ES2201167T3 - Soldadura para la reparacion de tejidos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA UNIR TEJIDO QUE CONSISTE EN ALINEAR Y UNIR BORDES DEL TEJIDO A UNIR APLICANDO UN SOLDADOR BIOLOGICO, BIODEGRADABLE O UNO DE SUS ANALOGOS, A TRAVES DE LOS BORDES Y EXPONER EL SOLDADOR A UNA FUENTE DE ENERGIA BAJO CONDICIONES QUE TRANSFIEREN ENERGIA A PARTIR DE LA FUENTE AL SOLDADOR PARA HACER QUE EL SOLDADOR UNA LA SUPERFICIE DEL TEJIDO ADYACENTE A LOS BORDES PARA PROPORCIONAR UNA SOLDADURA QUE MANTENGA UNIDOS LOS BORDES.

Description

Soldadura para la reparación de tejidos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para unir tejidos vivos, incluyendo venas, arterias, microvasos, tubos, nervios, tejidos de órganos y superficies biológicas, tales como: peritoneo, omento, fascia, espinilla, tejidos artificiales, y a productos farmacéuticos útiles en unir estos tejidos.

Fundamentos de la técnica

La unión de tejidos tales como: venas, arterias, microvasos, tubos, nervios, tejidos y superficies biológicas tales como el peritoneo y la piel, se ha llevado a cabo principalmente clínicamente, hasta la fecha, por suturación y microsuturación.

La microsuturación requiere considerable destreza y es un procedimiento que exige mucho tiempo. Con frecuencia, los tejidos que se han unido por microsuturación forman considerable tejido de cicatriz. Se pueden comprender mejor algunas de las dificultades que se encuentran con la microsuturación, considerando el ejemplo de volver a unir tejido nervioso periférico dañado.

Nervios periféricos

Las señales eléctricas que controlan los órganos del cuerpo y transmiten información de una parte a otra al sistema nervioso central (CNS) viajan a lo largo de nervios periféricos. La estructura de estos nervios periféricos es análoga a los cables de teléfono. En un cable de teléfono hay un recubrimiento externo, protector, fuerte, que protege todos los componentes internos. Los hilos de cobre con frecuencia están agrupados en tubos de aislamiento independientes que conducen a sistemas diferentes. Cada uno de los hilos de cobre internos es una línea única que puede transmitir electricidad en cualquier dirección y tiene un recubrimiento aislante a su alrededor de forma que no interfiera con las líneas próximas a él.

Un nervio periférico (Figura 1) tiene una membrana externa que consiste en tejido conjuntivo tal como colágeno. Esta membrana (epineurio) protege y soporta los haces de nervios independientes juntos. Los haces de nervios que yacen en el interior de esta membrana se denominan fascículos. Estos fascículos también tienen una membrana circundante a base de colágeno y su cometido es agrupar juntos axones nerviosos suministrando un área similar del cuerpo. En el interior de la membrana del fascículo los axones están rodeados por tejido conjuntivo suelto. Los axones son una larga extensión de un cuerpo celular que está contenido dentro del CNS en la columna vertebral o en el cerebro. Los axones sensoriales transmiten al CNS y los axones motores transmiten desde el CNS. El metabolismo nervioso está sustentado por el sistema vascular desde tanto el exterior del nervio como a lo largo del centro del nervio.

Los nervios periféricos pueden tener diámetros muy pequeños. Por ejemplo, el nervio mediano maduro en la muñeca tiene aproximadamente 1 cm de diámetro y contiene una media de cuarenta fascículos, cada uno de los cuales puede contener hasta 4.500 axones. Cuando se corta un nervio periférico, todos los axones distales a la herida cambian sus propiedades ya que se corta el flujo de axones del cuerpo celular. Incluso cuando se reconecta el nervio, estos axones continúan degenerando distalmente. Las células de Schwann que normalmente se envuelven alrededor de los axones como guía de aislamiento regenerando axones. Unir nervios tan precisamente como sea posible por alineamiento de los correspondientes fascículos permite que los axones se regeneren más eficazmente.

Se ha facilitado operar en los nervios usando equipo microquirúrgico de ampliación y especial. Es necesario que se efectúen reparaciones precisas al nivel fascicular asegurando que la regeneración sea a lo largo del haz correcto conduciendo al área original esos axones suministrados. La técnica actual de reparación de nervios periféricos usa microsuturación (Figura 2). Esta técnica requiere un cirujano especializado, totalmente entregado, ya que la microsuturación de uno solo de los muchos fascículos con tres o más microsuturas (usando digamos una aguja de 70 micrómetros de diámetro e hilo de 30 micrómetros) puede llevar tiempos de operación muy largos.

Actualmente la microsuturación se usa clínicamente donde están disponibles las técnicas. Desafortunadamente, hay relativamente pocos cirujanos que tengan la destreza de manipulación necesaria para operar a ampliación alta. Incluso una técnica de microsuturación razonable da como resultado largos tiempos de operación con daño añadido a los axones internos debido a que las suturas penetran la fina envoltura perineurial de aislamiento. El uso de suturas da como resultado algo de cicatrización de la reparación debido a reacción del cuerpo extraño. También hay evidencia que indica que, a la larga, la formación de tejido de cicatriz y la maduración de la cicatriz pueden conducir a deficiencia del nervio unido.

Se ha desarrollado trabajo sobre el uso de láseres sólo en la realización de uniones de nervios. Uno de los problemas de la soldadura por láser ha sido el hecho de que el tejido nervioso con aspecto de gel, intacto, de los axones, está realmente bajo presión dentro del fascículo. Cuando se corta el fascículo, este material se extruye. Esto puede conducir a que se forme la soldadura por láser directa sobre el tejido nervioso más bien que rodeando la membrana del fascículo, causando daño del nervio. Hasta la fecha, las soldaduras se han hecho típicamente usando láseres de infrarrojo tales como láseres de CO_{2} que cuentan con absorción de agua para transferencia de energía. La preparación de tejidos antes de la soldadura cuenta con la superposición de membranas nerviosas. Esto es difícil debido a la extrusión de axones de aspecto de gel y puede conducir así a la desnaturalización del material de axones nerviosos. El tejido afectado tiende a cicatrizar y el tejido fibroso que prolifera como resultado es un conductor de la electricidad más deficiente que el tejido nervioso. Las uniones formadas hasta la fecha, como se describieron en la técnica anterior, usando soldadura por láser, han carecido típicamente de resistencia. Estas uniones por láser solas tienden a fallar de forma que se ha usado la microsuturación además de soldadura para fortalecer estas uniones.

