EP4747672A1 - Dispositif de création d'un champ évanescent - Google Patents

Abstract

Dispositif (1, 1A, 1B, 1C, 1D) de création d'un champ évanescent (3) à la surface d'un dioptre (4) séparant deux milieux d'indices de réfraction différents, comprenant : - une source de lumière (6A, 6B, 6C, 6D), - un objectif (9A, 9B, 9C, 9D) comprenant un plan focal objet positionné à la surface du dioptre, et un plan pupille (PP) comprenant une région sous- critique (R2) et une région supercritique (R1), - un moyen optique actif (7A,7B, 70, 7D) comprenant une surface active (10A, 10B, 10C, 10D) s'étendant au moins dans l'ensemble de la région supercritique (R1 ') d'un plan conjugué du plan pupille ou s'étendant dans un plan conjugué du plan focal objet de l'objectif, le moyen optique actif comprenant un ensemble de microéléments contrôlables individuellement configurés pour illuminer l'ensemble de la région supercritique de l'objectif.

Description

DESCRIPTION

Dispositif de création d’un champ évanescent

Domaine Technique de l'invention

L’invention concerne un dispositif de création d’un champ évanescent à la surface d’un dioptre séparant deux milieux d’indices de réfraction différents. L’invention porte aussi sur un procédé d'utilisation d'un tel dispositif.

Etat de la technique antérieure

La microscopie de fluorescence est une technique utilisant un dispositif optique tirant profit du phénomène de fluorescence, au lieu de, ou en plus de l'observation classique par réflexion ou transmission de la lumière visible naturelle ou artificielle. Cette technique permet d'observer divers objets, substances (organiques ou inorganiques), notamment des cellules vivantes. Cette technique permet également d'exciter des molécules photosensibles dans des objets biologiques. Il est souhaitable de localiser l’excitation dans les trois directions de l’espace, de manière à atteindre une zone très précise de l'objet à observer. Une telle excitation est particulièrement recherchée pour l’activation opto-génétique de protéines susceptibles de rejoindre la membrane basale de cellules vivantes.

On connaît plusieurs types de microscopes de fluorescence parmi lesquels les microscopes de fluorescence par réflexion totale interne (couramment dénommés selon l'anglicisme TIRFM). Ces microscopes sont configurés pour illuminer l'ensemble du champ de vue d'un objectif avec une onde excitatrice évanescente de structure transversale homogène ou périodique. Une onde évanescente, ou autrement dit un champ évanescent, est obtenue en éclairant la région supercritique du plan pupille d'un objectif à grande ouverture numérique. On parvient ainsi à projeter une onde excitatrice sur un dioptre plan séparant deux milieux d’indices de réfraction différents avec un angle dont l'incidence est supérieure ou égale à la valeur de l'angle critique définie par ces deux indices de réfraction. L'onde excitatrice subit ainsi une réflexion interne totale et provoque l'apparition d'une onde évanescente à la surface du dioptre. Cette onde évanescente interagit avec la surface de l'objet à observer sur une profondeur très limitée, par exemple de l'ordre d'une centaine de nanomètres. Ce type de microscope comporte principalement trois variantes.

La première approche, qui est également la plus simple et la plus courante, consiste à focaliser un faisceau laser excitateur en un spot unique de la région supercritique du plan pupille de l'objectif. On génère ainsi une onde évanescente homogène à la surface du dioptre. Le document EP3969954A1 divulgue par exemple un dispositif de création d'un champ évanescent basé sur cette approche. Cette configuration simple possède toutefois l’inconvénient d’un éclairement anisotrope selon une direction prédéfinie par la position du spot unique dans la région supercritique, ce qui est dommageable pour la qualité de l’imagerie.

Une deuxième approche consiste à positionner successivement un spot laser en différents points de la région supercritique du plan pupille de l'objectif et à moyenner les images de fluorescence correspondantes. On peut ainsi obtenir une meilleure homogénéité de l'illumination du dioptre. Cette deuxième approche est généralement désignée par le nom générique "azimuthal beam spinning". Pour déplacer séquentiellement le spot laser dans le plan pupille un système de scanners galvanométriques peut être utilisé. Alternativement, on peut utiliser une matrice de micromiroirs (couramment dénommé par l'anglicisme DMD) qui est optiquement conjugué au plan focal objet de l'objectif de manière à ce que celui-ci soit éclairé de façon uniforme. Une troisième approche consiste à modifier la configuration TIRFM classique par analogie avec la microscopie par illumination structurée (SIM). Pour ce faire, un faisceau laser incident est séparé en deux de façon à générer simultanément, par l’intermédiaire d’un modulateur spatial de lumière (couramment dénommé par l'anglicisme SLM) à cristaux liquides ou d'une matrice de micro-miroirs, deux spots diamétralement opposés dans le plan pupille de l’objectif. Le plan focal objet reste éclairé sur l’ensemble du champ de vue de l'objectif. Les deux ondes évanescentes correspondantes interfèrent dans le plan focal objet, donnant lieu à un système de franges utilisé comme porteuse pour accéder à des fréquences spatiales de l’échantillon deux fois plus grandes que celles découlant de l’ouverture numérique de l’objectif.

Les microscopes de fluorescence par réflexion totale interne connus de l'état de la technique présentent tous des inconvénients. En particulier, ils ne permettent pas d'obtenir un éclairement à la fois isotrope et présentant une grande résolution spatiale dans le plan transverse, c'est à dire dans le plan du dioptre. En effet, l’onde évanescente générée par des dispositifs connus illumine un objet à observer sur une surface de plusieurs dizaines à quelques centaines de micromètres d’extension latérale, ce qui ne répond pas au besoin de précision de l’excitation dans le plan transverse. D'un point de vue pratique, les microscopes de fluorescence par réflexion totale interne connus de l'état de la technique ne permettent pas d'éclairer sélectivement des zones très bien définies d'un objet à observer, telle qu'une partie de la membrane basale d’une cellule vivante.

Présentation de l'invention

Le but de l’invention est de fournir un dispositif de création d’un champ évanescent et un procédé d'utilisation d'un tel dispositif remédiant aux inconvénients ci-dessus et améliorant les dispositifs et procédés connus de l’art antérieur.

Plus précisément, un premier objet de l’invention est un dispositif de création d’un champ évanescent permettant d'obtenir un motif de forme et de position prédéterminée, uniformément éclairé, et avec une très haute résolution spatiale, notamment de l'ordre du micromètre.

Résumé de l'invention

L'invention se rapporte à un dispositif de création d’un champ évanescent à la surface d’un dioptre séparant deux milieux d’indices de réfraction différents, le dispositif comprenant :

- une source de lumière,

- un objectif comprenant un plan focal objet positionné à la surface du dioptre, et un plan pupille comprenant une région sous-critique et une région supercritique,

- un moyen optique actif configuré pour moduler l'amplitude et/ou la phase de rayons lumineux émis par la source de lumière, le moyen optique actif comprenant une surface active s'étendant au moins dans l'ensemble de la région supercritique d'un plan conjugué du plan pupille ou s'étendant dans un plan conjugué du plan focal objet de l'objectif, le moyen optique actif comprenant un ensemble de microéléments contrôlables individuellement configurés pour illuminer l'ensemble de la région supercritique de l'objectif, et

- un moyen de contrôle de chaque microéléments configuré de sorte à produire un motif lumineux de forme prédéfinie dans le plan focal objet de l'objectif.

Selon un mode de réalisation, le moyen optique actif comprend un modulateur spatial de lumière à cristaux liquides ou une matrice de micro- miroirs.

