ES2198967T3 - Procedimiento para la amplificacion exponencial de matrices moleculares. - Google Patents
Procedimiento para la amplificacion exponencial de matrices moleculares.Info
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Abstract
Procedimiento para la amplificación exponencial de matrices moleculares, que comprende (a) la unión de matrices moleculares a la superficie de una fase sólida mediante un engarce reversible a la matriz; (b) la adición de fragmentos de matriz, presentando uno de los fragmentos una unidad de engarce dado el caso protegida; (c) la síntesis de copias de la matriz; (d) la eliminación de fragmentos de la matriz en exceso y de coadyuvantes de reacción; (e) la separación de las copias de la matriz; (f) la colonización de sitios de unión libres en la fase sólida por copias de matriz sintetizadas; y (g) la repetición frecuente a voluntad de los pasos (a)-(f)
Description
Procedimiento para la amplificación exponencial
de matrices moleculares.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la amplificación exponencial de matrices
moleculares, es decir compuestos isómeros de secuencia con
propiedades de molde. En el procedimiento se excluye una inhibición
de producto al llevar a cabo la reacción en una superficie de fase
sólida. La presente invención se refiere además a un procedimiento
para la evolución química utilizando el procedimiento indicado para
la amplificación exponencial de matrices moleculares.
Se han proyectado sistemas químicos
autorreplicantes para identificar los requisitos mínimos para una
replicación molecular [D. Sievers y col.,
Self-Reprod. of Supramolecular Structures, Kluwer
Publishers, Dordrecht (1994)], para transferir el principio a
sistemas sintéticos supramoleculares [E.A. Wintner y col., Acc.
Chem. Res. 27, 198-203 (1994)] y para conseguir una
mejor comprensión del alcance y de las limitaciones de los procesos
de autoorganización [M. Eigen, Naturwissenschaften 58,
465-523 (1971)], de los que se cree que son
relevantes para la formación de la vida sobre la tierra [L. Orgel,
Acc. Chem. Res. 28, 109-118 (1955)]. Los métodos
actuales utilizan análogos de oligonucleótidos [G. von Kiedrowski,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 25, 932-935 (1986);
W.S. Zielinski y col., Nature 327, 346-347 (1987);
G. von Kiedrowski y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30,
423-426, ibid. 892 (1991); T. Achilles y col.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1198-1201 (1993);
D. Sievers y col., Nature 369, 221-224 (1994); T. Li
y col., Nature 369, 218-221 (1994); B. Martin y
col., Helv. Chim. Acta 80, 1901-1951 (1997); D.
Sievers y col., Chem. Eur. J. 4, 629-641 (1998)],
péptidos [D. Lee y col., Nature 382, 525-528
(1996); K. Severin y col., Angew. Chem. Int. Ed. 37,
126-128 (1998); D. Lee y col., Nature 390,
591-594 (1997); S. Yao y col., Angew. Chem. Int. Ed.
37, 478-481 (1998); K.S. Severin y col., Chem. Eur.
J. 3, 1017-1024 (1997)] y otras moléculas [T.
Tjivikua y col., J. Am. Chem. Soc. 112, 1249-1250
(1990); A. Terfort y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31,
654-656 (1992); J.-I. Hong y col., Science 225,
848-850 (1992); Q. Feng y col., Science 256,
1179-1180 (1992); R.J. Pieters y col., Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 106, 1579-1581 (1994); D.N.
Reinhoudt y col., J. Am. Chem. Soc. 118, 6880-6889
(1996); B. Wang y col., Chem. Commun. 16, 1495-1496
(1997)] como matrices y se basan en rutas de la formación de la
matriz autocalíticas, catalíticas cruzadas o catalíticas
colectivas. Un problema frecuente de estos sistemas es la
inhibición de producto, lo que conduce a una amplificación
parabólica en lugar de a una exponencial [G. von Kiedrowski,
Bioorg. Chem. Front. 3, 113-146 (1993)]. Lo último
es la hipótesis dinámica de una selección en el sentido darwinista
[E. Szathmáry y col., J. Theor. Biol. 138, 55-58
(1989); R.W. Wills y col., Santa Fe Institute Working Paper
97-07-065 (1997)].
Diversas teorías de la formación de la vida han
destacado la importancia de las superficies para la evolución
química [J.D. Bernal, The Physical Base of Life, Routledge &
Keagan Paul, Londres, 1951; A.G. Cairns-Smitz, Thee
Life Puzzle, Oliever & Boyd, Edimburgo, 1971; H. Kuhn y col.
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 20, 500-520 (1981); G.
Wächtershäuser, Microbiol. Rev. 52, 452-484 (1988);
E. Szathmáry y col., J. Theor. Biol. 187, 555-571
(1977); L. Orgel, Origins Life Evol. Biosphere 28,
227-234 (1988)]. Así, se utilizaron ya prontamente
procedimientos con aporte paso a paso en dos sistemas químicos
diferentes que se habían descrito como modelos para procesos
prebióticos potenciales [T. Li y col., Nature 369,
218-221 (1994); J.P. Ferris y col., Nature 381,
59-61 (1996); G. von Kiedrowski, Nature 381,
20-21 (1996)]. En Li y col., se alcanza una
replicación de ADN dúplex compuesto por cadenas palindrómicas
(simétricas) de homopiridina y homopurina. La cadena de homopiridina
se sintetizó por enlace en triple hélice de sus fragmentos
precursores y se utilizó como matriz para el enlace químico de los
precursores de la cadena de homopurina. La aportación paso a paso de
fragmentos de homopiridina y homopurina permitió así impedir una
complejación de los fragmentos y por consiguiente conectar y
desconectar entre las correspondientes etapas intermedias de enlace
tríplex y dúplex. Ferris y col., han estudiado la síntesis de
materiales largos de tipo oligonucleotídico y peptídico sobre la
superficie de soportes minerales. En estos sistemas la aportación
paso a paso permitió que se completasen precursores activados y
posibilitó con ello superar el efecto limitador de la longitud de
la hidrólisis de los precursores.
Se conoce además un procedimiento de selección y
amplificación con caráter evolutivo por el documento WO 91/19813.
