EP4680933A1 - Dispositif de conditionnement d'une membrane de filtration en vue d'une analyse par cytométrie en phase solide sur ladite membrane de filtration et procédés associés - Google Patents

Dispositif de conditionnement d'une membrane de filtration en vue d'une analyse par cytométrie en phase solide sur ladite membrane de filtration et procédés associés

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Publication number
EP4680933A1
EP4680933A1 EP24714980.0A EP24714980A EP4680933A1 EP 4680933 A1 EP4680933 A1 EP 4680933A1 EP 24714980 A EP24714980 A EP 24714980A EP 4680933 A1 EP4680933 A1 EP 4680933A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
filtration
filtration membrane
membrane
filtration device
upper face
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP24714980.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Eric LALOUM
Céline LAMOTTE
Edgard MINASSIAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP4680933A1 publication Critical patent/EP4680933A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • G01N15/0606—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support
    • G01N15/0618—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support of the filter type
    • G01N15/0625—Optical scan of the deposits
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Definitions

  • the invention relates to the technical field of solid phase cytometry and more particularly to the devices and methods relating to operations on the filtration membrane enabling such analysis.
  • the bioMérieux company designed, developed, and markets the SCANRDI® method based on solid-phase cytometry analysis for the rapid microbiological control of filtered samples. This method is used in particular in the pharmaceutical field for the control of environments and production processes of sterile products (process water for example) as well as for release tests of finished products (sterility tests on injectable products for example).
  • This method is based on (i) reagents and consumables, including in particular a dedicated filtration membrane (detailed below) and fluorescent labeling reagents, (ii) a solid phase cytometry instrumental platform, such as the SCANRDI® instrument marketed by the company bioMérieux, (iii) algorithms for detecting and counting microorganisms.
  • one of the central elements of the analysis is a filtration membrane.
  • the latter is porous with a pore density ( ⁇ 1.5 10 8 pores /cm 2 ) and a pore size of less than 0.4pm, allowing all microorganisms (except viruses) to be retained.
  • Said filtration membrane is a so-called "surface” membrane where the objects are retained on the upper face and not in the volume of the membrane, and has a low thickness between 20pm and 30pm.
  • the filtration membrane is preferably made of polymer: polyester (PET type) or polycarbonate, pierced by "track-etching” and colored black to reduce its intrinsic fluorescence (high for plastics) and thus increase the contrast of the detection of microorganisms by fluorescence.
  • the membrane is flexible and can be used as is as a consumable to be handled (placed/removed on a filtration support, on the pads, etc.) but can advantageously be pre-fixed and stretched in a suitable support, facilitating coupling with other accessories necessary for the method, such as a filtration funnel, a support for filtration ramp, an impregnation pad.
  • the solid phase cytometry method has excellent performance: it can detect the presence of a single microbial cell in a sample volume of up to several tens of ml in just 3 hours.
  • the solid phase cytometry method is carried out in several steps as illustrated in Figure 1: filtration 101, counterstaining 105, activation 106, labeling 102, detection 103 and confirmation 104.
  • the first step is to filter the entire volume of the sample to be analyzed through a filtration membrane, in a controlled environment: a biological safety cabinet (BSC) or a laminar flow hood.
  • BSC biological safety cabinet
  • a second sterile fluid is usually filtered behind it, to recover the residues attached to the filtration funnel.
  • a counter-staining reagent is filtered, following the sample, to increase the contrast of the microorganisms. To be effective, this step must be done preferably from above the membrane.
  • the labeling step possibly preceded by an activation phase to increase the effectiveness of the marker.
  • These two steps are preferably carried out from the lower face of the filtration membrane, with a medium placed in intimate contact under the filtration membrane.
  • the reagent diffuses through the filtration membrane to the upper face of the filtration membrane. It can be assumed that a very thin layer of supernatant liquid forms on the surface of the membrane of a few microns or even tens of microns. Under the action of air, this layer can dry out with an additional stress factor for the microbes, whose viability and reproduction capacities must be maintained. On the other hand, too much liquid layer can disrupt the optical examination of the surface with a loss of focus. In general, the medium is soaked so that there is no visible liquid layer on the surface of the filtration membrane.
  • the filtration membrane is generally placed in intimate contact on a soaked pad so as to ensure its flatness and avoid drying.
  • the detection of specific fluorescence signals of microorganisms can be done with different optical means, but in all cases, there is a more or less long exposure to an exciting light (laser or LED) and the risks of drying and contamination are present.
  • Detection can be followed by a confirmation step, allowing the detected objects to be visualized at high resolution using a high numerical aperture microscope and to confirm that they are indeed microbes.
  • a confirmation step allowing the detected objects to be visualized at high resolution using a high numerical aperture microscope and to confirm that they are indeed microbes.
  • the membrane can finally be placed on agar or in a liquid culture medium in order to grow them to allow the most precise identification possible.
  • the filtration membrane is always exposed to air, except during the transfer steps from one station to another where a protective cover may possibly be placed on the membrane, with no properties other than limiting the possible contamination of the sample by the environment or vice versa, the cover being removed for the detection step of the method.
  • a protective cover may possibly be placed on the membrane, with no properties other than limiting the possible contamination of the sample by the environment or vice versa, the cover being removed for the detection step of the method.
  • the invention aims to improve the existing system described above and in particular to: maintain the integrity of the sample throughout the analysis, from filtration to the detection result, or even the identification of contaminants, reduce the risks of pollution of the environment by the sample, reduce the risk of contamination of the sample during the process (secondary contamination), reduce the phototoxicity of the analysis, reduce photobleaching, promote post-analysis regrowth, allow easier handling of the membrane and in particular to place it upside down, upper side down, in an inverted microscope, allow the use of immersion objectives and therefore improve the quality of the images during the confirmation step under the microscope (the use of immersion objectives for microscopic imaging with a very high numerical aperture allows better light collection and better image quality).
  • the invention relates to a device for conditioning a filtration membrane for analysis by solid phase cytometry, said conditioning device comprising: a filtration membrane configured to filter a biological sample, the filtration membrane having an upper face and a lower face, characterized in that the conditioning device further comprises at least: a lamella arranged above the upper face of the filtration membrane, the lamella being arranged so as to cover the entire upper face of the filtration membrane, an interstitial space formed between the lamella and the upper face of the filtration membrane, the interstitial space being shaped to receive a fluid.
  • the invention aims to maintain the integrity of the sample by controlling the state of the upper face of the filtration membrane during the steps of the protocol by applying a coverslip and the interstitial space.
  • the pollution can be microbiological but also by particles and dust from the environment.
  • the lamella limits any unexpected direct contact with the surface of the filtration membrane, for example friction, and limits the effects of poor handling, such as poor grip of the membrane, or the membrane falling, etc. and also prevents contact with the surrounding air, thus limiting drying out of the filtration membrane or oxidation.
  • the presence of a fluid in the interstitial space is compatible with the optical examination of the surface of the filtration membrane and has a specific favorable dissipation effect limiting “photo-bleaching” during fluorescence detection.
  • the combined presence of the coverslip and the interstitial space of the interstitial fluid presents other advantages among which: the specific control of an environment favorable to the metabolism of microorganisms (aerobic or anaerobic), the prevention of the toxic effects of oxygen specific to fluorescence analysis, in particular "quenching" and phototoxicity, the possibility of using an immersion objective.
  • the coverslip has optical qualities allowing microscopic examination. More particularly, the coverslip is transparent and for example made of borosilicate glass or quartz, or even of polymer material (acrylate resins, crystal polystyrene). The choice of material depends in particular on the mechanical constraints to be supported, the size of the membrane to be covered and the refractive index of the interstitial fluid placed between the upper face of the membrane and the lower face of the coverslip (between 1.35 for water up to 1.52 for immersion oils). According to another characteristic of the invention, the lamella has a thickness of between 100 ⁇ m and 300 ⁇ m.
  • the lamella is secured to the filtration membrane while maintaining the interstitial space.
  • the strip can be secured to the membrane by gluing and/or clipping and/or sealing.
  • the interstitial space has a predetermined thickness of between 100 pm and 500 pm and preferably at least 250 pm. Thanks to this space, it is possible to guarantee the filtration step (by limiting the capillary forces/fluidic resistance due to the lamella) and the optical examination after filtration.