Selon un mode de réalisation, la source de lumière est une source de lumière cohérente, notamment une source de lumière laser, et la surface active s'étend au moins dans l'ensemble de la région supercritique d'un plan conjugué du plan pupille.

Selon un mode de réalisation, le moyen optique actif comprend un modulateur spatial de lumière à cristaux liquides, et le dispositif comprend un masque optique s'étendant dans l'ensemble de la région sous-critique d'un plan conjugué du plan pupille.

Selon un mode de réalisation, le moyen optique actif comprend une matrice de micro-miroirs, la matrice de micro-miroirs s'étendant dans l'ensemble de la région supercritique et dans l'ensemble de la région sous- critique du plan conjugué du plan pupille, chaque micro-miroir de la région sous-critique du plan conjugué du plan pupille étant contrôlé de sorte à dévier les rayons lumineux hors de l'objectif.

Selon un mode de réalisation, la surface active s'étend dans un plan conjugué du plan focal objet, le moyen de contrôle étant configuré de sorte à reproduire ledit motif de forme prédéfinie directement sur la surface active du moyen optique actif, le dispositif comprenant en outre un masque optique s'étendant dans l'ensemble de la région sous-critique d'un plan conjugué du plan pupille.

Selon un mode de réalisation, la source de lumière est une source de lumière incohérente, notamment une diode électroluminescente, le moyen de contrôle étant configuré de sorte à reproduire l'ensemble dudit motif de forme prédéfinie directement sur la surface active du moyen optique actif. Selon un mode de réalisation, la source de lumière est une source de lumière cohérente, notamment un laser, et le moyen optique actif est contrôlé de sorte à moduler la phase et/ou l'amplitude d'un front d'onde réfléchi par la surface active par holographie.

Selon un mode de réalisation, le dispositif comprend au moins un masque configuré pour masquer un motif d'ordre de diffraction 0.

L'invention se rapporte également à un procédé de fonctionnement d'un dispositif tel que défini précédemment, le procédé comprenant :

- la mise en place d'un objet, notamment une cellule vivante, à observer sur un support transparent, l'objet et le support présentant des indices de réfraction différents, puis

- la définition de la forme et de la position d'une zone de l'objet à exciter avec un champ évanescent, puis

- le contrôle de chaque microéléments du moyen optique actif du dispositif de sorte à illuminer simultanément l'ensemble de la région supercritique de l'objectif, et de sorte à produire un motif lumineux dans le plan focal objet de l'objectif, la résolution spatiale dudit motif lumineux dans le plan focal objet étant limitée par diffraction, la forme et la position dudit motif lumineux correspondant à la zone à exciter prédéfinie.

Selon un mode de réalisation, le motif lumineux est formé par le balayage d'un spot lumineux dans le plan focal objet de l'objectif, l'ensemble de la région supercritique de l'objectif étant illuminée à chaque instant.

La définition de la forme et de la position d'une zone de l'objet à exciter avec un champ évanescent peut comprendre :

- une observation préalable de l’objet à exciter, puis

- l’identification du contour d’une zone de l’objet à exciter sur la base de l’observation préalable.

L’identification du contour d’une zone de l’objet à exciter peut être réalisée manuellement au moyen d’une interface homme-machine.

Le procédé de fonctionnement peut comprendre un calcul itératif, par exemple de type Gerchberg-Saxton, d’au moins une configuration de la surface active permettant de former ledit motif lumineux dans le plan focal objet de l'objectif.

Le procédé de fonctionnement peut comprendre le calcul d’une première configuration et d’au moins une deuxième configuration de la surface active, chaque configuration de la surface active étant calculée de sorte à obtenir le même motif lumineux, les motifs lumineux obtenus avec la première configuration et avec l’au moins une deuxième configuration comprenant une même forme et un même position mais une répartition de luminosité différente, et en ce que chaque microéléments du moyen optique actif est contrôlé successivement selon la première configuration puis selon l’au moins une deuxième configuration.

Présentation des figures

Ces objets, caractéristiques et avantages de la présente invention seront exposés en détail dans la description suivante de différents modes de réalisation particuliers en relation avec les figures jointes parmi lesquelles:

La figure 1 est une vue schématique en coupe d'une cellule vivante excitée par une onde évanescente générée par un dispositif de création d’un champ évanescent selon un mode de réalisation de l'invention.

La figure 2 est une vue schématique d'un dispositif de création d’un champ évanescent selon un premier mode de réalisation de l'invention. La figure 3 est une vue schématique en coupe d'un moyen optique actif du dispositif de la figure 2.

La figure 4 est une vue schématique de face d'une surface active du moyen optique actif de la figure 3.

La figure 5 est une vue schématique du plan pupille d'un objectif du dispositif de la figure 2.

La figure 6 est une vue schématique d'un dispositif de création d’un champ évanescent selon un deuxième mode de réalisation de l'invention.

La figure 7 est une vue isométrique de deux microéléments contrôlables individuellement d'un moyen optique actif possible du dispositif de la figure 6.

La figure 8 est une vue schématique de face d'une surface active du moyen optique actif de la figure 6.

La figure 9 est une vue schématique du plan pupille d'un objectif du dispositif de la figure 6.

La figure 10 est une vue schématique d'un dispositif de création d’un champ évanescent selon un troisième mode de réalisation de l'invention.

La figure 11 est une vue schématique d'un dispositif de création d’un champ évanescent selon un quatrième mode de réalisation de l'invention.

Description détaillée

La figure 1 illustre schématiquement une cellule C vivante dont la membrane basale est destinée à être excitée par une onde évanescente générée par un dispositif de création d’un champ évanescent 1 selon un mode de réalisation de l'invention. La cellule C comprend notamment un noyau N et diverses protéines P1 , P2. La cellule repose sur un support 2 transparent s'étendant parallèlement à un plan, dit plan transverse, défini par deux axes X et Y. Le support 2 peut être par exemple une lamelle de verre. On définit l'axe Z comme l'axe perpendiculaire au plan dans lequel le support 2 s'étend. L'axe Z est parallèle à l'axe vertical. Le plan transverse est un plan horizontal. Parmi les protéines de la cellule C, un groupe de protéines P1 se situe dans une zone bien délimitée d'une membrane basale M de la cellule C en contact avec le support 2. Comme nous allons l'expliquer, le dispositif de création d’un champ évanescent 1 , plus simplement dénommé dispositif 1 par la suite, est destiné à générer un champ évanescent 3, ou autrement dit une onde évanescente, apte à exciter uniquement le groupe de protéines P1 , sans exciter les autres protéines P2 de la cellule. Le champ évanescent 3 généré par le dispositif 1 présente une très haute résolution dans les trois dimensions de l'espace : en tant que champ évanescent, il interagit avec la cellule C sur une très faible profondeur suivant l'axe Z. De plus, le champ évanescent 3 possède également un très faible étalement dans le plan transverse. Le champ évanescent peut exciter une zone de la cellule présentant un diamètre D dans le plan transverse inférieur ou égal à 1 pm, voire inférieur ou égal à 500nm, voire même inférieur ou égal à 200nm.

