ES2210678T3 - Inmunoensayo que utiliza dos incubaciones con antigenos marcado. - Google Patents

Inmunoensayo que utiliza dos incubaciones con antigenos marcado.

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN INMUNOENSAYO PARA ANTICUERPOS CONTRA UN AGENTE INFECCIOSO, QUE COMPRENDE INCUBAR UNA MUESTRA QUE SE SOSPECHA QUE CONTIENE ANTICUERPOS CON ANTIGENOS INMOVILIZADOS Y MARCADOS LIBRES DEL AGENTE INFECCIOSO, SEPARAR LOS COMPONENTES INMOVILIZADOS E INCUBARLOS CON OTRO ANTIGENO MARCADO LIBRE, DETERMINANDOSE LA CANTIDAD DE ANTIGENO MARCADO INMOVILIZADO. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE AL USO DEL INMUNOENSAYO Y DE UN KIT PARA REALIZAR EL INMUNOENSAYO.

Description

Inmunoensayo que utiliza dos incubaciones con antígeno marcado.
La presente invención se refiere a un inmunoensayo. La presente invención se refiere también al uso del inmunoensayo y a un kit para llevar a cabo el inmunoensayo de la presente invención.
Los inmunoensayos emplean anticuerpos como reactivos analíticos para la detección de los analitos. Los inmunoensayos se usan para detectar la presencia de un agente infeccioso analizando bien el agente infeccioso o bien los anticuerpos generados por el hospedador infectado frente al agente infeccioso. La presente invención se refiere a un inmunoensayo para detectar anticuerpos contra un agente infeccioso.
Los inmunoensayos para detectar anticuerpos pueden implicar dos etapas de incubación. En la primera incubación se incuba la muestra a analizar con los antígenos de un agente infeccioso que ha sido inmovilizado en una superficie, por ejemplo la superficie de un micropocillo. Cualquier anticuerpo contra el agente infeccioso existente en la muestra se unirá a los antígenos en la superficie. Después de una etapa de lavado se lleva a cabo una segunda incubación usando antígenos del agente infeccioso marcados con una sustancia detectable. El antígeno marcado se unirá a los anticuerpos inmovilizados en la superficie. Tras una etapa adicional de lavado, se determina la cantidad de marcaje unido a la superficie. Una elevada señal indica la presencia de anticuerpos contra el agente infeccioso. La Figura 1 muestra una representación esquemática de dicha técnica anterior de inmunoensayo. La técnica anterior de inmunoensayo se describe también en el documento EP-A-0313986.
Un ejemplo disponible comercialmente de dicha técnica anterior es el sistema de análisis ORTHO^{TM} HIV-1/HIV-2 Ab-capture ELISA.
La detección precisa del VIH y de otras infecciones tiene una importancia considerable. El diagnóstico temprano de la infección por VIH permite comenzar un tratamiento médico y tomar precauciones con el fin de limitar la transmisión del virus. También es de gran importancia evitar los falsos positivos en la detección del VIH.
Los inmunoensayos de la técnica anterior tienen una serie de limitaciones, que incluyen la sensibilidad limitada y la dificultad de discriminar entre muestras positivas débiles y muestras negativas. Las limitaciones de los inmunoensayos de la técnica anterior se describen en el documento EP-A-0174652. Por lo tanto, hay una necesidad de encontrar un inmunoensayo con una sensibilidad y una especificidad aumentadas.
La presente invención proporciona un inmunoensayo para anticuerpos contra un agente infeccioso que comprende:
i. incubar una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos con un antígeno del agente infeccioso inmovilizado y un antígeno libre marcado del agente infeccioso;
ii. separar los componentes inmovilizados de los componentes no inmovilizados.
iii. incubar los componentes inmovilizados con más antígeno libre del agente infeccioso marcado y después separar los componentes inmovilizados de los componentes no inmovilizados; y
iv. determinar la cantidad de antígeno marcado inmovilizado, siendo la cantidad de marcaje indicativa de la cantidad de dichos anticuerpos presentes en la muestra.
