ES2215956T3 - Procedimiento para medir componentes de organismos vivos utilizando polipeptidos. - Google Patents
Procedimiento para medir componentes de organismos vivos utilizando polipeptidos.Info
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Abstract
Un procedimiento para medir un analito en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo, cuyo procedimiento comprende: hacer reaccionar una muestra obtenida a partir de un organismo vivo con un reactivo, comprendiendo dicho reactivo un producto combinado de un polipéptido que tiene 3 a 30 residuos ácidos derivados de un ácido fuerte que tiene un pKa de 3 o inferior, y una sustancia que tiene afinidad por el analito, separar el complejo resultante, y determinar la cantidad de analito en la muestra, basándose en la cantidad de complejo.
Description
Procedimiento para medir componentes de
organismos vivos utilizando polipéptidos.
Esta invención se refiere a un procedimiento para
medir analitos en muestras obtenidas a partir de organismos vivos,
tales como fluidos corporales (p. ej., suero, sangre, plasma, orina,
etc.), linfocitos, hemocitos y diversas células, cuyo procedimiento
incluye el uso de un polipéptido que tiene residuos ácidos derivados
de un ácido fuerte.
Se conoce que sustancias específicas
interaccionan fuertemente entre sí (es decir, tienen una alta
afinidad entre sí) para formar un complejo estable. Las sustancias
específicas incluyen, por ejemplo, las siguientes combinaciones:
antígeno y anticuerpo; proteasa y su inhibidor; cadena de azúcar y
lectina; enzima y su sustrato o coenzima; sustancia activa
fisiológicamente, tal como hormona, y receptor o proteína de
transporte para dicha sustancia activa; y una pareja de cadenas de
polinucleótidos de ADN bicatenario.
Como método para medir un analito en una muestra
utilizando la interacción anterior, se puede mencionar a modo de
ejemplo: un método para formar un complejo sobre una fase sólida
mediante la reacción de sustancias, en la combinación mencionada
anteriormente y a continuación llevar a cabo la denominada
separación Unión/Libre (del inglés, "Bound/Free", B/F),
empleando dicha fase sólida, tal como un enzimoinmunoanálisis (EIA),
radioinmunoanálisis (RIA) y fluoroinmunoanálisis (FIA) (por ejemplo,
el procedimiento descrito en el documento de patente
JP-A 1-22706
(EP-A-326100), JP-A
3-44399); y un método desarrollado por alguno de los
presentes inventores, p. ej., un método para realizar la separación
de un complejo de un analito libre que se va a medir, es decir, la
separación denominada B/F, empleando una cromatografía líquida de
alta precisión (HPLC) (por ejemplo, los procedimientos descritos en
los documentos de patentes JP-A
2-28557
(EP-A-357869), JP-A
3-206964, JP-A
3-221865, JP-A
6-66800).
En un método de medición tal, la precisión de la
medición y el tiempo requerido para el análisis están influidos por
la eficacia de la separación B/F hasta un cierto grado. Por tanto,
se han realizado diversas investigaciones sobre la separación
B/F.
Por ejemplo, en los procedimientos descritos en
los documentos de patente JP-A
1-227061
(EP-A-326100), JP-A
3-44399, en los que la separación B/F se lleva a
cabo utilizando una fase sólida y en los procedimientos descritos en
JP-A 6-66800, en los que la
separación B/F se realiza empleando HPLC, la separación B/F se
realiza, por ejemplo, del modo siguiente: una sustancia aniónica se
introduce previamente en, por ejemplo, un anticuerpo de un analito
que se va a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo
vivo, y la separación denominada B/F se realiza empleando las
propiedades aniónicas de la sustancia aniónica en un complejo del
analito y el anticuerpo.
Un método tal hace posible realizar la separación
B/F de un modo más eficaz que antes. Sin embargo, en todos los
procedimientos, la sustancia aniónica empleada es la obtenida a
partir de un poli(aminoácido) y la separación B/F se realiza
empleando las propiedades aniónicas impartidas por los grupos
carboxilo del poli(aminoácido) y, por tanto, se encuentran
los inconvenientes mencionados abajo, en los casos en los que la
separación B/F se realiza empleando HPLC.
Es decir, en el método en el que emplea HPLC, el
complejo se debe separar de, por ejemplo, el anticuerpo libre y las
sustancias presentes en la muestra que tienden a afectar la
medición, simultáneamente a la separación B/F. Para realizar dicha
separación suficientemente, utilizando las propiedades aniónicas de
los grupos carboxilo obtenidos a partir del poli(aminoácido),
se deben introducir al menos 200 grupos carboxilo (aproximadamente
200 residuos de aminoácidos) en la molécula de sustancia aniónica.
Por tanto, existen los siguientes problemas. Primero, la preparación
de la sustancia aniónica requiere mucho trabajo. Además, la
preparación a gran escala de la sustancia aniónica con un peso
molecular uniforme es difícil, de modo que cuando la separación B/F
se realiza mediante HPLC empleando una sustancia aniónica tal, tiene
lugar en algunos casos la formación de una cola en un pico o la
determinación de un pico que disminuye la precisión de la medición.
Adicionalmente, cuando un poli(aminoácido) que tiene grupos
carboxilo, tal como poli(ácido glutámico) se emplea para la
separación, tiene lugar una reacción no específica que causa un
fenómeno tal como un incremento de un valor en blanco y en algunos
casos de los valores medidos. Para evitar el fenómeno, es necesario
añadir un polímero aniónico adecuado, tal como
\gamma-poli(ácido glutámico).
Por tanto, existe una necesidad de búsqueda de
otras mejoras.
La síntesis del péptido
tri-sulfatado
H-Tyr(SO_{3}H)-Ala-Glu-Glu-Tyr-(SO_{3}H)-Glu-Tyr-(SO_{3}H)-Thr-Ser-OH
con el método en fase sólida, se describe en Chem. Abst., Vol. 121,
nº 11, 1994, resumen nº 134778.
El documento
WO-A-92/17194 describe un
polipéptido para la inhibición del depósito mineral que comprende 3
a 6 residuos de fosfoserina.
El documento
WO-A-87/07615 describe fosfopéptidos
que tienen de 5 a 30 aminoácidos que incluyen la secuencia
A-B-C-D-E,
en donde A, B, C, D y E son independientemente, fosfoserina,
fosfotreonina, fosfotirosina, fosfohistidina, glutamato y aspartato.
Los fosfopéptidos se emplean para la aplicación tópica en los
dientes o en el tejido gingival.
La síntesis del péptido que contiene
O-fosfoserina múltiple
Ac-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-NHMe
(P = fosfato), se describe en el Australian Journal of Chemistry
(1992), 45(2), 385-394.
La presente invención se realizó teniendo en
cuenta tales condiciones y proporciona un procedimiento para medir
un analito en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo,
comprendiendo dicho procedimiento: hacer reaccionar una muestra
obtenida a partir de un organismo vivo con un reactivo que comprende
un producto combinado de un polipéptido que tiene 3 a 30 residuos
ácidos, derivados de un ácido fuerte que tiene un pKa de 3 o
inferior, y una sustancia que tiene afinidad por el analito, separar
el complejo resultante y determinar la cantidad de analito en la
muestra, basándose en la cantidad de complejo. Cuando un complejo
formado por la interacción entre un analito que se va a medir en una
muestra obtenida de un organismo vivo y una sustancia que tiene
afinidad por el analito (de aquí en adelante abreviada como
"sustancia de afinidad") se separa de esta sustancia de
afinidad libre, es decir, sustancia de afinidad que no ha
reaccionado, y otras sustancias presentes en la muestra que tienden
a afectar la detección del complejo, por un método que aplica carga
negativa, p. ej., un método que emplea un intercambiador aniónico,
dicho polipéptido se puede utilizar para separar más eficazmente el
complejo de la sustancia de afinidad libre.
En esta memoria se describe un producto combinado
del polipéptido y una sustancia de afinidad para un analito que se
va a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo
vivo.
También se describe en esta memoria un compuesto
en el que un grupo maleimido se une mediante un espaciador al
extremo N-terminal del polipéptido, y un producto
combinado de dicho compuesto y una sustancia que tiene un grupo SH y
afinidad por un analito que se va a medir en una muestra obtenida a
partir de un organismo vivo.
También se describe en esta memoria un reactivo
para medir un analito que se va a medir en una muestra obtenida a
partir de un organismo vivo, que comprende un producto combinado del
polipéptido y una sustancia de afinidad para el analito, o el
producto combinado mencionado anteriormente que tiene un enlace de
grupo
maleimido-espaciador-polipéptido.
La Fig. 1 muestra las posiciones en la elución de
polipéptidos aniónicos mediante una cromatografía líquida de alta
precisión (HPLC), empleando una columna de intercambio aniónico
obtenida en el Ejemplo 8.
La Fig. 2 muestra las posiciones de la elución de
productos combinados del fragmento Fab como anticuerpo y un
polipéptido aniónico, mediante HPLC empleando una columna de
intercambio aniónico obtenida en el Ejemplo 11.
La Fig. 3 muestra los datos de estabilidad del
almacenamiento de un polipéptido que tiene residuos de serina
sulfatada en soluciones con pHs diferentes que se obtuvieron en el
Ejemplo 12.
La Fig. 4 muestra los datos de la estabilidad de
almacenamiento de un polipéptido que tiene residuos de tirosina
sulfatada en soluciones con pHs diferentes que se obtuvieron en el
Ejemplo 12.
La Fig. 5 muestra las posiciones de la elución de
distintos complejos de antígeno-anticuerpo mediante
HPLC, empleando una columna de intercambio aniónico, obtenidos en el
Ejemplo 14.
La Fig. 6 muestra los patrones de elución para el
análisis de muestras mediante HPLC, obtenidos en el
\hbox{Ejemplo 15.}
La Fig. 7 muestra las posiciones de la elución de
distintos complejos de antígeno-anticuerpo mediante
HPLC, empleando una columna de intercambio aniónico, obtenidos en el
Ejemplo 16.
Los presentes inventores investigaron un método
para separar mediante un intercambiador aniónico un complejo formado
por la interacción entre un analito que se va a medir en una muestra
obtenida a partir de un organismo vivo y una sustancia de afinidad,
de sustancias presentes junto con el complejo, que tienden a afectar
la detección del complejo, por ejemplo, la sustancia de afinidad
libre [o el analito libre; el analito se puede marcar con una
sustancia detectable por algún método (de aquí en adelante abreviada
como "sustancia detectable")]. Esto es, los presentes
inventores investigaron seriamente el desarrollo de un método que
permite una cierta mayor separación del complejo de la sustancia de
afinidad libre y similares. En el curso de la investigación, los
presentes inventores encontraron que cuando una sustancia que tiene
una capacidad adecuada para cambiar propiedades del complejo (de
aquí en adelante abreviada como "sustancia que mejora la
separación"), se introduce en el complejo y el complejo se separa
de las sustancias presentes junto con el complejo y que tienden a
afectar la detección del complejo, por ejemplo, la sustancia de
afinidad libre (o el analito libre), basándose en la capacidad de la
sustancia que mejora la separación, se puede ajustar libremente la
posición de elución del complejo, escogiendo de forma adecuada la
sustancia que mejora la separación. Con otras palabras, los
presentes inventores encontraron que la introducción de una
sustancia adecuada que mejora la separación en el complejo, permite
una cierta separación mayor del complejo, en relación con la
sustancia de afinidad libre y similares. Este descubrimiento se
presentó como patente (documento JP-A
6-66800). Sin embargo, cuando el complejo se separa
con este método, introduciendo en el complejo una sustancia aniónica
que mejora la separación, se producen en algunos casos los problemas
mencionados anteriormente. Para encontrar una sustancia aniónica que
mejora la separación que no cause tales problemas, los presentes
inventores realizaron otras investigaciones y encontraron
consecuentemente que los problemas mencionados anteriormente se
pueden resolver empleando como sustancia aniónica que mejora la
separación, un polipéptido que tiene tres a treinta residuos ácidos
derivados de un ácido fuerte.
El polipéptido puede ser cualquier polipéptido en
tanto que tenga por lo menos tres y hasta treinta residuos ácidos
derivados de un ácido fuerte. El tipo y la cantidad de residuos de
aminoácidos que constituyen el polipéptido, no están particularmente
limitados. Sin embargo, cuando se tiene en cuenta la capacidad de
síntesis y similares, el número total de los residuos de aminoácidos
se escoge adecuadamente en el intervalo de 3 a 30, preferentemente
de 5 a 15. Los residuos ácidos derivados de un ácido fuerte, se
definen como los residuos que se han obtenido a partir de un ácido
fuerte que tiene un pKa de 3 o menor, tal como ácidos fuertes
inorgánicos, p. ej., ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc.
La expresión "residuo ácido" significa una
parte retenida de un ácido después de eliminar un átomo de
hidrógeno, p. ej., HSO_{4}.
Además, la expresión "residuo de aminoácido"
significa una parte retenida de un aminoácido después de eliminar un
átomo de hidrógeno del extremo N-terminal
(-NH_{2}) y un grupo hidroxilo del extremo
C-terminal (-COOH).
El polipéptido tiene cualquiera de los residuos
de ácido fuerte mencionados anteriormente, introducidos normalmente
en los grupos reactivos de los residuos de aminoácidos que
constituyen el polipéptido. Como grupo reactivo, se puede mencionar
a modo de ejemplo en el polipéptido el grupo hidroxilo libre, el
grupo amino, el grupo imino, el grupo tiol y similares. El grupo
amino de la cadena principal del polipéptido, es decir, el grupo
amino N-terminal del polipéptido, también se puede
utilizar como grupo reactivo. Sin embargo, es preferible que el
residuo ácido se introduzca en los grupos reactivos distintos al
grupo amino N-terminal, debido a que el grupo amino
N-terminal del polipéptido puede actuar para
combinar el polipéptido con una sustancia de afinidad para
proporcionar un modo definitivo de combinación del polipéptido y la
sustancia de afinidad hasta un cierto grado, dando como resultado un
aumento de la precisión de la medición de un analito en una muestra
obtenida a partir de un organismo vivo.
El polipéptido se puede representar generalmente
por la fórmula:
[I]A-(R)_{m}-B
en donde m es un número entero 3 o superior; por
lo menos 3 y hasta 30, R's son iguales o diferentes,
independientemente un residuo de aminoácido que introduce un residuo
de ácido fuerte en el mismo, mediante un grupo reactivo del residuo
del aminoácido y el resto de R's son iguales o diferentes, un
residuo de aminoácido que no tiene un residuo de ácido fuerte,
pudiendo estar protegido cada grupo reactivo en cada cadena lateral
del residuo de aminoácido; A es un átomo de hidrógeno, un grupo
protector del extremo N-terminal o un residuo ácido
derivado de un ácido fuerte; y B es un grupo hidroxilo o un grupo
protector del extremo
C-terminal.
En la fórmula [I] anterior, m es un número entero
de por lo menos 3, generalmente 3 a 30, preferentemente 3 a 20, más
preferentemente 4 a 20 y lo más preferentemente 5 a 15. Entre una
pluralidad de R's en el número de m, por lo menos 3 hasta 30 R's
deben ser independientemente un residuo de aminoácido que tiene un
residuo ácido derivado de un ácido fuerte. El residuo ácido es
introducido en el residuo de aminoácido uniéndolo al grupo reactivo
del residuo de aminoácido. Cuando todos los R's del número m no
tienen dicho residuo de ácido fuerte, el resto de los R's son
independientemente un residuo de aminoácido que no tiene un residuo
de ácido fuerte y, en este caso, el grupo reactivo de la cadena
lateral del residuo de aminoácido puede estar protegido por un grupo
protector convencional del grupo amino N-terminal. A
es un átomo de hidrógeno en el grupo amino
N-terminal y también este átomo de hidrógeno puede
estar sustituido por un grupo protector convencional del grupo amino
N-terminal y, además, el residuo ácido derivado de
un ácido fuerte también puede ser introducido en lugar de este átomo
de hidrógeno, cuando no está protegido. B es un grupo hidroxilo en
el grupo carboxilo C-terminal y este grupo hidroxi
puede estar sustituido por un grupo protector convencional del grupo
carboxilo C-terminal. En lo mencionado
anteriormente, el tipo y la secuencia de m residuos de aminoácidos
R's puede ser arbitrario.
El polipéptido mostrado por la fórmula [I]
anterior se puede clasificar, por ejemplo, en los dos grupos
siguientes:
(1) Polipéptido representado por la fórmula:
[II]A-(R^{1})_{m'}-B
en donde R^{1}'s son, iguales o diferentes,
independientemente un residuo de aminoácido que introduce un residuo
de ácido fuerte en el mismo, mediante un grupo reactivo del residuo
de aminoácido; m' es un número entero 3 a 30 y A y B son como se han
definido
anteriormente.
En la fórmula [II] anterior, m' es un número
entero 3 a 30, preferentemente 3 a 20, más preferentemente 4 a 20,
lo más preferido 5 a 15; R^{1} es un residuo de aminoácido que
tiene un residuo ácido derivado de un ácido fuerte. Es decir, todos
los residuos de aminoácidos tienen independientemente un residuo
ácido derivado de un ácido fuerte. A y B son como se han definido
anteriormente. En lo mencionado anteriormente, el tipo y la
secuencia de los residuos de aminoácidos R^{1}'s en la cantidad m,
puede ser arbitrario.
(2) Polipéptido representado por la fórmula:
[III]A-(R^{1})_{m'}-(R^{2})_{n}-B
en donde m' es un número entero 3 a 30; los
R^{1}'s son, iguales o diferentes, independientemente un residuo
de aminoácido que introduce un residuo de ácido fuerte en el mismo
mediante un grupo reactivo del residuo de aminoácido; cada R^{2}
es un residuo de aminoácido que no tiene residuo de ácido fuerte,
pudiendo estar protegido cada grupo reactivo en cada cadena lateral
del residuo de aminoácido; n es un número entero 1 o superior; y A y
B son como se han definido
anteriormente.
En la fórmula [III] anterior, R^{2} es un
residuo de aminoácido que no tiene residuo ácido derivado de un
ácido fuerte; (m'+n) es un número entero por lo menos 4,
generalmente 4 a 30, preferentemente 4 a 20, más preferentemente 5 a
20, lo más preferido 6 a 15; n es un número entero por lo menos 1,
generalmente 1 a 27, preferentemente 1 a 17, más preferentemente 1 a
16, lo más preferido 1 a 10; y otros símbolos tienen el mismo
significado que los definidos anteriormente. El tipo y la secuencia
de los residuos de aminoácidos R^{1}'s en la cantidad de m' y los
residuos de aminoácidos R^{2}'s en la cantidad de n, puede ser
arbitrario. En este caso, hay un polipéptido compuesto por un bloque
que contiene residuos de aminoácidos, teniendo todos un residuo
ácido derivado de un ácido fuerte y un bloque que no contiene tal
residuo de ácido fuerte, tal y como se ha mencionado
anteriormente.
Los residuos ácidos derivados de un ácido fuerte
en el polipéptido son preferentemente residuos ácidos derivados de
un ácido fuerte polivalente, tal como ácido sulfúrico, ácido
fosfórico o similares. Entre esos residuos ácidos, se prefiere el
residuo de ácido sulfúrico, particularmente cuando el polipéptido se
emplea como una sustancia que mejora la separación, debido a que la
fosfatasa tiende a estar presente en el analito a medir en una
muestra obtenida a partir de un organismo vivo. Es suficiente que
los residuos de ácido fuerte estén presentes en el polipéptido en
una cantidad de por lo menos 3 y hasta 30. Cuando el número de
residuos ácidos es demasiado alto, es difícil emplear el polipéptido
como la sustancia que mejora la separación, por ejemplo, en la
separación con un intercambiador aniónico, es difícil la separación
y la elución desde una columna, o similar. Por tanto, cuando el
polipéptido se emplea como la sustancia que mejora la separación, la
cantidad de residuos ácidos se escoge adecuadamente en el intervalo
de por lo general 3 a 30, preferentemente 3 a 20, más
preferentemente 4 a 20, lo más preferido 5 a 15. Considerando la
capacidad de síntesis y similares, la cantidad total de residuos de
aminoácidos se escoge adecuadamente en el intervalo de por lo
general 3 a 30, preferentemente 3 a 20, más preferentemente 4 a 20,
lo más preferible 5 a 15. Cuando la cantidad de residuos ácidos es
menor de 3, se solapan entre sí un pico de separación, por la ayuda
de la sustancia que mejora la separación y un pico de elución debido
a un componente del suero, de modo que la precisión de la medición
(análisis) es menor. Para evitar el solapamiento del pico de
separación por la ayuda de la sustancia que mejora la separación y
el pico de elución debido a un componente en una muestra obtenida a
partir de un organismo vivo, tal como suero, para incrementar
adicionalmente la precisión de la medición, el número de residuos
ácidos es preferentemente 4 o superior, más preferentemente 5 o
superior. Además, cuando se introducen residuos de ácido sulfúrico
como residuos ácidos derivados de un ácido fuerte, la introducción
se lleva a cabo preferentemente utilizando los grupos hidroxilo
fenólicos de los residuos de tirosina, desde el punto de vista de la
estabilidad de los residuos de ácido sulfúrico en una solución
acuosa después de su introducción.
En el polipéptido, los residuos de aminoácidos
que tienen un residuo ácido derivado de un ácido fuerte, no están
particularmente limitados, en tanto que ellos son los obtenidos al
introducir un residuo ácido derivado de un ácido fuerte en cada uno
de los grupos reactivos libres de los residuos de aminoácidos, p.
ej., grupo hidroxilo, grupo amino, grupo imino, grupo tiol, etc.