  • the minimum limit of 100 pm thickness of the interstitial space is determined by the manufacturing constraints of the parts by injection/molding as well as by the intrinsic thickness of the filtration membrane itself, approximately 25 pm.
  • the thickness must be sufficient so as not to constrain the development of micro-colonies.
  • the minimum thickness of the interstitial space is at least 250 ⁇ m, which ensures that filtration takes place uniformly over the entire filtration membrane, without risk of mechanical rupture, tearing of the filtration membrane or leakage.
  • the entire volume above the filtration membrane is first uniformly filled with interstitial fluid, thanks to the fluidic resistance of the filtration membrane which is greater than the capillary friction forces linked to the lamella, before the interstitial fluid then passes through the filtration membrane towards the area of the filtration membrane placed under vacuum.
  • the maximum limit at 500 pm thickness of the interstitial space is determined by optical constraints and in particular the maximum working distance achievable for standard high magnification objectives, around 1 mm, which must cover the thickness of the coverslip added to the said thickness of the interstitial space. In addition, depending on the fluid used to fill this interstitial space, and in particular its absorption, diffusion or fluorescence characteristics, this maximum limit will be further reduced to guarantee the best imaging quality.
  • an interstitial space thickness of around 250 pm makes it possible to have a device that can be used throughout the analysis protocol, from the filtration of the biological sample to the confirmation step under the microscope and beyond during the possible culture allowing identification.
  • the filtration device comprises an interstitial fluid housed in the interstitial space, the fluid being a liquid buffer or a gel.
  • the fluid is a liquid buffer optionally containing a surfactant, such as for example a polysorbate, also known under the trade name Tween®, in order to improve the wettability of said buffer.
  • the interstitial fluid is transparent and not very diffusive, which allows its compatibility with a high-resolution optical examination of the filtration membrane.
  • the interstitial fluid is a gel or liquid gelled by means of a gelling agent, for example Kappa Carrageenan.
  • a gelling agent for example Kappa Carrageenan.
  • the liquid is introduced at a temperature between 45°C and 50°C and then gels rapidly at room temperature in the interstitial space.
  • the interstitial fluid may contain a reducing reagent in solution which aims to hydrolyze the fluorophore molecules present in the matrix, thereby increasing the contrast between the labeled microorganisms (fluorophore trapped in the cells) and the background.
  • the interstitial fluid can be supplemented with soluble nutrients to promote microbial growth.
  • the reagents added to the interstitial fluid can be encapsulated in microparticles allowing their controlled and programmed release throughout the protocol.
  • the interstitial fluid can also be a mixture of oil, paraffin or water.
  • the filtration membrane can be made of polymer, polycarbonate or polyethylene terephthalate (PET) or of rigid composite material.
  • the filtration membrane can be made of polymer and pierced with the "track-etched” type process, which means that the pores are made in 2 steps: a first step where the plastic film is bombarded by high-energy particles in order to generate impacts on the surface ("track"), a second step where the plastic film is then subjected to a chemical attack ("etching") in a bath, where the pores are formed from the traces ("tracks") previously formed.
  • etching chemical attack
  • the density of the pores is determined by the first step (density of the "tracks"), while the size of the pores is controlled by the conditions of the chemical attack.
  • the membrane can be made of ceramic and engraved/pierced by laser lithography.
  • the filtration membrane can be colored or metallized.
  • the filtration device comprises at least one support on which the filtration membrane is positioned, said support having at least one port communicating with the upper face of the filtration membrane.
  • the support comprises a plurality of ports.
  • the port(s) allow manipulations on the upper face of the filtration membrane, in particular filtration (by closing one of the two ports) or the introduction of an interstitial fluid after filtration.
  • At least one port of the support is configured to allow the filling of the interstitial space with the interstitial fluid.
  • the support of the filtration membrane is a frame on which the filtration membrane is stretched and fixed.
  • the frame is positioned on the perimeter of the filtration membrane.
  • the support of the filtration membrane has a lower housing provided under the filtration membrane.
  • the lower housing is open on the lower face 2b of the filtration membrane.
  • the support comprises a lower housing, formed under the filtration membrane, the lower housing being shaped to receive a functionalized cartridge intended to come into contact with the lower face of the membrane.
  • the filtration device comprises at least one functionalized cartridge, said functionalized cartridge being able to be a reagent or a culture medium or a medium for activating spores, or a cartridge for fluorescent labeling or a cartridge for deactivating the labeling and/or for maintaining the filtration membrane soaked.
  • the cartridge contains the reagents in the form of a solution in a liquid matrix.
  • the cartridge is a pad soaked in reagent.
  • the cartridge contains the reagents in a gel matrix.
  • the cartridges can be brought into contact one after the other during the protocol; for example, the activation cartridge, then the marking cartridge and finally the support cartridge guaranteeing flatness for detection.
  • a single cartridge can be used for several steps, with a mixture of reagents.
  • the cartridge reagents are encapsulated in microparticles allowing controlled/programmed release.
  • the particles release the labeling substrate into the medium which then diffuses towards the filtration membrane and labels the microorganisms of interest.
  • the filtration device further comprises a cover which is clipped/glued onto the support 6, once the filtration step has been carried out.
  • a cover which is clipped/glued onto the support 6, once the filtration step has been carried out.
  • the reagent can be in liquid, gel or soaked pad form.
  • the device also includes a space containing gases, allowing the growth of microbes.
  • the present invention also relates to a method of microbiological analysis by solid-phase cytometry using a filtration device according to the invention, the analysis method comprising at least the following steps: a step of filtration of the sample by the filtration membrane; a step of fluorescence labeling of the microorganisms likely to be present in the biological sample, a step of detection of the labeled microorganisms, the method being characterized in that it comprises at least one step according to which the coverslip is positioned above the upper face of the filtration membrane of the filtration device.
  • the method comprises a step of confirmation of detection by fluorescence microscope, this step being carried out after the detection step or after the marking step.
  • the fluorescence marking step consists of making the microorganisms fluorescent.
  • the fluorescence labeling step can be carried out with a fluorogenic substrate or a reagent or any other means making it possible to achieve fluorescence of the microorganism.
  • the sample is in liquid form so as to be filterable.
  • the sample is non-biological and is for example: waste water, injectable chemicals, etc.
  • the lamella is positioned above the upper face of the filtration membrane of the filtration device before the filtration step. After this lamella positioning step, an additional step of adding an interstitial fluid into the interstitial space of the filtration device is carried out after the filtration step, directly after the filtration step or not.
  • the lamella is positioned above the upper face of the filtration membrane of the filtration device after the filtration step. After this lamella positioning step, the interstitial fluid is added into the interstitial space of the filtration device before the detection step, directly after the detection step or not.
  • the lamella can be secured to the membrane by clipping at any time during the analysis method, once a filtration funnel has been removed.
  • the sample is injected directly onto the upper face of the filtration membrane via a filtration funnel.
  • the sample is injected onto the upper face of the filtration membrane via the port(s) of the support of the filtration device.
  • a depression can be applied to the lower face during the filtration of the sample, whether the lamella is present or not. of the filtration membrane, which allows homogeneous filtration over the entire surface of the filtration membrane, thereby improving the efficiency and speed of filtration.
  • the sample in liquid form fills the interstitial space before the suction effect causes it to pass through the pores of the filtration membrane.
  • the method may further include a step of adding a counter-staining solution, this addition being carried out by filtering said solution, after filtering the sample.
  • this step is carried out via the upper face of the membrane, either via a funnel or via the injection ports, if the coverslip is present.
  • This counterstaining step is an optional step that reduces the endogenous fluorescence of the sample and non-specific labeling.
  • the sample can correspond to different products, more or less complex (solution, suspension, emulsion) with possible prior preparation to make it filterable (centrifugation, mechanical lysis, chemical lysis).
  • the sample in addition to any microbes labeled with fluorescence, can therefore contain intrinsically fluorescent particles or debris.
  • the exogenous labeling provided by the protocol may not be perfectly specific and label objects other than microbes, either by direct conversion of the fluorogenic substrate into a fluorophore in an undesired site (not a microbial cell), or by efflux of the fluorophore generated inside a microbial cell through the membrane, by the action of efflux pumps; the fluorophore therefore labels the entire sample, and reduces the contrast.
  • the counter-staining solution therefore masks/covers the sites before the labeling step to prevent/hinder access of the fluorophore.
