ES2213441B1

ES2213441B1 - Metodo para determinar la contaminacion medioambiental mediante la deteccion de enterovirus bovino (evb) o porcino (evp).

Info

Publication number: ES2213441B1
Application number: ES200200394A
Authority: ES
Inventors: Victoria Ley Vega De Seoane; Miguel Angel Jimenez Clavero
Original assignee: Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Current assignee: Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Priority date: 2002-02-19
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2005-05-16
Anticipated expiration: 2022-02-19
Also published as: EP1336663B1; ES2213441A1; DE60307337D1; US20040058312A1; EP1336663A2; DE60307337T2; EP1336663A3; US7122315B2; ATE335854T1

Abstract

Método para determinar la contaminación medioambiental mediante la detección de entero virus bovino (EVB) o porcino (EVP). El método comprende la detección de enterovirus bovino (EVB) o porcino (EVP) en una muestra de ensayo, en donde la detección de EVB o de EVP, por ejemplo mediante RT-PCR, en dicha muestra de ensayo es indicativa de la existencia de contaminación. El método permite detectar la presencia o ausencia de EVB o EVP en una muestra de ensayo y, a partir de ahí, determinar la existencia de contaminación medioambiental, especialmente de contaminación fecal de origen bovino y porcino, en la muestra de ensayo, y, consecuentemente, en donde se ha recogido la muestra de ensayo. La caracterización y/o tipificación molecular o serológica del enterovirus detectado y su comparación con la de otros enterovirus presentes en fuentes de contaminación próximas a donde se han recogido las muestras para su análisis permite, adicionalmente, identificar el origen de dicha contaminación.

Description

Método para determinar la contaminación medioambiental mediante la detección de enterovirus bovino (EVB) o porcino (EVP).

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con la detección de organismos indicadores de la contaminación medioambiental, en particular, con el empleo del enterovirus bovino (EVB) y porcino (EVP) como marcadores de la contaminación fecal de origen animal en una muestra de ensayo, con el objetivo de determinar la existencia de contaminación medioambiental, prevenir la infección humana o animal e identificar el origen de la contaminación, mediante amplificación enzimática in vitro y análisis de secuencias genéticas específicas.

Antecedentes de la invención

La contaminación de aguas y pastos puede ocasionar patologías de diversa índole en los animales que ingieren dichas aguas y pastos contaminados. El control de estos posibles focos infecciosos requiere conocer la posible contaminación de tales pastos y aguas, y, consecuentemente, aplicar el correspondiente tratamiento para descontaminar los mismos, evitando o reduciendo de ese modo el riesgo de aparición de infecciones humanas o animales. Una fuente de contaminación medioambiental comprende las heces de animales, las cuales pueden ser portadoras de diversos organismos potencialmente contaminantes del medio ambiente y/o patógenos para plantas y animales, incluido el hombre.

El análisis de la contaminación microbiológica fecal de aguas se realiza habitualmente determinando la presencia de organismos, no necesariamente patogénicos, identificados como "organismos indicadores o marcadores". En este sentido, se ha descrito el empleo de algunas bacterias fecales, por ejemplo, Escherichia coli, como marcador de la contaminación fecal (EP 438115 A2).

Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que pueden utilizarse los enterovirus, concretamente, el enterovirus bovino (EVB) y el enterovirus porcino (EVP) como marcadores de la contaminación medioambiental, en particular, como marcadores de la contaminación fecal de aguas y pastos. Los enterovirus (EV) porcino y bovino se consideran endémicos en ganado bovino y porcino en muchas regiones. Generalmente, las infecciones causadas por estos EV son asintomáticas en animales sanos, que actúan como portadores, pero también pueden causar diarreas y abortos. Se transmiten por la vía fecal-oral y se excretan en grandes cantidades en las heces de animales infectados, por lo que, en principio, sería posible correlacionar una contaminación del medioambiente por EVB o EVP con las heces procedentes de una granja de ganado bovino o porcino.

Los enterovirus (EV) pertenecen a la familia Picornaviridae. Son los virus más comunes e infectan a una amplia variedad de mamíferos. Se han identificado aproximadamente 90 serotipos, 62 que infectan a humanos y 27 que infectan a animales. Estos virus pueden ser transmitidos muy fácilmente en la naturaleza debido a que infectan el tracto gastrointestinal, causando frecuentemente infecciones asintomáticas o leves y produciendo gran cantidad de progenie viral que permanece en las heces. Las partículas virales son muy estables bajo muchas condiciones medioambientales (amplios intervalos de pH, temperaturas y salinidad), por lo que los enterovirus pueden permanecer infecciosos durante largos períodos de tiempo en suelos, en especímenes biológicos, y en medioambientes acuáticos.

Se ha descrito la existencia de virus en medioambientes marinos, aunque se cree que la mayoría de los virus encontrados en aguas naturales son cianófagos o de otro tipo capaz de infectar microalgas. Asimismo, se ha descrito la existencia de agua contaminada por virus entéricos humanos, especialmente en sitios próximos a áreas urbanas, relacionados con focos de infecciones humanas [Chapron et al., 2000, Appl. Environ. Microbiol. 66:2520-2525; Abbaszadegan et al., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59:1318-1324; Abbaszadegan et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65:444-449; Bosch A., 1998, Int. Microbiol. 1:191-196; Pianetti et al., 2000, Epidemiol. Infect. 125:455-462; Schvoerer et al., Res. Microbiol. 152:179-186]. Sin embargo, la contaminación de aguas superficiales por heces animales que contienen enterovirus no ha sido investigada.

Los avances en técnicas de biología molecular han dado lugar a protocolos RT-PCR (transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa) altamente sensibles y específicos con mejores realizaciones que los métodos clásicos de aislamiento para la detección de enterovirus. Además de ser muy sensible, la reacción RT-PCR proporciona un fragmento de DNA que puede ser secuenciado y utilizado para tipificar el aislado. La detección se realiza generalmente utilizando iniciadores específicos de regiones RNA que contienen motivos conservados compartidos por este grupo de virus (Hyypia et al., 1989, J. Gen. Virol. 70:3261-3268; De León et al., 1990, Pro. 1990 Amer. Water Works Assoc. WQTC; Reynolds et al., 1996, Appl. Environ. Microbiol. 62:1424-1427; Puig et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:2963-2970; Schwab et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:531-537). El genoma de enterovirus es una molécula de cadena simple de RNA de polaridad positiva (ssRNA+) con 7.400 nucleótidos aproximadamente. Existe una región del genoma que codifica la cápside y las proteínas no estructurales, precedida por una región no codificante de, aproximadamente, 800 nucleótidos (nt), que tiene una región adicional de 110 nt en EVB. Esta región adquiere una estructura secundaria que es importante en la traducción y replicación del genoma viral y contiene un número de motivos conservados en entero- y rinovirus [Zell et al., 1997, Virus Res. 51:213-229; Zell et al., 1999, J. Gen. Virol. 80:2299-2309].