Se ha encontrado que la presencia de antígeno libre marcado en la primera incubación del inmunoensayo incrementa las señales positivas débiles mientras que las señales negativas permanecen sin cambios.
Se requiere la presencia de antígeno libre marcado, además de en la primera incubación, en la segunda incubación, especialmente si la muestra es una muestra fuertemente positiva o sospechosa de ser una muestra fuertemente positiva. Una muestra fuertemente positiva es una muestra en la que la cantidad de anticuerpo contra el agente infeccioso es suficientemente alta como para saturar el antígeno inmovilizado y el antígeno libre marcado. Por ejemplo, una muestra fuertemente positiva es una muestra que es positiva incluso a una dilución mayor de 1/5000.
La expresión "agente infeccioso" como se usa aquí significa cualquier organismo o partícula que puede infectar a un paciente. Los agentes infecciosos incluyen las bacterias y los virus. Preferiblemente, el inmunoensayo de la presente invención es para uso en la detección de anticuerpos contra uno o más de VIH-1, VIH-2, virus de la hepatitis B (abreviadamente VHB) y virus de la hepatitis C (VHC).
El inmunoensayo de la presente invención puede usarse para detectar la presencia de anticuerpos contra diferentes agentes infecciosos. Por lo tanto, el inmunoensayo de la presente invención puede ser usado para detectar la presencia de más de un agente infeccioso.
Para los expertos en la técnica resultará evidente que cuando se emplea el inmunoensayo para detectar la presencia de anticuerpos contra diferentes agentes infecciosos se deben usar en el inmunoensayo los antígenos de cada diferente agente infeccioso.
El inmunoensayo de la presente invención debe usar uno, y usa preferiblemente dos o más, antígenos para cada agente infeccioso a detectar. Los antígenos preferidos son aquellos que tienen un epítopo que es fácilmente reconocible y que se une fuertemente a un anticuerpo. Además se prefiere que el antígeno tenga un epítopo que sea estable y no proclive a mutación, reduciéndose por tanto el riesgo de que una forma mutada del agente infeccioso no sea detectada.
Cuando el agente infeccioso es el VIH, preferiblemente el antígeno se selecciona entre gp120, p24, gp41, gp160, Env10 y Env13 A/L.
Cuando el agente infeccioso es el VHB, preferiblemente el antígeno se selecciona entre los HBs (antígeno de superficie de hepatitis B) y HBc (antígeno central de hepatitis B).
En el inmunoensayo de la presente invención, el antígeno se inmoviliza preferiblemente sobre una superficie. La superficie puede ser una pared de un pocillo de una placa de microtitulación u otro recipiente para recoger la muestra y/o antígeno libre marcado, una tira reactiva o perlas. Las superficies apropiadas para inmovilizar un antígeno se describen en "Immunoassays" (Diamandis, E.P. y Christopoulos T.K., Academic Press, London (1996)), especialmente en las páginas 205 a 216.
El antígeno se puede inmovilizar a través de un número de técnicas estándar conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, por adsorción física del antígeno mismo o del antígeno acoplado a una proteína transportadora o a una macromolécula (véase "Immunoassays" Diamandis, E.P. y Christopoulos T.K., Academic Press, London (1996), especialmente en las páginas 216 a 222 y 229).
El antígeno libre marcado se puede marcar con cualquier tipo de marcaje detectable siempre que el marcaje no interfiera sustancialmente con la unión del antígeno con el anticuerpo. Los marcajes apropiados incluyen: enzimas, como la peroxidasa de rábano (en inglés HRP) y la cloranfenicol acetiltransferasa (abreviadamente CAT); digoxigenina (DIG); fluoresceína; y radioisótopos como ^{125}I, ^{3}H y ^{14}C. El antígeno se marca preferentemente con la HRP.