  • the method may comprise a pre-marking step prior to the marking step, said pre-marking step constituting an activation to resuscitate the spores and guarantee optimal enzymatic activity.
  • the activation and marking steps can be carried out with or without a coverslip present on the surface of the membrane.
  • the interstitial volume is filled with a fluid after the filtration and counter-staining step and before the activation and marking step.
  • the interstitial space is filled with an interstitial fluid after the activation and marking step and before the detection step.
  • the interstitial fluid can be injected via the ports of the device.
  • the interstitial space can be filled from the inner face of the membrane, via diffusion of the liquid through the pores of the membrane.
  • the optional confirmation step can be carried out using an immersion microscopy objective.
  • an immersion microscopy objective thanks to the presence of the coverslip above the filtration membrane, it is possible to use immersion microscopy objectives with a very high numerical aperture (from 40X and NA > 0.6) which therefore have a very high collection power and make it possible both to minimize the dose of light received by the sample and also to improve the resolution of the images.
  • the confirmation step can be carried out with an air objective, possibly corrected for the presence of the coverslip.
  • the air objective is a 60X, air, open at 0.7, with a long working distance (greater than or equal to 1 mm) allowing focusing over the majority of the range of the interstitial space and with correction of the coverslip (variable correction ring).
  • Figure 1 is a diagram of a method of microbiological analysis by solid phase cytometry according to the prior art
  • Figure 2 is a sectional view of the filtration device according to the invention.
  • Figure 3 is an exploded sectional view of the filtration device according to the invention.
  • Figure 4 is a possible implementation schematic, with a gel interstitial layer and the thickness of interest for detection
  • Figure 5 is a perspective view of a portion of the support and filtration membrane of the filtration device
  • Figure 6 is an illustration of the method according to the invention.
  • Figure 7 is an alternative embodiment of the method according to the invention.
  • the filtration device 1 is intended for use in solid-phase cytometry.
  • the filtration device 1 comprises a filtration membrane 2 configured to filter a sample (not shown).
  • the filtration membrane 2 has an upper face 2a and a lower face 2b, the filtration of the biological sample taking place from the upper face 2a to the lower face 2b.
  • the filtration membrane is fixed to a support 6.
  • the support 6 is arranged around the filtration membrane 2 as visible in FIG. 5. In this example illustrated in FIG. 5, the filtration membrane 2 is stretched and fixed to the support 6.
  • the support 6 of the filtration membrane 2 has a lower housing 8 formed under the filtration membrane 2.
  • the lower housing 8 is open on the lower face 2b of the filtration membrane 2.
  • the lower housing 8 is configured to receive one or more functionalized cartridges 9, which will be described later.
  • the filtration device 1 further comprises a lamella 3 arranged above the upper face 2a of the filtration membrane 2.
  • the lamella 3 is arranged so as to cover the entire upper face 2a of the filtration membrane 2, in particular to protect the latter.
  • the lamella 3 is transparent to allow analysis.
  • the lamella 3 is secured to the filtration membrane 2 while maintaining an interstitial space 4.
  • the interstitial space 4 is formed between the lamella 3 and the upper face 2a of the filtration membrane 2, the interstitial space 4 being shaped to receive an interstitial fluid 5 as visible in FIG. 2.
  • the interstitial space 4 also makes it possible to accommodate the sample (not shown) before filtration.
  • the interstitial space 4 is sealed when the lamella 3 is positioned above the filtration membrane 2.
  • the filtration device 1 comprises seals 10 to seal said interstitial space 4, as visible in particular in FIGS. 2 and 4.
  • the microbiological analysis method according to the invention is a solid phase cytometry analysis method.
  • a filtration device 1 as described above is used.
  • the first step 101 of the analysis method consists in filtering the sample to be analyzed.
  • the second step 102 of the analysis method is a step of labeling the microorganisms likely to be present in the biological sample, the labeling step 102 consisting in labeling the microorganisms with a fluorogenic substrate.
  • the analysis method comprises a third step, a step of detecting 103 the labeled microorganisms.
  • the analysis method comprises a fourth, optional, step of confirming 104 detection by fluorescence microscope.
  • the method comprises a positioning step 110 in which the lamella 3 is positioned above the upper face 2a of the filtration membrane 2 of the filtration device 1 and a step of adding interstitial fluid 112 into the interstitial space 4.
  • a positioning step 110 in which the lamella 3 is positioned above the upper face 2a of the filtration membrane 2 of the filtration device 1 and a step of adding interstitial fluid 112 into the interstitial space 4.
  • these two steps can be carried out at different times.
  • the positioning step 110 of the lamella 3 is carried out before the filtration 101, the addition step 112 is carried out after filtration 110 or after any step requiring the filling of the interstitial space 4, such as for example the step of introducing the sample 111 or the step 105 of counter-staining as illustrated in figure 6.
  • the sample introduction step 111 consisting of introducing the sample onto the upper face 2a of the filtration membrane 2, can be carried out via the port(s) 7 of the support 6 of the filtration device 1.
  • the coverslip 3 is positioned (step 110) before filtration 101, and the sample is introduced (step 111) after the positioning of the coverslip 3, which ensures optimal non-contamination of the biological sample.
  • an optional counterstaining step 105 can be implemented (the step is noted in dotted form in FIG. 6 given its optional nature).
  • the interstitial space 4 fills with counterstaining solution which is then filtered by the membrane.
  • the interstitial fluid addition step 112 occurs after the counterstaining step 105.
  • the interstitial fluid addition step 112 is implemented directly after filtration 110.
  • the step of adding interstitial fluid 112 can be carried out either: by first soaking the filtration membrane 2 on its lower face 2b with a cartridge 9 comprising the interstitial fluid 5 and therefore allowing the interstitial fluid 5 in liquid form to rise by capillarity via the pores of the filtration membrane 2 and fill the interstitial space 4, by wetting the lamella 3 with the interstitial fluid 5 in liquid form before placing it on the filtration membrane 2; by turning over the pair of filtration membrane 2 and lamella 3 to access the lower face 2b of the filtration membrane 2 and allowing the interstitial fluid 5 in liquid form to settle by gravity in the interstitial space 4, by injecting, once the lamella 3 has been deposited (step 110), the interstitial fluid 5 in liquid form via the port(s) 7 of the support 6 of the filtration membrane 2, by positioning the pair of filtration membrane 2 and lamella 3 vertically and injecting the interstitial fluid 5 in liquid form from bottom to top to expel air bubbles.
  • step 106 the step is noted in dotted lines in Figure 6 given its optional nature, consisting of an activation to resuscitate the spores present in the sample and guarantee optimal enzymatic activity.
  • the "spores" consisting of an activation to resuscitate the spores present in the sample and guarantee optimal enzymatic activity.
  • the sample corresponds to a certain physiological state of microorganisms, with a very reduced metabolism. Then, the labeling step 102 of the microorganisms is implemented.
  • functionalized cartridges 9 can be used as illustrated in FIG. 3. These functionalized cartridges 9, depending on the step, can be: a reagent 12 or a medium for activating spores 12, or a cartridge for fluorescent marking or a cartridge for deactivating the marking.
  • the latter 9 are inserted into the support 6 of the filtration device 1 in order to be in contact with the lower face 2b of the filtration membrane 2 on which the microorganisms of the biological sample are retained.
  • the pre-marking 106 and marking 102 steps can also be implemented by a single functionalized cartridge having two types of particles (A) and (B) with different release times.
  • the marking substrate can be diffused initially, then after a programmed marking time, a reagent which “bleaches” and extinguishes the marking, such as a strong reducing agent.
  • a single cartridge can be used, with a culture gel 12, which allows all 3 operations: activation, marking, stopping of the marking.
  • microorganisms collected on the filtration membrane 2 are analyzed in two steps: the detection step 103 and the confirmation step 104.
  • a functionalized cartridge of culture media can be considered or the culturing of the filtration membrane 2 is also considered.
  • two types of cartridges can be considered depending on whether one wants to detect and grow aerobic or anaerobic germs.
  • the gas 11 present in the functionalized cartridge 9, as illustrated in FIGS. 2, 3 and 4, for aerobes contains oxygen and that for anaerobes is without oxygen.
  • the detection step 103 is carried out by fluorescence imaging, in Laser-Scanning and/or Full-Field and/or Image Mosaic mode.
  • the detection confirmation step 104 may be performed using an air objective or an immersion objective, with the coverslip 3 allowing the use of both of these objectives.
