EP4689053A1 - Mikrofluidische vorrichtung zur kultivierung eines gewebeschnitts - Google Patents

Mikrofluidische vorrichtung zur kultivierung eines gewebeschnitts

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Publication number
EP4689053A1
EP4689053A1 EP24708201.9A EP24708201A EP4689053A1 EP 4689053 A1 EP4689053 A1 EP 4689053A1 EP 24708201 A EP24708201 A EP 24708201A EP 4689053 A1 EP4689053 A1 EP 4689053A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
layer
recess
microfluidic
tissue section
microfluidic channels
Prior art date
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Pending
Application number
EP24708201.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd SCHEUFELE
Matthias Schwab
Erich Aulitzky
Meng DONG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch Gesellschaft Fuer Medizinische Forschung Mbh Rbmf
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch Gesellschaft Fuer Medizinische Forschung Mbh Rbmf
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch Gesellschaft Fuer Medizinische Forschung Mbh Rbmf, Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch Gesellschaft Fuer Medizinische Forschung Mbh Rbmf
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/40—Manifolds; Distribution pieces
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device for cultivating a tissue section, in particular a tumor tissue section, for example for drug testing.
  • the present invention also relates to a method for cultivating a tissue section.
  • cancer patients with solid tumors respond differently to drug-based cancer therapy.
  • the main reasons for this are the individual variability and heterogeneity of the tumors as well as the complexity of the tumor microenvironment.
  • There is a great need for increasing personalization of cancer treatment which takes into account, among other things, the cellular characteristics of the individual patient in order to be able to derive an individually optimized therapy.
  • cancer tissue can be removed from a patient during a biopsy or surgery. The cancer tissue is then cultured and used for in vitro testing of cancer drugs and to investigate the individual drug effects.
  • In vitro testing requires a suitable cell-based tumor model that can be obtained from tissue samples from cancer patients and that reflects key aspects of complex in vivo tumor biology. Thin tissue sections are prepared from the removed tumor sample. These tumor tissue sections are particularly suitable for use as a tumor model because they preserve the in vivo tissue heterogeneity with different cell types and the preserved tumor microenvironment.
  • Various methods have been developed for culturing tumor tissue sections, but these only allow for a limited cultivation time. After a few days, the viability of the cells in the tissue section decreases significantly and the cells die. In addition, the cultivation methods or systems are not able to adequately replicate physiologically relevant in-vivo conditions.
  • tissue sections are cultured in a suitable medium, either floating or lying on a filter.
  • the most commonly used cultivation system is a tissue culture insert for multiwell plates (Millipore filter).
  • the tissue sections are cultured at the air-liquid interface, which achieves a higher oxygen supply.
  • the limited cultivation time of tissue sections is mainly due to the fact that the tumor tissue removed during a biopsy or surgery is separated from the blood supply. Cutting the tumor tissue destroys its three-dimensional tissue structure and the functionality of the blood and lymph vessels is lost.
  • a microfluidic device for cultivating a tissue section is proposed.
  • the tissue section is a tumor tissue section.
  • the microfluidic device has several layers, which can also be interpreted as different microfluidic components.
  • a first layer has a recess in which a tissue section can be accommodated.
  • the recess can generally have any shape, but a circular shape is suitable due to the ease of manufacture.
  • the shape of the recess can be adapted to the tissue section and for example, trace its outer contour.
  • the first layer is open on at least one side, in particular on one of the main surfaces, ie it has a recess on at least one side.
  • the main surfaces here are the (typically two) side surfaces with the largest extent.
  • the microfluidic device also has at least one further, for example second, layer, which is arranged on one of the main surfaces of the first layer.
  • the second layer has a network of microfluidic channels.
  • the microfluidic network has an irregular structure in particular, which is modeled on a vascular system around a tumor.
  • the characteristic blood vessel systems of tumor tissue are reproduced by the network of microfluidic channels.
  • strong cell growth and the expression of angiogenic factors lead to the development of blood vessel networks that differ significantly from normal vasculature.
  • These blood vessels are incompletely formed, hyperpermeable and have inconsistent diameters as well as irregular structures and shapes, such as bulges, shunts, vessels closed on one side and the like.
  • the lymph vessels are dilated and more permeable.
  • the vascular system characteristic of tumors has a decisive effect on the local distribution of oxygen and nutrients, on the further development of the tumor and the tumor microenvironment, and on the delivery of drugs to the tumor cells.
  • the microfluidic channels of the network can simulate arterial, venous and, if necessary, lymphatic capillaries.
  • the microfluidic channels have non-uniform diameters and shapes and form, for example, bulges, shunts and/or vessels that are closed on one side. In this way, an abnormal tumor vascular system is simulated in vitro.
  • the channels of the second layer also have openings - also referred to as pores - towards the first layer.
  • the microfluidic channels of the second layer are in fluidic contact with the recess in the first layer and thus with the tissue section that can be placed in the recess, and fluids can be supplied and/or removed.
  • the diameters of the Openings can be selected as required and are preferably between 1 pm and 100 pm.
  • the microfluidic channels ensure a defined supply of nutrients and oxygen to the tissue section and, for example, the removal of metabolic products.
  • a culture medium with a predeterminable composition of nutrients and a predeterminable oxygen concentration is fluidically supplied to the tissue section.
  • the culture medium flowing past the tissue section absorbs the cellular metabolic products that have formed in it and is then removed via one or more microfluidic channels. This achieves dynamic perfusion of the tissue section to be cultivated.
  • a pharmacological active substance solution with a defined volume and concentration can be dosed into the tissue section via the microfluidic channels. This can be used in drug testing to ensure precise delivery of drug solutions to the tissue section.
  • fluidic pressure increases pressure of the interstitial fluid
  • Leaky vessels combined with the disturbed drainage system lead to high fluidic pressure.
  • the fluidic pressure that acts on the tissue section and the cells contained therein can be realized in vitro by building up a pressure difference between the microfluidic inlets and outlets of at least one microfluidic network. Values for the fluidic pressure of, for example, approx. 1 kPa (7.5 mmHg) as in brain tumors and up to 5 kPa (37 mmHg) as in kidney carcinomas can be achieved.
  • a pump mechanism such as a syringe pump or a peristaltic pump can be provided for the supply and discharge of the fluid, which connected to the microfluidic channels
  • the pump mechanism can be set with a suitable selectable flow rate.
  • the first layer can have at least one microfluidic channel that is connected to the recess.
  • the at least one microfluidic channel recreates the lymphatic system that surrounded the tissue section in vivo in vitro and serves to drain fluids and metabolic products.
  • Exactly one microfluidic channel with a suitable diameter can be provided for drainage.
  • several microfluidic channels can be provided, which can in particular form a network with complex structures and shapes. In this way, several and irregularly running lymphatic vessels can be imitated.
  • the additional, second layer can already be sufficient if the recess in the first layer is closed on one side, either by the first layer itself or by a simple additional layer or component.
  • the supply and removal are realized via the same microfluidic network in the second layer, optionally together with the at least one microfluidic channel in the first layer.
  • the microfluidic device has a second and a third layer, each of which is arranged on the main surfaces of the first layer.
  • the second layer is arranged on one main surface of the first layer and the third layer is arranged on the other main surface of the first layer, which are preferably opposite each other.
  • the supply and removal of fluids can take place in both microfluidic networks of the second and third layers.
  • the tissue section is supplied from several sides.
  • the supply and removal can take place separately in the layers.
  • the microfluidic networks can be identical in both layers. This makes it easier to produce the layers and provides an evenly distributed supply to the tissue section.
  • the microfluidic networks of the two layers can differ from each other. This allows the supply and removal of culture medium, oxygen and, if necessary, drug solution to be implemented differently on both sides of the tissue section.
  • the recess in the first layer is open on both sides. This is easily achieved by drilling a through hole through the first layer, which then serves as a recess.
  • the thickness of the first layer is preferably selected to be smaller than the thickness of the tissue section.
  • the thickness of the first layer is preferably in the range of 150 pm to 400 pm.