En este procedimiento se genera una subpoblación de una biblioteca
de mutantes por unión reversible (partición) a una estructura diana
y seguidamente se amplifican los mutantes seleccionados. En una
amplificación semejante se presenta sin embargo frecuentemente el
problema de la inhibición del producto también conocido p.ej. en la
PCR.
El documento US 5,795,714 describe un
procedimiento para la replicación, pero no para la amplificación,
de sistemas de ácido nucleico. En el procedimiento aquí descrito
los moldes inmovilizados sirven para la síntesis de cadenas
complementarias por ligación enzimática de fragmentos de los cuales
uno posee una función inmovilizable (aquí biotina). Se realiza una
transferencia de la cadena sintetizada a una segunda superficie que
reacciona con la función inmovilizable (aquí avidina),
concretamente en el sentido de un proceso de termotransferencia. A
este respecto, la disposición maestra original -en la patente
estadounidense indicada se trata de una llamada disposición de
espigas en la que los ácidos nucleicos están inmovilizados en
pequeñas espigas de plástico- se copia sobre una membrana que a su
vez ya no puede copiarse.
El cometido de la presente invención ha
consistido pues en proporcionar un procedimiento de amplificación
para compuestos isómeros de secuencia con propiedades de molde (en
lo sucesivo brevemente "matrices moleculares") que posibilite
una ilimitada multiplicación de la matriz molecular, es decir, sin
inhibición del producto.
\newpage
El cometido de la presente invención ha
consistido además en proporcionar un procedimiento para la
evolución de matrices moleculares, en el que el paso de
amplificación no represente ningún factor limitativo, es decir que
sea posible una multiplicación ilimitada de la matriz molecular sin
inhibición del producto.
Sorprendentemente se ha encontrado un
procedimiento iterativo paso a paso que permite aumentar
exponencialmente la cantidad presente de matriz molecular. El
procedimiento utiliza para ello la superficie de un soporte sólido.
Por enlace químico sobre matrices inmovilizadas se sintetizan
copias de fragmentos precursores que luego pueden liberarse e
inmovilizarse, de modo que formen nuevas matrices. El proceso puede
repetirse con frecuencia a voluntad.
La presente invención se refiere pues a
(I) un procedimiento para la amplificación
exponencial de matrices moleculares, que comprende
- (a)
- la unión de matrices moleculares a la superficie de una fase sólida mediante un engarce reversible a la matriz;
- (b)
- la adición de fragmentos de matriz, presentando uno de los fragmentos una unidad de engarce dado el caso protegida;
- (c)
- la síntesis de copias de la matriz;
- (d)
- la eliminación de fragmentos de la matriz en exceso y de coadyuvantes de reacción;
- (e)
- la separación de las copias de la matriz;
- (f)
- la colonización de sitios de unión libres en la fase sólida por copias de matriz sintetizadas; y
- (g)
- la repetición frecuente a voluntad de los pasos (a)-(f)
y
(II) un procedimiento para la evolución química
por amplificación exponencial de matrices moleculares, que
comprende uno o varios ciclos de evolución de
- (1)
- selección de una subpoblación de matrices moleculares de una biblioteca combinatoria de partida; y
- (2)
- amplificación y mutación de las matrices selectivas para proporcionar una biblioteca de mutantes, que comprende más de uno de los ciclos de amplificación (a) a (f) definidos en (I).
El papel de la fase sólida (en lo sucesivo
también "soporte") en los procedimientos conforme a la
invención consiste en mantener separadas entre sí matrices
complementarias que en solución formarían dúplex estables. Los
materiales soporte adecuados están compuestos a este respecto por
material orgánico o inorgánico o por un híbrido de estos
materiales. Son materiales soporte orgánicos polímeros de base
azúcar, preferiblemente agarosa, celulosa así como derivados
adecuados o polímeros técnicos como poliestireno, poliacrilato,
poliacrilonitrilo, polialquenos o copolímero de injerto (p.ej.
PS-PEG, PAN-PEG,
PAN-PAG, etc.). Materiales soporte inorgánicos
pueden ser p.ej. vidrio, hidroxiapatito funcionalizado así como
metales, siendo de especial significación en especial la superficie
de oro (a consecuencia de la interacción del tiolato de oro). Como
híbridos son concebibles p.ej. perlas paramagnéticas.
En los procedimientos conforme a la invención las
copias de matriz producidas a este respecto en el paso (e) pueden
ser idénticas o complementarias a las matrices de partida. Por
"complementariedad" en el sentido de la invención debe
entenderse que la copia de la matriz se diferencia de la matriz de
partida, siendo sin embargo la copia de esta copia de nuevo
idéntica a la matriz de partida. En lo sucesivo esto se designa
también brevemente como "cadena (+)" y "cadena (-)". En
el caso de identidad de las matrices de partida y de las copias de
matriz puede realizarse tras la colonización de sitios de unión
libres (paso (f)) el siguiente próximo ciclo de reacción en el
mismo recipiente de reacción. Por otra parte, en el caso de que las
copias de matriz producidas sean complementarias a la matriz de
partida, el paso (f) se lleva a cabo preferiblemente en un segundo
recipiente de reacción y solo el paso (f) del siguiente ciclo de
reacción se lleva a cabo nuevamente junto con los fragmentos de
matriz originales.
En una forma de realización preferida del
procedimiento (I) tras la unión de matrices moleculares a la
superficie de la fase sólida se bloquean los sitios de unión
restantes de la fase sólida. Este bloqueo depende aquí del tipo de
enlace de los fragmentos de matriz utilizados a la fase sólida, es
decir, del tipo de engarce. La unión del engarce en el
procedimiento conforme a la invención puede realizarse tanto por
enlace covalente como también no covalente, estando comprendido por
enlace no covalente tanto sistemas de enlace iónico como también no
iónico y en especial miembros de pares de unión inmunológicos como
avidina/estreptavidina o antígeno-anticuerpo. Un
requisito básico para la selección del engarce adecuado es sin
embargo que este esté ortogonalmente a los demás enlaces químicos
utilizados en el sistema, en especial a los enlaces químicos en la
propia matriz y entre matriz y copia de matriz, de modo que las
matrices puedan eliminarse nuevamente de la superficie de la fase
sólida sin ruptura del enlace, es decir quede garantizado una unión
conectable a la fase sólida. Para el bloqueo de los sitios de unión
en exceso en la fase sólida, esto significa que el bloqueo puede
realizarse o bien por reacción con reactivos químicos que
introduzcan un enlace covalente con sitios de unión libres (p.ej.
en el caso de grupos tiol libres en la fase sólida: una reacción
con reactivos tiol adecuados formando disulfuros) o bien por
reacción con compuestos no covalentes adecuados que saturen los
sitios de unión libres (p.ej. en el caso de antígenos libres en la
fase sólida una reacción con los correspondientes anticuerpos). El
engarce puede encontrarse a este respecto en cualquier extremo
discrecional de la matriz, es decir, en un oligonucleótido puede
estar tanto en el extremo 5' como también en el extremo 3' y en un
péptido tanto en el N terminal como también en el C terminal.