Le support 2 comprend un premier indice de réfraction n1 et l'objet à observer, en l'espèce la cellule C, comprend un deuxième indice de réfraction n2 différent du premier indice de réfraction n1 . Le premier indice de réfraction n1 peut être sensiblement égal à l'indice de réfraction du verre et le deuxième indice de réfraction n2 peut être sensiblement égal à l'indice de réfraction de l'eau. Un dioptre 4, s'étendant dans un plan, peut être défini comme la surface séparant le support 2 de la cellule C et de son milieu. Le dioptre 4 s'étend donc dans un plan parallèle aux axes X et Y. Un angle critique A1 peut être défini par la formule : A1 = arcsin (n1/n2). Lorsque le dioptre 4 est illuminé par un champ incident 5 présentant un angle d'incidence A2 supérieur ou égal à l'angle critique A1 , il se produit un phénomène de réflexion totale : ce champ propagatif est entièrement réfléchi et un champ évanescent 3 est produit. Le champ évanescent 3 interagit avec la surface de la cellule C sur une profondeur très limitée, par exemple de l'ordre d'une centaine de nanomètres.

Le dispositif 1 peut être utilisé pour observer et/ou exciter une cellule, et plus généralement tout type d'objet. Dans la suite de la description, cet objet est désigné par le terme "objet à observer" bien que celui-ci puisse aussi, ou même exclusivement, être destiné à être excité par le champ évanescent 3.

Un tel champ évanescent 3 est donc obtenu au moyen d'un dispositif 1 selon l'invention. Plusieurs modes de réalisation du dispositif 1 sont envisagés. En particulier, quatre modes de réalisation sont illustrés respectivement sur les figures 2, 6, 10 et 11 et vont être successivement décrits. Afin de faciliter la lecture, on utilise respectivement les suffixes A, B, C et D pour décrire des éléments identiques ou similaires appartenant respectivement au premier mode de réalisation, au deuxième mode de réalisation, au troisième mode de réalisation, et au quatrième mode de réalisation. Les caractéristiques d'un élément ou de son agencement décrites dans le cadre d'un mode de réalisation particulier pourront être transposées aux autres modes de réalisation. Pour simplifier la description, on s'attachera principalement à décrire les différences du deuxième, du troisième et du quatrième mode de réalisation sans répéter leurs caractéristiques communes.

La figure 2 illustre donc un dispositif de création d’un champ évanescent 1A selon un premier mode de réalisation de l'invention. Le dispositif 1A comprend une source de lumière 6A, un moyen optique actif 7A, un moyen de contrôle 8A du moyen optique actif 7A, et un objectif 9A.

Selon ce premier mode de réalisation, la source de lumière 6A est une source de lumière cohérente telle qu'une source de lumière laser. La longueur de cohérence temporelle de la source de lumière est de préférence d'au moins quelques centimètres. La source de lumière 6A est agencée de sorte à illuminer le moyen optique actif 7 A. Le moyen optique actif 7A est configuré pour réfléchir des rayons lumineux issus de la source de lumière 6A vers l'objectif 9A.

Le moyen optique actif 7A est configuré pour moduler la phase de rayons lumineux émis par la source de lumière 6A. A cet effet, le moyen optique actif 7A comprend un ensemble de microéléments 15A contrôlables individuellement. Chaque microélément 15A forme un pixel d'une image projetée par le moyen optique actif 7A. Ces microéléments 15A s'étendent selon une surface active 10A du moyen optique actif 7A.

Plus précisément, le moyen optique actif 7A est de préférence un modulateur spatial de lumière à cristaux liquides. Un modulateur spatial de lumière est un appareil programmable électroniquement qui peut moduler une sortie de lumière sur la base d'un motif spatial fixe spécifique, projetant essentiellement de la lumière qui est contrôlée, soit uniquement en amplitude, soit uniquement, en phase. Un tel moyen optique actif comprend notamment un écran à cristaux liquides. Chaque microélément 15A du modulateur spatial de lumière correspond à une zone du modulateur spatial de lumière dont les cristaux liquides peuvent être orientés spécifiquement, en fonction d'un champ électrique appliqué à cette zone. Dans ce premier mode de réalisation, le modulateur spatial de lumière est configuré pour moduler la phase d'un faisceau lumineux au niveau de chaque microélément.

La figure 3 illustre schématiquement le fonctionnement du modulateur de spatial de lumière. Sur la partie gauche de la figure 3, on a représenté une onde incidente 01 en direction de la surface active 10A. Cette onde 01 est plane et incidente selon une direction parallèle à un axe optique ZO. La phase est constante en tout point du front d'onde. Sur la partie droite de la figure 3, on a représenté une onde réfléchie 02 par la surface active 10A. Le front d'onde réfléchi 02 n'est plus plan mais, au contraire, est localement déformé en fonction de la configuration du microélément 15A sur laquelle l'onde 01 s'est réfléchie, c’est-à-dire en fonction de l'orientation locale des cristaux liquides.

L'objectif 9A est un élément optique destiné à focaliser des rayons lumineux incidents sur la surface du dioptre 4. L’objectif 9A est de préférence un composant préassemblé et non modifiable. L'objectif peut être un objectif à immersion à l’huile pour que son indice de réfraction n soit le plus proche possible de l'indice de réfraction n1 du support 2, lequel est de préférence en verre.

Le dioptre 4 s'étend dans un plan confondu avec un focal objet de l'objectif 9A. Autrement dit, le plan focal objet de l'objectif 9A est positionné à la surface du dioptre 4.

L'objectif 9A comprend des composants optiques aptes à focaliser des rayons lumineux dans le plan focal objet de l'objectif avec un angle d'incidence supérieur ou égal à l'angle critique A1 .

On peut définir l'axe optique ZO comme l'axe parallèle à l'axe Z passant par un centre de l'objectif 9A. La surface active 10A du moyen optique actif 7 A peut être orientée de sorte à ce que les rayons lumineux qu'elle renvoie soient globalement orientés parallèlement à l'axe optique ZO.

Des composants optiques tels que des lentilles optiques peuvent être interposées entre le moyen optique actif 7A et l'objectif 9A. En l'espèce, le dispositif 1 A comprend une première lentille 11A et une deuxième lentille 12A interposées entre le moyen optique actif 7A et l'objectif 9A. Les lentilles 11A et 12A peuvent être des lentilles convergentes. Elles peuvent également s'étendre perpendiculairement à l'axe optique Z0 et être centrées sur l'axe optique Z0. La première lentille 11A et la deuxième lentille 12A ont respectivement des distances focales f1 et f2. La surface active 10A s'étend dans plan focal objet de la première lentille 11A. Un plan focal image PF1 de la première lentille 11 A est confondu avec un plan focal objet de la deuxième lentille 12A. Un plan focal image de la deuxième lentille 12A est confondu avec un plan pupille PP de l'objectif 9A.

Le plan pupille PP de l'objectif est confondu avec le plan de Fourier de l’objectif. Ainsi, ce plan peut être indistinctement appelé plan pupille ou plan de Fourier.

En remarque, on appelle pupille (sous-entendu, pupille d’entrée) de l’objectif d'un microscope, l’ouverture l’arrière de l’objectif, située du côté opposé à l’échantillon. Par définition, cette pupille est l’image du diaphragme d’ouverture (à travers les optiques se trouvant à l’arrière celui- ci), le plus bloquant vis à vis de l’inclinaison des rayons lumineux reçus par l’objectif (du côté de l'objet à observer).

Le diamètre D de la pupille d’entrée est donné par la formule suivante :

D = 2 x ON x FIM où :

- ON est l’ouverture numérique de l’objectif.

- FIM est sa distance focale image.

L'ouverture numérique ON peut être donnée par la formule suivante :

ON = n x sin(0), où :

- n est l’indice de réfraction du milieu d’immersion de l’objectif

- 0 est l’angle du rayon le plus incliné accepté par le diaphragme d’ouverture.

