WO2020230051A1 - Dispositif de creation d'un champ evanescent a motifs sur une surface et procede associe - Google Patents

Dispositif de creation d'un champ evanescent a motifs sur une surface et procede associe Download PDF

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WO2020230051A1
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objective
optical
diopter
plane
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Alexei GRICHINE
Olivier Destaing
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Université Grenoble Alpes
Cnrs (Centre National De La Recherche Scientifique)
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    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • Photobiology is a rapidly growing field of research, fueled by the development of several generations of photoreceptor proteins that can be activated or deactivated, change their state of oligomerization, bind to / dissociate from specific cellular partners or even be locally denatured. in response to light stimulation.
  • These versatile tools can be expressed in fusion with almost any cellular protein, thus allowing detailed functional studies of individual molecular actors through their spatiotemporal activation / inactivation and photo-manipulation at the inside living cells or even whole organisms using beams of light of specific wavelengths.
  • SLM Spatial Light Modulator
  • DMD Digital Micro-mirror Device
  • cytosolic photoreceptor proteins such as Cry2
  • Cry2 cytosolic photoreceptor proteins
  • a large volume of excitation also leads to significant photoinstability, photo-toxicity and thermal effect, as well as other undesirable effects, of light on living cells.
  • TIRF Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
  • the object of the present invention is to describe a method of creating evanescent field patterns which combines both the advantages of TIRF and optogenetic techniques and allows the creation of TIRF photo-activation regions of interest on the plasma membrane, thus reducing light excitation in all three dimensions.
  • Evanescent light fluorescence excitation is widely used in TIRF microscopy to specifically visualize the basement membrane labeled by fluorophores or nearby cytoskeletal structures in a living cell, in super-resolution microscopy techniques such as optical reconstruction microscopy stochastic (STORM, acronym for English STochastic Optical Reconstruction Microscopy) or photoactivated localization microscopy (PALM, acronym for English Photo-Activated Localization Microscopy) or to sample fluorescent solutions and thin films close to the glass substrate.
  • STORM optical reconstruction microscopy stochastic
  • PAM photoactivated localization microscopy
  • TIRF microscopy is based on a collimated beam of excitation light which reflects completely on the glass / water interface at an angle of incidence greater than the critical angle ⁇ c roughly equal to 61 ° .
  • ⁇ c can be a few degrees higher.
  • large numerical aperture objectives provide angles of incidence of almost 80 °, well above the critical value.
  • the characteristic penetration depth of the resulting evanescent wave in an aqueous medium or cells is then about 100 nm, while the lateral resolution, determined by the numerical aperture (NA) of the objective is close to 250 nm .
  • NA numerical aperture
  • the smallest sample volume may be less than 10 attoliters (1 attolitre representing 10 -18 liters), while the total excitation volume of the evanescent wave is much larger (greater than 10 femtoliters, 1 femtoliter representing 10 -15 liters), due to the fact that the total field of view is excited immediately.
  • the excitation light is focused in the rear focal plane (BFP, acronym for English Back Focal Plane) of the objective (also called the pupil plane), near its periphery.
  • BFP rear focal plane
  • the cone of light at this point has a very low numerical aperture (e.g. less than 0.04 in an iMIC microscope, produced by the company FEI Kunststoff GmbH) and the radial position of the focal point can be adjusted with a galvanometric scanner or a prism. This leads to evanescent wave excitation of the entire field of view by the highly tilted parallel beam, although sometimes affected by a multimodal laser beam profile or interference fringes.
  • More uniform illumination can be obtained by multipoint BFP focusing (TILL, produced by the company FEI Kunststoff GmbH) or rotating beam azimuthal configurations (material from the company Roper Scientific, currently the company GATACA).
  • TILL multipoint BFP focusing
  • Roper Scientific rotating beam azimuthal configurations
  • Many modern commercial TIRF microscopes produce a homogeneous evanescent field greater than 100 ⁇ m in diameter that covers the entire surface of typical adherent cells.
  • certain optical elements of microscopes particularly those in conjugate field planes, have been identified as sources of non-evanescent, propagating light which leads to partial far-field excitation.
  • the supercritical angle fluorescence imaging technique SAF
  • any element obstructing light in the conjugate field plane in the excitation light path is in fact considered to be detrimental to image quality and is avoided.
  • US patent application US2017276922A1 describes a structured illumination microscopy technique (TIRF-SIM, from the company Nikkon) takes advantage of the fact that a pair of intersecting and mutually coherent TIRF laser beams can produce a pattern of interference fringes. with bands very closely spaced in evanescent intensity. These periodic bands, however, span the entire field of view and are useful for calculating the 2-fold enhanced resolution microscopy image rather than for localized photoactivation.
  • TIRF-SIM structured illumination microscopy technique
  • US2016 / 131885 describes a device which is a multidirectional diffraction grating or a light modulator (SLM - Spatial Light Modulator) which forms such a grating. It can form periodic patterns to produce diffracted light in the +1 and -1 orders under coherent lighting.
  • SLM Spatial Light Modulator
  • US2012 / 0319007A1 describes a device comprising a generator of striated patterns, which are projected “divergent” onto a sample.
  • the present invention aims to overcome the drawbacks of the state of the art and therefore relates to a device for creating an evanescent patterned field on the surface of a diopter separating two media with respective refractive indices n 1 and n 2 , characterized by the fact that it includes:
  • the device further comprises at least one optical element between the object plane of the light injection element and the optical assembly for adjusting one of improving the resolution of the pattern formed and filtering the angle of incidence of the light beam on the diopter.
  • the invention is not limited by the number of optical elements which can be added between the light injecting element and the optical assembly.
  • the at least one optical element is one of a spatial diaphragm, a filter.
  • the optical pattern forming device is at least one of a diaphragm, an amplitude mask, a spatial light modulator, an array of micro-mirrors.
  • the amplitude mask can in particular be a slit, a hole or any other pattern of dimensions greater than the wavelength of the light used.
  • the device of the invention further comprises a laser light source for generating the collimated light beam to be injected into the light injection element.