  • Tissue sections which, for example, have a thickness greater than the thickness of the first layer are thus clamped by the second layer and in particular by the second and third layers.
  • the clamping exerts mechanical pressure on the tissue layer. This imitates mechanical tensions and pressures which arise inside and outside the tumor when proliferating and moving tumor cells press on the surrounding tissue and stretch it.
  • the mechanical pressure can reach values of, for example, 100 Pa in brain tumors and 10 kPa in pancreatic carcinomas.
  • the mechanical pressure can compress blood and lymph vessels in and around the tumors, which affects blood flow and the supply of oxygen, medication and immune cells.
  • the resulting mechanical forces at the tissue and cell level activate signaling pathways that promote tumor formation, proliferation and invasiveness of cancer cells and cause treatment resistance.
  • the thickness of the first layer can be the same or greater than the thickness of the tissue section. In this case, no mechanical pressure is exerted on the tissue layer.
  • the shape of the tissue section is chosen so that it corresponds to the general shape of the recess. In the case of a circular recess, the tissue section is generated as circular as possible.
  • the shape of the tissue section does not have to correspond exactly to the shape of the recess and can, for example, have indentations and/or bulges that deviate from the ideal shape of the recess.
  • the cross-sectional area of the tissue section should correspond at most to the cross-sectional area of the recess.
  • the longest side or the longest radius of the tissue section should correspond at most to the longest side or the longest radius of the recess.
  • the tissue section is generated with a thickness that is greater than the thickness of the first layer.
  • the thickness of the first layer can be selected in advance so that it is smaller than the thickness of the expected tissue section.
  • the thickness of the tissue layer is preferably in the range of 150 pm to 400 pm.
  • the tissue section is placed in the recess of the first layer.
  • the first layer is then covered with at least a second layer.
  • the second layer is arranged so that the recess of the first layer is flush with the area of the second layer in which the openings for the microfluidic channels are provided.
  • the second layer and the first layer are connected, for example, by pressing them together.
  • the fluids can be a cultivation medium with a predetermined concentration of nutrients and a predetermined oxygen concentration.
  • the fluids can be a cultivation medium with a predetermined concentration of nutrients and a predetermined oxygen concentration.
  • at least one drug solution with a predetermined concentration can also be supplied.
  • the microfluidic device further comprises a third layer
  • one of the further layers for example the second layer
  • the second layer is arranged in such a way that the recess of the first layer is flush with the area of the second layer in which the openings for the microfluidic channels are provided.
  • the tissue section is then placed in the recess of the first layer and placed on the second layer, for example. The tissue section thus comes into contact with the area of the second layer in which the openings for the microfluidic channels are provided.
  • another layer for example a third layer, is placed on the first layer.
  • the third layer is arranged so that the recess of the first layer is flush with the area of the third layer in which the openings for the microfluidic channels are provided.
  • the layers can be connected to one another, for example by pressing them together.
  • either the supply and removal of the fluids can take place in the fluidic networks of each of the two layers or the fluids are supplied via the fluidic network of one layer, for example the second layer, and removed via the fluidic network of the other layer, for example the third layer.
  • At least one microfluidic channel is provided in the first layer, which is connected to the recess, it can be provided to drain fluid from the recess and thus from the tissue section via the at least one microfluidic channel in the first layer. Metabolic products can also be drained with the fluid.
  • the at least one microfluidic channel recreates a lymphatic vessel of the tissue, in particular a tumor, in vitro.
  • Figure 1 shows an exploded view of an embodiment of the microfluidic device according to the invention.
  • Figure 2 shows a top view of a first layer of the microfluidic device of Figure 1 .
  • Figure 3 shows a top view of a second layer of the microfluidic device of Figure 1
  • Figures 4a, b each show a cross-section of the microfluidic device from Figure 1 in the separated state ( Figure 4a) and in the assembled state (Figure 4b)
  • Figures 5a-d each show a cross-section through the second layer at different stages of the manufacturing process.
  • Figure 6 shows a flow chart of an embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 1 shows an exploded view of a microfluidic device for cultivating a tissue section 4.
  • the microfluidic device has a first layer 1, a second layer 2, which is arranged below the first layer 1, and a third layer 3, which is arranged above the first layer 1.
  • the first layer 1 has a recess 10 designed as a circular through-opening, in which the tissue section 4 is received.
  • the first layer 1 has a thickness di that is smaller than the thickness d4 of the tissue section 4. In further embodiments not shown, the thickness di of the first layer 1 is the same size or larger than the thickness d4 of the tissue section d4.
  • a microfluidic channel 11 is connected to the recess 10, which functionally replicates a lymphatic vessel of the tissue section 4, in particular of a solid tumor.
  • the second layer 2 and the third layer 3 are identical in this embodiment.
  • the following description refers to the second layer 2, but can be adopted for the third layer 3 (unless an explicit distinction is made between the layers).
  • the second layer 2 has a network of microfluidic channels 21, which in an area 20 reproduce irregular structures and shapes of the blood vessels of the tissue section 4, in particular characteristic tumor blood vessels.
  • the third layer 3 has a network of microfluidic channels 31, which in an area 30 also reproduce the irregular structures and shapes of the blood vessels of the tissue section 4, in particular characteristic tumor blood vessels.
  • the two microfluidic networks of the second layer 2 and the third layer 3 as well as their microfluidic channels 21 and 31 are identical.
  • the two regions 20 and 30 are arranged below and above the recess 10 of the first layer 1, respectively, flush with the latter and correspond to the shape of the recess 10, i.e. they have a circular shape with the same radius.
  • the second layer 2 and the third layer 3 or their microfluidic networks or the microfluidic channels 21 and 31 can be designed differently. In this case, the supply and removal of fluids can also be realized in different layers 2, 3.
  • Figure 2 shows a top view of the first layer 1.
  • the first layer 1 has a recess 10 designed as a through-opening, which serves to receive the tissue section 4.
  • the shape, radius and position of the recess 10 correspond to the areas 20 and 30 of the second layer 2 and the third layer 3.
  • the through-opening is circular in this embodiment.
  • other shapes can be realized, which are adapted, for example, to the outer contours of the tissue section 4.
  • the recess 10 is followed by a microfluidic channel 11, which functionally replicates a lymphatic vessel of the tissue section 4, in particular of a solid tumor.
  • exactly one microfluidic channel 11 is provided.
  • several drainage channels can also be provided.
  • the microfluidic channel 11 has a microfluidic port on the side of the first layer 1, via which the fluid is discharged from the microfluidic device.
  • a pump unit such as a syringe pump or a peristaltic pump, can be connected to the microfluidic port.
  • Figure 3 shows a top view of the second layer 2.
  • the third layer 3 is identical in the present embodiment, so that the following description can be adopted for the third layer 3.
  • the second layer 2 has microfluidic channels 21 beneath its surfaces.
  • the second layer 2 has a microfluidic connection.
  • both the supply and the removal of fluids are realized in the second layer 2 (and accordingly also in the third layer 3).
  • a fluid can be supplied via the left connection. and discharged via the right connection.
  • the microfluidic connections can be connected to pump units, such as a syringe pump or a peristaltic pump.
  • the microfluidic channels 21 form a network that mimics the irregular structures and shapes of in-vivo blood vessels in the tissue section, in particular the characteristic tumor blood vessels in solid tumors.
  • the geometric design of the microfluidic channels 21 is irregular and these can have different and non-uniform diameters, bulges, constrictions, vessels ending on one side, shunts and/or the like.
  • the diameter of the microfluidic channels 21 is advantageously between 5 pm and 500 pm.
  • the microfluidic channels 21 also have small openings 22 (see Figure 4) that are open towards the first layer 1.
  • a fluid can exit from the microfluidic channels 21 of the second layer 2 into the recess 10 of the first layer 1.
  • a fluid can exit from the recess 10 into the microfluidic channels 21 of the second layer 2.
  • the microfluidic channels 21 can also be regular and orderly.