Este residuo de aminoácido incluye, por ejemplo, residuos de
aminoácidos que tienen un grupo hidroxilo libre, tales como
tirosina, serina, treonina, etc.; residuos de aminoácido que tienen
un grupo amino libre, tales como lisina, arginina, etc.; residuos de
aminoácido que tienen un grupo imino libre, tales como histidina,
triptófano, prolina, oxiprolina, etc.; y residuos de aminoácido que
tienen un grupo tiol libre, tales como cisteína, etc. Cuando se
tiene en cuenta la capacidad para introducir el residuo ácido
derivado de un ácido fuerte, los ejemplos preferibles del residuo de
aminoácido son serina, treonina y tirosina. Los residuos de
aminoácidos en el polipéptido no están particularmente limitados
mientras que sean los obtenidos a partir de aminoácidos
convencionales en el campo de la química peptídica. Ejemplos
preferibles de los mismos son residuos de aminoácidos, tales como
alanina, glicina, \beta-alanina, etc.
El polipéptido puede ser sintetizado por
cualquiera de los siguientes métodos, o similares: (i) un método
para introducir un residuo ácido derivado de un ácido fuerte en cada
uno de al menos tres grupos reactivos libres de un polipéptido que
tiene un número adecuado de grupos reactivos libres (J. Chem. Soc.
Perkin Trans I, (1990), 1739-1744, etc.),
(ii) un método para sintetizar un polipéptido deseado teniendo como
material de síntesis de partida, aminoácidos que tienen el residuo
ácido derivado del ácido fuerte (Chem. Pharm. Bull.,
41(2), (1993), 376-380, etc.).
Considerando el rendimiento del polipéptido deseado, etc., el método
(i) es preferible al método (ii) (particularmente cuando el número
de residuos de aminoácidos es alto). El método anterior (ii), sin
embargo, tiene la siguiente ventaja: puesto que no es necesaria la
sulfatación, un grupo funcional capaz de unirse a una sustancia de
afinidad (p. ej., anticuerpo), tal como un residuo de ácido
maleimidocaproico, se puede introducir directamente en el extremo
N-terminal del polipéptido resultante, de modo que
el polipéptido se puede combinar inmediatamente con la sustancia de
afinidad.
Un método para introducir un residuo ácido
derivado de un ácido fuerte en cada uno de los tres grupos reactivos
de un polipéptido o el grupo reactivo libre de un aminoácido, no
está limitado particularmente mientras que permita la introducción
del residuo ácido derivado de un ácido fuerte en el grupo reactivo
libre, tal como un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo imino,
un grupo tiol o similar.
Más ejemplos específicos del método se
proporcionan a continuación. Un método que comprende hacer
reaccionar un agente de sulfatación (p. ej., HSO_{3} Cl, HSO_{3}
dimetilformamida o HSO_{3} piridina) o un agente de
fosforilación
(p. ej., un haluro de fosforilo, tal como cloruro de fosforilo o un haluro de fósforo, tal como tricloruro de fósforo) con un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre (p. ej., tirosina, serina o treonina) (o un polipéptido que tiene residuos de un aminoácido tal) en una cantidad de 1 a 20 equivalentes por equivalente del grupo hidroxilo libre del aminoácido (o los grupos hidroxilo libres de los residuos de aminoácidos) a 0-40ºC, durante 1 a 24 horas en un disolvente anhidro [p. ej., dimetilformamida (DMF) o dimetil sulfóxido (DMSO)] empleando una sustancia alcalina
(p. ej., piridina, trietilamina o NaH) como catalizador, e introduciendo de este modo un residuo ácido derivado del ácido fuerte en el grupo hidroxilo del residuo de aminoácido (o cada uno de los grupos hidroxilo de los residuos de aminoácidos). Un método que comprende hacer reaccionar un agente de sulfatación (p. ej., HSO_{3}Cl, HSO_{3} dimetilformamida o HSO_{3} piridina) o un agente de fosforilación (p. ej., haluro de fosforilo, tal como cloruro de fosforilo o un haluro de fósforo, tal como tricloruro de fósforo) con un aminoácido que tiene un grupo amino libre (p. ej., lisina o arginina) (o un polipéptido que tiene uno o varios residuos de dicho aminoácido) o un aminoácido que tiene un grupo imino libre
(p. ej., histidina, triptófano, prolina u oxiprolina) (o un polipéptido que tiene uno o varios residuos de dicho aminoácido) en una cantidad de 1 a 20 equivalentes por equivalente del grupo amino o imino libre del aminoácido (o el(los) grupo(s) amino y/o grupo(s) imino libre(s) de los residuos de aminoácidos) a 0-40ºC durante 1 a 24 horas en un disolvente (anhidro) [p. ej., dimetilformamida (DMF) o dimetil sulfóxido (DMSO)] empleando una sustancia alcalina
(p. ej., piridina, trietilamina o NaH) como catalizador, e introduciendo de este modo un residuo ácido derivado del ácido fuerte en el grupo amino y/o imino del residuo de aminoácido (o cada uno de lo(s) grupo(s) amino y/o
grupo(s) imino de los residuos de aminoácidos). Considerando la capacidad de síntesis, la estabilidad del residuo ácido introducido en una solución acuosa, su estabilidad frente a enzimas presentes en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo (p. ej., fosfatasa), etc., el residuo de ácido sulfúrico es más preferible que el residuo ácido derivado de un ácido fuerte.
(p. ej., un haluro de fosforilo, tal como cloruro de fosforilo o un haluro de fósforo, tal como tricloruro de fósforo) con un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre (p. ej., tirosina, serina o treonina) (o un polipéptido que tiene residuos de un aminoácido tal) en una cantidad de 1 a 20 equivalentes por equivalente del grupo hidroxilo libre del aminoácido (o los grupos hidroxilo libres de los residuos de aminoácidos) a 0-40ºC, durante 1 a 24 horas en un disolvente anhidro [p. ej., dimetilformamida (DMF) o dimetil sulfóxido (DMSO)] empleando una sustancia alcalina
(p. ej., piridina, trietilamina o NaH) como catalizador, e introduciendo de este modo un residuo ácido derivado del ácido fuerte en el grupo hidroxilo del residuo de aminoácido (o cada uno de los grupos hidroxilo de los residuos de aminoácidos). Un método que comprende hacer reaccionar un agente de sulfatación (p. ej., HSO_{3}Cl, HSO_{3} dimetilformamida o HSO_{3} piridina) o un agente de fosforilación (p. ej., haluro de fosforilo, tal como cloruro de fosforilo o un haluro de fósforo, tal como tricloruro de fósforo) con un aminoácido que tiene un grupo amino libre (p. ej., lisina o arginina) (o un polipéptido que tiene uno o varios residuos de dicho aminoácido) o un aminoácido que tiene un grupo imino libre
(p. ej., histidina, triptófano, prolina u oxiprolina) (o un polipéptido que tiene uno o varios residuos de dicho aminoácido) en una cantidad de 1 a 20 equivalentes por equivalente del grupo amino o imino libre del aminoácido (o el(los) grupo(s) amino y/o grupo(s) imino libre(s) de los residuos de aminoácidos) a 0-40ºC durante 1 a 24 horas en un disolvente (anhidro) [p. ej., dimetilformamida (DMF) o dimetil sulfóxido (DMSO)] empleando una sustancia alcalina
(p. ej., piridina, trietilamina o NaH) como catalizador, e introduciendo de este modo un residuo ácido derivado del ácido fuerte en el grupo amino y/o imino del residuo de aminoácido (o cada uno de lo(s) grupo(s) amino y/o
grupo(s) imino de los residuos de aminoácidos). Considerando la capacidad de síntesis, la estabilidad del residuo ácido introducido en una solución acuosa, su estabilidad frente a enzimas presentes en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo (p. ej., fosfatasa), etc., el residuo de ácido sulfúrico es más preferible que el residuo ácido derivado de un ácido fuerte.
Como polipéptido que tiene grupos reactivos
libres, tales como grupos hidroxilo, grupos amino, grupos imino,
grupos tioles, etc., que se emplea como material de partida para el
polipéptido que tiene 3 a 30 residuos de ácido fuerte, se puede
utilizar un polipéptido disponible comercialmente o un polipéptido
sintetizado por un método convencional, empleado generalmente en el
campo de la química de péptidos, por ejemplo, el método de éster
activo, método mixto de anhídrido ácido o método azida (Nobuo
Izumiya y col. "Peptide Gosei no Kiso to Jikken" (Teoría y
práctica de la síntesis peptídica), págs. 89-142,
Ene. 20, 1985, Maruzen Co., Ltd.). Para sintetizar un polipéptido
tal, es preferible un grupo protector estable en la siguiente etapa
de sulfatación, como grupo protector para el grupo amino
N-terminal. Ejemplos preferibles del grupo protector
son grupos protectores de tipo uretano, tales como el grupo
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), que se pueden
eliminar bajo condiciones alcalinas. Los grupos protectores para los
grupos reactivos de las cadenas laterales de los aminoácidos o los
residuos de aminoácidos se pueden escoger adecuadamente
considerando, por ejemplo, las condiciones de síntesis del
polipéptido y las condiciones de introducción del residuo ácido
derivado de un ácido fuerte. Ejemplos preferibles de estos grupos
protectores son grupo terc-butilo y grupo
bencilo.
Se puede utilizar cualquier sustancia como
sustancia de afinidad, sin ninguna restricción particular mientras
que tenga afinidad por un analito que se va a medir en una muestra
obtenida a partir de un organismo vivo. Ejemplos específicos de la
sustancia de afinidad son anticuerpos, antígenos y lectinas (p. ej.,
concavalina A, lectina de Lens culinaris, lectina de
Phaseolus vulgaris, aglutinina de Datura stramonium,
lectina de Triticum vulgaris, etc.), que tienen afinidad por
el analito; inhibidores de enzimas [p. ej., amilasa, quinasa de
creatina (CK), transaminasa de glutamicoxalacético (GOT)]; cadenas
de polinucleótidos complementarias a polinucleótidos monocatenarios
de ácidos nucleicos que son analitos que se van a medir; y
receptores de la hormona estimuladora del tiroides, acetilcolina,
ácido glutámico, etc.
Como un método para preparar un producto
combinado de la sustancia de afinidad y el polipéptido (de aquí en
adelante abreviado como "el producto combinado"), se puede
mencionar a modo de ejemplo, un método para unir el grupo reactivo
específico de la sustancia de afinidad con el grupo reactivo
específico del polipéptido; un método para reemplazar el grupo
reactivo específico de la sustancia de afinidad por el polipéptido;
y un método para combinar la sustancia de afinidad y el polipéptido
mediante una sustancia que tiene afinidad por la sustancia de
afinidad (p. ej., anticuerpo, lectina, antígeno, inhibidor, ADN,
etc.). Específicamente, se pueden mencionar a modo de ejemplo todos
los métodos siguientes y la preparación se puede llevar a cabo según
cualquiera de ellos. 1) Métodos convencionales para fijar una
sustancia marcadora a un anticuerpo que se emplea generalmente, por
ejemplo, en enzimoinmunoanálisis convencional (EIA),
radioinmunoanálisis (RIA) y fluoroinmunoanálisis (FIA) (p. ej.,
Yuichi Yamamura "Igaku Jikken Koza Vol. 8", 1ª ed.,
NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971; Akira Kawano "Zusetsu
Keikokotai" 1ª ed., Soft Science, Inc., 1983 y Eiji Ishikawa,
Tadashi Kawai y Kiyoshi Miyai "Koso Men-eki
Sokuteiho" 2ª ed., IGAKU-SHOIN Ltd., 1982). 2)
Métodos convencionales para modificar e introducir sustancias (p.
ej., Ikuzo Uritani, Kensuke Shimura, Michinori Nakamura y Masaru
Funazu "Tanpakushitsu-no Kagakushushoku <Jo>
<Ge>" 1ª ed., GAKKAI-SHUPPAN CENTER Ltd.,
1981; Yudi Inada y col. "Poly(ethylene glicol) Shushoku
Tanpakushitsu" Seikagaku Vol., 62, nº 11, págs.
1351-1362, Asociación Bioquímica Japonesa, 1990 y
George H.K. y Mark M.M. "DNA PROBES" STOCKTON PRESS, 1989).
Ejemplos específicos del método para unir el
grupo reactivo específico de la sustancia de afinidad al grupo
reactivo específico del polipéptido, se proporcionan a continuación.
Se puede mencionar a modo de ejemplo un método que comprende hacer
reaccionar un compuesto en el que un grupo maleimido se une mediante
un espaciador al extremo N-terminal del polipéptido
(el compuesto se abrevia de aquí en adelante como "el compuesto
maleimida") con el grupo SH de un Fab' de anticuerpo, preparado
según un método convencional y preparando de este modo un producto
combinado del polipéptido y la sustancia de afinidad
(anticuerpo).
El compuesto maleimida, esto es, un compuesto que
comprende un grupo maleimido unido mediante un espaciador al extremo
N-terminal del polipéptido de la fórmula [I], puede
estar representado generalmente por la fórmula:
[IV]D-E-(R)_{m}-B
en donde D es un grupo maleimido; E es un
espaciador y R, m y B son como se han definido
arriba.
El compuesto maleimida de la fórmula [IV] se
puede clasificar, por ejemplo, en los dos grupos siguientes:
(1) Compuesto maleimida representado por la
fórmula:
[V]D-E-(R^{1})_{m'}-B
en donde D, E, R^{1}, m' y B son como se han
definido
anteriormente.
(2) Compuesto maleimida representado por la
fórmula:
[VI]D-E-(R^{1})_{m'}-(R^{2})_{n}-B
en donde D, E, R^{1}, R^{2}, m', n y B son
como se han definido
anteriormente.
El espaciador representado por E en estas
fórmulas no está limitado particularmente. Se puede utilizar
cualquier espaciador mientras que permita la fijación del extremo
N-terminal del polipéptido y un grupo maleimido a
los extremos, respectivamente, del espaciador, y no impida la
introducción (o unión) del compuesto maleimida a la sustancia de
afinidad, tal como un anticuerpo. Ejemplos del espaciador son grupos
representados por -R^{4}CO-, en donde R^{4} es un grupo
hidrocarburo divalente. Ejemplos más específicos son grupos
representados por las siguientes fórmulas [VII] a [IX]:
[VII]-(CH_{2})_{p}-CO-
en donde p es un número entero 1 a
10,
en donde q y r son cero o un número entero 1 a
5,
en donde q y r son como se han definido
anteriormente.
Los grupos alquileno, el grupo fenileno y el
grupo ciclohexileno en las fórmulas [VII] a [IX] pueden tener uno o
varios sustituyentes. Los sustituyentes incluyen, por ejemplo,
grupos alquilo inferiores, lineales o ramificados que tienen 1 a 4
átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo, butilo, etc.,
y grupos hidrófilos, tales como hidroxilo, carboxilo, sulfo, amino,
etc.
El compuesto maleimida se puede obtener
fácilmente, por ejemplo, según el siguiente método.
El polipéptido descrito anteriormente, un agente
reticulante divalente que incluye un compuesto que tiene un grupo
maleimido en un extremo y un grupo reactivo con grupo amino en el
otro extremo, en una cantidad de 1 a 100, preferentemente 1 a 50,
más preferentemente 1,2 a 10 moles por mol de grupo amino
N-terminal del polipéptido, y opcionalmente un
acelerador de la reacción en una cantidad de 2 a 5 moles por mol de
dicho grupo amino, se hacen reaccionar a 4-37ºC
durante 0,2 a 10 horas en una solución tampón adecuada que tiene un
pH de 6 a 9 o un disolvente orgánico adecuado. Después, la solución
de la reacción se purifica mediante una cromatografía en columna
adecuada, a partir de la cual se puede obtener el compuesto
maleimida.
El agente reticulante divalente empleado en la
reacción mencionada anteriormente, no está limitado particularmente
mientras que pueda introducir el grupo maleimido en el extremo
N-terminal del polipéptido. Ejemplos de los mismos
son agentes reticulantes que tienen un grupo maleimido y un grupo
succinimida. Ejemplos más específicos son
N-4-maleimido-butirato
de succinimidilo,
N-6-maleimidocaproilato de
succinimidilo,
N-8-maleimidocaprilato de
succinimidilo,
N-11-maleimidoundecanoato de
succinimidilo,
N-4-(2-maleimido-etoxi)succinilato
de succinimidilo,
N-4-maleimido-butirato
de sulfosuccinimidilo,
N-6-maleimidocaproilato de
sulfosuccinimidilo,
N-8-maleimidocaprilato de
sulfosuccinimidilo,
N-11-maleimidoundecanoato de
succinimidilo,
4-(N-maleimido-metil)ciclohexan-1-carboxilato
de succinimidilo,
4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato
de sulfosuccinimidilo, m-maleimidobenzoato de
succinimidilo, m-maleimidobenzoato de
sulfosuccinimidilo,
4-(p-maleimido-fenil)butirato
de succinimidilo,
4-(p-maleimido-fenil)butirato
de sulfosuccinimidilo, etc.
Como acelerador de la reacción se puede mencionar
a modo de ejemplo bases, tales como trietilamina,
\hbox{piridina, etc.}
Como solución tampón con un pH de 6 a 9, empleada
como disolvente para la reacción, se puede mencionar a modo de
ejemplo el tampón fosfato, el tampón
tris(hidroximetil)-aminometano, tampones de
Good [p. ej., tampón
N,N-bis(2-hidroxietil)glicina
(Bicina), el tampón de ácido
2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanosulfónico
(HEPES), el tampón de ácido
3-morfolinopropanosulfónico (MOPS), etc.]. El
disolvente orgánico incluye, por ejemplo, dimetilformamida (DMF) y
dimetilsulfóxido (DMSO).
La cromatografía empleada para purificar el
compuesto maleimida después de completar la reacción, incluye, por
ejemplo, cromatografía en columna con gel, cromatografía en columna
con gel de sílice y cromatografía líquida en columna con gel de
sílice de octadecilo (ODS).
El disolvente orgánico es preferible como
disolvente para la reacción. Esto es debido a que la descomposición
del grupo maleimido es menor en el disolvente orgánico, de modo que
el compuesto maleimida se puede obtener con mayor rendimiento.
La purificación se lleva a cabo preferentemente
mediante cromatografía líquida en columna ODS porque el agente
reticulante divalente surplus y el compuesto maleimida se pueden
separar más fácilmente entre sí.
El compuesto maleimida obtenido de la forma
descrita anteriormente, se puede almacenar de forma estable mediante
tratamiento, tal como concentración hasta sequedad, secado por
congelamiento, etc., y, por tanto, es muy útil como intermediario
para fijar el polipéptido descrito anteriormente a la sustancia de
afinidad adecuada, tal como un anticuerpo.
Un método para combinar el compuesto maleimida y
la sustancia de afinidad para obtener el producto combinado del
polipéptido descrito anteriormente y la sustancia de afinidad, es,
p. ej., el siguiente.
El compuesto maleimida se hace reaccionar con el
grupo SH de un Fab' de anticuerpo, preparado según un método
convencional, a 4-37ºC durante 1 a 16 horas, en una
solución que no priva al anticuerpo de sus propiedades
(p. ej., solución tampón, empleada generalmente en el campo del inmunoensayo), pudiéndose preparar de este modo el producto combinado del polipéptido y la sustancia de afinidad (anticuerpo).
(p. ej., solución tampón, empleada generalmente en el campo del inmunoensayo), pudiéndose preparar de este modo el producto combinado del polipéptido y la sustancia de afinidad (anticuerpo).
Como método para unir el grupo amino del
polipéptido descrito anteriormente, con el grupo amino de la
sustancia de afinidad, se puede mencionar a modo de ejemplo un
método convencional de glutaraldehído. Como método para unir el
grupo amino del polipéptido con la cadena de azúcar de la sustancia
de afinidad, se puede mencionar a modo de ejemplo un método
convencional de ácido periódico que comprende tratar la cadena de
azúcar con el ácido periódico para formar un grupo aldehído y unir
el grupo aldehído al grupo amino del polipéptido.
Aunque el polipéptido descrito anteriormente se
puede introducir en la sustancia de afinidad empleando el grupo
reactivo en la cadena lateral del polipéptido, se une
preferentemente al mismo (o se introduce en el mismo) empleando su
grupo amino N-terminal.
La razón es la siguiente. Puesto que el grupo
amino N-terminal suele ser generalmente único, la
fijación de la sustancia de afinidad empleando el grupo amino
N-terminal da como resultado la combinación del
polipéptido y la sustancia de afinidad en una relación molar de 1:1.
Por tanto, cuando un analito que se va a medir, se separa empleando
el producto combinado resultante, el analito se separa como un pico
aislado, de modo que se puede incrementar más la precisión de la
medición deseada. El compuesto maleimida es una sustancia útil para
preparar un producto combinado tal.
Cuando el producto combinado se prepara
utilizando el grupo amino N-terminal, es preferible
que no se introduzca ningún residuo ácido derivado de un ácido
fuerte en el residuo del aminoácido N-terminal del
polipéptido. Esto es debido a que el rendimiento del producto
combinado deseado es mayor cuando el polipéptido que no tiene
residuo ácido introducido en el residuo del aminoácido
N-terminal, se combina con la sustancia de
afinidad.
Un procedimiento para medir un componente de un
organismo vivo empleando el producto combinado (de aquí en adelante
abreviado como "el procedimiento de medición de la presente
invención") no está limitado particularmente en tanto que el
procedimiento hace posible la realización de una medición deseada
empleando el producto combinado. Ejemplos específicos de los mismos
son los siguientes procedimientos.
(1) Un procedimiento para medir la cantidad de un
analito que se va a medir en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo que emplea una reacción no competitiva (procedimiento
de medición (1)).
