ES2205031T3

ES2205031T3 - Mejoras introducidas en o relacionadas con agentes decontraste.

Info

Publication number: ES2205031T3
Application number: ES96916251T
Authority: ES
Inventors: Harald Dugstad; Jo Klaveness; Pal Rongved; Roald Skurtveit
Original assignee: Amersham Health AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: AU5907396A; EP0831926B1; ATE247490T1; DE69629566D1; JPH11506465A; EP0831926A1; CN1082380C; NZ309125A; WO1996040275A1; CN1190899A; GB9511488D0; DE69629566T2

Abstract

AGENTES DE CONTRASTE PARA DIAGNOSTICO QUE TIENEN MICROBURBUJAS DE GAS O UN GAS PRECURSOR ESTABILIZADO POR UNO O MAS LIPIDOS DE MEMBRANA RETICULADOS O POLIMERIZADOS EN LA PORCION HIDROFILICA DE ESTOS PUEDEN EXHIBIR ALTOS GRADOS DE ESTABILIDAD Y EFICACIA DE CONTRASTE.

Description

Mejoras introducidas en o relacionadas con agentes de contraste.

La presente invención se refiere a dispersiones acuosas de vesículas que contienen gas o precursor de gas, así como a agentes de contraste para su uso en la formación de imágenes para diagnóstico que se pueden obtener con ellas.

La solicitud de patente internacional publicada Nº WO 92/17212 describe agentes de contraste de ultrasonido que incluyen microburbujas de gas o precursor de gas encapsuladas mediante fracciones anfofílas de polímero o reticuladas no proteináceas. Las propiedades tensioactivas de los anfofílicos en dichos agentes de contraste estabilizan las microburbujas de gas, por ejemplo, reduciendo la tensión superficial en sus interfaces con el líquido circundante, v.g., un líquido de vehículo o un fluido corporal, por ejemplo, formando monocapas o multicapas, v.g., una o más bicapas, en dichas interfaces, al mismo tiempo que la unión química de los anfofilos genera mayor estabilidad.

La presente invención se refiere a dispersiones de vesícula y agentes de contraste que entran dentro de la descripción general de WO 92/17212 antes mencionada, pero que no se describen de manera específica en dicho documento, y se basa en el hallazgo de que dichas dispersiones de vesícula y agentes de contraste en los que las fracciones anfofílicas comprenden determinados lípidos de formación de membrana pueden presentar propiedades particularmente ventajosas.

Tal como se reconoce en la especialidad de los agentes tensioactivos, los lípidos de formación de membrana pueden presentar la característica de formar bicapas cristalinas líquidas en medios acuosos. Típicamente, su geometría molecular es tal que las porciones hidrófilas e hidrófobas tienen un tamaño comparable. Los lípidos de formación de membrana también incluyen anfófilos que forman monocapas o bicapas simples en interfaces gas-agua (v.g. como ocurre en las películas Langmuir-Blodget). Entre los lípidos de formación de membrana preferibles se incluyen lípidos como los que se encuentran en las membranas biológicas que se caracterizan por tener una baja hidrosolubilidad y la tendencia en soluciones acuosas a disminuir sustancialmente la tensión superficial, v.g., casi cero; dichos lípidos forman típicamente bicapas cristalinas líquidas o en estado gelficado a una baja concentración en medios acuosos.

Los autores de la invención han observado que las vesículas en las que las fracciones anfofilas incluyen uno o más lípidos dialcanoílfosfatidilserina, dialcanoílfosfatidilglicerol, dialcanoílfosfatidiletanolamina y/o dialcanoílfosfatidilinositol de formación de membrana presentan sorprendente una gran estabilidad. Los agentes de contraste obtenidos por reticulación o polimerización de al menos parte de dichas vesículas de lípidos de formación de membrana en la porción hidrofila de los lípidos puede presentar un marcado aumento de la eficacia de contraste, por ejemplo, tal como lo prueba la mejor escala de grises, la eficacia aromónica de Doppler y/o secundaria, en comparación con los agentes de contraste de ultrasonido que se describen de forma específica en WO 92/17212.

