zona abierta) los diferentes elementos ópticos difractivos destinados respectivamente a tratar una longitud de onda determinada. Cada elemento óptico difractivo presenta entonces un patrón tridimensional que le es propio, a fin de que pueda asegurar un filtrado de la longitud de onda y/o del reparto geométrico de la luz concernida, después
enviar la luz así filtrada al medio sensor concernido, según las características geométricas y espectrales elegidas en función de este medio sensor.

La invención se aplica de forma general a los dispositivos de inspección óptica de partículas de un fluido gaseoso o líquido, especialmente en los dominios de la citometría de flujo, de la hematología y del diagnóstico médico.

Claims (21)

1. Dispositivo de inspección óptica de un fluido, del tipo que comprende:

- un espacio de medida (8) que consta de un paso obligado (15) para el fluido,

- una fuente de luz (31),

- medios ópticos superiores (6, 32, 34) adecuados para recoger la luz (F1) procedente de la fuente (31) y para enviar esta luz recogida (F1) al nivel del paso obligado (15) bajo la forma de un haz de luz enviado por arriba (FC) de características geométricas y espectrales elegidas,

- primeros medios sensores (20) adecuados para enviar a una unidad de análisis (24) primeras señales representativas de primeras informaciones transportadas por un haz de luz recogida (FT),

- primeros medios ópticos inferiores (18, 19, 42) para recoger una parte al menos del haz de luz (FT) obtenido después de atravesar el paso obligado (15) y enviar este haz de luz recogida (FT) a los primeros medios sensores (20) bajo la forma de un haz de luz enviada inferior (FTT, FTD) de características geométricas y espectrales elegidas,

caracterizado porque uno al menos de los medios ópticos superiores (32) y de los primeros medios ópticos inferiores (42) comprenden al menos un primer elemento óptico difractivo (32, 42) para la conformación geométrica y espectral de dicho haz enviado una al menos de cuyas superficies (33, 43) que interactúan con el haz de luz que recogen, presenta un primer patrón tridimensional predeterminado adecuado para realizar una interacción predeterminada entre la luz que recoge (F1, FT) y la luz que envía (FC, FTT, FTD), teniendo en cuenta las características respectivas de estas dos luces.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de luz (31) es una fuente de radiación prácticamente monocromática cuya longitud de onda de emisión se elige de manera que induzca la fluorescencia de una parte al menos del fluido que atraviesa el paso obligado (15).

3. Dispositivo según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende segundos medios sensores (36) destinados a enviar a la unidad de análisis (24) segundas señales representativas de segundas informaciones transportadas por la fluorescencia emitida por el fluido durante su interacción con la luz (FC) al nivel del paso obligado (15).

4. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende terceros medios sensores (40) destinados a enviar a la unidad de análisis (24) terceras señales representativas de terceras informaciones transportadas por la luz (FTD) difractada por el fluido durante su interacción con la luz (FC) al nivel del paso obligado.

5. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los medios ópticos superiores comprenden el primer elemento óptico difractivo (32), una al menos de cuyas superficies (33), que interactúan con la luz (F1) enviada por la fuente (31), presenta el primer patrón tridimensional predeterminado en función de las características de la fuente (31) y de las características elegidas requeridas para la iluminación (FC) del paso obligado (15).

6. Dispositivo según una de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque los primeros medios ópticos superiores comprenden al menos un segundo
elemento óptico difractivo (42), una al menos de cuyas superficies (43), que interactúan con la luz (FT) obtenida después de la travesía del paso obligado (15), presenta un segundo patrón tridimensional predeterminado en función de una función de transferencia de frecuencia y geométrica de uno al menos de los primeros (20) y terceros (40) medios sensores.

7. Dispositivo según una de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque los patrones tridimensionales primero y segundo son respectivamente redes difractivas primera (38) y segunda (48) grabadas en sustratos (39, 49) transparentes a la longitud de onda de emisión de la fuente y/o la longitud de onda de fluorescencia.

8. Dispositivos según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los medios ópticos inferiores comprenden el primer elemento óptico difractivo (42), una al menos de cuyas superficies (43), que interactúan con la luz (F1) emitida por la fuente (31), presenta el primer patrón tridimensional predeterminado en función de una función de transferencia de frecuencia y geométrica entre uno al menos de los primeros (20) y terceros (40) medios sensores.

9. Dispositivo según la reivindicación 8, caracterizado porque el primer patrón tridimensional es una primera (48) red difractiva grabada en un sustrato (49) transparente a las longitudes de onda de emisión de la fuente y de fluorescencia.

10. Dispositivo según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque las redes difractivas primera y segunda (38, 48) son de tipo numérico con modulación de relieve, representando dicha modulación una función predeterminada capaz de acción difractiva coherente sobre la fase y/o la amplitud respectivamente de la luz (F1) emitida por la fuente (31) y de la luz (FT) obtenida después de la travesía del paso obligado (15).

11. Dispositivo según la reivindicación 10, caracterizado porque las redes difractivas primera y segunda poseen cada una modulación de relieve de al menos dos niveles y, preferiblemente, dieciséis niveles.

12. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las características geométricas y espectrales elegidas, requeridas para la iluminación del paso obligado (15), comprenden una iluminación uniforme, de la longitud de onda elegida, de una superficie prácticamente plana, cerrada y de geometría determinada.

13. Dispositivo según la reivindicación 12, caracterizado por que la superficie iluminada es un rectángulo.

14. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el primer elemento óptico difractivo (32) es del tipo denominado de Fresnel.

15. Dispositivo según una de las reivindicaciones 6 a 14, caracterizado porque el segundo elemento óptico difractivo (42) es del tipo denominado de
Fourier.

16. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el primer elemento óptico difractivo (32) es del tipo denominado de Fourier.

17. Dispositivo según una de las reivindicaciones 6 a 16, caracterizado porque el segundo elemento óptico difractivo (42) es del tipo denominado de
Fresnel.

18. Dispositivo según una de las reivindicaciones 5 a 7, en combinación con una de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque el primer elemento óptico difractivo (32) comprende una única superficie (33) que consta de un patrón difractivo de tipo Fresnel con dieciséis niveles.

19. Dispositivo según una de las reivindicaciones 6 y 7, en combinación con una de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque el segundo elemento óptico difractivo comprende una única superficie (43) que consta de un patrón difractivo de tipo Fourier con dieciséis niveles.

20. Dispositivo según una de las reivindicaciones 6 a 19, caracterizado porque uno al menos de los elementos ópticos difractivos presenta un patrón tridimensional predeterminado adecuado para asegurar una separación espacial de longitudes de onda predeterminadas.

21. Dispositivo según una de las reivindicaciones 3 a 20, caracterizado porque uno al menos de los elementos ópticos difractivos presenta un patrón tridimensional predeterminado adecuado para asegurar un filtrado de la longitud de onda y del reparto geométrico de la fluorescencia y para enviar a los segundos medios sensores (36) una luz de fluorescencia de características geométricas y espectrales elegidas.