ES2212607T3 - Medicamentos antivirales y antirretrovirales radioinmunologicos basados en emisores de rayos alfa y beta. - Google Patents

Abstract

Uso de un radioinmunoconjugado (RIC) para la fabri cación de un medicamento destinado al tratamiento de infec ciones víricas y de tumores inducidos por ellas, caracteri zado porque, en calidad de componente inmunológicamente activo, este conjugado contiene: a) una molécula receptora o un fragmento de la misma que tenga afinidad con un epítope de las proteínas estruc turales víricas expresadas en la membrana plasmática de células infectadas o b) un fragmento de molécula receptora celular, modificado por mutagénesis, provisto de afinidad con un epítope de las proteínas estructurales víricas expresadas en la membrana plasmática de células infectadas y, en calidad de componente radiactivo: c) un emisor de radiación alfa o un emisor de radiación beta.

Description

Medicamentos antivirales y antirretrovirales radioinmunológicos basados en emisores de rayos \alpha y \beta.

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas basadas en radioinmunoconjugados (RIC) que pueden utilizarse con el fin terapéutico en virología, en especial para tratar o curar enfermedades infecciosas provocadas por los virus VIH-1, VIH-2, VIH-3, HTLV-1, HTLV-2, VHB, VHC, VHD, CMV, EBV y HHV8 y tumores inducidos por los mismos. La presente invención se refiere además a preparados farmacéuticos basados en radioinmunoconjugados (RIC) que pueden utilizarse con fines terapéuticos en mamíferos infectados con los virus animales correspondientes a VIH-1, VIH-2, VIH-3, HTLV-1, HTLV-2, VHB, VHC, VHD, CMV, EBV y HHV8 (p.ej. el SIV).

El tratamiento de la mayoría de infecciones víricas - en especial las infecciones de VIH, VHC y VHB - no se ha resuelto satisfactoriamente hasta el presente. A continuación se expone la importancia de estas infecciones, el estado de la técnica en este ámbito, es decir, las terapias usuales así como sus límites y problemas, tomando como ejemplos las infecciones de VIH y de VHC.

Estado de la técnica en infecciones VIH como ejemplo

Según estimaciones de la OMS, a nivel mundial en diciembre del año 1997 existían ya 30,6 millones de personas infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH (para consultas véase http://www.who.org/asd/issues/
mar98. htm#th). La infección con el VIH se traduce en un déficit inmunológico progresivo con pérdida de linfocitos T (células auxiliares) que soportan al receptor CD4 (CD4+) infectado con el VIH. A los pacientes que sufren una infección sintomática de VIH o que se hallan en el estado clínico final de una infección de VIH (SIDA), en los que el recuento de células CD4 se sitúa por debajo de 350 células/\mul de sangre y/o en los que la presión vírica es superior a 35.000 copias de RNA vírico (vRNA)/\mul de suero, se les recomienda una terapia antirretrovírica, con preferencia una combinación medicamentosa de tres elementos, administrable por vía oral, que consta de dos inhibidores de la transcriptasa inversa (RTI) y de un inhibidor de proteasa (PI) (véase Brodt y col., 1997). Es cierto que con los preparados se obstaculiza y se retrasa la replicación de los virus de la IH, pero no se pueden eliminar con ellos las células huésped que replican los VIH. Por consiguiente, la infección del VIH persiste durante toda la vida como infección letal. Hasta el presente no es posible la curación de la infección del VIH. Aparte de ello, el tratamiento convencional de un infectado de VIH (paciente con SIDA) supone el derroche anual de unos 15.000 marcos alemanes (DM) (aprox. 7.500 euros) con la aparición simultánea de efectos secundarios, en algunos casos de notable
importancia.

Los programas inmunoterapéuticos convencionales para el tratamiento de enfermedades desencadenadas por el VIH o por el HHV8 (SIDA y sarcoma de Kaposi, respectivamente) no constituyen hasta el presente una opción satisfactoria de tratamiento. Es cierto que el VIH y las células infectadas con el VIH pueden marcarse con anticuerpos no marcados radiactivamente ("fríos"), pero estos no provocan la respuesta inmune deseada que conduce a la eliminación de las células infectadas, porque dicha respuesta está comprometida de todos modos por la infección del VIH. Por consiguiente, la respuesta inmune citotóxica, intrínseca del organismo, interferida por la infección del VIH tiene que reemplazarse por la muerte específica, ejecutada artificialmente, a ser posible de todas las células infectadas con el VIH.

Estado de la técnica en la infección del VHC como ejemplo

El número de personas infectadas con el virus de la hepatitis C (VHC) es también muy elevado, a saber más del 1% de la población mundial (Böker y Manns 1997). La infección aguda de VHC en el 80% de los casos no se cura de modo espontáneo, sino que sigue un curso crónico. Sin terapia, el 30% de los afectados por una hepatitis C crónica suelen sufrir al cabo de 20-30 años la formación de una cirrosis hepática, con todas sus complicaciones hepáticas y extrahepáticas: además de la hipertensión portal, hemorragias varicosas en esófago, encefalopatías hepáticas y carcinoma de células hepáticas aparecen crioglobulinemias con artalgias, prurito, púrpura, neuropatías y glomerulonefritis, glomerulonefritis independiente de la crioglobulina, una sintomatología seca, diversas enfermedades autoinmunes y posiblemente incluso linfomas (Maier 1997; Manns y Rambusch 1997; Petry y col. 1997). De hecho actualmente y en un contexto mundial mueren más personas a raíz de la infección de hepatitis C que como consecuencia de la epidemia del VIH. Por ello, la hepatitis C constituye un gigantesco problema social en espera de solución.

Como causa de la hepatitis C, conocida desde 1978 como hepatitis no A y no B (Alter y col., 1978), se pudo identificar por primera vez en 1989 el virus de la hepatitis C (VHC) (Choo y col. 1989). Es una partícula de 30-65 nm de tamaño, se considera perteneciente a la familia de los flavivirus y, como genoma, contiene una RNA monohebra que codifica una poliproteína de unos 3000 aminoácidos de longitud.

Esta poliproteína se descompone en un proceso complejo en tres proteínas estructurales C, E1 y E2 y en las proteínas funcionales NS1 y NS5 y se procesa (Shimotohno y col. 1995). La maduración de los viriones se efectúa en el lumen del retículo endoplásmico y en el aparato de Golgi. Desde allí se transportan a la superficie de las células, brotando de la membrana plasmática (Pozzetto y col. 1996).

Hasta el presente se sabe poco de la integración de proteínas víricas o inducidas por virus en la membrana de células infectadas por el VHC (Selby y col. 1993). Pero se da por sentado que las proteínas estructurales, como la E1 y la E2 y posiblemente también otras proteínas víricas o inducidas por virus, se forman en la superficie de células infectadas con el VHC.

El RNA vírico está protegido con un nucleocápsido de proteínas de núcleo (core, C) y está envuelto por una vaina o envoltura lípida con las proteínas superficiales integradas en ella (E1 y E2) (Zilpert y Roggendorf 1997). Con estas moléculas superficiales se realiza la adsorción del virus, presumible a través del epítope parcialmente independiente de las regiones hipervariables (Rosa y col. 1996), específicamente en un receptor de las células huésped, posiblemente en el receptor LDL (Seipp y col. 1997).

El proceso de adsorción puede impedirse con antígenos del suero infectado con VHC. Pero, los llamados epítopes neutralizadores son susceptibles de una actividad mutante muy viva del virus y por ello son tan variables que no puede montarse una protección eficaz contra todos los aislados de una casi-especie (Farci y col. 1996). Esta variabilidad marcada sigue dificultando en gran manera el desarrollo de una vacuna contra el VHC (Pozzetto y col. 1996).