Por lo tanto, según uno de los aspectos de la presente invención, se proporciona una dispersión acuosa de vesículas que comprenden microburbujas de gas o precursor de gas estabilizadas mediante un material anfófilo no proteináceo que comprende uno o más lípidos de formación de membrana seleccionado entre dialcanoílfosfatidilserinas, dialcanoílfosfatidilgliceroles, dialcanoílfosfatidiletanolaminas y dialcanoílfosfatidilinositoles.

La invención proporciona también un agente de contraste para diagnóstico que comprende una dispersión de vesículas tal como se ha definido, que se puede inyectar y en el que dicho lípido o lípidos de formación de membrana están al menos parcialmente reticulados o polimerizados en las porciones hidrófilas del mismo.

En virtud del alto grado de estabilidad que pueden impartir los lípidos de formación de membrana antes definidos, puede ser posible incorporar otros componentes, v.g., agentes tensioactivos o co-agentes tensioactivos, en el material de lípidos de formación membrana estabilizante, incluso en un grado en el que el lípido de formación de membrana reticulado o polimerizado de los agentes de contraste de la invención represente un componente menor del material estabilizante, v.g. de encapsulación, mientras mantenga una estabilidad de producto adecuada. Puede ser similarmente posible emplear un bajo grado de reticulación o polimerización de los agentes de contraste con arreglo a la invención, por ejemplo, para mejorar la flexibilidad del material de encapsulación, que a su vez mejorará la densidad de imagen proporcionada por los agentes de contraste.

El término "reticulado" se utiliza aquí para referirse a una unión química de al menos dos moléculas de lípido de formación de membrana, v.g., para formar una estructura polimérica, e incluye sistemas preparados por reacción de los llamados agentes de reticulación cero. Los términos "polimerizado" y "estructura polimérica" incluyen sistemas de bajo peso molecular como por ejemplo dímeros y otros oligómeros. Los oligómeros, v.g., que contienen de 2 a 20 unidades de repetición, constituyen una categoría preferible de lípidos de formación de membrana con arreglo a la invención.

Los lípidos de formación de membrana útiles según la invención son dialcanoílfosfatidilserinas como, por ejemplo, dipalmitoíl- y diestearoíl-fosfatidilserinas y los dialcanoílfosfatidilgliceroles, dialcanoílfosfatidiletanolaminas y dialcanoílfosfatidilinositoles correspondientes.

Los productos de la invención pueden comprender una mezcla de lípidos de formación de membrana, v.g., para que las propiedades de formación de membrana sean superiores las de los componentes individuales. Las mezclas de lípidos de formación de membrana pueden incluir por ejemplo mezclas de dialcanoílfosfatidilserina y diacilfosfatidilcolina o de dialcanoílfosfatidilserina y ácido diacilfosfatídico. Otros componentes de dichas mezclas pueden incluir sustancias que modifican las propiedades de membrana tales como estabilidad, dispersibilidad, tendencia a la agregación, actividad biológica, flexibilidad o polaridad. Entre los aditivos representativos se incluyen esteroles como colesterol, sustancias que llevan grupos que modifican la superficie como, por ejemplo, fracciones de polietilen glicol, y fosfolípidos no reticulables y no polimerizables. Alternativamente, el lípido de formación de membrana puede ser sometido a un grado relativamente bajo de reticulación o polimerización de manera que el material de membrana de encapsulación del producto de agente de contraste incluya una proporción de lípido de formación de membrana sin reaccionar (v.g., monomérico).

Se puede emplear cualquier gas biocompatible en las dispersiones de vesícula y los agentes de contraste de la invención, por ejemplo, aire, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, óxido nitroso, dióxido de carbono, helio, argón, fluoruros de azufre, como por ejemplo hexafluoruro de azufre, decafluoruro de disulfuro y pentafluoruro de tirfluorometil sulfuro, hidrocarburos opcionalmente fluorados de bajo peso molecular (v.g., C_{1-6}), como metano, acetileno, tetrafluoruro de carbono y otros perfluoroalcanos como, por ejemplo, perfluoropropano, perfluorobutano y perfluoropentano y mezclas de ellos (v.g. tal como se describe en WO 95/03835). El término "gas", tal como se utiliza aquí incluye sustancias, incluyendo mezclas, en forma gaseosa o de vapor a 37ºC. En general, el gas puede estar libre dentro de las microburbujas o puede estar atrapado o incorporado en una sustancia de contención.