Dependiendo del marcaje empleado, la cantidad de antígeno marcado inmovilizado se determina usando métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, si el marcaje es HRP, se pueden medir la degradación de luminol por la enzima y la emisión de quimioluminiscencia asociada. Sin embargo, si se emplea marcaje radioactivo, la presencia de marcaje se mide detectando la radiación emitida.
Si se detectan anticuerpos contra diferentes agentes infecciosos, los antígenos libres marcados de cada agente infeccioso pueden ser marcados de manera distinta para hacer así posible la distinción entre los anticuerpos contra cada agente infeccioso.
La muestra puede ser cualquier fluido o tejido que contenga anticuerpos, tal como sangre, suero, médula ósea, saliva u orina. Sin embargo, si la muestra es un tejido, puede ser necesario deshacer el tejido en una solución apropiada tal como la solución salina, de manera que los anticuerpos estén presentes en disolución.
Preferiblemente la muestra es sangre. En algunas circunstancias puede ser necesario eliminar determinados componentes de la muestra sanguínea tales como leucocitos y eritrocitos, antes de analizar la muestra. Lo más preferiblemente la muestra es plasma sanguíneo.
Preferiblemente el inmunoensayo de la presente invención comprende además el uso de un tampón de ensayo con el fin de proporcionar una medio biológico adecuado para llevar a cabo el inmunoensayo. Los tampones de ensayo apropiados son conocidos para los expertos en la técnica e incluyen a los tampones fosfato, y pueden conprender NaCl para aumentar la fuerza iónica y material proteínico para reducir las uniones inespecíficas y las interferencias.
La presente invención también proporciona el uso del inmunoensayo de la presente invención en el diagnóstico de la presencia de un agente infeccioso.
El agente infeccioso es, preferiblemente, el VIH-1 o el VIH-2.
La presente invención proporciona además un kit adaptado para llevar a cabo el inmunoensayo de la presente invención, que comprende:
i) una superficie en la que se ha inmovilizado un antígeno del agente infeccioso o una superficie en la que se puede inmovilizar un antígeno del agente infeccioso en combinación con los medios para inmovilizar un antígeno del agente infeccioso;
ii) antígeno libre marcado;
iii) reactivo señal y/o un aparato para detectar la presencia del antígeno marcado; y
iv) un recipiente para incubar la superficie con una muestra y/o el antígeno libre marcado, pudiendo comprender el recipiente opcionalmente la superficie,
estando el kit adaptado de manera que:
(a) el antígeno libre marcado se incuba con la muestra y el antígeno inmovilizado;
(b) los componentes inmovilizados se separan de los componentes no-inmovilizados; y
(c) antígeno libre marcado adicional se incuba con los componentes inmovilizados.
La superficie en la que ha sido inmovilizado el antígeno puede ser la pared del pocillo de una placa de microtitulación u otro recipiente para recoger la muestra y/o el antígeno libre marcado, una tira reactiva o perlas. Las superficies apropiadas para inmovilizar un antígeno se describen en "Immunoassays" (Diamandis, E.P. y Christopoulos T.K., Editores, Academic Press, London (1996)), especialmente en las páginas 205 a 216.
El reactivo señal y/o el aparato dependerán del marcaje empleado en el kit. Por ejemplo, si se marca con HRP, el reactivo señal puede comprender luminol.
Preferiblemente el kit de la presente invención también comprende un tampón de ensayo con el fin de proporcionar un medio biológico adecuado para llevar a cabo el inmunoensayo.