  • the microfluidic channels 21 in Figure 3 to the left of the area 20 form an orderly, tree-like branched structure.
  • the microfluidic channels 21 open into a single microfluidic channel, which leads to the microfluidic connection for the discharge on the right side.
  • further suitable channel structures may be provided within the second layer 2.
  • Figures 4a, b each show a cross-section of the microfluidic device.
  • the layers 1, 2, 3 are shown separated from one another.
  • the microfluidic device is shown in the assembled state in which the layers 1, 2, 3 are connected to one another, in particular by pressing.
  • the second layer 2 has openings 22 in the region 20 (see Figures 1 and 3) starting from the microfluidic channels 21 in the direction of the first layer 1.
  • the third layer also has 3 in the area 30 starting from the microfluidic channels 31 in the direction of the first layer 1 has openings 32.
  • the openings 22 can also be interpreted as pores. Fluids can pass from the microfluidic channels 21, 31 through the openings 22, 23 into the recess 10 of the first layer 1 and thus to the tissue section 4.
  • fluids can pass from the recess 10 via the openings 22, 23 into the microfluidic channels 21, 31 and then be transported away.
  • the geometric design ie the size, shape and spacing of the openings 22, 32, can be selected to suitably achieve a higher or lower permeability of the microfluidic channels 21, 31 for the fluids locally.
  • the diameters of the circular openings 22, 32 here are, for example, 50 pm.
  • the thickness d4 of the tissue section 4 is selected to be greater than the thickness di of the first layer 1.
  • the thickness di of the first layer 1 can be selected to suit the application during the manufacture of the microfluidic device.
  • the thickness d4 of the tissue section 4 can be determined, for example, by a measurement.
  • the tissue section 4 is generated with a thickness d4 of 160 pm.
  • the thickness di of the first layer 1 is 140 pm here, for example. In the separated state in Figure 4a, the thickness di of the first layer 1 is thus less than the tissue section thickness d4.
  • an adjustable mechanical pressure is thus applied, which imitates the in-vivo situation, particularly in the case of solid tumors.
  • the strength of the adjustable mechanical pressure depends on the difference between the tissue section thickness d4 and the thickness di of the first layer 1. This can be determined, for example, by previously carried out experimental tests and stored, for example, in a characteristic curve.
  • the thickness di of the first layer 1 is greater than the thickness d4 of the tissue section 4, so that cultivation and drug testing can be carried out without mechanical pressure on the tissue section 4.
  • a pressure difference is built up between the inlet connections of the second layer 2 and the third layer 3 and the outlet connections of the second layer 2 and the third layer 3 as well as the microfluidic channel 11 of the first layer 1.
  • a defined fluidic pressure can be set on the cultured tissue section 4.
  • the second layer 2 and the third layer 3 are designed differently.
  • the supply of the culture medium, the oxygen and, if applicable, the drug solution can take place via the microfluidic channels 21 of the second layer 2.
  • the culture medium that has flowed past and the absorbed cellular metabolic products are then discharged on the other side via the microfluidic channels 31 of the third layer 3.
  • the separate supply and discharge ensures that only the culture medium that has flowed past the tissue section 4 is discharged.
  • Figures 5a-d show various stages of the manufacturing process for the second layer 2 and the microfluidic channel 21.
  • the manufacturing process for the third layer 3 and the microfluidic channel 31 is identical, so that the following description can be adopted.
  • a substrate for the second layer 2 is initially provided. Materials known per se can be used for this.
  • a microfluidic channel 21 is formed in this substrate 23 using methods known per se.
  • the microfluidic channel 21 is covered with a cover 24.
  • the same material is used for the cover 24 as for the substrate 23.
  • the openings 22 described above are incorporated into the cover 24, as shown in Figure 5d.
  • Figure 6 shows a flow chart of an embodiment of the method according to the invention.
  • the layers 1, 2 and 3 are produced or provided 100.
  • the first layer 1 is produced by drilling a through hole into a substrate with the thickness di, which acts as a recess 10.
  • a microfluidic channel 11 is then formed between the recess 10 and one side of the first layer 1.
  • the second layer 2 and the third layer 3 are produced as described above in the The microfluidic device is produced as described in connection with Figure 5.
  • the first layer 1 is placed 101 on the second layer 2.
  • the region 20 of the second layer 2 is arranged flush below the recess 1.
  • the tissue section 4 has a shape that corresponds to the recess 10, with a diameter that is equal to or smaller than the diameter of the recess 10 and with a thickness d4 that is smaller here than the thickness di of the first layer 1.
  • the tissue section 4 is then introduced 104 into the recess 10 of the first layer 1.
  • it is placed on the second layer 2, for example.
  • the recess 10 and the second layer 2 as the base together form a cavity.
  • the third layer 3 is placed 105 on the first layer 1 so that the cavity is closed.
  • the area 30 of the third layer 3 is arranged flush above the recess 10.
  • the three layers 1, 2, 3 are then mechanically connected 106 and fastened by pressing.
  • the first layer 1 can be placed on the third layer 3 in step 101.
  • the recess 10 and the third layer 3 as the base together form a cavity.
  • the second layer 2 is then placed on the first layer 1.
  • a supply 107 of fluids is provided.
  • the fluids are introduced into the recess 10 of the first layer via the microfluidic channels 21, 31 of the second layer 2 and the third layer 3 and are thus supplied to the tissue section 4.
  • the supplied fluids are drained via the microfluidic channels 21, 31 of the second layer 2 and the third layer 3 and via the microfluidic channel 11 of the first layer 1.
  • a pump system is controlled at the inlets and outlets of the microfluidic channels 11, 21, 31.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung eines Gewebeschnitts (4). Diese weist eine erste Schicht (1) mit zwei Haupt-Oberflächen und mit einer Aussparung (10) zur Aufnahme des Gewebeschnitts (4), die zumindest zu einer Seite hin geöffnet ist, und zumindest eine weitere Schicht (2, 3), die an der ersten Schicht (1) angeordnet ist und zumindest im Bereich (20, 30) der Aussparung (10) ein Netzwerk aus mikrofluidischen Kanälen (21, 31) aufweist, auf. Die mikrofluidischen Kanäle (21, 31) weisen Öffnungen (22, 32) auf, mit denen sie in fluidischem Kontakt zu der Aussparung (10) in der ersten Schicht (1) stehen.

Description

Beschreibung
Titel
Mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung eines Gewebeschnitts
Die vorliegende Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung eines Gewebeschnitts, insbesondere eines Tumor-Gewebeschnitts beispielsweise für die Medikamententestung. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kultivierung eines Gewebeschnitts.
Stand der Technik
Krebspatienten mit soliden Tumoren sprechen leider unterschiedlich gut auf eine medikamentöse Krebstherapie an. Wesentliche Gründe hierfür sind die individuelle Variabilität und Heterogenität der Tumore sowie die Komplexität der Tumormikroumgebung. Es besteht hoher Bedarf an einer zunehmenden Personalisierung der Krebsbehandlung, welche u.a. zelluläre Besonderheiten des einzelnen Patienten berücksichtigt, um eine individuell optimierte Therapie ableiten zu können. Des Weiteren besteht hoher Bedarf nach einem verlässlichen in-vitro-Tumormodell, welches die in-vivo-Situation ausreichend widerspiegelt und für die Entwicklung und präklinische Testung von neuen Antitumor-Wirkstoffen eingesetzt werden kann.