Compendio de la invención

Debido a que los EV se encuentran en ganado bovino y porcino, generalmente como una infección asintomática, y se excretan por sus heces, se ha estudiado la prevalencia y genotipo en un rebaño cerrado de ganado y se ha comparado con el virus encontrado en animales próximos a su entorno medioambiental y en especímenes medioambientales. En el caso de EVB se encontró virus en las heces de la mayoría del ganado bovino, así como en animales medioambientalmente próximos que compartían los mismos pastos, y en el agua obtenida de los tanques de agua de bebida de los animales, agua de los pastos, corrientes de aguas de los pastos y agua del río que atravesaba los pastos. Asimismo, se encontró EVB en ostras recogidas en aguas de la bahía, en la que desembocaban ríos y arroyos que atravesaban dichos pastos (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción). Por ello, se evaluó la posibilidad de que dicho virus pudiera ser utilizado como un organismo indicador (marcador) de la contaminación fecal originada en una granja de ganado bovino. El análisis de secuencias parciales de los genomas virales indicó que las mismas variantes de EVB se encontraban en los animales y en las áreas contaminadas. Estos resultados mostraron que mediante esta técnica de secuenciación del genoma, se puede determinar el origen de la contaminación así como realizar estudios epidemiológicos y sobre la evolución molecular viral.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la variabilidad entre las secuencias 5' NTR del EVB aislado de heces de ganado bovino. El asterisco (*) corresponde aun nucleótido delecionado. C+ corresponde a la secuencia del aislado PS 87 de EVB obtenido de la ATCC (n° de catálogo VR-774), utilizado en esta invención como control positivo. La numeración de los nucleótidos se refiere a la secuencia del aislado PS 87 de EVB (n° de acceso en EMBL X79368). Se han separado las secuencias de aislados de EVB con cambios en nucleótidos similares.

La Figura 2 muestra la variabilidad entre las secuencias de EVB de diferentes fuentes y los serotipos más relacionados. PS 87 es la secuencia depositada en EMBL (n° de acceso X79368). RM2 es un EVB serotipo 2 (EMBL n° de acceso X79369). VG 527 es un EVB serotipo 1 (EMBL n° de acceso D00214). C+ corresponde a la secuencia del aislado PS 87 de EVB obtenido de la ATCC (n° de catálogo VR-774), utilizado en esta invención como control positivo. C corresponde a extractos fecales de ganado bovino. WF y WI corresponden a muestras de agua de la granja Wye y de arroyos, respectivamente. D corresponde a muestras fecales de ciervos y G a muestras fecales de gansos. O corresponde a ostras (estómago) y OP a un pool de lavados de agallas de ostras. El asterisco (*) corresponde a un nucleótido delecionado. Los cambios en los nucleótidos que son compartidos por todos los aislados aparecen resaltados.

Descripción detallada de la invención

La invención se relaciona, en general, con el empleo de enterovirus bovino (EVB) y porcino (EVP) como organismos indicadores (marcadores) de la contaminación medioambiental, en particular, como marcadores de la contaminación fecal, de origen bovino o porcino, en el medio ambiente. Por tanto, la invención proporciona un método para determinar la existencia de contaminación medioambiental, en particular, de contaminación fecal de origen bovino o porcino, en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho método la detección de EVB o EVP en dicha muestra de ensayo, en el que la detección de dichos virus en dicha muestra de ensayo es indicativa de la existencia de contaminación medioambiental, en particular, de contaminación fecal de origen bovino y/o porcino. La caracterización y/o tipificación molecular del EV detectado y su comparación con la de otros EV presentes en fuentes de contaminación próximas a donde se han recogido las muestras de ensayo para su análisis permitiría identificar el origen de dicha contaminación fecal.

La detección de enterovirus (EV) como marcador de contaminación medioambiental, en particular de contaminación fecal de origen bovino o porcino, se realiza mediante amplificación enzimática (RT-PCR) de una región del genoma viral y el análisis de su secuencia de nucleótidos. Por tanto, la invención proporciona un método para determinar la existencia de contaminación medioambiental en una muestra de ensayo, mediante la detección de EVB o EVP como marcador de dicha contaminación, que comprende:

a): recoger una muestra de ensayo en la que se desea conocer la existencia de contaminación medioambiental mediante la detección de EVB o EVP;

b): tratar dicha muestra de ensayo bajo condiciones que permiten liberar y extraer el RNA de las partículas virales eventualmente presentes en dicha muestra de ensayo;

c): poner en contacto RNA extraído de las partículas virales eventualmente presentes en dicha muestra de ensayo con una mezcla de reacción para la transcripción inversa (TR) y para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), bajo condiciones en las que una secuencia de nucleótidos diana presente en el genoma de dicho EVB o EVP es amplificada para formar un producto de amplificación; y

d): analizar el producto de amplificación para determinar la presencia o ausencia en dicha muestra de ensayo de dicho EVB o EVP que lleva la secuencia diana seleccionada,

en donde la detección de EVB o EVP en dicha muestra de ensayo es indicativa de la existencia de contaminación medioambiental por residuos fecales de origen animal.

El método proporcionado por esta invención comienza con la recogida de la muestra de ensayo. La muestra de ensayo puede ser recogida de cualquier sitio susceptible de contener enterovirus animales y en el que se desea conocer la existencia o no de contaminación medioambiental, en particular, por residuos de origen ganadero. A modo ilustrativo dicha muestra de ensayo se puede recoger de las instalaciones ganaderas, del agua de bebida para el ganado, del medio ambiente circundante (pastos, agua, etc.), de especímenes medioambientales, de medios acuáticos en contacto directo o indirecto con la posible fuente de contaminación, por ejemplo, efluentes de la instalación ganadera que contienen los residuos ganaderos, ríos próximos a la fuente de contaminación o que atraviesan la posible fuente de contaminación, etc. La fuente de contaminación puede ser, por ejemplo, una instalación ganadera, típicamente, una granja de ganado bovino o porcino.

La muestra de ensayo puede ser cualquier muestra susceptible de contener EV (EVB o EVP), por ejemplo, una muestra biológica, tal como una muestra de heces de un animal, una muestra de tejidos o células de animales, etc., o una muestra medioambiental, por ejemplo, una muestra de especímenes medioambientales, una muestra de pastos, una muestra de agua, una muestra de moluscos recogidos en aguas potencialmente contaminadas, etc.

La muestra de ensayo se somete, a continuación, a un tratamiento adecuado para extraer el RNA de las partículas virales eventualmente presentes en dicha muestra de ensayo antes de ponerla en contacto con la mezcla de reacción para RT y para la PCR. La extracción del RNA de EV se puede realizar mediante métodos convencionales, utilizando kits y reactivos convencionales (véase el Ejemplo, apartado Materiales y Métodos).

La reacción RT-PCR puede realizarse por métodos convencionales, bien en un solo paso o bien en dos pasos. Ambas alternativas son conocidas por los técnicos en la materia. Dependiendo de la alternativa elegida la mezcla de reacción contendrá unos u otros reactivos, tal como se mencionará más adelante.