Cuando la membrana estabilizante tiene una permeabilidad baja, v.g., por tener un alto grado de reticulación o polimerización del lípido de formación de membrana, puede ser preferible utilizar un gas que tenga una solubilidad relativamente alta en agua y los fluidos corporales. Cuando se emplea una membrana más porosa, v.g., con un grado relativamente bajo de reticulación o polimerización del lípido de formación de membrana, puede ser preferible emplear un gas o mezcla de gases que tenga una baja solubilidad en agua, por ejemplo que incluya hexafluoruro de azufre, decafluoruro de disulfuro, freón o fluorocarburo, como por ejemplo perfluoroetano, perfluoropropano, perfluoropropileno, perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluorobut-2-eno, perfluorobuta-1,3-dieno, perflorobut-2-ina o perfluoropetano. En EP-A-0554213 y WO 93/05819 se describen otros gases con una baja solubilidad en agua.

Los precursores de gas incluyen carbonatos y bicarbonatos, v.g., bicarbonato sódico o amónico y ésteres de aminomalonato. En WO 94/21302 se describen otros precursores de gas potenciales. El término "precursor de gas" tal como se utiliza aquí también abarca sustancias como, por ejemplo, hidrocarburos volátiles que pueden estar encapsulados inicialmente o si no, estabilizados de otra forma, pero que después son parcialmente o completamente eliminados, v.g., por evaporación, liofilizado, para ser reemplazados por el gas.

Los agentes de contraste de la invención se pueden utilizar en diversas técnicas de formación de imagen para diagnóstico, incluyendo ultrasonido, RM y formación de imágenes por rayos X; su uso en la formación de imágenes por ultrasonido para diagnóstico y en la formación de imágenes de RM, v.g., como agentes de contraste de susceptibilidad, constituye uno de los rasgos preferibles de la invención.

Para aplicaciones de ultrasonido como, por ejemplo, ecocardiografía, con el fin de permitir el paso libre a través del sistema pulmonar y para conseguir resonancia con las frecuencias de imagen preferibles de aproximadamente 0,1-15 MHz, puede ser conveniente emplear microburbujas estabilizadas que tienen un tamaño medio de 0,1 a 10 \mum, v.g. 1-7 \mum. Sin embargo, pueden ser útiles burbujas sustancialmente más grandes, v.g., con tamaños medios de hasta 500 \mum, en otras aplicaciones, por ejemplo formación de imágenes gastrointestinales o exámenes del útero y las trompas de falopio.

Los agentes de contraste según la invención se pueden preparar a través de cualquier método conveniente, por ejemplo por formación de una dispersión acuosa de vesículas que incluyen gas, un precursor de gas o un líquido orgánico volátil estabilizado mediante un material anfófilo no proteináceo que comprende uno o más lípidos de formación de membrana tal como se han definido antes, reticulación o polimerización de al menos parte de dicho lípido o lípidos de formación de membrana en su porción hidrófila antes, durante o después de dicha formación de vesícula y, si es necesario, eliminación del contenido en gas o líquido de las vesículas e introducción de un contenido en gas deseable.

Se podrá apreciar que, en dicho proceso, será deseable que el líquido orgánico volátil empleado sea deseablemente al menos sustancialmente no miscible en agua y, posiblemente también que no sea disolvente para el lípido de formación de membrana. Entre los líquidos representativos se pueden incluir por ejemplo hidrocarburos halogenados como, por ejemplo freones.

La formación de vesículas puede llevarse a efecto por ejemplo agitando una solución acuosa del lípido de formación de membrana que puede estar presente inicialmente, si se desea, en forma al menos parcialmente reticulada o polimerizada, en presencia de un gas, precursor de gas o líquido orgánico apropiado, por ejemplo, por agitación o sonicación, como por ejemplo una solución en un recipiente cerrado que contenga también dicho gas y/o líquido orgánico con el fin de que se formen las vesículas con el intervalo de tamaño deseado. Preferiblemente, la solución acuosa se prepara utilizando agua desgasificada y puede contener si se desea otros componentes adicionales, tales como tampones, potenciadores de la viscosidad, etc. Cuando se emplea el gas en esta etapa del proceso, puede ser ventajosamente hexafluoruro de azufre, perfluoroalcano, como, por ejemplo, perfluorobutano, o cualquier otro gas o mezcla de gases con una baja solubilidad en agua similar para asegurar una persistencia adecuada de las microburbujas durante el tiempo que tarda en formarse el lípido de formación de membrana estabilizante y su reticulación y polimerización.

