ES2163997B2 - Procedimiento para la inmovilizacion de una nueva penicilina v acilasa de "streptomyces lavendulae" para la obtencion de acido 6-aminopenicilanico. - Google Patents
Procedimiento para la inmovilizacion de una nueva penicilina v acilasa de "streptomyces lavendulae" para la obtencion de acido 6-aminopenicilanico.Info
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Abstract
Procedimiento para la inmovilización de una nueva penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae para la obtención de ácido 6- aminopenicilánico. La inmovilización de la penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae ATCC 13864 en el soporte comercial Eupergit C ha permitido la obtención del biocatalizador ECPVA, una nueva penicilina acilasa inmovilizada para la obtención de 6- APA a partir de penicilina V. Se describe el método para llevar a cabo esta inmovilización y las condiciones de la reacción que hacen posible la hidrólisis de penicilina V catalizada por ECPVA.
Description
Procedimiento para la inmovilización de una nueva
penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae para la
obtención de ácido 6-aminopenicilánico.
La presente invención se encuadra dentro del
campo biotecnológico de la obtención de ácido
6-aminopenicilánico a partir de penicilinas
naturales, y más concretamente, a partir de penicilina V. La
invención se refiere a un nuevo método de inmovilización covalente
sobre Eupergit C de la penicilina V acilasa aislada de cultivos de
Streptomyces lavendulae.
Actualmente existe una amplia gama de penicilina
V acilasas imnovilizadas, de diversas fuentes microbianas, como se
refleja en la Tabla 1. Se puede afirmar que no se conocen
referencias relativas a la inmovilización de la penicilina V acilasa
de Streptomyces lavendulae.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline
Organismo productor \+ Método de inmovilización \+ Referencias
\\\hline\multicolumn{3}{|l|}{Bacterias:}\\\hline Escherichia
coli 5K \+ Atrapamiento en poliuretano \+ Klein, J., Kluge, M.
y Warner, F. \\ (pHM 12) \+ activado por grupos epóxido. \+
(1981). German Patent 2929872 .
\\\hline\multicolumn{3}{|l|}{Actinomicetos:}\\\hline Chainia
\+ Enzima semipurificada adsorbida \+ Chauhan, S., Nichkawade, A.,
\\ \+ en Kieselguhr más atrapamiento \+ Iyengar M.R.S. y
Chattoo, B.B. \\ \+ en gel de poliacrilamida. \+ (1998).
Current Microbiol . 37: \\ \+ \+
186-190. \\\hline Streptomyces griseus \+
Adsorción de la enzima en \+ Heuser, L.J., Chiang, R.C., Park, \\
\+ bentonita. \+ H., Anderson, F.C. y Milltown, \\ \+ \+ N.J.
(1969). USA Patent 3446705 \\\hline Streptomyces
noursei \+ Adsorción de la enzima en \+ Heuser, L.J.,
Chiang, R.C., Park, \\ \+ bentonita. \+ H., Anderson, F.C. y
Milltown, \\ \+ \+ N.J. (1969). USA Patent 3446705
\\\hline\multicolumn{3}{|l|}{Levaduras:}\\\hline Rhodotorula
glutinis \+ Atrapamiento de la enzima en \+ Vandamme, E.J. y
Voets, J.P. \\ \+ gel de poliacrilamida. \+ (1973). Z. Allg.
Microbiol . 13: \\ \+ \+ 701-710.
\\\hline\multicolumn{3}{|l|}{Hongos:}\\\hline Fusarium sp.
7.5-5 \+ Entrecruzamiento de la enzima \+
SivaRaman, C., Bheemeswar, B., \\ \+ en glutaraldehido. \+
Ramachandran, S. y Borkar, P.S. \\ \+ \+ (1976a). Indian
patent 139907 . \\\hline Fusarium sp.
7.5-5 \+ Unión covalente de la enzima \+
SivaRaman, C., Bheemeswar, B., \\ \+ en celulosa activada por \+
Ramachandran, S. y Borkar, P.S. \\ \+ bromuro de cianógeno. \+
(1976b). Indian patent 139908 \\\hline Fusarium sp.
\+ Adsorción y entrecruzamiento \+ Sudhakaran, V.K. y Shewale, \\
SKF 235 \+ de la enzima en Amberlita \+ J.G. (1993). Worl J.