  • the collimated light is, preferably but not necessarily, a coherent beam of light, in particular a laser.
  • the optical assembly is formed by a first intermediate lens, the object plane of which is optically conjugated with the image plane of the light injection element and of which the image plane is optically conjugated with the object plane of the light injection element. 'goal.
  • the first intermediate lens can be optically conjugated with the light injection element by a second intermediate lens whose object plane corresponds to the image plane of the light injection element and whose image plane corresponds to the plane. object of the first intermediate lens.
  • the device according to the invention can in particular be a fluorescence microscope by total internal reflection, the sample corresponding to the diopter and being placed in the image plane of the objective of the microscope, the optical assembly corresponding to the optics of the microscope, 'light injection element being placed upstream of the optics of the microscope or being integrated with the optics of the microscope, the optical patterning device being disposed between a light source and the light injection element or being integrated into the optics of the microscope.
  • the optical pattern-forming device is thus not a diffraction grating but an amplitude SLM which forms in the conjugate field plane one or more localized regions of interest (ROI) of arbitrary shapes. Its position offset or offset from the optical axis of the lens achieves evanescent wave excitation.
  • the Fourier image of this ROI (s), focused in the pupil plane of the objective, has a non-point spatial extent, and which is only limited by the width of the supercritical band available in the TIRF objective.
  • the at least one optical element between the object plane of the light injection element and the optical assembly allows the selection of a spatial frequency band of the light diffracted by the edges of the ROI, while limiting the latter. in order to transmit only the "supercritical" angles.
  • the image of ROI projected into the pupil plane of the lens is not a point spot, but a spot of light whose size is limited by the space available in the supercritical fringe of a TIRF lens.
  • This spot therefore ensures the transmission of the spatial frequencies of the pattern, sufficient information for the reconstruction of its image located on the diopter formed by the surface S.
  • the device of the invention thus allows photomanipulation, a local, subcellular optogenetic photostimulation, with an evanescent wave, limited laterally and axially in 3 dimensions.
  • a subject of the present invention is also a method for creating an evanescent patterned field on a surface using a device as defined above, characterized in that it comprises the steps of:
  • the surface evanescent field is created on a biological sample in order to selectively excite by photoactivation, depending on the evanescent field created, specific surface regions of the biological sample.
  • the present invention can in particular find application in biology, for example to selectively activate with a chosen motif proteins placed on the surface of the diopter, but can also find application in thin-film photolithography or other surface photochemistry methods.
  • a subject of the present invention is therefore also a use of the device or of the method as described above for the applications indicated above, and in particular photomanipulation, local optogenetic photostimulation, subcellular optogenetic photostimulation, with an evanescent wave, limited laterally. and axially in 3 dimensions, by placing the appropriate structure on the surface of the diopter.
  • FIG. 1 is a diagram of a device according to a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram of a device according to a first variant of a second embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram of a device according to a second variant of the second embodiment of the present invention.
  • the surface S is a diopter separating two media with different refractive indices n 1 and n 2 .
  • a sample E was placed on the surface S, the sample E here being a cell for which it is desired to activate surface proteins by forming an evanescent wave on the surface S.
  • a light injection element 2 consisting of a light source 3 generating a collimated, preferably coherent light beam, and a lens L1 of focal length f1 creates a beam of light collimated B towards an optical assembly 4, constituted by a doublet of lenses L2 and L3, of respective focal lengths f2 and f3, the image plane of the lens L2 corresponding to the object plane of the lens L3.
  • the image focal plane of the light injection element 2 corresponds to the object focal plane of the lens L2.
  • This beam of light B is directed at the output of the optical assembly 4 towards an objective O of focal length fO, the object focal plane of the objective O corresponding to the image focal plane of the lens L3.
  • the collimated light beam B is injected into the optical assembly 4 off-center with respect to the optical axis of the optical assembly 4.
  • the surface S is placed in the image focal plane of the objective O.
  • the injection of the light beam B off-center with respect to the optical axis of the optical assembly 4 allows an incidence of the latter at the output of the optical assembly 4 on the peripheral part of the objective O.
  • the light beam B reflected by the surface S is returned to the objective O to be focused in the rear focal plane BFP of the objective O as a diverging and non-parallel beam, the size of the Fourier image of the pattern, formed in the periphery of the rear focal plane BFP, not being punctual, but limited by the thickness of the available supercritical margin.
  • the light beam B coming from the optical assembly 4 is not incident on the objective O along its optical axis, but is incident on the objective O at the periphery thereof, allowing a reflection on the surface S with an angle greater than the critical angle ⁇ c .
  • what is projected onto the objective O and reflected onto the surface S is directly the pattern that one seeks to form, already formed in the beam of light B.
  • the pattern to be formed on the surface S is formed upstream of the lens, and is not the result of optical interference formed on the lens by one or more incident beams.
  • a pattern forming element FS1 is placed in the object focal plane of the lens L1 and makes it possible to form, from the light from the source 3, a collimated light beam B with a pattern formed therein which, via the optical assembly 4 and the objective, will be formed on the surface S in order to generate thereon an evanescent wave with pattern.
  • the pattern forming element FS1 may in particular be a field diaphragm, but could also be, without departing from the scope of the present invention, a diaphragm, an amplitude mask, a spatial light modulator, a matrix. of micro-mirrors.
  • the aperture diaphragm AS in the image focal plane of the lens L1 serves to filter the light reflected from the edges of the field diaphragm FS1, to ensure that the light arrives on the surface S at an angle greater than or equal to l 'critical angle ⁇ c , so as not to produce far-field excitation.
  • ⁇ c critical angle
  • the optical assembly and the objective can for example be integrated into an existing microscope.
  • the invention then allows, from an existing microscope, to form a pattern on the surface S, without having to touch the optics of the microscope, from only the outside of the microscope.
  • This embodiment makes it possible to avoid any occlusion of the optical path and therefore to maintain the aperture, sensitivity and resolution of the microscope. This avoids any reduction in the detection channel.
  • a device 10 has been shown according to a first variant of a second embodiment of the invention.