La mezcla de reacción para efectuar la RT del RNA de EV contiene los reactivos necesarios para efectuar dicha reacción, por ejemplo, agua, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), un tampón adecuado para la reacción de RT, una transcriptasa inversa, un oligonucleótido iniciador que se hibrida con una región del RNA del EV en cuestión y, a partir de ahí, por acción de la transcriptasa inversa permite la obtención de un DNA complementario (cDNA) a dicho RNA, etc. Por su parte, la mezcla de reacción para efectuar la PCR, contiene los reactivos necesarios para la realización de dicha reacción, por ejemplo, agua, dNTPs, un tampón adecuado para la reacción de la PCR, una DNA polimerasa termoestable, un par de iniciadores que permiten la amplificación de una secuencia diana del genoma del EV en cuestión, una sal magnésica, etc.

En una realización particular, el método proporcionado por esta invención se realiza utilizando una única mezcla de reacción RT-PCR que contiene los reactivos necesarios para la realización de dicha reacción, por ejemplo, agua, dNTPs, un tampón adecuado para las reacciones RT-PCR, una transcriptasa inversa, una DNA polimerasa termoestable, etc. Existen kits disponibles en el mercado que proporcionan esa mezcla de reacción a la que se añaden los iniciadores apropiados. En este caso, ventajosamente, el iniciador utilizado como molde en la reacción de RT es uno de los iniciadores implicados en la reacción de amplificación enzimática (PCR).

Para la puesta en práctica del método proporcionado por esta invención se puede utilizar cualquier iniciador que permita la obtención de un cDNA del EV en cuestión así como cualquier par de iniciadores que permite la amplificación de una secuencia diana del genoma del EV en cuestión. En una realización particular, el iniciador útil para la obtención de un cDNA de EVB es uno de los iniciadores del par de iniciadores que permite la amplificación de una secuencia diana del genoma de EVB. A modo ilustrativo, dichos iniciadores son específicos de regiones RNA que contienen motivos conservados compartidos por EV. En una realización particular, dichos iniciadores son los iniciadores identificados en esta descripción como SEC. ID. N°: 1 y SEC. ID. N°: 2 que amplifican un fragmento de 183 pares de bases (pb) que contiene parte del extremo 5'-terminal del RNA de EVB.

La reacción RT-PCR se realiza mediante el empleo de técnicas convencionales (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción), bajo condiciones en las que un fragmento de DNA amplificable, eventualmente presente en el medio de reacción, representativo de una secuencia diana de EV es amplificado para formar un producto de amplificación. El producto de amplificación es analizado por electroforesis y secuenciado y, a partir de ahí, se determina la presencia o ausencia en dicha muestra de ensayo de EV que lleva la secuencia diana seleccionada y la identificación del aislado viral. La identificación del aislado del (o de los) enterovirus detectado(s) puede realizarse mediante, por ejemplo, secuenciación de la región del genoma viral amplificado. La detección de EV en dicha muestra de ensayo es indicativa de la existencia de contaminación medioambiental, en particular, de contaminación fecal de origen ganadero. Para efectuar dicho análisis, los productos de la amplificación enzimática se pueden separar y analizar por cualquier método convencional. En una realización particular, los productos de la reacción RT-PCR se separan mediante electroforesis en agarosa y se visualizan por métodos convencionales, por ejemplo, mediante luz ultravioleta tras tinción con bromuro de etidio.

El método proporcionado por esta invención permite detectar la presencia o ausencia de EVB o EVP en una muestra de ensayo y, a partir de ahí, determinar la existencia de contaminación medioambiental, especialmente de contaminación fecal de origen ganadero (bovino o porcino), en la muestra de ensayo, y, consecuentemente, en donde se ha recogido la muestra de ensayo. La caracterización y/o tipificación molecular (secuenciación del DNA y análisis de las secuencias) del EV detectado y su comparación con la de otros EV presentes en fuentes de contaminación próximas a donde se han recogido las muestras para su análisis permite, adicionalmente, identificar el origen de dicha contaminación fecal (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción).

El método proporcionado por esta invención puede utilizarse en distintas aplicaciones, por ejemplo, en la determinación de contaminación medioambiental, en particular, contaminación fecal de origen bovino o porcino, en la localización del origen de dicha contaminación, en la realización de estudios epidemiológicos y sobre la evolución molecular viral.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para localizar el origen de una fuente de contaminación medioambiental, en particular, una fuente de contaminación fecal de origen ganadero, por ejemplo bovino o porcino, que comprende la detección de EVB o EVP en una muestra de ensayo según el método previamente mencionado y la comparación de los EV eventualmente detectados en dicha muestra de ensayo con otros EV aislados y caracterizados en distintas posibles fuentes de contaminación, en donde la existencia de un determinado grado de identidad entre los aislados de EV detectados y caracterizados en dicha muestra de ensayo y los aislados de EV encontrados en una posible fuente de contaminación es indicativa de que dicha posible fuente de contaminación es la fuente de contaminación medioambiental, en particular, la fuente de contaminación fecal de origen ganadero (bovino o porcino).

Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "determinado grado de identidad" se refiere que la identidad entre los aislados de EV detectados y caracterizados en dicha muestra de ensayo y los aislados de EV encontrados en dicha posible fuente de contaminación es igual o superior al 50%, preferentemente, igual o superior al 80%, y más preferentemente, igual o superior al 95%, cuando dicho grado de identidad se determina, por secuenciación molecular de la región del genoma viral que se ha utilizado en este trabajo. Si se utilizara ora región menos conservada del genoma de EV estos valores podrían ser algo diferentes. Alternativamente pueden utilizarse otras técnicas, por ejemplo de tipificación molecular, serológicas, etc., que permitan comparar aislados de EV y concluir la pertenencia de 2 aislados de EV diferentes a un mismo genotipo o serotipo.

La invención puede materializarse en un kit para la detección de EVB y/o EVP, como marcadores de contaminación medioambiental, en particular de contaminación fecal de origen bovino o porcino, mediante RT-PCR, que comprende un iniciador que permite la obtención de un cDNA de EVB o EVP, y/o un par de iniciadores que permite la amplificación de una secuencia diana del genoma del EV en cuestión. En una realización particular, el iniciador útil para la obtención de un cDNA de EV es uno de los iniciadores del par de iniciadores que permite la amplificación de una secuencia diana del genoma de EV. A modo ilustrativo, dichos iniciadores son específicos de regiones RNA que contienen motivos conservados compartidos por enterovirus. En una realización particular, dichos iniciadores son los iniciadores identificados en esta descripción como SEC. ID. N°: 1 y SEC. ID. N°: 2 que amplifican un fragmento de 183 pb que contiene parte del extremo 5'-terminal del RNA de EVB.