Otras técnicas de formación de vesículas que se pueden emplear incluyen homogeneización mecánica, v.g., utilizando un rotor-estator o un molino de coloide; microfluidización, en la que los chorros del coloide en dos fase forma una emulsión; extrusión, v.g., en la que se hace pasar una corriente en dos fases que comprende burbujas de gas grandes a través de aperturas como toberas o poros de un filtro (que tiene preferiblemente un tamaño único) para generar una emulsión que comprende burbujas más pequeñas; e inyección de gas, v.g., cuando se inyecta el gas en el líquido a través de aperturas como toberas o placas de vidrio microporoso.

A continuación, si es necesario, se pueden hacer reaccionar los lípidos de membrana con un agente de reticulación apropiado o reactivo activador de la polimerización que reaccione o promueva la reacción de los grupos funcionales presentes en las porciones hidrófilas de al menos un lípido de formación de membrana. Se podrá apreciar que los parámetros de la reacción, tal es como las cantidades de reactivos, el tiempo de reacción, la temperatura y el pH, la velocidad de agitación, la presencia y naturaleza de catalizadores, etc. se pueden ajustar según sea necesario para obtener el grado necesario de reticulación o polimerización. El grado de reticulación puede aumentarse si se desea mediante el uso v.g., de agentes de reticulación trifuncionales u otros agentes de reticulación polifuncionales.

La naturaleza precisa del agente de reticulación o reactivo de activación de polimerización dependerá claramente de la naturaleza del lípido de formación de membrana, en particular, de la naturaleza de las agrupaciones funcionales reactivas presentes. A modo de ejemplo, los grupos amino libres de una dialcanoílfosfatidilserina o dialcanoílfosfatidiletanolamina pueden reaccionar con dialdehídos como glutaraldehído. Los grupos amino libres y carboxilo de dialcanoílfosfatidilserina pueden polimerizarse para formar polímeros de amida por reacción con un activador de grupo carboxilo, como por ejemplo carbodiimida, ventajosamente una carbodiimida hidrosoluble como hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (dichos compuestos se pueden contemplar también como agentes de reticulación cero). Es posible condensar dos o más lípidos que contengan correspondientemente grupos funcionales apropiados. Los agentes de reticulación que pueden emplearse contendrán generalmente al menos dos grupos funcionales reactivos e incluyen por ejemplo, gem-dihaluros, ácido fosfórico y ácido sulfónico.

Podrá apreciarse que la estabilidad inherentemente alta de las vesículas estabilizadas con lípidos de formación de membrana de la invención es ventajosa para mantener su estructura vesicular en el transcurso de dichas reacciones de reticulación y polimerización. La estabilidad sorprendentemente alta de las vesículas permite su lavado o su purificación, pudiéndose almacenarlas durante períodos de tiempo apreciables antes de someterlas a reticulación o polimerización. Los tiempos de proceso, por lo tanto, no son críticos, pudiéndose interrumpir el proceso si se desea.

Una vez alcanzado el grado de reticulación o polimerización deseado, se pueden enfriar o eliminar los reactivos residuales, por ejemplo, eliminado la mezcla de reacción acuosa, v.g., mediante el uso de separación por gravedad o centrifugado. Las vesículas reticuladas o polimerizadas pueden lavarse según se desee, v.g., 2 a 5 veces; el agua de lavado, puede contener, si se desea, aditivos como agentes de reticulación de la ósmosis, tampones, crioprotectores, etc. Dichas etapas de lavado pueden mejorar las características de distribución de tamaño del producto a través de la eliminación de las microburbujas con un tamaño inferior (que tienen un efecto ecogénico mínimo) y las partículas cargadas con material no gaseoso.