Para hacer frente a al menos algunas de las deficiencias de la soldadura por láser, se han usado diversas colas en la formación de las soldaduras. Estas colas fluidas, de baja concentración de proteínas, tienden a correr entre los extremos del nervio que se están uniendo, que puede dar como resultado daño del axoplasma del fascículo nervioso y también impedir la regeneración. También se aplican alrededor de la unión, que se suelda entonces circunferencialmente. Estas uniones muestran más tarde cicatrizado grueso, que causa estrechamiento del nervio. Por otra parte, las uniones tienden a ser débiles.

Las técnicas de soldadura disponibles hasta ahora también tienden a carecer de precisión. Los factores que influyen en la precisión de esta aproximación incluyen adversamente diferencias en: la consistencia de la cola usada; la abertura de la aguja u otro dispositivo usado para aplicar la cola; y la presión ejercida en la aplicación de la cola.

La patente WO-A-91/04073 describe soldadura de tejido por láser con soldaduras exaltadas de colorante y usa una solución viscosa de fibrinógeno para soldadura de tejido.

La patente WO-A-92/14513 describe material de carga para uso en soldadura de tejido, específicamente preparaciones de colágeno en agua que contienen de 0,5-10% de colágeno en peso.

Ninguna de estas dos publicaciones mencionadas resuelve los problemas identificados.

La presente invención proporciona composiciones de soldadura líquidas o sólidas (reivindicación 21), su uso (reivindicación 1) y sus métodos de preparación (reivindicación 15).

La soldadura de la invención es útil en un método para unir tejido que comprende:

alinear y confinar bordes del tejido que se ha de unir;

aplicar una soldadura, de un lado a otro de los bordes alineados y confinados; y

exponer la soldadura a una fuente de energía bajo condiciones que proporcionen una transferencia de energía desde la fuente a la soldadura para causar que la soldadura se una a la superficie de tejido adyacente a los bordes, proporcionando por lo tanto una soldadura que soporte los bordes juntos.

Además de causar que la soldadura se una a la proteína del tejido subyacente, la transferencia de energía puede afectar a la estructura de la soldadura misma conduciendo a la unión dentro de la soldadura y a una exaltación de la resistencia de la soldadura y por lo tanto la unión.

Típicamente se usan gotas de soldadura donde la soldadura sea una soldadura fluida, y se "pintan" de un lado a otro de los bordes.

También se puede proporcionar la soldadura como una tira sólida preformada.

La fuente de energía es típicamente un láser.

Se puede unir una variedad de tipos de tejido usando este método. El método es aplicable a anastomosis de tubos biológicos incluyendo: venas, arterias, vasos linfáticos, nervios, vaso eferente, trompas de Falopio, vías biliares, tubos del aparato digestivo, el uréter, la uretra, conductos lagrimales, bronquios y cualquier otro de tales tubos corporales así como para reparaciones de incisiones o desgarros de órganos biológicos tales como riñones, hígado o bazo, o de superficies biológicas tales como el peritoneo y la piel. Se entenderá, por lo tanto, que el método se puede usar en una variedad de situaciones de unión incluyendo la unión de anastomosis cilíndrica y el cierre de defectos lineales tales como incisiones.

Cuando la reparación de tejido sea con respecto a tejido nervioso u otros tubos de tejido donde se necesite proteger de daño los contenidos del tubo, es especialmente importante que la soldadura no se concentre sobre los bordes que se están uniendo puesto que esto puede dañar tejido extruido. Más bien, la soldadura se debería distribuir a lo largo de la superficie planar o tubular en que yace la discontinuidad.

Cuando el tejido a reparar sea esencialmente un tubo corporal hueco tal como un vaso sanguíneo, la reparación puede adicionalmente comprender la inserción de un cilindro hueco de paredes delgadas de soldadura, en el interior del tubo bajo reparación, de forma que el cilindro se extienda sobre las partes cortadas del tubo. Típicamente, al tiempo que se soporta el conjunto de tubo cortado y cilindro juntos, se dirige energía de la fuente de energía a través de la pared del tubo para unir el cilindro a los extremos del tubo. El cilindro puede incorporar un colorante, como se describirá de ahora en adelante, para atraer energía al cilindro para soldadura más eficaz. La reparación se completa por la aplicación de al menos una tira o gota de soldadura de un lado a otro de los bordes sobre la superficie externa y tratando la soldadura aplicada como se describió anteriormente.

Cuando la reparación sea con respecto a superficies de tejido tales como peritoneo, se entenderá que es menos importante evitar la concentración de soldadura sobre los bordes.

El método también se puede modificar para la reparación de otras discontinuidades en superficies de tejido tales como agujeros, que resultan de accidentes o de cirugía. En esta forma de la invención la soldadura se puede extender o precortar para conformar la forma del sitio a reparar, y puede que los bordes del sitio a reparar no necesiten que se alineen o confinen para la reparación a efectuar.

Una reparación de nervios típica usando el método de la invención es una en que los bordes son extremos de un fascículo de nervios periféricos cortados que se han de unir juntos o un extremo de un fascículo de nervios y el fascículo de material de injerto de nervios sustituto. Esta última situación es particularmente aplicable donde se requiere reparación de nervios pero una sección del nervio bajo reparación se ha dañado severamente o no está disponible, de forma que los extremos disponibles del fascículo están demasiado lejos uno de otro para que se unan directamente. La naturaleza real del daño sustentado por el nervio y si la reparación es una reparación primaria o secundaria, son factores que afectan a la recuperación pero en cualquier caso los bordes de los fascículos del nervio que se han de unir están cortados limpiamente en ángulos rectos previo a la unión.