Tampoco en lo referente al tratamiento de los pacientes de hepatitis C la medicina ha llegado a ser capaz de lograr una curación en sentido estricto, es decir, la eliminación total de los virus de la HC que provocan la enfermedad. La única terapia estándar que se ha consolidado en los últimos años para la hepatitis C crónica es el tratamiento con el interferón-alfa (IFN-\alpha).

El interferon-\alpha es una proteína propia del organismo, que se considera perteneciente a las citocinas y que se forma en monocitos y \beta-linfocitos activados como reacción a una infección vírica. Lo racional de la terapia del VHC son las propiedades inhibidoras de replicación e inmunomoduladoras del IFN-\alpha. Por un lado, esta citocina puede inhibir el ciclo de replicación vírica, por otro puede activar las células T citotóxicas, que a su vez matan de forma selectiva a las células infectadas con el VHC.

Actualmente se recomiendan programas de 3 x 6 millones de unidades de IFN-\alpha/semana en forma de inyección subcutánea durante 3-4 meses y en caso de reacción positiva durante otros 8-9 meses (Böker y Manns 1997).

Solo el 20% de los infectados crónicos del VHC tratados con IFN-\alpha reacciona positivamente a la terapia (Zilpert y Roggendorf 1997). El 80% de los pacientes continúa infectado y tiene que contar con las graves complicaciones de la enfermedad. La reacción a la terapia del IFN-\alpha es particularmente mala en el caso del genotipo VHC 1b que predomina en los países occidentales. Hasta el presente se desconoce la causa de este hecho.

Los costes del tratamiento de cada uno de los intentos de terapia con IFN-\alpha que se interrumpen sin éxito al cabo de 3 meses (> 50% de los casos) asciende actualmente a unos 5.000 DM (aprox. 2.500 euros) y en los demás casos a 20.000 DM (unos 10.000 euros), incluido otro 25% de fracasos terapéuticos, los llamados "recidivantes" (relapser). Por lo tanto, el éxito de la terapia IFN-\alpha puede evaluarse en un coste de más de 50.000 DM (unos 25.000 euros) (calculado según Berg y Hopf 1997).

El tratamiento con IFN-\alpha puede desencadenar un amplio abanico de efectos secundarios (Berg y Hopf 1997). Los pacientes sufren casi siempre, por lo menos en el estadio inicial, dolores similares a los de la gripe, que en algunos casos pueden ser graves, lo cual induce a algunos pacientes a abandonar la terapia. No es rara la aparición de alteraciones del cuadro hemático, enfermedades autoinmunes así como enfermedades neurológicas y síquicas, que a menudo obligan a los facultativos a interrumpir el tratamiento.

Además de la monoterapia con IFN-\alpha empieza a consolidarse la terapia combinada de IFN-\alpha con ribavirina que según los informes de otros grupos de trabajo (p.ej. Schvarcz y col. 1995) y las experiencias propias (Fetzer y col. 1997) cuenta con un mayor porcentaje de respuestas positivas. El problema de fondo que plantea también esta estrategia terapéutica consiste en que con la ribavirina, que es un análogo de nucleósido, solo puede conseguirse una pequeña inhibición de la replicación vírica y ninguna eliminación del genoma vírico (Reichard y col. 1993).

Entre tanto se ha constatado que una hepatitis C que se ha abordado con éxito mediante la terapia puede volver a inflamarse incluso después de pasados algunos años (Vento y col. 1996). Esto significa que, con independencia del tratamiento empleado, ya sea con IFN-\alpha, ya sea la terapia combinada de IFN-\alpha con ribavirina, la infección del VHC hasta ahora es incurable en la mayoría de los casos.

En un futuro próximo no se prevé el desarrollo de una vacuna eficaz. El VHC, al igual que el virus de la inmunodeficiencia humana VIH, está caracterizado por una fuerte mutagenidad en el ámbito de sus proteínas superficiales E1 y E2, en especial en el ámbito de los epítopes neutralizadores. Esto permite al virus, en su calidad de semi-especie, zafarse una y otra vez de los ataques del sistema inmune. La eliminación de un aislado de VHC conseguido espontáneamente o por vía terapéutica no siempre va acompañada de una protección inmunológica eficaz contra una infección causada por otro aislado de VHC (Purcell 1997).

El estudio y desarrollo clínico de una vacuna potencial es además difícil y requiere mucha dedicación de personal y tiempo. Por un lado, la infección del VHC en chimpacés constituye el único modelo animal, difícil de manejar. Por otro lado, los ensayos que se realicen con personas entrañan riesgos y requieren años antes de poder efectuar predicciones fiables sobre la eficacia de la vacunación. Finalmente, suponiendo incluso que hoy se lanzara al mercado una vacuna contra el VHC, el estado de las cosas no cambiaría, porque se calcula que son 40 millones de personas en todo el mundo los que continuarían estando infectado con el VHC y necesitarían una terapia antivírica eficaz.

Dado que en un futuro próximo no se dispondrá de métodos de biología molecular para la eliminación específica del genoma del VIH o del VHC en las células infectadas, la terapia de la infección del VIH o del VHC deberá tender a la eliminación de las células que replican el VIH o del VHC con los métodos terapéuticos practicables en el momento actual.

Telón de fondo de la radioinmunoterapia para las infecciones víricas

Las infecciones citadas tienen en común el curso crónico y que están asociadas a una morbilidad y mortalidad elevadas. Actualmente con medicamentos antivíricos o antirretrovíricos se puede suprimir mejor o peor la replicación vírica. Pero la curación de la hepatitis B y C solamente se consigue en la actualidad en un número limitado de casos y la infección con el VIH es probable que no pueda eliminarse en modo alguno impidiendo meramente la replicación del virus.

El objetivo de una terapia antivírica o antirretrovírica eficaz tienen que ser por tanto las células infectadas propiamente dichas.

El tratamiento con radioisótopos en forma de radioyodoterapia es conocido en Alemania desde la década de los años 50 por el tratamiento de enfermedades benignas o malignas de las tiroides como el procedimiento más importante de la terapéutica médica nuclear y se ha constatado que tiene pocos efectos secundarios. Hasta el presente no se han observado complicaciones tardías, en especial la inducción de malignomas (Moser 1996).

Las posibilidades terapéuticas recientes con radioisótopos resultan ahora de la meta-yodo-bencil-guanidina (MIBG) marcada con I^{131} para el tratamiento de feocromocitomas y neuroblastomas metastásicos, por la radiosinoviortesis en caso de artritis reumática, por el centelleo intracavital de silicato de Y^{90} en caso de carcinosis de pleura o de peritoneo, por el tratamiento paliativo del dolor en caso de metástasis esquelética con sustancias afines al hueso, por ejemplo el Sr^{89}, o por el tratamiento con radiofósforo de la policitemia vera (Moser 1996). Actualmente se halla en fase de estudio clínico una terapia con IgG anti-CEA marcado con I^{131} para el carcinoma de colon-recto (Blumenthal y col. 1992, Blumenthal 1994) y para el linfoma de células B (Kaminski y col. 1993, Press y col. 1993, Press y col. 1995, Press y col. 1995).

No se dispone de experiencia en el uso de radioisótopos para la terapia de la infección del VIH. Las dosis pequeñas de rayos gamma pueden provocar según parece una expresión más intensa del VIH (Xu y col. 1996), mientras que en ensayos con animales, en el caso de una infección del virus SIV en macacos, se ha puesto de manifiesto que la irradiación selectiva de nódulos linfáticos puede traducirse en una disminución de la presión vírica en la sangre periférica y en una interrupción de la progresión de la enfermedad (Fultz y col. 1995). La irradiación de la totalidad del cuerpo de los pacientes infectados con el VIH tendrá un efecto meramente inespecífico y exige una dosis elevada de radiación. Por consiguiente, el efecto es en principio inseguro y el precio a pagar es elevado por los daños no deseados que provoca la radiación.

