ES2209660A1 - Mejoras en el objeto de la patente principal n.9901037 por: "nueva utilizacion de lactobacillus casei para la preparacion de leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios deprimidos". - Google Patents
Mejoras en el objeto de la patente principal n.9901037 por: "nueva utilizacion de lactobacillus casei para la preparacion de leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios deprimidos".Info
- Publication number
- ES2209660A1 ES2209660A1 ES200300009A ES200300009A ES2209660A1 ES 2209660 A1 ES2209660 A1 ES 2209660A1 ES 200300009 A ES200300009 A ES 200300009A ES 200300009 A ES200300009 A ES 200300009A ES 2209660 A1 ES2209660 A1 ES 2209660A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hline
- study
- treatment
- preparation
- stress
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Dairy Products (AREA)
Abstract
Mejoras en el objeto de la patente principal nº 9901037 por: "nueva utilización de lactobacillus casei para la preparación de leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios deprimidos". Utilización de bacterias lácticas Lactobacillus casei para la preparación de leches fermentadas a utilizar en la modulación de la supresión inmunológica asociada con estrés psicológico.
Description
Mejoras en el objeto de la patente principal n°
9901037 por: ``Nueva utilización de Lactobacillus casei para
la preparación de leches fermentadas para el tratamiento de niveles
inmunitarios deprimidos''.
La presente patente de adición se refiere a
mejoras introducidas en la Patente principal 9901037 por: ``Nueva
utilización de Lactobacillus casei para la preparación de
leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios
deprimidos''.
La presente invención es fruto de
investigaciones posteriores realizadas en la utilización de leches
fermentadas con Lactobacillus casei, habiéndose conseguido
una nueva utilización ventajosa, la cual es objeto de la presente
invención.
La presente invención se basa en el
descubrimiento, después de prolongados estudios realizados, de que
la leche fermentada con Lactobacillus casei
DN-114 001 modula la supresión inmunológica asociada
con estrés psicológico.
Como es sabido, se produce estrés cuando se
supera la capacidad de resistencia del cuerpo humano. Esto puede
ser debido a factores de estrés físico, tales como trauma o agentes
químicos, o agentes de estrés puramente psicológicos que se
originan de forma cognitiva. Son ejemplos de agentes de estrés
psicológico los disgustos, ansiedad, divorcios, mudanzas de la
vivienda y estos eventos de la vida pueden tener un profundo efecto
en la salud y en el sistema inmunitario, reduciendo las defensas
naturales e incrementando la susceptibilidad a infecciones y cáncer
(Biondi y Zannino 1997; Spiegel et al. 1998). Un modelo bien
estudiado de estrés psicológico es el asociado con exámenes
académicos y la inmunosupresión en estos estudiantes ha sido bien
documentada (Kiecolt-Glaser et al. 1984a;
Kiecolt-Glaser et al. 1984b; Glaser et
al. 1986a; Glaser et al. 1986b;
Kiecolt-Glaser et al. 1986; Dobbin et
al. 1991; Glaser et al. 1992; Glaser et al. 1998;
Marshall et al. 1998; Maes et al. 1999b; Yang y
Glaser 2002).
Las bacterias del ácido láctico (LAB) son
ejemplos de probióticos, microorganismos vivos que cuando se
ingieren en número suficiente tienen un efecto beneficioso en la
salud del sujeto que los toma. Los efectos varían con la cepa
específica de LAB y el Lactobacillus casei
DN-114 001 ha demostrado ser muy eficaz en la
protección de ratones contra infecciones por Salmonella
(Paubert-Braquet 1995), reduciendo la diarrea en
niños Pedone, 1999 #614; Pedone et al. 2000; Agarwal et
al. 2001) y protegiendo ratas contra infección por rotavirus
(Guerin-Danan et al. 2001). El L.
casei DN-114 001 puede ejercer estos efectos
beneficiosos modificando el perfil de la microflora
gastrointestinal, mejorando la función barrera de la mucosa
gastrointestinal y aumentando la inmunidad mucosal y sistémica. Se
informó sobre una función inmunomoduladora con anterioridad para el
L. casei DN-114 001, con producción reducida
de TNF-\alpha a partir de biopsias
gastrointestinales de pacientes afectados de la enfermedad de Crohn
(Borruel et al. 2002) y redujo la disminución del número de
células NK provocado por ejercicios intensos (Pujol 2000).
Si bien están aumentando las pruebas de la
eficacia de probióticos en modelos de infecciones, pocos estudios
han examinado el papel inmunomodulador de probióticos en sujetos
sanos. Los mecanismos por los que los probióticos influyen en el
sistema inmune de individuos sanos debe ser evaluado con estudios
bien controlados para apoyar los beneficios sanitarios propuestos.
El presente estudio fue diseñado para investigar si el
Lactobacillus casei DIN-114 001, podía
modular la inmunosupresión asociada con el estrés psicológico,
tomando como ejemplo el estrés producido por los exámenes
académicos en estudiantes universitarios y a qué parámetros inmunes
afectaba.
Estudiantes sanos (n=155) con edades
comprendidas entre 18 y 23 años que fueron reclutados en la
Universidad Alfonso X El Sabio (Madrid, España). Los sujetos no
tenían historial de alergia o intolerancia a la leche ni ningún
otro síntoma atópico en el momento del estudio. También se
excluyeron sujetos que hubieran sufrido alguna infección durante el
mes anterior o si habían participado en otros estudios de
intervención nutricional durante los tres meses anteriores. Los
estudiantes facilitaron su consentimiento previo por escrito antes
del inicio de la prueba, y el estudio fue llevado a cabo de acuerdo
con las reglas éticas de la Declaración de Helsinki (revisión de
Hong Kong, Septiembre de 1989), siguiendo las normas de una
Práctica Clínica Sana CE (documento 111/3976/88 de Julio de 1990) y
la Ley española actual que regula las investigaciones clínicas en
humanos (Real Decreto 561/1993 con respecto a pruebas clínicas).