La aplicación de la soldadura como una tira o tiras, con espacio en medio para coadaptación natural de las superficies mismas permite que se revascularice el nervio bajo reparación. La soldadura circunferencial, por comparación, puede presentar el procedimiento de curación natural del cuerpo y así reducir el acceso capilar sanguíneo necesario para el área de reparación. Las técnicas de soldadura por láser y suturación cuentan por último con que el cuerpo regenere tejido conjuntivo para soportar el nervio junto después de fallo de las conexiones bien de soldadura o de sutura y se reemplacen por el procedimiento de curación. Los autores presentes han mostrado en experimentos in vivo que se puede conseguir regeneración exitosa por los métodos de la presente invención sin restricción sobre el movimiento de tejido circundante después de la operación. En el caso de operación de reparación de nervios en pacientes humanos es rutina restringir inicialmente los movimientos de las uniones de los miembros operados para favorecer la reducción de tensión de un lado a otro del sitio de reparación.

Soldaduras biológicas, biodegradables, típicas, útiles en el método de la invención incluyen soldaduras de proteína.

Se prevé que otras biomoléculas que se encuentran en la naturaleza se puedan usar como alternativas. Se podían usar análogos adicionales de polipéptidos biodegradables, biológicos. Los análogos de polipéptidos biodegradables, biológicos, útiles en la invención incluyen polipéptidos sintéticos y otras moléculas capaces de formar una "cola" viscosa que no reaccione adversamente dentro del tejido que experimenta reparación.

La soldadura de proteína puede ser una composición de soldadura sólida o una fluida.

Las composiciones de soldadura de proteínas, fluidas, útiles en soldadura de tiras, típicamente comprenden entre 100 y 120% en masa de proteína en relación con agua. Preferiblemente, las soldaduras de proteína fluidas comprenden entre 100 y 110% en masa de proteína en relación con agua.

La tira de soldadura fluida tiene típicamente 50 a 200 \mum de espesor. Su longitud se selecciona para adaptar la unión a formar pero típicamente es del orden de 2 a 3 mm de longitud. Típicamente se pinta de un lado a otro de la unión.

Las composiciones de soldadura de proteínas, sólidas, útiles en soldadura de tiras, típicamente comprenden entre 120 y 230% en masa de proteína en relación con agua. Preferiblemente la tira comprende 170 a 230% en masa de proteína y más preferiblemente aproximadamente 210% en masa.

Se entenderá que proteínas diferentes tendrán diferentes grados de solubilidad en agua o soluciones apropiadas que, a su vez, afectarán la concentración óptima de proteína en la composición para diferentes soldaduras de proteína. Se pueden determinar intervalos apropiados para proteínas particulares en soldaduras tanto sólidas como fluidas, en base a las propiedades conocidas de las proteínas.

Típicamente, se proporciona la composición de soldadura de proteínas sólida como una tira preformada. Las tiras de soldadura sólidas son más fáciles de manipular que las soldaduras fluidas. Bajo las condiciones de humedad inherentes en cirugía las soldaduras fluidas pueden correr haciendo difícil que el láser desnaturalice la soldadura antes de que se haya extendido. Las tiras de soldadura sólida pueden tener una consistencia similar a pasta o más rígida. Típicamente se ponen de un lado a otro de la unión con microforceps. En una forma de la invención, se prevé que las tiras de soldadura sean sustancialmente rectangulares de forma. Sin embargo, se pueden requerir tiras de forma diferente en situaciones de reparación diferentes. También se puede desear proporcionar una pluralidad de tiras unidas juntas para reparación eficaz de un gran, o un sustancial, número de sitios de reparación.

La soldadura de proteínas puede comprender una proteína única de la que la albúmina es un ejemplo típico o alternativamente la soldadura puede comprender más de una proteína.

La albúmina presenta cualidades deseables para la formación de tiras de soldadura sólida puesto que tiene una alta proporción de estructura de hoja \beta, que da rigidez a las tiras. La fibrina es otro ejemplo de una proteína con estructura de hoja \beta significativa. La incorporación de proteína \alpha-helicoidal en la soldadura puede favorecer hacer las tiras más maleables y por lo tanto retener un perfil más liso que sea particularmente bien adecuado para unir extremos de nervios. Un ejemplo de una proporción adecuada de proteína \alpha-helicoidal está entre 1 y 10% en peso de la proteína usada. Aproximadamente 5% es una cantidad preferida. Colágeno, tropoelastina y elastina son ejemplos de proteínas \alpha-helicoidales adecuadas.

Se selecciona la proteína usada en la soldadura para minimizar el riesgo de reacciones del huésped adversas y por lo tanto debería ser preferiblemente una proteína autóloga para el huésped o una proteína extraña de baja antigenicidad.

Las proteínas se pueden obtener a partir de cualquier fuente adecuada. Se pueden usar proteínas producidas recombinantemente o sintéticamente así como proteínas que se encuentran en la naturaleza purificadas.

Preferiblemente, cuando se va a usar la soldadura con un láser que produce energía a una longitud de onda adecuada, la composición incluye una sustancia, tal como un colorante, que absorbe energía a la longitud de onda producida por el láser con que se va a usar la soldadura. Es preferible elegir la combinación tal que el colorante u otra sustancia absorba la energía transmitida por el láser eficazmente pero el tejido subyacente que se ha de unir absorba la energía transmitida deficientemente. El colorante u otra sustancia favorece hacer la soldadura específica a la soldadura usada que, a su vez, ayuda a minimizar el daño por calentamiento del tejido, accidental, al tejido subyacente.

El procedimiento de unión, donde se usan soldaduras de proteínas, cuenta con moléculas de proteína que están disponibles para reticulación. Esto ocurre cuando las moléculas de proteína están desdobladas. En la irradiación con láser de, por ejemplo, una soldadura que contiene albúmina y verde de indocianina en una unión de tejido nervioso, se calientan moléculas de albúmina a través de la transferencia de energía a partir de las moléculas de verde de indocianina, permitiendo que se desdoblen y se unan entre sí y a la superficie de tejido inmediata tal como la membrana de fascículos.