L’indice de réfraction n2 de l’objet à observer est inférieur à l’ouverture numérique ON. Ainsi, il existe dans la partie centrale de la pupille d’entrée de l’objectif une région sous-critique qui correspond à des rayons se propageant dans l'objet à observer. Inversement, les rayons qui passent dans la zone périphérique de la pupille d’entrée, appelée région supercritique, ne peuvent pas se propager dans l'objet à observer.

Les objectifs de microscope sont aujourd’hui conçus de sorte que la pupille d’entrée se trouve dans le plan focal arrière de l’objectif, c’est-à-dire dans le plan de Fourier de l'objectif. De plus, ces objectifs sont appelés "à l’infini" ou "corrigés à l'infini", car ils donnent une image à l’infini de l’objet, de sorte qu’une image réelle est produite lorsqu’ils sont associés à une lentille dite de tube. Dans la description de la présente invention, il est uniquement fait référence à un objectif à l’infini. La lentille de tube n’intervient nulle part en tant que telle.

Le plan focal objet de la première lentille 11 A, lequel est confondu avec le plan dans lequel la surface active 10A s'étend, est un plan conjugué du plan pupille PP. Autrement dit, tout point du plan pupille PP de l'objectif 9A possède une image dans le plan dans lequel la surface active 10A s'étend.

En variante, le dispositif optique pourrait être plus complexe et comprendre notamment davantage de lentilles et/ou des moyens de réflexions tels que des miroirs. Dans des versions plus complexes du dispositif, plusieurs plans conjugués du plan pupille pourraient être définis.

Comme expliqué précédemment, le plan pupille PP de l'objectif 9A peut être séparé en deux régions complémentaires : une région supercritique R1 et une région sous-critique R2. La région supercritique R1 correspond à la partie du plan pupille PP dans laquelle des rayons incidents sont focalisés par l'objectif 9A avec un angle d'incidence supérieur ou égal à l'angle critique A1. La région sous-critique R2 correspond à la partie du plan pupille PP dans laquelle des rayons incidents sont focalisés par l'objectif 9A avec un angle d'incidence strictement inférieur à l'angle critique A1.

La région sous-critique R2 a la forme d'un disque centré sur l'axe optique Z0. La région supercritique R1 à une forme annulaire s'étendant autour de la région sous-critique R2. On comprend donc que les dimensions précises de la région sous-critique R2 et de la région supercritique R1 dépendent des indices de réfraction du support 2 et de l'objet à observer ainsi que de la distance focale FIM de l’objectif et de son ouverture numérique ON.

Comme la surface active 10A s'étend dans un plan conjugué du plan pupille, on peut également définir une région supercritique R1' et une région sous-critique R2' dans ce plan conjugué. La région supercritique R1 ' et la région sous-critique R2' peuvent présenter des formes homothétiques respectivement à la région supercritique R1 et à la région sous-critique R2. La surface active 10A s'étend au moins dans l'ensemble de la région supercritique R1 ' du plan conjugué du plan pupille PP.

La surface active 10A peut également s'étendre dans la région sous- critique R2'. Néanmoins, afin d'obtenir une onde évanescente à la surface du dioptre 4, il est nécessaire qu'aucun rayon lumineux n'illumine le dioptre 4 avec un angle d'incidence strictement inférieur à l'angle critique A1 . C'est pourquoi le dispositif 1A est configuré pour n'émettre aucun rayon lumineux dans la région sous-critique R2 du plan pupille PP. Pour ce faire, le moyen optique actif 7A peut être contrôlé de sorte que les rayons lumineux en provenance de la source de lumière 6A incidents au niveau de la région sous-critique R2' soient réfléchis hors d'un chemin optique dirigé vers l'objectif 9A. Alternativement, on peut aussi prévoir un masque 13A optique s'étendant dans l'ensemble de la région sous-critique d'un plan conjugué du plan pupille. Le masque 13A peut s'étendre dans le plan dans lequel la surface active 10A s'étend, ou dans tout autre plan conjugué du plan pupille, voire même directement dans le plan pupille PP. Toutefois, l'intégration du masque 13A directement dans le plan pupille PP peut être difficile à réaliser et nécessiterait une modification opto-mécanique de l'objectif. Dans tous les cas, le masque 13A empêche tout rayon lumineux d'atteindre la région sous-critique R2 du plan pupille, et donc la formation d'une onde propagative à la surface du dioptre 4.

Selon l'invention, pour obtenir un motif de forme prédéfinie à la surface du dioptre 4, on contrôle le moyen optique actif 7A de manière à éclairer l'ensemble de la zone supercritique R1 de l'objectif. Ainsi, l'ensemble de l'anneau formant la zone supercritique R1 reçoit des rayons lumineux, et non uniquement un point ou une zone de cet anneau. On comprend donc que le dispositif 1A est configuré pour illuminer l'ensemble de la région supercritique R1 de l'objectif, et non une partie seulement de cette région supercritique. Aucun élément du dispositif 1A ne peut empêcher l’illumination de l’ensemble de la région supercritique R1 de l'objectif.

Le moyen de contrôle 8A est configuré pour contrôler individuellement chaque microélément du moyen optique actif 7A qui s'étend dans la région supercritique RT. Le moyen de contrôle 8A est ainsi configuré pour modifier la phase d'un front d'onde dans l'ensemble de la région supercritique RT.

Le moyen de contrôle 8A peut notamment comprendre un ordinateur pourvu d'une interface homme-machine. Le moyen de contrôle 8A est programmé de sorte à produire un motif lumineux ML de forme prédéfinie dans le plan focal objet de l'objectif, c’est-à-dire à la surface du dioptre 4. De manière classique, l’ordinateur peut comprendre des moyens de visualisation tels qu’un écran et des moyens de commande tels qu’un clavier et une souris d’ordinateur. Les moyens de visualisation sont destinés à afficher l’objet étudié avec le dispositif 1A, notamment ladite cellule C. Ceci permet à un utilisateur d’identifier une zone d’intérêt particulière sur cet objet. Les moyens de contrôle sont destinés à définir le motif lumineux ML souhaité.

Par exemple, si l’utilisateur cherche à exciter le groupe de protéines P1 de la cellule C, il peut dessiner manuellement, avec lesdits moyens de contrôle (par exemple avec une souris d’ordinateur), une forme géométrique qui entoure le groupe de protéines P1 de la cellule C. Cette forme géométrique présente donc une forme et une position qui dépendent d’une observation préalable de l’objet à observer. Alternativement, la forme et la position de ladite forme géométrique pourrait être déterminée automatiquement, notamment grâce à un traitement automatique d’une image issue d’une observation préalable dudit objet.

Le moyen de contrôle 8A comprend une mémoire dans laquelle est mémorisée la forme et la position du motif lumineux ML préalablement spécifié par l’utilisateur. Le moyen de contrôle 8A comprend également un programme d'ordinateur dans lequel est codée une fonction de transfert permettant de calculer un état d'activation de chaque microélément du moyen optique actif en fonction de la forme et de la position du motif lumineux ML souhaité.

Chaque microélément 15A est une structure à petite échelle qui rayonne des ondes lumineuses. La résolution spatiale du motif lumineux ML dans le plan focal objet de l'objectif est limitée par la diffraction due à l’ouverture numérique de l’objectif. Ainsi, l’onde incidente au niveau du plan pupille PP présente : i) une phase contrôlée en tout point de la région supercritique R1 de la pupille d’entrée de l’objectif, et ii) une amplitude uniformément nulle dans toute la région sous-critique R2 de la pupille d’entrée de l’objectif.