Además, la colonización de sitios de unión libres
en la fase sólida por copias de matriz sintetizadas requiere que
estén presentes sitios de unión libres para el siguiente ciclo de
reacción. Esto puede realizarse por una parte por liberación de
nuevos sitios de unión en la fase sólida ya presente en la
síntesis, pero por otra parte también por adición de nuevo material
de fase sólida, o por transferencia de la copia de matriz formada
sobre nuevo material sólido. De estas tres posibilidades, las dos
primeras son especialmente bien adecuadas para la situación en la
que la matriz de partida y la copia de matriz sean idénticas. La
tercera posibilidad es más bien adecuada para aquellos sistemas en
los que la matriz producida es complementaria a la matriz de
partida.
En otra forma de realización del procedimiento
(I) pueden desprotegerse unidades de engarce de las copias de
matriz en este punto del ciclo de reacción (es decir antes, durante
o después del paso (e)). Tras la desprotección estas reaccionan
entonces con sitios de unión libres en el material soporte. En esta
forma de realización también pueden estar presentes durante los
pasos (b)-(e) sitios de unión libres en la fase sólida. En esta
forma de realización no es necesario un bloqueo de sitios de unión
en exceso tras el paso (a).
Para el tipo de estos grupos protectores de
engarce son válidos los mismos requisitos que anteriormente para la
química del engarce. También aquí debe garantizarse la
ortogonalidad con respecto a los demás compuestos químicos. Grupos
protectores adecuados para el correspondiente sistema de
amplificación pueden encontrarse p.ej. en T.W. Green, Protective
Groups in Organic Síntesis in Organic Synthesis, Wiley & Sons,
N.J.
Finalmente una forma de realización especial
consiste en que en lugar de un método de inmovilización se utilizan
dos o más métodos ortogonales. Esto implica entonces que en lugar
de una superficie se utilizan dos o más superficies.
Preferiblemente la cadena (+) se inmoviliza por un método distinto
al de la cadena (-), con lo que se realizan dos procedimientos de
inmovilización ortogonales en dos superficies funcionalizadas
correspondientes. Pueden construirse procedimientos de
inmovilización ortogonales sobre distintas interacciones
específicas no covalentes, p.ej. sobre la pareja
biotina-avidina y la pareja
digoxigenina-antidigoxigenina, pero también sobre
procedimientos de enlace covalentes ortogonales, como p.ej.
reacciones de Diels-Alder y reacciones de
condensación. Si se designa con A-A' y
B-B' a dos interacciones ortogonales covalentes o no
covalentes, entonces el procedimiento de replicación consiste
en
- (1a) se inmoviliza la cadena (+) A'-funcionalizada en la superficie A,
- (1b) se inmoviliza la cadena (-) B'-funcionalizada en la superficie B,
- (2a) a la cadena (+) se le añaden fragmentos de los cuales uno está funcionalizado con B',
- (2b) a la cadena (-) se le añaden fragmentos de los cuales uno está funcionalizado con A',
- (3a) se realiza la ligación de los fragmentos en la cadena (+),
- (3b) se realiza la ligación de los fragmentos en la cadena (-),
- (4a) se separa la copia B'-funcionalizada de la cadena (+),
- (4b) se separa la copia A'-funcionalizada de la cadena (-).
En la forma de realización técnica preferida la
superficie A permanece siempre separada de la superficie B. Los
pasos parciales (a) y (b) en las reacciones (1a,b), (3a,b) y (4a,b)
pueden llevarse a cabo entonces para las dos superficies
correspondientemente juntas, es decir en la misma fase líquida.
Solamente los pasos parciales (2a) y (2b) deben desarrollarse por
separado, pues aquí debe evitarse que el fragmento A' entre en
contacto con la superficie A y el fragmento B' con la superficie
B.
En el procedimiento conforme a la invención
pueden utilizarse matrices con una longitud de 2 a 2000, en
especial de 4 a 50 unidades monómeras. Como "fragmentos de
matriz" en el paso (b) del procedimiento conforme a la invención
pueden utilizarse tanto unidades monómeras individuales como
también oligómeros de estas unidades monómeras. Es un requisito sin
embargo que una de estas unidades monómeras o unidades oligómeras
presente una unidad de engarce protegida, definiéndose el tipo de
grupo protector del engarce como anteriormente.
La concentración de matrices utilizada en el
procedimiento conforme a la invención depende del material de fase
sólida utilizado, en especial del tamaño de partícula y del número
de sitios de unión en su superficie. Otro factor limitativo es la
longitud de las matrices. En general la construcción de la
molécula de matriz en la mezcla de reacción debe alcanzar de
10^{-15} a 10^{-1}, en especial de 10^{-12} a 10^{-3}
mol/l. Los segmentos de matriz empleados deben utilizarse en una
concentración de 10^{-12} a 1 mol/l, en especial de 10^{-9} a
10^{-1} mol/l, utilizándose un cierto exceso de fragmentos de
matriz, referido a las unidades monómeras necesarias para la matriz
correspondiente. Es especialmente preferido un exceso de 1:1,1 a
1:100 de las unidades monómeras, siendo la reacción antieconómica
con un exceso superior a 10.