También pueden ser útiles colorantes que contrastan con los tejidos que se están reparando, en hacer más fácil de ver la soldadura. Un ejemplo de un colorante con esta propiedad es el verde de indocianina.

Cuando el láser usado es un láser de CO_{2}, un colorante no favorecerá la transferencia de energía, ya que la transferencia de energía es por absorción de agua.

La energía proporcionada por la fuente de energía debería ser suficiente para unir la soldadura, para formar la soldadura al tiempo que se minimiza el daño al tejido subyacente. La temperatura requerida para desnaturalizar una soldadura de proteínas es típicamente al menos 50ºC y puede superar 100ºC. Un intervalo preferido es 50º a 90ºC. Un intervalo particularmente preferido es 80º a 90ºC.

El tiempo de tratamiento para cada unión a efectuar puede variar dependiendo de factores tales como condiciones ambientales, altitud, y por supuesto la naturaleza del tejido que se ha de unir. La duración del tratamiento es típicamente corta. Un pase de 30 segundos por tratamiento con láser de una tira de 0,4 mg es un ejemplo del tiempo implicado, aunque se entenderá que se podían requerir tiempos de tratamiento más cortos o más largos. Se entenderá que la soldadura sólida lleva más tiempo para desnaturalizarse que la soldadura fluida.

En un segundo aspecto la presente invención proporciona una composición de soldadura de tejido de proteínas que comprende proteína soluble en agua y un disolvente que contiene agua adecuado para la proteína.

En un tercer aspecto la presente invención proporciona un kit para uso en unión de tejidos que comprende, en un envase preferiblemente estéril, una pluralidad de tiras de soldadura de tejido de proteínas y/o formas del segundo aspecto de la invención. Preferiblemente se incluye una pluralidad de longitudes de tira y/o tamaños de forma en el envase.

El kit preferiblemente incluye medios para manipulación estéril de las tiras. El kit también incluye preferiblemente medios para medir las tiras.

El kit también puede comprender una fuente de energía tal como un sistema de láser acoplado de fibra.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la estructura de un nervio periférico en forma esquemática.

La Figura 2 muestra la unión de un nervio periférico por técnicas de microsuturación de la técnica anterior.

Las Figuras 3 a) y b) muestran en forma esquemática unión de un fascículo de nervios con a) soldadura fluida y b) tiras sólidas.

La Figura 4 muestra el sitio de reparación de un nervio tibial de 0,3 mm de diámetro inmediatamente después de: a) soldadura de tira por láser de diodo, y b) microsuturación.

La Figura 5a muestra una soldadura de nervio tibial de rata por los métodos de soldadura por láser de la presente invención. La soldadura y la membrana se desnaturalizan pero no ha tenido lugar cambio significativo de los axones (Giemsa x100).

La Figura 5b muestra un nervio ciático de rata unido por microsuturación usando nilón 10-0. Tiene lugar daño perineural y axonal localizado.

La Figura 6 muestra en forma esquemática la unión de un vaso sanguíneo usando cilindro de soldadura sólida, biodegradable, interno y tiras de soldadura sólida externas.

La Figura 7 muestra en forma esquemática un corte transversal de un fascículo de nervios reparado.

La Figura 8 muestra el método usado para medir la resistencia a la tracción de nervios reparados.

La Figura 9 muestra una tira de soldadura sólida posicionada sobre un nervio tibial de rata cortado justo previo a la soldadura por láser.

La Figura 10a muestra regeneración de axones mielinados en una reparación de nervios por láser que se ha regenerado durante 3 meses.

La Figura 10b muestra tejido fibroso alrededor de una sutura en un nervio suturado que se ha regenerado durante 3 meses.

La Figura 11 muestra resultados de potencial de acción muscular por nervios reparados.

Método mejor de llevar a cabo la invención

La reparación de tejido se lleva a cabo usando un láser para activar una soldadura de proteínas aplicada de un lado a otro de los bordes del tejido que se ha de unir. Esta soldadura se desnaturaliza en irradiación con láser y se une consigo misma y la membrana inmediata para formar la unión. El procedimiento se muestra esquemáticamente en las Figuras 3 y 7 para una reparación de un fascículo de nervios. La soldadura se aplica en tiras longitudinales de un lado a otro de la unión.

Reparación de nervios

La reparación de tejidos nerviosos cortados se lleva a cabo por la colocación de soldadura de un lado a otro de los bordes cortados y exposición de la soldadura a láser como se describió anteriormente. Para reparar tejido nervioso sin daño a los contenidos del nervio es deseable evitar concentrar la soldadura sobre los bordes, ya que se pueden dañar los contenidos del nervio extruido. Más bien la soldadura se debería distribuir de un lado a otro de la superficie planar o tubular en que yace la discontinuidad.

Reparación de tubo corporal hueco

Cuando se reparan tubos corporales huecos es preferible insertar un cilindro interno de soldadura en el tubo, de forma que yazca en medio la discontinuidad. Los extremos cortados del tubo se colocan sobre extremos opuestos del cilindro de soldadura. La disposición se muestra en la Figura 6. Se puede llevar a cabo entonces el tratamiento con láser para causar la unión del cilindro al tubo que se está uniendo al tiempo que se soporta la disposición en el lugar. Si hay un buen ajuste entre el tubo y el cilindro puede que no se requiera esta etapa de láser. La unión se completa por la adición de soldadura externa como para reparaciones de nervios.

Reparaciones de superficie de tejido

Las superficies tales como peritoneo, son planos de tejido en que se pueden conseguir uniones sin suturas por la aplicación de soldadura de un lado a otro de las discontinuidades que se han de unir y soldar como se describió anteriormente. En este caso es menos importante evitar concentración de soldadura sobre los bordes.