Los kits proporcionados por esta invención pueden presentarse en forma de estuche conteniendo, además de unos recipientes con los iniciadores mencionados u otros iniciadores que tengan la misma finalidad, unos recipientes con la totalidad o parte del resto de reactivos necesarios para la realización del método proporcionado por esta invención, por ejemplo, agua, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), un tampón adecuado para la reacción (RT, PCR o RT-PCR), una transcriptasa inversa, una DNA polimerasa termoestable, una sal magnésica, etc. Adicional y opcionalmente, los kits proporcionados por esta invención pueden incluir unos recipientes con RNA (o con cDNA) de EVB y/o EVP bien caracterizado para su empleo como control positivo.

El siguiente ejemplo ilustra la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.

Ejemplo Determinación de la existencia de contaminación medioambiental a partir de una granja con ganado bovino 1. Materiales y métodos Virus y células

El enterovirus bovino tipo 2 (aislado PS 87) se obtuvo a partir de la ATCC (Manassas, VA, USA). El virus se propagó en células MDBK (Madin Darbi Bovine Kidney) crecidas en medio mínimo esencial de Earle (MEM) conteniendo un 5% de suero de ternera fetal y antibióticos. Las células fueron infectadas a razón de 1 unidad formadora de placa (ufp)/célula y el sobrenadante conteniendo la progenie viral, fue recolectado después de 24-36 h, cuando se observaron efectos citopáticos en la mayoría (>80%) de la monocapa celular. El sobrenadante conteniendo el virus se clarificó mediante centrifugación a 5.000 x g durante 15 minutos a 4°C. El stock de virus fue titulado en células MDBK y guardado a 20°C hasta su utilización. Las células de riñón BGM fueron suministradas por M.A. Jiménez-Clavero (INIA, Madrid - ESPAÑA).

Recogida de muestras fecales

Las muestras fecales se recogieron directamente del recto de ganado bovino (n=138), de las heces de ciervos de cola blanca (Odocoileus virginianus) (n=50), y de las heces de gansos de Canadá (Branta canadensis) (n=4), en pastizales de la Granja de Investigación Wye de la Universidad de Maryland, Queenstown, MD. Aproximadamente 15 g de heces se suspendieron en 30 ml de tampón fosfato salino (PBS) durante 12 h con agitación ocasional. La suspensión se centrifugó durante 15 minutos a 15.000 x g y el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio. Se añadió PBS hasta un volumen final de 50 ml y se centrifugó de nuevo durante 10 minutos a 15.000 x g. Los sobrenadantes se filtraron a través de una membrana, de 0,4 \mum de tamaño de poro, fueron suplementados con antibióticos y guardados a -20°C hasta su utilización. En el caso de las heces de ciervos y gansos, después de la primera centrifugación, los extractos se trataron con 5% de cloroformo para extraer el virus del material orgánico, y, a continuación, los tubos se centrifugaron a 10.000 x g durante 5 minutos y los sobrenadantes se transfirieron a un tubo limpio, se filtraron a través de una membrana de 0,4 \mum de tamaño de poro, se suplementaron con antibióticos y se guardaron a -20°C.

Recolección de muestras de agua

Las muestras de agua (200 ml) se recogieron de diferentes lugares de la propia Granja de Investigación Wye y de lugares cercanos, así como de lugares adyacentes al río Wye en Queenstown (Maryland). Las muestras WI1 y WI2 se tomaron de corrientes que fluyen desde los campos de pasto del ganado a la ría Wye adyacente. Las muestras WF1, WF2 y WF5 se tomaron de aguas estancadas de los pastos. Las muestras WF3 y WF4 se tomaron del agua potable de los tanques utilizados por el ganado en la granja. El RNA se extrajo directamente de estas muestras de agua, sin concentrarlas, tal como se describe más adelante. Las muestras WR1 (Covington Cove), WR2 (Bryan Bar), WR3 (Pintail Point) y WR4 (Bluffs Point) consistían en 50 litros de agua recogida en distintos sitios de la ría Wye, a aproximadamente 2 km. de la costa y a aproximadamente 2 m por debajo de la superficie (salinidad 14,0 a 15,0 ppt (pars per thousand, es decir, g de sal por kg. de agua); temperatura: 4,7°C-5,8°C). Estas muestras de agua se filtraron a través de una membrana con un tamaño de poro de 3 \mum (MF, 293 mm de diámetro, Millipore). Las membranas se cortaron en trozos y el filtrado se recuperó mediante lavado de las membranas en PBS (5 cm^{2}/ml) durante 30 minutos con agitación en vortex. Todas las muestras se almacenaron en tubos estériles a 4°C hasta su uso.

Muestras de ostras

Se recogieron muestras de ostras (Crassostrea virginica) en una barra de la ría Wye, a aproximadamente 3 km. río abajo de la granja. Inmediatamente después de su recogida, las ostras se diseccionaron, recogiéndose sus estómagos, agallas y hemolinfa que se almacenaron en tubos de polipropileno, que se mantuvieron en hielo hasta llegar al laboratorio. Dentro de las primeras 24 h desde su recogida, las muestras de estómago y agallas se procesaron individualmente. Los tejidos se cortaron en trozos pequeños y se lavaron con 5 ml de MEM durante 1 h con agitación en vortex ocasional. Después de centrifugar a 1.000 x g durante 10 minutos, los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0,4 \mum de tamaño de poro, se suplementaron con antibióticos y se transfirieron a tubos limpios. Todas las muestras se almacenaron a -20°C hasta su uso.

Infectividad viral

Las muestras de los extractos fecales y de las ostras se añadieron a células MDBK sembradas en placas de 24 ó 96 pocillos (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lake, NI), a una dilución final 1:5 (por ejemplo, 40 Fl de extracto fecal:160 \mul de medio de cultivo). Los cultivos se mantuvieron a 37°C y 5% de CO2 durante 2 a 6 días. Se observó efecto citopático (CPE) en monocapas celulares entre los 2 y 4 días de incubación. Después de 5 días de cultivo no se observaron nuevos pocillos con CPE.

Las muestras de agua se diluyeron 1:3 en medio de cultivo y la infectividad se determinó mediante la aparición de CPE tal como se describió más arriba.

Todas las muestras que no exhibieron CPE en células MDBK, se sembraron en células BGM de riñón, donde tampoco produjeron CPE.

Extracción de RNA

El RNA se extrajo con el mini kit QIAamp Viral RNA (Qiagen, Valencia, CA). Un volumen de 140 \mul de cada muestra (agua, eluatos de agua, lavados de ostras, extractos fecales o sobrenadantes de cultivos) se procesaron siguiendo las instrucciones del suministrador. El RNA extraído se eluyó en 60 \mul de agua libre de RNasa.