La eliminación selectiva de células infectadas con virus es posible según la invención con medicamentos radioinmunes que, como componente radiactivo, contienen un emisor de rayos \alpha o \beta. El alcance de la radiación \beta es del orden varios milímetros. El problema estriba, por tanto, en que no se puede descartar que resulten dañadas las células contiguas no infectadas. Por consiguiente sería más favorable en general el uso de emisores de rayos \alpha, que tienen una mayor transferencia energética lineal y su radiación tiene un alcance menor.

Los problemas descritos se resuelven según la invención con la creación de preparados farmacéuticos que contienen moléculas eficaces en sentido inmunológico, por ejemplo anticuerpos monoclonales (MAB) o receptores celulares de la fijación vírica conjugados con un emisor de rayos \alpha o \beta. Semejante montaje se denomina seguidamente radioinmunoconjugado (RIC). Son también idóneos según la invención los péptidos pequeños, p.ej. los proyectados y diseñados mediante ingeniería molecular, en el supuesto de que, al igual que los anticuerpos, puedan fijarse sobre antígenos víricos o antígenos celulares, específicos de las células infectadas. Cuanto menor sea el peso molecular de tales péptidos, tanto mayor será la facilidad con que pasarán la barrera hematoencefálica, de modo que puedan alcanzar y eliminar también las células infectadas del SNC.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los RIC para fabricar un medicamento destinado al tratamiento de infecciones víricas y de tumores inducidos por ellas. Según una forma preferida de ejecución, la infección a tratar es un infección de VIH-1, VIH-2, VIH-3, HTLV-1, HTLV-2, VHB, VHC, VHD, CMV, EBV o HHV8 o un tumor inducido por una infección en una persona o una enfermedad equivalente (infección con un virus, equivalente a una de las recién mencionadas o tumor inducido por ellas) en un animal mamífero como pueda ser un simio o un ratón.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que contiene un RIC de la invención, con preferencia en forma liofilizada, a una columna para procesos separativos cromatográficos y event. un disolvente para el anticuerpo/receptor o sus fragmentos, event. un oxidante como la cloramina T o un secuestrante para realizar la conjugación del radionúclido con la molécula que reconoce específicamente a las células infectadas.

En calidad de RIC para el preparado farmacéutico de la invención pueden utilizarse compuestos que se ajusten a la fórmula general siguiente:

a) molécula de fijación-emisor de rayos alfa;

b) molécula de fijación-emisor de rayos beta.

Son preferidos en especial los compuestos de la fórmula

a1) MAB-emisor de rayos alfa;

a2) fragmento de MAB-emisor de rayos alfa;

a3) receptor de virus o fragmento de receptor de virus emisor de rayos alfa;

a4) péptidos sintéticos (ingeniería molecular)-emisor de rayos alfa.

La especificidad de los MAB debe dirigirse en especial contra epítopes integrados en la membrana plasmática de las células. Entre ellos se cuentan:

a) epítopes de las glicoproteínas de superficie o de transmembrana del VIH-1, 2 ó 3, p.ej. la gp120 y la gp41 del VIH-1 y las correspondientes proteínas estructurales del VIH-2 y VIH-3;

b) epítopes de las glicoproteínas de superficie del VHB, p.ej. la HBsAg (SHBs, MHBs, LHBs);

c) epítopes de las glicoproteínas de superficie del VHC, p.ej. E1 y E2;

d) epítopes de las glicoproteínas de superficie del HHV8;

e) epítopes de glicoproteínas de superficie o de transmembrana de otros retrovirus, p.ej. la gp46 y la gp21 de los HTLV-1 o bien HTLV-2;

f) el péptido T20/DP178 (Kilby y col. 1998; Su y col. 1999) o un fragmento del mismo que equivalga a un segmento del extremo terminado en C de la gp41;

g) epítopes de los complejos gp220/350 del EBV (Darai y col.).

Como alternativa a lo anterior pueden utilizarse también anticuerpos (monoclonales) específicos de proteínas y péptidos (p.ej. del MHC) integrados en la membrana plasmática de las células infectadas.

En calidad de anticuerpos monoclonales se toman en consideración:

a) anticuerpos monoclonales murinos;

b) anticuerpos monoclonales humanos o humanizados;

c) fragmentos que fijan antígenos (Fab, Fab' o F(ab)_{2}) de anticuerpos monoclonales murinos o humanos o humanizados.

Se han identificado diversas moléculas que actúan como receptores de virus. Por lo tanto, dichas moléculas pueden utilizarse entre otros

a) receptores CD4 (en caso de infección de VIH);

b) receptores LDL (en caso de infección VHC);

c) ASGPR (receptor de asialoglicoproteína; Treichel y col. 1997) y otras (en caso de infección de VHB).

Pueden utilizarse otros receptores, que el virus correspondiente necesita de modo específico para penetrar e infectar las células, en función de la infección que se pretende tratar. Eventualmente pueden fabricarse también fragmentos (péptidos) de proteínas de fijación, idóneos para la fijación de antígenos, que tengan propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas mejoradas y modificar por mutagénesis la correspondiente molécula de fijación (o un fragmento de la misma) de tal manera que se obtengan mejores propiedades de fijación para el medicamento radioinmune.

Por consiguiente, son compuestos especialmente preferidos según las anteriores fórmulas a) y b):

a5) gp41 (del VIH-1)-emisor de rayos alfa;

a6) gp120 (del VIH-1)-emisor de rayos alfa;

a7) receptor CD4-emisor de rayos alfa;

a8) E1 (del VHC)-emisor de rayos alfa;

a9) E2 (del VHC)-emisor de rayos alfa;

a10) péptido pequeño diseñado por ingeniería molecular-emisor de rayos alfa.

Son radionúclidos idóneos los siguientes: I^{131}, P^{32}, Y^{90}, Sr^{89}, Lu^{177}, Re^{186}, Re^{188}, Rh^{105}, Ru^{97}, Sc^{47}, Sm^{153} y Tb^{149} (emisores de rayos beta) y Bi^{212}, Ac^{225}, Bi^{213} y Ra^{223} (emisores de rayos alfa).

Una opción terapéutica (en el caso de la infección de VIH) consiste en integrar un radioisótopo a un anticuerpo específico del VIH que reconozca un epítope de las proteínas estructurales víricas presentes en la superficie de las células infectadas con VIH y se fije sobre él. Se toma en consideración sobre todo la asociación de un anticuerpo monoclonal humano específico de la gp41 con uno de los isótopos siguientes: I^{131}, P^{32}, Y^{90}, Sr^{89}, Lu^{177}, Re^{186}, Re^{188}, Rh^{105}, Ru^{97}, Sc^{47}, Sm^{153} y Tb^{149} (emisores de rayos beta) y Bi^{212}, Ac^{225}, Bi^{213} y Ra^{223} (emisores de rayos alfa).

La glicoproteína de transmembrana retrovírica gp41 está firmemente integrada en la membrana lípida celular y vírica y por ello, a diferencia de lo que ocurre con la proteína de superficie gp120, no puede separarse por disociación mediante desprendimiento (shedding) del virus o de la célula infectada con el VIH. Son especialmente ventajosos los anticuerpos específicos de un epítope muy conservado, siendo preferidos los anticuerpos humanos.

Como componente de un radioinmunoconjugado que se ha caracterizado ampliamente sería idóneo por ejemplo el anticuerpo monoclonal humano 2F5, que se fija sobre un epítope muy conservado y, por lo tanto, muy propagado en diversos aislados de VIH-1 (Muster y col. 1993).

Otra opción (en el caso de una infección de VIH) consiste en una conjugación de moléculas CD4 o de fragmentos de moléculas CD4 con radioisótopos. Pueden utilizarse emisores de rayos \alpha o de rayos \beta, por ejemplo I^{131}, P^{32}, Y^{90}, Sr^{89}, Lu^{177}, Re^{186}, Re^{188}, Rh^{105}, Ru^{97}, Sc^{47}, Sm^{153} y Tb^{149} (emisores de rayos beta) y Bi^{212}, Ac^{225}, Bi^{213} y Ra^{223} (emisores de rayos alfa). Los conjugados pueden emplearse con eficacia para lograr la curación de la infección con virus VIH-1 o VIH-2 mediante la muerte específica de todas las células infectadas.