En primer lugar, una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo y que contiene un analito a medir, una sustancia
de afinidad marcada con una sustancia detectable (de aquí en
adelante, abreviada como "sustancia de afinidad marcada") y el
producto combinado (los sitios de unión de la sustancia de afinidad
marcada y el producto combinado, respectivamente en el analito son
diferentes) se hacen reaccionar por mezcla, si es necesario, en una
solución tampón adecuada, para formar un complejo por combinación
del analito, la sustancia de afinidad marcada y el producto
combinado. A continuación, el complejo se separa de la sustancia de
afinidad marcada y libre mediante un método que aplica carga
negativa, por ejemplo, una máquina o un instrumento que tiene una
acción de intercambio aniónico, incluyendo un aparato de HPLC
equipado con una columna cargada con un material empaquetado para la
cromatografía de intercambio aniónico, una membrana de intercambio
aniónico o un tubo de reacción que tiene una acción de intercambio
aniónico. Posteriormente, se determina la cantidad de sustancia
detectable contenida en el complejo separado, mediante un método de
medición adecuado de las propiedades de la sustancia detectable.
Separadamente, la medición se realiza del mismo modo que el descrito
anteriormente, empleando muestras que contienen concentraciones
conocidas del analito y se obtiene una curva de calibración que
muestra la relación entre la cantidad de analito y la cantidad de
sustancia detectable en el complejo. Empleando la curva de
calibración, se puede medir la cantidad de analito correspondiente a
la cantidad de sustancia detectable en el complejo, pudiéndose medir
de este modo la cantidad de analito en la muestra.
En la reacción mencionada anteriormente, las
concentraciones de la sustancia de afinidad marcada y el producto
combinado empleado para formar el complejo, varían dependiendo de un
valor en el cual se fija el límite de la medición del analito en la
muestra. Generalmente se prefiere que la sustancia de afinidad
marcada y el producto combinado estén presentes en la solución de la
reacción en concentraciones que no son menores a una concentración
con la que se pueden unir al analito completo con una concentración
correspondiente al límite de la medición, preferentemente dos veces
o más, más preferentemente 5 veces o más, lo más preferible 10 veces
o más veces superior a la concentración.
Cuando el analito mismo es una sustancia medible
o detectable por algún método, la cantidad de analito en la muestra
se puede medir de forma similar realizando la reacción mencionada
anteriormente sin la sustancia de afinidad marcada, y midiendo la
cantidad de analito en el complejo resultante según un método
adecuado para las propiedades del analito.
(2) Un procedimiento para medir la cantidad de un
analito que se va a medir en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo, que emplea una reacción competitiva (procedimiento
de medición (2)).
En primer lugar, una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo y que contiene un analito que se va a medir, un
analito marcado con una sustancia detectable (de aquí en adelante
abreviado como "analito marcado") y el producto combinado, se
hacen reaccionar por mezcla, si es necesario, en una solución tampón
adecuada para formar un complejo del analito y del producto
combinado y un complejo del analito marcado y del producto combinado
(de aquí en adelante abreviado como "complejo marcado"). A
continuación, el complejo marcado se separa del analito marcado
libre por un método de aplicación de carga negativa, por ejemplo,
una máquina o un instrumento que tiene acción de intercambio
aniónico que incluye un aparato de HPLC equipado con una columna
cargada con un material empaquetado para la cromatografía de
intercambio aniónico, una membrana de intercambio aniónico o un tubo
de reacción que tiene una acción de intercambio aniónico.
Posteriormente, la cantidad de sustancia detectable contenida en el
complejo marcado así separado, se determina según un método de
medición adecuado para las propiedades de la sustancia detectable.
Separadamente, la medición se realiza de la misma forma que se ha
descrito anteriormente, empleando muestras que contienen
concentraciones conocidas del analito y obteniendo de este modo una
curva de calibración que muestra la relación entre la cantidad de
analito y la cantidad de sustancia detectable en el complejo
marcado. Empleando la curva de calibración, se determina la cantidad
de analito que se corresponde con la cantidad de sustancia
detectable en el complejo marcado, pudiéndose medir de este modo la
cantidad de analito en la muestra.
En la reacción mencionada anteriormente, las
concentraciones del producto combinado y el analito marcado empleado
para formar el complejo marcado, no están limitadas particularmente
y se pueden determinar adecuadamente, dependiendo de los valores en
los que se fija el límite de la medición del analito y la
sensibilidad de la medición del analito, respectivamente. Sin
embargo, la concentración del analito marcado utilizado no debe ser
menor que una concentración en la que el analito marcado se puede
unir al producto combinado completo que está presente en la solución
de la reacción.
(3) Un procedimiento de medición en el que los
analitos que se van a medir en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo son dos o más sustancias que tienen la misma acción y
la misma característica química detectable (procedimiento de
medición (3)).
En primer lugar, una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo y que contiene analitos que se van a medir, se
hace reaccionar con una sustancia que se une específicamente al
menos con uno de los analitos, pero no se une con, al menos uno de
los otros analitos y que tiene el polipéptido descrito anteriormente
unido a la misma (o introducido en la misma) (la sustancia se
abrevia de aquí en adelante como "producto combinado A"),
mezclando, si es necesario, en una solución tampón adecuada. De este
modo, se forma un complejo de analito(s) específico(s)
en la muestra y el producto combinado A. A continuación, el complejo
se separa del(de los) analito(s) libre(s) por
un método que aplica carga negativa, por ejemplo, una máquina o un
instrumento que tiene una función de intercambio aniónico que
incluye un aparato de HPLC equipado con una columna cargada con un
material de empaquetamiento para la cromatografía de intercambio
aniónico, una membrana de intercambio aniónico o un tubo de reacción
que tiene acción de intercambio aniónico. Subsecuentemente, se
determina la cantidad de analito(s) contenido(s) en el
complejo separado o la cantidad de analito(s) libre(s)
o ambas, mediante un método de medición adecuado para las
propiedades de los analitos. Separadamente, se realiza la medición
del mismo modo que se ha descrito anteriormente, por ejemplo,
empleando muestras que contienen concentraciones conocidas del
analito y se obtiene una curva de calibración que muestra la
relación entre la cantidad del analito y el valor medido realmente
obtenido de la propiedad del analito en el complejo. Empleando la
curva de calibración, se determina la cantidad de analito
correspondiente al valor medido, pudiéndose medir de este modo
cualquiera de los analitos en la muestra.
En la reacción mencionada anteriormente, la
concentración del producto combinado A, empleado para formar el
complejo, no está particularmente limitada y se puede determinar
adecuadamente, dependiendo de los valores en los que se fija el
límite de la medición del analito y la sensibilidad de la medición
para el analito, respectivamente.
(4) Un procedimiento de medición en el que los
analitos que se van a medir en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo, son dos o más sustancias que tienen la misma acción
o que tienen diferentes acciones a pesar de sus estructuras
similares (procedimiento de medición (4)).
En primer lugar, una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo y que contiene analitos que se van a medir, se
hace reaccionar con una sustancia que tiene afinidad por todos los
analitos (de aquí en adelante abreviada como "sustancia de
afinidad A") que se ha marcado con una sustancia detectable (de
aquí en adelante abreviada como "sustancia de afinidad marcada
A") y una sustancia que tiene afinidad por lo menos un analito
específico entre los analitos y que tiene el polipéptido descrito
anteriormente introducido en la misma (la sustancia se abrevia de
aquí en adelante como "producto combinado B"), mezclando, si es
necesario, en una solución tampón adecuada. De este modo, se forma
un complejo de analito(s) y la sustancia de afinidad marcada
A (de aquí en adelante abreviado como "complejo A") y un
complejo del(de los) analito(s) específico(s),
la sustancia de afinidad marcada A y el producto combinado B (de
aquí en adelante abreviado como "complejo B"). A continuación,
el complejo A, el complejo B y la sustancia de afinidad marcada A
libre se separan entre sí por un método que aplica carga negativa,
por ejemplo, una máquina o un instrumento que tiene acción de
intercambio aniónico que incluye un aparato de HPLC equipado con una
columna cargada con un material de empaquetamiento para la
cromatografía de intercambio aniónico, una membrana de intercambio
aniónico o un tubo de reacción que tiene acción de intercambio
aniónico. Subsecuentemente, se determina la cantidad de sustancia
detectable contenida en el complejo A separado o la cantidad de
sustancia detectable contenida en el complejo B separado o ambas,
mediante un método de medición adecuado para las propiedades de la
sustancia detectable. Separadamente, se realiza la medición del
mismo modo que se ha descrito anteriormente, por ejemplo, empleando
muestras que contienen concentraciones conocidas del analito y se
obtiene una curva de calibración que muestra la relación entre la
cantidad del analito y la cantidad de sustancia detectable contenida
en el complejo A y/o la cantidad de sustancia detectable contenida
en el complejo B. Empleando la curva de calibración, se determina la
cantidad de analito correspondiente a la cantidad de sustancia
detectable en el(los) complejo(s), pudiéndose medir de
este modo cualquiera de los analitos en la muestra.
Cuando la sustancia de afinidad A misma es
medible o detectable por algún método, se puede medir de forma
similar la cantidad de analito en la muestra, realizando la reacción
mencionada anteriormente empleando la sustancia de afinidad A no
marcada con la sustancia detectable y medir la cantidad de sustancia
de afinidad A en el complejo resultante por un método adecuado para
las propiedades de la sustancia de afinidad A.
(5) Un procedimiento de medición en el que los
analitos que se van a medir en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo, son dos sustancias que tienen la misma acción o que
tienen diferentes acciones a pesar de sus estructuras similares
(procedimiento de medición (5)).
En primer lugar, una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo y que contiene analitos que se van a medir, se
hace reaccionar con una sustancia de afinidad A, una sustancia que
tiene afinidad por el analito 1 en la muestra y que tiene un
polipéptido 1, tal y como se ha descrito anteriormente, introducido
en la misma (la sustancia se abrevia de aquí en adelante como
"producto combinado C"), y una sustancia que tiene afinidad por
el analito 2 en la muestra y que tiene un polipéptido 2, tal y como
se ha descrito anteriormente, introducido en la misma (la sustancia
se abrevia de aquí en adelante como "producto combinado D"),
mezclando, si es necesario, en una solución tampón adecuada. De este
modo, se forma un complejo del analito 1, el producto combinado C y
la sustancia de afinidad marcada A (de aquí en adelante abreviado
como "complejo C") y un complejo del analito 2, el producto
combinado D y la sustancia de afinidad marcada A (abreviado de aquí
en adelante como "complejo D"). A continuación, el complejo C,
el complejo D y la sustancia de afinidad marcada A libre, se separan
entre sí basándose en la diferencia de propiedades entre los
polipéptidos 1 y 2, por un método que aplica carga negativa, por
ejemplo, una máquina o un instrumento que tiene acción de
intercambio aniónico que incluye un aparato de HPLC equipado con una
columna cargada con un material de empaquetamiento para la
cromatografía de intercambio aniónico, una membrana de intercambio
aniónico o un tubo de reacción que tiene acción de intercambio
aniónico. Subsecuentemente, se determina la cantidad de sustancia
detectable contenida en el complejo C separado o la cantidad de
sustancia detectable contenida en el complejo D separado o ambas,
mediante un método de medición adecuado para las propiedades de la
sustancia detectable. Separadamente, se realiza la medición del
mismo modo que se ha descrito anteriormente, por ejemplo, empleando
muestras que contienen concentraciones conocidas del analito y se
obtiene una curva de calibración que muestra la relación entre la
cantidad del analito 1 (o 2) y la cantidad de sustancia detectable
contenida en el complejo C y/o la cantidad de sustancia detectable
contenida en el complejo D. Empleando la curva de calibración, se
determina la cantidad de analito correspondiente a la cantidad de
sustancia detectable en el(los) complejo(s),
pudiéndose medir de este modo la cantidad de cualquiera de los
analitos en la muestra.
Cuando la sustancia de afinidad A misma es
medible o detectable por algún método, se puede medir de forma
similar la cantidad de analito en la muestra realizando la reacción
mencionada anteriormente, empleando la sustancia de afinidad A no
marcada con la sustancia detectable y medir la cantidad de sustancia
de afinidad A en el complejo resultante por un método adecuado para
las propiedades de la sustancia de afinidad A.
(6) Un método de medición en el que los analitos
que se van a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo
vivo son dos o más formas de glicoproteínas que son diferentes en la
estructura de la cadena de azúcar pero tienen sustancialmente la
misma estructura proteica (procedimiento de medición (6)).
En primer lugar, una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo y que contiene dos o más formas de glicoproteínas
que se van a medir, se hace reaccionar con una lectina capaz de
reconocer la estructura de la cadena de azúcar de al menos uno de
estos analitos glicoproteicos que se van a medir y un producto
combinado del polipéptido descrito anteriormente y un anticuerpo que
tiene la propiedad de unirse a todos los analitos glicoproteicos,
pero que no se une al(a los) analito(s)
glicoproteico(s) que tiene(n) la lectina introducida
en el mismo (el producto combinado se abrevia de aquí en adelante
como "polipéptido-anticuerpo combinado") y un
anticuerpo que se puede unir a todos los analitos glicoproteicos
incluyendo el(los) analito(s) glicoproteico(s)
que tiene(n) la lectina introducida en el mismo (este
anticuerpo se abrevia de aquí en adelante como "anticuerpo
anti-glicoproteína marcado"). De este modo, se
forma un complejo de glicoproteína(s), la lectina y el
anticuerpo anti-glicoproteína marcado, y un complejo
de glicoproteína(s), el
polipéptido-anticuerpo combinado y el anticuerpo
anti-glicoproteína marcado. A continuación, estos
complejos se separan del anticuerpo
anti-glicoproteína marcada libre por un método que
aplica carga negativa, por ejemplo, una máquina o un instrumento que
tiene acción de intercambio aniónico que incluye un aparato de HPLC
equipado con una columna cargada con un material de empaquetamiento
para la cromatografía de intercambio aniónico, una membrana de
intercambio aniónico o un tubo de reacción que tiene acción de
intercambio aniónico. Subsecuentemente, se determina la cantidad de
sustancia detectable contenida en cada uno o en ambos de los
complejos separados, mediante un método de medición adecuado para
las propiedades de la sustancia detectable. Separadamente, se
realiza la medición del mismo modo que se ha descrito anteriormente,
por ejemplo, empleando muestras que contienen concentraciones
conocidas del analito glicoproteico y se obtiene una curva de
calibración que muestra la relación entre la cantidad del analito
glicoproteico y la cantidad de sustancia detectable contenida en
cada uno o en ambos complejos. Empleando la curva de calibración, se
determina la cantidad de analito glicoproteico correspondiente a la
cantidad de sustancia detectable en el(los)
complejo(s), pudiéndose medir de este modo la cantidad de
cualquiera de los analitos glicoproteicos en la muestra.
Cuando el analito glicoproteico mismo es medible
(detectable) por algún método, se puede realizar la medición
mencionada anteriormente, por supuesto, sin el anticuerpo
anti-glicoproteína marcado.
Un analito en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo que se puede medir según cualquiera de los
procedimientos de medición (1) y (2), desarrollados para aplicar la
presente invención, no está particularmente limitado mientras que
cumpla la siguiente condición i) o ii). i) Existe una sustancia que
puede formar un complejo estable con el analito mediante una alta
afinidad entre la sustancia y el analito y dicha sustancia se puede
medir (detectar) por sí misma mediante algún método o se puede
marcar con alguna sustancia detectable. ii) El analito mismo se
puede marcar con alguna sustancia detectable, y existe una sustancia
que puede formar un complejo marcado estable con el analito,
mediante una alta afinidad entre la sustancia y el analito. Ejemplos
típicos del analito son proteínas, péptidos, ácidos nucleicos,
cadenas de azúcar, lípidos, hormonas, fármacos, etc., que están
contenidos en muestras obtenidas a partir de organismos vivos, por
ejemplo, fluidos corporales tales como suero, sangre, plasma, orina
y similares, linfocitos, hemocitos y diversas células. Ejemplos más
específicos del analito son marcadores tumorales, tales como
\alpha-fetoproteína (AFP), CA19-9, antígeno específico de la próstata (PSA), antígeno carcinoembriónico (CEA), sustancias que tienen cadenas de azúcar especiales producidas por células cancerosas, y similares; proteínas séricas tales como inmunoglobulina A (IgA), inmunoglobulina E (IgE), inmunoglobulina G (IgG), \beta_{2}-microglobulina, albúmina, ferritina y similares; péptidos, tales como péptido C, angiotensina I y similares; enzimas tales como amilasa, fosfatasa alcalina, \gamma-glutamiltransferasa (\gamma-GTP) y similares; anticuerpos antivíricos contra virus observados clínicamente, tales como virus de la rubéola, herpesvirus, virus de la hepatitis, virus ATL, virus del SIDA y similares; ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) de patógenos, tales como virus y similares, o polinucleótidos monocatenarios que constituyen ácidos nucleicos descritos anteriormente; sustancias antigénicas obtenidas de patógenos tales como virus y similares; anticuerpos reactivos con alergenos, tales como polen de árboles y plantas
(p. ej., criptomeria), polvo de las casas y similares; lípidos, tales como lipoproteínas y similares; proteasas, tales como tripsina, plasmina, proteasa de serina y similares; hormonas, tales como insulina, gonadotropina coriónica humana (hCG), tiroxina (T4), triyodoatironina (T3), prolactina, hormona estimuladora del tiroides (TSH), y similares; fármacos tales como digoxina, fenitoina, morfina, nicotina y similares; y receptores de la hormona estimuladora del tiroides, acetilcolina, ácido glutámico, etc.
\alpha-fetoproteína (AFP), CA19-9, antígeno específico de la próstata (PSA), antígeno carcinoembriónico (CEA), sustancias que tienen cadenas de azúcar especiales producidas por células cancerosas, y similares; proteínas séricas tales como inmunoglobulina A (IgA), inmunoglobulina E (IgE), inmunoglobulina G (IgG), \beta_{2}-microglobulina, albúmina, ferritina y similares; péptidos, tales como péptido C, angiotensina I y similares; enzimas tales como amilasa, fosfatasa alcalina, \gamma-glutamiltransferasa (\gamma-GTP) y similares; anticuerpos antivíricos contra virus observados clínicamente, tales como virus de la rubéola, herpesvirus, virus de la hepatitis, virus ATL, virus del SIDA y similares; ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) de patógenos, tales como virus y similares, o polinucleótidos monocatenarios que constituyen ácidos nucleicos descritos anteriormente; sustancias antigénicas obtenidas de patógenos tales como virus y similares; anticuerpos reactivos con alergenos, tales como polen de árboles y plantas
(p. ej., criptomeria), polvo de las casas y similares; lípidos, tales como lipoproteínas y similares; proteasas, tales como tripsina, plasmina, proteasa de serina y similares; hormonas, tales como insulina, gonadotropina coriónica humana (hCG), tiroxina (T4), triyodoatironina (T3), prolactina, hormona estimuladora del tiroides (TSH), y similares; fármacos tales como digoxina, fenitoina, morfina, nicotina y similares; y receptores de la hormona estimuladora del tiroides, acetilcolina, ácido glutámico, etc.
La sustancia de afinidad para un analito que se
va a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo que
se emplea para preparar la sustancia de afinidad marcada en el
procedimiento de medición (1), desarrollada aplicando la presente
invención, no está particularmente limitada mientras que forme un
complejo estable con el analito mediante una alta afinidad entre la
sustancia de afinidad y el analito y, si es necesario, la sustancia
de afinidad se puede medir o detectar por sí misma según algún
método o se puede marcar con alguna sustancia medible o detectable.
La sustancia de afinidad incluye, por ejemplo, anticuerpos contra
sustancias que tienen antigenicidad que incluyen haptenos; antígenos
contra anticuerpos; lectinas que tienen afinidad por cadenas de
azúcar que tienen una estructura específica, tales como concavalina
A, lectina de Lens culinaris, lectina de Phaseolus
vulgaris, aglutinina de Datura stramonium, lectina de
Triticum vulgaris, y similares; inhibidores de enzimas
específicas, tales como
\alpha_{1}-anti-tripsina para
tripsina, \alpha_{2}-macroglobulina para
plasmina, \alpha_{2}-macroglobulina y
\alpha_{1}-antiquimotripsina para la proteasa de
serina y similares; cadenas de polinucleótidos complementarias a
polinucleótidos monocatenarios que son analitos que se van a medir
en muestras obtenidas a partir de organismos vivos; y receptores de
hormonas.
La sustancia de afinidad para un analito que se
va a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo que
se emplea para preparar el producto combinado en los procedimientos
de medición (1) y (2), desarrollados aplicando la presente
invención, no está particularmente limitada mientras que forme un
complejo estable con el analito o el analito marcado, o un complejo
del analito y la sustancia de afinidad marcada, por una alta
afinidad entre la sustancia de afinidad y el analito o el analito
marcado o el complejo. La sustancia de afinidad incluye, por
ejemplo, anticuerpos contra sustancias que tienen antigenicidad que
incluyen haptenos; antígenos contra anticuerpos; lectinas que tienen
afinidad por cadenas de azúcar que tienen una estructura específica,
tales como concavalina A, lectina de Lens culinaris, lectina
de Phaseolus vulgaris, aglutinina de Datura
stramonium, lectina de Triticum vulgaris, y similares;
inhibidores de enzimas específicas, tales como
\alpha_{1}-antitripsina para tripsina,
\alpha_{2}-macroglobulina para plasmina,
\alpha_{2}-macroglobulina para la proteasa de serina y similares; y cadenas de polinucleótidos complementarias a polinucleótidos monocatenarios que son analitos que se van a medir en muestras obtenidas a partir de organismos vivos (el sitio de unión para estas sustancias es diferente del de la sustancia de afinidad empleada para preparar la sustancia de afinidad marcada).
\alpha_{2}-macroglobulina para la proteasa de serina y similares; y cadenas de polinucleótidos complementarias a polinucleótidos monocatenarios que son analitos que se van a medir en muestras obtenidas a partir de organismos vivos (el sitio de unión para estas sustancias es diferente del de la sustancia de afinidad empleada para preparar la sustancia de afinidad marcada).