Microbiol. \\ \+ CG-50. \+ Biotechnol.
9: 630-634. \\\hline Bovista plumbea
\+ Atrapamiento de la enzima \+ Brandl, E. y Knauseder, F. \\ NRRL
3501 \+ en fibras de acetato de celulosa \+ (1975). German
Patent 2503584 \\ \+ y gel de poliacrilamida. \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la imnovilización de una nueva penicilina V
acilasa de Streptomyces lavendulae para la obtención de ácido
6-aminopenicilánico (6-APA)
Concretamente esta invención permite la obtención industrial de
6-APA a partir de penicilina V mediante la
utilización de una nueva preparación de penicilina V acilasa
(penicilina amidohidrolasa, EC 3.5. 1.11) inmovilizada. Este
biocatalizador se ha preparado mediante la inmovilización covalente
de la penicilina V acilasa (PVA) de Streptomyces lavendulae
ATCC 13664 en el soporte comercial Eupergit C (Rhöm GmbH,
Kirschenallee, Alemania).
La PVA es producida por el actinomiceto
Streptomyces lavendulae ATCC 13664 según el protocolo
descrito por Torres et al., 1998 (Torres, R., de la Mata, I.,
Castillón, M.P., Arroyo, M., Torres, J., Acebal, C. (1998)
Purification and characterization of penicillin V acylase from
Streptomyces lavendulae. Progress in Biotechnology 15:
Stability and Stabilization of Biocatalysts, A. Ballesteros,
F.J. Plou, J.L. Iborra y P.J. Halling Eds. Elsevier. Amsterdam, pp.
719-724.), parcialmente purificada por precipitación
con acetona y posteriormente liofilizada.
La inmovilización de la PVA se realiza sobre
Eupergit C, un soporte constituido por un copolímero de
metacrilamida,
N,N'-metilen-bis-metacrilamida
y grupos oxirano. La enzima se une covalentemente al soporte a
través de sus grupos epóxido (grupos oxirano).
Este nuevo biocatalizador permite una notable
mejora de la estabilidad de la enzima frente a la temperatura y el
pH. A su vez, posibilita su reutilización lo que supone una ventaja
económica a la hora de llevar a cabo reacciones industriales de
obtención de 6-APA.
Se ha considerado una unidad de actividad (UI)
como los \mumoles de ácido 6-aminopenicilánico
producidos en un minuto a 40ºC y pH 9,5 y valorados
espectofotométricamente por reacción con
p-dimetil-aminobenzaldehido (método
del PDAB) según las especificaciones de Balasingham, K., Warburton,
D., Dunnill, P. y Lilly, H.D. (The isolation and kinetics of
penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys.
Acta. 1972, 276, 250-256).
El preparado inmovilizado de PVA en Eupergit C ha
mostrado una importante mejora en sus características cinéticas tras
un tratamiento con seroalbúmina bovina (BSA), posterior a la unión
de la enzima. Este tratamiento ha permitido incrementar la actividad
del derivado inmovilizado en un 60% con respecto a la que presenta
antes de la modificación con BSA.
El nuevo derivado inmovilizado de penicilina V
acilasa en Eupergit C, modificado con BSA, se ha denominado
ECPVA.
Si comparamos esta preparación inmovilizada de la
PVA con otras descritas anteriormente, nuestra invención presenta
una serie de ventajas: la K_{m(ap)} (7,64 mM) más baja de
las descritas en la bibliografía, una V_{máx(ap)} de 0,393
UI/g derivado y un rendimiento del 80% de hidrólisis de penicilina V
(5 mM) a 6-APA después de una hora de reacción.
ECPVA presenta además la máxima actividad en el
intervalo de pH 9,5-10,5 y de temperatura
40-45ºC, lo que permite su óptima utilización
industrial en la obtención de 6-APA a partir de
penicilina V.
En las condiciones óptimas de ensayo establecidas
(pH 9,5 y 40ºC), ECPVA presenta una vida media de 304 horas,
mientras que incrementa su estabilidad considerablemente a 40ºC y pH
7, aumentando su vida media hasta al menos 1150 horas.
Finalmente, ECPVA se puede utilizar en sucesivas
reacciones de 1 hora durante al menos 50 ciclos, conservando el 100%
del rendimiento exhibido en el primer ciclo de actividad.