La phase du front d’onde en tout point de la région supercritique R1 du plan pupille PP est optimisée pour produire le motif d’intensité recherché dans le plan focal objet de l'objectif 9A.

La forme du motif lumineux ML peut être librement choisie. On peut par exemple obtenir un motif lumineux de forme circulaire, ovoïde, elliptique, polygonale, notamment triangulaire, carrée, rectangulaire ou toute autre forme géométrique souhaitable. Avantageusement, la forme du motif lumineux est définie en fonction d'une observation ou d'une déduction préalable de la position de zones photosensibles de l'objet observé. Sur la figure 2, le motif lumineux ML présente une forme arbitraire qui pourra donc être librement adaptée en fonction des besoins. En remarque, le masque 13A précédemment décrit permet de filtrer les basses fréquences du front d'onde dans l'espace de Fourier. La présence de ce masque n'empêche pas la formation du motif lumineux ML, mais il peut éventuellement altérer l'homogénéité d'éclairage de ce motif lumineux.

Comme cela est illustré sur la figure 2, ce motif lumineux pourrait être observé en positionnant un écran dans le plan focal image PF1. Bien sûr, en pratique, le dispositif 1A ne comprend pas un tel écran puisque celui-ci bloquerait ou limiterait le passage des rayons lumineux. Le plan focal image PF1 correspond à un plan de Fourier du plan pupille PP. Autrement dit, le motif projeté sur le plan pupille PP correspond à une transformée de Fourrier du motif lumineux ML. La figure 4 illustre schématiquement la surface active 10A permettant de produire le motif lumineux ML tel que représenté sur la figure 2. Chaque microélément de la surface active est représenté avec un certain niveau de gris en fonction du déphasage local qu'il induit. Par convention, la couleur blanche indique un déphasage nul et la couleur noire indique un déphasage égal à 2TT. De manière macroscopique, la surface active 10A semble grise. Néanmoins, le déphasage produit par la surface active 10A n'est pas du tout uniforme. En effet, si on observe la surface active 10A à l'échelle microscopique, comme cela est indiqué sur la partie droite de la figure 4, on constate que chaque microélément 15A est dans une configuration particulière, produisant un déphasage compris entre 0 et 2TT. Le motif de phase ainsi généré sur la surface active 10A correspond à la partie complexe de la transformée de Fourier du motif désiré dans le plan focal objet de l'objectif.

La figure 5 illustre schématiquement le plan pupille PP de l'objectif. La zone supercritique R1 du plan pupille PP est entièrement illuminée par un motif sensiblement identique au motif généré sur la surface active 10A. De même, le motif formé sur le plan pupille PP de l'objectif correspond à une transformée de Fourier du motif désiré dans le plan focal objet de l'objectif.

Selon une variante de réalisation, on peut ajouter, par l’intermédiaire du moyen de contrôle 8A, un gradient de phase linéaire dans le plan pupille PP, de façon à déplacer la position, dans le plan focal objet de l'objectif, d'un spot laser super-résolu qui reproduit par balayage successif le motif recherché. Autrement dit, le moyen optique actif 7A peut être contrôlé de manière à produire à chaque instant, dans le plan focal objet de l'objectif, non pas une forme ou un motif géométrique particulier, mais un unique spot lumineux dont la taille est limitée par la diffraction. Ensuite on balaye la forme géométrique désirée avec ce spot lumineux. Pour obtenir un spot lumineux, on contrôle le moyen optique actif de manière de manière adaptée. Si le front d'onde 02 est perpendiculaire à l'axe optique ZO on obtient un spot lumineux centré sur l'axe optique ZO. Si le front d'onde 02 est incliné par rapport à l'axe optique ZO, on obtient un spot lumineux décalé par rapport à l'axe optique ZO. Dans tous les cas, l'ensemble de la zone supercritique R1 du plan pupille de l'objectif est illuminé, même pour obtenir un spot lumineux.

Avantageusement, le dispositif 1 A peut en outre comprendre un moyen de polarisation de l’onde incidente dans le plan pupille PP de l’objectif. En effet, la grande ouverture numérique de l'objectif génère des rayons lumineux très inclinés dont les amplitudes peuvent dépendre des angle et plan d’incidence. L’état de polarisation le plus adapté et permettant la meilleure résolution spatiale est la polarisation radiale. Une polarisation radiale peut être obtenue, à partir d’une polarisation linéaire, grâce à des lames de polarisation, idéalement placées à proximité du plan pupille de l’objectif.

Pour déterminer le déphasage de chaque microélément de la surface active 10A, on procède à un calcul itératif, par exemple de type Gerchberg-Saxton, qui, bien sûr, dépend de la forme et de la position du motif lumineux ML prédéfini, mais également d’une condition initiale. Cette condition initiale peut correspondre à une condition initiale de phase dans le plan focal image PF1. Le déphasage de chaque microélément de la surface active 10A dépend ainsi d’une condition initiale. Pour un même motif lumineux ML, il existe plusieurs configurations possibles de chaque microélément de la surface active 10A. Les motifs lumineux ML obtenus avec ces différentes configurations comprennent la même forme et la même position. Toutefois, les différents motifs lumineux présentent tous une certaine inhomogénéité lumineuse, c’est-à-dire que certaines portions de chaque motif lumineux sont plus ou moins éclairées. Les différents motifs lumineux se distinguent les uns des autres par une répartition de luminosité différente au sein même du motif lumineux ML. Pour obtenir un motif lumineux ML de forme prédéfinie et avec une luminosité homogène, on peut avantageusement calculer pour un même motif lumineux ML plusieurs configurations de la surface active 10A avec différentes conditions initiales du calcul itératif. Ensuite, on peut contrôler le moyen optique actif 7 A de sorte qu’il produise successivement et cycliquement les différentes configurations de la surface active 10A. Plus le nombre de configurations différentes est important, meilleure est l’homogénéité lumineuse du motif lumineux.

La figure 6 illustre un dispositif de création d’un champ évanescent 1 B selon un deuxième mode de réalisation de l'invention. De même que pour le premier mode de réalisation, le dispositif 1 B comprend une source de lumière 6B, un moyen optique actif 7B, un moyen de contrôle 8B du moyen optique actif 7B, et un objectif 9B. Le moyen optique actif 7B comprend un ensemble de microéléments 15B contrôlables individuellement. Le dispositif 1 B comprend également une première lentille 11 B et une deuxième lentille 12B interposées entre le moyen optique actif 7B et l'objectif 9B. La source de lumière 6B, l'objectif 9B, la première lentille 11 B et la deuxième lentille 12B peuvent présenter les mêmes caractéristiques et les mêmes agencements que respectivement la source de lumière 6A, l'objectif 9A, la première lentille 11A et la deuxième lentille 12B décrits précédemment. De même que pour le premier mode de réalisation, le moyen optique actif 7B comprend une surface active 10B qui s'étend dans un plan conjugué du plan pupille PP, et qui peut être décomposée en une région supercritique R1' et une région sous-critique R2'. Le dispositif 1 B est également configuré pour illuminer l'ensemble de la région supercritique R1 de l'objectif, et non une partie seulement de cette région supercritique. Ce deuxième mode de réalisation se distingue du premier mode de réalisation par son moyen optique actif 7B et le moyen de contrôle 8B associé. En effet, le moyen optique actif 7B et le moyen de contrôle 8B associé sont configurés pour produire un motif lumineux dans le plan focal objet par holographie. Plus précisément, le moyen optique actif 7B est utilisé pour encoder un front d'onde à l'aide d'une porteuse à haute fréquence. On appelle porteuse, un motif périodique de haute fréquence spatiale appliqué aux microéléments 15B. Ce motif périodique est typiquement constitué d’une série de lignes parallèles. Ce motif périodique est notamment illustré sur la figure 8.