Las moléculas CD4 están integradas en la membrana celular de los linfocitos T, tienen un peso molecular de 55.000 daltones y desempeñan un papel importante en la lucha contra la infección con su parte de receptor dirigida hacia fuera (Gaubin y col. 1996), pero también por la fijación del VIH sobre estas células (Dalgleish y col. 1984). Los virus de la IH se valen del receptor CD4 que les proporciona un lugar de anclaje en la cara exterior de la membrana celular. El lugar exacto en el que tiene lugar el anclaje de la glicoproteína de superficie gp120 vírica se ha localizado como el extremo terminal amino de la molécula CD4. Se demonina región V1 (Richardson y col. 1988, Arthos y col. 1989).

En base a estos conocimientos se han puesto en marcha una serie de estudios que pretenden clarificar si pueden utilizarse con fines terapéuticos las moléculas CD4 sintéticas o partes de las mismas (péptidos). Se ha constatado que tales moléculas ocupan el lugar de fijación CD4 de la glicoproteína superficial vírica gp120 y neutralizan los virus de la IH (Deen y col. 1988, Byrn y col. 1989, Clapham y col. 1989, Watanabe y col. 1989). De este modo pueden protegerse las células no infectadas de una eventual infección con el VIH. Sin embargo, para el tratamiento de una infección con VIH ya existente no basta por sí sola la aplicación de tales proteínas o péptidos, porque con ellos no se destruye el genoma del VIH de las células infectadas y los nuevos virus de la IH pueden seguir replicándose sin trabas.

Otra opción (en las infecciones de VIH y de VHC) son los conjugados de un anticuerpo monoclonal o de sus fragmentos que fijan antígenos o de las moléculas receptoras del VIH o del VHC o de fragmentos de las mismas y un emisor de rayos \alpha o de rayos \beta.

Ya es conocida la obtención de anticuerpos monoclonales murinos, humanizados y humanos (recopilaciones: Lidell y Weeks 1995, Peters y col. 1996). El aislamiento de los anticuerpos monoclonales específicos del SIV y del VIH es la base de la investigación del VIH (Bergter 1990). Se ha descrito también ampliamente la obtención y la conjugación de isótopos radiactivos (recopilación: Eckert y Kartenbeck 1996).

La radiación alfa es una radiación corpuscular. Con la emisión de una partícula alfa, el núcleo de un emisor de radiación alfa pierde una carga positiva de +2e y una masa de 4 amu. Las partículas alfa emitidas poseen un alcance inferior a 100 \mum, por lo tanto claramente menor al alcance de los electrones de los emisores de las partículas beta. Pero poseen una energía mayor y provocan una ionización mucho más densa que los emisores de rayos beta (Zalutzky y Bigner 1996). Esto se traduce en un mayor daño de las membranas plasmáticas de las células infectadas y en una citotoxicidad netamente mayor, mientras las células no infectadas están expuestas a un efecto radiológico inespecífico menor. Esto es importante cuando las células infectadas con el VIH se hallan por ejemplo diseminadas en todo el organismo del paciente.

De los más de 100 radionúclidos que emiten partículas alfa, la mayor parte no son idóneos para una terapia radioinmune debido a un prolongado período de semidesintegración. Además, muchos son difíciles de obtener o se obtienen en cantidades demasiado pequeñas, de modo que hasta el presente se han podido utilizar muy pocos emisores de radiación alfa en las pruebas clínicas. La mayor parte de experiencias se reducen a la aplicación del astato-211 (At^{211}) y del bismuto-212 (Bi^{212}) (Zweit 1996).

El astato-211 es idóneo para los fines terapéuticos de la presente invención porque tiene dos mecanismos de descomposición, cada uno de los cuales conduce a la emisión de partículas alfa, porque emite rayos X de una intensidad suficiente para el análisis de muestras de sangre y de tejidos con un contador gamma o para el proceso terapéutico de análisis con sistemas de imagen, como es la tomografía computerizada de emisión de protón único (single-proton-emissions-computertomography, SPECT) (Turkington y col. 1993) y porque tiene un período de semidesintegración (hvt) de solo 7 h.

Es también ventajoso en el sentido de la presente invención el bismuto-212 (hvt: 70 min) que ya se ha conjugado con anticuerpos monoclonales y se ha empleado con éxito en modelos animales para la eliminación de células malignas (Kozak y col. 1986, Macklis y col. 1988).

Otro emisor idóneo de rayos alfa, cuyo período de semidesintegración es de 46 minutos, es el bismuto-213 (Bi^{213}) que puede obtenerse mediante un generador a partir del núclido original de actinio (Ac^{225}).

En términos generales son idóneos todos los emisores de rayos alfa y beta que tienen un hvt de 10 d o menos, porque entonces los pacientes están expuestos a una dosis considerable de radiactividad durante un período de tiempo relativamente corto.

Existen amplios estudios sobre los efectos de la radiación radiactiva sobre células y sobre material genético (DNA) (recopilaciones: Kauffmann y col. 1996, Sauer 1998). La base de los efectos biológicos de las radiaciones estriba en el daño estructural de la información genética (DNA) de las células infectadas por el virus (en el caso de la infección con VHC: el DNA de las células hepáticas). Este DNA celular modificado codifica proteínas erróneas, que no cumplen correctamente su misión. De este modo, no solo las enzimas, que son imprescindibles para la replicación del virus, dejan de cumplir con su cometido, sino que además de producen alteraciones metabólicas en la célula infectada con el virus. Esto conduce a la eliminación de las células infectadas por el virus por muerte celular reproductiva o apóptosis. Por otro lado, con la radiación ionizante pueden inactivarse directamente los virus (Follea y col. 1996).

Desde el punto de vista oncológico se emplea con éxito la radiación para la terapia del sarcoma de Kaposi, asociado con el SIDA, dicho sarcoma está inducido por el herpes-virus humano 8 (HHV8) (Conill y col. 1997).

Apenas se cuenta con experiencias de la acción de la radiación ionizante sobre la replicación del VIH. La radiación gamma en dosis bajas puede favorecer según parece una expresión más intensa del VIH (Faure y col. 1995, Xu y col. 1996), pero hasta el presente no ha llamado la atención ningún tipo de aceleración de la replicación del VIH a raíz de la irradiación terapéutica de tumores asociados con el VIH (Lotz y col. 1990, Plettenberg y col. 1991, Scheidegger y col. 1991, Stanley y col. 1991, Krain y Dieckmann 1994, Saran y col. 1995, Swift 1996, Saran y col. 1997). Al contrario, en ensayos con animales se ha constatado a raíz de la infección de macacos con SIV que irradiando específicamente los nódulos linfáticos se puede lograr una reducción de la presión vírica en la sangre periférica y una interrupción de la progresión de la enfermedad (Fultz y col. 1995). La irradiación de la totalidad del cuerpo de los pacientes infectados con el VIH tiene un efecto meramente inespecífico y exige una dosis elevada de radiación. Por consiguiente, el efecto es en principio inseguro y el precio a pagar es elevado por los daños no deseados que provoca la radiación.

A diferencia de lo anterior, hasta el presente no se han hecho pruebas del uso específico de radioisótopos libres para el tratamiento de infecciones víricas (VIH-1, HTLV-1, VHB, HHV8, VIH-2, VIH-3, HTLV-2, VHC, VHD, CMV, EBV, etc.). Sin embargo, tal uso estaría legitimado en la terapia de dichas enfermedades infecciosas, caracterizadas por su curso crónico, la frecuencia y la gravedad de sus secuelas y por la deficiencia del tratamiento terapéutico convencional.