El procedimiento para la inmovilización de una
nueva penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae para la
obtención de ácido 6-aminopenicilánico, objeto de la
invención, se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos,
los cuales no son limitativos de su alcance.
Este ejemplo hace referencia al método de
inmovilización de la PVA de Streptomyces lavendulae ATCC
13664 en el soporte Eupergit C.
Se disuelven 4,59 UI de liofilizado de PVA en
tampón fosfato potásico 0.1 M pH 8 en un volumen final de 5 ml. A
esta disolución, se le añade ácido fenoxiacético (inhibidor
competitivo de la penicilina V acilasa) a una concentración 30 mM
con el fin de evitar la posible unión de la enzima al soporte por su
centro activo durante la inmovilización.
Se mantiene durante 5 minutos la disolución
enzimática en presencia de ácido fenoxiacético, y posteriormente se
añade 1 gramo de Eupergit C seco. La mezcla se incuba, con agitación
en vaivén y a temperatura ambiente, en un matraz erlenmeyer de 25
ml.
Tras 24 horas, se obtiene 3,6 gramos de derivado
inmovilizado húmedo de PVA en Eupergit C. A continuación, se lava 2
veces con 40 ml de agua destilada y otras 2 veces con 40 ml de
tampón fosfato potásico 0,1 M y pH 8.
Hace referencia a los métodos empleados para
determinar la eficacia de la unión de la penicilina V acilasa al
soporte Eupergit C.
La eficacia de unión de la enzima al soporte se
determina valorando la presencia de proteína por el método de
Bradford (Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Anal
Biotech. 1976, 72, 248-245) y de
actividad enzimática (método del PDAB) en cada uno de los lavados
del derivado inmovilizado. La finalidad es comprobar que toda la
enzima que se ha puesto en contacto con el soporte ha quedado unida
a él.
El resultado de la inmovilización muestra que el
100% de la PVA queda unida al Eupergit C.
El ejemplo nos muestra las condiciones de
reacción en la hidrólisis de la penicilina V a ácido
6-aminopenicilánico catalizada por el derivado
inmovilizado de penicilina V acilasa en Eupergit C.
Las condiciones son las siguientes:
- 1.
- 0,36 gramos de derivado por cada mililitro de volumen de reacción.
- 2.
- Tampón: fosfato-citrato-borato (1:1:1) 0,1 M pH 9,5
- 3.
- Temperatura: 40ºC
- 4.
- Agitación orbital: 190 r.p.m.
El seguimiento de la hidrólisis de la penicilina
V se lleva a cabo valorando la cantidad de ácido
6-aminopenicilánico producido, para lo cual se toman
alícuotas de 50 \mul y se diluyen con 0,25 ml de agua destilada,
para posteriormente añadir 0,9 ml de ácido acético al 20% (v/v). El
6-APA producido se valora mediante el método del
PDAB.
El derivado inmovilizado según el ejemplo 1
muestra una actividad de 0,245 UI/g de derivado inmovilizado. El
rendimiento de la reacción de hidrólisis de penicilina V (5 mM)
catalizada por este derivado es de un 76% tras una hora de
reacción.
Se describe la modificación del derivado
inmovilizado de PVA en Eupergit C, para dar lugar al biocatalizador
ECPVA.
Tras la unión de la enzima al soporte, todavía
quedan en el Eupergit C grupos oxirano sin reaccionar. Mediante un
tratamiento con seroalbúmina bovina (BSA), proteína que contiene
muchos residuos de lisina, se consigue neutralizar la matriz al
reaccionar los grupos amino de estos aminoácidos con los grupos
oxirano que no han reaccionado.
Esta modificación se lleva a cabo de la siguiente
manera:
- 1.
- 3,6 gramos del derivado preparado según el ejemplo 1 se incuban con 5 ml de una solución 5 mg/ml de BSA durante 25 horas a temperatura ambiente y agitación en vaivén.
- 2.
- Tras la incubación, con el fin de eliminar el exceso de seroalbúmina bovina, y así evitar posibles interferencias con la reacción de hidrólisis, el derivado se lava siguiendo el protocolo anteriormente descrito.