Detección de virus

Un fragmento de 183 pares de bases (pb) conteniendo parte del extremo 5'- terminal de la molécula de RNA se amplificó para detectar RNA de EVB con el kit One-Step RT-PCR Superscript One-Step RT-PCR (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Los oligonucleótidos fueron suministrados por Gene Probe Technologies, Inc., USA, e incluían un iniciador directo [SEC. ID. N°: 1, 5'-ACGGAGTAGATGGTATTCCC-3', nucleótidos 188 a 207], y un iniciador inverso [SEC. ID. N°: 2, 5'-CGAGCCCCATCTTCCAGAG-3', nucleótidos 389 a 420]. La reacción de amplificación se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se realizaron en un volumen total de 25 \mul conteniendo 1 x tampón de reacción, 0,5 \muM de cada iniciador y 0,5 \mul de la mezcla enzimática transcriptasa inversa-DNA Taq polimerasa. Un total de 6 \mul de RNA extraído se probó para cada muestra. El ciclo térmico consistió en 50°C durante 30 minutos, 95°C durante 15 minutos y 40 ciclos de: 94°C durante 45 s, 56°C durante 45 s, y 72°C durante 1 minuto. Una elongación final a 72°C se llevó a cabo al final de cada reacción. Los productos de reacción (10 \mul) se analizaron mediante electroforesis en agarosa y se tiñeron con 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. Se tomó especial cuidado para evitar contaminación por RNA y falsos positivos. Los controles positivos nunca se procesaron el mismo día que los especímenes, y todo el proceso de extracción de RNA se hizo en ambientes separados estériles.

Sensibilidad en la detección de EVB

Antes del análisis de las muestras, la sensibilidad del método se determinó mediante la introducción de cantidades conocidas de EVB-2 (cepa PS 87) en un extracto fecal libre de EVB. El protocolo para la extracción de RNA seguido de la amplificación RT-PCR fue capaz de detectar una cantidad de virus correspondiente a 0,2 - 2 ufp en 14 \mul de extracto fecal, que corresponde a la mínima cantidad detectada en 3 \mug de heces. Esto indica que todo el ganado encontrado positivo mediante este método, tenía al menos 119 ufp/g de heces. Para determinar la sensibilidad del método para extraer RNA del agua, se añadieron cantidades conocidas de EVB-2 a agua libre de RNasa y se siguió el protocolo de extracción habitual. Una muestra de agua positiva indicaba que la concentración de EVB era, al menos, de 1,4 ufp/ml de agua no concentrada y aproximadamente de 37 ufp/l de agua filtrada. Esta estimación se refiere al título de partículas infecciosas, y no a la cantidad de moléculas de RNA viral, ya que no todas las partículas virales son infecciosas en una cepa viral. El límite de detección de la propia RT-PCR era de 5-10 copias del genoma RNA.

Secuenciación y análisis de secuencias

Los productos de la amplificación del DNA (15 \mul) obtenidos después de las reacciones RT-PCR se purificaron en gel utilizando un kit de purificación QIAquick PCR purification (Qiagen) y se secuenciaron con los mismos iniciadores utilizados para la amplificación. Cuando se observó más de una banda, la banda correspondiente al tamaño correcto del EVB, se cortó y el DNA se extrajo y se purificó utilizando el kit de extracción Qiaquick Gel Extraction (Qiagen). Las secuencias se realizaron en un secuenciador de DNA ABI PRISM 377 (Applied Biosystems, Perkin Elmer) o en el Servicio de Secuenciación del Centro de Investigaciones Biológicas (Madrid, España), utilizando un aparato similar. Los análisis de secuenciación se realizaron utilizando las herramientas de búsqueda y alineamientos de la base de datos de la EMBL Fasta3 y ClustaIW, respectivamente (http://www.ebi.ac.uk/Toolsl).

2. Resultados EVB en ganado

Se procesaron heces de 139 piezas de ganado para detectar EVB. De ellas, 137 muestras se recogieron en la propia granja, en Queenstown, MD, y las otras 2 muestras se obtuvieron de ganado estabulado en Beltsville Agricultural Research Center Dairy (Beltsville, MD). Estas últimas muestras se utilizaron como controles negativos. La infectividad de todos los extractos fecales fue examinada en cultivos MDBK. La infectividad era variable; algunos extractos eran altamente citopatogénicos, causando la destrucción completa de la monocapa celular en 2 días. Otros extractos produjeron CPE visible después de 4 días de cultivo, y algunas veces sólo una pequeña área de la monocapa celular resultó afectada. Otros extractos produjeron CPE sólo en uno de los pocillos duplicados, o dieron resultados no reproducibles. La sensibilidad del método se comparó con la del protocolo de formación de placa con agar semisólido utilizando cantidades conocidas de ufp de EVB-2, obteniéndose resultados similares (no mostrados). Los mismos niveles de sensibilidad se obtuvieron en muestras fecales negativas evaluadas con cantidades conocidas de EVB-2, lo que indicaba que, que bajo estas condiciones, los extractos fecales no inhibían la infección celular o el crecimiento celular. En su conjunto, aproximadamente el 40% de las muestras de extractos fecales produjeron CPE (no se incluyeron los resultados dudosos) (Tabla 1). Todas las muestras fecales que se mostraron infecciosas en células MDBK (n=56) y 30 muestras fecales que eran negativas o dudosas, se sometieron a extracción de RNA para la detección de RNA de EVB. En este análisis, el 76% de las muestras fueron positivas (Tabla 1), rindiendo un fragmento de DNA del tamaño esperado (183 nt). Interesantemente, sólo 51 de 56 muestras, que resultaban infecciosas para las células MDBK, también resultaron positivas por RT-PCR utilizando iniciadores de EVB. Sin embargo, 21 de las 39 muestras que no mostraron CPE tenían una banda de DNA del tamaño esperado para iniciadores de EVB.

TABLA 1 Detección de EVB en extractos fecales de ganado

	N° de extractos	N° de extractos positivos por RT-PCR
CPE +	56/139 (40,3%)	51/56 (78%)
CPE -	83/139 (59,7%)	21/39 (54%)
Total	139	72/95 (76%)

Análisis de EVB en áreas potencialmente contaminadas por estiércol de ganado

Puesto que se determinó que la mayor parte del ganado estaba infectado con EVB y el virus se excretaba en las heces, el estudio se extendió para determinar si la carga viral podría contaminar agua estancada en pastos, agua de los tanques de agua potable, agua que fluye de los pastos, y agua en la ría Wye. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 2. Las 2 muestras (WI1 y WI2) de agua de arroyos que fluyen de la granja eran positivas en ambos ensayos: infectividad en cultivos celulares y RT-PCR. Las 3 muestras de agua recogidas de los pastos (WF1, WF2, WF5) eran positivas para EVB por RT-PCR, aunque sólo 2 de ellas eran infecciosas en cultivos de células MDBK (WF2, WF5). Una de las 2 muestras del agua potable de los tanques (WF3) era positiva para EVB por RT-PCR pero no se observó CPE en el cultivo celular.