La base de una terapia radioinmune de las infecciones víricas mencionadas anteriormente con los conjugados de inmunoglobulina de la invención consiste en que los antígenos víricos o los antígenos inducidos por virus se integran en la membrana externa de las células infectadas. Esta es una propiedad que ya se ha constatado en el caso de mucho virus, por ejemplo los flavivirus (Westaway y Goodman 1987, Ng y col. 1992), el HSV (Schlehofer y col. 1979), los virus de la gripe (Boulan y col 1980, Ciampor y col. 1981, Kohama y col. 1981, Hughey y col. 1992), los virus de la rabia (Revilla-Monsalve y col. 1985), el EBV (Liebowitz y col. 1986), el VHB (Saito y col. 1992, Gerber y col. 1988, Chu y col. 1997) y el VIH (Timar y col. 1986, Rusche y col. 1987, Feremans y col. 1988, Desportes y col. 1989, Ikuta y col. 1989, Dennin y col. 1991, Dudhane y col. 1996).

Para los medicamentos radioinmunes y RIC de la invención, basados en inmunoglobulinas, deben utilizarse por tanto como componentes inmunológicamente eficaces de los radioinmunoconjugados los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos que fijan antígenos, que en cada caso reconocen y fijan un epítope de los antígenos víricos o inducidos por virus que se hallan en la membrana plasmática de las células infectadas. Son especialmente indicados los anticuerpos monoclonales contra un epítope lo más conservado posible de un antígeno vírico. Entonces, el emisor de rayos alfa o beta conjugado con el anticuerpo monoclonal o con su fragmento que fija antígenos daña específicamente las células que replican el virus. En el caso de tratamiento de una infección del VHC son preferidos los anticuerpos contra un epítope lo más conservado posible de las proteínas E1 o E2 o contra la proteína transmembrana codificada por la región NS2 del VHC (Santolini y col. 1995).

Una forma de ejecución especialmente preferida de la presente invención se refiere a la aplicación simultánea de anticuerpos monoclonales y receptores o sus fragmentos "fríos", es decir, no marcados radiactivamente. La administración de los anticuerpos/receptores/fragmentos puede tener lugar antes (diana previa o pretargeting), después o al mismo tiempo que los radioinmunoconjugados según la presente invención, con lo cual pueden capturarse y neutralizarse las partículas libres de virus.

El anticuerpo frío puede ser idéntico al "caliente", pero puede ser también distinto. Lo importante es que se fije sobre la célula infectada.

El tema de fondo de la radioinmunoterapia de infecciones víricas con conjugados de receptores celulares está además de la expresión de las proteínas víricas en la superficie de las células infectadas también en que se facilita o se media la adsorción de los virus en las células hospedantes de modo específico mediante un receptor situado en la membrana celular. Tal adsorción, mediada por un receptor, se ha constatado ya en numerosos virus, por ejemplo el VIH (Dalgleish y col. 1984), EBV (Fingeroth y col. 1984), virus de la poliomielitis (Leon-Monzon y col. 1995), virus de la rabia (Lentz y col. 1986), virus de la gripe C (Nishimura y col. 1988), virus del sarampión (Dorig y col. 1993), HAV (Kaplan y col. 1996), HSV (Whitbeck y col. 1997), VHB (Treichel y col. 1997), VHC (Seipp y col. 1997), virus de Coxsackie B3 (Shafren y col. 1997) y adenovirus (Bergelson y col. 1998), para no citar más que unos pocos. De este modo pueden tratarse los infectados de VIH p.ej. con un radioinmunoconjugado a7). De igual manera puede efectuarse el tratamiento de pacientes de hepatitis C: con un conjugado de receptor LDL (o un fragmento del mismo) y un radionúclido, con preferencia un emisor de rayos \alpha, con preferencia especial el bismuto-213 o el astato-211, ya que el VHC podría llegar a las células mediante el receptor LDL que actuaría como receptor celular (Seipp y col. 1997).

Las moléculas de receptor recombinante de este tipo se fijan sobre antígenos víricos expresados en la superficie de las células infectadas y del modo descrito anteriormente anclan los radioisótopos sobre las células infectadas.

Los éxitos de la terapia de la invención con los radioinmunoconjugados descritos anteriormente en caso de una disminución previa o concomitante de la presión vírica por el tratamiento del paciente son susceptibles incluso de mejora. Son indicadas al respecto la terapia triple estándar moderna antirretrovírica en caso de las infecciones de VIH y la monoterapia con IFN-\alpha o la terapia de combinación del IFN-\alpha con ribavirina en el caso de las infecciones de VHB o VHC. Con la terapia triple se puede aportar una dosis mayor del medicamento radioinmune anti-VIH a las células infectadas con el virus, con el fin de eliminarlas. De lo contrario, el RIC resultaría capturado por las partículas víricas libres y se reduciría su efecto citotóxico. La monoterapia con IFN-\alpha o la terapia combinada de IFN-\alpha con ribavirina produce la estabilización de la membrana celular de los hepatocitos, lo cual impide que las partículas víricas puedan brotar.

Por consiguiente es preferido un producto farmacéutico de combinación que, además de los RIC, contenga también IFN-\alpha y/o ribavirina y/o un inhibidor de proteasa (PI) y/o un análogo de nucleósido antirretrovírico, p.ej. el AZT, que se emplea en las terapias estándar de las infecciones de VIH. Son también preferidos aquellos productos que contienen además anticuerpos, receptores o sus fragmentos sin marcar según la definición de la reivindicación 1 de a) a c).

Otra variante preferida de tratamiento de pacientes infectados con los RIC de la invención consiste en proteger del ataque vírico las células (todavía) no infectadas de modo que se bloqueen los receptores correspondientes (el receptor CD4 en el caso del VIH) con moléculas no marcadas. Para ello son especialmente indicados los anticuerpos anti-receptor CD4 y los fragmentos de dichos anticuerpos que tengan una afinidad suficientemente grande con el receptor. Son también idóneos los péptidos sintéticos provistos de afinidad con el receptor y que pueden aplicarse antes, al mismo tiempo o incluso después de la administración de los RIC. Es preferida la administración previa o
simultánea.

El radioinmunoconjugado (RIC) de la invención se administra por vía parenteral, con preferencia intravenosa. Para ello es necesario en general un ingreso en clínica de varios días (de 2 a 10 días, en general de 3 a 7 ó 8 días), con el fin de aislar al paciente del medio ambiente hasta que remita la intensidad de la radiación.

El RIC se fija específicamente (mediante anticuerpos monoclonales, sus fragmentos o mediante receptores o sus fragmentos) sobre el epítope correspondiente de una glicoproteína de superficie o de transmembrana, retrovírica, integrada en la pared de las células que replican el virus (o sobre el epítope del receptor). El radioisótopo fijado de este modo sobre esta célula emite radiación sobre su entorno contiguo. Con ello se dañan sobre todo las células infectadas con el virus que han sido ocupadas por numerosos radioinmunoconjugados.

Después de la administración del medicamento radioinmune (también en el caso de pacientes de VIH) hay que contar con la aparición transitoria de efectos secundarios sobre todo hematológicos y hepáticos y con un mayor riesgo de infecciones oportunistas, porque es lógico que además de una mielotoxicidad general disminuirá también considerablemente el número de las células auxiliares T4. Pero tratándose en este caso de células auxiliares T4 infectadas por el VIH que no cumplen con su misión normal, este es un objetivo explícito de la terapia. Por este motivo, la radioinmunoterapia puede acompañarse eventualmente de un trasplante de células patrón. Dado que lascélulas precursoras T4 no están infectadas con el VIH por faltar los receptores CD4, entonces tendrá lugar una regeneración de la población de células auxiliares T4. Este fenómeno se observa también en el estudio mediante ensayos con animales que se ha descrito antes (Fultz y col. 1995).