Im Rahmen einer Biopsie bzw. Operation kann beispielsweise Krebsgewebe von einem Patienten entnommen werden. Das Krebsgewebe wird dann kultiviert und für eine in-vitro-Testung von Krebsmedikamenten und Untersuchung der individuellen Medikamentenwirkungen verwendet. Für die in-vitro-Testung ist ein geeignetes zellbasiertes Tumormodell erforderlich, das aus Gewebeproben von Krebspatienten gewonnen werden kann und zentrale Aspekte der komplexen in- vivo-Tumorbiologie abbildet. Aus der entnommenen Tumorprobe werden dünne Gewebeschnitte hergestellt. Diese Tumor-Gewebeschnitte zeichnen sich für die Verwendung als Tumormodell insbesondere durch den Erhalt der in-vivo- Gewebeheterogenität mit verschiedenen Zelltypen und der konservierten Tumormikroumgebung aus. Für die Kultivierung von Tumor-Gewebeschnitten wurden verschiedene Methoden entwickelt, die jedoch nur eine begrenzte Kultivierungszeit ermöglichen. Nach wenigen Tagen nimmt die Viabilität der Zellen des Gewebeschnitts deutlich ab und die Zellen sterben. Zudem sind die Kultivierungsmethoden bzw. -Systeme nicht in der Lage, physiologisch relevante in-vivo-Gegebenheiten in ausreichendem Maße nachzubilden.
Heutzutage werden zur Kultivierung die viablen Tumorgewebeschnitte in einem geeigneten Medium schwimmend oder auf einem Filter liegend kultiviert. Das am häufigsten verwendete Kultivierungssystem ist ein Gewebekultur-Einsatz für Multiwell-Platten (Millipore-Filter). Dabei werden die Gewebeschnitte an der Luft- Flüssigkeits-Grenze kultiviert, womit eine höhere Sauerstoffversorgung erreicht wird.
Zudem existieren Kultivierungsansätze, bei denen anstelle einer statischen Kultivierung eine fluidische Zuführung von Kulturmedium zu den Gewebeschnitten realisiert ist. Beispielsweise wurde das sogenannte Perfusion Air Culture (PAC)-System mit einstellbarer Medium- bzw. Medikamentenzufuhr entwickelt, das in der WO 2019/029947 A1 offenbart ist.
Die begrenzte Kultivierungsdauer von Gewebeschnitten ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, dass das im Rahmen einer Biopsie bzw. Operation entnommene Tumorgewebe von der Blutversorgung getrennt wird, Durch das Schneiden des Tumorgewebes wird dessen dreidimensionale Gewebestruktur zerstört und die Funktionalitäten der Blut- und Lymphgefäße geht verloren.
Offenbarung der Erfindung
Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung eines Gewebeschnitts vorgeschlagen. Insbesondere ist der Gewebeschnitt ein Tumor-Gewebeschnitt. Die mikrofluidische Vorrichtung weist mehrere Schichten auf, die auch als verschiedene mikrofluidische Komponenten interpretiert werden können. Eine erste Schicht weist eine Aussparung auf, in der ein Gewebeschnitt aufgenommen werden kann. Die Aussparung kann generell jede Form aufweisen, jedoch bietet sich eine Kreisform aufgrund der einfachen Herstellung an. Andererseits kann die Form der Aussparung an den Gewebeschnitt angepasst werden und beispielsweise dessen Außenkontur nachzeichnen. Die erste Schicht ist insbesondere an einer der Haupt-Oberflächen zu zumindest einer Seite hin geöffnet, d.h. sie weist zumindest zu einer Seite hin eine Aussparung auf. Als Haupt-Oberflächen werden hier die (typischerweise zwei) Seitenoberflächen mit der größten Ausdehnung bezeichnet. Die mikrofluidische Vorrichtung weist zudem zumindest eine weitere, beispielsweise zweite, Schicht auf, die an einer der Haupt-Oberflächen der ersten Schicht angeordnet ist.
In einem Bereich der zweiten Schicht, der im zusammengefügten Zustand der ersten und der zweiten Schicht, mit der Aussparung der ersten Schicht überlappt, weist die zweite Schicht ein Netzwerk aus mikrofluidischen Kanälen auf. Das mikrofluidische Netzwerk weist insbesondere eine irreguläre Struktur auf, welche einem vaskulären System um einen Tumor nachempfunden ist. Insbesondere werden die charakteristischen Blutgefäßsysteme eines Tumorgewebes durch das Netzwerk aus mikrofluidischen Kanälen nachgebildet. In Tumoren führt das starke Zellwachstum und die Expression angiogener Faktoren zur Entwicklung von Blutgefäßnetzwerken, die sich deutlich von der normalen Vaskulatur unterscheiden. Diese Blutgefäße sind unvollständig ausgebildet, hyperpermeabel und weisen uneinheitliche Durchmesser sowie irreguläre Strukturen und Formen auf, wie z.B. Ausbuchtungen, Shunts, einseitig geschlossene Gefäße und Ähnliches. In ähnlicher Weise sind die Lymphgefäße erweitert und permeabler. In seiner Gesamtheit wirkt sich das für Tumore charakteristische Gefäßsystem insbesondere auf die lokale Verteilung von Sauerstoff und Nährstoffen, auf die Weiterentwicklung des Tumors und der Tumormikroumgebung sowie auf die Zuführung von Medikamenten zu den Tumorzellen entscheidend aus. Die mikrofluidischen Kanäle des Netzwerks können dabei arterielle, venöse und gegebenenfalls lymphatische Kapillaren nachbilden. Die mikrofluidischen Kanäle weisen uneinheitliche Durchmesser und Formen auf und bilden z. B. Ausbuchtungen, Shunts und/oder einseitig geschlossene Gefäße. Auf diese Weise wird ein anomales Tumorgefäßsystem in vitro nachgebildet.
Im Bereich der Aussparung der ersten Schicht weisen die Kanäle der zweiten Schicht zudem Öffnungen - auch als Poren bezeichnet - zu der ersten Schicht hin auf. Über die Öffnungen (bzw. Poren) stehen die mikrofluidischen Kanäle der zweiten Schicht mit der Aussparung in der ersten Schicht und somit mit dem in der Aussparung platzierbaren Gewebeschnitt in fluidischem Kontakt und es können Fluide zugeführt und/oder abgeführt werden. Die Durchmesser der Öffnungen sind geeignet wählbar und betragen vorteilhafterweise zwischen 1 pm bis 100 pm.
Über die mikrofluidischen Kanäle wird eine definierte Versorgung des Gewebeschnitts mit Nährstoffen und Sauerstoff sowie beispielsweise eine Abführung von Stoffwechselprodukten erreicht. Dem Gewebeschnitt wird ein Kultivierungsmedium mit vorgebbarer Zusammensetzung von Nährstoffen und vorgebbarer Sauerstoffkonzentration fluidisch zugeführt. Das am Gewebeschnitt vorbeigeflossene Kultivierungsmedium nimmt die darin entstandenen zellulären Stoffwechselprodukte auf und wird dann über einen oder mehrere mikrofluidischen Kanäle abgeführt. Dadurch wird eine dynamische Perfusion des zu kultivierenden Gewebeschnitts erreicht.
Zudem kann dem Gewebeschnitt über die mikrofluidischen Kanäle eine pharmakologische Wirkstofflösung mit definiertem Volumen und Konzentration dosiert zugeführt werden. Dies kann bei der Medikamententestung eingesetzt werden, um eine präzise Zuführung von Medikamentenlösungen zum Gewebeschnitt zu realisieren.
Bei Tumoren ist das Gleichgewicht zwischen Blutzufuhr und der Blutabfuhr durch die Blutgefäße sowie die Abfuhr von Gewebeflüssigkeit durch die Lymphgefäße deutlich gestört. Ein erhöhter Druck der interstitiellen Flüssigkeit (nachfolgend auch fluidischer Druck genannt) wird durch Austritt von Blutplasma aus den hyper-permeablen Tumorblutgefäßen und durch unzureichende Lymphdrainage verursacht. Undichte Gefäße kombiniert mit dem gestörten Drainagesystem führen zu einem hohen fluidischen Druck. Dadurch entstehen unter anderem Ödeme und strömungsinduzierte Scherspannungen und die Zufuhr von Medikamenten ist beeinträchtigt. Der fluidische Druck, der auf den Gewebeschnitt und die darin enthaltenen Zellen einwirkt, kann in vitro realisiert werden, indem eine Druckdifferenz zwischen den mikrofluidischen Ein- und Auslässen des zumindest einen mikrofluidischen Netzwerks aufgebaut wird. Dabei können Werte für den fluidischen Druck von z. B. ca. 1 kPa (7,5 mmHg) wie bei Hirntumoren und bis zu 5 kPa (37 mmHg) wie bei Nieren-Karzinomen erreicht werden.