Selon une première variante du deuxième mode de réalisation, la porteuse à haute fréquence peut être un réseau de franges d'intensité variable, autrement dit d'amplitude variable. Chaque microélément 15B de la surface active 10B est alors configuré soit en position "ON" de sorte à réémettre des rayons lumineux susceptibles d'atteindre le plan pupille de l'objectif de même intensité que des rayons lumineux incidents, soit en position "OFF" de sorte à ne réémettre aucun rayon lumineux susceptible d'atteindre le plan pupille de l'objectif. La position de chaque microélément de la surface active 10B peut être obtenue par un calcul itératif analogue au calcul itératif décrit pour le premier mode de réalisation.

Le moyen optique actif 7B est alors de préférence une matrice de micromiroirs. Alternativement, le moyen optique actif 7B pourrait aussi être un modulateur spatial de lumière adapté pour moduler l'amplitude ou la phase de l'onde incidente.

Une matrice de micro-miroirs est un microsystème électromécanique permettant la projection d'une image numérique par réflexion sur des micro-miroirs qui peuvent basculer sur 2 positions différentes : dans la position "ON", un micro-miroir est orienté de sorte à ce que les rayons lumineux qu'il réfléchit atteignent l'objectif 9B. Dans la position "OFF", un micro-miroir est orienté de sorte à ce que les rayons lumineux qu'il réfléchit n'atteignent pas l'objectif 9B. Une matrice de micro-miroirs présente un faible coût et une grande rapidité d'affichage. La figure 7 illustre à titre d'exemple deux microéléments 15B d'une matrice de micro-miroirs. Un premier microélément est en position "ON" et l'autre microélément est en position "OFF".

Comme cela est illustré sur la figure 8, le moyen de contrôle 8B est configuré pour contrôler individuellement chaque micro-miroir de sorte que les micro-miroirs de la région supercritique R1 ' sont soit en position OFF soit en position ON, et tous les micro-miroirs positionnés de la région sous- critique R2' sont en position OFF. L'utilisation d'une matrice de micromiroirs permet aussi de s'affranchir de l'utilisation d'un masque optique s'étendant un plan conjugué de la région sous-critique. Ainsi, la matrice de micro-miroirs peut être utilisée pour contrôler l'amplitude du front d'onde incident dans le plan pupille PP de l'objectif.

Une observation microscopique de la région supercritique R1 ' de la surface active 10B permet de visualiser le réseau de franges d'intensité variable, lequel se traduit par un agencement des micro-miroirs en position ON et OFF sensiblement selon des lignes parallèles. D'une manière générale, le moyen de contrôle 8B peut encoder sur une porteuse la phase et/ou l’amplitude du front d'onde qui doit être généré dans le plan pupille de l'objectif, de façon à obtenir le motif lumineux ML recherché dans le plan focal objet de l'objectif 9B.

Dans le cas où seule la phase de la région supercritique est contrôlée, celle-ci peut être encodée à travers les positions des franges d’un réseau affiché sur la matrice de micro-miroirs suivant la méthode de Lee, donnée par l'équation suivante : où :

- x et y désigne les coordonnées de chaque micro-miroir le long des axes X et Y,

- c|)(x,y) désigne la phase recherchée, et

- p désigne la période du réseau (la fréquence porteuse étant donc donnée par 1/p).

En raison de la diffraction générée par un réseau de franges, on observe dans le plan focal image PF1 de la première lentille 11 B une série de motifs à différents ordres de diffraction. Ainsi, en laissant passer, dans le plan focal image PF1 , uniquement la lumière venant de l’ordre 1 du réseau de diffraction, on obtient un front d’onde dans le plan pupille dont la phase correspond à <|)(x,y). Avantageusement, on prévoit un masque 14B s'étendant dans le plan focal image PF1 pour masquer la lumière venant d’autres ordres que l'ordre 1 , c’est-à-dire des ordres 0, -1 , +2, -2 etc. Le front d'onde dans le plan pupille PP est ainsi débarrassé de sa composante haute fréquence. Sur la figure 6, on a indiqué par la référence MLO, le motif lumineux d'ordre 0 et par ML1 , le motif lumineux d'ordre 1. Bien que représenté comme un masque transparent sur la figure 6 (de manière à visualiser le motif lumineux MLO), le masque 14B est bien un masque opaque.

Le front d'onde dans le plan pupille PP est illustré sur la figure 9. La zone supercritique R1 du plan pupille PP est entièrement illuminée par un motif correspondant à une transformée de Fourier du motif désiré dans le plan focal objet. La résolution spatiale des motifs d’intensité obtenus dans le plan focal objet de l'objectif dépend de l’optimisation de la phase, voire également de l’amplitude, dans la région supercritique du plan pupille et de son encodage via la porteuse affichée sur la matrice de micro-miroirs. L’extension du champ de vue (c’est-à-dire de la région du plan focal objet de l'objectif où l’intensité peut être contrôlée), dépend également de l’encodage via la porteuse affichée sur la matrice de micro-miroirs.

Une variante de l’holographie de Lee permet d’encoder également l’amplitude de l’onde en jouant sur la largeur des franges. Il faut alors noter que les pixels d’une période donnée servant à contrôler l’amplitude en plus de la phase, le nombre de niveaux de phase réalisables est plus limité.

La technique présentée ci-dessus permet de former, avec une seule illumination, des motifs d’intensité dans le plan focal objet de l’objectif. Cependant, il est également possible de reconstituer des motifs par balayage d’un spot évanescent, dont la position est alors déterminée par le période et l’orientation du réseau porteur. La matrice de micro-miroirs pouvant avoir une vitesse de rafraichissement de l’ordre de 10 kHz, la méthode de balayage permet de reconstituer des motifs en moins d’une seconde. La phase 4>(x,y) à gradient constant dans le plan pupille peut également être le résultat d’un tip-tilt du faisceau laser incident réalisé à l’aide de miroirs galvanométriques ou de cristaux acousto-optiques, placés dans un plan optiquement conjugué du plan pupille (montage de type 4f).

Les déformations de la surface de la matrice de micro-miroirs, ainsi que la propagation de l’onde lumineuse dans l’ensemble du dispositif 1 B sont des sources importantes d’aberrations optiques qui peuvent dégrader la résolution spatiale du motif lumineux ML. Il est possible de compenser ces aberrations en modifiant de façon adaptée la phase du front d’onde encodée sur la matrice de micro-miroirs avec la méthode de Lee mentionnée ci-dessus.

Selon une deuxième variante du deuxième mode de réalisation, la porteuse à haute fréquence pourrait être un réseau de franges de phase variable au lieu d'un réseau de franges d'intensité variable. Dans ce cas, le moyen optique actif est alors de préférence un modulateur spatial de lumière. Les positions ON et OFF de chaque microélément correspondent alors respectivement à un déphasage nul et à un déphasage égal à TT.