Una forma preferida de ejecución de la invención se refiere al conjugado a7) y a su utilización para el tratamiento de infecciones de VIH. Las moléculas CD4 pueden obtenerse en grandes cantidades a partir de cultivos celulares (Deen y col. 1988, Glick y Pasternak 1995). La purificación de las moléculas CD4 puede realizarse mediante procedimientos ya consolidados de la biología molecular. Por ejemplo, pueden aislarse de la membrana celular por extracción diferencial con detergentes no iónicos (Eckert y Kartenbeck 1997^{1}), por purificación de líquidos sobrenadantes de cultivos celulares del modo descrito por Deen y col. 1988, por separación biomagnética (Deutsche Dynal GmbH, Hamburgo) o por otros métodos. La obtención de conjugados de proteínas e isótopos radiactivos puede efectuarse por ejemplo por el método de la cloramina T (Hunter y Greenwood 1962, Eckert-Kartenbeck 1997^{2}).

Otra forma de ejecución de la presente invención se refiere al uso de fragmentos CD4 sintéticos provistos de afinidad con la gp120. Tales fragmentos pueden producirse en grandes cantidades en un huésped procariótico, tal como la Escherichia coli, o un huésped eucariótico, como la Saccharomyces cerevisiae (Wilcox y Studnicka 1988, Martin y Scheinbach 1989).

Finalmente, los fragmentos CD4 pueden modificarse además por mutagénesis (Jones y col. 1990) y con vistas a la aplicación terapéutica pueden optimizarse en lo referente a su farmacocinética, afinidad con la gp120 y solubilidad en líquidos. Para lograr una mutagénesis específica se requieren conocimientos del papel que desempeñan los aminoácidos en un péptido adecuado para la misión prevista. Estos conocimientos pueden lograrse mediante análisis genéticos, análisis radiológicos de la estructura espacial tridimensional de los nformáticos computerizados. Un conjugado a7) especialmente preferido consta de un receptor CD4 y un radionúclido Bi-212, Bi-213 o At-211.

Frente a la terapia convencional (VHC: terapia con IFN-\alpha; VIH: terapia convencional antirretrovírica), la principal ventaja de la terapia con los radioinmunoconjugados de la presente invención consiste en que se dañan y eliminan directamente las células infectadas con los virus, con lo cual aumenta notablemente la probabilidad de una curación total. Esto se aplica también al procedimiento del trasplante de hígado en el caso de cirrosis hepática provocada por el VHC, procedimiento que está lastrado con la problemática de la recidiva del VHC.

Una ventaja de la terapia radioinmune de la invención, en especial cuando se utiliza el conjugado a7), consiste en que se dañan selectivamente las células infectadas por el virus. Los radioinmunoconjugados se fijan específicamente mediante la parte de proteína o de péptido al epítope específico de CD4 (en el caso de una infección de VIH) de glicoproteínas de superficie gp120 retrovíricas que, por la membrana citoplasmática exterior de las células replicadoras del VIH, están expuestas al brote de los virus y emiten su radiación directamente sobre las células.

Otra ventaja de estos conjugados a7) consiste en que son idóneos para el tratamiento de un amplio espectro de cepas víricas (VIH-1, VIH-2, VIH-3, HTLV-1, HTLV-2, etc.). Esto tiene una importancia enorme con vistas a la facilidad de mutación de estos virus y del consiguiente desarrollo de resistencia frente a sustancia terapéuticas convencionales (en efecto, los epítopes gp-120 relevantes para la fijación del receptor CD4 son muy parecidos en todos los aislados de VIH-1 y VIH-2 (Sattentau y col. 1988) y esenciales para la infecciosidad).

Otra ventaja de los péptidos sintéticos y eventualmente modificados adicionalmente, de un tamaño lo menor posible, pero que conservan la especificidad de antígeno, consiste en que pueden atravesar fácilmente la barrera hemático-encefálica. Por ello, estos conjugados son también idóneos para la eliminación de células infectadas del SNC.

Es determinante el hecho de que la molécula CD4 o una parte de la molécula CD4 esté unida a un radionúclido con el fin de poder tratar la infección de VIH tendente a eliminar las células infectadas con el virus. El beneficio de la terapia de medicina nuclear descrita de las infecciones de VIH resulta del simple hecho de que esta infección de lentivirus es una infección más peligrosa que otras infecciones víricas, que tiene un curso crónico, que probablemente desemboca en casi todos los casos en un desenlace fatal y que no puede curarse con medicamentos convencionales. Por el hecho de que además a largo plazo no se dispondrá de una vacuna fiable contra la infección del VIH (Gallo, Reuters News, mayo 1997) y que en los últimos tiempos han aparecido cepas de VIH mono- y multirresistentes a los agentes antirretrovíricos convencionales (Erickson y Burt 1996, Imrie y col. 1997), las estrategias terapéuticas novedosas, como la descrita en esta solicitud, cobran una gran importancia.

Pertenecen al estado de la técnica los procedimientos de obtención de moléculas CD4, el desarrollo de fragmentos CD4 con afinidad para la gp120 por técnicas de recombinación de DNA y procedimientos de marcado "in vitro" de proteínas solubles con radioisótopos. La conjugación de radioisótopos con moléculas CD4 o los correspondientes fragmentos CD4 se ilustra en los ejemplos.

Finalmente, una gran ventaja estriba en la buena tolerancia subjetiva si se compara con las terapias antirretrovíricas convencionales y en el bajo porcentaje objetivo de efectos secundarios que presentan las terapias radioinmunológicas. Es conocido ciertamente que la energía de radiación de un emisor de rayos \alpha o \beta, como es el I^{131}, tiene un alcance de uno a 40 diámetros celulares. Sin embargo, las transformaciones malignas de células sanas como consecuencia del daño provocado por radiaciones son extraordinariamente raras y apenas se han registrado estadísticamente. Si una célula sana resulta dañada, entonces pierde también en la mayoría de los casos la capacidad de división y sufre la muerte reproductiva o programada (apóptosis). La irradiación de células sanas contiguas desempeña un papel secundario en el caso de la radioinmunoterapia de linfocitos T infectados con VIH o de hepatocitos infectados con VHC debido a que estas células se hallan mayormente en circulación y por ello las células sanas solo se exponen a la carga de la radiación durante un período de tiempo corto.

Obtención de radioinmunoconjugados 1. Medicamentos radioinmunes basados en anticuerpos monoclonales

El desarrollo de anticuerpos monoclonales específicos de virus y la comprobación de su capacidad de reacción cruzada son las bases de trabajos de investigación virológica (Bergter 1990).

Pertenecen al estado de la técnica la identificación y la purificación de proteínas y péptidos víricos fijados sobre la membrana celular (Eckert y Kartenbeck 1997). Son igualmente conocidos los métodos de obtención de anticuerpos monoclonales (MAB) murinos, humanizados y humanos así como la obtención de fragmentos de MAB que pueden fijar antígenos (Peters y Baumgarten 1990, Lidell y Weeks 1996). En el ejemplo 1 se describe esquemáticamente la identificación y el aislamiento de antígenos víricos o inducidos por virus a partir de la membrana plasmática de células infectas y la obtención de anticuerpos monoclonales.

Ejemplo 1

Mediante análisis inmunocitológicos y de microscopio electrónico previos se clarifica en primer lugar si en principio se han integrado proteínas víricas en la membrana de las células infectadas que pudieran ser susceptibles de radioinmunoterapia. Para ello se detecta con microscopio de fluorescencia o con microscopio electrónico la fijación de anticuerpos específicos de virus sobre las células infectadas por incubación con anticuerpos monoclonales murinos marcados (Payne y col. 1990, Stirling 1990, Kaito y col. 1994, Sabri y col. 1997).

Si se detectan antígenos de este tipo en la membrana citoplasmática, entonces tiene que aclararse de qué tipo concreto de antígenos se trata. Para ello se lisan las células infectadas con los virus y se separan las proteínas de la membrana por electroforesis a través de gel. Se pinchan sobre nitrocelulosa y después se analizan con antisueros o con anticuerpos monoclonales murinos.