La presente invención se describe adicionalmente ahora a modo de ejemplo solamente, haciendo referencia a las figuras adjuntas en las que:
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un inmunoensayo de la técnica anterior. En la primera incubación del inmunoensayo se añade una muestra de un paciente que contiene el anticuerpo al antígeno inmovilizado. Todo anticuerpo que no se ha unido se retira por lavado durante la etapa de lavado. A continuación, se añade el antígeno conjugado a la HRP en la segunda incubación del inmunoensayo y se une a cualquiera de los sitios libres de unión del anticuerpo unido. La cantidad de HRP unida, y consecuentemente el anticuerpo unido del paciente se mide por la adición de un reactivo señal; y
La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra el inmunoensayo de la presente invención. En la primera incubación del inmunoensayo se añaden una muestra de un paciente que contiene el anticuerpo y el antígeno conjugado con la HRP al antígeno inmovilizado. Cualquier componente no unido se elimina por lavado en la etapa de lavado. A continuación el antígeno conjugado con la HRP se añade en la segunda incubación del inmunoensayo y se une a cualquiera de los sitios libres de unión del anticuerpo unido. La cantidad de HRP unida, y consecuentemente el anticuerpo unido del paciente, se mide por la adición de un reactivo señal.
Ejemplo comparativo
Técnica anterior, protocolo de dos etapas (véase Figura 1)
Se añade 80 \mul de muestra y 20 \mul de tampón de ensayo a un micropocillo recubierto de antígeno del VIH preparado por adsorción pasiva de Env10, Env13, Env A/L y p24 (suministrados comercialmente por Chiron) durante una noche cubriéndolo con tampón borato (pH 9.0, 90 mM),. Se incuba durante 25 minutos. Se lava con tampón de lavado. Se añaden 100 \mul de antígenos marcados con HRP (p. ej. Env10, Env13, Env A/L y p24 marcados con HRP (suministrados comercialmente por Chiron)) y se incuba durante 5 minutos. Se lava con tampón de lavado (suministrado comercialmente por Ortho Clinical Diagnostics (O.C.D.), Amersham). Se añaden 200 \muL de reactivo señal (suministrado comercialmente por O.C.D., Amersham); y se detecta la señal usando quimioluminiscencia intensificada.
Ejemplo 1 Protocolo de incubación doble con antígeno marcado con HRP (véase la Figura 2)
Se añaden 80 \mul de muestra, 20 \mul de tampón de ensayo y 20 \mul de los antígenos marcados con HRP (según se definió anteriormente) a un micropocillo recubierto con antígeno del virus VIH preparado como antes. Se incuba durante 25 minutos. Se lava con tampón de lavado. Se añaden 100 \mul del antígeno marcado con HRP (como se definió anteriormente) y se incuba durante 5 minutos. Se lava con tampón de lavado (suministrado comercialmente por O.C.D., Amersham). Se añaden 200 \mul de reactivo señal (suministrado comercialmente por O.C.D., Amersham) y se detecta la señal usando quimioluminiscencia intensificada.
Formulaciones de los reactivos
Tampón de ensayo con HRP Reactivo de antígeno marcado
Agua desionizada 1000 g Agua desionizada 580 g
Ortofosfato disódico H 0,31 g Ortofosfato disódico H 0,63 g
Ortofosfato monopotásico 2H 1,09 g Ortofosfato monopotásico 2H 0,20 g
Cloruro sódico 8,2 g Cloruro sódico 4,83 g
Kathon 5,0 g Kathon 10,0 g
EDTA 0,35 g Suero fetal bovino 410 g
Antiespumante 0,01 g Ferrocianuro potásico 0,34 g
Tween 20 0,5 g
Antígenos del VIH marcados con HRP 17 g
Antiespumante 0,01 g
Resultados
Con el uso del protocolo de incubación doble con antígeno marcado con HRP de la presente invención se consigue un aumento en la diferenciación de las señales negativas y las señales positivas débiles (véase la Tabla 1). Esta diferenciación aumentada se puede usar para incrementar tanto la sensibilidad como la especificidad del inmunoensayo seleccionando el valor discriminante de manera adecuada.