  • the light source 13 emits a collimated light beam towards the mirror M, the mirror M reflecting the beam towards a field diaphragm FS.
  • the light injection element is in this variant constituted by the mirror M. It should be noted that the light could also be collimated at the exit of an optical fiber directly in the stand of the microscope, or even introduced and collimated thanks to to any other suitable optical means.
  • the light beam B coming from the field diaphragm FS is sent towards the objective O, again to arrive on the surface S with a angle of incidence ⁇ greater than the critical angle ⁇ c to generate a total internal reflection on the surface S and an evanescent wave therein, the beam reflected by the surface S towards the objective O being focused on the focal plane rear BFP of the lens O.
  • the aperture diaphragm AS makes it possible to filter the light reflected by the edges of the diaphragm FS so as to allow only rays with an angle of incidence greater than the critical angle ⁇ c .
  • the light beam is offset with respect to the optical axis of the objective O, to be incident on the objective O at the periphery thereof is to be returned with the surface S with a angle greater than or equal to the critical angle ⁇ c
  • This assembly could for example be integrated directly into new types of microscopes.
  • Figure 3 is a variant of Figure 2 of a device 20 according to a second variant of the second embodiment, and the elements bearing the same reference will not be described in more detail.
  • the difference lies in the means of forming a pattern upstream of the optical assembly 24, the pattern being formed here by a reflection of the collimated light coming from the light source 23 on a digital DMD micro-mirror, said digital DMD micro-mirror reflecting the light towards a pattern forming device BS reflecting only a part of the light received with a pattern towards the digital micromirror DMD, which injects it into the lens L 'in the same way as has been described with reference in Figure 2.
  • the light beam is offset with respect to the optical axis of the objective O, to be incident on the objective O at the periphery thereof is to be returned with the surface S with an angle greater than or equal to the critical angle ⁇ c
  • the invention can therefore be implemented with an existing microscope, for example in the case of the first embodiment, or be integrated into a microscope, as in the case of the second embodiment.
  • the invention can be applied to photolithography, surface photochemistry, microscopy and regiospecific photostimulation of nanoparticles, the creation of nano-films and nano-objects between liquid phases forming the diopter, the engraving of bar codes, grids or other micrometric patterns on photosensitive surfaces, regiospecific evolutions of surface plasmon resonance technologies, the development of a regiospecific activation in evanescent wave sensors, the regionalization of the production of evanescent waves, the confinement and the manipulation of light by photonic crystals, integration of photonic patterns on silicon chips, development of artificial composite materials to perform new optical functions, optoelectronics.
  • the present invention also finds a particularly advantageous application in biology, for example for the optogenetic addressing of subcellular structures of perimembranes or their formation (for example, focal adhesion, podosome, lamellipodia, endo or exocytosis vesicle, cytoskeletal anchoring) , for fine local control of cell geometry, polarity and movement, for local activation of plasma membrane receptors (EGFR, IGFR,...) or transcription factors (Stat3, 5,%) without modifying their nuclear reserve (essential for analyzes by fluorescence correlation spectroscopy (acronym FCS for Fluorescence Correlation Spectroscopy) for example), for the quantification of the rate of subcellular signaling between separate membrane structures, for the structuring of cell substrates by methods photolithography with micrometric lateral and nanometric axial resolution.
  • subcellular structures of perimembranes or their formation for example, focal adhesion, podosome, lamellipodia, endo or exocytosis vesicle, cytoskeletal anchoring

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Abstract

L'invention concerne un dispositif (1) de création d'un champ évanescent à motifs sur la surface (S) d'un dioptre comprenant un objectif (O), dans un plan focal image duquel est disposée la surface (S) du dioptre, un élément (2) d'injection de lumière émettant un faisceau de lumière (B) collimaté, un montage optique (4) entre l'élément (2) et l'objectif (O) par lequel le plan objet de l'objectif (O) est conjugué optiquement avec le plan image de l'élément (2), le montage (4) étant configuré pour qu'un faisceau de lumière collimaté (B) provenant de l'élément (4) soit émis vers l'objectif (O) pour être renvoyé vers la surface (S) du dioptre avec un angle d'incidence supérieur ou égal à l'angle critique du dioptre, un dispositif optique (FS1) de formation de motifs dans le plan objet de l'élément (2), de telle sorte que le motif formé par le dispositif optique de formation de motifs en lumière transmise sur le faisceau de lumière dans le plan objet de l'élément (2) se retrouve en surface du dioptre.

Description

DISPOSITIF DE CREATION D’UN CHAMP EVANESCENT A MOTIFS SUR UNE SURFACE ET PROCEDE ASSOCIE
La photobiologie est un domaine de recherche en rapide croissance, alimenté par le développement de plusieurs générations de protéines photoréceptrices qui peuvent être activées ou désactivées, changer leur état d'oligomérisation, se lier à/se dissocier de partenaires cellulaires spécifiques ou encore être dénaturées localement en réponse à une stimulation lumineuse. Ces outils polyvalents peuvent être exprimés en fusion avec presque n’importe quelle protéine cellulaire, permettant ainsi des études fonctionnelles détaillées d'acteurs moléculaires individuels par l'intermédiaire de leur activation/inactivation spatio-temporelle et d’une photo-manipulation à l'intérieur de cellules vivantes ou même d'organismes entiers à l'aide de faisceaux de lumière de longueurs d'onde spécifiques.
Actuellement, dans les cellules cultivées, l’activation locale est obtenue par formation de motifs de lumière avec des scanners galvanométriques de microscopie, des modulateurs de lumière spatiaux (SLM, acronyme de l'anglais Spatial Light Modulator) ou autres dispositifs à micro-miroirs numériques (DMD, acronyme de l'anglais Digital Micro-mirror Device). Un faisceau de lumière confiné, orthogonal à la surface du substrat, est alors dirigé vers une région cellulaire souhaitée. Cependant, un tel faisceau traverse la totalité de l'épaisseur de la cellule et peut éventuellement activer des récepteurs à la fois sur les membranes plasmiques supérieure et inférieure ainsi que sur les structures cytoplasmiques ou nucléaires présentes entre celles-ci. De plus, la diffusion rapide de protéines photoréceptrices cytosoliques, comme Cry2, étale le signal généré à l’intérieur du volume focal vers le cytosol avoisinant, réduisant ainsi la résolution spatio-temporelle à quelques micromètres et quelques secondes. Un grand volume d'excitation conduit également à une photo-instabilité, une photo-toxicité et un effet thermique importants, ainsi qu’à d'autres effets indésirables, de la lumière sur les cellules vivantes.