Los analitos en una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo que se puede medir mediante el procedimiento de
medición (3), desarrollado aplicando la presente invención, no están
particularmente limitados mientras que sean medibles por sí mismos o
detectables según algún método y exista una sustancia que pueda
formar un complejo estable con al menos uno de los analitos,
mediante una alta afinidad entre la sustancia y el(los)
analito(s) pero no se una al menos con uno de los otros
analitos. Ejemplos típicos de los analitos son enzimas y similares
que están contenidas en muestras obtenidas a partir de organismos
vivos, por ejemplo, fluidos corporales tales como suero, sangre,
plasma, orina y similares, linfocitos, hemocitos y diversas células.
Ejemplos más específicos de los analitos son enzimas, tales como
amilasa, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida,
\gamma-glutamiltransferasa
(\gamma-GTP), lipasa, quinasa de creatina (CK),
deshidrogenasa de lactato (LDH), transaminasa de
glutámico-oxalacético (GOT), transaminasa de
glutámico-pirúvico (GPT), renina, quinasa de
proteína (PK), quinasa de tirosina, etc.
La sustancia de afinidad para el(los)
analito(s) específico(s) que se va a medir en una
muestra obtenida a partir de un organismo vivo que se emplea para
preparar el producto combinado A, en el procedimiento de medición
(3) desarrollado aplicando la presente invención, no está
particularmente limitada mientras que pueda formar un complejo
estable con al menos uno de los analitos que se van a medir en la
muestra mediante una alta afinidad entre la sustancia de afinidad y
el(los) analito(s), pero no se una al menos con uno de
los otros analitos. La sustancia de afinidad incluye, por ejemplo,
anticuerpos contra estructuras parciales específicas o determinantes
antigénicos de sustancias que tienen antigenicidad (incluyendo
haptenos); lectinas que tienen afinidad por cadenas de azúcar que
tienen una estructura específica, tales como concavalina A, lectina
de Lens culinaris, lectina de Phaseolus vulgaris,
aglutinina de Datura stramonium, lectina de Aleuria
aurantia, lectina de Ricinus communis, lectina de
Arachis hypogaea, lectina de Triticum vulgaris, etc.;
e inhibidores de enzimas tales como amilasa, quinasa de creatina
(CK), transaminasa de glutámico-oxalacético (GOT),
etc.
Los analitos en una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo que se puede medir por el procedimiento de
medición (4), desarrollado aplicando la presente invención, no están
particularmente limitados mientras que cumplan las siguientes
condiciones i) e ii). i) Existe una sustancia que se une a todos los
analitos en la muestra y que tiene por sí misma una propiedad
detectable según algún método o se puede marcar con una sustancia
detectable. ii) Existe una sustancia que puede formar un complejo
estable con al menos uno de los analitos mediante una alta afinidad
entre la sustancia y el(los) analito(s), pero que no
se une al menos con uno de los otros analitos. Ejemplos típicos de
los analitos son enzimas, sustancias fisiológicamente activas,
antígenos asociados a tumores, sustancias que tienen una cadena de
azúcar, etc., que están contenidos en muestras obtenidas de
organismos vivos, por ejemplo, fluidos corporales, tales como suero,
sangre, plasma, orina y similares, linfocitos, hemocitos y diversas
células. Ejemplos más específicos de los analitos son
preferentemente enzimas tales como amilasa, fosfatasa alcalina,
fosfatasa ácida, \gamma-glutamiltransferasa
(\gamma-GTP), lipasa, quinasa de creatina (CK),
deshidrogenasa de lactato (LDH), transaminasa de
glutámico-oxalacético (GOT), transaminasa de
glutámico-pirúvico (GPT), renina, quinasas de
proteínas, quinasa de tirosina, etc.; sustancias activas
fisiológicamente, tales como hormonas esteroides, gonadotropina
coriónica humana (hCG), prolactina, hormona estimuladora del
tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), etc.; y antígeno asociado
a tumores, tal como antígeno específico de próstata (PSA),
\alpha_{2}-macroglobulina, antígeno
carcinoembriónico (CEA),
\alpha-fetoproteína, etc.
\alpha-fetoproteína, etc.
La sustancia de afinidad para analitos que se van
a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo que se
emplea para preparar la sustancia de afinidad marcada A en el
procedimiento de medición (4), desarrollado aplicando la presente
invención, no está limitada particularmente mientras que se pueda
unir a todos los analitos en la muestra y tenga por sí misma una
propiedad detectable según algún método o se pueda marcar con una
sustancia detectable. Ejemplos específicos de la sustancia de
afinidad son anticuerpos contra estructuras parciales específicas o
determinantes antigénicos de sustancias que tienen antigenicidad
incluyendo haptenos; lectinas que tienen afinidad por cadenas de
azúcar que tienen una estructura específica, tales como concavalina
A, lectina de Lens culinaris, lectina de Phaseolus
vulgaris, aglutinina de Datura stramonium, lectina de
Aleuria aurantia, lectina de Ricinus communis, lectina de
Arachis hypogaea, lectina de Triticum vulgaris, etc.;
e inhibidores de enzimas tales como amilasa, quinasa de creatina
(CK), transaminasa de glutámico-oxalacético (GOT),
etc.
La sustancia que tiene afinidad hacia
analito(s) específico(s) que se van a medir en una
muestra obtenida a partir de un organismo vivo que se emplea para
preparar el producto combinado B en el procedimiento de medición
(4), desarrollado aplicando la presente invención, no está
particularmente limitada mientras que cumpla las siguientes
condiciones i) e ii) o iii). i) No inhibe una reacción para formar
un complejo de analito(s) y sustancia de afinidad marcada A y
libre y una reacción para detectar una sustancia detectable (o la
sustancia de afinidad A) en el complejo. ii) Tiene afinidad por
un(os) analito(s) específico(s) en la muestra.
iii) Cuando la sustancia de afinidad marcada A tiene una sustancia
detectable introducida dentro de la misma, la sustancia de afinidad
para el(los) analito(s) específico(s) en la
muestra tiene afinidad por esta sustancia detectable. Ejemplos
específicos preferibles de la sustancia de afinidad para
el(los) analito(s) específico(s) en la muestra,
son anticuerpos y lectinas (p. ej., concavalina A, lectina de
Lens culinaris, lectina de Phaseolus vulgaris,
aglutinina de Datura stramonium, lectina de Triticum
vulgaris, etc.) (el sitio de unión de estas sustancias es
diferente del sitio de unión de la sustancia de afinidad A) que
tienen afinidad por el(los) analito(s)
específico(s); y anticuerpos y lectinas (p. ej., concavalina
A, lectina de Lens culinaris, lectina de Phaseolus
vulgaris, aglutinina de Datura stramonium, lectina de
Triticum vulgaris, etc.) que tienen afinidad por la sustancia
de afinidad A o la sustancia detectable.
Los analitos en una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo que se pueden medir mediante el procedimiento de
medición (5), desarrollado aplicando la presente invención, no están
particularmente limitados mientras que cumplan las siguientes
condiciones i) e ii) o iii). i) Existe una sustancia que se une a
todos los analitos en la muestra y que tiene por sí misma una
propiedad detectable por algún método o se puede marcar con una
sustancia detectable. ii) Existe una sustancia que puede formar un
complejo estable con un analito 1 en la muestra mediante una alta
afinidad entre la sustancia y el analito 1, pero no se une a un
analito 2 en la muestra. iii) Existe una sustancia que forma un
complejo estable con el analito 2, mediante una alta afinidad entre
la sustancia y el analito 2, pero no se une al analito 1. Ejemplos
típicos de los analitos son enzimas, sustancias fisiológicamente
activas, antígenos asociados a tumores, sustancias que tienen una
cadena de azúcar, etc., que están contenidos en muestras obtenidas a
partir de organismos vivos, por ejemplo, fluidos corporales tales
como suero, sangre, plasma, orina y similares, linfocitos, hemocitos
y diversas células. Ejemplos más específicos de los analitos son
preferentemente enzimas tales como amilasa, fosfatasa alcalina,
fosfatasa ácida, \gamma-glutamiltransferasa
(\gamma-GTP), lipasa, quinasa de creatina (CK),
deshidrogenasa de lactato (LDH), transaminasa de
glutámico-oxalacético (GOT), transaminasa de
glutámico-pirúvico (GPT), renina, quinasas de
proteínas, quinasa de tirosina, etc.; sustancias activas
fisiológicamente, tales como hormonas esteroides, gonadotropina
coriónica humana (hCG), prolactina, hormona estimuladora del
tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), etc.; y antígeno asociado
a tumores, tal como antígeno específico de próstata (PSA),
\alpha_{2}-macroglobulina, antígeno
carcinoembriónico (CEA), \alpha-fetoproteína,
etc.
La sustancia de afinidad para analitos que se van
a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo que se
emplea para preparar la sustancia de afinidad marcada A en el
procedimiento de medición (5), desarrollado aplicando la presente
invención, no está particularmente limitada mientras que se pueda
unir a todos los analitos en la muestra y tenga por sí misma una
propiedad detectable según algún método o se pueda marcar con una
sustancia detectable. Ejemplos específicos de la sustancia de
afinidad son anticuerpos contra estructuras parciales específicas o
determinantes antigénicos de sustancias que tienen antigenicidad
(incluyendo haptenos); lectinas que tienen afinidad por cadenas de
azúcar que tienen una estructura específica, tales como concavalina
A, lectina de Lens culinaris, lectina de Phaseolus
vulgaris, aglutinina de Datura stramonium, lectina de
Aleuria aurantia, lectina de Ricinus communis, lectina
de Arachis hypogaea, lectina de Triticum vulgaris,
etc.; e inhibidores de enzimas, tales como amilasa, quinasa de
creatina (CK) y transaminasa de
glutámico-oxalacético (GOT), etc.
La sustancia que tiene afinidad por el analito
específico 1 ó 2 que se va a medir en una muestra obtenida a partir
de un organismo vivo que se emplea para preparar el producto
combinado C o D, respectivamente en el procedimiento de medición
(5), desarrollado aplicando la presente invención, no está
particularmente limitada mientras que cumpla las siguientes
condiciones i) e ii). i) No inhibe una reacción para formar un
complejo del analito 1 ó 2 y la sustancia de afinidad marcada A y
libre y una reacción para detectar una sustancia detectable (o la
sustancia de afinidad A) en el complejo. ii) Tiene afinidad por el
analito específico 1 ó 2. Ejemplos específicos preferibles de la
sustancia de afinidad para el analito específico 1 ó 2 son los
siguientes: anticuerpos y lectinas (p. ej., concavalina A, lectina
de Lens culinaris, lectina de Phaseolus vulgaris,
aglutinina de Datura stramonium, lectina de Triticum
vulgaris, etc.) (el sitio de unión de estas sustancias es
diferente del sitio de unión de la sustancia de afinidad A) que
tienen afinidad por el analito específico 1 ó 2; y anticuerpos y
lectinas (p. ej., concavalina A, lectina de Lens culinaris,
lectina de Phaseolus vulgaris, aglutinina de Datura
stramonium, lectina de Triticum vulgaris, etc.) que
tienen afinidad por la sustancia de afinidad A o la sustancia
detectable.
La lectina empleada en el procedimiento de
medición (6) desarrollado aplicando la presente invención, no está
particularmente limitada y se puede seleccionar adecuadamente una
lectina que tenga capacidad para reconocer una estructura de cadena
de azúcar objeto, a partir de diversas lectinas, tales como
concavalina A, lectina de Lens culinaris, lectina de
Phaseolus vulgaris, aglutinina de Datura stramonium,
lectina de Triticum vulgaris, etc.
Como anticuerpo empleado para preparar el
polipéptido-anticuerpo combinado y el anticuerpo
anti-glicoproteína marcado, respectivamente, en el
procedimiento de medición (6), desarrollado para aplicar la presente
invención, se puede utilizar uno de los siguientes anticuerpos
policlonales y anticuerpos monoclonales, mientras que tengan las
propiedades descritas anteriormente: p. ej. anticuerpos policlonales
preparados inmunizando animales, tales como caballo, ganado, oveja,
conejo, cabra, rata, ratón etc. con un(os) analito(s)
a medir, de acuerdo con un método convencional, por ejemplo, el
método descrito por Tadashi Matsuhashi y col.
"Men-ekigaku Jikken Nyumon" 2ª ed.,
GAKKAI-SHUPPAN CENTER Ltd., 1981, etc., y
anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas obtenidos
mediante fusión de células procedentes de una línea tumoral de
ratón, junto con células del bazo de ratón, inmunizado previamente
con un(os) analito(s) que se va a medir, de acuerdo
con el método convencional, es decir, el método de fusión celular
establecido por G. Kohler y C. Milstein (Nature, 256, 495,
1975). Estos anticuerpos policlonales y/o monoclonales se pueden
utilizar individualmente o en una combinación adecuada de dos o más
de los mismos.
Como glicoproteína que se puede separar y medir
mediante el procedimiento de medición (6), desarrollado aplicando la
presente invención, se puede mencionar a modo de ejemplo cualquier
glicoproteína sin restricción particular, mientras que cumpla las
siguientes condiciones: está contenida en una muestra obtenida a
partir de un organismo vivo, por ejemplo, un fluido corporal (p.
ej., suero, sangre, plasma u orina), linfocito, hemocito o
cualquiera entre diversas células, puede tener formas que son
diferentes en la estructura de la cadena de azúcar pero que tienen
sustancialmente la misma estructura proteica, y existe una lectina
capaz de reconocer la estructura de la cadena de azúcar específica
de al menos una de las formas de glicoproteína que se va a medir y
un anticuerpo a partir del cual se puede preparar el anticuerpo
combinado con polipéptido. Ejemplos preferibles de la glicoproteína
son enzimas, tales como amilasa, fosfatasa alcalina, fosfatasa
ácida, \gamma-glutamiltransferasa
(\gamma-GTP), lipasa, quinasa de creatina (CK),
deshidrogenasa de lactato (LDH), transaminasa de
glutámico-oxalacético (GOT), transaminasa de
glutámico-pirúvico (GPT), renina, quinasas de
proteínas, quinasa de tirosina, etc.; sustancias fisiológicamente
activas, tales como gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona
estimuladora del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), etc.;
antígeno asociado a tumores, tal como antígeno específico de
próstata (PSA), \alpha_{2}-macroglobulina,
antígeno carcinoembriónico (CEA),
\alpha-fetoproteína, etc.; y antígenos glicogénicos del cáncer, tales como CA 19-9, CA 125, etc.
\alpha-fetoproteína, etc.; y antígenos glicogénicos del cáncer, tales como CA 19-9, CA 125, etc.
Las concentraciones de los reactivos empleados en
el procedimiento de medición (6) según una realización particular de
la presente invención se explican a continuación.
En primer lugar, la concentración de la lectina
utilizada varía dependiendo del tipo de lectina empleada, las
propiedades de los analitos glicoproteicos que se van a medir, etc.
Es preferible que la lectina esté presente junto con los analitos
glicoproteicos en una concentración de generalmente 10 veces o
superior, preferentemente 100 veces o superior, más preferentemente
1000 veces o superior, a una concentración límite fijada para la
detección de los analitos glicoproteicos.
La concentración del anticuerpo combinado con
polipéptido, es decir, un producto combinado tal y como se emplea en
el procedimiento de la presente invención, varía dependiendo de un
valor en el cual se fija el límite de la detección de los analitos
glicoproteicos que se van a medir. La concentración se determina
preferentemente en función de la diferencia entre la lectina y el
anticuerpo combinado con polipéptido, asociado constantemente con
los analitos glicoproteicos. Aunque la concentración varía
dependiendo de, por ejemplo, los tipos y las propiedades de los
analitos glicoproteicos y la lectina y las propiedades del
anticuerpo combinado con polipéptido, la concentración se determina
preferentemente utilizando, por ejemplo, la siguiente fórmula
general:
Concentración del anticuerpo
combinado con polipéptido = (constante de asociación de la lectina)
+ (constante de asociación del anticuerpo combinado con polipéptido)
x (concentración de la
lectina)
La constante de asociación en la fórmula general
anterior, se refiere a una constante de asociación obtenida en la
reacción de equilibrio representada por la fórmula (1) descrita a
continuación y se calcula por la ecuación (2) descrita a
continuación:
(1)[A] + [B] [A
\cdot
B]
(2)Constante de asociación =
[A \cdot B] / ([A] x
[B])
en donde [A]: la concentración (M) de la lectina
o del anticuerpo combinado con polipéptido en un estado de
equilibrio,
[B]: la concentración (M) de analito(s)
glicoproteico(s) libre(s) que se va a medir en un
estado de equilibrio,
[A\cdotB]: la concentración (M) de un complejo
de la lectina (o el anticuerpo combinado con polipéptido) y
el(los) analito(s) glicoproteico(s).
Más específicamente, por ejemplo, cuando la
constante de asociación de la lectina para los analitos
glicoproteicos es 1 x 10^{6} M^{-1} y la constante de asociación
del anticuerpo combinado con polipéptido para los analitos
glicoproteicos es 1 x 10^{8} M^{-1}, la concentración del
anticuerpo combinado con polipéptido es una centésima parte o menos,
preferentemente una milésima parte o menos que la concentración de
lectina. Aunque la concentración del anticuerpo combinado con
polipéptido empleado no es preferentemente menor que una
concentración en la que el anticuerpo combinado con polipéptido se
puede unir al total de analitos glicoproteicos que se van a medir,
con una concentración que se corresponde a un límite de detección
fijado, puede ser menor que (por ejemplo, aproximadamente una décima
parte) la concentración mencionada anteriormente.
La concentración del anticuerpo
anti-glicoproteína marcado empleado varía,
dependiendo de una concentración en la que se fija el límite de
detección de los analitos glicoproteicos. Es preferible ajustar la
concentración del anticuerpo anti-glicoproteína
marcado en la solución de reacción a una concentración que no es
menor que una concentración en la que el anticuerpo
anti-glicoproteína marcado se puede unir a la
totalidad de los analitos glicoproteicos, con una concentración que
se corresponde al límite de detección, preferentemente dos veces más
alta o superior, más preferentemente 5 veces más alta o superior, lo
más preferido 10 veces más alta o superior a la concentración.
Al poner en práctica cualquiera de los
procedimientos de medición (1) a (6), desarrollados aplicando la
presente invención, se puede emplear cualquiera de los métodos
siguientes aplicando carga negativa, en lugar de la HPLC mencionada
anteriormente, para separar el(los) complejo(s) de la
sustancia de afinidad libre que incluye sustancia de afinidad
marcada y libre, analito(s) que se va a medir incluyendo
analito(s) marcado(s), etc.: métodos para la
separación eléctrica de sustancias en base a su diferencia de carga
eléctrica que se emplean normalmente en la técnica, por ejemplo,
separación electrocinética que no emplea soporte para la separación
(documento JP-B 7-111398),
electroforesis que emplea un soporte para la separación,
electroforesis capilar, un método que comprende acelerar una
hibridación de ácido nucleico, reacción
antígeno-anticuerpo o similares, utilizando la
diferencia de carga eléctrica y separando a continuación la cadena
de polinucleótidos libre, el anticuerpo libre o similares (documento
con número de Publicación Internacional WO 95/12808). En la
electroforesis que emplea un soporte para la separación entre estos
métodos, se puede utilizar cualquier soporte sin una restricción
particular, mientras que sea un soporte utilizado generalmente en la
técnica, por ejemplo, papel de filtro, gel (p. ej. gel de agar, gel
de agarosa, gel de poliarilamida o gel de almidón) o membrana de
acetato de celulosa.
La sustancia detectable que se va a utilizar para
marcar la sustancia de afinidad o el analito en los procedimientos
de medición de acuerdo con las realizaciones descritas en esta
memoria de la presente invención, incluye, por ejemplo, enzimas
tales como fosfatasas alcalinas,
\beta-galactosidasa, peroxidasa, microperoxidasa,
oxidasa de glucosa, deshidrogenasa de la
glucosa-6-fosfato,
acetilcolinesterasa, deshidrogenasa de malato, luciferasa, etc., que
se emplean, por ejemplo en enzimoinmunoanálisis (EIA); radioisótopos
tales como ^{99m}Tc, ^{131}I, ^{125}I, ^{14}C, ^{3}H,
etc., que se emplean, por ejemplo, en radioinmunoanálisis (RIA);
sustancias que pueden emitir fluorescencia, tales como fluoresceína,
residuo de dansilo, fluorescamina, coumarina, naftilamina, sus
derivados, etc., que se emplean, por ejemplo, en
fluoroinmunoanálisis (FIA); sustancias luminiscentes tales como
luciferina, isoluminol, luminol, oxalato de
bis(2,4,6-trifluoro-fenilo),
etc.; sustancias que pueden absorber luz ultravioleta, tales como
fenol, naftol, antraceno, sus derivados, etc.; y sustancias que
tienen propiedades como marcadores de la rotación, que están
representadas por compuestos que tienen un grupo oxilo, tales como
4-amino-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo,
3-amino-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-1-oxilo,
2,6-di-t-butil-\alpha-(3,5-di-t-butil-4-oxo-2,5-ciclohexadien-1-ilideno)-p-toliloxi,
etc. No es necesario decir que la sustancia detectable no está
limitada a estas sustancias.
Como método para marcar la sustancia de afinidad
con la sustancia detectable, mencionada anteriormente a modo de
ejemplo, se pueden mencionar a modo de ejemplo todos los métodos de
marcación convencionales que se emplean generalmente, por ejemplo,
en EIA, RIA y FIA convencionales (p. ej., Yuichi Yamamura "Ikagaku
Jikken Koza vol. 8" 1ª ed. NAKAYAMA-SHOTEN Ltd.,
1971, Akira Kawano "Zusetsu Keikokotai" 1ª ed., Soft Science,
Inc., 1983; y Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai y Kiyoshi Miyai "Koso
Men-eki Sokuteiho" 2ª ed.,
IGAKU-SHOIN Ltd., 1982). La marcación se puede
realizar de acuerdo con estos métodos. No es necesario decir que un
método convencional que emplea la reacción de avidina (o
estreptoavidina) con biotina, se puede emplear como método de
marcación.