Por matrices moleculares en el sentido de la
presente invención debe entenderse todos los compuestos isómeros de
secuencia que presentan propiedades de molde. Estos son en especial
oligonucleótidos y derivados de nucleótidos (incluidos APN, ARNp,
2',5'-nucleótidos y ARN/ADN isómeros especulares),
oligopéptidos y derivados de oligopéptidos (en especial en espiral
enrollada (p.ej. cremallera de leucina) y estructuras en lámina
plegada). En el caso de los derivados de oligonucleótidos y
oligopéptidos son de mencionar en especial estructuras no
naturales, como oligonucleótidos con estructuras 2',5' y péptidos
con D-aminoácidos, que presentan una mayor
estabilidad frente a enzimas disociadoras. Como esqueleto de molde
pueden utilizarse preferiblemente diésteres, amidatos, tioatos,
pirrofosfatos del ácido fosfórico, y otros derivados del ácido
fósfórico así como amidas, pero también ésteres, ureas, uretanos,
disulfuros, iminas, acetales y encadenamientos C-C.
El reconocimiento molecular que tiene lugar en los moldes puede
realizarse a través de heterociclos (en especial nucleobases),
puentes salinos (en especial interacción con carboxilato de
amidinio), interacción ion-ion, interacción
ion-dipolo, interacción
dipolo-dipolo, complejación de inclusión (en
especial a través de ciclodextrinas y las llamadas pinzas
moleculares), interacción de apilamiento y transferencia de carga
(en especial a través de apilamiento de compuestos aromáticos ricos
en electrones y pobres en electrones) así como a través de
interacción ligando-metal-ligando.
Los moldes pueden poseer topología tanto lineal, cíclica,
ramificada (de tipo dendrímero) como bidimensional.
Son disolventes adecuados para el procedimiento
conforme a la invención el agua y medios de reacción orgánicos o
mezclas de los mismos. En el caso de que las matrices y fragmentos
de matrices contengan grupos iónicos (como mono o diésteres del
ácido fosfórico) son especialmente preferidos sistemas de
disolventes acuosos. Los disolventes pueden contener además sistemas
tampón adecuados.
El enlace de unión en el paso (c) puede llevarse
a cabo tanto química como enzimáticamente. En el enlace químico se
lleva a cabo a este respecto la reacción de los correactantes con
los reactivos de activación y agentes de condensación adecuados
para el correspondiente enlace de unión. Así, la reacción de
condensación de derivados del ácido fosfórico se realiza en medios
acuosos preferiblemente utilizando carbodiimidas solubles en agua.
Para el enlace enzimático pueden utilizarse todas las enzimas que
presenten las correspondientes propiedades catalíticas (ligasas,
polimerasas, estearasas, etc.).
La temperatura de reacción para los pasos de
reacción anteriormente indicados, en especial para el paso de
enlace (c), puede encontrarse a este respecto según el sistema de
reacción entre -20 y 100ºC. Son especialmente preferidas
temperaturas entre 0 y 50ºC. En especial para la reacción de enlace
mediante polimerasas el sistema de amplificación conforme a la
invención permite una realización de la reacción por debajo de
50ºC.
Tras la síntesis de las copias de matriz, en el
paso (d) se elimina el exceso de fragmentos de matriz y
coadyuvantes de reacción (es decir, agentes de condensación,
reactivos de activación, tampón, enzimas, etc.) que fueron
necesarios para el enlace.
La separación de las copias de matriz de las
matrices depende del respectivo sistema de matriz y debe realizarse
de modo que tanto los compuestos enlazados químicamente como
también el enlace del engarce con superficies o grupos protectores
del engarce permanezcan sin verse afectadas en las copias de matriz.
Son medidas adecuadas p.ej. tratamientos de soluciones acuosas u
orgánico-acuosas con reactivos de desnaturalización,
incremento de la temperatura, campos eléctricos y magnéticos,
procedimientos mecánicos y combinaciones de las mismas. La presente
invención ofrece por tanto múltiples posibilidades de
desnaturalización, es decir, no es imprescindible un calentamiento
por encima de 90ºC como con la TAQ-polimerasa en la
PCR.
En el procedimiento (II) la selección de la
subpoblación de matrices moleculares se lleva a cabo mediante una
unión reversible a una o más estructuras diana (moléculas diana).
Esto se realiza preferiblemente mediante una cromatografía de
absorción. En el ciclo de evolución conforme a la invención, en el
caso de que la biblioteca de mutantes no presente ningún engarce
adecuado, las matrices moleculares seleccionadas se proveen en un
paso adicional (1') de un engarce reversible. La biblioteca de
mutantes obtenida en el paso (2) del procedimiento es la biblioteca
de partida para el siguiente ciclo de evolución. La mutación en el
ciclo de amplificación se controla mediante los parámetros de
reacción en los pasos (b) y (c). El número de ciclos de evolución
depende aquí por una parte de la complejidad (es decir, del número
de las posibles variables de la estructura a seleccionar), la
relación de merma en el paso de selección, que en el marco de la
presente invención se encuentra entre el 0,01 y el 50%, así como el
efecto de contrasentido de la mutación en el paso de la
amplificación. Además del paso de selección en (1) puede también
llevarse a cabo una selección adicional mediante el paso de
separación (2)(e).
El procedimiento (II) puede aquí además
comprender o bien después de cada ciclo de evolución o bien después
del último ciclo de evolución también los pasos adicionales de
aislamiento de las moléculas de matriz obtenidas y análisis
subsiguiente.
\newpage
La presente invención se ilustra con la ayuda de
las siguientes figuras.
(1) Paso de inmovilización: se inmoviliza
una matriz mediante una reacción irreversible con la superficie de
un soporte sólido.
(2) Paso de hibridación: la matriz fija
fragmentos complementarios de la solución.
(3) Paso de ligación: los fragmentos se
enlazan entre sí por enlace químico.
(4) Paso de separación: la copia se libera
y se inmoviliza de nuevo en otra parte del soporte sólido,
convirtiéndose en una matriz para el siguiente ciclo de pasos.