Dans la recherche sur la signalisation cellulaire et la mécanotransduction, les photorécepteurs spécifiques doivent être activés uniquement au niveau de la membrane plasmique basale (par exemple, des composants de structures adhésives, le récepteur de l'EGF, des canaux ioniques...). Dans ce cas, la technique bien établie de microscopie par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF, acronyme de l'anglais Total Internal Reflection Fluorescence) peut être utilisée pour introduire la lumière de photo-activation sous la forme d'un champ évanescent au voisinage de la membrane basale. Cette même technique permet également l'observation de la distribution de fluorophores avec un rapport signal sur bruit très élevé, allant jusqu'à la détection d'une seule molécule. De manière surprenante, malgré le nombre toujours croissant de publications traitant de manière séparée la microscopie TIRF ou des applications optogénétiques, une seule publication récente combine les deux techniques: « Optogenetic interrogation of integrin αVβ3 function in endothelial cells » (Interrogation optogénétique de la fonction intégrine αVβ3 dans des cellules endothéliales), Liao, Z., Kasirer-Friede, A. & Shattil, S. J., J. Cell Sci. 130, 3532–3541 (2017).
Ceci illustre le manque de flexibilité spatiale des équipements de microscopie TIRF actuels. En effet, tout en réduisant efficacement l'excitation lumineuse dans la direction axiale à proximité de la membrane plasmique, les microscopes TIRF actuels excitent l'ensemble du champ de vision et manquent d'outils de contrôle de lumière latérale pour créer des régions d'intérêt (ROI) avec une excitation TIRF.
Les études concernant la transduction de signal intracellulaire et la structuration spatio-temporelle nécessitent cependant une activation localisée dans des régions de dimensions subcellulaires. L'objet de la présente invention est de décrire un procédé de création de motifs de champ évanescents qui combine à la fois les avantages des techniques TIRF et optogénétiques et permet la création de régions d'intérêt de photo-activation TIRF sur la membrane plasmique, réduisant ainsi l'excitation lumineuse dans les trois dimensions.
L'excitation de fluorescence par lumière évanescente est largement utilisée en microscopie TIRF afin de visualiser spécifiquement la membrane basale étiquetée par des fluorophores ou les structures cytosquelettiques proches dans une cellule vivante, dans des techniques de microscopie à super-résolution comme la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM, acronyme de l’anglais STochastic Optical Reconstruction Microscopy) ou la microscopie par localisation photoactivée (PALM, acronyme de l’anglais Photo-Activated Localization Microscopy) ou pour échantillonner des solutions fluorescentes et des films minces proches du substrat de verre.
Le principe de la microscopie TIRF est basé sur un faisceau collimaté de la lumière d'excitation qui se réfléchit totalement sur l'interface verre/eau à un angle d'incidence supérieur à l'angle critique θc à peu près égal à 61°.
Dans le cas de structures à indice de réfraction plus important présentes sur le verre, telles que des cellules adhérentes, θc peut être supérieur de quelques degrés. Dans la plupart des installations optiques TIRF « à travers l'objectif » les plus populaires, les objectifs à grande ouverture numérique permettent d'obtenir des angles d'incidence de presque 80°, bien au-delà de la valeur critique.
La profondeur de pénétration caractéristique de l'onde évanescente résultante dans un milieu aqueux ou des cellules est alors d'environ 100 nm, tandis que la résolution latérale, déterminée par l'ouverture numérique (NA) de l'objectif est proche de 250 nm. Ainsi, le plus petit volume d'échantillonnage peut être inférieur à 10 attolitres (1 attolitre représentant 10-18 litres), tandis que le volume d'excitation total de l'onde évanescente est bien plus grand (supérieur à 10 femtolitres, 1 femtolitre représentant 10-15 litres), en raison du fait que le champ de vision total est excité immédiatement.
Afin de créer le champ évanescent, la lumière d'excitation est focalisée dans le plan focal arrière (BFP, acronyme de l'anglais Back Focal Plane) de l'objectif (également appelé plan de pupille), à proximité de sa périphérie. Le cône de lumière en ce point a une très faible ouverture numérique (par exemple inférieure à 0,04 dans un microscope iMIC, produit par la société FEI Munich GmbH) et la position radiale du point focal peut être ajustée avec un scanner galvanométrique ou un prisme. Ceci conduit à une excitation d'onde évanescente du champ de vision complet par le faisceau parallèle hautement incliné, bien que parfois affecté par un profil de faisceau laser multimodal ou des franges d'interférence. Un éclairage plus uniforme peut être obtenu par focalisation BFP multipoints (TILL, produit par la société FEI Munich GmbH) ou des configurations azimutales de faisceau rotatif (matériel de la société Roper Scientific, actuellement société GATACA). De nombreux microscopes TIRF commerciaux modernes produisent un champ évanescent homogène de plus de 100 µm de diamètre qui couvre la totalité de la surface de cellules adhérentes typiques. Il doit être noté, cependant, que certains éléments optiques des microscopes, notamment ceux dans les plans de champ conjugués, ont été identifiés comme sources de lumière non-évanescente, se propageant, qui conduit à une excitation partielle en champ lointain. Afin de limiter cet effet, la technique d'imagerie par fluorescence à angle supercritique (SAF, acronyme de l'anglais Supercritical Angle Fluorescence) a été développée, laquelle est basée sur un filtrage spatial de la lumière émise au niveau du BFP ou un niveau équivalent du BFP. Ainsi, tout élément obstruant la lumière dans le plan de champ conjugué dans le trajet de lumière d'excitation est en fait considéré comme néfaste pour la qualité d'image et est évité.