  • Figure 4 shows a possible implementation diagram, with a gel interstitial layer and the thickness of interest for detection, with 01 representing the focusing range of the objective and 02 the maximum working distance of the objective, with the numerical reference 50 being the objective.
  • Figure 7 also represents the method of the invention but in which the lamella 3 is only added before analysis (steps 103 and 104).
  • step 111 of introducing the biological sample it is possible to prepare the biological sample so that it is filterable.
  • the invention is not limited to the embodiments described and shown in the appended figures. Modifications remain possible, in particular from the point of view of the constitution of the various elements or by substitution of technical equivalents, without departing from the scope of protection of the invention.

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Abstract

L'invention porte sur un dispositif de filtration destiné à une utilisation en cytométrie en phase solide, ledit dispositif de filtration étant configuré pour filtrer un échantillon biologique susceptible de contenir des microorganismes et permettre son analyse, le dispositif de filtration comprenant : une membrane de filtration configurée pour filtrer l'échantillon biologique, la membrane de filtration présentant une face supérieure et une face inférieure, caractérisé en ce que le dispositif de filtration comprend en outre au moins : une lamelle agencée au-dessus de la face supérieure de la membrane de filtration, la lamelle étant agencée de manière à couvrir l'intégralité de la face supérieure de la membrane, un espace interstitiel formé entre la lamelle et la face supérieure de la membrane de filtration, l'espace interstitiel étant conformé pour recevoir un fluide.

Description

Titre : Dispositif de conditionnement d'une membrane de filtration en vue d'une analyse par cytométrie en phase solide sur ladite membrane de filtration et procédés associés
Domaine technique de l'invention
L'invention concerne le domaine technique de la cytométrie en phase solide et plus particulièrement les dispositifs et procédés et liés aux opérations sur la membrane de filtration permettant une telle analyse.
Arrière-plan technologique de l'invention
La société bioMérieux a conçu, développé, et commercialise la méthode SCANRDI® basée sur l'analyse par cytométrie en phase solide pour le contrôle microbiologique rapide d'échantillons filtra blés. Cette méthode est notamment utilisée dans le domaine pharmaceutique pour le contrôle des environnements et des procédés de production de produits stériles (eaux de process par exemple) ainsi que pour les tests libératoires des produits finis (tests de stérilité sur produits injectables par exemple).
Cette méthode est basée sur (i) des réactifs et des consommables, incluant notamment une membrane de filtration dédiée (détaillée ci-dessous) et des réactifs de marquage fluorescent, (ii) une plateforme instrumentale de cytométrie en phase solide, comme par exemple l'instrument SCANRDI® commercialisé par la société bioMérieux, (iii) des algorithmes de détection et de comptage des microorganismes.
Comme expliqué ci-avant, un des éléments centraux de l'analyse est une membrane de filtration. Cette dernière est poreuse avec une densité de pores (~ 1.5 108 pores /cm2) et une taille de pores inférieure à 0.4pm, permettant de retenir l'ensemble des microorganismes (hors virus). Ladite membrane de filtration est une membrane dite « de surface » où les objets sont retenus sur la face supérieure et non pas dans le volume de la membrane, et présente une faible épaisseur entre 20pm et 30pm. Par ailleurs, la membrane de filtration est préférentiellement réalisée en polymère : polyester (de type PET) ou polycarbonate, percée par « track-etching » et colorée en noir pour réduire sa fluorescence intrinsèque (élevée pour les matières plastiques) et ainsi augmenter le contraste de la détection des microorganismes par fluorescence.
La membrane est flexible et peut être utilisée telle quelle comme un consommable à manipuler (pose/dépose sur un support de filtration, sur les tampons, etc...) mais peut être avantageusement préfixée et tendue dans un support adapté, facilitant le couplage avec les autres accessoires nécessaires à la méthode, tels qu'un entonnoir de filtration, un support pour rampe de filtration, un tampon d'imprégnation.
Par ailleurs, il existe également des membranes de filtration en surface basée sur des matériaux inorganiques, de type céramique par exemple, qui sont nativement rigides, avec des pores usinés en lithographie. De telles membranes ne sont généralement pas colorées car avec une très faible fluorescence intrinsèque.
La méthode de cytométrie en phase solide a d'excellentes performances : elle permet de détecter la présence d'une seule cellule microbienne dans un volume d'échantillon jusqu'à plusieurs dizaines de ml en seulement 3 heures.
Néanmoins plusieurs facteurs limitent son usage, et notamment : le fait que le protocole soit essentiellement manuel et assez fastidieux (voir détail ci-dessous), le fait que l'échantillon soit transféré d'un équipement à un autre (rampe de filtration, incubateur, SCANRDI®, microscope), avec des possibilités d'une contamination secondaire liée au test lui-même, le fait que la confirmation d'un éventuel contaminant nécessite un examen minutieux en microscopie de fluorescence, pas toujours aisé à cause du risque de photoblanchiment (photo-bleaching) et une phototoxicité associée, le fait que certains microbes détectés ne puissent pas repousser ultérieurement sur un milieu de culture à cause du stress global induit par la méthode.
La méthode de cytométrie en phase solide s'effectue en plusieurs étapes comme illustré en figure 1 : filtration 101, contre-coloration 105, activation 106, marquage 102, détection 103 et confirmation 104. Les étapes de contre-coloration 105, d'activation
106 et de confirmation 104 sont optionnelles. Optionnellement, une étape de culture
107 peut être mise en œuvre après la confirmation 104.
La première étape consiste à filtrer tout le volume de l'échantillon à analyser sur une membrane de filtration, dans un environnement contrôlé : une enceinte de sécurité biologique (PSM) ou sous hotte à flux laminaire. Pour garantir que l'ensemble de l'échantillon passe au travers de la membrane, un second fluide stérile est généralement filtré derrière, pour récupérer les résidus accrochés à l'entonnoir de filtration. Dans un second temps, et de façon optionnelle, un réactif de contre-coloration est filtré, à la suite de l'échantillon, permettant d'augmenter le contraste des microorganismes. Pour être efficace, cette étape doit se faire de façon privilégiée par le dessus de la membrane.
Ensuite vient l'étape de marquage, éventuellement précédée d'une phase d'activation pour augmenter l'efficacité du marqueur. Ces deux étapes sont réalisées préférentiellement à partir de la face inférieure de la membrane de filtration, avec un medium placé en contact intime sous la membrane de filtration. Le réactif diffuse au travers de la membrane de filtration jusque vers la face supérieure de la membrane de filtration. On peut supposer qu'il se forme une très fine couche de liquide surnageant à la surface de la membrane de quelques microns voire dizaine de microns. Sous l'action de l'air cette couche peut s'assécher avec un facteur de stress supplémentaire pour les microbes, dont il faut maintenir la viabilité et les capacités de reproduction. D'un autre côté, une couche liquide trop importante peut perturber l'examen optique de la surface avec une perte de focus. En général le medium est imbibé de façon à ce qu'il n'y ait pas de couche liquide visible en surface de la membrane de filtration.
Lors de l'étape de détection, la membrane de filtration est généralement placée en contact intime sur un tampon imbibé de façon à garantir sa planéité et éviter l'assèchement. La détection des signaux de fluorescence spécifiques des microorganismes peut se faire avec différents moyens optiques, mais dans tous les cas, il y a une exposition plus ou moins longue à une lumière excitatrice (Laser ou LED) et les risques d'assèchement et de contamination sont présents.
La détection peut être suivie d'une étape de confirmation, permettant de visualiser à haute résolution, au moyen d'un microscope à forte ouverture numérique, les objets détectés et confirmer qu'il s'agit bien de microbes. Comme pour l'étape de détection, et de façon encore plus critique, il est important de maîtriser la planéité de la membrane et l'éventuelle fine couche de liquide surnageant à la surface afin de garantir la qualité des images acquises (résolution et contraste).
En cas de détection de présence de microorganismes, et de façon optionnelle, la membrane peut enfin être placée sur une gélose ou dans un milieu de culture liquide afin de les faire croître pour permettre une identification la plus fine possible.