Para la inmunización y obtención de anticuerpos monoclonales es necesaria la purificación de los antígenos víricos o inducidos por virus, integrados en la membrana celular que se hayan hallado. Para ello se cultivan los virus en sistemas idóneos de cultivo celular, por ejemplo los VIH en células H9, células MT-4, células MOLT-4, células HUT-78, etc. (Bergter 1990) y los VHC en células DAUDI (Nakajima y col. 1996) y se aíslan del líquido sobrenadante del cultivo celular. En primer lugar se centrifugan las células y los restos (cascotes) celulares. A continuación se sedimenta el virus a partir del líquido sobrenadante purificado por centrifugación a 27.000 rpm. El perdigón del virus se vuelve a suspender en un tampón de muestra y se separa por electroforesis a través de gel. Finalmente se aísla la fracción de antígeno, que corresponde al antígeno buscado de la membrana plasmática. Este antígeno se emplea para inmunizar ratones y para fabricar anticuerpos monoclonales.

Se verifica la reactividad cruzada de los anticuerpos monoclonales obtenidos de este modo con diversos aislados víricos con preferencia mediante un ensayo ELISA, Immunoblot y RIPA. El anticuerpo monoclonal idóneo posee de forma ideal una amplia reactividad cruzada y abarca por tanto la totalidad de la casi-especie de un infectado.

Si no se obtiene ningún anticuerpo monoclonal que reconozca a todos los aislados víricos, entonces se fabrican anticuerpos monoclonales específicos de los aislados, que seguidamente podrán utilizarse en la terapia del aislado detectado en cada caso concreto.

2. Fabricación de medicamentos radioinmunes basados en moléculas de receptores hospedantes

Tal como se ha descrito anteriormente, ahora se han identificado una amplia serie de moleculares receptores celulares de virus, que facilitan o median la adsorción de los virus en la superficie de las células hospedantes. Los métodos de identificación y obtención de tales moléculas receptoras pertenecen al estado de la técnica. El procedimiento se describe en el ejemplo 2. El receptor del VIH-1 y del VIH-2 es el receptor CD4, mientras que el VHC se fija probablemente sobre el receptor LDL (Seipp y col. 1997).

Ejemplo 2

Se separa el virus en cuestión (p.ej. el VHC) por electroforesis a través de gel, de modo que se puedan aislar los antígenos víricos (de HC). A continuación se realizan estudios de fijación con las muestras de tejido (del hígado) y sistemas de cultivo celular y se identifica el receptor celular buscado que interviene en la adsorción del virus (Dorig y col. 1993, Treichel y col. 1997). Se aísla este receptor por métodos ya conocidos (Suzuki y col. 1983) y se analiza seguidamente el epítope de anclaje, para ello se analiza el anclaje del antígeno sobre los distintos productos de descomposición. Finalmente se clona la molécula receptora (Bergelson y col. 1998) y después se procesa a gran escala para conjugarla con un radioisótopo y para el uso terapéutico previsto en la presente invención.

3. Conjugación de radionúclidos idóneos

Se conjugan los anticuerpos monoclonales o moléculas receptoras hospedantes con un radionúclido (emisor de radiación alfa o beta). La conjugación de radionúclidos con proteínas se ha descrito en muchas ocasiones y pertenece al estado de la técnica (recopilación: Eckert y Kartenbeck 1996). El procedimiento se describe a título ilustrativo en el ejemplo 3, teniendo en cuenta que los distintos métodos (p.ej. Zalutzky y col. 1989) pueden ser más o menos adecuados para determinadas estructuras de conjugado, de modo que los métodos y procedimientos deberán adaptarse a cada caso particular y optimizarse según proceda.

Ejemplo 3

Se conjugan radiactivamente los anticuerpos monoclonales o las moléculas receptoras idóneos con fines terapéuticos por el método de la cloramina T (Hunter y Greenwood 1962) con arreglo a las instrucciones de Eckert y Kartenbeck 1997. Para ello se oxida brevemente un radioisótopo con el hipoclorito liberado en medio acuoso por la cloramina T (sal Na de la N-cloro-p-tolueno-4-sulfonamida). El radioisótopo muy electrófilo se fija en este estado con preferencia sobre los anillos bencénicos de los aminoácidos aromáticos existentes en la proteína. Para preservar los anticuerpos monoclonales o las moléculas receptoras, después de un breve período de incubación esta reacción se interrumpe con un exceso de bisulfito, con lo cual se reducen no solo la cloramina T residual, sino también los radioisótopos todavía sin fijar, con lo cual se inactivan. Finalmente se aísla por electroforesis a través de gel el conjugado de MAB-radioisótopo y se procesa con los adyuvantes necesarios para la administración con preferencia intravenosa. Se dispone además de otros procedimientos (Harrison y Royle 1984, Zalutzky y col. 1989). Por uno de estos procedimientos pueden obtenerse p.ej. los conjugados a7).

Estudios preclínicos

Los ensayos "in vitro" ponen de manifiesto en primer lugar si y con qué afinidad los radioinmunoconjugados a través del lugar de fijación de antígeno de los anticuerpos monoclonales o de las moléculas receptoras hospedantes se fijan sobre los correspondientes epítopes de proteínas víricas integradas en la membrana de células infectadas con virus y si las células resultan dañadas por la radiación emitida por el radioisótopo. Estos estudios se realizan en sistemas adecuados de cultivo celular.

En las etapas siguientes, con ratones desnudos y con otros modelos animales pueden realizarse ensayos "in vivo" preclínicos para determinar la eficacia de la terapia radioinmune antes de ensayar la aplicación clínica en pacientes infectados. En el caso del tratamiento del VHC, los chimpancés infectados con el VHC p.ej. (Tabor y col. 1978, Walker y col. 1997) constituyen un sistema experimental idóneo.

Aplicación al paciente: requisitos terapéuticos

En diversos estudios de fase I (estudios de escalado de dosis) deberán determinarse las dosis máximas tolerables (DMT) en lo referente a efectos secundarios, farmacocinética e inmunogenidad. Con los estudios clínicos posteriores (estudios de fase II y fase III) deberá verificarse finalmente el efecto de los distintos medicamentos radioinmunes en pequeños colectivos de pacientes que sufren una enfermedad avanzada y en colectivos de pacientes tomados al azar (Fiebig 1995).

El corto período de semidesintegración de los radionúclidos (tanto los emisores de rayos \alpha, como los de rayos \beta) exige que la fabricación se realice en las proximidades del centro clínico y que el transporte del radioinmunoconjugado hasta el facultativo que dirige el tratamiento sea rápido. Esto es importante en el supuesto de que los períodos prolongados de semidesintegración expongan al paciente tratado a una dosis de radiación excesiva a lo largo de un período demasiado largo. Para la terapia de pacientes de VIH, de hepatitis vírica y event. de otras infecciones víricas que se realice con radionúclidos de vida corta es imprescindible por tanto la construcción de centros interdisciplinarios especializados, en los que además de una terapia específica correcta de los infectados se garantice también la aplicación en el lapso de tiempo correcto del radioinmunoconjugado teniendo en cuenta los aspectos jurídicos de protección a la radiación.

Un requisito previo del éxito terapéutico puede ser además la reducción preterapéutica de la presión vírica, que puede lograrse mediante el tratamiento previo del paciente con preparados antivíricos o antirretrovíricos. De este modo, la dosis de medicamento radioinmune que llega a las células replicadoras de virus es mayor y con ello se mejora el efecto terapéutico. De lo contrario, el medicamento radioinmune resultaría posiblemente capturado por las partículas libres de virus y se reduciría el efecto citotóxico. En caso de una infección de VHC puede realizarse un tratamiento previo con IFN-\alpha o con ribavirina. Puede llevarse a cabo en forma de monoterapia o bien en forma de terapia combinada.