Una serie de estudiantes (n=17) no completó el estudio, debido
principalmente a cambio de programas de los exámenes y uno de los
sujetos quedó excluido debido a enfermedad. Se indican detalles
antropométricos de los sujetos que terminaron el estudio (n=138) en
la tabla 1, e indica que los sujetos tenían un BMI normal. Se
incluyeron en los análisis juegos de datos completos para 127
sujetos.
El estudio fue prospectivo, randomizado,
controlado y paralelo, que permita determinar las diferencias de
linfocitos totales. Los sujetos fueron asignados a uno de dos
grupos, recibiendo o bien un vaso [250 ml] de leche descremada cada
día (grupo de control, n=63) o dos raciones de 100ml por día de
leche fermentada (Actimel®, Danone, Francia) conteniendo L.
casei DN-114 001 (10^{8}/ml), y cultivos de
yogurt L. bulgaricus (10^{7}/ml) y Streptococcus
thermophilus (10^{8}/ml) todos los días (grupo de
tratamiento, n=75). Esta intervención fue llevada a cabo durante
las tres semanas anteriores al período de exámenes del estudiante y
también durante las tres semanas de los propios exámenes. Se
permitió a los estudiantes el consumo de su dieta normal, si bien
no se les permitió consumir ningún otro producto de leche
fermentada durante el estudio.
Para controlar la variación estacional en la
situación de inmunidad, se estudiaron dos grupos de estudiantes;
los que se sometían a exámenes en Febrero (n=86) y los que se
sometían a exámenes en Junio (n=63). Si bien existió un período de
descanso de 6 meses entre las dos fases.
Se midieron parámetros de ansiedad,
hematológicos, bioquímicos e inmunológicos al inicio del estudio
(línea base) y 6 semanas más tarde al final del período de exámenes
(final del estudio). En los días indicados, los estudiantes
llegaron al laboratorio por la mañana y proporcionaron muestras de
sangre venosa en ayunas y fueron sometidos a pruebas inmunológicas
in vivo y mediciones antropométricas (peso corporal,
altura). El cumplimiento de la dieta fue evaluado utilizando un
diario de dieta de 7 días y un cuestionario sobre la frecuencia de
las comidas.
Se evaluaron los niveles de estrés utilizando la
prueba de ansiedad por trazos de Spielberger (STAI) (Spielberger
et al. 1966). Este instrumento comprende dos escalas
autoinformativas de 20 elementos para evaluar el nivel corriente de
ansiedad y propensión al estrés. Se evalúan en ambas escalas
sentimientos de aprensión, tensión, nerviosidad y preocupación.
Se evaluó la hematología de sangre entera de
modo rutinario utilizando sangre recogida en EDTA (diferencial de
célula sanguínea, hemoglobina, hematocrito, MCV, MCH, MCHC) y
bioquímica en el suero a partir de muestras coaguladas (glucosa,
perfil de lípidos, hierro, ferritina, transferrina, proteína total,
albúmina, pre-albúmina, enzimas de hígado, ácido
úrico y urea) utilizando un analizador automatizado (Coulter
Counter, Hialeah, Florida). Se midió el cortisol en el suero por
nefelometría.
Se midieron los subjuegos de linfocitos y
citoquinas por citometría de flujo (Facscan Plus, Becton Dickinson,
Sunnyvale, CA). Se incubó sangre entera heparinizada con
anticuerpos monoclonales (CD3, CD4, CD8, CD19, CD56,
IL-2, IL-4,
TNF-\alpha e IFN-\gamma; Coulter
Clone, Coulter Corporation, Hialeah, Florida) durante 10 minutos a
4°C, y se procesó utilizando el sistema Immunoprep (EPICS XL,
Coulter Corporation, Hialeah, Florida).
También se evaluó la función de fagocitos
(fago-coli) por citometría de flujo de sangre
entera heparinizada por detección de bacterias tintadas,
opsonizadas en granulocitos de sangre periférica después de la
ingestión. Se evaluó de manera similar la capacidad oxidante
(burst-coli) por detección por citometría de flujo
de la actividad de peroxidasa en granulocitos de sangre
periférica.
Se midieron las inmonoglobulinas del suero (IgG,
IgM, IgA) por nefelometría.
Se evaluaron datos referentes a la normalidad y
homogeneidad de variancia, y se expresan como media \pm error
estándar. Se evaluaron las diferencias con respecto a la línea base
para cada parámetro utilizando la prueba apareada t de Student o
bien Wilcoxon según necesidades. La comparación de grupos se llevó
a cabo utilizando ANOVA (con tratamiento y período como factores),
o en el caso en que los datos infringían las suposiciones para
análisis paramétrico se convirtieron en gamas antes del análisis
por ANOVA. El análisis fue llevado a cabo utilizando software SPSS,
y se consideró significativo P<0,05. El nivel de asociación entre
variables se estudió por el coeficiente de correlación de
Pearson.
De modo global, el nivel del estadio de ansiedad
aumentó significativamente durante el estudio de 6 semanas, de
40,74\pm(SE) a 61,19\pm(SE)% con pocos cambios en
la ansiedad de rasgo. No hubieron diferencias significativas en los
niveles de ansiedad de estado o de rasgo entre los grupos de
control y de tratamiento que fueron similares en la línea base y al
final del estudio y que cambiaron de manera similar durante el
estudio (tabla 2). La ansiedad fue similar para estudiantes en
ambos períodos de examen a excepción de la medición de ansiedad de
estado de la línea base que fue significativamente más elevada para
el período de examen de Junio (46,80\pm(SE)%) en
comparación con el período de examen de Febrero
(36,61\pm(SE)%).
Hubo una diferencia significativa entre el grupo
de control y el grupo de tratamiento en los números absolutos de
linfocitos de la línea base (2,84\pm(SE) células
10^{3}/mm^{3} y 2,41\pm(SE) células 10^{3}/mm^{3},
respectivamente). También hubo un efecto significativo de tipo
estacional en los números absolutos de linfocitos en la línea base
cuando con independencia del grupo se encontraron números de
linfocitos absolutos más elevados en sujetos durante el período de
exámenes de Febrero (2,78\pm(SE) células 10^{3}/mm^{3})
en comparación con el período de exámenes de Junio
\hbox{(2,29 \pm (SE)} células
10^{3}/mm^{3}).