Dans l'état de l'art actuel, la membrane de filtration est toujours à l'air, sauf pendant les étapes de transfert d'un poste à un autre où un couvercle de protection peut éventuellement être posé sur la membrane, sans propriétés autres que limiter la contamination éventuelle de l'échantillon par l'environnement ou vice-versa, le couvercle étant retiré pour l'étape de détection de la méthode. Objet de l'invention
L'invention a pour but d'améliorer l'existant ci-dessus décrit et notamment de : maintenir l'intégrité de l'échantillon tout le long de l'analyse, depuis la filtration jusqu'au résultat de détection, voire l'identification des contaminants, réduire les risques de pollution de l'environnement par l'échantillon, réduire le risque de contamination de l'échantillon durant le procédé (contamination secondaire), réduire la phototoxicité de l'analyse, réduire le photoblanchiment, favoriser la repousse post-analyse, permettre une manipulation plus aisée de la membrane et notamment de la placer à l'envers, face supérieure vers le bas, dans un microscope inversé, permettre l'utilisation d'objectifs à immersion et donc d'améliorer la qualité des images lors de l'étape de confirmation au microscope (l'utilisation d'objectifs à immersion pour une imagerie microscopique avec une très forte ouverture numérique permet une meilleure collection de lumière et meilleure qualité d'image).
À cet effet, l'invention a pour objet un dispositif de conditionnement d'une membrane de filtration en vue d'une analyse par cytométrie en phase solide, ledit dispositif de conditionnement comprenant : une membrane de filtration configurée pour filtrer un échantillon biologique, la membrane de filtration présentant une face supérieure et une face inférieure, caractérisé en ce que le dispositif de conditionnement comprend en outre au moins : une lamelle agencée au-dessus de la face supérieure de la membrane de filtration, la lamelle étant agencée de manière à couvrir l'intégralité de la face supérieure de la membrane de filtration, un espace interstitiel formé entre la lamelle et la face supérieure de la membrane de filtration, l'espace interstitiel étant conformé pour recevoir un fluide. L'invention vise à maintenir l'intégrité de l'échantillon en maîtrisant l'état de la face supérieure de la membrane de filtration pendant les étapes du protocole grâce à l'apposition d'une lamelle et à l'espace interstitiel. On évite ainsi la pollution de l'échantillon par l'environnement de l'analyse (et principalement l'équipement qui est en contact direct), la contamination de l'environnement (principalement équipement) par l'échantillon, et on limite donc ainsi la contamination croisée d'un échantillon vers l'autre. La pollution peut être microbiologique mais également par des particules et poussières de l'environnement.
En outre, la lamelle permet de limiter tout contact direct inopiné avec la surface de la membrane de filtration, frottements par exemple, et à limiter les effets d'une mauvaise manipulation, comme par exemple, une mauvaise prise de la membrane, ou la membrane qui tombe, etc... et permet également d'éviter les contacts avec l'air environnant, limitant ainsi l'assèchement de la membrane de filtration ou l'oxydation.
Par ailleurs, la présence d'un fluide dans l'espace interstitiel, avec une épaisseur déterminée, est compatible avec l'examen optique de la surface de la membrane de filtration et a un effet spécifique favorable de dissipation limitant le « photo-bleaching » pendant la détection en fluorescence.
La présence combinée de la lamelle et de l'espace interstitiel du fluide interstitiel présente d'autres avantages parmi lesquels : le contrôle spécifique d'un milieu favorable au métabolisme des microorganismes (aérobie ou anaérobie), la prévention des effets toxiques de l'oxygène spécifiques à l'analyse en fluorescence, en particulier le « quenching » et la phototoxicité, la possibilité d'utiliser un objectif à immersion.
Selon une caractéristique de l'invention, la lamelle présente des qualités optiques permettant l'examen microscopique. Plus particulièrement, la lamelle est transparente et par exemple en verre borosilicaté ou en quartz, ou encore en matériau polymère (résines acrylates, polystyrène cristal). Le choix de la matière dépend notamment des contraintes mécaniques à supporter, de la taille de la membrane à couvrir et de l'indice de réfraction du fluide interstitiel placé entre la face supérieure de la membrane et la face inférieure de la lamelle (entre 1.35 pour de l'eau jusqu'à 1.52 pour des huiles d'immersion). Selon une autre caractéristique de l'invention, la lamelle présente une épaisseur comprise entre 100 pm et 300 pm.
Selon une caractéristique de l'invention, la lamelle est solidarisée à la membrane de filtration tout en maintenant l'espace interstitiel.
Selon une caractéristique de l'invention, la lamelle peut être solidarisée à la membrane par collage et/ou clipsage et/ou scellage.
Selon une caractéristique de l'invention, l'espace interstitiel présente une épaisseur prédéterminée comprise entre 100 pm et 500 pm et préférentiellement d'au moins 250 pm. Grâce à cet espace, il est possible de garantir l'étape de filtration (en limitant les forces de capillarité / résistance fluidique dues à la lamelle) et l'examen optique après filtration.
La borne minimale à 100 pm d'épaisseur de l'espace interstitiel est déterminée par les contraintes de fabrication des pièces par injection/moulage ainsi que par l'épaisseur intrinsèque de la membrane de filtration elle-même, environ 25 pm. De plus, dans le cadre de la mise en croissance ultérieure des microorganismes restants à la surface de la face supérieure de la membrane de filtration, l'épaisseur doit être suffisante pour ne pas contraindre le développement de micro-colonies.
Dans l'option où la lamelle est positionnée au-dessus de la membrane de filtration avant l'étape de filtration, l'épaisseur minimale de l'espace interstitiel est d'au moins 250 pm, ce qui garantit que la filtration s'opère de façon uniforme sur toute la membrane de filtration, sans risque de rupture mécanique, déchirure de membrane de filtration ou de fuite. En effet, avec une telle épaisseur, et dans le cadre d'une dépression appliquée entre la face supérieure et la face inférieure de la membrane de filtration, tout le volume au-dessus de la membrane de filtration est d'abord rempli uniformément de fluide interstitiel, grâce à la résistance fluidique de la membrane de filtration qui est supérieure aux forces capillaire de friction liées à la lamelle, avant que le fluide interstitiel ne passe ensuite au travers de la membrane de filtration vers la zone de la membrane de filtration mise en dépression.
La borne maximale à 500 pm d'épaisseur de l'espace interstitiel est déterminée par les contraintes optiques et notamment la distance de travail maximale atteignable pour des objectifs standards à fort grossissement, autour de 1 mm, qui doit couvrir l'épaisseur de la lamelle ajoutée de ladite épaisseur de l'espace interstitiel. De plus, en fonction du fluide utilisé pour remplir cet espace interstitiel, et notamment de ses caractéristiques d'absorption, de diffusion ou de fluorescence, cette borne maximale sera d'autant plus réduite pour garantir la meilleure qualité d'imagerie.
Préférentiellement, une épaisseur d'espace interstitiel autour de 250 pm permet d'avoir un dispositif utilisable tout le long du protocole d'analyse, depuis la filtration de l'échantillon biologique jusqu'à l'étape de confirmation au microscope et au-delà pendant la mise en culture éventuelle permettant l'identification.
Selon une caractéristique de l'invention, le dispositif de filtration comprend un fluide interstitiel logé dans l'espace interstitiel, le fluide étant un tampon liquide ou un gel. Avantageusement, le fluide est un tampon liquide contenant optionnellement un tensio-actif, comme par exemple un polysorbate, connu également sous le nom commercial Tween®, afin d'améliorer la mouillabilité dudit tampon.
Selon une caractéristique de l'invention, le fluide interstitiel est transparent et peu diffusant, ce qui permet sa compatibilité avec un examen optique à haute résolution de la membrane de filtration.
Avantageusement, le fluide interstitiel est un gel ou liquide gélifié au moyen d'un gélifiant par exemple du Kappa Carraghénane. Dans cette configuration, le liquide est introduit à une température entre 45°C et 50°C et gélifie ensuite rapidement à température ambiante dans l'espace interstitiel.
Selon une caractéristique de l'invention, le fluide interstitiel peut contenir un réactif réducteur en solution qui vise à hydrolyser les molécules de fluorophores présentes dans la matrice en augmentant ainsi le contraste entre les microorganismes marqués (fluorophore piégé dans les cellules) et l'arrière-plan.
Selon une caractéristique de l'invention, le fluide interstitiel peut être additionné de substances nutritives solubles pour favoriser la croissance microbienne.