Très peu d'exemples de création de motif latéral de lumière évanescente ont été rapportés. La demande de brevet américain US2017276922A1 décrit une technique de microscopie à éclairage structuré (TIRF-SIM, de la société Nikkon) tire parti du fait qu'une paire de faisceaux lasers TIRF se coupant et mutuellement cohérents peuvent produire un motif de franges d'interférence à bandes très étroitement espacées dans l'intensité évanescente. Ces bandes périodiques, cependant, s'étendant sur l'intégralité du champ de vision et sont utiles pour calculer l'image de microscopie à résolution améliorée de facteur 2 plutôt que pour réaliser une photo-activation localisée. Une autre méthode théorique a été proposée pour créer un point d'éclairage très petit (super-résolution) d'onde évanescente, en étendant l'idée d'interférence laser à une infinité de faisceaux ou un éclairage en anneau au niveau du BFP de l'objectif (« Evanescent excitation and emission in fluorescence microscopy » (Excitation et émission évanescentes en microscopie à fluorescence), Axelrod, D., Biophys. J. 104, 1401–9 (2013)). Malheureusement, le point central résultant pourrait conduire à être entouré par les franges d'interférence circulaires, bien qu'avec des amplitudes décroissantes, et la condition de polarisation nécessaire de l'anneau de lumière dans le BFP n'est pas encore compatible avec les sources de lumière TIRF existantes.
US2016/131885 décrit un dispositif qui est un réseau de diffraction multidirectionnel ou un modulateur de lumière (SLM – Spatial Light Modulator) qui forme un tel réseau. Il peut former des motifs périodiques afin de produire la lumière diffractée dans les ordres +1 et -1 sous éclairage cohérent.
US2012/0319007A1 décrit un dispositif comprenant un générateur de motifs striés, lesquels sont projetés de « façon divergente » sur un échantillon.
La présente invention vise à surmonter les inconvénients de l’état de la technique et a donc pour objet un dispositif de création d’un champ évanescent à motifs sur la surface d’un dioptre séparant deux milieux d’indices de réfraction respectifs n1 et n2, caractérisé par le fait qu’il comprend :
  • un objectif, dans un plan focal image duquel est disposée la surface du dioptre,
  • un élément d’injection de lumière émettant un faisceau de lumière collimaté de diamètre donné,
  • un montage optique entre l’élément d’injection de lumière et l’objectif par lequel le plan objet de l’objectif est conjugué optiquement avec le plan image de l’élément d’injection de lumière, le montage optique étant configuré pour qu’un faisceau de lumière collimaté provenant de l’élément d’injection de lumière soit émis vers l’objectif pour être renvoyé vers la surface du dioptre avec un angle d’incidence minimal θmin supérieur ou égal à l’angle critique θc du dioptre afin que le faisceau de lumière subisse sur la surface du dioptre une réflexion totale interne pour générer une onde évanescente en surface du dioptre,
  • un dispositif optique de formation de motifs dans le plan objet de l’élément d’injection de lumière, monté désaxé par rapport à l’axe optique de l’objectif, de telle sorte que le motif formé par le dispositif optique de formation de motifs en lumière transmise sur le faisceau de lumière dans le plan objet de l’élément d’injection de lumière se retrouve en surface du dioptre.
L’angle critique pour le dioptre est défini par θc = sin-1(n1/n2).
Il est ainsi possible avec l’invention de former une onde évanescente avec une grande liberté de formation de motifs, ce qui n’était pas possible avec l’état de la technique, puisque le motif est formé en amont et peut être défini de manière très précise.
Le faisceau de lumière collimaté est injecté en périphérie de l’objectif, donc de manière désaxée par rapport à l’axe optique de l’objectif.Selon un mode de réalisation, le dispositif comprend en outre au moins un élément optique entre le plan objet de l’élément d’injection de lumière et le montage optique permettant de régler l’un parmi l’amélioration de la résolution du motif formé et le filtrage de l’angle d’incidence du faisceau de lumière sur le dioptre.
On améliore ainsi le motif que l’on souhaite former sur la surface du dioptre par l’onde évanescente. L’invention n’est pas limitée par le nombre d’éléments optiques qui peuvent être ajoutés entre l’élément d’injection de lumière et le montage optique. Ainsi, on pourra avoir par exemple un élément pour l’amélioration de la résolution du motif formé et un élément pour le filtrage de l’angle d’incidence du faisceau de lumière.
Selon un mode de réalisation, l’au moins un élément optique est l’un parmi un diaphragme spatial, un filtre.
Selon un mode de réalisation, le dispositif optique de formation de motifs est au moins l’un parmi un diaphragme, un masque d’amplitude, un modulateur spatial de lumière, une matrice de micro-miroirs. Le masque d’amplitude peut notamment être une fente, un trou ou tout autre motif de dimensions supérieures à la longueur d’onde de la lumière utilisée.
Selon un mode de réalisation, le dispositif de l’invention comprend en outre une source de lumière laser pour générer le faisceau de lumière collimaté à injecter dans l’élément d’injection de lumière. Ainsi, selon l’invention, la lumière collimatée est, de préférence mais pas obligatoirement, un faisceau de lumière cohérent, notamment laser.
Selon un mode de réalisation, le montage optique est constitué par une première lentille intermédiaire dont le plan objet est conjugué optiquement avec le plan image de l’élément d’injection de lumière et dont le plan image est conjugué optiquement avec le plan objet de l’objectif.
De préférence, la première lentille intermédiaire peut être conjuguée optiquement avec l’élément d’injection de lumière par une deuxième lentille intermédiaire dont le plan objet correspond au plan image de l’élément d’injection de lumière et dont le plan image correspond au plan objet de la première lentille intermédiaire.
Le dispositif selon l’invention peut notamment être un microscope de fluorescence par réflexion totale interne, l’échantillon correspondant au dioptre et étant placé dans le plan image de l’objectif du microscope, le montage optique correspondant à l’optique du microscope, l’élément d’injection de lumière étant placé en amont de l’optique du microscope ou étant intégré à l’optique du microscope, le dispositif optique de formation de motifs étant disposé entre une source de lumière et l’élément d’injection de lumière ou étant intégré dans l’optique du microscope.