Sistema láser y soldadura adecuado para reparación fasicular de nervios

Para desnaturalizar la soldadura de proteínas, se usa un diodo láser GaAs/GaA1As con una potencia nominal de 250 mW (Spectra Diode Labs, San Jose, California). La luz del láser se acopla en una fibra óptica con núcleo de 100 \mum de diámetro que se soporta manualmente en un soporte de fibra. El diodo se hace funcionar en modo continuo a 75 mW durante la soldadura por láser. Debido a que este láser es Clase 3b, y no es seguro para los ojos, se deben llevar gafas protectoras en todo momento cuando se usa este láser.

Una soldadura de proteínas adecuada es una mezcla de agua, albúmina y colorante (ICG) verde de indocianina (Becton Dickinson, Missouri). El verde de indocianina tiene un coeficiente de absorción máxima a una longitud de onda de 805 nm de 2 x 10^{5} M^{-1} cm^{-1}. Los porcentajes de albúmina y colorante comparados con el agua fueron 110% y 0,6% respectivamente para soldadura fluida. Se usó 210% de albumen en la preparación de tiras de soldadura. Es de notar que el colorante ICG parece unirse preferentemente con la albúmina asegurando que se transfiera eficazmente el calor para desnaturalizar la soldadura de proteína.

Técnica de soldadura por láser

Cuando se lleva a cabo la cirugía, es preferible un microscopio quirúrgico o alguna forma de ampliación. Para una reparación de soldadura por láser de una unión tubular se coloca una porción de material de gasa fina bajo la unión para favorecer una técnica de rotación. Los bordes de tejido se preparan de acuerdo con técnicas estándar para el tipo de tejido y geometría de la reparación.

Usando microforceps, los bordes se alinean y se cosen juntos. Se "pinta" una tira de 2 mm de largo, de soldadura fluida, longitudinalmente de un lado a otro de la unión de los bordes usando una aguja de calibre 30 recubierta recientemente en la soldadura. Alternativamente se pone una soldadura de tira de un lado a otro de la unión usando microforceps. El método de reparación de tiras sólidas es más simple. Se soporta una tira sólida en microforceps especiales y se coloca de un lado a otro de la unión paralela a la longitud de las estructuras que se han de unir. La salida del láser se dirige después a la tira sólida y la soldadura sólida cambia de color indicando desnaturalización, que causa que se adhiera a la membrana de tejido subyacente. El procedimiento se repite con tiras adicionales para asegurar una unión fuerte de superficie.

Se usa después la salida del láser de diodo a partir de fibra óptica de 100 \mum, en un pase continuo de 30 segundos para desnaturalizar soldadura sólida en una soldadura de tira. A una potencia de salida del diodo de 75 mW, la tira de soldadura sólida se vuelve parda en la superficie y opaca debajo a partir del pase único, indicando desnaturalización. Cuando se usa soldadura fluida tiene lugar desnaturalización más rápidamente. Un pase de láser de dos segundos puede ser suficiente para desnaturalizar la soldadura fluida. Normalmente se aplica una segunda capa de soldadura fluida a la tira para aumentar la resistencia de la soldadura y se repite el pase de láser de dos segundos. Después se usa la gasa bajo la unión con los microforceps para rotar la unión de forma que se puedan aplicar otras tiras.

Preparación de soldadura de proteína fluida Composición

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Albúmina (polvo de fracción V de Sigma, St. Louis, Missouri) al menos 100% a 110% en peso comparado con agua.

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Verde de indocianina (Becton Dickinson, Missouri) aproximadamente 0,6% en peso comparado con agua.

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Agua (grado inyección)

Procedimiento: Se preparó una solución de ICG en agua en un minitubo. Se añadió la albúmina al tubo. Se mezclaron la albúmina y la solución usando un mezclador vórtex. Esto causa que la estructura de la proteína cambie conduciendo a la unión de moléculas de proteína unas con otras más bien que a moléculas de agua.

Preparación de soldadura de proteína sólida Composición

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Albúmina (polvo de fracción V de Sigma, St. Louis, Missouri) 210% en peso comparado con agua.

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Verde de indocianina (Becton Dickinson, Missouri) aproximadamente 0,6% en peso comparado con agua.

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Agua (grado inyección)

Procedimiento: El ICG se disolvió en el agua y se añadió la albúmina a esta solución en un minitubo. Esta combinación se mezcló usando un mezclador vórtex y una aguja. La combinación se mezcló (durante aproximadamente 3 minutos) hasta que se hizo una pasta verde, maleable, homogénea. La fase de la mezcla cambió bajo esta técnica de mezclado para proporcionar una composición casi sólida, con proteína principalmente para uniones de proteína más bien que proteína para uniones de agua. El sistema no fue una solución más tiempo en esta fase. La pasta de proteína fue maleable y se podía cortar en tiras durante hasta aproximadamente 30 minutos después del mezclado.

Al cabo de este tiempo la pasta se endureció debido a deshidratación y se hizo demasiado dura para cortarse.

Las tiras resultantes tenían entre 50 y 100 \mum de espesor, aproximadamente 0,6 mm de ancho y 1,5 a 3,5 mm de largo. Se entenderá que donde se usan las tiras en componer fascículos de nervios, el ancho y la longitud deseados se dictan por las dimensiones de los fascículos. El ancho, espesor y longitud mencionados aquí son los adecuados para uso con un nervio tibial de rata que tiene un diámetro de 0,2 a 0,8 mm. La relación de ancho de tira a circunferencia de nervio es típicamente:

Ancho \sim 1/5 circunferencia

Ejemplo 1

Se ha usado un láser de diodo de 75 mW acoplado con fibra óptica de núcleo de 100 \mum funcionando a una longitud de onda de 800 nm, junto con una soldadura de proteína para hacer tiras nervios tibiales de rata cortados de soldadura, reduciendo el largo tiempo de operación requerido para la reparación de nervios microquirúrgica. Se produce soldadura por desnaturalización con láser selectiva de la soldadura a base de proteína que contiene el colorante verde de indocianina. El tiempo de operación para soldadura por láser fue 10 +/- 5 min. (n=24) comparado con 23 +/- 9 min (n=13) para microsuturación. La técnica de soldadura por láser dió como resultado soldaduras de patente con una resistencia a la tracción de 15 +/- 5 g, al tiempo que los nervios microsuturados tenían una resistencia a la tracción de 40 +/- 10 g. La histología patológica de los nervios soldados por láser, conducida inmediatamente después de cirugía, indicó adhesión de la soldadura a la membrana externa, con daño mínimo a los axones internos de los nervios. Un estudio in vivo, con un total de cincuenta y siete ratas wistar macho adultas, comparó nervios tibiales reparados por soldadura por láser con reparación por microsutura convencional. Se caracterizaron veinticuatro nervios soldados por láser y trece nervios suturados a tres meses y mostraron regeneración exitosa con Potencial de Acciones Musculares Compuestas medias (CMAP) de 2,4 +/- 0,7 mV y 2,7 +/- 0,8 mV, respectivamente. La histología patológica del estudio in vivo, confirmó la regeneración comparable de axones en nervios operados con láser y sutura. Se presenta una técnica anastomótica a base de láser más rápida, menos dañina y de mayor duración.

Materiales y métodos 1. Animales

Se usó un total de cincuenta y siete ratas Wistar macho, adultas, jóvenes, pesando entre 400 y 550 g al principio, en este estudio. Treinta y cuatro ratas recibieron reparación de soldadura por láser y las veintitrés restantes recibieron reparación por microsutura estándar, como se detalla a continuación. Se usaron cinco ratas de cada método de reparación para mediciones de resistencia a la tracción y microscopía óptica inmediatamente después de cirugía y se sometieron las treinta y siete ratas restantes a un estudio de recuperación funcional usando electrofisiología e histología patológica.

2. Sistema de soldadura por láser

Para desnaturalizar la soldadura de proteína, se usó un diodo láser GaAs/GaA1As con una potencia nominal de 250 mW (Spectra Diode Labs, San José, California). La luz del láser se acopló en una fibra óptica de núcleo de 100 \mum de diámetro que se soportó manualmente en un soporte de fibra. El láser de diodo se montó sobre un disipador de calor y la corriente y temperatura del diodo se controlaron por un diodo conductor SDL-800. El diodo se hizo funcionar en modo continuo a 75 mW durante el soldado por láser, correspondiendo a una densidad de potencia máxima de 955 W/cm en el tejido. La potencia de salida del láser se midió con un medidor de corriente Scientech (Boulder, Colorado). Debido a que este láser es Clase 3b, y no es seguro para los ojos, se llevaron puestas gafas protectoras todo el tiempo cuando se usaba este láser.

La soldadura usada en este estudio fue una mezcla de proteínas a base de albúmina, que también contenía colorante (ICG) verde de indocianina (Becton Dickinson, Missouri). El verde de indocianina tiene un coeficiente de absorción máxima a una longitud de onda de 805 nm de 2 x 10^{5} M^{-1} cm^{-1}. Es de notar que este colorante parece unirse preferencialmente con las proteínas asegurando que se transfiere eficazmente calor para desnaturalizar la soldadura de proteínas.

3. Cirugía

Se mantuvo anestesia durante la cirugía usando una mezcla que contenía fluotano (4% durante inducción, 2% después) en O_{2} (1l/min). Usando un microscopio quirúrgico OPMI 7 (Zeiss, Alemania Oeste) se expuso el nervio ciático de la pierna izquierda en la escotadura ciática de forma que se pudieran distinguir las ramas del nervio. Se expuso la rama tibial, justo por debajo de la escotadura ciática, a partir del tejido subcutáneo circundante durante una longitud de 1 cm. Para una reparación de soldadura por láser, se colocó una porción de material de gasa delgada bajo el nervio tibial para favorecer la rotación del nervio, y para la reparación de sutura, se colocó una porción de plástico bajo el nervio para permitir suturación más fácil. El nervio tibial se cortó después con microtijeras dentadas y se dejó durante 3 minutos para que tuviera lugar la extrusión normal de axoplasma. Este después se cortó con las microtijeras dentadas como se requería, después de lo cual se reparó el nervio con, bien cuatro tiras de soldadura por láser o cuatro suturas perineuriales 10-0.

El método de soldadura por láser implicaba alinear ambos muñones del nervio cortado con microforceps, después se "pintó" una tira de 2 mm de largo de soldadura, longitudinalmente, de un lado a otro de la unión de los extremos cortados usando una aguja de calibre 30 recubierta recientemente en la soldadura (Figura 3a). Se usó entonces la salida del láser de diodo a partir de la fibra óptica de 100 \mum, en un pase de dos segundos continuo, para desnaturalizar la soldadura en una soldadura de tira. A una potencia de salida del diodo de 75 mW, se observó que la soldadura se volvía parda en la superficie y opaca debajo a partir del único pase, indicando desnaturalización. Se aplicó una segunda capa de soldadura a la tira y se repitió el pase de láser de dos segundos. Después se usó la gasa bajo el nervio con los microforceps para rotar el nervio de forma que se podían aplicar otras tres tiras de dos capas, cada una aproximadamente 90º separadamente.

Se operaron siete ratas con una versión más avanzada de la soldadura orgánica, que aún era una mezcla de proteínas a base de albúmina pero tenía la ventaja de deshidratarse y cortarse en tiras rectangulares sólidas (Figura 9). El área superficial media de las tiras de soldadura fue 1,5 +/- 0,5 mm^{2} y el espesor fue 0,15 +/- 0,01 mm. Se colocaron cuatro tiras a lo largo del nervio anastomizado tibial y después se irradió con el mismo procedimiento adoptado para la soldadura fluida. La tira sólida se fusionó con el perineurio del nervio tibial por la radiación láser, uniendo las extremidades del nervio seccionado.

Para toda la operación se registró el tiempo de anastomosis y se tomó un registro fotográfico para referencia posterior. Los animales se pusieron en sus jaulas sin restricción de movimiento durante 3 meses.