Selon une caractéristique de l'invention, les réactifs ajoutés dans le fluide interstitiel peuvent être encapsulés dans des microparticules permettant leur libération contrôlée et programmée tout le long du protocole. Alternativement, le fluide interstitiel peut être également un mélange d'huile, paraffine ou de l'eau.
Selon une caractéristique de l'invention, la membrane de filtration peut être réalisée en polymère, polycarbonate ou polyéthylène téréphtalate (PET) ou en matériau composite rigide.
Selon une caractéristique de l'invention, la membrane de filtration peut être en polymère et percée avec le procédé de type « track-etched », ce qui signifie que le pores sont réalisés en 2 étapes : une première étape où le film plastique est bombardé par des particules à haute énergie afin de générer des impacts à la surface (« track »), une seconde étape où le film plastique est ensuite soumis à une attaque chimique (« etching ») dans un bain, où les pores sont formés à partir des traces (« tracks ») préalablement constituées. Dans ce procédé, la densité des pores est déterminée par la première étape (densité des « tracks »), tandis que la taille des pores est contrôlée par les conditions de l'attaque chimique.
Selon une caractéristique de l'invention, la membrane peut être en céramique et gravée/percée par lithographie laser.
Selon une caractéristique de l'invention, la membrane de filtration peut être colorée ou métallisée.
Selon une caractéristique de l'invention, le dispositif de filtration comprend au moins un support sur lequel la membrane de filtration est positionnée, ledit support présentant au moins un port communicant avec la face supérieure de la membrane de filtration.
Selon une caractéristique de l'invention, le support comprend une pluralité de ports.
Avantageusement, le ou les ports permettent les manipulations sur la face supérieure de la membrane de filtration, notamment la filtration (en fermant un des deux ports) ou l'introduction d'un fluide interstitiel après filtration.
Selon une caractéristique de l'invention, au moins un port du support est configuré pour permettre le remplissage de l'espace interstitiel avec le fluide interstitiel. Avantageusement, le support de la membrane de filtration est un cadre sur lequel la membrane de filtration est tendue et fixée. Avantageusement, le cadre est positionné sur le périmètre de la membrane de la filtration.
Selon une caractéristique de l'invention, le support de la membrane de filtration présente un logement inférieur ménagé sous la membrane de filtration.
Avantageusement, le logement inférieur est ouvert sur la face inférieure 2b de la membrane de filtration.
Selon une caractéristique de l'invention, le support comprend un logement inférieur, formé sous la membrane de filtration, le logement inférieur étant conformé pour recevoir une cartouche fonctionnalisée destinée à venir en contact avec la face inférieure de la membrane.
Selon une caractéristique de l'invention, le dispositif de filtration comprend au moins une cartouche fonctionnalisée, ladite cartouche fonctionnalisée pouvant être un réactif ou un milieu de culture ou un milieu pour l'activation de spores, ou une cartouche pour le marquage fluorescent ou une cartouche de désactivation du marquage et/ou pour maintenir la membrane de filtration imbibée.
Selon une caractéristique de l'invention, la cartouches contient les réactifs sous forme de solution dans une matrice liquide.
Selon une caractéristique de l'invention, la cartouche est un tampon (pad) imbibé de réactif.
Selon une caractéristique de l'invention, la cartouche contient les réactifs dans une matrice gel.
Selon une caractéristique de l'invention, les cartouches peuvent être mises en contact l'une à la suite de l'autre durant le protocole ; par exemple, la cartouche d'activation, ensuite la cartouche de marquage et enfin la cartouche de support garantissant la planéité pour la détection. Selon une caractéristique de l'invention, une seule cartouche peut s'utiliser pour plusieurs étapes, avec un mélange de réactifs.
Selon une caractéristique de l'invention, les réactifs de la cartouche sont encapsulés dans des microparticules permettant une libération contrôlée/programmée. Ainsi, dans un intervalle de temps donné, ou sous l'effet d'un gradient de température, les particules libèrent le substrat de marquage dans le milieu qui vient ensuite diffuser vers la membrane de filtration et marquer les microorganismes d'intérêt. Une telle cartouche permet de combiner avec une seule cartouche les étapes d'activation et de marquage.
Avantageusement, le dispositif de filtration comprend en outre un couvercle qui est clipsé/collé sur le support 6, une fois l'étape de filtration réalisée. Un tel dispositif de filtration selon l'invention, une fois fermé et avant l'étape de détection, permet de garder de façon protégée la membrane de filtration et la laisser plusieurs jours dans un incubateur pour permettre la croissance des microorganismes à la surface de la membrane de filtration, ce qui facilite l'identification des microorganismes.
Avantageusement, le réactif peut être sous forme liquide, gel ou pad imbibé.
Avantageusement, le dispositif de comprend également un espace contenant des gaz, permettant la croissance des microbes.
La présente invention a également pour objet une méthode d'analyse microbiologique par cytométrie en phase solide au moyen d'un dispositif de filtration selon l'invention, la méthode d'analyse comprenant au moins les étapes suivantes : une étape de filtration de l'échantillon par la membrane de filtration ; une étape de marquage en fluorescence des microorganismes susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique, une étape de détection des microorganismes marqués, la méthode étant caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins une étape selon laquelle on positionne la lamelle au-dessus de la face supérieure de la membrane de filtration du dispositif de filtration.
Selon une caractéristique de l'invention, la méthode comprend une étape de confirmation de détection par microscope de fluorescence, cette étape étant réalisée après l'étape de détection ou après l'étape de marquage. Selon une caractéristique de l'invention, l'étape de marquage en fluorescence consiste à rendre les microorganismes fluorescents.
Selon une caractéristique de l'invention, l'étape de marquage en fluorescence peut être réalisée avec un substrat fluorogénique ou un réactif ou tout autre moyen permettant d'aboutir à la fluorescence du microorganisme.
Selon une caractéristique de l'invention, l'échantillon se présente sous la forme liquide de manière à être filtrable. Préférentiellement, l'échantillon est non biologique et est par exemple : des eaux usées, des produits chimiques injectables, etc.
Selon une caractéristique de l'invention, on positionne la lamelle au-dessus de la face supérieure de la membrane de filtration du dispositif de filtration avant l'étape de filtration. Après cette étape de positionnement de lamelle, une étape supplémentaire d'ajout d'un fluide interstitiel dans l'espace interstitiel du dispositif de filtration est réalisé après l'étape de filtration, directement après l'étape de filtration ou non.
Alternativement et selon une caractéristique de l'invention, on positionne la lamelle au- dessus de la face supérieure de la membrane de filtration du dispositif de filtration après l'étape de filtration. Après cette étape de positionnement de lamelle, on ajoute le fluide interstitiel dans l'espace interstitiel du dispositif de filtration avant l'étape de détection, directement après l'étape de détection ou non.
Selon une caractéristique de l'invention la lamelle peut être solidarisée à la membrane par clipsage à n'importe quel moment de la méthode d'analyse, une fois un entonnoir de filtration retiré.
Selon une caractéristique de l'invention, si la lamelle est positionnée après l'étape de filtration, l'échantillon est injecté directement sur la face supérieure de la membrane de filtration via un entonnoir de filtration.
Selon une caractéristique de l'invention, si la lamelle est positionnée avant l'étape de filtration, l'échantillon est injecté sur la face supérieure de la membrane de filtration via le ou les ports du support du dispositif de filtration.
Selon une caractéristique de l'invention, il peut être appliqué, durant la filtration de l'échantillon, que la lamelle soit présente ou non, une dépression sur la face inférieure de la membrane de filtration, ce qui permet d'obtenir une filtration homogène sur toute la surface de la membrane de filtration, améliorant de ce fait l'efficacité et la rapidité de la filtration.
Avantageusement, si la lamelle est présente durant la filtration, l'échantillon sous forme liquide vient remplir l'espace interstitiel avant que l'effet d'aspiration le fasse passer au travers des pores de la membrane de filtration.
Selon une caractéristique de l'invention, la méthode peut en outre inclure une étape d'ajout d'une solution de contre-coloration, cet ajout étant réalisé par la filtration de ladite solution, après filtration de l'échantillon. Comme pour la filtration de l'échantillon, cette étape se fait par la face supérieure de la membrane, soit via un entonnoir, soit via les port d'injection, si la lamelle est présente.