Le dispositif optique de formation de motifs n’est ainsi pas un réseau de diffraction mais un SLM d’amplitude qui forme dans le plan de champ conjugué une ou plusieurs régions d’intérêt (ROI) localisées, de formes arbitraires. Sa position décalée ou désaxée par rapport à l’axe optique de l’objectif permet d’atteindre l’excitation d’onde évanescente. L’image de Fourier de cette ou ces ROI, focalisée dans le plan pupille de l’objectif, a une étendue spatiale non ponctuelle, et qui est seulement limitée par la largeur de la bande supercritique disponible dans l’objectif TIRF.
L’au moins un élément optique entre le plan objet de l’élément d’injection de lumière et le montage optique permet la sélection d’une bande de fréquences spatiales de la lumière diffractée par les bords de ROI, tout en limitant celle-ci afin de transmettre uniquement les angles « supercritiques ».
L’image de ROI projetée dans le plan pupille de l’objectif n’est pas un spot ponctuel, mais une tache lumineuse dont la taille est limitée par l’espace disponible dans la frange supercritique d’un objectif TIRF.
Cette tache assure donc la transmission des fréquences spatiales du motif, information suffisante pour la reconstruction de son image localisée sur le dioptre constitué par la surface S.
Le dispositif de l’invention permet ainsi une photomanipulation, une photostimulation optogénétique locale, subcellulaire, avec une onde évanescente, limitée latéralement et axialement en 3 dimensions.
La présente invention a également pour objet un procédé de création d’un champ évanescent à motifs sur une surface à l’aide d’un dispositif tel que défini précédemment, caractérisé par le fait qu’il comprend les étapes consistant à :
  • disposer la surface sur le plan image de l’objectif ;
  • former le motif d’amplitude en lumière transmise souhaité dans le plan objet de l’élément d’injection de lumière à l’aide du dispositif de formation de motifs ;
  • injecter un faisceau de lumière collimaté dans l’élément d’injection de lumière.
Selon un mode de réalisation, le champ évanescent de surface est créé sur un échantillon biologique afin d’exciter sélectivement par photoactivation, selon le champ évanescent créé, des régions spécifiques de surface de l’échantillon biologique.
La présente invention peut notamment trouver application en biologie, par exemple pour activer de manière sélective avec un motif choisi des protéines placées sur la surface du dioptre, mais peut également trouver application dans la photolithographie en couches minces ou d’autres méthodes de photochimie de surface utilisant les ondes évanescentes, la microscopie et la photostimulation régiospécifique de nanoparticules, la création de nano-films et de nano-objets entre des phases liquides formant le dioptre, la gravure de codes à barres, grilles ou autres motifs micrométriques sur des surfaces photosensibles, des évolutions régiospécifiques des technologies de résonance de plasmon de surface, le développement d’une activation régiospécifique dans les capteurs à ondes évanescentes, la régionalisation de la production d’ondes évanescentes, le confinement et la manipulation de la lumière par des cristaux photoniques, l’intégration de motifs photoniques sur puces de silicium, le développement de matériaux composites artificiels pour réaliser de nouvelles fonctions optiques, l’optoélectronique, et plus généralement toute application pour laquelle il est nécessaire de former des ondes évanescentes sur une surface avec des motifs prédéterminés.
La présente invention a donc également pour objet une utilisation du dispositif ou du procédé tels que décrits ci-dessus pour les applications indiquées ci-dessus, et notamment la photomanipulation, la photostimulation optogénétique locale, photostimulation optogénétique subcellulaire, avec une onde évanescente, limitée latéralement et axialement en 3 dimensions, par placement de la structure appropriée sur la surface du dioptre.
Pour mieux illustrer l’objet de la présente invention, on va en décrire ci-après, à titre illustratif et non limitatif, des modes de réalisation particuliers en référence aux dessins annexés.
Sur ces dessins :
est un schéma d’un dispositif selon un premier mode de réalisation de la présente invention ;
est un schéma d’un dispositif selon une première variante d’un deuxième mode de réalisation de la présente invention ; et
est un schéma d’un dispositif selon une deuxième variante du deuxième mode de réalisation de la présente invention .
Si l’on se réfère à la Figure 1, on peut voir que l’on y a représenté un dispositif 1 de création d’un champ évanescent à motifs sur une surface S.
La surface S est un dioptre séparant deux milieux d’indices de réfraction différents n1 et n2.
Dans le mode de réalisation non limitatif représenté, on a placé un échantillon E sur la surface S, l’échantillon E étant ici une cellule dont on souhaite activer des protéines de surface par formation d’une onde évanescente sur la surface S.
Dans ce premier mode de réalisation du dispositif 1 selon l’invention, un élément d’injection de lumière 2, constitué par une source de lumière 3 générant un faisceau de lumière collimaté, de préférence cohérent, et une lentille L1 de distance focale f1, crée un faisceau de lumière collimaté B vers un montage optique 4, constitué par un doublet de lentilles L2 et L3, de distances focales respectives f2 et f3, le plan image de la lentille L2 correspondant au plan objet de la lentille L3. Le plan focal image de l’élément d’injection de lumière 2 correspond au plan focal objet de la lentille L2.
Ce faisceau de lumière B est dirigé en sortie du montage optique 4 vers un objectif O de distance focale fO, le plan focal objet de l’objectif O correspondant au plan focal image de la lentille L3.
Le faisceau de lumière collimaté B est injecté dans le montage optique 4 de manière désaxée par rapport à l’axe optique du montage optique 4.
La surface S est placée dans le plan focal image de l’objectif O.