Como sustancia de afinidad medible o detectable
por sí misma, según algún método que se emplea en el procedimiento
de la presente invención, se puede mencionar a modo de ejemplo las
siguientes sustancias que tienen ellas mismas la propiedad
mencionada anteriormente como sustancia detectable: por ejemplo,
enzimas, sustancias que pueden emitir fluorescencia, sustancias
luminiscentes, sustancias que pueden absorber luz ultravioleta,
etc.
En el procedimiento de medición de la invención,
el tiempo de elución del complejo puede ser controlado libremente
escogiendo el tipo de polipéptido descrito anteriormente en esta
memoria (el tipo y la cantidad de residuos ácidos introducidos
derivados de un ácido fuerte, el tipo de residuos de aminoácidos
constituyentes, etc.). Por tanto, con la ventaja de esta
característica del procedimiento, se puede conseguir la separación y
la medición de analitos.
Esto es, la medición simultánea (separación y
medición) de una pluralidad de analitos que se van a medir, se
vuelve posible cuando se emplean dos o más polipéptidos, tal y como
se ha descrito anteriormente, que son diferentes en la cantidad de
residuos ácidos derivados de un ácido fuerte y los tipos de
sustancias de afinidad se escogen adecuadamente, dentro de las
cuales se introducen los polipéptidos, respectivamente.
Incluso si una muestra contiene una variedad de
componentes séricos que influyen en la medición, volviendo la
ionicidad del complejo más alta que la de los componentes séricos,
empleando el polipéptido descrito en esta memoria anteriormente, es
eficaz para evitar una influencia sobre la medición, ejercida por
los componentes del suero. En este caso, el tiempo requerido para el
análisis se puede reducir empleando un gradiente por etapas.
Además, puesto que un material para cromatografía
(p. ej., material de gel, material de membrana, material de vidrio,
etc.) empleado en un método de intercambio aniónico, tiene
generalmente una alta capacidad de intercambio (capacidad de
absorción absoluta para sustancia iónica), el complejo completo, al
que está unido el producto combinado, puede ser absorbido sobre el
soporte, incluso en el análisis de una muestra que contiene una
cantidad absoluta alta de sustancias iónicas, junto con los analitos
que se van a medir, tales como una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo, por ejemplo, suero. Por tanto, dicho complejo se
puede eluir en una posición en la que la influencia de las
sustancias presentes junto con los analitos se puede evitar
sustancialmente. Además, puesto que el polipéptido utilizado en el
procedimiento de medición de la presente invención tiene una alta
solubilidad en agua, la solubilidad en agua del complejo al que se
une el polipéptido es mayor que antes de la unión. Por ello, en el
procedimiento de medición de la presente invención, la
desnaturalización y la desactivación de los analitos que se van a
medir, difícilmente tiene lugar durante la formación del complejo
que tiene la sustancia que mejora la separación (el polipéptido)
introducida en el mismo.
Como material empleado en un método de
intercambio aniónico para separar una sustancia objeto de otras
sustancias presentes junto con la misma, utilizando las propiedades
aniónicas del polipéptido descrito anteriormente, se puede mencionar
a modo de ejemplo cualquier material sin restricciones particulares,
mientras que tenga capacidad de intercambio aniónico. El soporte
incluye, por ejemplo, soportes que tienen un grupo de intercambio
aniónico, tal como un grupo de dietilaminoetilo (DEAE), un grupo de
amonio cuaternario (p. ej., grupo Q, grupo QAE, etc.) o similares.
Ejemplos más específicos del material, son cargas para cromatografía
de intercambio aniónico, tales como gel DEAE-MCl (un
nombre de marca, Mitsubishi Kasei Corp.), gel QAE MCl (un nombre de
marca, Mistubishi Kasei Corp.), gel Wakobeads DEAE (un nombre de
marca, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), etc.; y materiales que
emplean una membrana, tal como MemSep DEAE (un nombre de marca,
Japan Millipore Ltd.). No es necesario mencionar que se pueden
utilizar materiales disponibles comercialmente para la cromatografía
y materiales preparados personalmente, fijando el grupo de
intercambio aniónico mencionado anteriormente a la superficie de una
resina o de un recipiente de vidrio, según un método
convencional.
El procedimiento para medir un componente de un
organismo vivo, empleando el producto combinado de acuerdo con el
procedimiento de la presente invención, es particularmente atractivo
cuando se emplea un intercambiador aniónico.
Por ejemplo, para poner en práctica el
procedimiento de medición de un componente de un organismo vivo
utilizando un método de filtración en gel, se debe utilizar una
columna con una longitud adecuada. Para ello, el empleo de un método
de filtración en gel es desventajoso porque da como resultado un
tiempo de separación mayor que con el empleo de un intercambiador
iónico. Por tanto, cuando es necesaria la reducción del tiempo de
separación, se emplea preferentemente un método que utiliza un
intercambiador aniónico, tal como un aparato de HPLC equipado con
una columna cargada con un material empaquetado para la
cromatografía de intercambio aniónico, una membrana de intercambio
aniónico y un tubo de reacción que tiene una acción de intercambio
aniónico. Además, los métodos de filtración en gel son
inconvenientes porque no son adecuados para separar analitos que se
van a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo
que tienen un peso molecular muy alto (tamaño de molécula:
aproximadamente 1000 \ring{A} o superior).
Un método de separación hidrofóbica, en algunos
casos provoca el siguiente problema: cuando los analitos que se van
a medir en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo son
sustancias fisiológicamente activas que tienen una estructura de
orden superior, tales como proteínas, la actividad del(de
los) analito(s) en el complejo se pierde debido a la
destrucción de la estructura de orden superior del(de los)
analito(s) por un disolvente orgánico empleado en la
separación.
Por otro lado, el método que emplea un
intercambiador aniónico permite una separación más eficaz de los
analitos que se van a medir en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo, basándose en la diferencia delicada en ionicidad.
Además, cuando se emplea el método que emplea un intercambiador
aniónico, el polipéptido descrito anteriormente en esta memoria, se
puede seleccionar a partir de polipéptidos con diversa ionicidad, de
modo que los analitos que se van a medir en una muestra obtenida a
partir de un organismo vivo, se pueden separar con un pH óptimo.
Además, puesto que el polipéptido tiene por sí mismo una alta
solubilidad en agua, normalmente no hay peligro de que la
introducción del polipéptido en los analitos que se van a medir en
una muestra obtenida a partir de un organismo vivo, pueda precipitar
los analitos. Por tanto, la separación se puede realizar de forma
estable.
Cuando los analitos que se van a medir en una
muestra obtenida a partir de un organismo vivo, se miden según el
procedimiento de medición de la presente invención, se puede desviar
un pico objeto debido al(a los) analito(s) hasta una
posición en la que no hay influencia de los componentes del suero,
urea, etc. Además, se puede obtener también el siguiente efecto:
puesto que las posiciones en la elución de los complejos que
contienen analitos diferentes que se van a medir, se pueden igualar
escogiendo el producto combinado que tiene propiedades adecuadas,
dependiendo de los analitos, los diversos analitos que se van a
medir empleando el método que usa un intercambiador aniónico (p.
ej., HPLC) bajo las mismas condiciones de análisis.
En el procedimiento de medición de acuerdo con la
presente invención, la cantidad de sustancia detectable, la
sustancia de afinidad, la sustancia de afinidad A o el(los)
analito(s) que se va a medir en una muestra obtenida a partir
de un organismo vivo contenido en el complejo o el complejo marcado,
separado por el método que emplea un intercambiador aniónico, se
determina según un método predeterminado basándose en la propiedad
detectable, por algún método de la sustancia detectable (la
sustancia de afinidad, la sustancia de afinidad A o el(los)
analito(s)). Por ejemplo, cuando la propiedad es la actividad
enzimática, la determinación se realiza según un método convencional
de EIA, por ejemplo, el método descrito en Tsunehiro Kitagawa, Tosio
Nanbara, Akio Tsuji y Eiji Ishikawa "Koso Meneki Sokuteiho", un
ejemplar extra nº 31 de Tanpakushitsu Kakusan Koso, págs.
51-63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd.,
publicado el 10 de Sept. 1987. Cuando la sustancia detectable es un
radioisótopo, la determinación se realiza según un método
convencional de RIA, escogiendo adecuadamente y empleando un
instrumento de medición tal como un contador GM, un contador de
centelleo líquido, un contador de tipo pocillo, un contador para
HPLC o similares, dependiendo del tipo y de la intensidad de una
radiación emitida por dicho radioisótopo (véase, por ejemplo, Yuichi
Yamamura, "Ikagaku Jikken Koza vol. 8" 1ª ed.,
NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971). Cuando la propiedad son
las propiedades de emisión de fluorescencia, la determinación se
realiza según un método convencional de FIA que emplea un
instrumento de medición tal como un fluorómetro, por ejemplo, el
método descrito por Akira Kawano "Zusetsu
Keiko-kotai" 1ª ed., Soft Science, Inc., 1983.
Cuando la propiedad son las propiedades de emisión de luminescencia,
la determinación se realiza según un método convencional que emplea
un instrumento de medición tal como un contador de fotones, por
ejemplo, el método descrito en Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara,
Akio Tsuji y Eiji Ishikawa "Koso Meneki Sokuteiho", un ejemplar
extra nº 31 de Tanpakushitsu Kakusan Koso, págs.
252-263, KYORITSU-SHUPPAN Ltd.,
publicado el 10 de sept. De 1987. Cuando la propiedad es la
absorción de luz ultravioleta, la determinación se realiza según un
método convencional que emplea un instrumento de medición tal como
un espectrofotómetro. Cuando la sustancia detectable es una
sustancia que tiene propiedades de marcador de rotación, la
determinación se realiza según un método convencional que emplea un
aparato de resonancia del momento angular del electrón, por ejemplo,
el método descrito en Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji
y Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", un
ejemplar extra nº 31 de Tanpakushitsu Kakusan Koso, págs.
264-271, KYORITSU-SHUPPAN Ltd.,
publicado el 10 de Sept. de 1987.
En el procedimiento de medición de acuerdo con la
presente invención, las condiciones de reacción para formar un
complejo haciendo reaccionar un(os) analito(s) que se
va medir en una muestra obtenida a partir de un organismo vivo, con
el producto combinado (que incluye los productos combinados A, B, C
y D, etc.) y, opcionalmente, la sustancia de afinidad marcada o sin
marcar (que incluye la sustancia de afinidad A) o las condiciones de
reacción para formar un complejo marcado haciendo reaccionar
un(os) analito(s) que se va a medir en una muestra
obtenida a partir de un organismo vivo con analito marcado y el
producto combinado, no están particularmente limitadas mientras que
no inhiban la formación del complejo (o del complejo marcado). La
reacción se puede realizar con las condiciones de reacción empleadas
para formar un complejo en un método convencional tal como EIA, RIA,
FIA o cromatografía de afinidad. Por ejemplo, cuando se emplea una
solución tampón en la reacción, se puede escoger como tampón y otros
reactivos, los utilizados en los métodos convencionales anteriores.
Aunque el pH en la reacción no está particularmente limitado,
mientras que no inhiba la formación del complejo (o del complejo
marcado), generalmente es 2-10, preferentemente
5-9. Aunque la temperatura de la reacción tampoco
está particularmente limitada mientras que no inhiba la formación
del complejo (o del complejo marcado), es generalmente
0-50ºC, preferentemente
20-40ºC. Puesto que el tiempo de reacción requerido para la formación del complejo (o del complejo marcado) varía dependiendo de la reactividad del(de los) analito(s) con el producto combinado y la sustancia de afinidad marcada o similares, o con el producto combinado y el analito marcado, la reacción se puede realizar de forma adecuada durante varios segundos hasta varias horas, dependiendo de las propiedades de estos componentes.
20-40ºC. Puesto que el tiempo de reacción requerido para la formación del complejo (o del complejo marcado) varía dependiendo de la reactividad del(de los) analito(s) con el producto combinado y la sustancia de afinidad marcada o similares, o con el producto combinado y el analito marcado, la reacción se puede realizar de forma adecuada durante varios segundos hasta varias horas, dependiendo de las propiedades de estos componentes.
En el HPLC empleado para poner en práctica el
procedimiento de medición de la presente invención que emplea un
intercambiador aniónico, se puede utilizar cualquier aparato sin
ningún problema particular, mientras que se emplee normalmente en el
campo del análisis y tenga un caudal constante. En el procedimiento
de medición de la presente invención que emplea HPLC, el área del
pico o la altura del pico se emplea para determinar la cantidad de
analito(s).
Un disolvente (un eluyente) empleado para separar
el complejo (o el complejo marcado) de la sustancia de afinidad
marcada y libre, etc., según el método que emplea un intercambiador
aniónico, más específicamente HPLC, no está limitado particularmente
mientras que no descomponga el complejo formado (o el complejo
marcado formado) en analito(s), la sustancia de afinidad
marcada, etc., y no elimine la propiedad, que es detectable según
algún método, de la sustancia de afinidad, la sustancia detectable
que está contenida en el complejo (o el complejo marcado).
Generalmente, como disolvente, se emplea preferentemente cualquier
solución tampón que se utilice en métodos convencionales, tales como
EIA, RIA, FIA, cromatografía de afinidad, etc. Ejemplos específicos
preferibles del disolvente son soluciones tampón que tienen un pH de
2 a 10, preparado escogiendo los materiales descritos anteriormente,
dependiendo de las propiedades del complejo (o el complejo marcado),
la sustancia de afinidad marcada y libre, seguido de adición y
mezcla: por ejemplo, tampones tales como fosfatos, acetatos,
citratos, tampones de Good,
tris(hidroximetil)aminometano, etc.; sales tales como
cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato de amonio, etc.;
disolventes orgánicos polares tales como metanol, etanol,
isopropanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano, etc.; y
tensioactivos.
La adición adecuada de un tensioactivo adecuado
al eluyente, permite evitar un pico con cola debido al complejo (o
el complejo marcado) y el ajuste más libre de las posiciones de
elución del complejo (o del complejo marcado), la sustancia de
afinidad marcada y libre, y similares. El tensioactivo utilizable
para estos fines no está particularmente limitado y se puede escoger
dependiendo de las propiedades del complejo (o del complejo
marcado), la sustancia de afinidad marcada y libre y similares.
Ejemplos preferibles del tensioactivo, son tensioactivos catiónicos
tales como bromuro de n-dodeciltrimetilamonio,
cloruro de 1-laurilpirimidio, etc.; y tensioactivos
anfóteros tales como laurilbetaína, lauramida propilbetaína,
propil-betaína de amida de ácido graso de aceite de
coco, betaína de
2-alquil-N-carboximetil-N-hidroxietil-imidazolio,
betaína de
2-undecil-N-carboximetil-N-hidroxietilimidazolio,
N-lauroil-N-metil-\beta-alanina
sodio, etc. Cuando el tensioactivo se añade al eluyente para los
fines anteriores, la concentración del tensioactivo añadido no está
limitada particularmente mientras que aporte un efecto deseado.
Aunque la concentración varía algo, dependiendo del tipo de
tensioactivo, se escoge adecuadamente en el intervalo generalmente
de 0,01 a 2%, preferentemente 0,05 a 1%.
En el procedimiento de medición de la presente
invención, como método de medición después de la separación con
HPLC, se emplea preferentemente el método que comprende introducir
un efluente desde una columna de HPLC en una sección de detección
tal como es, y medir directamente la cantidad de sustancia
detectable (o la sustancia de afinidad o el(los)
analito(s) que se va(n) a medir) contenida en el
complejo (o en el complejo marcado) en el efluente, cuyo método está
descrito, por ejemplo, por Shoji Hara y Akio Tsuji en "Newest
Liquid Chromatography" 1ª ed., págs. 92-104,
NANZANDO Ltd., publicado el 1 de febrero de 1978. La razón es que
este método permite una medición rápida. En este caso, cuando la
propiedad detectable por algún método de la sustancia de afinidad (o
el(los) analito(s)) o la de la sustancia detectable en
la sustancia de afinidad marcada (o el(los) analito(s)
marcado(s)) es, por ejemplo, la actividad enzimática, una
sección de la reacción del método denominado
post-columna, en el que se añade al efluente un
reactivo para medir la actividad enzimática para reaccionar con él,
se debe proporcionar por supuesto entre la columna de HPLC y la
sección de detección. Como reactivo para medir la actividad
enzimática que se emplea en la sección de reacción cuando la
propiedad de la sustancia detectable (o la sustancia de afinidad o
el(los)
analito(s)) es la actividad enzimática, se puede utilizar un reactivo preparado según un método convencional, por ejemplo, un método basado en el contenido de Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji y Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", un ejemplar extra nº 31 de Tanpakushitsu Kakusan Koso, págs. 51-63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., publicado el 10 de Sept. de 1987. Alternativamente, se puede escoger y emplear un reactivo de un equipo de reactivos disponible comercialmente, para la exploración física. También cuando la propiedad de la sustancia detectable, la sustancia de afinidad o el(los) analito(s) es distinta de la actividad enzimática, se puede proporcionar una sección de reacción adecuada entre la columna de HPLC y la sección de detección, para añadir y hacer reaccionar un reactivo predeterminado con el fin de aumentar la sensibilidad de la detección.
analito(s)) es la actividad enzimática, se puede utilizar un reactivo preparado según un método convencional, por ejemplo, un método basado en el contenido de Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji y Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", un ejemplar extra nº 31 de Tanpakushitsu Kakusan Koso, págs. 51-63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., publicado el 10 de Sept. de 1987. Alternativamente, se puede escoger y emplear un reactivo de un equipo de reactivos disponible comercialmente, para la exploración física. También cuando la propiedad de la sustancia detectable, la sustancia de afinidad o el(los) analito(s) es distinta de la actividad enzimática, se puede proporcionar una sección de reacción adecuada entre la columna de HPLC y la sección de detección, para añadir y hacer reaccionar un reactivo predeterminado con el fin de aumentar la sensibilidad de la detección.
Cuando una pluralidad de eluyentes diferentes en
los componentes se utilizan en el HPLC empleado en el procedimiento
de medición de la presente invención, la elución se puede realizar
según un método de gradiente de concentración (un método de
gradiente lineal) o un método por etapas. Sin embargo, se prefiere
el método por etapas porque es ventajoso, por ejemplo, porque se
puede poner en práctica mediante operaciones sencillas, puede
reducir el tiempo real de análisis y proporciona un pico objeto
agudo.
Un reactivo para medir un analito que se puede
emplear en el procedimiento de la presente invención, comprende un
producto combinado del polipéptido descrito anteriormente en esta
memoria y una sustancia que tiene afinidad por el analito, o un
producto combinado del compuesto maleimida y una sustancia que tiene
un grupo SH y afinidad por el analito como componente esencial. Si
es necesario, dicho reactivo puede contener, por ejemplo, analito
marcado, sustancia de afinidad marcada, un tampón, un tensioactivo,
etc., además del producto combinado. Las propiedades preferibles,
los ejemplos específicos de estos componentes son como se han
descrito anteriormente.
La presente invención se explica con más detalle
a continuación en relación con los Ejemplos, que no son una
limitación sino una ilustración y que también ilustran la
preparación de polipéptidos y productos combinados que se pueden
utilizar en el procedimiento de la presente invención.
Las abreviaturas empleadas en los Ejemplos
significan lo siguiente.
Ala: alanina, \betaAla:
\beta-alanina, Ser: serina, Tyr: tirosina, Asp:
ácido aspártico, Fmoc: grupo
9-fluorenil-metoxicarbonilo, Alko:
alcohol p-alcoxibencílico, tBu: grupo
t-butilo, TFA: ácido trifluoroacético, BOP:
hexafluorofosfato de
benzotiazol-1-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfonio,
HOBt:
1-hidroxi-1H-benzotriazol,
DMF: N,N-dimetilformamida; DIEA:
N,N-diisopropil-etilamina.
Empleando 2,3 g (1,5 mmoles en función de
\betaAla) de la resina
Fmoc-\betaAla-Alko (100 a 200 de
malla, fab. por
Watanabe Chemical Industries, Ltd.) como material de partida, se sintetizó Fmoc-Ala-(Ser)_{5}-\betaAla mediante una técnica en fase sólida, según el método (método BOP/HOBt) descrito en una referencia (J. Org. Chem., 53, 617-624 (1988)).
Watanabe Chemical Industries, Ltd.) como material de partida, se sintetizó Fmoc-Ala-(Ser)_{5}-\betaAla mediante una técnica en fase sólida, según el método (método BOP/HOBt) descrito en una referencia (J. Org. Chem., 53, 617-624 (1988)).
Con más detalle, la resina
Fmoc-\betaAla-Alko se trató
primero con piperidina para eliminar el grupo Fmoc. A la resina así
tratada se añadió una solución de DMF que contenía un aminoácido
predeterminado en una cantidad de 3 equivalentes por equivalente de
\betaAla en la resina y BOP, HOBt y DIEA en cantidades de 3
equivalentes, 3 equivalentes y 5,3 equivalentes, respectivamente,
por equivalente de \betaAla en la resina. El aminoácido
predeterminado se introdujo mediante reacción de acoplamiento (dos
veces) a temperatura ambiente durante 2 horas. Los aminoácidos
fueron introducidos uno después del otro, repitiendo el
procedimiento anterior. El orden de los aminoácidos introducidos era
el siguiente: Fmoc-Ser(tBu) (fab. por Wako
Pure Chemical Industries Ltd.),
Fmoc-Ser(tBu),
Fmoc-Ser(tBu),
Fmoc-Ser(tBu),
Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ala (fab.
por Wako Pure Chemical Industries Ltd.).