4. Medición inmediata de resistencia a la tracción e histología patológica

En diez de las ratas operadas, se recogió la porción de 1 cm de largo de los nervios reparados por láser y sutura, inmediatamente, para mediciones de resistencia a la tracción. Se ató seda fina a cada extremo del nervio tibial. Un extremo se unió después a un transductor de fuerza calibrado (FT30C, Grass Instruments, Quincy, Mass) y el otro a un traductor conducido por tornillos (Figura 8). A medida que se giraba el tornillo el traductor estiraría el nervio de una forma lenta y firme. Se observó la tensión aplicada en un osciloscopio conectado a la salida del transductor de fuerza. Se aplicó tensión hasta que se cortó el nervio, y se registró la fuerza de rotura. Los nervios se mantuvieron húmedos, ya que en el secado, se puede aumentar la resistencia a la tracción.

Para microscopía óptica se fijó el sitio de anastomosis de los nervios tibiales, en formalina al 5%, alcohol deshidratado, embebido en parafina, seccionado longitudinalmente y marcado con, bien tricromo de Masson o Giemsa.

5. Valoración funcional: histología patológica y electrofisiología

Tres meses después de la operación se reanestesiaron las ratas usando el método descrito en la sección 3. Se expuso el sitio y se observó la anastomosis del nervio tibial. Después se cortaron las otras dos ramas del nervio ciático, los nervios peroneal y sural, de forma que sólo la rama del nervio tibial del nervio ciático pudiera conducir estimulación eléctrica del nervio ciático a los músculos del pie trasero. Dos días más tarde se colocaron las ratas sobre su lado y se aislaron de la mesa por un vendaje quirúrgico plegado. Se usó una lámpara de infrarrojos para mantener su temperatura rectal por encima de 36ºC.

Se usó un electromiográfo clínico (Cadwell Sierra EMG/EP) para estimulación y registro. Se pusieron dos electrodos de estimulación de calibre 25 a 10 mm separadamente en cada lado del nervio ciático por encima de la escotadura ciática, cerca de la cadera. El nervio se activó usando pulsos rectangulares (0,1 a 0,3 ms; 0 a 30 mA; 1 Hz). Se registraron los potenciales de acción muscular compuesta (CMAPs) a partir de los músculos plantares del pie en respuesta a estimulación supramaximal del nervio ciático. Se usó una serie de tres electrodos de registro. Se insertó un electrodo de masa de calibre 25 subcutáneamente entre los electrodos^{1, 2} de estimulación y de registro. Se insertó un electrodo de referencia de calibre 30 en la zona terminal del talón y se insertó un electrodo de registro de calibre 30 en los músculos plantares del pie. Se registraron y se procesaron los CMAPs para determinar su valor de pico de onda negativo.

Se llevó a cabo histología patológica de los nervios suturados y soldados por láser, después del ensayo electrofisiológico con el mismo procedimiento que se adoptó en la sección 4.

Resultados

A la terminación de la cirugía todas las anastomosis fueron un éxito. Se encontró que el procedimiento de operación fue más fácil por soldado por láser que por microsuturación. Esto dio como resultado tiempos de operación más cortos para reparaciones de soldadura por láser {10 \pm 5 min (n=24)} que {23 \pm 9 min (n=13)} para reparaciones por microsutura. La resistencia a la tracción de cinco nervios reparados por soldadura por láser, inmediatamente después de la operación, fue 15 \pm 5 g y la resistencia a la tracción de los nervios microsuturados, 40 \pm 10 g.

El examen histopatológico de los sitios de anastomosis inmediatamente después de cirugía demostraron que la soldadura por láser a base de albúmina y colorante ICG se unía bien con la membrana externa del nervio, el perineurio, al tiempo que los axones internos permanecían sin calentarse. En la Figura 10a, se muestra en corte una soldadura de fascículo de nervios tibiales producida por la soldadura por láser de diodo y albúmina/colorante ICG. Tanto la soldadura de proteínas como el perineurio se habían desnaturalizado formando el enlace. En el lado inferior del enlace, el axoplasma tenía su estructura ondulada normal. Obsérvese que puesto que el calentamiento se concentró en el colorante, sólo tuvo lugar desnaturalización de la soldadura y el perineurio adyacente.

Uno de los aspectos prometedores de la anastomosis con láser es el potencial para daño reducido al axoplasma por eliminación de la necesidad de suturas. En la Figura 5b se muestra un corte que muestra el efecto de microsuturar fascículos de nervios usando nilón 10-0. Este corte marcado con Giemsa, indica extrusión de axones en la unión, así como daño perineurial y axonal localizado debido a la sutura.

La histología patológica a 3 meses mostró regeneración de axones mielinados en reparaciones de nervios por láser (Figura 10a), sin discontinuidad de, bien las fibras y sus envolturas o el perineurio fibroso. No se vio evidencia de inflamación o fagocitosis de mielina. Se había conseguido restauración completa, como se evaluó por microscopía óptica, de la integridad histológica del nervio tibial por la soldadura por láser.

Los nervios suturados también mostraron anastomosis exitosa con regeneración de axones mielinados, sin embargo, era aún evidente que el hilo de nilón estaba rodeado por tejido fibroso, que creaba un obstáculo a la direccionalidad de los axones regenerados (Figura 10b).

Las mediciones electrofisiológicas del estudio in vivo se realizaron sobre veinticuatro ratas reparadas por soldadura por láser y trece ratas reparadas por microsutura con tres meses de recuperación. De este grupo todas las veinticuatro anastomosis de soldadura por láser eran patentes así como lo eran las trece anastomosis de microsutura. La amplitud media de los potenciales de acción muscular resultantes de estimulación supramaximal del nervio por encima del sitio de reparación fue 2,4 +/- 0,7 mV para los veinticuatro nervios tibiales soldados por láser y 2,7 +/- 0,8 mV para los trece nervios microsuturados. Se registró el potencial de acción muscular normal producido por estimulación del nervio tibial supramaximalmente, a 8,7 \pm 3 mV a partir de diez ratas (Figura 11).