Durante el transcurso del período de estudio de
6 semanas el número absoluto de linfocitos cambió de manera
significativa. En comparación con valores de la línea base, los
contajes absolutos de linfocitos para el grupo de control en ambos
períodos de examen disminuyeron significativamente al final del
estudio. En comparación con los valores de línea base, los contajes
absolutos de linfocitos para el grupo de tratamiento había
incrementado al final del estudio, si bien esto solamente fue
significativo para el examen de Junio (tabla 3).
Con independencia del período de exámenes, hubo
un efecto significativo de tratamiento en el cambio en el número
absoluto de linfocitos a lo largo del estudio de 6 semanas, siendo
de -0,04\pm(SE) células x 10^{3}/mm^{3} para el grupo
de control y de 0,37\pm(SE) células 1 0^{3}/mm^{3} para
el grupo de tratamiento (P<0,05) (figura 1).
Los niveles de línea base de células expresando
el antígeno de diferenciación CD56 fueron significativamente
distintos para los grupos de control (354,63\pm(SE)
células/mm^{3}) y tratamiento (284,02\pm(SE)
células/mm^{3}) (tabla 4). También hubo un efecto estacional
significativo, con el valor absoluto de células CD56^{+} de línea
base en el período de examen de Febrero (367,55\pm(SE)
células/mm^{3}) en comparación con el período de Junio
(221,00\pm(SE) células/mm^{3}), con independencia del
grupo.
Los números absolutos de células CD56^{+}
cambiaron significativamente en el curso del estudio de 6 semanas.
En comparación con los valores de base, los contajes absolutos de
células CD56^{+} en el grupo de control en ambos períodos de
examen había disminuido significativamente al final del estudio. En
comparación con los valores base, los contajes absolutos de células
CD56^{+} en el grupo de tratamiento en ambos períodos de examen
siguieron siendo similares al final del estudio (tabla 4). Este
efecto de tratamiento sobre el cambio de las células CD56^{+} a
lo largo del período de estudio de 6 semanas era estadísticamente
significativo (-51,97\pm(SE) células/mm^{3} y
17,29\pm(SE) células/mm^{3} para los grupos de control y
de tratamiento respectivamente, P<0,05 (figura 2).
No hubo diferencia significativa entre los
grupos de control y de tratamiento en el cortisol en el suero
medido para la línea base (19,98\pm(SE) y
19,63\pm(SE) \mug/dL respectivamente). No obstante, los
valores de cortisol para la línea base presentaban diferencias
significativas estacionales (23,41\pm(SE) \mug/dL y
17,57\pm(SE) \mug/dL para los sujetos de examen de Junio
y Febrero respectivamente).
Los niveles de cortisol en el suero aumentaron
durante el estudio de 6 semanas en los grupos de control y de
tratamiento (24,29\pm(SE) y 21,32\pm(SE) \mug/dL
al final del estudio, respectivamente), si bien esto fue solamente
significativo para el grupo de examen de Febrero. El incremento fue
mayor para el grupo de control (4,30\pm\mug/dL) en comparación
con el grupo de tratamiento (1,75\pm\mug/dL), si bien esto no era
significativo (figura 3).
Los parámetros de hematología y bioquímica de la
sangre permanecieron dentro de gamas normales durante el curso del
estudio confirmando la ausencia de enfermedad.
Hubieron diferencias significativas entre los
grupos de tratamiento y de control en los valores de base para la
mayor parte de parámetros de serología (no se muestran datos).
Durante el período de estudio de 6 semanas, IL-2,
IL-4,
\hbox{IL-5},
IL-10, IFN\gamma, e IgM tendieron a aumentar en
una magnitud mayor en el grupo de tratamiento en comparación con el
grupo de control, si bien ello no era estadísticamente
significativo (tabla 4). Los parámetros que tendían a disminuir
durante el período de estudio de 6 semanas (IgG y TNF\alpha) lo
hicieron en una magnitud más reducida en el grupo de tratamiento en
comparación con el grupo de control (tabla 4). La excepción fue
IgA que disminuyó más en el grupo de tratamiento en comparación con
el grupo de control si bien ello no era significativo. Además, el
cambio en IgG, TNF\alpha, IL-5,
IL-10 e IFN\gamma varió significativamente con la
estación.
Se observaron diferencias significativas entre
los grupos de control y tratamiento en valores base para la mayor
parte de parámetros celulares (no se muestran datos). Durante el
período de estudio de 6 semanas, las células expresando CD2, CD3,
CD4 y CD19 aumentaron en una magnitud superior en el grupo de
tratamiento en comparación con el grupo de control, si bien ello no
era estadísticamente significativo (tabla 5). Además, si bien las
células que expresaban CD8 disminuyeron en el grupo de control,
éste incrementó durante el estudio de 6 semanas en el grupo de
tratamiento (tabla 5). Se incrementó Burst-coli en
el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control,
mientras que Phage-coli mostró la tendencia opuesta
(tabla 5). Además, el cambio en todas las variables celulares
cambió significativamente con la estación.
Hubo una correlación inversa significativa entre
el cortisol medio en el suero y los números absolutos de linfocitos
(r>0,70), pero no se observó correlación entre cortisol y otros
parámetros inmunológicos (r<0,70).
El estrés psicológico ha sido asociado desde
hace mucho tiempo con la inmunosupresión, que aumenta la
susceptibilidad a las infecciones (Biondi y Zannino 1997) y que se
puede implicar en el avance del cáncer (Spiegel et al.
1998). El presente estudio descubrió que la inmunosupresión
asociada a estrés académico se podía modular por el suplemento de
dieta con un producto de leche fermentada conteniendo L.
casei DN-114 001. Este efecto fue observado en
sujetos sanos que consumían su dieta usual, utilizando dosis
prácticamente asequibles y demuestra eficacia a plazo medio (6
semanas) para la leche fermentada conteniendo L. casei
DN-114.