Los pasos individuales del procedimiento (1)-(4)
se llevaron a cabo por separado para las matrices complementarias X
e Y en distintos tubitos. PySS designa una unidad estructural de
disulfuro de 2-piridilo, que en la inmovilización
(1a) y remate (1b) se disocia formando
2-tiopiridona. La modificación del esqueleto X en
el enlace internucleotídico central de X e Y es X =
N-H, excepto en la primera inmovilización, en la que
X = O. A^{x}, B^{x}, A^{y} y B^{y} designan los fragmentos
de matriz correspondientes. El paso de hibridación (2) proporciona
un complejo termomolecular de las matrices inmovilizadas y los
respectivos fragmentos A^{x}, B^{x}, A^{y} y B^{y}. En
presencia de la carbodiimida hidrosoluble EDC el enlace químico (3)
conduce a una unión
3'-5'-fosforamidato entre un grupo
5'-amino y un grupo 3'-fosfato
vecino. Cada complejo bicatenario resultante se desnaturaliza (4),
lo que proporciona el soporte que porta la matriz así como una copia
modificada con PySS inmovilizada sobre soporte con SH fresco.
Todas las muestras de HPLC sin tampón de
reducción (RB) se llevaron antes de los análisis a una
concentración de 100 mM de DTT (excepto (a)) para garantizar la
reproducibilidad de la cuantificación por HPLC.
t_{R} = tiempo de reacción en minutos
(a) = mezcla de reacción, que contiene X y
GAATCCATGGTAAG (X^{ref}) como patrón interno, antes de la
inmovilización
(b) = sobrenadante tras la inmovilización
(c) = mezcla de reacción tras la hibridación de X
inmovilizado con A^{y} y B^{y} y tratamiento del soporte con
RB.
(d) = mezcla de reacción tras el enlace químico y
disociación reductora del soporte con auxilio de RB
(e, f) = análisis por HPLC del grupo de dieciséis
muestras obtenidas por disociación reductora de matrices
inmovilizadas que habían sido obtenidas a través de tres ciclos de
amplificación.
Las leyendas a la derecha de los perfiles de la
HPLC se explica seguidamente con más detalle en la figura 4. Se
observa que pequeñas impurezas que son visibles en los primeros
perfiles desaparecen progresivamente en el transcurso de la
amplificación.
Los cuadrados y letras simbolizan tubitos de
reacción o soporte portador de matriz. Eje X: número de los ciclos
de amplificación; eje Y: número de muestras. Las flechas indican
qué copia de qué matriz se ha producido. La cantidad del material
de matriz indicada se cuantificó tras la disociación de los puentes
disulfuro por reducción con DTT por análisis de HPLC. A partir de
los datos anteriores se calcularon 14 rendimientos individuales.
Los rendimientos medios y los errores típicos son: p_{x}= 0,763
+/- 0,071 y p_{y}= 0,855 +/- 0,079. La cantidad de materia de la
correspondiente matriz en el ciclo n en nanomoles se compara con su
valor teórico (entre paréntesis) que se calcula a partir de (3a,b):
x_{0} = 38,87 (38,87); y_{0} = 45,44 (45,44), x_{1} = 72,81
(73,54), y_{1} = 80,71 (78,68), x_{2} = 126,29 (133,58), y_{2}
= 138,97 (141,57), x_{3} = 238,90 (241,61), y_{3} = 249,77
(255,80).
(1) Paso de inmovilización: se inmoviliza
una matriz mediante una reacción irreversible con la superficie de
un soporte sólido.
(2) Paso de hibridación: la matriz fija
fragmentos complementarios de la solución.
(3) Paso de ligación: los fragmentos se
enlazan entre sí por enlace químico.
(4) Paso de separación: la copia se libera
y se inmoviliza de nuevo en otra parte del soporte sólido,
convirtiéndose en una matriz para el siguiente ciclo.
(5) Paso de selección: adición de la
matriz a la molécula diana.
(6) Desecho de las matrices que no se unen.
En concreto la figura 1 describe dos formas de
realización especiales del procedimiento (I) con los siguientes
pasos: un paso de inmovilización del molde, (2) un paso de
hibridación o remate, (3) un paso de ligación o copia y (4) un paso
de separación o desnaturalización. Se abarcan dos variantes de
procedimiento (I y II) de las cuales (I) implica un paso de copia no
enzimático y (II) implica un paso de copia enzimático.
(I): En la primera variante de procedimiento se
utilizan como molde derivados de oligodesoxi- u
oligorribonucleótidos que poseen 10-100 unidades
nucleotídicas y o bien contienen un esqueleto natural de uniones
3',5'-fosforamidato, uniones
3',5'-pirofosfato u otras uniones incluidas uniones
2',5'-internucleotídicas. En el esqueleto pueden
encontrarse mezcladas uniones naturales y sintéticas.
(con referencia a 1) La inmovilización del molde
se efectúa en el extremo 5' a través de un puente disulfuro o a
través de la interacción biotina-avidina. En el
primer caso, el molde oligonucleotídico a inmovilizar contiene en el
extremo 5' una modificación de disulfuro de
2-piridilo y el material soporte grupos tiol
libres. La inmovilización tiene lugar aquí por intercambio de
disulfuro con disociación de 2-tiopiridona. En el
segundo caso se utiliza un molde oligonucleotídico
5'-biotinilado, pudiendo contener el modificador de
biotina también un puente disulfuro. La inmovilización tiene lugar
por unión de la biotina a la avidina, que a su vez está presente
unida a soportes sólidos. Como materiales soporte pueden utilizarse
tentageles, agarosa u otros polímeros adecuados incluidos vidrio o
papel.
(con referencia a 2) Tras la inmovilización se
desactivan los sitios de la superficie no cubiertos mediante un
reactivo adecuado. Los grupos tiol se desactivan preferiblemente
por tratamiento con disulfuro de 2-hidroxietil
-(2-piridilo), pero también con disulfuro de
2,2'-dipiridilo, un alquilano suave, o por
oxidación. La avidina libre se desactiva con biotina.