Se obtiene de esta forma un derivado imnovilizado
de PVA modificado con BSA, al que denominamos ECPVA.
Hace referencia a como se analiza si la
modificación con BSA produce algún cambio en la eficacia de la unión
de la PVA al Eupergit C. El método a seguir es el mismo que el
expuesto en el ejemplo 2.
Los resultados obtenidos de este análisis
muestran que el 100% de la PVA sigue unida al soporte.
Hace referencia a cuales son las condiciones de
ensayo utilizadas en la hidrólisis de penicilina V catalizada por
ECPVA. Tiene lugar en un reactor en discontinuo, con las condiciones
siguientes:
\newpage
- 1.
- 0,36 gramos de derivado por cada mililitro de volumen de reacción.
- 2.
- Tampón: fosfato-citrato-borato (1:1:1) 0,1 M pH 9,5
- 3.
- Temperatura: 40ºC
- 4.
- Agitación orbital: 190 r.p.m.
El seguimiento de la hidrólisis de la penicilina
V catalizada por el ECPVA se lleva a cabo igual que como se indicó
en el ejemplo 3.
El derivado inmovilizado y modificado (ECPVA)
muestra una actividad de 0,393 UI/g de derivado. El rendimiento de
la reacción de hidrólisis de penicilina V (5 mM) catalizada por
ECPVA alcanza un 80% tras una hora de reacción.
Claims (5)
1. Procedimiento para la inmovilización de una
penicilina V acilasa para la obtención de ácido
6-amino penicilánico (6-APA) a
partir de penicilina V, caracterizado por emplear un método
de inmovilización covalente de la enzima en el soporte comercial
EUPERGIT C, y posterior modificación del soporte con un tratamiento
con seroalbúmina bovina.
2. Procedimiento para la obtención de
6-APA mediante la hidrólisis de penicilina V
catalizada por la penicilina V acilasa, inmovilizada según la
reivindicación 1, en las siguientes condiciones:
- a)
- una concentración de penicilina V de 5 mM;
- b)
- un valor de pH comprendido entre 9,5 y 10,5;
- c)
- una temperatura comprendida entre 40 y 45°C.
3. Procedimiento para la obtención de
6-APA, según la reivindicación 2,
caracterizado por obtener un rendimiento del 80% de
hidrólisis de penicilina V después de una hora de reacción.
4. Procedimiento para la obtención de
6-APA, según las reivindicaciones 2 y 3, donde el
biocatalizador descrito en la reivindicación 1 puede ser utilizado
en sucesivas reacciones de una hora durante al menos 50 ciclos,
conservando el 100% de rendimiento exhibido en el primer ciclo de
actividad.
5. Procedimiento para la inmovilización de la
penicilina V acilasa aislada de cultivos de Streptomyces
lavendulae y preferentemente de Streptomyces lavendulae
ATCC 13664, según la reivindicación 1, y su posterior utilización en
la obtención de 6-APA según las reivindicaciones 2,
3 y 4.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| ES009902332A ES2163997B2 (es) | 1999-10-22 | 1999-10-22 | Procedimiento para la inmovilizacion de una nueva penicilina v acilasa de "streptomyces lavendulae" para la obtencion de acido 6-aminopenicilanico. |
| PCT/ES2000/000408 WO2001029202A1 (es) | 1999-10-22 | 2000-10-23 | Procedimiento para la inmovilizacion de una nueva penicilina v acilasa de streptomyces lavendulae par la obtencion de acido 6-aminopenicilanico |
| AU10308/01A AU1030801A (en) | 1999-10-22 | 2000-10-23 | Method for immobilizing a novel penicillin v acylase of streptomyces lavendulae for obtaining 6-amino penicillanic acid |
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|---|---|---|---|---|
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1999
- 1999-10-22 ES ES009902332A patent/ES2163997B2/es not_active Expired - Fee Related
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2000
- 2000-10-23 AU AU10308/01A patent/AU1030801A/en not_active Abandoned
- 2000-10-23 WO PCT/ES2000/000408 patent/WO2001029202A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BALDARO, E. et al. "Pen G acylase catalized resolution of phenylacetate esters of secondary alcohols". TETRAHEDRON: ASYMMETRY. Vol. 4, nº 5, 1993, páginas 1031-1034, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| ES2163997A1 (es) | 2002-02-01 |
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