Vorzugsweise kann für die Zufuhr und Abfuhr des Fluids ein Pumpmechanismus, wie z. B. eine Spritzenpumpe oder eine Peristaltikpumpe vorgesehen sein, der mit den mikrofluidischen Kanälen verbunden ist Der Pumpmechanismus kann mit einer geeignet wählbaren Flussrate eingestellt werden.
Zusätzlich kann die erste Schicht zumindest einen mikrofluidischen Kanal aufweisen, der mit der Aussparung verbunden ist Der zumindest eine mikrofluidischen Kanal bildet das Lymphsystem, das den Gewebeschnitt in vivo umgeben hat, in vitro nach und dient zur Ableitung von Flüssigkeiten und Stoffwechselprodukten. Es kann genau ein mikrofluidischer Kanal mit einem geeigneten Durchmesser zur Ableitung vorgesehen sein. Alternativ können auch mehrere mikrofluidische Kanäle vorgesehen sein, die insbesondere ein Netzwerk mit komplexen Strukturen und Formen bilden können. Somit können mehrere und irregulär verlaufende lymphatische Gefäße nachgeahmt werden.
Generell kann bereits die weitere, zweite Schicht ausreichend sein, wenn die Aussparung in der ersten Schicht auf einer Seite abgeschlossen ist, entweder durch die erste Schicht selbst oder durch eine einfache zusätzliche Schicht oder Komponente. In diesem Fall wird die Zufuhr und die Abfuhr über dasselbe mikrofluidische Netzwerk in der zweiten Schicht, gegebenenfalls zusammen mit dem zumindest einen mikrofluidischen Kanal in der ersten Schicht, realisiert. Vorzugsweise weist die mikrofluidische Vorrichtung eine zweite und eine dritte Schicht auf, die jeweils an den Haupt-Oberflächen der ersten Schicht angeordnet sind. Beispielsweise ist die zweite Schicht an einer Haupt-Oberfläche der ersten Schicht angeordnet und die dritte Schicht ist an der anderen Haupt-Oberfläche der ersten Schicht angeordnet, welche sich vorzugsweise gegenüberliegen. Die Zufuhr und Abfuhr von Fluiden können in beiden mikrofluidischen Netzwerken der zweiten und der dritten Schicht erfolgen. Dadurch findet die Versorgung des Gewebeschnitts von mehreren Seiten statt. Alternativ können die Zufuhr und die Abfuhr getrennt in den Schichten erfolgen. Die mikrofluidischen Netzwerke können in beiden Schichten identisch ausgebildet sein. Dies führt zu einer einfacheren Herstellung der Schichten und einer gleichverteilten Versorgung des Gewebeschnitts. Alternativ können sich die mikrofluidischen Netzwerke der beiden Schichten voneinander unterscheiden. Somit lassen sich die Zufuhr und Abfuhr von Kultivierungsmedium, Sauerstoff und gegebenenfalls Medikamentenlösung auf beiden Seiten des Gewebeschnitts unterschiedlich realisieren. Für den Fall, dass eine zweite und eine dritte Schicht an den gegenüberliegenden Haupt-Oberflächen der ersten Schicht angeordnet sind, ist die Aussparung in der ersten Schicht zu beiden Seiten hin geöffnet. Dies wird in einfacher Weise erreicht, indem ein Durchgangsloch durch die erste Schicht gebohrt wird, das dann als Aussparung dient.
Vorzugsweise wird die Dicke der ersten Schicht kleiner gewählt als die Dicke des Gewebeschnitts. Bevorzugt liegt die Dicke der ersten Schicht im Bereich von 150 pm bis 400 pm. Somit werden Gewebeschnitte, die beispielsweise eine Dicke größer der Dicke der ersten Schicht aufweisen, von der zweiten Schicht und insbesondere von der zweiten und der dritten Schicht eingeklemmt. Durch das Einklemmen wird ein mechanischer Druck auf die Gewebeschicht ausgeübt. Dadurch werden mechanische Spannungen und Drücke nachgeahmt, die innerhalb und außerhalb des Tumors entstehen, wenn wuchernde und sich fortbewegende Tumorzellen auf das umgebende Gewebe drücken und dieses dehnen. Der mechanische Druck kann Werte von z. B. 100 Pa bei Hirntumoren und 10 kPa in Bauchspeicheldrüsen-Karzinomen erreichen. Durch den mechanischen Druck können Blut- und Lymphgefäße in und um die Tumore komprimiert werden, was den Blutfluss und die Versorgung mit Sauerstoff, Medikamenten und Immunzellen beeinflusst. Zudem aktivieren die resultierenden mechanischen Kräfte auf Gewebe- und Zellebene u.a. Signalwege, welche die Tumorentstehung, Proliferation und Invasivität von Krebszellen fördern sowie Behandlungsresistenzen hervorrufen. Alternativ kann die Dicke der ersten Schicht auch gleich groß oder größer als die Dicke des Gewebeschnitts gewählt werden. In diesem Fall wird kein mechanischer Druck auf die Gewebeschicht ausgeübt.
Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Kultivierung eines Gewebeschnitts mit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung vorgeschlagen. Die Form des Gewebeschnitts wird so gewählt, dass sie der generellen Form der Aussparung entspricht. Bei einer kreisförmigen Aussparung wird demnach der Gewebeschnitt möglichst kreisförmig generiert. Die Form des Gewebeschnitts muss dabei nicht genau der Form der Aussparung entsprechen und kann beispielsweise Einbuchtungen und/oder Ausbuchtungen aufweisen, durch die er von der idealen Form der Aussparung abweicht. Damit der Gewebeschnitt in die Aussparung eingelegt werden kann, soll die Querschnittsfläche des Gewebeschnitts maximal der Querschnittsfläche der Aussparung entsprechen. Alternativ oder zusätzlich soll die längste Seite bzw. der längste Radius des Gewebeschnitts maximal der längsten Seite bzw. dem längsten Radius der Aussparung entsprechen. Für den bevorzugten Fall, dass ein mechanischer Druck auf den Gewebeschnitt ausgeübt werden soll, wird der Gewebeschnitt mit einer Dicke generiert, die größer als die Dicke der ersten Schicht gewählt wird. Hierbei kann die Dicke der ersten Schicht bereits im Vorhinein so gewählt werden, dass sie kleiner ist als die Dicke des zu erwartenden Gewebeschnitts. Die Dicke der Gewebeschicht liegt bevorzugt im Bereich von 150 pm bis 400 pm. Beim Zusammenfügen drückt die zumindest eine zweite Schicht auf den Gewebeschnitt und klemmt diesen ein.
Der Gewebeschnitt wird in der Aussparung der ersten Schicht platziert. Anschließend wird die erste Schicht mit zumindest einer zweiten Schicht abgedeckt. Dabei wird die zweite Schicht so angeordnet, dass die Aussparung der ersten Schicht bündig mit dem Bereich der zweiten Schicht, in dem die Öffnungen für die mikrofluidischen Kanäle vorgesehen sind, ist. Die zweite Schicht und die erste Schicht werden beispielsweise durch Anpressen in Verbindung gebracht.
Schließlich erfolgt eine Zufuhr und Abfuhr von Fluiden durch die mikrofluidischen Kanäle in der zweiten Schicht. Die Fluide können wie oben beschrieben ein Kultivierungsmedium mit vorgegebener Konzentration an Nährstoffen und vorgegebener Sauerstoffkonzentration sein. Zur Medikamententestung kann zusätzlich zumindest eine Medikamentenlösung mit vorgegebener Konzentration zugeführt werden.