En outre, le montage optique 4 et l’objectif O sont configurés pour que le faisceau de lumière B émis du montage optique 4 vers l’objectif O soit incident sur la surface S avec un angle supérieur à l’angle critique θc = sin-1(n1/n2) du dioptre constitué par la surface S afin d’avoir une réflexion interne totale et de générer dans l’échantillon E une onde évanescente. L’injection du faisceau de lumière B de manière désaxée par rapport à l’axe optique du montage optique 4 permet une incidence de celui-ci en sortie du montage optique 4 sur la partie périphérique de l’objectif O. Le faisceau de lumière B réfléchi par la surface S est renvoyé vers l’objectif O pour être focalisé dans le plan focal arrière BFP de l’objectif O sous forme d’un faisceau divergeant et non parallèle, la taille de l'image de Fourier du motif, formée dans la périphérie du plan focal arrière BFP, n'étant pas ponctuelle, mais limitée par l'épaisseur de la marge supercritique disponible. Ainsi, le faisceau de lumière B provenant du montage optique 4 n’est pas incident sur l’objectif O selon son axe optique, mais est incident sur l’objectif O en périphérie de celui-ci, permettant une réflexion sur la surface S avec un angle supérieur à l’angle critique θc. Ainsi ce qui est projeté sur l’objectif O et réfléchi sur la surface S est directement le motif que l’on cherche à former, déjà formé dans le faisceau de lumière B.
Contrairement à l’état antérieur de la technique, le motif à former sur la surface S est formé en amont de l’objectif, et n’est pas issu d’une interférence optique formée sur l’objectif par un ou plusieurs faisceaux incidents.
Un élément de formation de motif FS1 est placé dans le plan focal objet de la lentille L1 et permet de former, à partir de la lumière provenant de la source 3, un faisceau de lumière collimaté B avec un motif formé dans celui-ci qui, par l’intermédiaire du montage optique 4 et de l’objectif, sera formé sur la surface S afin de générer sur celle-ci une onde évanescente avec motif. L’élément de formation de motif FS1 peut notamment être un diaphragme de champ, mais pourrait aussi être, sans s’écarter de la portée de la présente invention, un diaphragme, un masque d’amplitude, un modulateur spatial de lumière, une matrice de micro-miroirs.
Le diaphragme d’ouverture AS dans le plan focal image de la lentille L1 sert à filtrer la lumière réfléchie par les bords du diaphragme de champ FS1, afin d’assurer que la lumière arrive sur la surface S à un angle supérieur ou égal à l’angle critique θc, pour ne pas produire d’excitation en champ lointain. Même si la netteté des bords de motif dans le plan de l’échantillon E diminue avec la diminution de l’ouverture du diaphragme d’ouverture AS, il a été constaté expérimentalement qu’il était possible de former des motifs pour des régions de dimensions supérieures à la longueur d’onde du faisceau de lumière, notamment des régions de dimensions 5 à 10 fois supérieures à la longueur d’onde du faisceau de lumière B (des régions de taille 3-5 µm avec l’excitation à 515 nm).
Dans ce premier mode de réalisation, le montage optique et l’objectif peuvent par exemple être intégrés à un microscope existant. L’invention permet alors, à partir d’un microscope existant, de former un motif sur la surface S, sans avoir à toucher à l’optique du microscope, à partir uniquement de l’extérieur du microscope. Ce mode de réalisation permet d’éviter toute occlusion du chemin optique et par conséquent de conserver l’ouverture, la sensibilité et la résolution du microscope. On évite ainsi toute réduction dans le canal de détection.
Si l’on se réfère à la Figure 2, on peut voir que l’on a représenté un dispositif 10 selon une première variante d’un deuxième mode de réalisation de l’invention.
Dans cette première variante, la source de lumière 13 émet vers le miroir M un faisceau de lumière collimaté, le miroir M réfléchissant le faisceau vers un diaphragme de champ FS. L’élément d’injection de lumière est dans cette variante constitué par le miroir M. Il est à noter que la lumière pourrait aussi être collimatée à la sortie d’une fibre optique directement dans le statif du microscope, ou encore introduite et collimatée grâce à tout autre moyen optique adapté.
Par l’intermédiaire d’une lentille L’, de distance focale f’, constituant le montage optique 14, le faisceau lumineux B issu du diaphragme de champ FS est envoyé vers l’objectif O, toujours pour arriver sur la surface S avec un angle d’incidence θ supérieur à l’angle critique θc pour générer une réflexion totale interne sur la surface S et une onde évanescente dans celle-ci, le faisceau réfléchi par la surface S vers l’objectif O étant focalisé sur le plan focal arrière BFP de l’objectif O. Comme pour le premier mode de réalisation, le diaphragme d’ouverture AS permet de filtrer la lumière réfléchie par les bords du diaphragme FS afin de ne laisser passer que les rayons ayant un angle d’incidence supérieur à l’angle critique θc. Egalement comme pour le premier mode de réalisation, le faisceau lumineux est désaxé par rapport à l’axe optique de l’objectif O, pour être incident sur l’objectif O en périphérie de celui-ci est être renvoyé avec la surface S avec un angle supérieur ou égal à l’angle critique θc Ce montage pourrait par exemple être intégré directement dans de nouveaux types de microscopes.
La Figure 3 est une variante de la Figure 2 d’un dispositif 20 selon une deuxième variante du deuxième mode de réalisation, et les éléments portant la même référence ne seront pas décrits plus en détail. La différence réside dans le moyen de former un motif en amont du montage optique 24, le motif étant formé ici par une réflexion de la lumière collimatée issue de la source de lumière 23 sur un micro-miroir numérique DMD, ledit micro-miroir numérique DMD réfléchissant la lumière vers un dispositif de formation de motif BS réfléchissant uniquement une partie de la lumière reçue avec un motif vers le micro-miroir numérique DMD, qui l’injecte dans la lentille L’ de manière identique à ce qui a été décrit en référence à la Figure 2. Egalement comme pour le premier mode de réalisation, le faisceau lumineux est désaxé par rapport à l’axe optique de l’objectif O, pour être incident sur l’objectif O en périphérie de celui-ci est être renvoyé avec la surface S avec un angle supérieur ou égal à l’angle critique θc
L’invention peut donc être mise en œuvre avec un microscope existant, par exemple dans le cas du premier mode de réalisation, ou être intégré à un microscope, comme dans le cas du deuxième mode de réalisation.