Tres rutas principales subyacen en los efectos
del estrés psicológico sobre el sistema inmunológico; el eje
hipotalámico-pituitario-adrenal
(HPA), el eje
simpático-adrenal-medular (SAM), y
el sistema opioide endógeno (Kusnecov y Rabin 1994; Yang y Glaser
2002). El sistema nervioso central (CNS), el sistema endocrino y el
sistema inmunitario están íntimamente relacionados y los efectos
son bi-direccionales, de manera que cambios en
cualquiera de ellos puede afectar a los otros. El CNS puede modular
el sistema inmunitario dado que las células inmunitarias tienen
receptores para hormonas neuroendocrinas, neuropéptidos y
neurotransmisores y uniones neuroefectoras existen entre órganos
linfoides y neuronas simpáticas (Yang y Glaser 2002). Además, el
sistema inmunitario puede influir en el CNS debido a la presencia
de receptores para citoquinas en el CNS (Kusnecov y Rabin
1994).
Se incluyen entre los modelos de estrés
psicológico los estudiantes de medicina sometidos a exámenes y el
estudio de estos sujetos ha revelado que este estrés académico está
asociado con la desregulación del sistema inmunitario y en cambios
en muchos parámetros inmunitarios. Estos incluyen una disminución
en IFN\gamma(Glaser et al. 1986b; Dobbin et
al. 1991; Marshall et al. 1998), respuesta proliferativa
de linfocitos disminuida (Dobbin et al. 1991), actividad y
número de las células NK reducida (Kiecolt-Glaser
et al. 1984a; Glaser et al. 1986b; Kiecolt-Glaser
et al. 1986) y proporción reducida CD4^{+}/CD8^{+} de
células T (Kiecolt-Glaser et al. 1986; Maes
et al. 1999b). También quedó afectada la inmunidad humoral,
con cambios en los niveles de inmunoglobulina en plasma
(Kiecolt-Glaser et al. 1984a; Glaser et
al. 1986a). De modo global, la supresión de la inmunidad
mediada por las células tiene como resultado una reducción en la
capacidad del cuerpo en defenderse a sí mismo contra los patógenos
y el cáncer, y una mayor incidencia de infecciones del tubo
respiratorio, una respuesta reducida a las vacunas y a la
reactivación de virus latentes que se han observado como resultado
de estrés académico (Kiecolt-Glaser et al.
1984b; Glaser et al. 1992; Glaser et al. 1998; Yang y Glaser
2002). Se han obtenido resultados similares de otros modelos de
estrés psicológico incluyendo estudiantes de nivel universitario
(Kang et al. 1997) y personas al cuidado de parientes
afectados de demencia (Esterling et al. 1996; Glaser et al.
1998). El presente estudio apoya estos descubrimientos con
disminuciones significativas en los números de linfocitos y
disminución del número de células NK circulantes en estudiantes que
se someten al estrés de examen.
Las LAB en el yogurt y leches fermentadas se han
demostrado desde hace mucho tiempo con características de mejora de
la salud dado que alteran de manera beneficiosa el perfil de la
microflora gastrointestinal y pueden proteger al individuo que las
toma contra bacterias patógenas, protegiendo contra cáncer y
reduciendo alergia y atopia (DeSimone et al. 1988; Perdigon
et al. 1990; Van de Water et al. 1999; Perdigon et
al. 2002).
Las LAB tienen también una función
inmunomoduladora, uniéndose a la superficie luminal de las células
M gastrointestinales y estimulando los tejidos linfoides asociados
al intestino (Erikson y Hubbard 2000; Meydani y Ha 2000). Esto
tiene como resultado la modulación de la inmunidad local y
sistémica, reforzando la respuesta inmune innata y proporcionando
un coadyuvante para la respuesta inmune específica (Meydani y Ha
2000).
De acuerdo con la presente invención, los
estudiantes que tomaban leche fermentada con L. casei
DN-114 001 en el presente estudio tuvieron contajes
de linfocitos significativamente más elevados después del período
de 6 semanas y mantuvieron sus niveles de células NK previas para
examen en comparación con sujetos de control que tenían contajes de
linfocitos más bajos y niveles de células NK más reducidos al final
del estudio. No obstante, se debe observar que los números de
células CD56^{+} medidos en este estudio habrían contenido un
subjuego de células T que son CD56^{+}, y esto habría elevado el
contaje absoluto de células ``NK''. No es posible determinar que
impacto tenía este subconjunto de células T sobre los contajes de
células CD56^{+} observados.
Estos descubrimientos de incrementos de células
NK confirman un estudio previo, en el que 30 días de suplemento
dietético con leche fermentada con L. casei DN-114
001 redujeron la disminución de células NK asociadas con una
actividad muy fuerte (Pujol 2000). Los estudios con otras cepas de
Lactobacillus soportan estos descubrimientos con respuestas
de las células NK incrementados en humanos después de suplemento
durante tres semanas de L. casei shirota (Nagao et
al. 2000), y respuestas de linfocitos incrementadas y mayor
resistencia a la infección y cáncer en modelos animales después de
suplemento con una serie de LAB (DeSimone et al. 1987; Kato
et al. 1994; Yamazaki et al. 2000; Takagi et
al. 2001; Aattour et al. 2002; Hori et al.
2002).
Si bien algunos estudios han indicado
incrementos en B linfocitos, pero no linfocitos T después de
administración LAB (DeSimone et al. 1987; Aattour et
al. 2002), el presente estudio no encontró diferencia
significativa en los subconjuntos de linfocitos en comparación con
la línea base, aunque había una tendencia hacia el incremento tanto
en células T (CD3) como en células B (CD19). Otros parámetros
mostraron también esta tendencia incluyendo citoquinas y fagocitos,
y confirman los descubrimientos de incremento en la gama de
parámetros inmunes mucosal y sistémico después de administración de
LAB (Solis Pereyra y Lemonnier 1991; Muscettola et al. 1994;
Solis Pereyra et al. 1997; Gill y Rutherford 2001; Aattour
et al. 2002; Perdigon et al. 2002).