Si se desea preparar un producto de agente de contraste seco, se puede secar la dispersión de vesícula lavada y extraer el material de núcleo líquido o gaseoso encapsulado, v.g., por liofilización, para dar un polvo seco que incluye cápsulas de pared delgada huecas que pueden almacenarse de forma indefinida, v.g., bajo una atmósfera de gas o mezcla de gases que se desea incorporar en el producto. El producto se puede reconstituir después por ejemplo, en agua libre de pirógenos esterilizada para inyección para dar una formulación de agente de contraste inyectable.

Si se desea, se puede esterilizar con calor el producto tanto antes como después de dicha etapa de secado.

Los ejemplos no limitativos que se exponen a continuación, servirán para ilustrar la invención

Ejemplos 1-8

Procedimiento general

Se disolvió 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) en una solución de 50 mg de propilen glicol/glicerol (3:10) en 1 ml de agua hasta una concentración final de 5 mg de fosfolípido /ml de solución. Se transfirieron porciones de 0,8 ml de esta solución de reserva a viales de 2 ml con tapones de rosca, tras lo cual se niveló el espacio de cabeza con gas perfluorobutano. Se agitaron vigorosamente los viales durante 45 segundos y se transfirieron a un rodillo de mesa durante aproximadamente 30 minutos. Se prepararon soluciones de reserva de agentes de reticulación/activadores de la polimerización disolviendo el reactivo en agua hasta una concentración en la que 0,1 ml de solución contenía 1 equivalente de glutaraldehído o 2 equivalentes de hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Se añadió la solución de reactivo con la ayuda de una pipeta al fondo de cada uno de los viales de una sola aplicación, tras lo cual se niveló el espacio de cabeza con gas perfluorobutano, y se transfirió el vial al rodillo de mesa y se pasó por él durante aproximadamente 3 horas. Se centrifugaron los viales durante 5 minutos a 2000 rpm a 20ºC, tras lo cual se eliminó el infranadante del fondo del vial mediante una jeringuilla y se sustituyó con un volumen equivalente de agua desgasificada. Se niveló el espacio de cabeza con gas perfluorobutano, y se continuó la aplicación de rodillo hasta que se obtuvo una dispersión homogénea. Se repitió dos veces el procedimiento de lavado.

Ejemplo 1

Se hizo reaccionar el fosfolípido con 0,1 ml de solución de glutaraldehído. Se caracterizó el producto por análisis de recuento Coulter (número y distribución de tamaño) y las medidas de ecogenicidad in vitro, y se observó que era estable a temperatura ambiente durante varios días.

Ejemplo 2

Se hizo reaccionar el fosfolípido con 0,1 ml de solución de EDC. Se caracterizó el producto por análisis de recuento de Coulter (número y distribución de tamaño) y las medidas de ecogenicidad in vitro, y se observó que era estable a temperatura ambiente durante varios días.

Ejemplo 3

Se lavó previamente el fosfolípido durante 30 minutos sobre el rodillo de mesa, tras lo cual se centrifugaron los viales durante 5 minutos a 2000 rpm a 20ºC, se separó el infranadante del fondo del vial mediante una jeringuilla y se sustituyó con un volumen equivalente de agua desgasificada. Se niveló el espacio de cabeza con gas perfluorobutano y se continuó la aplicación del rodillo hasta obtener una dispersión homogénea. A continuación, se hizo reaccionar este fosfolípido lavado previamente con 0,1 ml de solución de glutaraldehído. Se caracterizó el producto por análisis de recuento de Coulter (número y distribución de tamaño) y según las medidas de ecogenicidad in vitro y se observó que era estable a temperatura ambiente durante varios días.

Ejemplo 4

Se reaccionar fosfolípido lavado previamente como en el ejemplo 3 con 0,1 ml de solución EDC. Se caracterizó el producto por análisis de recuento de Coulter (número y distribución de tamaño) y según las medidas de ecogenicidad in vitro y se observó que era estable a temperatura ambiente durante varios días.

Ejemplo 5

Se hizo reaccionar el fosfolípido con 0,1 ml de solución de glutaraldehído. Se congeló la suspensión resultante y se liofilizó.

Ejemplo 6

Se hizo reaccionar el fosfolípido con 0,1 ml de solución EDC. Se congeló la solución resultante y se liofilizó.