Für den bevorzugten Fall, dass die mikrofluidische Vorrichtung weiterhin eine dritte Schicht aufweist, wird vor dem Platzieren des Gewebeschnitts eine der weiteren Schichten, beispielsweise die zweite Schicht, unterhalb der ersten Schicht angeordnet und die erste Schicht dann darauf gelegt. Dabei wird die zweite Schicht so angeordnet, dass die Aussparung der ersten Schicht bündig mit dem Bereich zweiten Schicht, in dem die Öffnungen für die mikrofluidischen Kanäle vorgesehen sind, ist. Der Gewebeschnitt wird dann in der Aussparung der ersten Schicht platziert und dabei beispielsweise auf die zweite Schicht aufgelegt. Der Gewebeschnitt kommt somit in Kontakt mit dem Bereich der zweiten Schicht, in dem die Öffnungen für die mikrofluidischen Kanäle vorgesehen sind. Schließlich wird noch eine weitere Schicht, beispielsweise eine dritte Schicht, auf die erste Schicht gelegt. Wie oben bereits im Zusammenhang mit der zumindest einen Schicht beschrieben, wird die dritte Schicht so angeordnet, dass die Aussparung der ersten Schicht bündig mit dem Bereich der dritten Schicht, in dem die Öffnungen für die mikrofluidischen Kanäle vorgesehen sind, ist. Schließlich können die Schichten beispielsweise durch Anpressen miteinander in Verbindung gebracht werden.
In diesem Fall kann entweder die Zufuhr und die Abfuhr der Fluide in den fluidischen Netzwerken jeder der beiden Schichten stattfinden oder die Fluide werden über das fluidische Netzwerk einer Schicht, beispielsweise der zweiten Schicht, zugeführt und über das fluidische Netzwerk der anderen Schicht, beispielsweise der dritten Schicht, abgeführt.
Ist, wie oben beschrieben, zumindest ein mikrofluidischer Kanal in der ersten Schicht vorgesehen, der mit der Aussparung verbunden ist, kann vorgesehen sein, Fluid von der Aussparung und somit vom Gewebeschnitt über den zumindest einen mikrofluidischen Kanal in der ersten Schicht abzuleiten. Mit dem Fluid können zudem Stoffwechselprodukte abgeleitet werden. Der zumindest eine mikrofluidische Kanal bildet ein lymphatisches Gefäß des Gewebes, insbesondere eines Tumors, in vitro nach.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
Figur 1 zeigt eine Explosionsansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung.
Figur 2 zeigt eine Draufsicht auch eine erste Schicht der mikrofluidischen Vorrichtung aus Figur 1 .
Figur 3 zeigt eine Draufsicht auch eine zweite Schicht der mikrofluidischen Vorrichtung aus Figur 1
Figuren 4a, b zeigen jeweils einen Querschnitt der mikrofluidischen Vorrichtung aus Figur 1 im separierten Zustand (Figur 4a) und im zusammengefügten Zustand (Figur 4b) Figuren 5a-d zeigen jeweils einen Querschnitt durch die zweite Schicht in verschiedenen Stadien des Herstellungsprozesses.
Figur 6 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsbeispiele der Erfindung
Figur 1 zeigt eine Explosionsdarstellung einer mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung eines Gewebeschnitts 4. Die mikrofluidische Vorrichtung weist eine erste Schicht 1 , eine zweite Schicht 2, die unterhalb der ersten Schicht 1 angeordnet ist, und eine dritte Schicht 3, die oberhalb der ersten Schicht 1 angeordnet ist, auf. Die erste Schicht 1 weist eine als kreisrunde Durchgangsöffnung ausgebildete Aussparung 10 auf, in der der Gewebeschnitt 4 aufgenommen wird. Die erste Schicht 1 weist eine Dicke di auf, die kleiner ist als die Dicke d4 des Gewebeschnitts 4. In weiteren, nicht gezeigten Ausführungsformen ist die Dicke di der ersten Schicht 1 gleich groß oder größer als die Dicke d4 des Gewebeschnitts d4. Ein mikrofluidischer Kanal 11 schließt sich an die Aussparung 10 an, der ein lymphatisches Gefäß des Gewebeschnitts 4, insbesondere eines soliden Tumors, funktional nachbildet. Die zweite Schicht 2 und die dritte Schicht 3 sind in diesem Ausführungsbeispiel identisch ausgebildet. Die nachfolgende Beschreibung bezieht sich auf die zweite Schicht 2, kann aber für die dritte Schicht 3 übernommen werden (außer es wird explizit zwischen den Schichten unterschieden). Die zweite Schicht 2 weist ein Netzwerk aus mikrofluidischen Kanälen 21 auf, welche in einem Bereich 20 irreguläre Strukturen und Formen der Blutgefäße des Gewebeschnitts 4, insbesondere charakteristische Tumorblutgefäße, nachbilden. Gleichermaßen weist die dritte Schicht 3 ein Netzwerk aus mikrofluidischen Kanälen 31 auf, welche in einem Bereich 30 ebenfalls die irregulären Strukturen und Formen der der Blutgefäße des Gewebeschnitts 4, insbesondere charakteristischen Tumorblutgefäße nachbilden. In dieser Ausführungsform sind die beiden mikrofluidischen Netzwerke der zweiten Schicht 2 und der dritten Schicht 3 sowie deren mikrofluidische Kanäle 21 und 31 identisch ausgebildet. Die beiden Bereiche 20 und 30 sind unterhalb bzw. oberhalb der Aussparung 10 der ersten Schicht 1 bündig mit dieser angeordnet und entsprechen der Form der Aussparung 10, weisen also eine Kreisform mit demselben Radius auf. In weiteren, nicht gezeigten Ausführungsbeispielen können die zweite Schicht 2 und die dritte Schicht 3 bzw. deren mikrofluidische Netzwerke bzw. die mikrofluidischen Kanäle 21 und 31 unterschiedlich ausgebildet sein. In diesem Fall kann die Zufuhr und die Abfuhr von Fluiden auch in unterschiedlichen Schichten 2, 3 realisiert sein.
Figur 2 zeigt eine Draufsicht auf die erste Schicht 1 . Wie bereits beschrieben, weist die erste Schicht 1 eine als Durchgangsöffnung ausgebildete Aussparung 10 aus, die zur Aufnahme des Gewebeschnitts 4 dient. Die Form, der Radius und die Position der Aussparung 10 stimmen mit den Bereichen 20 und 30 der zweiten Schicht 2 und der dritten Schicht 3 überein. Die Durchgangsöffnung ist in diesem Ausführungsbeispiel kreisförmig ausgebildet. Alternativ sind andere Formen realisierbar, die z.B. an die Außenkonturen des Gewebeschnitts 4 angepasst sind. Wie bereits beschrieben schließt sich an die Aussparung 10 ein mikrofluidischer Kanal 11 an, der ein lymphatisches Gefäß des Gewebeschnitts 4, insbesondere eines soliden Tumors, funktional nachbildet. In dieser Ausführungsform ist genau ein mikrofluidischer Kanal 11 vorgesehen. In weiteren Ausführungsformen können auch mehrere abführende Kanäle vorgesehen sein. Durch diesen mikrofluidischen Kanal 11 wird Fluid aus der Aussparung 10 gezielt abgeführt. In dieser Ausführungsform werden die Ober- und Unterseite des mikrofluidischen Kanals 11 durch die ober- bzw. unterhalb positionierten Schichten 2 und 3 ausgebildet. Der mikrofluidische Kanal 11 weist einen mikrofluidischen Anschluss an der Seite der ersten Schicht 1 auf, über den das Fluid aus der mikrofluidischen Vorrichtung abgeführt wird. An dem mikrofluidischen Anschluss kann eine Pumpeinheit, wie z.B. eine Spritzenpumpe oder eine Peristaltikpumpe, angeschlossen sein.