El uso del inmunoensayo de la presente invención también mejora la sensibilidad del panel de seroconversión. En los resultados mostrados en la Tabla 2 se puede observar que la muestra AB2 da un resultado negativo con el formato de ensayo estándar, pero el resultado es un positivo claro cuando se añade el antígeno marcado con HRP en la primera etapa del inmunoensayo. La muestra R1 también da un resultado positivo más fuerte con el extra de antígeno marcado con HRP. Ambas muestras son muestras clave de seroconversión que no se detectan en la mayoría de los inmunoensayos disponibles comercialmente.
TABLA 1 Efecto sobre la señal por la adición de antígeno marcado con HRP en la primera etapa de un inmunoensayo de 2 etapas
Señal (unidades de luz)
Muestra marcada Ensayo estándar Doble antígeno con HRP
Positivos débiles
Calibrador 0,68 4,08
QCA 0,12 4,74
QCB 4,54 20,56
QCC 9,80 50,36
QCD 13,27 32,13
Negativos
1 0,07 0,10
2 0,02 0,02
3 0,02 0,03
4 0,02 0,02
5 0,03 0,03
6 0,02 0,03
Media del resultado negativo 0,03 0,04
Las señales positivas aumentaron entre 3 y 40 veces. No existe un incremento significativo de los resultados negativos.
TABLA 2 Detección mejorada de muestras de seroconversión por adición de antígeno marcado con HRP en la primera etapa de la reacción
Resultados normalizados (>1 = positivo)
Ensayo de muestras de seroconversión Ensayo estándar Doble antígeno con
marcadas HRP
R1 1,70 2,32
R2 14,81 15,41
E8 0,13 0,12
E9 7,31 7,85
E10 53,50 40,92
AB2 0,85 1,28
AB3 89,06 72,25
W8 0,11 0,09
W9 5,86 5,83
W10 26,13 21,17
Por lo tanto, la invención ofrece las siguientes ventajas para la realización de los inmunoensayos:
1.
Una sensibilidad de seroconversión mejorada;
2.
Una sensibilidad de dilución mejorada (es decir, una capacidad mejorada para detectar menores cantidades de anticuerpos); y
3.
Una especificidad mejorada.
Otras realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Se sobreentiende que el ejemplo se da para una mayor claridad, y es meramente ejemplar. El espíritu y alcance de la presente invención no están limitados por el ejemplo anterior, sino que están definidos mediante las siguientes reivindicaciones:

Claims (11)

1. Un inmunoensayo para anticuerpos contra un agente infeccioso que comprende:
i. incubar una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos con antígeno inmovilizado del agente infeccioso y antígeno libre marcado del agente infeccioso;
ii. separar los componentes inmovilizados de los componentes no inmovilizados.
iii. incubar los componentes inmovilizados con más antígeno libre marcado del agente infeccioso y eliminar los componentes no inmovilizados; y
iv. determinar la cantidad de antígeno marcado inmovilizado, siendo la cantidad de marcaje indicativa de la cantidad presente en la muestra de dichos anticuerpos.
2. El inmunoensayo de la reivindicación 1, en el que los anticuerpos son frente a dos o más agentes infecciosos diferentes.
3. El inmunoensayo de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que se usan dos o más antígenos de cada agente infeccioso.
4. El inmunoensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente infeccioso es uno o más de VIH-1, VIH-2, VHB o VHC.
5. El inmunoensayo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente infeccioso es el VIH-1 y/o el VIH-2.
6. El inmunoensayo de la reivindicación 5, en el que el antígeno es uno o más de gp120, p24, gp41, gp160, Env10 y Env13 A/L.
7. El inmunoensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente infeccioso es el VHB.
8. El inmunoensayo de la reivindicación 7, en el que el antígeno es uno o más de los HBs o HBc.
9. El inmunoensayo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antígeno marcado se marca con peroxidasa de rábano.
10. El uso del inmunoensayo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el diagnóstico de la presencia de un agente infeccioso.
11. El uso de la reivindicación 10, en el que el agente infeccioso es el VIH-1 y/o VIH-2.
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