Después de introducir todos los aminoácidos, la
resina se lavó dos veces con MeOH, seguido de adición a la misma de
20 ml de una solución mixta de TFA-anisol (95:5), y
la reacción se llevó a cabo con agitación, a temperatura ambiente,
durante 1 hora para separar el polipéptido deseado de la resina y
eliminar los grupos tBu (grupos protectores para el grupo hidroxilo
de Ser). Después de completar la reacción, la resina se separó por
filtración y el material filtrado se concentró bajo presión
reducida. Se añadió éter al material concentrado para precipitar el
compuesto deseado. El material precipitado se recogió y se secó a
continuación en un desecador para obtener 0,84 g de
Fmoc-Ala-(Ser)_{5}-\betaAla.
En 40 ml de DMF se disolvieron 547 mg (0,67 mmol)
de
Fmoc-Ala-(Ser)_{5}-\betaAla
sintetizada en (1), seguido de adición al mismo de 30 ml de una
solución de DMF\cdotSO_{3} [(una solución de 2,57 g de
DMF\cdotSO_{3} (fab. por Fluka
Chemika-Biochemica) en 30 ml de una solución mixta
de DMF-piridina (4:1)], y la reacción se llevó a
cabo durante una noche a 4ºC. A la solución de reacción se añadieron
30 ml de una solución de DMF\cdotSO_{3} y la solución resultante
se sometió a reacción durante una noche a 4ºC. Después de completar
la reacción, la solución de reacción se añadió a
400 ml de acetona y el precipitado formado se recogió por filtración y se disolvió en 40 ml de DMF. A la solución resultante se añadieron 8 ml de piperidina y la reacción se realizó con agitación a temperatura ambiente, durante 40 minutos, para eliminar el grupo Fmoc. La solución de reacción se añadió a 500 ml de acetona y el material precipitado formado se recogió por filtración, se lavó con acetona y éter y a continuación se secó en un desecador. El material precipitado secado se sometió a cromatografía de intercambio aniónico y a continuación a filtración en gel, para obtener 210 mg de Ala-(Ser(SO_{3}H))_{5}-\betaAla (polipéptido 3).
400 ml de acetona y el precipitado formado se recogió por filtración y se disolvió en 40 ml de DMF. A la solución resultante se añadieron 8 ml de piperidina y la reacción se realizó con agitación a temperatura ambiente, durante 40 minutos, para eliminar el grupo Fmoc. La solución de reacción se añadió a 500 ml de acetona y el material precipitado formado se recogió por filtración, se lavó con acetona y éter y a continuación se secó en un desecador. El material precipitado secado se sometió a cromatografía de intercambio aniónico y a continuación a filtración en gel, para obtener 210 mg de Ala-(Ser(SO_{3}H))_{5}-\betaAla (polipéptido 3).
La Tabla 1 muestra los resultados de los análisis
de aminoácidos y la cromatografía iónica de este compuesto
deseado.
El análisis de aminoácidos se realizó mediante un
sistema analizador de PTC-aminoácidos de Wako (fab.
por Wako Pure Chemical Industries Ltd.) (de aquí en adelante se
aplica el mismo).
Empleando 0,77 g (0,5 mmol) de resina
Fmoc-\betaAla-Alko como material
de partida, se introdujeron aminoácidos predeterminados con los
mismos reactivos según el mismo procedimiento que el descrito en el
Ejemplo 1 (1). El orden de los aminoácidos introducidos era el
siguiente: Fmoc-Tyr(SO_{3}Na) (fab. por
Bachem Feinchemikalien AG),
Fmoc-Tyr(SO_{3}Na),
Fmoc-Tyr(SO_{3}Na),
Fmoc-Ala.
Después de introducir todos los aminoácidos, la
resina se lavó con MeOH, seguido de la adición a la misma de
50 ml de una solución mixta de DMF-piperidina (4:1) y la reacción se llevó a cabo con agitación, a temperatura ambiente, durante 1 hora para eliminar el grupo Fmoc. El disolvente se eliminó por filtración, después de lo cual, se lavó la resina con MeOH y se añadió la mezcla de TFA, H_{2}O y m-cresol (45:5:2). A continuación, la reacción se llevó a cabo bajo corriente de gas nitrógeno, a 4ºC durante 16 horas para separar el polipéptido deseado de la resina. La resina se separó de la solución de reacción mediante filtración y el material filtrado se concentró bajo presión reducida, después de lo cual se precipitó el compuesto deseado con éter. El material precipitado se sometió a cromatografía de intercambio aniónico y a continuación filtración en gel, para obtener 180 mg de Ala-Tyr(SO_{3}H)_{3}-\betaAla (polipéptido 11).
50 ml de una solución mixta de DMF-piperidina (4:1) y la reacción se llevó a cabo con agitación, a temperatura ambiente, durante 1 hora para eliminar el grupo Fmoc. El disolvente se eliminó por filtración, después de lo cual, se lavó la resina con MeOH y se añadió la mezcla de TFA, H_{2}O y m-cresol (45:5:2). A continuación, la reacción se llevó a cabo bajo corriente de gas nitrógeno, a 4ºC durante 16 horas para separar el polipéptido deseado de la resina. La resina se separó de la solución de reacción mediante filtración y el material filtrado se concentró bajo presión reducida, después de lo cual se precipitó el compuesto deseado con éter. El material precipitado se sometió a cromatografía de intercambio aniónico y a continuación filtración en gel, para obtener 180 mg de Ala-Tyr(SO_{3}H)_{3}-\betaAla (polipéptido 11).
\newpage
La Tabla 1 también muestra los resultados del
análisis de aminoácidos y la cromatografía iónica del compuesto
deseado.
Empleando 2,3 g (1,5 mmoles) de la resina
Fmoc-\betaAla-Alko como material
de partida, se introdujeron los aminoácidos predeterminados con los
mismos reactivos, según el mismo procedimiento que el descrito en el
Ejemplo 1 (1). El orden de los aminoácidos introducidos era el
siguiente: Fmoc-Tyr(tBu) (fab. por Watanabe
Chemical Industries, Ltd.), Fmoc-Tyr(tBu),
Fmoc-Tyr(tBu),
Fmoc-Tyr(tBu),
Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ala.
Después de introducir todos los aminoácidos, la
resina se lavó dos veces con MeOH, seguido de adición a la misma de
una solución mixta de TFA, anisol y 1,2-etanodiol
(95:5:1) y la reacción se llevó a cabo con agitación a temperatura
ambiente, durante 1 hora para separar el polipéptido de la resina y
eliminar los grupos tBu (grupos protectores para el grupo hidroxilo
de Tyr). Después de completar la reacción, la resina se separó por
filtración y el material filtrado se concentró bajo presión
reducida. Se añadió éter al material concentrado para precipitar el
compuesto deseado. El material precipitado se recogió y se secó a
continuación en un desecador para obtener 1,71 g de
Fmoc-Ala-(Tyr)_{5}-\betaAla.
A una mezcla de 0,5 g de
Fmoc-Ala-(Tyr)_{5}-\betaAla
obtenida en (1) y 3 ml de DMF, se añadieron 15 ml de una solución de
DMF\cdotSO_{3} [una solución de 3,2 g de DMF\cdotSO_{3} en
15 ml de una solución mixta de DMF-piridina (4:1)],
y la reacción se llevó a cabo durante una noche a 4ºC, después de lo
cual se añadió éter a la solución de la reacción, para precipitar el
producto de reacción. El material precipitado se disolvió en 10 ml
de DMF, seguido de la adición al mismo de 2,5 ml de piperidina y la
reacción se llevó a cabo con agitación a temperatura ambiente,
durante 1 hora. A la solución de la reacción se añadieron 150 l de
éter y el material precipitado formado se recogió por filtración. El
material precipitado se disolvió en 4 ml de agua y el compuesto
deseado se aisló mediante una cromatografía líquida en columna ODS
[columna: Wakosil _{10}C_{18} (2,0 \phi x 25 cm) (fab. por
Wako Pure Chemical Industries. Ltd.); condiciones de la elución:
AcONa 10 mM (pH 6,0), 2 \rightarrow 60% de acetonitrilo). La
fracción así obtenida que contenía el compuesto deseado se trató por
filtración en gel para obtener 203 mg de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla
(polipéptido 14).
La Tabla 1 también muestra los resultados del
análisis de aminoácidos y la cromatografía iónica de este compuesto
deseado.
Los polipéptidos 1, 2, 4 a 9, 18 y 20 a 22
enumerados en la lista de la Tabla 1, se sintetizaron con los mismos
reactivos, según el mismo procedimiento que el descrito en el
Ejemplo 1. El polipéptido 10 enumerado en la Tabla 1, se sintetizó
con los mismos reactivos y el mismo procedimiento que el descrito en
el Ejemplo 2.
El polímero
Fmoc-Ser(tBu)-O (fab. por
Kokusan Chemical Works, Ltd.) se empleó como material de partida
para la síntesis del polipéptido 6 y la resina
Fmoc-Tyr(tBu)-Alko (100 a 200
de malla, fab. por Watanabe Chemical Industries, Ltd.) se empleó
como material de partida para sintetizar los polipéptidos 21 y
22.
La Tabla 1 también muestra los resultados del
análisis de aminoácidos y la cromatografía iónica de los diversos
polipéptidos así obtenidos.
Los polipéptidos 12, 13, 15 a 17 y 19 enumerados
en la lista de la Tabla 1 se sintetizaron con los mismos reactivos y
según el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3. La
resina Fmoc-\betaAla-Alko (100 a
200 de malla, fab. por Watanabe Chemical Industries, Ltd.) se empleó
como material de partida para sintetizar los polipéptidos 12 y 16 y
la resina Fmoc-Tyr(tBu)-Alko
(100 a 200 de malla, fab. por Watanabe Chemical Industries, Ltd.) se
empleó como material de partida para sintetizar los polipéptidos 13,
15, 17 y 19.
La Tabla 1 también muestra los resultados del
análisis de aminoácidos y la cromatografía iónica de los compuestos
deseados.
Empleando 780 mg (0,5 mmol) de resina
Fmoc-\betaAla-Alko como material
de partida, se introdujeron aminoácidos predeterminados con los
mismos reactivos, según el mismo procedimiento que el descrito en el
Ejemplo 1 (1). El orden de los aminoácidos introducidos era el
siguiente: Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}) (fab.
por Novabiochem Corp.),
Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}),
Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}),
Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}),
Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}),
Fmoc-Ala.
Después de introducir todos los aminoácidos, la
resina se lavó con MeOH, seguido de la adición a la misma de 50 ml
de una solución mixta de DMF-piperidina (4:1) y la
reacción se llevó a cabo con agitación a temperatura ambiente,
durante 1 hora, para eliminar el grupo Fmoc. Después de completar la
reacción, la resina se recogió por filtración y se lavó con MeOH y a
continuación se añadieron 20 ml de una solución mixta de TFA, fenol,
H_{2}O, tioanisol y etanodiol (33:2:2:2:1). La mezcla resultante
se sometió a reacción con agitación a temperatura ambiente, durante
1 hora para separar el polipéptido de la resina. Después de
completar la reacción, la resina se separó por filtración y se
añadió éter al material filtrado para precipitar el compuesto
deseado. El material precipitado así obtenido se sometió a
cromatografía de intercambio aniónico y a continuación a filtración
en gel para obtener 760 mg de
Ala-(Tyr(PO_{3}H_{2}))_{5}-\betaAla
(polipéptido 23).
La Tabla 1 también muestra los resultados del
análisis de aminoácidos y la cromatografía iónica para el compuesto
deseado.
Empleando 780 mg (0,5 mmol) de la resina
Fmoc-\betaAla-Alko como material
de partida, se introdujeron aminoácidos predeterminados con los
mismos reactivos y según el mismo procedimiento que el descrito en
el Ejemplo 1 (1). El orden de los aminoácidos introducidos era el
siguiente: Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}) (fab.
por Novabiochem Corp.),
Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}),
Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}),
Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}),
Fmoc-Tyr(PO_{3}H_{2}),
Fmoc-Ala, ácido maleimidobutírico.
Después de introducir todos los aminoácidos, la
resina se lavó con MeOH y se trató con una solución mixta de
TFA-anisol (95:5) para separar el polipéptido de la
resina. La resina se separó por filtración y se añadió éter al
material filtrado para formar un precipitado. El material
precipitado se sometió a una cromatografía líquida en columna ODS
[columna: Wakosil _{5}C_{18} (2,0 \phi x 25 cm) (fab. por Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.); condiciones de la elución: TFA al
0,1%, 0 \rightarrow 10% de acetonitrilo] y a continuación
filtración en gel para obtener 820 mg de
4-maleimidobutiril-Ala-(Tyr(PO_{3}H_{2}))_{5}-\betaAla
(polipéptido 24).
La Tabla 1 también muestra los resultados del
análisis de aminoácidos y la cromatografía iónica para el compuesto
deseado.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Investigación de las posiciones de la elución de
polipéptidos aniónicos en el caso de una columna de intercambio
aniónico
Soluciones acuosas que contenían 5 mg/ml de los
polipéptidos 1 a 24, respectivamente, obtenidas en los Ejemplos 1 a
7, se emplearon como muestras.
También se prepararon como muestras, soluciones
acuosas que contenían como compuesto patrón de referencia 5 mg/ml de
(Asp)_{9}-\betaAla (de aquí en adelante
abreviado como "Asp9"; preparado personalmente según el método
BOP/HOBt), un poli(ácido aspártico) que tenía un peso molecular
promedio de 6.000 (de aquí en adelante abreviado como "Asp6K");
fab. por Sigma Chemical Co.) o un poli(ácido aspártico) que tenía
peso molecular promedio de 50.000 (de aquí en adelante abreviado
como "pAsp"; fab. por Sigma Chemical Co.), respectivamente.
Columna: POROS DEAE (4,6 \phi x 10 mm, fab. por
Perseptive Biosystems).
Eluyente A: tampón fosfato 50 mM (pH 7,6).
Eluyente B: tampón fosfato 50 mM (pH 7,6 que
contiene NaCl 5 M).
Caudal: 1 ml/min.
Detección: para los polipéptidos que contienen
uno o varios residuos de serina sulfatados: UV 220 nm, para los
polipéptidos que contienen uno o varios residuos de tirosina
sulfatados: UV 260 nm, para los polipéptidos que contienen residuos
de tirosina fosfatados: UV 260 nm.
| Condición del gradiente: | 0 \rightarrow 5 min. | A = 100% | |
| 5 \rightarrow 30 min. | B = 0 \rightarrow 100% | ||
| 30 \rightarrow 35 min. | B = 100% |
Se analizaron 20 \mul de cada muestra por HPLC
con las condiciones mencionadas anteriormente.
La Fig. 1 muestra las concentraciones salinas
necesarias para la elución de los polipéptidos individuales (de aquí
en adelante abreviado como "concentración salina eluyente"). En
la Fig. 1, \medbullet muestra una concentración salina en la
parte superior del pico de la elución, - - -\dashv
muestra un intervalo de concentración salina entre el inicio y el
final de la elución, es decir, un pico ancho. Los nºs. y las
indicaciones en el eje de abscisas, muestran el tipo de polipéptidos
(los nºs de polipéptidos y las abreviaturas en la Tabla 1).
A partir de los resultados mostrados en la Fig.
1, se puede observar lo siguiente.
(i) El incremento del número de residuos ácidos
(grupos sulfónicos o grupos fosfónicos) da como resultado una
concentración salina eluyente incrementada.
(ii) El polipéptido 3 (número de residuos de
ácido sulfúrico: 5) y el polipéptido 11 (número de residuos de ácido
sulfúrico: 3) son iguales a Asp 9 en la concentración salina
eluyente. El polipéptido 6 (número de residuos de ácido sulfúrico:
10), el polipéptido 8 (número de residuos de ácido sulfúrico: 9), el
polipéptido 9 (número de residuos de ácido sulfúrico: 10), los
polipéptidos 12 y 13 (número de residuos de ácido sulfúrico: 4) y
los polipéptidos 14 y 15 (número de residuos de ácido sulfúrico: 5)
son iguales a Asp6K y pAsp en la concentración salina eluyente. Con
otras palabras, los polipéptidos descritos en esta memoria
proporcionan un efecto igual al de los polipéptidos convencionales
que tienen residuos de ácido carboxílico (son iguales a los
polipéptidos convencionales, basándose en el valor de retención con
una columna de intercambio aniónico), incluso si tienen una longitud
de cadena menor (un número menor de residuos de aminoácidos) que los
polipéptidos convencionales.
(iii) El valor de la retención con una columna de
intercambio aniónico varía dependiendo del tipo de los residuos
ácidos derivados de un ácido fuerte, el tipo de residuos de
aminoácidos en los que han sido introducidos los residuos ácidos,
las propiedades de empaquetado para la columna, etc. Por ejemplo, la
comparación entre los resultados de los polipéptidos 2 a 9 que
contienen residuos de serina sulfatada y los resultados de los
polipéptidos 10 a 20 que contienen uno o varios residuos de tirosina
sulfatada, indica que cuando la cantidad de residuos ácidos
derivados de un ácido fuerte es la misma en el primero y en el
último de los polipéptidos, los polipéptidos que contienen uno o
varios residuos de tirosina sulfatada tienen una mayor concentración
salina eluyente. La razón se presume que es la siguiente: puesto que
un material base para el empaquetado empleado en el presente ejemplo
es algo hidrófobo, los polipéptidos que contienen residuos de
tirosina que tienen un anillo de benceno, son más fácilmente
retenidos por la columna, de modo que su concentración salina
eluyente evidente es mayor. La comparación entre los resultados de
los polipéptidos 3 y 14 que contienen 5 residuos de ácido sulfúrico
y los resultados de los polipéptidos 23 y 24 que contienen 5
residuos de ácido fosfórico, indica que los polipéptidos que
contienen residuos de ácido sulfúrico tienen una mayor concentración
salina eluyente. Por los resultados anteriores, se puede observar
que un polipéptido que tiene una concentración salina eluyente
arbitraria, se puede elegir, escogiendo cuidadosamente el tipo y la
cantidad de residuos ácidos que se van a introducir, el tipo de
residuos de aminoácidos constituyentes, el tipo de empaquetamiento
para la columna, etc.
(iv) Incluso si el tipo y la cantidad de residuos
de aminoácidos en los que se han introducido los residuos ácidos
derivados de un ácido fuerte, son iguales y el tipo y la cantidad de
los residuos ácidos son iguales, el valor de retención de tales
polipéptidos en una columna de intercambio aniónico, varía
dependiendo de la presencia de otros residuos de aminoácidos en los
polipéptidos. Por ejemplo, de los resultados de los polipéptidos 12
a 19 que contienen residuos de tirosina sulfatada, se puede observar
que la concentración salina eluyente varía dependiendo de la
presencia de un residuo de \beta-alanina (la
introducción de un residuo de \beta-alanina
disminuye la concentración salina eluyente) incluso si la cantidad
de residuos de tirosina sulfatada es la misma. Por tanto, se puede
observar que un polipéptido que tiene una concentración salina
eluyente arbitraria se puede preparar introduciendo un residuo de
aminoácido adecuado, además de los residuos de aminoácidos que han
introducido en el mismo el residuo ácido.
(v) A partir de los resultados de
pAsp-1 y pAsp-2 (pAsp's en
diferentes lotes de producción) como ejemplos comparativos, se puede
observar lo siguiente: dependiendo del lote de producción, los
polipéptidos convencionales que tienen residuos de ácido
carboxílico, varían en la concentración salina eluyente, en otras
palabras, la adición de una cola en un pico objeto varía, es decir,
es difícil obtener un polipéptido que tenga un peso molecular
uniforme. Por el contrario, el polipéptido descrito en esta memoria,
está exento de dicho problema en pAsp porque se puede obtener
fácilmente como un polipéptido con un peso molecular uniforme
mediante síntesis peptídica.
En 500 \mul de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0),
se disolvió 1 mg de
Ala-(Tyr(SO_{3}H)_{8}-\betaAa
preparado en el Ejemplo 4, seguido de la adición al mismo de 1,2 mg
de butirato de
sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenilo)(fab.
por Pierce Chemical Co.) y la reacción se llevó a cabo a 37ºC
durante 3 horas. La solución de la reacción se trató con una columna
peptídica Superdex (ID 16 mm x 30 cm, fab. por Pharmacia AB) para
retirar el exceso de reactivos, obteniéndose de este modo una
solución acuosa de 0,84 mg de
4-(p-maleimidofenil)butiril-Ala-(Tyr(SO_{3}H)_{8}-\betaAa
(rendimiento: 75%).
Según un método convencional, se trataron 10 mg
de anticuerpo monoclonal A4-4
anti-AFP (de aquí en adelante abreviado como
"AFP-A4-4"; disponible en Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.) para formar un fragmento
F(ab')_{2} (5 mg, rendimiento 80%). A continuación, el
fragmento F(ab')_{2} se trató para formar un fragmento Fab'
(de aquí en adelante abreviado como
"AFP-A4-4Fab'") (3,1 mg,
rendimiento 62%) según un método convencional.
En tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0), se hicieron
reaccionar 3,1 mg del
4-(p-maleimidofenil)butiril-Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAa
obtenido en (1) anterior, y 3,1 mg del
AFP-A4-4\cdotFab' obtenido en (2)
arriba, a 4ºC durante 16 horas. La solución de la reacción se cargó
en una columna Superdex de 200 pg (ID 26 mm x 60 cm, fab. por
Pharmacia AB) para eliminar el exceso de del
4-(p-maleimidofenil)butiril-Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAa.
A continuación, se trató el residuo con una columna de DEAE
TOYOPEARL (ID 10 mm x 2 cm, fab. por Tosoh Ltd.) y la fracción
adsorbida se recuperó para obtener 1 mg de un producto combinado de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAa y
AFP-A4-4\cdotFab' (rendimiento:
15%).