Antes de la aplicación de un preparado basado en el I^{131} tiene que realizarse además un diagnóstico de glándulas tiroides y un bloqueo de las mismas con arreglo al esquema habitual.

Para la terapia radioinmune es necesario el ingreso del paciente en un centro clínico durante varios días para aislarlo el medio ambiente hasta que remita la radiación. El medicamento radioinmune se administra por vía periférica o intravenosa en forma de bolo, de infusión breve o de terapia prolongada durante varios días con una dosis de 25-300 mCi, con preferencia de 50-300, con preferencia especial de 100-200 mCi. La administración se realiza en una sola vez o en forma de ciclos a intervalos de varias semanas. En caso de existir hipersensibilidad a los anticuerpos monoclonales o a la molécula receptora puede ser eventualmente necesario inmediatamente antes de la administración del preparado un tratamiento previo con un glucocorticoide, un antihistamínico y/o un antogonista H_{2} (Lorenz 1994).

Una forma de ejecución especialmente ventajosa de la invención es el uso de anticuerpos monoclonales (MAB) humanizados o humanos, con lo cual puede soslayarse la inmunogenidad de los conjugados de MAB murinos. Por otro lado, este uso es adecuado cuando se trata de sensibilizar adicionalmente el sistema inmunológico contra la infección del virus.

Otra forma ventajosa de ejecución se refiere al uso de fragmentos de anticuerpos monoclonales o de receptores celulares como componentes inmunológicamente activos de los radioinmunoconjugados porque, cuando las moléculas tienen un tamaño menor, es mejor su movilidad en los tejidos y su capacidad de penetración a través de la barrera hemático-cefálica.

La terapia radioinmunológica de infecciones víricas adquiere una importancia enorme desde el punto de la medicina preventiva en especial en aquellos casos en los que se trata de impedir o tratar enfermedades oncológicas mediante la eliminación preventiva de los virus, por ejemplo las que derivan de infecciones de VIH-1, HTLV-1, HTLV-2, HHV8, EBV, VHC y VHB.

A pesar de que los emisores de rayos beta y alfa ya se utilizan en la terapia radioinmunológica de enfermedades malignas, a diferencia de ellos la presente invención no solo constituye una indicación completamente nueva para los medicamentos radioinmunes en general, sino que tiene un enfoque terapéutico fundamentalmente distinto y reivindica preparados antivíricos de estructura muy específica, destinados a un ámbito exactamente definido. En el caso de la terapia radioinmune de enfermedades malignas se emplean anticuerpos monoclonales contra proteínas intrínsecas de las células y específicas de los tumores, mientras que en el caso de los radioinmunoconjugados descritos en la invención se emplean anticuerpos monoclonales o sus fragmentos u otras proteínas o péptidos con un objetivo terapéutico dirigido especialmente contra proteínas víricas (es decir, no propias de las células) e inducidas por virus (es decir, no específicas de un tipo de células).

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Claims (13)

1. Uso de un radioinmunoconjugado (RIC) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de infecciones víricas y de tumores inducidos por ellas, caracterizado porque, en calidad de componente inmunológicamente activo, este conjugado contiene:

a) una molécula receptora o un fragmento de la misma que tenga afinidad con un epítope de las proteínas estructurales víricas expresadas en la membrana plasmática de células infectadas o

b) un fragmento de molécula receptora celular, modificado por mutagénesis, provisto de afinidad con un epítope de las proteínas estructurales víricas expresadas en la membrana plasmática de células infectadas y,

en calidad de componente radiactivo:

c) un emisor de radiación alfa o un emisor de radiación beta.

2. Uso de un radioinmunoconjugado (RIC) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de infecciones víricas y de tumores inducidos por ellas, caracterizado porque, en calidad de componente inmunológicamente activo, este conjugado contiene:

a) un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que fije a un antígeno, dirigido contra un antígeno vírico o inducido por virus, expresado en la membrana plasmática de células infectadas con virus y,

en calidad de componente radiactivo,

b) un emisor de radiación alfa o un emisor de radiación beta, y caracterizado además porque

c) se prepara el medicamento contra una infección de VIH para administrarse después de o durante una terapia antirretrovírica como pueda ser la terapia triple estándar y/o

d) se prepara el medicamento contra una infección de VHB, VHC o VHD para administrarse después de o durante una monoterapia con IFN-\alpha o una terapia combinada de IFN-\alpha y ribavirina,

con la limitación de que el RIC no es un medicamento para el tratamiento de infecciones de HTV ni de tumores inducidos por ellas, cuando el anticuerpo monoclonal o su fragmento contiene, en calidad de componente radiactivo, un emisor de radiación beta.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la infección vírica es una infección de VIH, VHB, VHC, VHD, HTLV, CMV, EBV o HHV8.

4. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque la infección es una infección de VIH, en especial una infección de VIH-1, VIH-2 o VIH-3, una infección de VHB, una infección de VHC o una infección de HTLV, en especial una infección de HTLV-1 o HTLV-2.

5. Uso según una de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, caracterizado porque el radioinmunoconjugado, en calidad de componente inmunológicamente activo, contiene el receptor CD4 o un fragmento del mismo que tenga afinidad con un epítope de la gp120 del VIH-1 y/o del VIH-2.

6. Uso según una de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, caracterizado porque el radioinmunoconjugado, en calidad de componente inmunológicamente activo, contiene el receptor LDL u otro receptor que tenga afinidad con un epítope de la glicoproteína de superficie E1 o E2 del VHC o un fragmento de estos receptores.

7. Uso según una de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, caracterizado porque el radioinmunoconjugado, en calidad de componente inmunológicamente activo, contiene el receptor ASGPR u otro receptor que tenga afinidad con las glicoproteínas de superficie del VHB o un fragmento de estos receptores.

8. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el radioinmunoconjugado se fabrica para la administración intravenosa en una o en varias veces de una dosis corporal total comprendida entre 25 y 300 mCi, manteniendo al paciente aislado del medio ambiente durante uno o varios días hasta cesen las radiaciones.

9. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el emisor de rayos \alpha o de rayos \beta tiene un período de semidesintegración de 10 días o menos.

10. Uso según la reivindicación 9, caracterizado porque el emisor de rayos \alpha es o contiene bismuto-212 y/o bismuto-213 y/o astato-211 y/o radio-223 y/o actinio-225 y el emisor de rayos \beta es o contiene I^{131} y/o Sr^{89} y/o Lu^{177} y/o Lu^{186} y/o Re^{186} y/o Re^{188} y/o Rh^{105} y/o Sc^{47} y/o Sm^{153} y/o Tb^{149}.

11. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque

a) se fabrica el medicamento contra una infección de VIH para administrarse después de o durante una terapia antirretrovírica, tal como la terapia triple estándar y/o

b) se fabrica el medicamento contra una infección de VHB, VHC o VHD para administrarse después de o durante una monoterapia con IFN-\alpha o una terapia de combinación de IFN-\alpha con ribavirina y/o

c) se fabrica el medicamento para administrarse antes de, durante o después de una operación quirúrgica, en especial un trasplante después de la degradación cirrótica del hígado como consecuencia de una hepatitis vírica o una resección de un carcinoma de células hepáticas, inducido por una hepatitis vírica, y/o

d) se fabrica el medicamento para administrarse protegiendo un trasplante de células patrón y/o

e) se fabrica el medicamento para administrarse antes de o durante una administración de un componente inmunológico,definido en la reivindicación 1 ó 2, sin componente radiactivo.

12. Kit que comprende uno o varios componentes inmunológicos, definidos en la reivindicación 1 ó 2, y una columna cromatográfica.

13. Kit según la reivindicación 12 que contiene además un disolvente para el (los) componente(s) inmunológico(s) así como eventualmente un elemento de anclaje, como la cloramina T, para fabricar el conjugado (RIC).