L’invention peut être appliquée à la photolithographie, la photochimie de surface, la microscopie et la photostimulation régiospécifique de nanoparticules, la création de nano-films et de nano-objets entre des phases liquides formant le dioptre, la gravure de codes à barres, grilles ou autres motifs micrométriques sur des surfaces photosensibles, des évolutions régiospécifiques des technologies de résonance de plasmon de surface, le développement d’une activation régiospécifique dans les capteurs à ondes évanescentes, la régionalisation de la production d’ondes évanescentes, le confinement et la manipulation de la lumière par des cristaux photoniques, l’intégration de motifs photoniques sur puces de silicium, le développement de matériaux composites artificiels pour réaliser de nouvelles fonctions optiques, l’optoélectronique.
La présente invention trouve également une application particulièrement intéressante en biologie, par exemple pour l’adressage optogénétique de structures subcellulaires de périmembranes ou leur formation (par exemple, adhésion focale, podosome, lamellipode, vésicule d’endo ou d’exocytose, ancrage cytosquelettique), pour le contrôle local fin de la géométrie, de la polarité et du mouvement cellulaire, pour l’activation locale de récepteurs de membrane plasmique (EGFR, IGFR, …) ou de facteurs de transcription (Stat3, 5, …) sans modifier leur réserve nucléaire (essentiel pour des analyses par spectroscopie à corrélation de fluorescence (acronyme anglais FCS pour Fluorescence Correlation Spectroscopy) par exemple), pour la quantification de la vitesse de signalisation subcellulaire entre des structures membranaires séparées , pour la structuration de substrats cellulaires par des procédés de photolithographie avec une résolution latérale micrométrique et axiale nanométrique.

Claims (10)

  1. – Dispositif (1 ; 10 ; 20) de création d’un champ évanescent à motifs sur la surface (S) d’un dioptre séparant deux milieux d’indices de réfraction respectifs n1 et n2, caractérisé par le fait qu’il comprend :
    • un objectif (O), dans un plan focal image duquel est disposée la surface (S) du dioptre,
    • un élément (2 ; 12 ; 22) d’injection de lumière émettant un faisceau de lumière (B) collimaté de diamètre (d),
    • un montage optique (4 ; 14 ; 24) entre l’élément (2 ; 12 ; 22) d’injection de lumière et l’objectif (O) par lequel le plan objet de l’objectif (O) est conjugué optiquement avec le plan image de l’élément (2 ; 12 ; 22) d’injection de lumière, le montage optique (4 ; 14 ; 24) étant configuré pour qu’un faisceau de lumière collimaté (B) provenant de l’élément (4 ; 14 ; 24) d’injection de lumière soit émis vers l’objectif (O) pour être renvoyé vers la surface (S) du dioptre avec un angle d’incidence minimal θmin supérieur ou égal à l’angle critique du dioptre θc afin que le faisceau de lumière (B) subisse sur la surface (S) du dioptre une réflexion totale interne pour générer une onde évanescente en surface (S) du dioptre,
    • un dispositif optique (FS1 ; BS) de formation de motifs dans le plan objet de l’élément (2 ; 12 ; 22) d’injection de lumière, monté désaxé par rapport à l’axe optique de l’objectif (O), de telle sorte que le motif formé par le dispositif optique de formation de motifs en lumière transmise sur le faisceau de lumière dans le plan objet de l’élément (2 ; 12 ; 22) d’injection de lumière se retrouve en surface du dioptre, le faisceau de lumière (B) réfléchi par la surface (S) étant renvoyé vers l’objectif (O) pour être focalisé dans le plan focal arrière (BFP) de l’objectif (O).
  2. – Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu’il comprend en outre au moins un élément optique (AS) entre le plan objet de l’élément (2 ; 12 ; 22) d’injection de lumière et le montage optique permettant de régler l’un parmi l’amélioration de la résolution du motif formé et le filtrage de l’angle d’incidence du faisceau de lumière (B) sur le dioptre.
  3. – Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l’une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l’au moins un élément optique est l’un parmi un diaphragme spatial, un filtre.
  4. – Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le dispositif optique de formation de motifs est au moins l’un parmi un diaphragme, un masque d’amplitude, un modulateur spatial de lumière, une matrice de micro-miroirs.
  5. – Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu’il comprend en outre une source de lumière laser pour générer le faisceau de lumière collimaté à injecter dans l’élément d’injection de lumière.
  6. – Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le montage optique est constitué par une première lentille intermédiaire dont le plan objet est conjugué optiquement avec le plan image de l’élément d’injection de lumière et dont le plan image est conjugué optiquement avec le plan objet de l’objectif (O).
  7. – Dispositif (1) selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la première lentille intermédiaire est conjuguée optiquement avec l’élément d’injection de lumière par une deuxième lentille intermédiaire dont le plan objet correspond au plan image de l’élément d’injection de lumière et dont le plan image correspond au plan objet de la première lentille intermédiaire.
  8. – Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que le dispositif est un microscope de fluorescence par réflexion totale interne, l’échantillon correspondant au dioptre et étant placé dans le plan image de l’objectif du microscope, le montage optique correspondant à l’optique du microscope, l’élément d’injection de lumière étant placé en amont de l’optique du microscope ou étant intégré à l’optique du microscope, le dispositif optique de formation de motifs étant disposé entre une source de lumière et l’élément d’injection de lumière ou étant intégré dans l’optique du microscope.
  9. – Procédé de création d’un champ évanescent à motifs sur une surface à l’aide d’un dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu’il comprend les étapes consistant à :
    • disposer la surface (S) sur le plan image de l’objectif (O) ;
    • former le motif d’amplitude en lumière transmise souhaité dans le plan objet de l’élément (2 ; 12 ; 22) d’injection de lumière à l’aide du dispositif de formation de motifs (FS1, BS) ;
    • injecter un faisceau de lumière collimaté dans l’élément (2 ; 12 ; 22) d’injection de lumière.
  10. – Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait le champ évanescent de surface est créé sur un échantillon biologique (E) afin d’exciter sélectivement par photoactivation, selon le champ évanescent créé, des régions spécifiques de surface de l’échantillon biologique (E).
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