No obstante, otros estudios no revelan efectos
de LAB sobre parámetros inmunitarios, o incluso disminuciones de
función inmunitaria (Wheeler et al. 1997; Ha et al.
1999; Campbell et al. 2000; Pestka et al. 2001).
Resultados anómalos tales como los indicados son debidos
probablemente a diferencias en metodología (por ejemplo, duración
del suplemento alimenticio, dosis, sujetos, especies, dieta
prevalente) o a las cepas de LAB (Maassen et al. 2000).
Además, la naturaleza compleja del sistema inmunitario se debe
considerar durante la interpretación, dado que algunos estudios
indican la desregulación de la respuesta inmunitaria asociada a
informaciones, alergias y autoinmunidad después de suplementos con
LAB (Ha et al. 1999; Cross et al. 2001; Kano et
al. 2002). La desregulación de la respuesta inmunitaria se
observa también después del cultivo de explantes mucosales de
pacientes afectados de enfermedad de Crohn con L. casei
DN-114 001, con resultado de disminución de
producción de TNF-\alpha (Borruel et al.
2002).
El estrés tiene como resultado la activación del
eje HPA, lo que resulta finalmente en liberación de cortisona. Esta
``hormona del estrés'' es bien conocida como inmunosupresora y se
incrementó por el estrés de exámenes en el presente estudio, si
bien solamente de manera significativa en el período de exámenes de
Febrero. Otros estudios anteriores no habían mostrado asociación
entre estrés y cortisona (Dobbin et al. 1991), o habían
encontrado incrementos de cortisol solamente en un subconjunto de
sujetos (Malarkey et al. 1995). Estos hallazgos pueden ser
debidos a diferencias en la sensibilidad (siendo algunos sujetos
más capaces de resistir estrés que otros) o sincronización de las
muestras (dado que se puede esperar que los sujetos se encontrarían
al máximo del estrés justamente antes del primer examen).
No obstante, la relación entre estrés,
glucocorticoides e inmunosupresión no es probablemente tan
directa
\break(Christensen y Jensen 1994), y pueden presentarse muchas anomalías. Por ejemplo, si bien la administración de corticoesteroides exógenos reduce la resistencia a la infección, los corticoesteroides se utilizan para tratar enfermedades inflamatorias y, si bien es conocido que el estrés crónico aumenta mucho la enfermedad inflamatoria, el estrés agudo tiene el efecto opuesto (Strausbaugh et al. 1999). Así pues, si bien la producción de IL-6 por células mononucleares de sangre periférica se reduce por el estrés, la producción de IL-6 por el sistema neuroendocrino se incrementa, lo cual es proinflamatorio (Zhou et al. 1993). Además, la cortisona y ACTH (hormona adrenocorticotrópica) pueden no estar necesariamente correlacionadas en modelos de estrés (Malarkey et al. 1995; Jensen et al. 1996). Es probable que si bien dosis farmacológicas de corticoesteroires suprimen la respuesta inmune, dosis fisiológicas pueden tener una gama de efectos desde incremento hasta la supresión (Dhabar 2000), y si bien un estrés agudo aumenta la reactividad inmune, un estrés crónico resulta en inmunosupresión (Dhabar y McEwan 1996; Dhabar 2000). La relación entre estrés y cortisol es por lo tanto compleja, si bien la ansiedad y el cortisol incrementaron durante el presente estudio.
El hallazgo de una correlación inversa entre el
cortisol y el número de linfocitos con un reducido incremento de
cortisol e incremento de linfocitos en sujetos que consumen leche
fermentada conteniendo L. casei DN-114 001
es interesante. Es posible que la acción inmunomoduladora de las
LAB sobre el número de linfocitos tenga influencia en el CNS por
alteraciones en el equilibrio de citoquinas. La reducción de la
liberación de citoquinas tales como IL-1 pueden
reducir el factor de liberación de corticotrofina (CRF), liberación
de ACTH y cortisol (Kusnecov y Rabin 1994), si bien no se analizó
IL-1 en el presente estudio. No obstante, este punto
de vista es probablemente demasiado simple dado que la
distribución de linfocitos queda afectada por el equilibrio de
corticoesterona, epinefrina y norepinefrina, y los incrementos y
disminuciones en el número de linfocitos quedan mediados por
diferentes rutas (Dhabar 2000). La interacción de los tres sistemas
(HPA, SAM, opioides) es probablemente responsable de la variedad de
relaciones entre cortisona y parámetros inmunitarios sobre los que
se ha informado (Lu et al. 1999; Maes et al.
1999a).
De manera alternativa, es factible que el LAB o
microflora gastrointestinal tenga un efecto directo en la
cortisona. El estrés afecta el tubo gastrointestinal a través de
una serie de mecanismos incluyendo disrupción de la
microcirculación (Filaretova et al. 1999) y menores niveles
de prostaglandina mucosal (Gitlin et al. 1988), y altera el
equilibrio de la microflora gastrointestinal con una disminución de
las LAB (Bailey y Coe 1999). No obstante, estos cambios
gastrointestinales no tenían correlación con la secreción de
cortisona (Gitlin et al.. 1988; Bailey y Coe 1999;
Filaretova et al. 1999), y la administración de un
probiótico no tenía efectos sobre la cortisona en el suero en
ciervos (Zomborszky et al. 1996). La correlación entre
cortisol y números de linfocitos del presente estudio es por lo
tanto difícil de explicar y requiere trabajos adicionales, si bien
se debe observar que la correlación no indica causalidad, y que los
dos descubrimientos pueden ser independientes.