(con referencia a 3) El paso de copia se efectúa
por ligación química: oligodesoxinucleótidos, oligorribonucleótidos
2-50-meros complementarios o
derivados que contienen o bien un grupo 5'-fosfato
y uno 3'-hidroxi o bien un grupo
5'-hidroxi y uno 3'-fosfato o bien
un grupo 5'-fosfato y uno 3'-amino o
bien un grupo 5'-amino y uno
3'-fosfato o bien un grupo 5'- y uno
3'-fosfato o bien otros grupos químicamente
enlazables, se adicionan al molde inmovilizado y en presencia de
una carbodiimida hidrosoluble, preferiblemente EDC, u otro agente
de condensación como bromuro de cianógeno o
N-cianoimidazol se enlazan. El oligodesoxinucleótido
complementario al extremo 3' de la matriz inmovilizada posee la
función de un 5'-cebador. Este contiene en el
extremo 5' una de las modificaciones indicadas en (1) y en el
extremo 3' uno de los grupos indicados en (3).
(con referencia a 4) La desnaturalizaciónn con
separación de la copia se efectúa o bien ajustando una temperatura
elevada adecuada o eluyendo con una solución de urea u otro agente
desnaturalizante.
Las copias separadas se inmovilizan en soporte
nuevo -como se ha descrito en (1)- y sirven en el paso siguiente
como matriz. El nuevo material soporte recubierto se fusiona con
aquellos de ciclos anteriores. Las cadenas (+) y (-) pueden
fusionarse por separado o conjuntamente. En la fusión por separado
los pasos (3) se efectúan alternativamente con cebadores (+) y (-);
en la fusión conjunta cada paso (3) se efectúa con ambos
cebadores.
(II): En la segunda variante de procedimiento los
pasos (1), (3), (4) corresponden a los indicados en (I). El paso
(2) implica la prolongación enzimática de un cebador o la ligación
enzimática de dos o más fragmentos oligonucleotídicos. La secuencia
objetivo a amplificar se transcribe primeramente usando un cebador
5'-modificado en una secuencia inmovilizable
5'-terminal. Tras la inmovilización del molde se
efectúa la hibridación con el cebador 5'-modificado
y su prolongación mediante dNPT en presencia de una polimerasa.
Como alternativa puede realizarse aquí un enlace catalizado por
ligasa de oligonucleótidos 5'-fosforilados.
La figura 4 recoge la ruta de cada soporte
individual y la cantidad del material obtenido tras cada ciclo de
copia para cada ejemplo descrito. En general el rendimiento p de un
ciclo de replicación no necesita de modo necesario alcanzar p = 1
para hacer posible un modo de amplificación exponencial. En el caso
de matrices palíndrómicas en las que X = Y, A^{x} = A^{y},
B^{x} = B^{y}, la cantidad del material x_{n} que se obtiene
tras n ciclos de replicación a partir de una cantidad inicial
x_{0} viene dada por:
x_{n} =
x_{0}\cdot(1+p)^{n}(1)
que para p > 0 hace posible un crecimiento
exponencial. En matrices no palíndrómicas, que sirven de base a
nuestros experimentos, cada ronda de replicación consta de dos
ciclos de copia con los rendimientos individuales p_{x} y p_{y}
para la síntesis de X e Y respectivamente. Aquí la cantidad de las
matrices X e Y inmovilizadas sigue la secuencia de iteración:
x_{n+1} = x_{n} + p_{x}\cdoty_{n}
e y_{n+1} = y_{n} +
p_{y}\cdotx_{n}(2a,b)
lo que exige para un crecimiento exponencial
tanto p_{x} > 0 como también P_{y} > 0. Las ecuaciones
(2a,b) dan:
en las que x_{0} e y_{0} designan la cantidad
inicial de X e Y respectivamente. Una comparación de los valores
experimentales y teóricos para X_{n} e y_{n}, como está
indicado en la leyenda de la figura 4, confirma que los datos
mostrados en la figura 4 están de acuerdo con un modo exponencial
de la amplificación para materiales de
matriz.
El procedimiento (I) combina las ventajas de la
química en fase sólida con la replicación química y puede
desarrollarse ulteriormente para la amplificación no enzimática y
enzimática de ARN, péptidos y otras matrices así como para la
evolución darwinista en ecosistemas químicos artificiales.
Procesos similares quizás han jugado también un papel en la
aparición de la vida en la tierra, pues los sistemas de replicación
más tempranos habrían podido multiplicarse por extensión sobre
superficies minerales.
Además, el procedimiento conforme a la invención
constituye un primer ejemplo de amplificación exponencial y química
en estado sólido en la replicación química. La química en fase
sólida es un requisito para una automatización practicable del
procedimiento, pues esencialmente solo intervienen pasos de pipeteo
y filtración. La amplificación exponencial abre la posibilidad de
una evolución molecular dirigida. En relación con lo último el
procedimiento tiene el potencial de una frecuencia de mutación
controlable, pues la liberación de las copias en el paso (4)
depende de la estabilidad termodinámica de los dúplex inmovilizados
y por consiguiente los mutantes deben eluirse más rápidamente como
copias perfectas. Los protocolos, que se basan en ciclos de
temperatura (u otros parámetros ambientales) así como en química en
solución, pueden utilizarse peor en sistemas químicos que en
matrices cortas. Los saltos bruscos negativos de temperatura así
como una química de condensación rápida no serían necesarios para
impedir el reequilibrio de los complejos oligonucleotídicos
implicados. Estas condiciones limitarían entonces necesariamente la
exactitud de la copia de las matrices, pues el control
termodinámico del reconocimiento molecular establece el umbral para
la exactitud de copia en ausencia de un mecanismo corrector de la
disipación de energía.
De lo anterior resulta directamente que el
procedimiento conforme a la invención es de notable valor para el
diseño de sistemas químicos evolutivos. Pueden utilizarse otras
matrices, superficies, enlaces matrices-superficies,
pueden investigarse variantes enzimáticas y combinarse entre sí
distintos pasos de modo que se consiga un mayor nivel de
integración y autonomía de procesos. Son concebibles procesos en
los que matrices utilizadas se inmovilizan próximas entre sí de
modo que el concepto de cuasiespecie [M. Eigen, Naturwissenschaften
58, 465-523 (1971)] alcanza una dimensión espacial.
Además, protocolos en los que estén implicados dos o más clases de
moléculas matriz, como oligonucleótidos y péptidos, pueden
contribuir a la selección y descubrimiento de sistemas cooperativos
más complejos. A corto plazo el procedimiento ya puede aplicarse a
la química de la replicación de péptidos y ARNp descrita por los
grupos de D.H. Lee y col., Nature 382, 525-528
(1996) y B. Martin y col., Helv. Chim. Acta 80,
1901-1951 (1997), así como para la síntesis del
llamado ARN-especularómero (Jens Fürste y col.,
Nature Biotechnology 14, 1112, 1116; 15, 229).