TABLA 2 Análisis de EVB en muestras de agua

Muestra	Fuente	Infectividad	RT-PCR
WI1	Arroyo 1	+	+
WI2	Arroyo 2	+	+
WF1	Agua estancada en pastos	-	+
WF2	Agua estancada en pastos	+	+
WF3	Agua potable granja	-	+
WF4	Agua potable granja	-	-
WF5	Agua estancada en pastos	+	+
RW1	Río Wye (Covington Cove)	-	+
RW2	Río Wye (Bryan Bar)	-	-
RW3	Río Wye (Pintail Point)	-	-
RW4	Río Wye (Bluff's Point)	-	+

Todas las muestras de agua de la granja, incluyendo los efluyentes, eran positivos sin necesidad de concentrar las muestras, lo que indicaba que la cantidad de partículas virales era de, al menos, 14.000 ufp/l. Las muestras del río Wye eran negativas antes de ser concentradas y sólo 2 muestras (RW1 y RW4) fueron positivas por RT-PCR después de su concentración.

Para continuar con la determinación de la presencia de EVB en el medioambiente marino, se recogieron 30 ostras de un lugar de la ría en el que se había tomado una muestra de agua (RW1). Las muestras de ostras de dividieron en 3 grupos de 10 ostras cada uno y se analizaron para determinar la presencia de EVB (Tabla 3). Todas las fracciones de lavados de agallas fueron infecciosas para células MDBK y eran RT-PCR positivas. Sin embargo, no se detectó EVB en ninguna de las fracciones de hemolinfa. Adicionalmente, el estómago y las agallas de 5 ostras se analizaron individualmente. Se detectó EVB en 2 ostras en ambos tejidos, y ambos (lo mismo que el agua de lavado de las agallas de otra ostra) fueron infecciosos en cultivos celulares. En las muestras positivas, se encontró EVB sólo en lavados de agallas y/o estómagos, y no en la hemolinfa, de acuerdo con otros estudios en los cuales, la mayoría de la acumulación viral en moluscos es en el estómago y en los divertículos. Aunque se han descrito protocolos optimizados para la detección de virus en moluscos, en este estudio se han utilizado las aguas de lavado de agallas o de estómago como fuente de virus porque es el método más simple, las muestras no tenían sustancias inhibidoras, y la sensibilidad era similar a la de protocolos optimizados (no mostrado). Sin embargo, en áreas menos contaminadas puede ser necesario utilizar métodos más sensibles.

TABLA 3 Análisis de EVB en ostras

Muestra	Tejido	CPE	RT-PCR
Pool 1-10	Hemolinfa	-	-
Pool 1-10	Agallas	+	+
Pool 11-20	Hemolinfa	-	-
Pool 11-20	Agallas	+	+
Pool 21-30	Hemolinfa	-	-
Pool 21-30	Agallas	+	+
Ostra 1	Estómago	-	-
Ostra 1	Agallas	-	-
Ostra 3	Estómago	-	-
Ostra 3	Agallas	-	+-
Ostra 5	Estómago	-	-
Ostra 5	Agallas	-	-

TABLA 3 (continuación)

Muestra	Tejido	CPE	RT-PCR
Ostra 6	Estómago	+	+
Ostra 6	Agallas	+	+
Ostra 8	Estómago	+	+
Ostra 8	Agallas	+	+

Detección de EVB en otros animales: ciervos y gansos

Para determinar si otros animales, a parte de los bovinos, pudieran estar infectados con el virus, o servirle de vectores, se examinaron 50 extractos fecales de ciervo y 4 de gansos. Estos animales comparten los mismos pastos que el ganado en este estudio y las muestras fecales se recogieron de estos pastos. Las muestras se procesaron y se analizaron respecto a su infectividad en células MDBK y respecto a la detección de RNA de EVB mediante RT-PCR, de la misma forma que se hizo con las muestras de ganado bovino. Como se muestra en la Tabla 4, el 38% (19/50) de las muestras de ciervos mostraron una banda del tamaño esperado para el EVB en los análisis de RT-PCR.

TABLA 4 Detección de EVB en extractos fecales de ciervos

	N° de extractos	N° de extractos positivos por RT-PCR
CPE +	28/50 (56%)	14/50 (28%)
CPE -	22/50 (44,7%)	5/50 (10%)
Total	50	19/50 (38%)

La razón para examinar las heces de gansos fue que comparten pastos con el ganado y podían comer semillas y plantas contaminadas con EVB. Utilizando el mismo protocolo para el procesamiento de los extractos fecales y análisis para la detección de EVB, se encontró que una de cada 4 heces de ganso era positiva para EVB por RT-PCR, pero no infecciosa para las células NIDBK (no mostrado).

Análisis de secuencias

Los resultados mencionados previamente ponen de manifiesto que, en algunos casos, la infectividad en MDBK y la amplificación mediante RT-PCR no se correlacionaban. Adicionalmente, fragmentos de DNA de algunos especímenes, que se amplificaron con iniciadores de EVB, no eran del tamaño correcto. En particular, la amplificación de fragmentos de diferentes tamaños era relativamente frecuente en muestras de agua y extractos de heces de ciervos. Esto podría deberse a una o más de las siguientes posibilidades: a) las presencia de otros virus infecciosos, distintos al EVB, y citopáticos, b) la sensibilidad del método RT-PCR es mayor que la sensibilidad del método para determinar la infectividad, o c) la presencia de otros enterovirus con un producto RT-PCR de tamaño similar al del EVB. Para investigar estas posibilidades, se secuenció el fragmento de DNA amplificado de un número representativo (n=16) de las 72 muestras fecales de ganado que eran positivas para EVB por RT-PCR. También se secuenciaron los fragmentos de las muestras de agua y ostras que tenía una banda del tamaño esperado después de la amplificación, así como de las heces positivas de ciervos y gansos. Cuando se observó más de un amplicón en los geles de agarosa, la banda de DNA del tamaño correcto se extrajo y se utilizó como molde para la secuenciación. El producto RT-PCR se secuenció con los mismos iniciadores utilizados para la amplificación. Las secuencias se compararon con las publicadas para otros EVB y se alinearon utilizando el programa ClustaIW. Como se muestra en la Figura 1, para las heces de ganado, todas las secuencias corresponden a EVB conocidos, incluso aquellas que no produjeron CPE en células MDBK. Este resultado sugiere que el método RT- PCR fue más sensible que el método de la infectividad en cultivos celulares y que la cantidad de virus infecciosos en algunas heces no era suficiente para producir CPE detectable en la monocapa celular.