Cette étape de contre-coloration est une étape optionnelle qui permet de réduire la fluorescence endogène de l'échantillon et le marquage non-spécifique. En effet, l'échantillon peut correspondre à différents produits, plus ou moins complexes (solution, suspension, émulsion) avec une éventuelle préparation préalable pour le rendre filtrable (centrifugation, lyse mécanique, lyse chimique). L'échantillon, en plus des éventuels microbes marqués en fluorescence peut donc contenir des particules ou débris intrinsèquement fluorescents. Même si certaines particules ne sont pas nativement fluorescentes, le marquage exogène apporté par le protocole peut ne pas être parfaitement spécifique et marquer des objets autres que des microbes, soit par conversion directe du substrat fluorogénique en fluorophore dans un site non recherché (pas une cellule microbienne), soit par efflux du fluorophore généré à l'intérieur d'une cellule microbienne au travers de la membrane, par l'action de pompes à efflux ; le fluorophore venant donc marquer l'ensemble de l'échantillon, et réduisant le contraste. La solution de contre-coloration vient donc masquer / couvrir les sites avant l'étape de marquage pour prévenir/empêcher l'accès du fluorophore.
Selon une caractéristique de l'invention, la méthode peut comprendre une étape de prémarquage préalable à l'étape de marquage, ladite étape de prémarquage constituant en une activation pour ressusciter les spores et garantir une activité enzymatique optimale. Selon une caractéristique de l'invention, les étapes d'activation et de marquage peuvent se réaliser avec ou sans lamelle présente à la surface de la membrane.
Selon une caractéristique de l'invention, le volume interstitiel est rempli d'un fluide après l'étape de filtration et de contre-coloration et avant l'étape d'activation et de marquage.
Selon une caractéristique de l'invention, l'espace interstitiel est rempli d'un fluide interstitiel après l'étape d'activation et de marquage et avant l'étape de détection.
Selon une caractéristique de l'invention le fluide interstitiel peut être injecté via les ports du dispositif.
Selon une caractéristique de l'invention, l'espace interstitiel peut être rempli depuis la face intérieure de la membrane, via diffusion du liquide au travers des pores de la membrane
Selon une caractéristique de l'invention, l'étape de confirmation, optionnelle, peut être réalisée au moyen d'un objectif de microscopie à immersion. En effet, grâce à la présence de la lamelle au-dessus de la membrane de filtration, on peut utiliser des objectifs de microscopie à immersion, à très forte ouverture numérique (à partir de 40X et NA > 0,6) qui ont donc un très fort pouvoir de collection et permettent à la fois de minimiser la dose de lumière reçue par l'échantillon et également d'améliorer la résolution des images. Dans le cas de l'utilisation d'un objectif à immersion, il faut prévoir l'utilisation d'une huile d'immersion compatible avec le matériau de la lamelle. Alternativement, l'étape de confirmation peut être réalisée avec un objectif à air, corrigé éventuellement de la présence de lamelle.
Selon une caractéristique de l'invention, l'objectif à air est un 60X, à air, ouvert à 0.7, à longue distance de travail (supérieure ou égale à 1 mm) permettant la mise au point sur la majorité de la plage de l'espace interstitiel et avec correction de la lamelle (bague de correction variable).
Brève description des figures
L'invention sera mieux comprise, grâce à la description ci-après, qui se rapporte à des modes de réalisation selon la présente invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs et expliqués avec référence aux figures schématiques annexées. Les figures schématiques annexées sont listées ci-dessous :
La figure 1 est un schéma d'une méthode d'analyse microbiologique par cytométrie en phase solide selon l'art antérieur,
La figure 2 est une vue en coupe du dispositif de filtration selon l'invention,
La figure 3 est une vue en coupe éclatée du dispositif de filtration selon l'invention,
La figure 4 est un schéma d'implémentation possible, avec une couche interstitielle en gel et l'épaisseur d'intérêt pour la détection,
La figure 5 est une vue en perspective d'une partie du support et de la membrane de filtration du dispositif de filtration,
La figure 6 est une illustration de la méthode selon l'invention
La figure 7 est une variante de réalisation de la méthode selon l'invention.
Description détaillée
L'invention va maintenant être décrite en détail en référence aux figures listées ci- dessus.
Le dispositif de filtration 1 selon l'invention est destiné à une utilisation en cytométrie en phase solide. Le dispositif de filtration 1 comprend une membrane de filtration 2 configurée pour filtrer un échantillon (non représenté). Comme illustré en figure 2 notamment, la membrane de filtration 2 a une face supérieure 2a et une face inférieure 2b, la filtration de l'échantillon biologique s'opérant de la face supérieure 2a vers la face inférieure 2b. La membrane de filtration est fixée sur un support 6. Idéalement, le support 6 est agencé autour de la membrane de filtration 2 comme visible sur la figure 5. Dans cet exemple illustré en figure 5, la membrane de filtration 2 est tendue et fixée sur le support 6.
Le support 6 de la membrane de filtration 2 présente un logement inférieur 8 ménagé sous la membrane de filtration 2. Le logement inférieur 8 est ouvert sur la face inférieure 2b de la membrane de filtration 2. Le logement inférieur 8 est configuré pour recevoir une ou plusieurs cartouches fonctionnalisées 9, qui vont être décrites par la suite.
Comme illustré aux figures 2 et 3, le dispositif de filtration 1 comprend en outre une lamelle 3 agencée au-dessus de la face supérieure 2a de la membrane de filtration 2. Comme on peut le voir, la lamelle 3 est agencée de manière à couvrir l'intégralité de la face supérieure 2a de la membrane de filtration 2, afin, notamment, de protéger cette dernière. La lamelle 3 est transparente pour permettre l'analyse. La lamelle 3 est solidarisée à la membrane de filtration 2 tout en maintenant un espace interstitiel 4. L'espace interstitiel 4 est formé entre la lamelle 3 et la face supérieure 2a de la membrane de filtration 2, l'espace interstitiel 4 étant conformé pour recevoir un fluide interstitiel 5 comme visible en figure 2. L'espace interstitiel 4 permet également d'accueillir l'échantillon (non représenté) avant filtration. L'espace interstitiel 4 est étanche lorsque la lamelle 3 est positionnée au-dessus de la membrane de filtration 2. En effet, le dispositif de filtration 1 comprend des joints 10 pour étanchéifier ledit espace interstitiel 4, comme visible notamment en figures 2 et 4.
D'autres détails du dispositif de filtration 1 vont apparaître à la lumière de la description de la méthode qui va maintenant être détaillée.
La méthode d'analyse microbiologique selon l'invention, est une méthode d'analyse par cytométrie en phase solide.
Pour mettre en œuvre cette méthode d'analyse, on utilise un dispositif de filtration 1 tel que décrit précédemment.
La première étape 101 de la méthode d'analyse consiste à filtrer l'échantillon à analyser. La deuxième étape 102 de la méthode d'analyse est une étape de marquage des microorganismes susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique, l'étape de marquage 102 consistant à marquer avec un substrat fluorogénique les microorganismes. La méthode d'analyse comprend une troisième étape, une étape de détection 103 des microorganismes marqués. La méthode d'analyse comprend une quatrième étape, optionnelle, de confirmation 104 de détection par microscope de fluorescence.
La méthode comprend une étape de positionnement 110 selon laquelle on positionne la lamelle 3 au-dessus de la face supérieure 2a de la membrane de filtration 2 du dispositif de filtration 1 et une étape d'ajout de fluide interstitiel 112 dans l'espace interstitiel 4. Suivant les étapes du procédé, ces deux étapes peuvent être réalisées à des moments différents.
Par exemple, comme illustré en figure 6, l'étape de positionnement 110 de la lamelle 3 est réalisée avant la filtration 101, l'étape d'ajout 112 est réalisée après filtration 110 ou après toute étape nécessitant le remplissage de l'espace interstitiel 4, comme par exemple l'étape d'introduction de l'échantillon 111 ou encore l'étape 105 de contre- coloration comme illustré en figure 6.
L'étape d'introduction d'échantillon 111, consistant à introduire l'échantillon sur la face supérieure 2a de la membrane de filtration 2, peut être réalisée, via le ou les ports 7 du support 6 du dispositif de filtration 1.