Figur 3 zeigt eine Draufsicht auf die zweite Schicht 2. Die dritte Schicht 3 ist in der vorliegenden Ausführungsform identisch ausgebildet, sodass die nachfolgende Beschreibung für die dritte Schicht 3 übernommen werden kann. Die zweite Schicht 2 weist unterhalb ihrer Oberflächen mikrofluidische Kanäle 21 auf. Auf der linken und rechten Seite weist die zweite Schicht 2 jeweils einen mikrofluidischen Anschluss auf. In diesem Ausführungsbeispiel sind sowohl die Zufuhr als auch die Abfuhr von Fluiden in der zweiten Schicht 2 (und entsprechend ebenfalls in der dritten Schicht 3) realisiert. Wie durch die Pfeile beispielhaft dargestellt, kann über den linken Anschluss ein Fluid zugeführt werden und über den rechten Anschluss abgeführt werden. Hierfür können die mikrofluidischen Anschlüsse mit Pumpeinheiten, wie z.B. eine Spritzenpumpe oder eine Peristaltikpumpe, verbunden sein.
In einem Bereich 20, der in Form, Durchmesser und Position mit der Aussparung 10 der ersten Schicht 1 übereinstimmt, bilden die mikrofluidischen Kanäle 21 ein Netzwerk, welches die irregulären Strukturen und Formen bei in-vivo- Blutgefäßen des Gewebeschnitts, insbesondere die charakteristischen Tumorblutgefäße bei soliden Tumoren, nachahmt. Die geometrische Ausgestaltung der mikrofluidischen Kanäle 21 ist irregulär und diese können verschiedene und uneinheitliche Durchmesser, Ausbuchtungen, Verengungen, einseitig endende Gefäße, Shunts und/oder Ähnliches aufweisen. Die Durchmesser der mikrofluidischen Kanäle 21 liegt vorteilhafterweise zwischen 5 pm und 500 pm. Im obengenannten Bereich 20 weisen die mikrofluidischen Kanäle 21 zudem kleine Öffnungen 22 (siehe Figur 4) auf, die zur ersten Schicht 1 hin geöffnet sind. Somit kann ein Fluid aus den mikrofluidischen Kanälen 21 der zweiten Schicht 2 in die Aussparung 10 der ersten Schicht 1 austreten. Gleichermaßen kann ein Fluid aus der Aussparung 10 in die mikrofluidischen Kanäle 21 der zweiten Schicht 2 austreten. Außerhalb des Bereichs 20 können die mikrofluidischen Kanäle 21 auch regulär und geordnet ausgebildet sein. So bilden die mikrofluidischen Kanäle 21 in Figur 3 links von dem Bereich 20 eine geordnete, baumartig verzweigte Struktur. Auf der linken Seite befindet sich, wie oben beschrieben, der mikrofluidische Anschluss für die Zufuhr. Dadurch ist es möglich, einen mikrofluidischen Kanal 21 gezielt aufzuteilen und so das Fluid über mehrere Kanäle 21 in den Bereich 20 zu führen. Rechts vom Bereich 20 münden die mikrofluidischen Kanäle 21 in einem einzelnen mikrofluidischen Kanal, der zu dem mikrofluidischen Anschluss für die Abfuhr auf der rechten Seite führt. In anderen Ausführungsformen können weitere geeignete Kanalstrukturen innerhalb der zweiten Schicht 2 vorgesehen sein.
Die Figuren 4a, b zeigen jeweils einen Querschnitt der mikrofluidischen Vorrichtung. In Figur 4a sind die Schichten 1 , 2, 3 separiert voneinander dargestellt. In Figur 4b ist die mikrofluidische Vorrichtung im zusammengefügten Zustand dargestellt, in dem die Schichten 1 , 2, 3 miteinander, insbesondere durch Anpressen, verbunden sind. Die zweite Schicht 2 weist im Bereich 20 (siehe Figur 1 bzw. 3) ausgehend von den mikrofluidischen Kanälen 21 in Richtung der ersten Schicht 1 Öffnungen 22 auf. Ebenso weist die dritte Schicht 3 im Bereich 30 ausgehend von den mikrofluidischen Kanälen 31 in Richtung der ersten Schicht 1 Öffnungen 32 auf. Die Öffnungen 22 können auch als Poren interpretiert werden. Fluide können von den mikrofluidischen Kanälen 21 , 31 durch die Öffnungen 22, 23 in die Aussparung 10 der ersten Schicht 1 und somit zum Gewebeschnitt 4 gelangen. Ebenso können Fluide von der Aussparung 10 über die Öffnungen 22, 23 in die mikrofluidischen Kanäle 21 , 31 gelangen und dann abtransportiert werden. Im Ergebnis wird somit die mikrofluidische Versorgung des Gewebeschnitts mit Nährstoffen und Sauerstoff, die Abführung von Stoffwechselprodukten sowie eine Zuführung von Medikamenten ermöglicht. Die geometrische Ausgestaltung, d.h. die Größe, die Form und der Abstand der Öffnungen 22, 32, ist geeignet wählbar, um eine höhere bzw. geringere Durchlässigkeit der mikrofluidischen Kanäle 21 , 31 für die Fluide lokal realisieren zu können. Die Durchmesser der hier kreisförmigen Öffnungen 22, 32 betragen hier beispielsweise 50 pm.
Bei der Generierung des Gewebeschnitts 4, insbesondere eines Tumor- Gewebeschnitts, wird die Dicke d4 des Gewebeschnitts 4 größer gewählt als die Dicke di der ersten Schicht 1. Die Dicke di der ersten Schicht 1 kann bei der Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung für den Anwendungszweck geeignet gewählt werden. Die Dicke d4 des Gewebeschnitts 4 kann beispielsweise durch eine Messung bestimmt werden. Der Gewebeschnitt 4 wird in diesem Beispiel mit einer Dicke d4 von 160 pm generiert. Die Dicke di der ersten Schicht 1 beträgt hier beispielsweise 140 pm. Im separierten Zustand in Figur 4a ist die Dicke di der ersten Schicht 1 somit geringer als die Gewebeschnittdicke d4. Beim Zusammenfügen der Schichten 1 , 2 und 3 wird der Gewebeschnitt 4 in definierter Weise mechanisch eingespannt, wie in Figur 4b gezeigt. Auf den Gewebeschnitt
4 wirkt somit ein einstellbarer mechanischer Druck, wodurch die in-vivo-Situation insbesondere bei soliden Tumoren nachgeahmt wird. Die Stärke des einstellbaren mechanischen Drucks ist abhängig von der Differenz der Gewebeschnittdicke d4 und der Dicke di der ersten Schicht 1. Dieser kann beispielsweise durch zuvor ausgeführte experimentelle Tests ermittelt werden und beispielsweise in einer Kennlinie hinterlegt werden. In einer alternativen Ausführungsform der mikrofluidischen Vorrichtung ist die Dicke di der ersten Schicht 1 größer als die Dicke d4 des Gewebeschnitts 4, so dass eine Kultivierung und Medikamententestung ohne einen mechanischen Druck auf den Gewebeschnitt 4 realisierbar sind. Im zusammengefügten Zustand in Figur 4b wird zwischen den Einlassanschlüssen der zweiten Schicht 2 und der dritten Schicht 3 und den Auslassanschlüssen der zweiten Schicht 2 und der dritten Schicht 3 sowie des mikrofluidischen Kanals 11 der ersten Schicht 1 eine Druckdifferenz aufgebaut Somit lässt sich ein definierter fluidischer Druck auf den kultivierten Gewebeschnitt 4 einstellen.
In anderen Ausführungsformen sind die zweite Schicht 2 und die dritte Schicht 3 unterschiedlich ausgebildet. Hierbei kann die Zufuhr des Kultivierungsmediums, des Sauerstoffs und gegebenenfalls der Medikamentenlösung über die mikrofluidischen Kanäle 21 der zweiten Schicht 2 erfolgen. Das vorbeigeflossene Kultivierungsmedium und die aufgenommenen zellulären Stoffwechselprodukte werden dann auf der anderen Seite über die mikrofluidischen Kanäle 31 der dritten Schicht 3 abgeführt. Durch die getrennte Zufuhr und Abfuhr wird zum einen sichergestellt, dass nur Kultivierungsmedium, welches am Gewebeschnitt 4 vorgeflossen ist, abgeführt wird.