En 3 ml de DMF se disolvieron 25 mg de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8} (polipéptido 19) preparado en el
Ejemplo 4, seguido de la adición al mismo de 10 mg de butirato de
sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenilo)(fab.
por Pierce Chemical Co.) y la reacción se llevó a cabo a temperatura
ambiente, durante 1 hora. La mezcla de la reacción se trató con una
columna ODS [columna: Wakosil 5C18 (2,0 \phi x 25 cm) (fab. por
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); condiciones de elución:
acetato de amonio 50 mM pH 6, 2 \rightarrow 60% de acetonitrilo).
La fracción así obtenida que contenía el compuesto deseado se
concentró hasta sequedad para obtener 26,5 mg de
4-(p-maleimidofenil)butiril-Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}
(rendimiento: 95%).
Los datos de la RMN de la
4-(p-maleimidofenil)butiril-Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}
obtenida se muestran a continuación:
^{1}H-RMN (270 MHz,
DMSO-d_{6}) \deltappm: 7,16 (s, 2H, protón
maleimido).
La comparación con el resultado obtenido en el
Ejemplo 9(1), indica que según el método descrito
anteriormente, un polipéptido que tiene un grupo maleimido
introducido en el extremo N-terminal, se puede
obtener con mayor rendimiento.
También se encontró que cuando se almacena a 15ºC
o menos, el
4-(p-maleimidofenil)butiril-Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}
obtenido según el método descrito anteriormente, se puede almacenar
de forma estable sin degradación. Por tanto, este compuesto se
encontró que era más fácil de utilizar que el compuesto obtenido
según el método descrito en el Ejemplo 9(1), que estaba en
forma de una solución acuosa y era casi completamente degradable en
aproximadamente 24 horas.
Según un método convencional, se trataron 30 mg
de anticuerpo monoclonal A4-4
anti-AFP (de aquí en adelante abreviado como
"AFP-A4-4"; disponible en Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.) para formar un fragmento
F(ab')_{2} (16 mg, rendimiento 80%). A continuación, el
fragmento F(ab')_{2} se trató para formar un fragmento Fab'
(de aquí en adelante abreviado como
"AFP-A4-4\cdotFab'") (11,1
mg, rendimiento 70%) según un método convencional.
En tampón fosfato 50 mM (pH 6,5), se hicieron
reaccionar 1 mg del
4-(p-maleimidofenil)butiril-Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}
obtenido en (1) anterior y 11,1 mg del
AFP-A4-4\cdotFab' obtenido en (2)
arriba, a 4ºC durante 16 horas. La solución de la reacción se
fraccionó empleando una columna de DEAE POROS (ID 6 mm x 1 cm, fab.
por Perseptive Biosystems) para obtener 6 mg de un producto
combinado de Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8} y
AFP-A4-4\cdotFab' (rendimiento:
60%).
Comparando este resultado con el resultado
obtenido en el Ejemplo 9(3), se puede observar que empleando
el polipéptido que tiene un grupo maleimido introducido en el
extremo N-terminal que se había obtenido en el
Ejemplo 10(1), se puede obtener eficazmente un producto
combinado del polipéptido y Fab'.
Aunque no es evidente, se supone que la razón es
la siguiente: en el Ejemplo 9(1), el butirato de
sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenilo)
libre se eliminó empleando la columna peptídica de Superdex,
mientras que en el Ejemplo 10(1), la eliminación se realizó
empleando la columna ODS. Con más detalle, se proporciona la
siguiente hipótesis: puesto que la diferencia en peso molecular
entre el polipéptido que tiene un grupo maleimido introducido en el
mismo y el butirato de
sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenilo)
libre era pequeña, no se podían separar suficientemente entre sí
empleando la columna peptídica Superdex, de modo que el butirato de
sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenilo)
libre reaccionaba con Fab', dando como resultado un bajo rendimiento
de producto combinado de Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8} y
AFP-A4-4\cdotFab'.
Los productos combinados de cada uno de los
distintos polipéptidos aniónicos enumerados en la lista de la Tabla
1 y AFP-A4-4\cdotFab', se
prepararon con los mismos reactivos y según el mismo procedimiento
que el descrito en el Ejemplo 9. Soluciones acuosas que contenían 1
mg/ml de cada producto combinado se emplearon como muestras. Puesto
que el polipéptido 24 tenía un grupo maleimido fijado al extremo
N-terminal, se combinó con
AFP-A4-4\cdotFab' que estaba sin
modificar con butirato de 4-(p-maleimidofenilo).
Como compuesto patrón de referencia, cada uno de
los pAsp's disponibles comercialmente (en dos lotes) formaron un
producto combinado con
AFP-A4-4\cdotFab', empleando los
mismos reactivos y según el mismo procedimiento que el descrito en
el Ejemplo 9. Soluciones acuosas que contenían 1 mg/ml de los
productos combinados así obtenidos, respectivamente, se prepararon
como muestras.
Se podía obtener el producto combinado no deseado
del polipéptido 22 y
AFP-A4-4\cdotFab'. La razón se
supone que es la siguiente: cuando un residuo de aminoácido aniónico
está presente en el extremo N-terminal de un
polipéptido, la eficacia de la combinación del polipéptido con un
anticuerpo (más exactamente, la combinación del polipéptido con un
agente de reticulación) disminuye, debido a una causa relacionada
con la carga eléctrica.
El análisis y la medición se realizaron del mismo
modo que se ha descrito en el Ejemplo 8, excepto que la detección se
realizó con UV 280 nm en todos los casos.
La Fig. 2 muestra las concentraciones salinas
eluyentes y las anchuras de los picos de los productos combinados de
cada uno de los distintos polipéptidos y
AFP-A4-4\cdotFab'. En la Fig. 2,
\medbullet muestra una concentración salina en la parte superior
del pico de la elución, - - -\dashv muestra un
intervalo de concentración salina entre el inicio y el final de la
elución, es decir, una anchura de pico. Los nºs y las indicaciones
en el eje de abscisas muestran el tipo de polipéptidos (los nºs. de
polipéptidos y las abreviaturas en la Tabla 1).
A partir de los resultados mostrados en la Fig. 2
se puede observar lo siguiente.
(1) Debido a la combinación con el anticuerpo, la
concentración salina eluyente es un poco menor que la del péptido
aislado, pero la interrelación entre las concentraciones salinas
eluyentes de los diversos polipéptidos y la interrelación entre las
concentraciones salinas eluyentes de los polipéptidos y las de los
pAsp, son iguales que las interrelaciones determinadas en el Ejemplo
8.
(ii) Cuando el análisis de un componente sérico
se realizaba con las condiciones de análisis descritas en el Ejemplo
8, empleando una POROS-DEAE (4,6 \phi x 10 mm, una
columna de intercambio aniónico), la concentración salina en la
parte superior de un pico de elución debido a una sustancia presente
en el suero, junto con el componente sérico, es cercana a 0,3 M (no
se muestra en la Fig. 2). A partir de este hecho se puede encontrar
que cuando el producto combinado del polipéptido 1 (número de
residuos de ácido sulfúrico:1) y el anticuerpo se emplea como
sustancia que mejora la separación, un pico objeto se solapa con el
pico debido a la sustancia presente en el suero, dando como
resultado una disminución de la precisión de la medición (análisis).
Los resultados mostrados en la Fig. 2, sugieren que también cuando
el producto combinado del anticuerpo y el polipéptido 2 (número de
residuos de ácido sulfúrico: 3), el polipéptido 10 (número de
residuos de ácido sulfúrico: 1) o el polipéptido 11 (número de
residuos de ácido sulfúrico: 3), se emplea como sustancia que mejora
la separación, la precisión de la medición (análisis) disminuye algo
por la influencia de la sustancia presente en el suero, aunque la
disminución no es tan grande como la causada en el caso del
polipéptido 1.
Puesto que un material base para
POROS-DEAE, es decir, el empaquetamiento empleado en
el presente ejemplo, es algo hidrófobo, los productos combinados del
anticuerpo y cada uno de los polipéptidos 10 a 20 que tienen uno o
varios residuos de tirosina sulfatados, tienen una concentración
salina eluyente evidente mayor que la de los productos combinados
del anticuerpo y cada uno de los polipéptidos que tienen uno o
varios residuos de serina sulfatados. Por tanto, la concentración
salina eluyente evidente del producto combinado del anticuerpo y el
polipéptido 10 que sólo contiene un residuo de ácido sulfúrico pero
contiene un residuo de tirosina, es sustancialmente la misma que la
del producto combinado del anticuerpo y el polipéptido 2 que tiene
tres residuos de serina sulfatados.
Sin embargo, cuando se realiza el mismo
experimento que arriba, exceptuando el uso de un empaquetamiento
obtenido a partir de un material base hidrófobo en lugar del
empaquetamiento utilizado en el experimento anterior, se anticipa lo
siguiente: la concentración salina eluyente evidente del producto
combinado del anticuerpo y el polipéptido 10 que tiene sólo un
residuo de tirosina sulfatado, es sustancialmente la misma que la
del producto combinado del anticuerpo y el polipéptido 1 que sólo
contiene un residuo de serina sulfatado, de modo que un pico objeto
se solapa con un pico debido a la sustancia presente en el suero,
dando como resultado una disminución de la precisión de la medición
(análisis).
A partir de los resultados descritos
anteriormente, se puede observar que un polipéptido que tiene al
menos 3 residuos ácidos derivados de un ácido fuerte,
preferentemente 4 o más, más preferentemente 5 o más, es preferible
como sustancia que mejora la separación.
Cada uno de
Ala-(Ser(SO_{3}H))_{8}-\betaAla
(polipéptido 4) y
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla
(polipéptido 14) fueron almacenados a 40ºC en una solución tampón
que tenía un pH de 6 a 10, en donde se investigó su estabilidad.
Como muestras se emplearon soluciones preparadas
disolviendo cada uno de los polipéptidos 4 y 14 en cada uno de las
siguientes soluciones tampón, hasta obtener una concentración final
de 1 mg/ml:
Soluciones tampón:
pH 6,0 ácido
2-morfolinoetanosulfónico (MES),
pH 7,0 ácido
3-morfolinopropanosulfónico (MOPS),
pH 8,0 ácido
N-tris(hidroximetil)metil-3-ami-nopropano-sulfónico
(TAPS),
pH 9,0 TAPS,
pH 10,0 ácido
N-ciclohexil-2-hidroxi-3-aminopropano-sulfónico
(CAPSO).
Las concentraciones de todas las soluciones
tampón se ajustaron a 50 mM.
Cada muestra se almacenó a 40ºC durante un número
predeterminado de días.
La tasa restante de polipéptidos (%) en cada
muestra se determinó los días 6 y 19 del almacenamiento, basándose
en el valor del área del pico del polipéptido en la muestra,
inmediatamente después de la preparación y el de después de un
número predeterminado de días de almacenamiento, que se había
determinado con las condiciones del análisis descrito en el Ejemplo
8, según el procedimiento descrito en esta memoria.
La Fig. 3 y la Fig. 4 muestran los resultados de
la medición obtenidos para el polipéptido 4 y los obtenidos para el
polipéptido 14, respectivamente. En cada una de las Figs. 3 y 4, las
barras negras y las barras blancas muestran los resultados obtenidos
para cada muestra el día 6 y el día 19, respectivamente, de
almacenamiento.
Los resultados mostrados en la Fig. 3 indican que
la degradación del polipéptido 4 se acelera con un incremento del pH
en el almacenamiento y que 10% o más del polipéptido 4 se degrada
después de 16 días de almacenamiento, incluso a pH 6, con el que el
polipéptido 4 es lo más estable.
Por otro lado, los resultados mostrados en la
Fig. 4 indican que el polipéptido 14 es estable con todos los
valores de pH.
Partiendo de los resultados anteriores, se puede
observar que los grupos sulfónicos introducidos en los residuos de
tirosina son menos susceptibles a la influencia del pH y, por tanto,
más estables que los grupos sulfónicos introducidos en los residuos
de serina, es decir, el primero tiene una propiedad preferible a lo
último cuando se emplea en una sustancia que mejora la
separación.
El anticuerpo anti-TSH (de aquí
en adelante abreviado como "TSH-1"; disponible
en Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) se trató para formar un
fragmento Fab' según un método convencional. La peroxidasa
(disponible en TOYOBO, Co., Ltd.) se introdujo en el fragmento Fab'
según un método convencional, para preparar un fragmento Fab' del
anticuerpo anti-TSH, marcado con peroxidasa (de aquí
en adelante abreviado como
"TSH-1\cdotFab'-POD").
Como solución de anticuerpo 1, se preparó un
tampón MOPS 50 mM (pH 7,5) que contenía
TSH-1\cdotFab'-POD
\hbox{5
nM.}
El anticuerpo monoclonal anti-TSH
que se había confirmado que era diferente en el epítopo de
TSH-1 (de aquí en adelante abreviado como
"TSH-2"; disponible en Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.) se trató para formar el fragmento Fab' (de aquí en
adelante abreviado como "TSH-2\cdotFab'").
Los productos combinados de TSH-2\cdotFab' y cada
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla
(polipéptido 14) y
Ala-(Ser(SO_{3}H))_{5}-\betaAla
(polipéptido 3) se prepararon según el mismo procedimiento que el
descrito en el Ejemplo 9 (3).
Como soluciones de anticuerpo 2, se prepararon
soluciones tampón de MOPS 50 mM que contenían 50 mM de cada uno de
los productos combinados.
Como muestra se empleó una solución preparada
añadiendo TSH disponible comercialmente (a disposición en Genzyme
Diagnostics) a un tampón MOPS 50 mM (pH 7,5, que contenía 0,5% de
seroalbúmina bovina) hasta llegar a una concentración de 70 pM.
Columna: 0,46 \phi x 1,0 cm.
Empaquetamiento: gel POROS-DEAE
(un nombre de marca, Perseptive Biosystems)
Eluyente A: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5).
Eluyente B: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5, que
contiene NaCl 3 M).
Solución sustrato: una solución acuosa 25 mM de
4-N-acetilaminofenol (fab. por
DOJINDO LABORATORIES).
Caudal: eluyente A + eluyente B; 1,0 ml/min, la
solución sustrato; 0,1 ml/min.
Sección de la reacción: 0,025 \phi x 1.000 cm
(mantenida a 60ºC).
Detección: la fluorescencia se midió a una
longitud de onda de excitación de 328 nm y una longitud de onda de
emisión de 432 nm.
Gradiente: 0 \rightarrow 10 min. B = 0
\rightarrow 100%
Con 100 \mul de solución de anticuerpo 1, se
mezclaron 50 \mul de la muestra y 50 \mul de cada solución de
anticuerpo 2 y la mezcla resultante se dejó reposar a 25ºC durante
30 minutos, después de lo cual, 10 \mul de la mezcla se sometieron
a medición (análisis) por HPLC con las condiciones anteriores.
Como resultado del análisis con HPLC, las
concentraciones salinas (concentraciones de cloruro sódico) de la
elución de diversas sustancias, se encontraron que eran del modo
siguiente:
\bullet
TSH-1\cdotFab'-POD y un complejo
de TSH-1\cdotFab'-POD y TSH: 0 a
0,1 M.
\bullet un complejo de
TSH-1\cdotFab'-POD, TSH y el
producto combinado de TSH-2\cdotFab' y
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla
(polipéptido 14): 0,5 a 1,2 M.
\bullet un complejo de
TSH-1\cdotFab'-POD, TSH y el
producto combinado de TSH-2\cdotFab' y
Ala-(Ser(SO_{3}H))_{5}-\betaAla
(polipéptido 3): 0,25 a 0,45 M.
De los resultados anteriores, se puede observar
que los complejos que contienen el analito que se va a medir, se
pueden separar con mayor facilidad del anticuerpo libre marcado con
POD presente en el mismo, utilizando cualquiera de los productos
combinados del polipéptido sulfatado y el anticuerpo y que la
posición en la elución de un complejo objeto, se puede ajustar
libremente, escogiendo adecuadamente el tipo de polipéptido
sulfatado.
También se encontró que utilizando un pico debido
al complejo que tiene el polipéptido sulfatado fijado al mismo, se
puede obtener una curva de calibración satisfactoria para TSH, en la
muestra, es decir, se puede determinar la cantidad de TSH.
El anticuerpo anti-AFP
WA-1 (de aquí en adelante abreviado como
"AFP-WA-1"; disponible en Wako
Pure Chemicals Industries, Ltd.) diferente en el epítopo de
AFP-A4-4, se trató para formar un
fragmento Fab', según un método convencional. La peroxidasa
(disponible en TOYOBO, Co., Ltd.) se fijó al fragmento Fab' según un
método convencional para preparar fragmento Fab' del anticuerpo
anti-AFP, marcado con peroxidasa (de aquí en
adelante abreviado como
"AFP-WA-1\cdotFab'-POD").
Como reactivos, se prepararon soluciones de
tampón MOPS (pH 7,5) que contenían 200 nM de un producto combinado
predeterminado entre los productos combinados preparados en el
Ejemplo 11, es decir, los productos combinados de
AFP-A4-4\cdotFab' y cada uno de
los polipéptidos aniónicos enumerados en la lista de la de la Tabla
1, 100 nM de
AFP-WA-1\cdotFab'-POD
y 0,2 (p/v) de un poli(alcohol vinílico) (fab. por Aldrich
Chemical Co.).
Como muestra, se empleó una solución preparada
disolviendo AFP disponible comercialmente en tampón MOPS 50 mM (pH
7,5, que contenía 0,2% (p/v) de poli(alcohol vinílico)) hasta
llegar a una concentración de 100 ng/ml.
Columna: POROS-DEAE (4,6 \phi x
10 mm).
Eluyente A: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5).
Eluyente B: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5, que
contiene NaCl 3 M).
Solución sustrato: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5, que
contiene 90 mM de
4-N-(4-carbobutiril)aminofenol
y H_{2}O_{2} 20 mM).
Caudal: eluyente A + eluyente B; 1 ml/min, la
solución sustrato; 0,1 ml/min.
Sección de la reacción: 0,025 \phi x 1.000
cm.
Temperatura: 60ºC.
Detección: la fluorescencia se midió a una
longitud de onda de excitación de 328 nm y una longitud de onda de
emisión de 432 nm.
Gradiente: El mismo que en el Ejemplo 8.
Con 100 \mul de cada reactivo, se mezclaron 10
\mul de la muestra y la reacción se realizó a 8ºC durante 10
minutos, después de lo cual se analizaron 20 \mul de la mezcla de
reacción mediante HPLC, con las condiciones anteriores.
La Fig. 5 muestra las concentraciones salinas
eluyentes y las anchuras de los picos de complejos de producto
combinado de cada uno de los distintos polipéptidos y
AFP-A4-4\cdotFab',
AFP-WA-1\cdotFab'-POD
y AFP (complejos antígeno-anticuerpo). En la Fig. 5,
\medbullet muestra una concentración salina en la parte superior
del pico de la elución, - - -\dashv muestra un
intervalo de concentración salina entre el inicio y el final de la
elución, es decir, una anchura de pico. Los nºs. y las indicaciones
en el eje de abscisas muestran el tipo de polipéptidos (los nºs de
polipéptidos y las abreviaturas en la Tabla 1).
A partir de los resultados mostrados en la Fig.
5, se puede observar lo siguiente.
(i) Las concentraciones salinas eluyentes (las
posiciones en la elución) de los complejos
antígeno-anticuerpo, varían dependiendo del tipo de
polipéptido fijado a
AFP-A4-4\cdotFab'. El orden de la
elución de los complejos antígeno-anticuerpo era el
mismo que el orden de la elución de los productos combinados de
AFP-A4-4\cdotFab' y cada
polipéptido (véase, Ejemplo 11 y Fig. 2). Estos resultados indican
que la concentración salina eluyente de un complejo de
antígeno-anticuerpo objeto, se puede determinar de
forma adecuada escogiendo adecuadamente el tipo de polipéptido.
(ii) Puesto que la concentración salina eluyente
de
AFP-WA-1\cdotFab'-POD
era 0 para 0,1 M, el
AFP-WA-1\cdotFab'-POD
libre y el complejo antígeno-anticuerpo se podían
separar completamente entre sí, empleando cualquiera de los
polipéptidos. Particularmente, cuando se emplea cualquiera de los
polipéptidos 4 a 9 y los polipéptidos 11 a 21, la concentración
salina eluyente del complejo antígeno-anticuerpo se
puede ajustar a 0,3 M o superior, de modo que se puede evitar la
influencia de la sustancia presente en el suero junto con AFP,
empleando cualquiera de estos polipéptidos como sustancia que mejora
la separación.
Tal y como se ha descrito previamente, un
material base para POROS-DEAE, el empaquetamiento
empleado en el ejemplo presente, es algo hidrófobo de modo que los
complejos antígeno-anticuerpo formados a partir de
los productos combinados del anticuerpo y cada uno de los
polipéptidos 10 a 20 que tienen uno o más residuos de tirosina
sulfatados, tienen una concentración salina eluyente evidente mayor
que la de los formados a partir de los productos combinados del
anticuerpo y cada uno de los polipéptidos que tienen uno o varios
residuos de serina sulfatados. Por tanto, la concentración salina
eluyente evidente del complejo antígeno-anticuerpo
formado a partir del producto combinado del anticuerpo y el
polipéptido 10 que sólo tiene un residuo de ácido sulfúrico, pero
tiene un residuo de tirosina, es sustancialmente la misma que la del
complejo antígeno-anticuerpo formado a partir del
producto combinado del anticuerpo y el polipéptido 2 que tiene tres
residuos de serina sulfatados.
Sin embargo, cuando se realiza el mismo
experimento que antes, exceptuando que se emplea un empaquetamiento
obtenido a partir de un material base hidrófilo en lugar del
empaquetamiento utilizado en el experimento anterior, se anticipa lo
siguiente: la concentración salina eluyente evidente del complejo
antígeno-anticuerpo formado a partir del producto
combinado del anticuerpo y el polipéptido 10 que tiene sólo un
residuo de tirosina sulfatado, es sustancialmente la misma que la
del complejo antígeno-anticuerpo formado a partir
del producto combinado del anticuerpo y el polipéptido 1 que
contiene sólo 1 residuo de serina sulfatado, de modo que un pico
objeto se solapa con un pico debido a la sustancia presente en el
suero junto con AFP, dando como resultado una disminución de la
precisión de la medición (análisis).