Discusión

Clínicamente, cuando se corta un nervio periférico principal, cuarenta o más fascículos pueden necesitar que se vuelvan a unir individualmente. Con tres o cuatro microsuturas por fascículo, la suturación tiende a prolongarse, ya que debe ser meticulosa. En un injerto de nervio, donde se necesitan dos anastomosis, el tiempo de suturación se dobla. Hemos buscado un método adecuado de anastomosis de nervios que pueda al menos duplicar el resultado final pero fue significativamente más rápido que la presente técnica de microsutura cosida a mano. Un plus del método de soldadura por láser descrito fue la falta demostrada de cambio en los componentes axonales por debajo de la capa perineurial desnaturalizada vista inmediatamente después de la cirugía. Tres meses más tarde se demostró regeneración comparable por estudios de conducción nerviosa electrofisiológicos.

Aplicabilidad industrial

La presente invención tiene aplicación en el campo de la cirugía donde es de aplicación en unir juntos bordes de tejido, en aplicaciones de extremo a extremo, lado a extremo y lado a lado.

Referencias

1) R. Malik, S. Ho y D.B. Church: A new method for recording and analysing evoked motor potential from dogs. Journal of Small Animal Practice (1989) 30, 13-19.

2) R. Malik, S. Ho: Motor nerve conduction parameters in the cat. Journal of Small Animal Practice (1989) 30, 396-400.

3) Laser activated protein bands for peripheral nerve repair. A Lauto, R Trickett, R Malik, J Dawes, E Owen. Semana Óptica Biomédica Europea -BIOS Europe 195. Septiembre 12-16, 1995 (Acta en Prensa).

Claims (33)

1. Uso de, bien 100-120 partes en peso de proteína soluble en agua por cada 100 partes en peso de agua en un disolvente que contiene agua, en la fabricación de una soldadura biológica, biodegradable, fluida, para unir tejido, o 120-230 partes en peso de proteína soluble en agua por cada 100 partes en peso de agua en un disolvente que contiene agua en la fabricación de una soldadura biológica, sustancialmente sólida, para unir tejido.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido es tejido nervioso.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido que se han de unir es una anastomosis de un tubo biológico incluyendo: venas, arterias, vasos linfáticos, vaso eferente, trompas de Falopio, vías biliares, tubos del aparato digestivo, el uréter, la uretra, conductos lagrimales o bronquios.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido que se han de unir es una reparación de una incisión o desgarro de un órgano biológico incluyendo riñones, hígado o bazo, o de una superficie biológica tal como el peritoneo o la piel.

5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la soldadura incorpora una sustancia que absorbe energía a partir de una fuente de energía altamente comparable con la absorción de la energía por el tejido.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la sustancia es un colorante.

7. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, en el que la fuente de energía es un láser.

8. Uso, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de 100-120 partes en peso de proteína por cada 100 partes en peso de disolvente.

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de 120-230 partes en peso de proteína por cada 100 partes en peso de disolvente.

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el disolvente es agua.

11. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína es albúmina.

12. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína contiene estructura de hoja-\beta.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la estructura de hoja-\beta imparte rigidez a la soldadura.

14. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína tiene entre 1 y 10% en peso de contenido \alpha-helicoidal.

15. Un método para preparar una soldadura biológica, biodegradable, para unir tejido, que comprende mezclar bien 100-120 partes en peso de proteína soluble en agua con 100 partes en peso de agua en un disolvente que contiene agua, siendo dicha soldadura fluida, o 120-230 partes en peso de proteína soluble en agua con 100 partes en peso de agua en un disolvente que contiene agua, siendo dicha soldadura sustancialmente sólida.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la soldadura comprende además una sustancia que absorbe energía a partir de una fuente de energía altamente comparable con la absorción de la energía por el tejido.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la sustancia es un colorante.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en el que la fuente de energía es un láser.

19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para preparar una soldadura de tejido fluida que comprende mezclar 100-120 partes en peso de proteína con 100 partes en peso de disolvente.

20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para preparar una soldadura de tejido sólida que comprende mezclar 120-230 partes en peso de proteína con 100 partes en peso de disolvente.

21. Una composición de soldadura de tejido, de proteínas, fluida, que comprende 100 a 120 partes en peso de proteína soluble en agua por cada 100 partes en peso de agua en un disolvente que contiene agua.

22. Una composición de soldadura de tejido de proteínas de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende 100 a 110 partes en peso de proteína.

23. Una soldadura de tejido de proteínas sustancialmente sólida que comprende 120 a 230 partes en peso de proteína soluble en agua por cada 100 partes en peso de agua en un disolvente que contiene agua.

24. Una soldadura de proteínas de acuerdo con la reivindicación 23, que comprende 170 a 230 partes en peso de proteína.

25. Una soldadura de proteínas de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende aproximadamente 210 partes en peso de proteína.

26. Una soldadura de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-25, en la que el disolvente es agua.

27. Una composición de soldadura de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-26, que comprende además una sustancia que absorbe energía a partir de una fuente de energía altamente comparable con la absorción de la energía por el tejido.

28. Una composición de soldadura de proteínas de acuerdo con la reivindicación 27, en la que la sustancia es un colorante.

29. Una soldadura de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-28, en la que la proteína es albúmina.

30. Una soldadura de proteínas sustancialmente sólida de acuerdo con la reivindicación 23, en la que la proteína contiene estructura de hoja-\beta.

31. Una soldadura de proteínas sustancialmente sólida de acuerdo con la reivindicación 30, en la que la estructura de hoja-\beta imparte rigidez a la soldadura.

32. Una soldadura de proteínas sustancialmente sólida de acuerdo con la reivindicación 30, en la que la proteína tiene entre 1 y 10% en peso de contenido \alpha-helicoidal.

33. Un kit para unir tejidos que comprende, en un envase preferiblemente estéril, una pluralidad de tiras y/o formas de una soldadura de proteínas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32.