In den Figuren 5a-d sind verschiedene Stadien des Herstellungsprozesses der zweiten Schicht 2 und des mikrofluidischen Kanals 21 gezeigt. Der Herstellungsprozess für die dritte Schicht 3 und den mikrofluidischen Kanal 31 läuft identisch ab, sodass die nachfolgende Beschreibung übernommen werden kann. In Figur 5a wird zu Beginn ein Substrat für die zweite Schicht 2 bereitgestellt. Hierfür können an sich bekannte Materialien verwendet werden. In dieses Substrat 23 wird, wie in Figur 5b gezeigt, ein mikrofluidischer Kanal 21 mittels an sich bekannter Verfahren ausgebildet. In Figur 5c wird der mikrofluidische Kanal 21 mit einem Deckel 24 abgedeckt. Vorzugsweise wird für den Deckel 24 dasselbe Material wie für das Substrat 23 verwendet. Schließlich werden im Bereich 20 (siehe Figur 1 bzw. 3) die oben beschriebenen Öffnungen 22 in den Deckel 24 eingearbeitet, wie in Figur 5d gezeigt.
Figur 6 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Zu Beginn werden die Schichten 1 , 2 und 3 hergestellt bzw. bereitgestellt 100. Die erste Schicht 1 wird hergestellt, indem in ein Substrat mit der Dicke di ein Durchgangsloch gebohrt wird, das als Aussparung 10 fungiert. Anschließend wird ein mikrofluidischer Kanal 11 zwischen der Aussparung 10 und einer Seite der ersten Schicht 1 ausgebildet. Die zweite Schicht 2 und die dritte Schicht 3 werden wie vorstehend im Zusammenhang mit Figur 5 beschrieben, hergestellt. Für den Zusammenbau der mikrofluidischen Vorrichtung wird die erste Schicht 1 auf die zweite Schicht 2 aufgesetzt 101. Dabei wird der Bereich 20 der zweiten Schicht 2 bündig unterhalb der Aussparung 1 angeordnet.
Der Gewebeschnitt 4 weist eine Form auf, die der Aussparung 10 entspricht, mit einem Durchmesser, der gleich oder kleiner ist als der Durchmesser der Aussparung 10 und mit einer Dicke d4, die hier kleiner als die Dicke di der ersten Schicht 1 ist. Der Gewebeschnitt 4 wird dann in die Aussparung 10 der ersten Schicht 1 eingebracht 104. Hierzu wird dieser beispielsweise auf die zweite Schicht 2 aufgelegt. Die Aussparung 10 und die zweite Schicht 2 als Boden bilden zusammen eine Kavität. Abschließend wird die dritte Schicht 3 auf die erste Schicht 1 aufgesetzt 105, sodass die Kavität geschlossen ist. Dabei wird der Bereich 30 der dritten Schicht 3 bündig oberhalb der Aussparung 10 angeordnet. Die drei Schichten 1 , 2, 3 werden dann mechanisch durch Anpressen in Verbindung gebracht 106 und befestigt. Alternativ kann die erste Schicht 1 in Schritt 101 auf die dritte Schicht 3 aufgesetzt werden. Die Aussparung 10 und die dritte Schicht 3 als Boden bilden dabei zusammen eine Kavität. In Schritt 105 wird dann die zweite Schicht 2 auf die erste Schicht 1 aufgesetzt.
Zur Kultivierung des Gewebeschnitts 4 erfolgt eine Versorgung 107 mit Fluiden. Die Fluide werden über die mikrofluidischen Kanäle 21 , 31 der zweiten Schicht 2 und der dritten Schicht 3 in die Aussparung 10 der ersten Schicht eingeleitet und somit dem Gewebeschnitt 4 zugeführt. Zudem werden die zugeführten Fluide über die mikrofluidischen Kanäle 21 , 31 der zweiten Schicht 2 und der dritten Schicht 3 sowie über den mikrofluidischen Kanal 11 der ersten Schicht 1 abgeleitet. Hierfür wird ein Pumpsystem an den Ein- und Auslässen der mikrofluidischen Kanäle 11 , 21 , 31 gesteuert.

Claims

Ansprüche
1 . Mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung eines Gewebeschnitts (4), aufweisend eine erste Schicht (1) mit zwei Haupt-Oberflächen und mit einer Aussparung (10) zur Aufnahme des Gewebeschnitts (4), die zumindest zu einer Seite hin geöffnet ist, und zumindest eine weitere Schicht (2, 3), die an einer Haupt-Oberfläche der ersten Schicht (1) angeordnet ist und zumindest im Bereich (20, 30) der Aussparung (10) ein Netzwerk aus mikrofluidischen Kanälen (21 , 31) aufweist wobei die mikrofluidischen Kanäle (21 , 31) Öffnungen (22, 32) aufweisen, mit denen sie in fluidischem Kontakt zu der Aussparung (10) in der ersten Schicht (1) stehen.
2. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die erste Schicht (1) zumindest einen mikrofluidischen Kanal (11) aufweist, der mit der Aussparung (10) verbunden ist
3. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Öffnungen (22, 32) der mikrofluidischen Kanäle (21 , 31) der zumindest einen weiteren Schicht (2, 3) im Bereich von 1 pm bis 100 pm liegt
4. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Schicht eine zweite Schicht (2) ist und dass die Vorrichtung neben der zweiten Schicht (2) eine dritte Schicht (3) aufweist, die an der anderen Haupt-Oberfläche der ersten Schicht (1) angeordnet ist und zumindest im Bereich (30) der Aussparung (10) ein Netzwerk aus mikrofluidischen Kanälen (31) aufweist wobei die mikrofluidischen Kanäle (31) Öffnungen (32) aufweisen, mit denen sie in fluidischem Kontakt zu der Aussparung (10) in der ersten Schicht (1) stehen.
5. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aussparung (10) ein Durchgangsloch ist.
6. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke (di) der ersten Schicht (1) im Bereich von 150 pm bis 400 pm liegt.
7. Verfahren zur Kultivierung eines Gewebeschnitts (4) mit einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit folgenden Schritten:
- Platzieren (104) eines Gewebeschnitts (4) in der Aussparung (10) der ersten Schicht (1);
- Abdecken (105) zumindest einer Haupt-Oberfläche der ersten Schicht (1) mit zumindest einer weiteren Schicht (2, 3), wobei die Aussparung (10) der ersten Schicht (1) bündig mit dem Bereich (20, 30) der zumindest einen weiteren Schicht (2,3), in dem Öffnungen (22, 32) in den mikrofluidischen Kanälen (21 , 31) vorgesehen sind, angeordnet wird;
- Zufuhr und/oder Abfuhr (107) von Fluiden durch die mikrofluidischen Kanäle (21 , 31) in der zumindest einen weiteren Schicht (2, 3).
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluide Nährstoffe, Sauerstoff und/oder zumindest eine Medikamentenlösung enthalten.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Schicht (1) eine Dicke (di) aufweist, die kleiner als eine Dicke (d i) des Gewebeschnitts (4) ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Schicht (2) an einer Haupt-Oberflächen der ersten Schicht (1) angeordnet (101) wird, wobei die Aussparung (10) der ersten Schicht (1) über dem Bereich (20) der zweiten Schicht (2), in dem Öffnungen (22) in den mikrofluidischen Kanälen (21) vorgesehen sind, angeordnet wird, der Gewebeschnitt (4) in der Aussparung (10) der ersten Schicht platziert (104) wird und dann die dritte Schicht (3) an der anderen Haupt-Oberfläche der ersten Schicht (1) angeordnet wird, wobei die Aussparung (10) der ersten Schicht (1) unter dem Bereich (30) der dritten Schicht (3), in dem Öffnungen (32) für die mikrofluidischen Kanäle (31) vorgesehen sind, angeordnet wird.
11 . Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fluid durch zumindest einen mikrofluidischen Kanal (11) in der ersten Schicht (1) abgeführt wird.
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