(iii) A partir de los resultados anteriores, se
considera que cuando un polipéptido se emplea como sustancia que
mejora la separación, la cantidad de residuos ácidos derivados de un
ácido fuerte en el polipéptido es 3 a 20, preferentemente 4 a 30,
más preferentemente 5 a 15 (la presencia de un número elevado de
residuos ácidos no es preferible para la medición porque la
concentración salina eluyente en elución de una columna se vuelve
muy alta).
(iv) Dos o más sustancias que tienen estructuras
similares (p. ej., dos o más sustancias diferentes sólo en una parte
de una estructura, tal como la estructura de la cadena de azúcar,
isoenzimas, dos o más anticuerpos capaces de reconocer diferentes
epítopos de un antígeno), se pueden separar y medir escogiendo una
combinación de dos o más polipéptidos diferentes en la concentración
salina eluyente (p. ej., una combinación de cualquiera de los
polipéptidos 4 a 7, 8, 9, 11 a 14 y cualquiera de los polipéptidos 7
y 16 a 21) y empleando productos combinados obtenidos fijando cada
uno de los dos o más polipéptidos a una sustancia de afinidad
adecuada.
(v) Los resultados obtenidos empleando cada uno
de pAsp-1 y pAsp-2 (los pAsp en
lotes de producción diferentes) como polipéptido, sugerían que los
polipéptidos convencionales que tienen residuos de ácido
carboxílico, implican el siguiente problema: dependiendo de los
lotes de producción, los polipéptidos convencionales varían en la
concentración salina eluyente, de modo que varía la adición de una
cola a un pico objeto, es decir, es difícil obtener un polipéptido
que tenga un peso molecular uniforme. Por el contrario, el
polipéptido descrito en esta memoria, está exento de este problema
en pAsp porque se puede obtener fácilmente en forma de polipéptido
con un peso molecular uniforme mediante síntesis peptídica.
Se mezclaron 100 \mul de la solución de
anticuerpo 1, 50 \mul de la muestra y 50 \mul de la solución de
anticuerpo 2 [que contiene un producto combinado de
TSH-2\cdotFab' y
Ala-(Ser(SO_{3}H))_{5}-\betaAla 3)] que
se había preparado en el Ejemplo 13. Después de estar a 25ºC durante
30 minutos, 20 \mul de la mezcla resultante se sometieron a
medición (análisis) por HPLC, con las condiciones descritas
anteriormente. Como resultado, se eluyó un complejo objeto
antígeno-anticuerpo con la concentración salina
eluyente de un complejo de antígeno-anticuerpo
formado cuando se realizó la medición de (análisis de) AFP empleando
el polipéptido 3 (los datos de la concentración salina eluyente se
muestran también en una posición correspondiente a la abreviatura
TSH en el eje de abscisas en la Fig. 5). A partir de este resultado,
se puede observar que incluso en el caso de medir un analito
diferente, el empleo del polipéptido descrito en esta memoria como
sustancia que mejora la separación, hace posible realizar una
medición deseada (análisis) empleando HPLC bajo condiciones de
análisis definidas.
Excepto para el uso del anticuerpo monoclonal
WA-2 anti-AFP (de aquí en adelante
abreviado como "AFP-WA-2";
disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; diferente en el
epítopo de AFP-WA-1 y
AFP-A4-4) como anticuerpo y
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla como
polipéptido, se preparó un producto combinado de
AFP-WA-2\cdotFab' y
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla con los
mismos reactivos, según el mismo procedimiento que el descrito en el
Ejemplo 9. Como reactivo líquido 1, se preparó tampón MES 50 mM (pH
6,5) que contenía 139 nM del producto combinado, 1 mg/ml de lectina
de Lens culinaris (de aquí en adelante abreviado como
"LCA"; disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 mM
de cloruro de magnesio y 1 mM de cloruro cálcico.
Como reactivo líquido 2, se emplearon 50 nM de
tampón MES (pH 7,5) que contenía 147 nM del
AFP-WA-1\cdotFab'-POD
preparado en el Ejemplo 12, 156 nM del producto combinado de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAa y
AFP-A4-4\cdotFab' preparado en el
Ejemplo 9, y 0,2% (p/v) de un poli(alcohol vinílico).
AFP obtenida a partir de hepatoma humano, se
fraccionó en AFP no unida a LCA y AFP unida a LCA, empleando una
columna cargada con material de empaquetamiento de LCA inmovilizada.
Las dos se añadieron a suero humano que no contenía AFP, con una
concentración de 100 ng/ml, preparándose de este modo la muestra 1
(que contiene la AFP no unida a LCA) y la muestra 2 (que contiene la
AFP unida a LCA).
Columna: POROS-DEAE (4,6 mm
\phi x 10 mm).
Solución tampón A: tampón TAPS 50 mM (pH 8,5, que
contiene NaCl 0,25 M).
Solución tampón B: tampón TAPS 50 mM (pH 8,5, que
contiene NaCl 3 M).
Solución sustrato: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5, que
contiene 90 mM de
4-N-(4-carbobutiril)aminofenol
y 20 mM de H_{2}O_{2}).
Gradiente: Soluciones tampón A + B, caudal 2
ml/min.
| 0 \rightarrow 2 min. | B = 0% | |
| 2 \rightarrow 4,5 min. | B = 13% | |
| 4,5 \rightarrow 8 min. | B = 100% | |
| 8 \rightarrow 8,5 min. | B = 0% |
Post-columna: adición de sustrato
POD (una solución de sustrato, 0,1 ml/min). Reacción a 60ºC durante
30 s.
Detección: la fluorescencia se midió a una
longitud de onda de excitación de 328 nm y a una longitud de onda de
emisión de 432 nm.
Con 100 \mul de solución del reactivo líquido 1
se mezclaron 10 \mul de la muestra 1 o la muestra 2 y la reacción
se realizó a 8ºC durante 10 minutos. Después de lo cual se añadieron
10 \mul de reactivo 2 a la solución de la reacción y la mezcla
resultante se sometió a reacción durante otros 20 minutos. Con una
HPLC con las mismas condiciones que las anteriores, se sometieron a
medición (análisis) 80 \mul de la mezcla de reacción.
La Fig. 6 muestra los resultados de la medición.
En la Fig. 6, la línea continua (------) muestra los datos obtenidos
de la muestra 1 y la línea de guiones (- - - - -) los datos
obtenidos de la muestra 2.
Por los resultados mostrados en la Fig. 6, se
puede observar lo siguiente: un complejo
antígeno-anticuerpo (complejo 1) de AFP, el producto
combinado de AFP-WA-2\cdotFab' y
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla, y
AFP-WA-1\cdotFab'-POD
fue eluido en una posición de 2,9 min; un complejo de
antígeno-anticuerpo (complejo 2) formado por la
introducción del producto combinado de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAa y
AFP-A4-4\cdotFab' en el complejo
1, fue eluido en una posición de 5,8 min; y estos complejos se
separaban fácilmente entre sí.
De los resultados mostrados en la Fig. 6, también
se puede observar lo siguiente: en el caso de la muestra 1 que
contiene AFP no unido a LCA, complejo 2 formado por la fijación del
producto combinado de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAa y
AFP-A4-4\cdotFab' está formado
principalmente en forma de complejo de
antígeno-anticuerpo; y en el caso de la muestra 2
que contiene AFP fijable a LCA, el complejo 1 está formado
principalmente como un complejo de
antígeno-anticuerpo. Estos resultados indican que el
producto combinado de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAa y
AFP-A4-4\cdotFab' es inhibido al
reaccionar con AFP, por su competición por LCA.
El porcentaje de la cantidad de complejo 1
formado, basado en la cantidad total de los dos complejos formados
(porcentaje del complejo 1) se calculó (véase Tabla 2) para
encontrar que este porcentaje refleja la proporción de AFP unida a
LCA en cada muestra, es decir, la proporción de AFP unida a LCA en
cada muestra se puede medir utilizando dicho porcentaje.
Ejemplo
comparativo
El mismo experimento que en el Ejemplo 15 se
realizó, con la excepción de usar un producto combinado de
AFP-WA-2\cdotFab' y un polímero de
ácido aspártico con un peso molecular promedio de 6.000, en lugar
del producto combinado de
AFP-WA-2\cdotFab' y
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla, y usar
un producto combinado de
AFP-A4-4\cdotFab' y un polímero de
ácido aspártico con un peso molecular promedio de 28.800 en lugar
del producto combinado de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAa y
AFP-A4-4\cdotFab'. A continuación
se calculó el porcentaje del complejo 1.
Además, se realizó el mismo experimento que el
descrito anteriormente, exceptuando que en lugar del reactivo
líquido 1 usado anteriormente, se empleó un reactivo líquido
preparado añadiendo un \gamma-poli(ácido
glutámico) con un peso molecular promedio de 550.000 para el
reactivo líquido 1 hasta una concentración de 100 \mug/ml.
Los resultados obtenidos se muestran también en
la Tabla 2.
| Porcentaje del complejo 1 | ||
| Muestra 1 | Muestra 2 | |
| Ejemplo 14 | 42,3% | 86,9% |
| Ejemplo Comparativo | 58,4% | 82,9% |
| Ejemplo Comparativo (en presencia de \gamma-PGA*) | 41,0% | 82,3% |
| * \gammaPGA: un \gamma-poli(ácido glutámico) que tiene un peso molecular promedio de 550.000. |
De los resultados mostrados en la Tabla 2, se
puede observar lo siguiente: cuando se emplea el procedimiento del
Ejemplo Comparativo (el procedimiento que emplea el poli(ácido
aspártico)), el porcentaje del complejo 1 tiende a ser más alto en
el caso de la muestra 1, es decir, una reacción no competitiva
tiende a tener lugar, y un aditivo aniónico tal como \gammaPGA se
debe añadir para evitar este fenómeno.
Por el contrario, cuando se emplea el polipéptido
descrito en esta memoria, no es necesario un aditivo tal. Por tanto,
el procedimiento de medición que emplea el polipéptido descrito en
esta memoria como sustancia que mejora la separación, es superior
también en relación con un procedimiento de medición que emplea un
polímero que tiene grupos carboxilo (p. ej., poli(ácido aspártico))
que se ha utilizado como sustancia que mejora la separación.
Aunque no es evidente, la razón por la que se
supone el fenómeno mencionado anteriormente es la siguiente.
Ya que un polímero aniónico tal como poli(ácido
aspártico) tiene moléculas relativamente grandes, la reacción
antígeno-anticuerpo es inhibida por cargas
eléctricas, impedimento estérico, etc., dando como resultado el
fenómeno mencionado anteriormente. Por otro lado, se puede especular
que el polipéptido descrito en esta memoria tiene moléculas pequeñas
y, por tanto, afecta fuertemente a la reacción
antígeno-anticuerpo.
Como reactivo se utilizó tampón MOPS 50 mM (pH
7,5) que contenía 200 nM del producto combinado de polipéptido 18 y
AFP-A4-4\cdotFab', preparado en el
Ejemplo 9 y 100 nM del
AFP-WA-1\cdotFab'-POD.
La misma que en el Ejemplo 14.
Columna: POROS-DEAE (4,6 mm
\phi x 10 mm).
Solución tampón A: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5, que
contiene 0,1% (p/v) de un tensioactivo predeterminado).
Solución tampón B: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5, que
contiene NaCl 3 M y 0,1% (p/v) del tensioactivo predeterminado).
Solución sustrato: tampón MOPS 50 mM (pH 7,5, que
contiene 90 mM de
4-N-(4-carbobutiril)aminofenol
y 20 mM de H_{2}O_{2}).
Gradiente: soluciones tampón A+B, caudal; 1
ml/min
| 0 \rightarrow 5 min. | A = 100% | |
| 5 \rightarrow 30 min. | B = 0 \rightarrow 100% | |
| 30 \rightarrow 35 min. | B = 100% |
Post-columna: adición de sustrato
POD (una solución de sustrato, 0,1 ml/min). Reacción a 60ºC durante
30 s.
Detección: la fluorescencia se midió a una
longitud de onda de excitación de 328 nm y una longitud de onda de
emisión de 432 nm.
La Tabla 3 muestra los tensioactivos empleados
como tensioactivo añadido a los eluyentes.
| Nº | Nombre | Tipo |
| B | Ninguno | - |
| 1 | Alcohol superior de polioxietileno | No iónico |
| 2 | Éter octilfenílico de polioxietileno (10) | No iónico |
| 3 | Bromuro de n-dodeciltrimetilamonio | catiónico |
| 4 | Laurilbetaína | Anfótero |
| 5 | Propilbetaína de lauramida | Anfótero |
| 6 | Propilbetaína amida de ácido graso de aceite de coco | Anfótero |
| 7 | Betaína de 2-undecil-N-carboximetil-N-hidroxietilimidazo-lio | Anfótero |
| 8 | N-eruroil-N-metil-\beta-alamina | Anfótero |
Con 100 \mul del reactivo se mezclaron 10
\mul de la muestra y la reacción se realizó a 8ºC durante 10
minutos. Después de lo cual se analizaron 20 \mul de la mezcla de
reacción mediante HPLC con las condiciones anteriores.
La Fig. 7 muestra la concentración salina
eluyente y la anchura del pico de un complejo de
antígeno-anticuerpo de AFP que se determinaron
empleando el eluyente que contenía cada uno de los distintos
tensioactivos. En la Fig. 7, \medbullet muestra una concentración
salina en la parte superior del pico de la elución,
- - -\dashv muestra un intervalo de concentración
salina entre el inicio y el final de la elución, es decir, una
anchura de pico. Los nºs. en el eje de abscisas muestran el tipo de
tensioactivo (los nºs de tensioactivo en la Tabla 3).
A partir de los resultados mostrados en la Fig.
7, se puede observar lo siguiente.
(i) Al añadir el tensioactivo, la anchura del
pico se puede estrechar, con otras palabras, la adición de una cola
al pico durante la elución se puede evitar, es decir, la precisión
de la medición se puede mejorar. Este efecto es notable en el caso
de tensioactivos catiónicos y tensioactivos anfóteros.
(ii) La concentración salina eluyente (la
posición de elución) varía por la adición del tensioactivo, es
decir, la concentración salina eluyente de un complejo objeto de
antígeno-anticuerpo se puede ajustar adecuadamente
escogiendo cuidadosamente el tensioactivo.
Las muestras se prepararon diluyendo con solución
tampón MOPS 50 mM (pH 7,5) la
AFP-A4-4\cdotFab' producida en el
Ejemplo 10, un producto combinado de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8} y
AFP-A4-4\cdotFab', la
AFP-WA2\cdotFab' producida en el Ejemplo 15 o un
producto combinado de
Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla y
AFP-WA2\cdotFab', respectivamente, para volver el
contenido 1 mg/ml.
Cada muestra en una cantidad de 4 \mul fue
aplicada en los pocillos de aplicación de la muestra sobre un lado
del gel de agarosa al 1%. El lado aplicado se volvió un cátodo y se
realizó una electroforesis a un voltaje de 200 V durante 30 minutos,
seguido de secado de proteínas empleando Quick-CBB
(un nombre de marca, fab. por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
para medir un valor Rf de cada muestra.
Los valores Rf de las muestras fueron los
siguientes:
| Muestra | Valor Rf | ||
| AFP-A4-F4\cdot Fab' | 0,38 | ||
| [Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}]-[AFP-A4\cdot4Fab'] | 0,66 | ||
| AFP-WA2\cdot Fab' | 0,06 | ||
| [Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla]-[AFP-WA2\cdot Fab'] | 0,22 |
Tal y como se muestra arriba, al combinar el
péptido sulfatado, la carga negativa se incrementa y se alarga la
movilidad. Además, cuanto más elevado sea el número de residuos de
ácido sulfúrico en el péptido sulfatado, mayor es la movilidad.
Las muestras se prepararon añadiendo 50 \mul de
solución de AFP ajustada con solución tampón MOPS 50 mM (pH 7,5) de
forma que el contenido de AFP fuera 0,5 mg/ml para 50 \mul de una
solución del producto combinado de Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}
y AFP-A4-4\cdotFab', obtenido en
el Ejemplo 17 (1 mg/ml) en solución tampón MOPS (pH 7,5),
50 \mul de una solución del producto combinado de Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla y AFP-WA2\cdotFab' obtenido en el Ejemplo 17 (1 mg/ml) en solución de tampón MOPS (pH 7,5) o 50 \mul de solución tampón MOPS (pH 7,5), seguido de reacción a 37ºC durante 30 minutos.
50 \mul de una solución del producto combinado de Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla y AFP-WA2\cdotFab' obtenido en el Ejemplo 17 (1 mg/ml) en solución de tampón MOPS (pH 7,5) o 50 \mul de solución tampón MOPS (pH 7,5), seguido de reacción a 37ºC durante 30 minutos.
Cada muestra en una cantidad de 4 \mul fue
aplicada en los pocillos de aplicación de la muestra sobre un lado
de un gel de agarosa al 1%. El lado aplicado se volvió un cátodo y
se realizó la electroforesis a un voltaje de 200 V durante 30
minutos, seguido de metástasis de afinidad con anticuerpos
(transferencia) a temperatura ambiente durante 30 minutos, empleando
una membrana de nitrocelulosa revestida con anticuerpo
anti-AFP. Esta membrana se lavó dos veces con una
solución de lavado (NaCl al 0,9%). Después de sumergir esta membrana
en una solución de anticuerpo anti-AFP a 37ºC
durante 30 minutos, esta membrana se lavó dos veces usando la
solución de lavado. A continuación, esta membrana se sumergió en una
solución de anticuerpo anti-IgG marcado con POD a
37ºC durante 30 minutos, seguido de lavado dos veces con la solución
de lavado. Después, se reveló el color de esta membrana en una
solución de revelado de color (solución de tampón fosfato 50 mM (pH
7,5) que contenía 0,37 mM de azul de nitrotetrazolio, 2,6 mM de
dinucleótido de \beta-nicotinamida adenina, la
forma reducida y 0,01% de peróxido de hidrógeno), seguido de
medición del valor Rf del producto de la reacción
antígeno-anticuerpo.
Los valores Rf de las muestras eran los
siguientes:
| Muestra | Valor Rf | ||
| Producto de la reacción antígeno anticuerpo de | |||
| [Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}]- [AFP-A4-4\cdotFab'] con AFP | 0,63 | ||
| Producto de la reacción antígeno anticuerpo de | |||
| [Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla]-[AFP-WA2\cdotFab'] con AFP | 0,20 | ||
| AFP | 0,85 |
Tal y como se observa arriba, está claro que los
valores Rf del producto de la reacción
antígeno-anticuerpo de
[Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}]-[AFP-A4-4\cdotFab']
con AFP y de
[Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}-\betaAla]-[AFP-WA2\cdotFab']
con AFP son, respectivamente, casi los mismos que los de
[Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}]-[AFP-A4-4\cdotFab']
y de
[Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla]-[AFP-WA2\cdotFab'].
Por tanto, se ha encontrado que la carga negativa de AFP no influye
sobre los valores de Rf del producto de la reacción
antígeno-anticuerpo de
[Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{8}]-[AFP-A4-4\cdotFab']
con AFP y de
[Ala-(Tyr(SO_{3}H))_{5}-\betaAla]-[AFP-WA2\cdotFab']
con AFP.
Tal y como se ha descrito anteriormente, la
presente invención proporciona un procedimiento para medir un
analito que se va a medir en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo que emplea un polipéptido que tiene 3 a 30 residuos
ácidos derivados de un ácido fuerte que tiene un pKa de 3 o
inferior. Cuando un complejo formado por la interacción entre un
analito que se va a medir en una muestra obtenida a partir de un
organismo vivo y una sustancia de afinidad, se separa por un método
de intercambio aniónico, de la sustancia de afinidad libre y las
sustancias presentes en la muestra que tienden a afectar la
detección del complejo, dicho polipéptido se puede utilizar para
separar el complejo de la sustancia de afinidad libre y similares,
de forma más eficaz. La presente invención es notablemente eficaz
porque el procedimiento de medición de la presente invención hace
posible medir un componente traza en una muestra obtenida a partir
de un organismo vivo, tal como suero, de forma más fácil y en menos
tiempo, con mayor precisión cuando se compara, por ejemplo, con
procedimientos convencionales de medición según EIA, RIA o
similares, y procedimientos que emplean un polímero que tiene grupos
carboxilo, como sustancia que mejora la separación. Por tanto, la
presente invención contribuye considerablemente con la técnica.
Claims (5)
1. Un procedimiento para medir un analito en una
muestra obtenida a partir de un organismo vivo, cuyo procedimiento
comprende:
hacer reaccionar una muestra obtenida a partir de
un organismo vivo con un reactivo, comprendiendo dicho reactivo un
producto combinado de un polipéptido que tiene 3 a 30 residuos
ácidos derivados de un ácido fuerte que tiene un pKa de 3 o
inferior, y una sustancia que tiene afinidad por el analito,
separar el complejo resultante, y
determinar la cantidad de analito en la muestra,
basándose en la cantidad de complejo.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ácido fuerte es ácido sulfúrico o ácido fosfórico.
3. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que el extremo
N-terminal de dicho polipéptido está unido mediante
un espaciador a un grupo maleimido y dicha sustancia que tiene
afinidad por el analito, tiene un grupo SH.
4. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la separación del complejo
resultante se realiza según un método de aplicación de carga
negativa empleando un intercambiador aniónico.
5. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la separación del complejo
resultante se realiza empleando un intercambiador aniónico y un
tensioactivo se añade a un eluyente empleado en el intercambiador
aniónico.
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