Todas las muestras secuenciadas estaban más relacionadas con la cepa PS 87 de EVB (n° de acceso X79368), que ha sido tipificada como EVB-2, que con otros serotipos de EVB. Sin embargo, todas ellas tenían algunos cambios de nucleótidos que las diferenciaban de la de PS 87. Los mismos cambios han sido encontrados en especímenes de varios ganados indicando que no correspondían a mutaciones individuales, sino que, más probablemente, eran variantes de un virus original. Considerando estas diferencias en los nucleótidos, las muestras de ganado se pudieron dividir en 3 grupos, todos ellas conteniendo un grado de identidad de nucleótidos de, al menos, un 84%, en comparación con

\hbox{PS 87.}

Para determinar si EVB estaba contaminando agua y ostras, así como heces de ciervos y gansos, e identificar la cadena viral, se secuenciaron los fragmentos amplificados en las reacciones RT-PCR del RNA extraído a partir de esas muestras. Todas las secuencias fueron comparadas entre ellas mismas y con aquéllas de EVB depositadas en la base de datos GenBank de EMBL. La Figura 2 muestra los alineamientos de las secuencias de cada grupo de ganado, y de heces de ciervos y gansos, ostras y agua. Para simplificar el análisis, las secuencias dentro de cada grupo se representan en una línea. Se incluyen secuencias de la misma región de los serotipos PS 87 (EVB-2), RM2 (EVB-2) y VG527 (EVB-1). Lo mismo que con las muestras de ganado, todas las secuencias de gansos, ciervos, ostras y agua correspondían a EVB-2. Hay 4 regiones que muestran gran variabilidad (nt 224-231, 249-256, 267-269 y 349-358). Asimismo, todas las muestras encontradas en este estudio tenían cambios en 6 nt, no encontrados en PS 87, pero que compartían ambos aislados RM2 y VG527. La mayoría de los aislados encontrados en las muestras de agua eran similares a los de ganado 46, 48, 107, 116 y 126, mientras que la mayoría de las muestras de ciervos, gansos y ostras eran similares a las de ganado 26, 65, 71, 9, 95, 103 y 106. Estos resultados sugieren que, probablemente, el ganado bovino y los ciervos contribuyeron a la contaminación del medioambiente acuoso y marino con EVB.

3. Discusión

En este estudio se describe el primer seguimiento de un enterovirus animal (EVB) unido a especímenes, biológicos y medioambientales de un mismo lugar. El objetivo del presente estudio fue primero detectar EVB en ganado y, en su caso, determinar si este virus, que es específico del ganado bovino, estaba contaminando el medioambiente y podía servir de indicador de residuos fecales de origen bovino.

El alto porcentaje de ganado bovino que es portador del EVB, indica que este virus es endémico en el área estudiada. Como el EVB se excreta en gran cantidad en las heces de los animales infectados, se procedió a examinar la presencia de este enterovirus en medioambientes potencialmente afectados por los residuos fecales de una granja con ganado bovino. Con este objetivo se analizaron varias muestras de agua recogidas de agua estancada en pastos, arroyos en pastos, agua potable de los tanques y agua y ostras de la ría adyacente Wye. Los resultados de la infectividad in vitro y de los estudios moleculares con RNA viral extraído de estas muestras indicaron que estos medioambientes estaban contaminados con EVB. En las muestras de agua recogidas de agua estancada, arroyos y agua de los tanques, la concentración de virus era lo suficientemente alta como para ser detectada sin necesidad de tener que realizar ninguna concentración previa, es decir, de, al menos, 14.000 ufp/l de agua. Los análisis de las aguas y ostras de la ría Wye confirmaron la contaminación del medioambiente marino con este virus. Dos de las cuatro muestras del agua de la ría y aproximadamente el 40% de las ostras contenían EVB. La vigilancia se complementó con el análisis de 50 muestras fecales de ciervo que utilizaban los mismos pastos que el ganado y que podían estar infectados con el virus o servir de vectores mecánicos. En estos análisis, aproximadamente la mitad de las muestras de ciervo fueron EVB positivas mediante PCR. Estos animales también parecieron ser portadores de otros patógenos que afectaban a células NIDBK. Puesto que los ciervos abundan en este área y excretan partículas virales en sus heces, es probable que se sumen al nivel detectable de enterovirus de contaminación en los especímenes medioambientales.

Para analizar el EVB detectado en muestras biológicas y medioambientales, se secuenciaron los fragmentos de DNA amplificado mediante RT-PCR utilizando iniciadores específicos de EVB. La región secuenciada fue la región 5' NTR, una región altamente conservada en muchos picornavirus. Aunque todas las secuencias estudiadas eran más homólogas con la cepa PS 87 de EVB que con otras secuencias de otras cepas de EVB, se encontraron diferencias significativas entre los aislados de ganado bovino. En la población de ganado bovino, las secuencias se podían agrupar en 3 grupos. Cada grupo tenía cambios en nucleótidos similares y específicos si se comparaban con la secuencia PS 87 pero todas tenían al menos un 84% de homología con esta cepa. Aunque la divergencia de la secuencia era relativamente baja, la región del genoma viral que se analizó correspondía a una región muy conservada, por lo que un grado de identidad de secuencia inferior al 85% en esa región podría indicar que los aislados podían ser variantes y pertenecían a distintos serotipos. Puesto que todas las muestras se tomaron al mismo tiempo y en un área relativamente pequeña, estos resultados indican que hay varias poblaciones de EVB que coexisten en la misma área. La diversidad viral dentro de esta población viral es notablemente alta, incluso considerando la variabilidad genética de estos virus RNA, y puede tener implicaciones interesantes en la evolución viral. La secuenciación y análisis de la región VP1 del genoma viral permite caracterizar más estos aislados y confirmar su serotipo.

El análisis de las secuencias de muestras de ganado bovino, ciervos, agua y ostras, puso de manifiesto que había 4 regiones en las que se encontró el mayor número de cambios de nucleótidos. Asimismo, había 6 cambios, comparados con la secuencia de la cepa PS 87 (GeneBank), que eran idénticos en todas las muestras y en los aislados de RM2 y VG527 de EVB, así como en el aislado de EVB usado en este estudio como control positivo (C+). Las secuencias de EVB determinadas en muestras de agua contenían las mismas variantes que las de los grupos de ganado bovino, sugiriendo fuertemente que estos animales son la fuente de contaminación. El análisis de las muestras de ostras indicó que estaban contaminadas con, al menos, 2 variantes de EVB, ambas encontradas en la población de ganado bovino. El análisis de las muestras de heces de ciervos puso de manifiesto que estos animales excretaban partículas de EVB en sus heces. Sin embargo, no está claro si los ciervos son vectores mecánicos o son susceptibles de infección con EVB. La secuencia de la región 5' NTR de los aislados de EVB de ciervo era similar a la de un grupo de ganado bovino, excepto para un ciervo. Finalmente, incluso el ganso canadiense parece ser portador de EVB y puede jugar un papel en su diseminación de pasto a pasto o de pasto a agua, papel que el ganso parece jugar.

En resumen, este estudio indica que el EVB es un virus endémico que infecta ganado bovino y, posiblemente, a otros rumiantes, tales como el ciervo. La población viral consiste en varias variantes que son coetáneas, coexisten en el mismo área, y se encuentran en el medioambiente asociadas con el ganado bovino. Por tanto, el EVB puede servir de marcador sensible de la contaminación fecal de origen bovino.