Ejemplo 7

Se hizo reaccionar el fosfolípido con 0,1 ml de solución de glutaraldehído. En la etapa de lavado final, se sustituyó el infranadante por una solución al 20% de glucosa como crioprotector. Se congeló la suspensión resultante y se liofilizó.

Ejemplo 8

Se hizo reaccionar el fosfolípido con 0,1 ml de solución EDC. En la etapa de lavado final, se sustituyó el infranadante por una solución al 20% de glucosa como crioprotector. Se congeló la suspensión resultante y se liofilizó.

Ejemplo 9 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica)

Se agitó vigorosamente una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (5,0 mg) en agua destilada (1 ml) en un vial de 2 ml con un septo durante 15 segundos, se calentó a 60ºC durante 10 minutos y después se enfrió a 20ºC. Se añadió perfluoropentano (1,2 \mul) y se agitó vigorosamente el vial durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano de 2-4 \mum de tamaño tal como se determinó por microscopía óptica. Esta solución fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

b) Polimerización del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de EDC (0,1 mg en 3 gotas de agua) a una suspensión acuosa de (a) anterior. Se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, se inclinó aproximadamente 60º, durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica, fue 2-4 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

c) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (25%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa de (a) anterior. Se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60ºC, durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 2-4 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 10 Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica)

Se agitó vigorosamente una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (4,6 mg) en agua destilada (1 ml) en un vial de 2 ml con un septo durante 15 segundos, se calentó a 60ºC durante 10 minutos y después se enfrió a 20ºC. Se añadió perfluoropentano (2,4 \mul) y se agitó vigorosamente el vial durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire de 2-5 \mum de tamaño, según se determinó por microscopía ótica. La suspensión resultó estable durante varios días a temperatura ambiente. Se puede polimerizar el producto o reticular utilizando técnicas análogas a las del ejemplo 9(b) y (c).

Ejemplo 11 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica)

Se agitó vigorosamente una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (5,2 mg) en agua destilada (1 ml) en un vial de 2 ml con un septo durante 15 segundos, se calentó a 60ºC durante 10 minutos y después se enfrió a 20ºC. Se añadió perfluoropentano (5 mg) y se agitó el vial vigorosamente durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire 2 a 5 \mum de tamaño según se determinó por microscopía óptica. Esta suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

b) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (15%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa de (a) anterior. Se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 2-4 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 12 a) Microburbujas de perfluorobutano/perfluorohexano preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica)

Se agitó vigorosamente una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (5,0 mg) en agua destilada (1 ml) en un vial de 2 ml con un septo durante 15 segundos, se calentó a 60ºC durante 10 minutos y después se enfrió a 20ºC. Se evacuó el vial a 10 mm Hg durante 20 minutos para eliminar el aire, tras lo cual se niveló el espacio de cabeza con perfluorobutano. Se añadió perfluorohexano (1,4 \mul) y se agitó vigorosamente el vial durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluorobutano/perfluorohexano de 1-10 \mum de tamaño según se determinó por microscopía óptica. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

b) Polimerización del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de EDC (0,1 mg en 3 gotas de agua) a una suspensión acuosa de (a) anterior. Se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60ºC durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 2-4 \mum. La suspensión resultó estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 13 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica)

Se agitó vigorosamente una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (3,0 mg) y propilen glicol/glicerol (3:10, 46 mg) en agua destilada (1 ml) en un vial de 2 ml con un septo durante 1 minuto. Se añadió perfluoropentano (4,5 \mul y se agitó el vial vigorosamente durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire de 2-10 \mum de tamaño, según se determinó por microscopía óptica. Esta suspensión fue estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Polimerización del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de EDC (0,1 mg en 3 gotas de agua) a una suspensión acuosa de (a) anterior, y se agitó vigorosamente la mezcla resultante durante 5 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º, durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 1-8 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 14 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (2,5 mg) y 1,2-di-palmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (0,5 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió después perfluropentano (1,2 \mul) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire de 1-8 \mum de tamaño según se determinó por microscopía óptica. La suspensión fue estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (25%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa de (a) anterior y se agitó vigorosamente la mezcla durante 5 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º, durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 1-5 \mum. La suspensión resultó estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 15 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (4,5 mg) y 1,2-di-palmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (0,5 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió perfluoropentano (1,2 \mul y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire de tamaño 1-10 \mum según se determinó por microscopía óptica. La suspensión fue estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (25%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa de (a) anterior, y se agitó vigorosamente la mezcla durante 3 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 segundos a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 1-5 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