La invención se ilustra además mediante el
ejemplo siguiente.
La síntesis de dos matrices
14-meras complementarias, X e Y así como de los
cuatro fragmentos de matriz, A^{x}, B^{x}, A^{y} y B^{y} se
llevó a cabo utilizando química de fosforamidito convencional, por
ejemplo la de L. Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron 48,
2223-2311 o L. Beaucage y col., Tetrahedron Lett.
22, 1859-1862 (1981). El soporte modificado con tiol
se obtuvo a partir de Agarose® activada con disulfuro de
2-piridilo que puede adquirirse comercialmente
(Sepharose® 6B, Pharmacia) por reducción con ditiotreíta (DTT).
Tampón de reducción (RB): DTT 100 mM,
Tris-HCl 40 mm, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, pH 7,9:
tampón de inmovilización (IB): acetato sódico/ácido acético 370 mM,
NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, pH 4,4, desgasificado con argón para
expulsar el oxígeno.
Tampón de remate (CB):
S-(2-tiopiridil)-2-mercaptoetanol,
MES 40 mM, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, pH 6,5.
Tampón de hibridación (HB): MES 100 mM,
MgCl_{2} 40 mM, NaCl 1 M, disulfuro de
2,2'-dipiridilo 1 mM, pH 6,1.
Tampón de enlace (LB): HB con EDC 0,2 M, fresco
antes del enlace químico.
Si no se indica otra cosa todas las reacciones
soportadas se realizaron a 25ºC en filtros de centrífuga
micro-spin (0,5 ml, acetato de celulosa de poros de
0,45 \mum, Roth) que se apilaron en tubitos Eppendorff (1,5 ml). A
cada filtro se le cargó una serie de 16 filtros con 50 mg de
Sepaharose® 6B húmeda (lavados conforme a las instrucciones del
fabricante) y entonces se centrifugó (3 min a 4000 x g) para
eliminar el sobrenadante. Antes de un paso de inmovilización las
perlitas se agitaron en vórtex en 400 \mul de RB durante 1 h para
producir la forma tiol de la Sepaharose 6B. Entonces se reemplazó
el RB por IB repitiendo la adición de tampón, tratamiento con
ultrasonidos (10 s) y centrifugación seis veces.
Se agitó en vórtex una suspensión de
SH-Sepaharose® en 400 \mul de IB que contenía
20-40 nmol de la respectiva matriz durante 1 h a
1000 rpm.
Se añadieron 100 \mul de CB a la suspensión
anterior. Tras 1 h de agitación las perlitas se separaron por
centrifugación, se suspendieron de nuevo en 400 \mul de CB y se
agitaron en vórtex durante 1 h a 25ºC. Entonces se reemplazó el CB
por una solución de S-(2-tiopiridil)
-2-mercaptoetanol 200 mM en etanol. Después de 2 h
de agitación en vórtex a 70ºC las perlitas se lavaron con etanol (5
x 200 \mul) y NaCl 1M (5 x 200 \mul).
Las perlitas se resuspendieron en 250 \mul de
HB que contenía el heptámero complementario en una concentración de
400 \muM. La temperatura se elevó a 85ºC, en el transcurso de 1 h
se redujo a 4ºC y se mantuvo durante 2 h a este valor. El heptámero
sobrante se eliminó lavando las perlitas con tres porciones de 200
\mul de NaCl 1M a 4ºC.
Las perlitas se resuspendieron en 375 \mul de
LB, se agitaron en vórtex durante 40 h a 4ºC y se lavaron tres
veces con 200 \mul de NaCl 1 M a 4ºC.
Se insertó un filtro micro-spin
con las correspondientes perlitas en un tubito Eppendorf que
contenía 150 \mul de tampón acetato 1M (pH 4,4). Las perlitas se
resuspendieron y se agitaron ligeramente en 50 \mul de NaOH 0,1
M, y el sobrenadante se transfirió por centrifugación (7000 x g, 30
s) a un tubito Eppendorf. Tras repetir tres veces este paso del
procedimiento la solución resultante (400 \mul) estaba ya lista
para el siguiente ciclo. Las perlitas se reciclaron mediante lavado
con cuatro porciones de HB.
\newpage
Todas las muestras de HPLC sin tampón de
reducción (RB) se llevaron antes del análisis a una concentración
de 100 mM de DTT para garantizar la reproducibilidad. Todas las
separaciones se llevaron a cabo en una columna
RP-C-18 (250, Nucleosil®
120-5 AB, Macherey & Nagel. Eluatos: acetato de
trietilamonio 0,1 M (pH = 7)/MeCN 1% (A) y MeCN (B). Las mediciones
analíticas se efectuaron a 50ºC utilizando un gradiente de 2% a 6%
de A en dos minutos, de 6% a 25% en 30 min y una velocidad de flujo
de 1 ml/min. El eluato se controló simultáneamente a 254 nm y 273
nm. Equipo (Kontron): dos bombas 422, inyector automático de
muestras 465, integrador 440. Como sistema registrador de datos se
utilizó un Kroma 2000.
Para la realización del procedimiento
esquematizado en la figura 2 en primer lugar se inmovilizaron las
matrices 14-meras X e Y utilizando reacciones de
intercambio de disulfuro [J.R. Lorsch, Nature 371,
31-36 (1994) en una respectiva carga del soporte
con SH, obteniéndose los soportes que portaban matriz X0 e Y0. La
eficiencia del paso de inmovilización se determinó por análisis de
HPLC del sobrenadante (figura 3a,b). Los restantes grupos tiol del
soporte se remataron por reacción con
S-(2-tiopiridil)-2-mercaptoetanol.
Entonces los fragmentos A^{x}, B^{x} y A^{y}, B^{y} se
hibridaron con las matrices inmovilizadas Y0 y X0
respectivamente.