El presente estudio encontró diferencias
estacionales significativas en muchos parámetros inmunes incluyendo
linfocitos y células NK, y se puede esperar debido a la
variabilidad estacional en la prevalencia de infecciones. También
se observó efecto en el cortisol por la estacionalidad en el
presente estudio en contraste con datos publicados anteriormente
que no hallaron efectos estacionales en la secreción de cortisol en
24 horas (Malarkey et al. 1995), si bien el mismo estudio
encontró variación estacional en ACTH durante el día.
A continuación se indican varias tablas
relacionadas con los estudios experimentales llevados a cabo por el
inventor:
la Tabla 1 muestra detalles antropométricos de
los sujetos del estudio,
la Tabla 2 muestra la ansiedad de estudiantes en
grupos de control y tratamiento,
la Tabla 3 muestra el diferencial de células
blancas de la sangre durante el estudio de 6 semanas,
la Tabla 4 muestra el número de células NK
durante el estudio,
la Tabla 5 muestra el cambio en serología
inmunológica durante el estudio de 6 semanas,
la Tabla 6 muestra el cambio en la inmunología
celular durante el estudio de 6 semanas.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|}\hline
\+ exámenes de junio \+ exámenes de febrero \+ total muestra \\
\+ media \hfill SE \+ media \hfill SE \+
media \hfill SE \\\hline tamaño de la \+ \+ \+ \\
muestra \+ 52 \+ 86 \+ 138 \\\hline número mujeres \+ 37 \+ 59
\+ 96 \\\hline número hombres \+ 15 \+ 27 \+ 42
\\\hline\multicolumn{4}{|c|}{}\\\hline edad (años) \+ \+ \+
\\\hline peso corporal (kg) \+ \+ \+ \\\hline BMI (kg/m ^{2} ) \+
\+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|c|l|c|l|c|c|c|}\hline
\+ \+\multicolumn{2}{|c|}{Línea base
}\+\multicolumn{2}{|c|}{Final del }\+\multicolumn{3}{|c|}{Cambio a
lo largo de las 6}\\ \+ Grupo
\+\multicolumn{2}{|c|}{}\+\multicolumn{2}{|c|}{estudio
}\+\multicolumn{3}{|c|}{semanas del estudio}\\\dddcline{3}{9} \+
\+ n \+ media SE \+ n \+ media SE \+ n \+ media \+
significación de la \\ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ diferencia
\\ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ P entre grupos \\\hline
Ansiedad- \+ control \+ 58 \+ 43,59 \+ 60 \+ 65,12 \+ 57 \+
21,65 \+ P >0,05 \\\hline situación \+ tratamiento \+ 68 \+
38,31 \+ 69 \+ 57,77 \+ 65 \+ 19,14 \+
\\\hline\multicolumn{9}{|c|}{}\\\hline Ansiedad- \+ control \+ 58
\+ 40,55 \+ 60 \+ 40,00 \+ 57 \+ -0,95 \+ P >0,05 \\\hline
rasgo \+ tratamiento \+ 67 \+ 37,36 \+ 69 \+ 39,13 \+ 64 \+
1,34 \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|l|c|l|l|l|c|}\hline\multicolumn{3}{|c|}{}\+
Línea base \+ Final del \+ Cambio \+ significación
\\\multicolumn{3}{|c|}{}\+ \+ estudio \+ \+ de P cambio \\\hline
\+ Sujetos \+ n \+ media SE \+ media SE \+ media SE \+ \\\hline
Leucocitos 10 ^{3} /mm ^{3} \+ todos \+ 127 \+ 7,11 \+ 7,49
\+ 0,38 \+ <0,001 ^{1} \\\hline Monocitos % \+ todos \+
127 \+ 4,91 \+ 4,8 \+ -0,11 \+ <0,05 \\\hline Granulocitos
% \+ todos \+ 127 \+ 57,75 \+ 56,79 \+ -0,96 \+ >0,05
\\\hline Linfocitos % \+ todos \+ 127 \+ 37,33 \+ 38,41 \+
1,08 \+ <0,05 ^{1} \\\hline Linfocitos 10 ^{3} /mm ^{3} \+
todos \+ 127 \+ 2,60 \+ 2,79 \+ 0,19 \+ \\\hline \+ Junio,
control \+ \+ \+ \+ \+ <0,05 \\\hline \+ Febrero, control
\+ \+ \+ \+ \+ <0,05 \\\hline \+ Total control \+ \+
2,84 \+ 2,81 \+ -0,04 \+ \\\hline\multicolumn{7}{|c|}{}\\\hline
\+ Junio, tratamiento \+ \+ \+ \+ \+ 0,001 \\\hline \+
Febrero, tratamiento \+ \+ \+ \+ \+ >0,05 \\\hline \+
Total tratamiento \+ \+ 2,41 \+ 2,78 \+ 0,37 \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^{1} Solamente período de exámenes de junio;
los sujetos en el período de exámenes de febrero no fueron
significativos
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|l|c|l|l|c|c|}\hline\multicolumn{3}{|c|}{}\+
Línea base \+ Final del \+ Cambio \+ significación
\\\multicolumn{3}{|c|}{}\+ \+ estudio \+ \+ de P cambio \\\hline
\+ Sujetos \+ n \+ media SE \+ media SE \+ media SE \+ \\\hline
Células CD56 ^{+} /mm ^{3} \+ todos \+ 127 \+ 314,70 \+ 301,89
\+ \+ \\\hline \+ Junio, control \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline \+
Febrero, control \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline \+ Total control \+ \+
354,63 \+ 302,66 \+ \+ <0,05
\\\hline\multicolumn{7}{|c|}{}\\\hline \+ Junio, tratamiento \+ \+
\+ \+ \+ \\\hline \+ Febrero, tratamiento \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline
\+ Total tratamiento \+ \+ 284,02 \+ 301,31 \+ \+ >0,05
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|c|}\hline
\+\multicolumn{2}{|c|}{Cambio a lo largo del estudio }\+
significación de la diferencia entre \\ \+\multicolumn{2}{|c|}{}\+
grupos de control y tratamiento \\\dddcline{1}{3} ¿UNIDADES? \+
Grupo de control \+ Grupo de tratamiento \+ \\ \+ media
\hfill SE \+ media \hfill SE \+ \\\hline
IgG \+ -72,90 \+ -49,91 \+ <0,1 \\\hline IgA \+ -2,59 \+
-11,93 \+ <0,1 \\\hline IgM \+ 0,29 \+ 1,49 \+ <0,1
\\\hline TNF \alpha \+ -141,24 \+ -38,59 \+ <0,1 \\\hline
IFN \gamma \+ 10.263,29 \+ 13.274,14 \+ <0,1 \\\hline
IL - 10 \+ 99,28 \+ 236,07 \+ <0,1 \\\hline
IL - 5 \+ 110,67 \+ 149,47 \+ <0,1 \\\hline
IL - 4 \+ 103,92 \+ 133,59 \+ <0,1 \\\hline
IL - 2 \+ 108,22 \+ 274,69 \+ <0,1
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|c|}\hline
\+\multicolumn{2}{|c|}{Cambio a lo largo del estudio }\+