La figure 10 illustre un dispositif de création d’un champ évanescent 1 C selon un troisième mode de réalisation de l'invention. De même que précédemment, le dispositif 1 C comprend une source de lumière 6C, un moyen optique actif 7C, un moyen de contrôle 8C du moyen optique actif 7C, et un objectif 9C. Le dispositif 1 C est également configuré pour illuminer l'ensemble de la région supercritique R1 de l'objectif, et non une partie seulement de cette région supercritique. Les spécificités de ces éléments seront décrites ci-après. Le dispositif 1 C comprend en outre une première lentille 11 C, une deuxième lentille 12C et une troisième lentille 13C interposées entre le moyen optique actif 7C et l'objectif 9C.

Les lentilles 1 1 C, 12C et 13C peuvent être des lentilles convergentes. Elles peuvent s'étendre perpendiculairement à l'axe optique Z0 et être centrées sur l'axe optique Z0. La première lentille 11 C, la deuxième lentille 12C et la deuxième lentille 13C comprennent respectivement une distance focale f1 , f2 et f3. Une surface active 10C du moyen optique actif 7C s'étend dans plan focal objet de la première lentille 11 C. Un plan focal image PF1 de la première lentille 1 1 C est confondu avec un plan focal objet de la deuxième lentille 12C. Un plan focal image PF2 de la deuxième lentille 12C est confondu avec un plan focal objet de la troisième lentille 13C. Un plan focal image de la troisième lentille 13C est confondu avec un plan pupille PP de l'objectif 9A. Les différentes lentilles 11 C, 12C, et 13C et l'objectif 9C sont agencées de sorte que la surface active 10C s'étende dans un plan conjugué du plan focal objet, c’est-à-dire que tout point du plan focal objet de l'objectif 9C possède une image dans le plan de la surface active 10C. En variante, le dispositif optique pourrait être plus complexe et comprendre notamment davantage de lentilles et/ou des moyens de réflexions tels que des miroirs.

Selon ce mode de réalisation le motif lumineux ML est directement reproduit par le moyen optique actif 7C sur la surface active 10C. On prévoit alors un masque 14C s'étendant dans la région sous-critique R2' d'un plan conjugué du plan pupille, de manière à empêcher des rayons lumineux d'atteindre la région sous-critique R2 du plan pupille. De même que précédemment, l'ensemble de la région supercritique R1 du plan pupille est illuminé.

Selon ce troisième mode de réalisation, la source de lumière 6C peut être une source de lumière incohérente. La source de lumière 6C peut, par exemple, comprendre une diode électroluminescente, ce qui simplifie la conception du dispositif 1C. Le moyen optique actif 7C peut comprendre un modulateur spatial de lumière à cristaux liquides ou une matrice de micro-miroirs. Le moyen optique actif 7C est configuré pour contrôler l'amplitude de l’illumination incidente. Le motif est reproduit avec un ensemble de microéléments en position ON, tandis que les autres microéléments du moyen optique actif 7C sont en position OFF.

Selon ce mode de réalisation, le moyen optique actif 7C est plus facile à réaliser que dans le premier et le deuxième mode de réalisation précédemment décrits car les microéléments sont activés selon la forme et la position du motif lumineux ML recherché. Il n'est donc pas utile de recourir à des calculs de transformées de Fourier itératifs pour déterminer quels microéléments doivent être activés.

En remarque, lorsqu'on utilise une onde incidente monochromatique et spatialement cohérente, la fonction de transfert du système d'imagerie est donnée par la région supercritique de la pupille d'entrée de l'objectif. Elle exclue donc la partie centrale, basses fréquences, du plan de Fourier, ce qui rend a priori difficile la reproduction de motifs d'illumination comportant des régions homogènes, sauf à utiliser un contrôle de la phase par holographie. Inversement, la production d'un spot central est réalisable directement, lequel peut d'ailleurs être balayé en modifiant les paramètres du réseau de franges comme vu précédemment.

Inversement, si la source de lumière est spatialement incohérente, la fonction de transfert du système d'imagerie est donnée par l'autocorrélation de la région supercritique de la pupille d'entrée de l'objectif. Celle-ci correspond à une répartition plus homogène des fréquences transmises et contient, en plus des hautes fréquences, la partie centrale, à basses fréquences, du plan de Fourier. Ceci rend possible la reproduction de motifs d'illumination comportant des régions homogènes limitées par des frontières très étroites.

La figure 11 illustre un dispositif de création d’un champ évanescent 1 D selon un quatrième mode de réalisation de l'invention. Le dispositif 1 D comprend une source de lumière 6D, un moyen optique actif 7D, un moyen de contrôle 8D du moyen optique actif 7D, un objectif 9D, une première lentille 11 D, une deuxième lentille 12D et une troisième lentille 13D interposées entre le moyen optique actif 7D et l'objectif 9D. Le dispositif 1 D est également configuré pour illuminer l'ensemble de la région supercritique R1 de l'objectif, et non une partie seulement de cette région supercritique. Les caractéristiques et agencements de ces éléments peuvent être identiques à ceux du dispositif 1 C selon le troisième mode de réalisation.

Le dispositif 1 D se distingue du dispositif 1 C d'une part par la nature de la source de lumière 6D qui est à présent une source de lumière cohérente. D'autre part, le moyen optique actif 7C et le moyen de contrôle 8C associé sont configurés pour produire un motif dans le plan focal objet par holographie. Le moyen optique actif 7D peut être configuré pout moduler la phase et/ou l'amplitude du front d'onde incident dans le plan pupille PP de l'objectif par holographie. Par analogie au deuxième mode de réalisation, le moyen optique actif 7D peut comprendre un modulateur spatial de lumière ou une matrice de micro-miroirs. Le moyen optique actif 7C est utilisé pour encoder un front d'onde à l'aide d'une porteuse à haute fréquence. La porteuse à haute fréquence peut être un réseau de franges d'intensité variable et/ou un réseau de franges de phase variable. La position de chaque microélément de la surface active 10D peut être obtenue par un calcul itératif analogue au calcul itératif décrit pour le premier mode de réalisation.

Le contour du motif lumineux ML recherché est directement reproduit sur la surface active 10D. les microéléments positionnés à l'intérieur de ce contour sont contrôlés de sorte à produire un réseau de franges.

En outre, le dispositif 1 D peut comprendre un premier masque 14D1 s'étendant dans la région sous-critique R2' d'un plan conjugué du plan pupille, de manière à empêcher des rayons lumineux d'atteindre la région sous-critique R2 du plan pupille. Le dispositif 1 D doit nécessairement comprendre un deuxième masque 14D2 pour masquer la lumière venant de l'ordre 0 du réseau de diffraction. Bien que représenté comme un masque transparent sur la figure 11 (de manière à visualiser le motif lumineux MLO), le masque 14D2 est bien un masque opaque. Finalement pour utiliser l'un quelconque des dispositifs 1A, 1 B, 1C, 1 D précédemment décrits, on peut procéder de la manière suivante. Tout d'abord, on met en place un objet à observer sur un support transparent, l'objet et le support présentant des indices de réfraction différents, celui de l’objet étant inférieur à celui de support. Par exemple on positionne une cellule vivante sur une lamelle de verre.

Ensuite, on définit la forme et la position d'une zone de l'objet à exciter avec un champ évanescent. Cette définition peut notamment résulter d'une observation préalable de l'objet et/ou de calculs et/ou d'hypothèses relatives à l'objet. Par exemple, s'agissant d'une cellule, on peut définir une portion de la membrane basale de la cellule comprenant des protéines d'un type recherché.