c) Polimerización del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de EDC (0,1 mg en 3 gotas de agua) a la suspensión acuosa de (a) anterior, y se agitó vigorosamente la mezcla durante 3 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 1-5 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 16 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (2,5 mg) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (0,7 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió perfluoropentano (5 mg) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire de tamaño 1-8 \mum, según se determinó por microscopía óptica. La suspensión fue estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Polimerización del fosfolípido

Ejemplo 1 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2_dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (2,5 mg) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (0,6 mg) y propilen glicol/glicerol (10, 40 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió perfluoropentano (1,4 \mul) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire del tamaño 1-10 \mum según se determinó por microscopía óptica. La suspensión fue estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (25%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa (a) anterior, y se agitó vigorosamente la mezcla durante 3 segundos. A continuación se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 1-5 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 18 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (4,5 mg) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1,0 mg) y propilen glicol/glicerol (3:10, 45 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió perfluoropentano (1,2 \mul) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire del tamaño 1-10 \mum según se determinó por microscopía óptica. La suspensión resultó estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (25%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa de (a) anterior y se agitó vigorosamente la mezcla durante 3 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes según se estimó por microscopía óptica fue 1-8 \mum. La suspensión resultó estable durante varios días a temperatura ambiente.

c) Polimerización del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de EDC (0,1 mg en 3 gotas de agua) a la suspensión acuosa de (a) anterior y se agitó vigorosamente la mezcla durante 3 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 1-5 \mum. La suspensión resultó estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 19 a) Microburbujas de perfluoropentano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (2,5 mg), 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (0,5 mg) y propilen glicol/glicerol (3:10, 40 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió perfluoropentano (2,5 \mul) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluoropentano/aire de 1-10 \mum de tamaño según se determinó por microscopía óptica. La suspensión resultó estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (25%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa de (a) anterior y se agitó vigorosamente la mezcla durante 5 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica, fue 1-7 \mum. La suspensión resultó estable durante varios días a temperatura ambiente.

c) Polimerización del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de EDC (0,1 mg en 3 gotas de agua) a la suspensión acuosa de (a) anterior) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 5 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 1-5 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 20 a) Microburbujas de perfluorohexano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (2,5 mg) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (0,5 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió perfluorohexano (1,4 \mul) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluorohexano/aire de 2-10 \mum de tamaño según se determinó por microscopía óptica. La suspensión fue estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Polimerización del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de EDC (0,1 mg en 3 gotas de agua) a la suspensión acuosa de (a) anterior y se agitó vigorosamente la mezcla durante 3 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica, fue 2-10 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 21 a) Microburbujas de perfluorohexano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (2,5 mg) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1,3 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió perfluorohexano (1,4 \mul) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluorohexano/aire de 2-10 \mum de tamaño según se determinó por microscopía óptica. La suspensión resultó estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (25%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa de (a) anterior, y se agitó vigorosamente la mezcla durante 3 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 2-10 \mum. La suspensión fue estable durante varios días a temperatura ambiente.

Ejemplo 22 a) Microburbujas de perfluorohexano/aire preparadas mediante el uso de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) y 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina

Se calentó una solución de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-(fosfo-L-serina) (sal sódica) (2,5 mg) y 1,2-di-palmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (0,6 mg) y propilen glicol/glicerol (3:10, 45 mg) en agua destilada (1 ml) a 80ºC durante 1 hora. Se añadió perfluorohexano (2,4 \mul) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 30 segundos para dar una suspensión de microburbujas de perfluorohexano/aire de 2-10 \mum de tamaño, según se determinó por microscopía óptica. Esta suspensión fue estable durante varias horas a temperatura ambiente.

b) Reticulación del fosfolípido

Se añadió una solución acuosa de glutaraldehído (25%, 16,5 mg) a la suspensión acuosa de (a) anterior y se agitó vigorosamente la mezcla durante 3 segundos. A continuación, se colocó el vial en un carrusel que giraba lentamente, inclinado aproximadamente 60º durante 20 horas a 20ºC. El tamaño de las microburbujas resultantes, según se estimó por microscopía óptica fue 2-10 \mum. La suspensión resultó estable durante varios días a temperatura ambiente.