Significación de diferencia \\\dddcline{1}{3} Unidades \+ Grupo de
control \+ Grupo de tratamiento \+ entre grupos de control y de
\\ \+ \+ \+ tratamiento \\ \+ media \hfill SE \+
media \hfill SE \+ \\\hline CD2 \+ 89,43 \+ 271,46 \+
<0,1 \\\hline CD3 \+ 130,78 \+ 196,66 \+ <0,1 \\\hline
CD4 \+ 146,70 \+ 382,34 \+ <0,1 \\\hline CD8 \+ -60,28 \+
254,06 \+ <0,1 \\\hline CD19 \+ 29,76 \+ 67,31 \+ <0,1
\\\hline Burst - Coli \+ 6,44 \+ 8,42 \+ <0,1
\\\hline Phage - Coli \+ 30,16 \+ 23,58 \+
<0,1
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Este estudio es el primero en demostrar la
modulación de la inmunosupresión provocada por el estrés
psicológico por el consumo de leche fermentada conteniendo L.
casei DN-114 001. Dos raciones de leche
fermentada cada día durante seis semanas incrementaron
significativamente el número de linfocitos en circulación y
mejoraron la reducción de células NK asociadas con el estrés de
exámenes académicos. La modulación nutricional del estado
inmunitario puede incrementar la resistencia a la enfermedad
asociada con estrés y con inmunosupresión consiguiente.
Por lo tanto, queda demostrado el efecto
modulador de la supresión inmunológica producido por leches
fermentadas que contienen Lactobacillus casei y, en
particular Lactobacillus casei DN-114
001.
Si bien los estudios llevados a cabo por el
inventor se han referido en particular a la bacteria láctica
Lactobacillus casei DN-114 001, se
comprenderá por los expertos en este campo que se pueden introducir
modificaciones y cambios que podrán quedar evidentes de la lectura
y estudio de la descripción anterior. Se deberá considerar que
dichas variaciones y cambios quedarán incluidas dentro del ámbito
de la presente invención siempre que estén comprendidas del modo
más amplio dentro de la definición de la invención de acuerdo con
las siguientes reivindicaciones.
Todo cuanto no afecte, altere, cambie o
modifique la esencia de los perfeccionamientos descritos, será
variable a los efectos de la presente invención.
Claims (2)
1. Mejoras en el objeto de la patente principal
nº 9901037 por: ``Nueva utilización de Lactobacillus casei
para la preparación de leches fermentadas para el tratamiento de
niveles inmunitarios deprimidos'', caracterizadas por la
utilización de bacterias lácticas Lactobacillus casei para
la preparación de leches fermentadas a utilizar en la modulación de
la supresión inmunológica asociada con estrés psicológico.
2. Mejoras en el objeto de la patente principal
n° 9901037 por: ``Nueva utilización de Lactobacillus casei
para la preparación de leches fermentadas para el tratamiento de
niveles inmunitarios deprimidos'', según la reivindicación 1,
caracterizadas por la utilización de la bacteria láctica
Lactobacillus casei DN-114 001 en la
preparación de leches fermentadas para la modulación de la
supresión inmunológica asociada con estrés psicológico.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES009901037A ES2155783B1 (es) | 1999-05-07 | 1999-05-07 | Nueva utilizacion de lactobacillus casei para la preparacion de leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios deprimidos. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2209660A1 true ES2209660A1 (es) | 2004-06-16 |
| ES2209660B1 ES2209660B1 (es) | 2005-04-01 |
Family
ID=8308411
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES009901037A Expired - Fee Related ES2155783B1 (es) | 1999-05-07 | 1999-05-07 | Nueva utilizacion de lactobacillus casei para la preparacion de leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios deprimidos. |
| ES200300009A Expired - Fee Related ES2209660B1 (es) | 1999-05-07 | 2002-12-12 | Mejoras en el objeto de la patente principal n.9901037 por: "nueva utilizacion de lactobacillus casei para la preparacion de leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios deprimidos". |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES009901037A Expired - Fee Related ES2155783B1 (es) | 1999-05-07 | 1999-05-07 | Nueva utilizacion de lactobacillus casei para la preparacion de leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios deprimidos. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (2) | ES2155783B1 (es) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998023727A1 (en) * | 1996-11-29 | 1998-06-04 | Bio K + International Inc. | Lactic ferment comprising a particular strain of lactobacillus acidophilus and use thereof |
| WO1999010476A1 (en) * | 1997-08-21 | 1999-03-04 | New Zealand Dairy Board | Immunity enhancing lactic acid bacteria |
-
1999
- 1999-05-07 ES ES009901037A patent/ES2155783B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-12-12 ES ES200300009A patent/ES2209660B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998023727A1 (en) * | 1996-11-29 | 1998-06-04 | Bio K + International Inc. | Lactic ferment comprising a particular strain of lactobacillus acidophilus and use thereof |
| WO1999010476A1 (en) * | 1997-08-21 | 1999-03-04 | New Zealand Dairy Board | Immunity enhancing lactic acid bacteria |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| OUWEHAND A C et al.: "The health effects of cultured milk products with viable and non-viable bacteria". INTERNATIONAL DAIRY JOURNAL, 8 (9), 749-758, 1998. Pagina 749, columna 1; pagina 751, columna 1. * |