\vskip0.333000\baselineskip

<110> Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<120> Método para determinar la contaminación medioambiental mediante la detección de enterovirus bovino (EVB) o porcino (EVP)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<160> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<170> PatentIn version 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido iniciador directo

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 1

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGGAGTAGA TGGTATTCCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido iniciador inverso

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGCCCCAT CTTCCAGAG

\hfill

19

Claims

1. Un método para determinar la existencia de contaminación medioambiental en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho método la detección de enterovirus bovino (EVB) o porcino (EVP) en dicha muestra de ensayo, en el que la detección de EVB o EVP en dicha muestra de ensayo es indicativa de la existencia de contaminación medioambiental.

2. Un método para determinar la existencia de contaminación fecal de origen bovino o porcino en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho método la detección de enterovirus bovino (EVB) o enterovirus porcino (EVP) en dicha muestra de ensayo, en el que la detección de EVB o de EVP en dicha muestra de ensayo es indicativa de la existencia de contaminación fecal de origen bovino o porcino, respectivamente.

3. Un método para determinar la existencia de contaminación medioambiental por residuos fecales en una muestra de ensayo, mediante la detección de enterovirus bovino (EVB) o enterovirus porcino (EVP) como marcadores de dicha contaminación, por reacción de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR), que comprende:

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra de ensayo es recogida de cualquier sitio susceptible de contener enterovirus animales y en el que se desea conocer la existencia o no de contaminación medioambiental por residuos de origen animal.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha muestra de ensayo es recogida de una instalación ganadera, del agua de bebida para el ganado, del medio ambiente circundante, de especímenes medioambientales, de moluscos, o de medios acuáticos en contacto directo o indirecto con una posible fuente de contaminación.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha posible fuente de contaminación es una granja que contiene ganado bovino o porcino.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra susceptible de contener EVB o EVP, seleccionada entre una muestra biológica y una muestra medioambiental.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra biológica de un animal no bóvido, un especimen medioambiental, una muestra de moluscos, o una muestra de un medio acuático.

9. Método según la reivindicación 3, en el que dicha reacción RT-PCR se realiza en un solo paso o en dos pasos.

10. Método según la reivindicación 3, en el que dicha mezcla de reacción para efectuar la RT del RNA de EVB o EVP comprende un oligonucleótido iniciador que se hibrida con una región del RNA de dicho EVB o EVP y, a partir de ahí, por acción de la transcriptasa inversa permite la obtención de un DNA complementario (cDNA) a dicho RNA de EVB o EVP.

11. Método según la reivindicación 3, en el que dicha mezcla de reacción para efectuar la PCR comprende un par de iniciadores que permiten la amplificación de una secuencia diana del genoma de EVB o del genoma de EVP.

12. Método según la reivindicación 3, en el que en dicha mezcla de reacción para efectuar la reacción RT-PCR, el iniciador utilizado como molde en la reacción de RT es uno de los iniciadores implicados en la PCR.

13. Método según la reivindicación 3, en el que dicho par de iniciadores presente en la mezcla de reacción comprende un par de iniciadores que permite la amplificación de una secuencia diana del genoma de EVB o del genoma de EVP.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicha secuencia diana del genoma de EVB y del genoma de EVP es una región de RNA que contiene uno o más motivos conservados compartidos por enterovirus.

15. Método según la reivindicación 13, en el que dicho par de iniciadores que permite la amplificación de una secuencia diana del genoma de EVB está constituido por los iniciadores identificados como SEC. ID. N°: 1 y SEC. ID. N°: 2.

16. Método según la reivindicación 3, en el que el producto de amplificación se separa mediante electroforesis en agarosa y se visualiza con luz ultravioleta tras tinción con bromuro de etidio.

17. Un método para localizar el origen de una fuente de contaminación medioambiental, que comprende la detección de enterovirus bovino (EVB) y/o enterovirus porcino (EVP) en una muestra de ensayo según el método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 3, y la comparación de los virus eventualmente detectados en dicha muestra de ensayo con otros enterovirus aislados y caracterizados en distintas posibles fuentes de contaminación, en donde la existencia de un determinado grado de identidad entre los aislados de enterovirus detectados y caracterizados en dicha muestra de ensayo y los aislados de enterovirus encontrados en una posible fuente de contaminación es indicativa de que dicha posible fuente de contaminación es la fuente de contaminación medioambiental.

18. Un método para localizar el origen de una fuente de contaminación fecal de origen bovino o porcino, que comprende la detección de enterovirus bovino (EVB) o porcino (EVP) en una muestra de ensayo según el método de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, y la comparación de los enterovirus eventualmente detectados en dicha muestra de ensayo con otros enterovirus aislados y caracterizados en distintas posibles fuentes de contaminación, en donde la existencia de un determinado grado de identidad entre los aislados de enterovirus detectados y caracterizados en dicha muestra de ensayo y los aislados de enterovirus encontrados en una posible fuente de contaminación es indicativa de que dicha posible fuente de contaminación es la fuente de contaminación fecal de origen bovino o porcino.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, en el que la comparación de los EVB y EVP eventualmente detectados en dicha muestra de ensayo y los EVB y EVP aislados y caracterizados en distintas posibles fuentes de contaminación, se realiza mediante estudios de secuenciación o tipificación molecular o serológicos.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, en el que dicho grado de identidad entre los aislados de enterovirus detectados y caracterizados en dicha muestra de ensayo y los aislados de enterovirus aislados en dicha posible fuente de contaminación es igual o superior al 50%, preferentemente, igual o superior al 80%, y más preferentemente, igual o superior al 95%, cuando dicho grado de identidad se determina, por secuenciación molecular.

21. Un kit para la detección de enterovirus bovino (EVB) o porcino (EVP), como marcadores de contaminación medioambiental, mediante RT-PCR, que comprende un iniciador que permite la obtención de un cDNA de EVB o de EVP, y/o un par de iniciadores que permite la amplificación de una secuencia diana del genoma de EVB o del genoma de EVP.

22. Kit según la reivindicación 21, en el que dicho iniciador útil para la obtención de un cDNA de EVB o de EVP es uno de los iniciadores del par de iniciadores que permite la amplificación de una secuencia diana del genoma de EVB o del genoma de EVP respectivamente.

23. Kit según la reivindicación 22, que comprende un par de iniciadores que permite la amplificación de una región específica del genoma de EVB o del genoma de EVP que contiene uno o más motivos conservados compartidos por enterovirus.

24. Kit según la reivindicación 23, que comprende el par de iniciadores identificados como SEC. ID. N°: 1 y SEC. ID. N°: 2.

25. Empleo de un enterovirus seleccionado entre enterovirus bovino (EVB) y enterovirus porcino (EVP), como organismo marcador de la contaminación medioambiental.

26. Empleo de un enterovirus seleccionado entre enterovirus bovino (EVB) y enterovirus porcino (EVP), como organismo marcador de la contaminación fecal, de origen bovino o porcino, respectivamente, en el medio ambiente.