Para la determinación de la eficiencia de
hibridación una parte del soporte se redujo con DTT y se analizó
por HPLC (figura 3c). El enlace químico [N.G. Dolinnaya y col.,
Nucleic Acids Res. 19, 3073-3080 (1991); K.D. James
y col., Chem. Biol. 4, 595-605 (1997)] se consiguió
intercambiando el tampón de hibridación por un tampón de enlace que
contenía clorhidrato de
N-etil-N'-(dimetilaminopropil)-carbodiimida
(EDC) como agente de condensación.
Para la determinación de la eficiencia de
ligación se controló la formación de producto por análisis de HPLC
de la mezcla de productos que se obtuvo tras la escisión de los
enlaces disulfuro de una alícuota del soporte portador de matriz
con DTT como agente reductor (figura 3d). Entonces se liberaron las
copias por lavado del soporte con NaOH 0,1 M, se analizaron por
HPLC y de nuevo se inmovilizaron sobre dos nuevas cargas del
soporte con SH, lo que proporcionó los soportes portadores de
matriz X1 (copia del soporte portador de matriz Y0) e Y1 (copia del
soporte portador de matriz X0).
Para la siguiente generación se repitió todo el
ciclo de pasos con cada una de las cuatro cargas X0, Y0, X1 e Y1,
lo que proporcionó Y2, X2, Y3 y X3 respectivamente. Otra ronda
proporcionó los soportes portadores de matriz X4..X7, Y4..Y7 (figur
3e,f).
\vskip0.333000\baselineskip
<110> von Kiedrowski, Günther
\hskip1.1cmNoxxon Pharma AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Procedimiento para la amplificación
exponencial de matrices moleculares
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> 992074wo/JH/ml
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<140>
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: matriz de referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgaatccatgg taag
\hfill
Claims (20)
1. Procedimiento para la amplificación
exponencial de matrices moleculares, que comprende
- (a)
- la unión de matrices moleculares a la superficie de una fase sólida mediante un engarce reversible a la matriz;
- (b)
- la adición de fragmentos de matriz, presentando uno de los fragmentos una unidad de engarce dado el caso protegida;
- (c)
- la síntesis de copias de la matriz;
- (d)
- la eliminación de fragmentos de la matriz en exceso y de coadyuvantes de reacción;
- (e)
- la separación de las copias de la matriz;
- (f)
- la colonización de sitios de unión libres en la fase sólida por copias de matriz sintetizadas; y
- (g)
- la repetición frecuente a voluntad de los pasos (a)-(f)
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
en el que las copias de las matrices generadas en el paso (e) son
idénticas o complementarias a las matrices de partida.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
en el que se utilizan dos o más procedimientos de inmovilización
ortogonales en dos o más superficies.
4. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que tras el paso (a) se bloquean los
sitios de unión restantes en la fase sólida.
5. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los sitios de unión libres en la
fase sólida se generan en el paso (f) por liberación de nuevos
sitios de unión en la fase sólida, adición de nuevo material de
fase sólida o transferencia de la copia de matriz formada en (e)
sobre nuevo material de fase sólida.
6. Procedimiento conforme a la reivindicación 5,
en el que las matrices generadas en el paso (e) son complementarias
a las matrices de partida y se transfieren sobre nuevo material de
matriz.
7. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la unidad de engarce del
fragmento de matriz está protegida en el paso (b) y las copias de
matriz formadas en el paso (e) se desprotegen.
8. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que las matrices presentan una
longitud de 2 a 2000, en especial de 4 a 50 unidades monómeras y
como fragmentos de matriz se utilizan unidades monómeras u
oligómeros de unidades monómeras.
9. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 u
8, en el que la cantidad de matriz utilizada en el paso (a) alcanza
de 10^{-15} a 10^{-1} mol/l y la concentración de los
fragmentos de matriz en el paso (b) alcanza de 10^{-12} a 1
mol/l.
10. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 - 9, en el que las matrices moleculares están
seleccionadas entre nucleótidos y derivados de nucleótidos,
péptidos y derivados de péptidos.
11. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 - 10, en el que los enlaces formados en el paso
(c) están seleccionados entre enlaces diéster del ácido fosfórico,
esteramida del ácido fósfórico, éster, amida, disulfuro, acetal y
C-C.
12. Procedimiento conforme a la reivindicación 1
u 11, en el que el enlace de unión en el paso (c) se realiza
químicamente o por enlace enzimático.
13. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 - 12, en el que el engarce se une a la fase
sólida por enlaces covalentes o no covalentes.
14. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 - 13, en el que el material de la fase sólida
está seleccionado entre material orgánico o inorgánico o entre un
híbrido de estos materiales.
15. Procedimiento para la evolución química por
amplificación exponencial de matrices moleculares, que comprende
uno o varios ciclos de evolución de
\newpage
- (1)
- selección de una subpoblación de matrices moleculares de una biblioteca combinatoria de partida; y
- (2)
- amplificación y mutación de las matrices selectivas para proporcionar una biblioteca de mutantes, que comprende más de uno de los ciclos de amplificación (a) a (f) definidos en las reivindicaciones 1 a 14.
16. Procedimiento conforme a la reivindicación
15, en el que la selección de la subpoblación de matrices
moleculares en el paso (1) se efectúa mediante una unión reversible
a una o más estructuras diana.
17. Procedimiento conforme a la reivindicación 15
ó 16, en el que la biblioteca de mutantes obtenida en el paso (2)
es la biblioteca de partida para el siguiente ciclo de
evolución.
18. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 15 - 17, en el que la mutación se controla
mediante los parámetros de reacción en los pasos (b) y (c) del
ciclo de amplificación.
19. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 15 - 18, en el que el primer ciclo de evolución
comprende también el siguiente paso (1'):
- (1')
- proveer a las matrices moleculares seleccionadas de un engarce reversible.
20. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 15 - 19, en el que en el paso de separación (e) se
efectúa una selección adicional por separación selectiva.
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|---|---|---|---|
| DE19848403 | 1998-10-21 | ||
| DE19848403A DE19848403A1 (de) | 1998-10-21 | 1998-10-21 | Verfahren zur exponentiellen Amplifikation molekularer Matrizen |
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| DE19853185A DE19853185C1 (de) | 1998-11-19 | 1998-11-19 | Chemische Evolution durch exponentielle Amplifikation molekularer Matrizen |
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