Une fois cette zone définie, on contrôle chaque microélément du moyen optique actif du dispositif de sorte à produire un motif lumineux dans le plan focal objet de l'objectif qui correspond à la forme et la position prédéfinie. A cet effet, le moyen de contrôle du dispositif calcule, le cas échéant à l'appui d'une fonction de transfert prédéfinie et/ou de manière itérative, comment chacun des microéléments doit être contrôlé. Le moyen de contrôle actif dirige les rayons lumineux issu de la source de lumière de sorte à éclairer l'ensemble de la région supercritique R1 du plan pupille de l'objectif. Le moyen de contrôle actif (ou, le cas échéant, des masques correctement dimensionnés et positionnés) bloque les rayons lumineux incidents au niveau de la région sous-critique du plan pupille de l'objectif. On obtient ainsi une onde évanescente dont la forme et la position dans le plan transverse correspond à la zone prédéfinie.

Comme l'ensemble de la région supercritique R1 du plan pupille de l'objectif est éclairé, on maximise la quantité de lumière traversant l'objectif et on produit un éclairage isotrope. Ces avantages sont obtenus tout en produisant un motif lumineux de forme prédéterminée.

On obtient un motif lumineux à la surface du dioptre dont la forme et la position correspond à la zone à exciter prédéfinie. On obtient ainsi une excitation de l'objet circonscrite dans les trois dimensions de l'espace. L'invention permet ainsi d'obtenir un éclairage uniforme avec une très haute résolution spatiale. La résolution spatiale dudit motif lumineux dans le plan focal objet de l'objectif est limitée par diffraction.

Claims

REVENDICATIONS

1 . Dispositif (1 , 1 A, 1 B, 1 C, 1 D) de création d’un champ évanescent (3) à la surface d’un dioptre (4) séparant deux milieux d’indices de réfraction différents, comprenant :

- une source de lumière (6A, 6B, 6C, 6D),

- un objectif (9A, 9B, 9C, 9D) comprenant un plan focal objet positionné à la surface du dioptre, et un plan pupille (PP) comprenant une région sous-critique (R2) et une région supercritique (R1),

- un moyen optique actif (7A,7B, 7C, 7D) configuré pour moduler l'amplitude et/ou la phase de rayons lumineux émis par la source de lumière, le moyen optique actif comprenant une surface active (10A, 10B, 10C, 10D) s'étendant au moins dans l'ensemble de la région supercritique (RT) d'un plan conjugué du plan pupille ou s'étendant dans un plan conjugué du plan focal objet de l'objectif, le moyen optique actif comprenant un ensemble de microéléments contrôlables individuellement configurés pour illuminer l'ensemble de la région supercritique de l'objectif, et

- un moyen de contrôle (8A,8B, 8C, 8D) de chaque microéléments configuré de sorte à produire un motif lumineux de forme prédéfinie dans le plan focal objet de l'objectif.

2. Dispositif (1 , 1A, 1 B, 1C, 1 D) selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le moyen optique actif (7A, 7B, 7C, 7D) comprend un modulateur spatial de lumière à cristaux liquides ou une matrice de micro-miroirs.

3. Dispositif (1 A, 1 B) selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la source de lumière (6A, 6B) est une source de lumière cohérente, notamment une source de lumière laser, et en ce que la surface active (10A, 10B) s'étend au moins dans l'ensemble de la région supercritique (R1 ') d'un plan conjugué du plan pupille.

4. Dispositif (1A, 1 B) selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le moyen optique actif (7A, 7B) comprend un modulateur spatial de lumière à cristaux liquides, et en ce qu'il comprend un masque (13A) optique s'étendant dans l'ensemble de la région sous- critique (R2¹) d'un plan conjugué du plan pupille.

5. Dispositif (1 B) selon la revendication 3, caractérisé en ce que le moyen optique actif (7B) comprend une matrice de micro-miroirs, la matrice de micro-miroirs s'étendant dans l'ensemble de la région supercritique (R1 ') et dans l'ensemble de la région sous-critique (R2¹) du plan conjugué du plan pupille, chaque micro-miroir de la région sous-critique du plan conjugué du plan pupille étant contrôlé de sorte à dévier les rayons lumineux hors de l'objectif.

6. Dispositif (1 C, 1 D) selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la surface active (10C, 10D) s'étend dans un plan conjugué du plan focal objet, le moyen de contrôle (7C, 7D) étant configuré de sorte à reproduire ledit motif de forme prédéfinie directement sur la surface active du moyen optique actif, le dispositif comprenant en outre un masque optique (14C, 14D1 ) s'étendant dans l'ensemble de la région sous-critique (R2¹) d'un plan conjugué du plan pupille.

7. Dispositif (1 C) selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la source de lumière est une source de lumière incohérente, notamment une diode électroluminescente, le moyen de contrôle (7C) étant configuré de sorte à reproduire l'ensemble dudit motif de forme prédéfinie directement sur la surface active du moyen optique actif.

8. Dispositif (1 B, 1 D) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source de lumière (6B, 6D) est une source de lumière cohérente, notamment un laser, et en ce que le moyen optique actif (7B, 7D) est contrôlé de sorte à moduler la phase et/ou l'amplitude d'un front d'onde réfléchi par la surface active (10B, 10D) par holographie.

9. Dispositif (1 B, 1 D) selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un masque (14B, 14D2) configuré pour masquer un motif d'ordre de diffraction 0.

10. Procédé de fonctionnement d'un dispositif (1 , 1A, 1 B, 1C, 1 D) selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend :

- la mise en place d'un objet, notamment une cellule (C) vivante, à observer sur un support (2) transparent, l'objet et le support présentant des indices de réfraction différents, puis

- la définition de la forme et de la position d'une zone de l'objet à exciter avec un champ évanescent, puis

- le contrôle de chaque microéléments du moyen optique actif (7A, 7B, 7C, 7D) du dispositif de sorte à illuminer simultanément l'ensemble de la région supercritique de l'objectif, et de sorte à produire un motif lumineux dans le plan focal objet de l'objectif, la résolution spatiale dudit motif lumineux dans le plan focal objet étant limitée par diffraction, la forme et la position dudit motif lumineux correspondant à la zone à exciter prédéfinie.

11. Procédé de fonctionnement selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le motif lumineux est formé par le balayage d'un spot lumineux dans le plan focal objet de l'objectif, l'ensemble de la région supercritique de l'objectif étant illuminée à chaque instant.

12. Procédé de fonctionnement selon la revendication 10 ou 11 , caractérisé en ce que la définition de la forme et de la position d'une zone de l'objet à exciter avec un champ évanescent comprend :

- une observation préalable de l’objet à exciter, puis

- l’identification du contour d’une zone de l’objet à exciter sur la base de l’observation préalable.

13. Procédé de fonctionnement selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’identification du contour d’une zone de l’objet à exciter est réalisée manuellement au moyen d’une interface homme-machine.

14. Procédé de fonctionnement selon l’une des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu’il comprend un calcul itératif, par exemple de type Gerchberg-Saxton, d’au moins une configuration de la surface active permettant de former ledit motif lumineux (ML) dans le plan focal objet de l'objectif.

15. Procédé de fonctionnement selon l’une des revendications 10 à 14, caractérisé en ce qu’il comprend le calcul d’une première configuration et d’au moins une deuxième configuration de la surface active, chaque configuration de la surface active étant calculée de sorte à obtenir le même motif lumineux (ML), les motifs lumineux obtenus avec la première configuration et avec l’au moins une deuxième configuration comprenant une même forme et un même position mais une répartition de luminosité différente, et en ce que chaque microéléments du moyen optique actif (7A, 7B, 7C, 7D) est contrôlé successivement selon la première configuration puis selon l’au moins une deuxième configuration.