Dans l'exemple illustré en figure 6, la lamelle 3 est positionnée (étape 110) avant filtration 101, et l'échantillon est introduit (étape 111) après le positionnement de la lamelle 3, ce qui permet d'assurer une non-contamination de l'échantillon biologique optimale. Suite à la filtration, une étape optionnelle 105 de contre-coloration peut être mise en œuvre (l'étape est notée en pointi liée sur la figure 6 étant donné son caractère optionnel). Lorsque l'étape de contre-coloration 105 est mise en œuvre, l'espace interstitiel 4 se remplit de solution de contre-coloration qui est alors filtrée par la membrane. L'étape d'ajout de fluide interstitiel 112 intervient après l'étape de contre- coloration 105. Lorsque l'étape de contre-coloration n'est pas mise en œuvre, l'étape d'ajout de fluide interstitiel 112 est mise en œuvre directement après filtration 110.
L'étape d'ajout 112 de fluide interstitiel peut être réalisée soit : en imbibant d'abord la membrane de filtration 2 sur sa face inférieure 2b avec une cartouche 9 comprenant le fluide interstitiel 5 et laissant donc le fluide interstitiel 5 sous forme liquide remonter par capillarité via les pores de la membrane de filtration 2 et remplir l'espace interstitiel 4, en mouillant la lamelle 3 avec le fluide interstitiel 5 sous forme liquide avant de la poser sur la membrane de filtration 2 ; en retournant le couple membrane de filtration 2 et lamelle 3 pour accéder à la face inferieure 2b de la membrane de filtration 2 et en laissant le fluide interstitiel 5 sous forme liquide se déposer par gravité dans l'espace interstitiel 4, en injectant, une fois la lamelle 3 déposée (étape 110), le fluide interstitiel 5 sous forme liquide via le ou les ports 7 du support 6 de la membrane de filtration 2, en positionnant le couple membrane de filtration 2 et lamelle 3 à la verticale et en injectant le fluide interstitiel 5 sous forme liquide de bas en haut pour chasser les bulles d'air. Comme illustré en figure 6, s'en suit une étape optionnelle de prémarquage 106 (l'étape est notée en pointil lée sur la figure 6 étant donné son caractère optionnel), consistant en une activation pour ressusciter les spores présents dans l'échantillon et garantir une activité enzymatique optimale. Dans la présente invention, les « spores »
De l'échantillon correspondent à un certain état physiologique des micro-organismes, avec un métabolisme très réduit. Puis, on met en œuvre l'étape de marquage 102 des microorganismes.
Lors des étapes de prémarquage 106 et de marquage 102, on peut utiliser des cartouches fonctionnalisées 9 comme illustré en figure 3. Ces cartouches fonctionnalisées 9, selon l'étapes, peuvent être : un réactif 12 ou un milieu pour l'activation de spores 12, ou une cartouche pour le marquage fluorescent ou une cartouche de désactivation du marquage. Ces dernières 9, s'insèrent dans le support 6 du dispositif de filtration 1 afin d'être en contact avec la face inférieure 2b de la membrane de filtration 2 sur laquelle les microorganismes de l'échantillon biologique sont retenus.
Les étapes de prémarquage 106 et de marquage 102 peuvent également être mises en œuvre par une seule et même cartouche fonctionnalisée présentant deux types de particules (A) et (B) avec des temps de libération différent. Ainsi, on peut diffuser dans un premier temps le substrat de marquage, puis après une durée de marquage programmée, un réactif qui « bleach » et éteint le marquage, comme un agent réducteur fort. Avec un tel dispositif, on peut utiliser une seule cartouche, avec un gel de culture 12, qui permette l'ensemble des 3 opérations : activation, marquage, arrêt du marquage.
Enfin, on analyse les microorganismes recueillis sur la membrane de filtration 2 par deux étapes : l'étape de détection 103 et l'étape de confirmation 104.
Il est également possible d'ajouter une étape de culture des microorganismes afin d'augmenter la masse de microorganismes à des fins de détection plus efficace : une cartouche fonctionnalisée de milieux de culture peut s'envisager ou la mise en culture de la membrane de filtration 2 est également envisagée. Dans cette étape (non représentée), on peut envisager deux types de cartouches selon que l'on veuille détecter et faire croître des germes aérobies ou anaérobies. Le gaz 11 présent dans la cartouche fonctionnalisée 9, comme illustré en figures 2, 3 et 4, pour les aérobies contient de l'oxygène et celui pour les anaérobies est sans oxygène.
L'étape de détection 103 est réalisée par imagerie de fluorescence, en mode Laser- Scanning et/ou Full-Field et/ou Mosaïque d'images. L'étape de confirmation de détection 104, peut être réalisée au moyen d'un objectif à air ou un objectif à immersion, la lamelle 3 permettant l'utilisation de ces deux objectifs. La figure 4 présente un schéma d'implémentation possible, avec une couche interstitielle en gel et l'épaisseur d'intérêt pour la détection, avec 01 représentant la plage de mise au point de l'objectif et 02 la distance maximale de travail de l'objectif, la référence numérique 50 étant l'objectif.
La figure 7 représente également la méthode de l'invention mais dans laquelle la lamelle 3 n'est ajoutée qu'avant analyse (étapes 103 et 104).
Par ailleurs, préalablement à l'étape 111 d'introduction de l'échantillon biologique, il est possible de préparer l'échantillon biologique pour qu'il soit filtrable. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés aux figures annexées. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de filtration destiné à une utilisation en cytométrie en phase solide, ledit dispositif de filtration étant configuré pour filtrer un échantillon susceptible de contenir des microorganismes et permettre son analyse, le dispositif de filtration comprenant : une membrane de filtration configurée pour filtrer l'échantillon biologique, la membrane de filtration présentant une face supérieure et une face inférieure, caractérisé en ce que le dispositif de filtration comprend en outre au moins : une lamelle agencée au-dessus de la face supérieure de la membrane de filtration, la lamelle étant agencée de manière à couvrir l'intégralité de la face supérieure de la membrane, un espace interstitiel formé entre la lamelle et la face supérieure de la membrane de filtration, l'espace interstitiel étant conformé pour recevoir un fluide.
2. Dispositif de filtration selon la revendication 1, comprenant un fluide interstitiel logé dans l'espace interstitiel, le fluide étant un liquide ou un gel.
3. Dispositif de filtration selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la lamelle est solidarisée à la membrane de filtration tout en maintenant l'espace interstitiel.
4. Dispositif de filtration selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant au moins un support sur lequel la membrane de filtration est positionnée, ledit support présentant au moins un port communicant avec la face supérieure de la membrane.
5. Dispositif de filtration selon la revendication 4, dans lequel le support comprend un logement inférieur, formé sous la membrane de filtration, le logement inférieur étant conformé pour recevoir une cartouche fonctionnalisée destinée à venir en contact avec la face inférieure de la membrane.
6. Dispositif de filtration selon la revendication 5, comprenant au moins une cartouche fonctionnalisée, ladite cartouche fonctionnalisée pouvant être un réactif ou un milieu de culture ou un milieu pour l'activation de spores, ou une cartouche pour le marquage fluorescent ou une cartouche de désactivation du marquage et/ou pour maintenir la membrane de filtration imbibée.
7. Méthode d'analyse microbiologique par cytométrie en phase solide au moyen d'un dispositif de filtration selon l'une quelconque des revendications précédentes, la méthode d'analyse comprenant au moins les étapes suivantes : une étape de filtration de l'échantillon par la membrane de filtration, une étape de marquage en fluorescence des microorganismes susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique, une étape de détection des microorganismes marqués, la méthode étant caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins une étape selon laquelle on positionne la lamelle au-dessus de la face supérieure de la membrane de filtration du dispositif de filtration.
8. Méthode d'analyse microbiologique par cytométrie en phase solide selon la revendication 7, dans laquelle on positionne la lamelle au-dessus de la face supérieure de la membrane de filtration du dispositif de filtration avant l'étape de filtration et une étape supplémentaire d'ajout d'un fluide interstitiel dans l'espace interstitiel du dispositif de filtration est réalisé après l'étape de filtration.
9. Méthode d'analyse microbiologique par cytométrie en phase solide selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, dans laquelle l'échantillon est injecté sur la face supérieure de la membrane de filtration via le ou les ports du support du dispositif de filtration.
10. Méthode d'analyse microbiologique par cytométrie en phase solide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans laquelle on positionne la lamelle au-dessus de la face supérieure de la membrane de filtration du dispositif de filtration et on ajoute le fluide interstitiel dans l'espace interstitiel du dispositif de filtration avant l'étape de détection.
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