| OUWEHAND A C et al.: "The health effects of cultured milk products with viable and non-viable bacteria". INTERNATIONAL DAIRY JOURNAL, 8 (9), 749-758, 1998. Página 749, columna 1; página 751, columna 1. * |
| PERDIGON G et al.: "PREVENTION OF GASTROINTESTINAL INFECTION USING IMMUNOBIOLOGICAL METHODS WITH MILK FERMENTED WITH LACTOBACILLUS CASEI AND LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS". JOURNAL DAIRY RESEARCH, CAMBRIDGE, GB, Vol. 57, 1990, paginas 255-264, XP000916913. Paginas 255-256. * |
| PERDIGON G et al.: "PREVENTION OF GASTROINTESTINAL INFECTION USING IMMUNOBIOLOGICAL METHODS WITH MILK FERMENTED WITH LACTOBACILLUS CASEI AND LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS". JOURNAL DAIRY RESEARCH, CAMBRIDGE, GB, Vol. 57, 1990, páginas 255-264, XP000916913. Páginas 255-256. * |
| PERDIGON G. et al.: Systemic and Local augmentation of the Immune Response in Mice-by feeding with milk fermented with Lactobacillus acidophilus and/or Lactobacillus casei". Foods, Nutrition and Immunity. Dyn Nut Res., Basel, Karger, 1992, Vol. 1, paginas 66-77. Paginas 66,67. * |
| PERDIGON G. et al.: Systemic and Local augmentation of the Immune Response in Mice-by feeding with milk fermented with Lactobacillus acidophilus and/or Lactobacillus casei". Foods, Nutrition and Immunity. Dyn Nut Res., Basel, Karger, 1992, Vol. 1, páginas 66-77. Páginas 66,67. * |
| SALJI J: "Acidophilus milk products: foods with a third dimension". FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY TODAY, 1992, 45, PURBECK CLOSE, BEDFORD MK41 9LX, UK, Vol. 6, nº 3, paginas 142-147, XP000952420. Pagina 146; tabla 2. * |
| SALJI J: "Acidophilus milk products: foods with a third dimension". FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY TODAY, 1992, 45, PURBECK CLOSE, BEDFORD MK41 9LX, UK, Vol. 6, nº 3, páginas 142-147, XP000952420. Página 146; tabla 2. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2155783A1 (es) | 2001-05-16 |
| ES2209660B1 (es) | 2005-04-01 |
| ES2155783B1 (es) | 2002-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Marcos et al. | The effect of milk fermented by yogurt cultures plus Lactobacillus casei DN-114001 on the immune response of subjects under academic examination stress | |
| Scharek et al. | Influence of a probiotic Enterococcus faecium strain on development of the immune system of sows and piglets | |
| Calder et al. | The immune system: a target for functional foods? | |
| Díaz‐Ropero et al. | Two Lactobacillus strains, isolated from breast milk, differently modulate the immune response | |
| Roessler et al. | The immune system in healthy adults and patients with atopic dermatitis seems to be affected differently by a probiotic intervention | |
| TWI418355B (zh) | 使用失活的益生菌（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）的方法及含彼之產物 | |
| DK3061458T3 (en) | OIL PRODUCT FOR IMPROVED BREAST MILK NUTRITION TO REDUCE THE RISK OF ALLERGY | |
| JP4740999B2 (ja) | 哺乳類における炎症を軽減するための乳酸菌の選択及び使用 | |
| Rozé et al. | An α-lactalbumin-enriched and symbiotic-supplemented v. a standard infant formula: a multicentre, double-blind, randomised trial | |
| Snel et al. | Strain‐specific immunomodulatory effects of Lactobacillus plantarum strains on birch‐pollen‐allergic subjects out of season | |
| Kopp et al. | Probiotics and prevention of allergic disease | |
| Halkjaer et al. | Effects of probiotics (Vivomixx®) in obese pregnant women and their newborn: study protocol for a randomized controlled trial | |
| KR20070052246A (ko) | 유아에서의 호흡기 감염증 및 급성 중이염의 예방 또는치료 방법 | |
| EP1915058B1 (en) | Use of specific lactic bacteria for the preparation of immunomodulating compositions | |
| Ozkan et al. | Effect of Saccharomyces boulardii in children with acute gastroenteritis and its relationship to the immune response | |
| ES2553177T3 (es) | Cepas de Lactobacillus plantarum como probióticos con efecto inmunomodulador especifico | |
| Saliganti et al. | Consumption of probiotic Lactobacillus rhamnosus (MTCC: 5897) containing fermented milk plays a key role in development of the immune system in newborn mice during the suckling–weaning transition | |
| Rigon et al. | Maternal factors pre-and during delivery contribute to gut microbiota shaping in newborns | |
| Piano et al. | Comparison of the kinetics of intestinal colonization by associating 5 probiotic bacteria assumed either in a microencapsulated or in a traditional, uncoated form | |
| RU2470994C2 (ru) | Применение lactobacillus casei для усиления защиты, индуцированной вакцинацией против гриппа | |
| ES2209660B1 (es) | Mejoras en el objeto de la patente principal n.9901037 por: "nueva utilizacion de lactobacillus casei para la preparacion de leches fermentadas para el tratamiento de niveles inmunitarios deprimidos". | |
| WO2011099875A1 (en) | Use of lactic acid bacteria to treat or prevent rhinitis | |
| Himaja et al. | Lactobacillus rhamnosus GG supplementation during critical windows of gestation influences immune phenotype in Swiss albino mice offspring | |
| Terahara et al. | Effects of the intake of non-live Bifidobacterium bifidum on the faecal IgA of full-term infants: A double-blind, randomised, placebo-controlled study | |
| Crane | Pro and anti: the biotics of allergic disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20040616 Kind code of ref document: A1 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20190613 |