Claims

1. Una dispersión acuosa de vesículas que comprenden microburbujas de gas o precursor de gas estabilizadas mediante un material anfofílico no proteináceo que comprende uno o más lípidos de formación de membrana seleccionados del grupo que consiste en dialcanoílfosfatidilserinas, dialcanoílfosfatidilgliceroles, dialcanoílfosfatidiletanolaminas y dialcanoílfosfatidilinositoles.

2. Una dispersión según la reivindicación 1, en la que dicho material anfofílico comprende una mezcla de una o más dialcanoílfosfatidilserinas con una o más diacilfosfatidilcolinas y/o ácidos diacilfosfatídicos.

3. Una dispersión según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2 en la que dicho material anfofílico incluye además un esterol.

4. Una dispersión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que dicho material anfofílico incluye además fracciones de polietilen glicol.

5. Una dispersión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye microburbujas de gas seleccionado entre aire, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, óxido nitroso, dióxido de carbono, helio, argón, fluoruros de azufre, opcionalmente, hidrocarburos de bajo peso molecular fluorados y mezclas de ellos.

6. Una dispersión según la reivindicación 5 que incluye microburbujas de hexafluoruro de azufre y/o uno o más hidrocarburos de bajo peso molecular perfluorados.

7. Una dispersión según la reivindicación 6 en la que dicho hidrocarburo de bajo peso molecular perfluorado es perfluoropropano, perfluorobutano o perfluoropentano.

8. Un agente de contraste de diagnóstico que incluye una dispersión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se puede inyectar y en la que el lípido o los lípidos de formación de membrana están al menos parcialmente reticulados o polimerizados en sus porciones hidrófilas.

9. Un agente de contraste según la reivindicación 8, en el que dicho lípido o lípidos de formación de membrana reticulado o polimerizado consiste en oligómeros que contienen de 2 a 20 unidades de repetición.

10. Uso de un agente de contraste según la reivindicación 8 ó 9 para la fabricación de un agente de formación de imagen para su uso en la captación de imágenes para diagnóstico.

11. Uso de un agente de contraste según la reivindicación 8 o la reivindicación 9 para la fabricación de un agente de formación de imagen para su uso en la captación de imágenes de ultrasonido para diagnóstico.

12. Uso de un agente de contraste según la reivindicación 8, o la reivindicación 9 para la fabricación de un agente de formación de imagen para su uso en la captación de imágenes para resonancia magnética.

13. Un método para generar imágenes mejoradas del organismo humano o animal no humano que consiste en la generación de una imagen por ultrasonido o resonancia magnética de al menos una parte de dicho organismo, al que se le ha administrado previamente un agente de contraste según las reivindicaciones 8 ó 9.

14. Un proceso para la preparación del agente de contraste según la reivindicación 8 que consiste en la formación de una suspensión acuosa de vesículas que incluyen gas, un precursor de gas, o un líquido orgánico volátil estabilizadas mediante un material anfóbilo no proteináceo que consiste en uno o más lípidos de formación de membrana seleccionados entre dialcanoílfosfatidilserinas, dialcanoílfosfatidilgliceroles, dialcanoílfosfatidil-dietanolaminas y dialcanoílfosfatidilinositoles, la reticulación o polimerización al menos parcial de dicho lípido o lípidos de formación de membrana en su porción hidrófila antes, durante o después de la formación de dicha vesícula, y si es necesario, la eliminación del contenido en gas o líquido de las vesículas y la introducción del contenido en gas deseado.

15. Un proceso según la reivindicación 14 en el que se forma una dispersión acuosa de las vesículas que comprenden un hidrocarburo halogenado volátil, azufre, hexafluoruro o un gas perfluoroalcano o mezcla de gases.

16. Un proceso según la reivindicación 14 o la reivindicación 15 en el que la dispersión de vesículas reticuladas o polimerizadas se liofiliza después.