EP4652457A1 - Verfahren und vorrichtung zur untersuchung von säugerzellen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur untersuchung von säugerzellen

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EP4652457A1
EP4652457A1 EP23808770.4A EP23808770A EP4652457A1 EP 4652457 A1 EP4652457 A1 EP 4652457A1 EP 23808770 A EP23808770 A EP 23808770A EP 4652457 A1 EP4652457 A1 EP 4652457A1
Authority
EP
European Patent Office
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inlet
diffusion chamber
segment
microfluidic device
mammalian cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23808770.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sonja Kuellmer
Michael Stumber
Bernd SCHEUFELE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4652457A1 publication Critical patent/EP4652457A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
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    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502738—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by integrated valves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
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    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device. Furthermore, the present invention relates to a method for examining mammalian cells in the microfluidic device.
  • Cancer models such as circulating tumor cells, organoid cultures, and patient-derived transplants can be used for personalized cancer therapy and drug development.
  • US 11,098,369 B2 describes a method for determining the viability of tumor cell spheroids in a three-dimensional microfluidic device.
  • the viability determination can be carried out via a total fluorescence measurement.
  • the microfluidic device has a diffusion chamber into which several inlets open. At least one first inlet opens into the diffusion chamber below at least one second inlet. At least one third inlet opens into the diffusion chamber above the second inlet.
  • the three inlets are arranged in particular in such a way that, when the device is used as intended, the second inlet opens into the diffusion chamber higher than the first inlet and the third inlet opens higher than the second inlet and thus the three inlets are preferably arranged vertically one above the other.
  • This microfluidic device can be used in particular to subject cells, preferably mammalian cells, which can originate for example from a 3D culture of tumor mammalian cells, to different analysis steps.
  • subject cells preferably mammalian cells, which can originate for example from a 3D culture of tumor mammalian cells, to different analysis steps.
  • the diffusion chamber is preferably made of at least one material selected from the group consisting of polycarbonates (PC), polymethyl methacrylates (PMMA), cycloolefin copolymers (COC), cycloolefin polymers (COP), polystyrenes (PS) and glass.
  • PC polycarbonates
  • PMMA polymethyl methacrylates
  • COC cycloolefin copolymers
  • COP cycloolefin polymers
  • PS polystyrenes
  • the first inlet is preferably fluidically connected to a cell culture element and in particular to a processing element for isolating and splitting mammalian cells from 3D cell cultures. This makes it possible to introduce mammalian cells from a cell culture, in particular from a 3D cell culture, as a cell suspension into the lower region of the diffusion chamber.
  • the second inlet and the third inlet are each preferably fluidically connected to a reagent reservoir. This makes it possible to overlay the mammalian cells in the diffusion chamber using reagents introduced through the second inlet and/or the third inlet.
  • splitting in the sense of the present invention refers to the dissolution of connections between cells of a cell agglomerate, such as for example, an organoid or spheroid and the resulting dissociation of the cell agglomerate into multicellular cell agglomerate fragments or individual cells.
  • the processing element can be, for example, a chamber or a structure in which separation or splitting takes place.
  • the diffusion chamber preferably has at least one vent opening on its upper side. In this way, when a cell suspension or reagents are introduced, air can be displaced from the diffusion chamber through the vent opening.
  • a filter is particularly preferably arranged in the vent opening in order to prevent impurities from entering the diffusion chamber through the vent opening.
  • the first inlet opens in particular into a first segment of the diffusion chamber
  • the second inlet opens in particular into a second segment of the diffusion chamber
  • the third inlet opens in particular into a third segment of the diffusion chamber.
  • Each segment is intended to be filled with a different fluid.
  • the segments cannot be sections of the diffusion chamber that are separated from one another.
  • it is preferred that a web is arranged between the first segment and the second segment and between the second segment and the third segment.
  • the webs run in particular horizontally and are arranged in particular directly below the second inlet and directly below the third inlet. They enable improved capillary filling of the diffusion chamber and separate the segments from one another.
  • the third segment is divided into several sub-segments by means of at least one partition wall.
  • This partition wall runs vertically in particular.
  • a third inlet opens into each sub-segment. This makes it possible to fill each sub-segment with a reagent.
  • the first inlet has an interruptible fluidic connection line to the second inlet. This makes it possible to inlet and the second inlet to circulate a fluid stored in the diffusion chamber.
  • the method for examining cells, in particular mammalian cells, in the microfluidic device comprises introducing cells, in particular mammalian cells, through the first inlet, in particular in the form of a cell suspension.
  • the cells, in particular mammalian cells are lysed in the diffusion chamber.
  • a microfluidic device is used, the first inlet of which is connected to the second inlet by means of an interruptible fluidic connecting line. Lysing takes place by introducing at least one lysis reagent into the diffusion chamber, in particular through the first inlet.
  • the contents of the diffusion chamber are led out of the diffusion chamber through the first inlet after the lysis reagent has been introduced and are led back into the diffusion chamber through the connecting line and the second inlet.
  • a viability determination of the mammalian cells is to be carried out.
  • reagents for determining the viability are introduced into the diffusion chamber and the viability determination is then carried out.
  • These reagents preferably comprise a fluorophore dye that selectively stains dead cells and/or a fluorophore dye that selectively stains living cells.
  • the fluorophore dye can in particular be conjugated with an antibody, connected to a nanoparticle or bind to free DNA. If two fluorophore dyes are used for living and dead cells, then fluorophores are used for this purpose which emit at different wavelengths. The total fluorescence of both fluorophore dyes can be measured to determine viability. If samples of a cell culture are examined in this way several times in succession, changes in the ratio of fluorescence intensity at the two wavelengths can indicate cultivation progress.
  • the culture medium can be analyzed for metabolites in order to obtain information about the metabolic activity of the mammalian cells.
  • the metabolites can be glucose, lactate and/or lactate dehydrogenase (LDH).
  • this comprises introducing sucrose into the diffusion chamber through the first inlet and mixing the sucrose with the lysed mammalian cells to obtain a lower phase that contains sucrose and nucleic acids, in particular DNA and/or RNA.
  • the introduction of the sucrose can take place before or after the introduction of the mammalian cells.
  • the lysis of the mammalian cells can take place by means of the method according to the first embodiment before the lysate is subsequently mixed with sucrose.
  • CRISPR-Cas reagents are introduced into the diffusion chamber through the third inlet.
  • an upper phase which is particularly free of sucrose, is obtained, which is arranged above the lower phase in the diffusion chamber.
  • This is followed by a diffusion of nucleic acid molecules from the lower phase into the upper phase and an analysis of the nucleic acid molecules using CRISPR-Cas-based diagnostics.
  • This takes advantage of the fact that small nucleic acid fragments diffuse more quickly from the sucrose-containing lower phase into the upper phase than larger molecules. This enables, for example, a quantitative genetic analysis using time-resolved fluorescence detection in a CRISPR-Cas12a system or CRISPR-Cas13 system.
  • the method thus makes it possible to check whether the quality of a cell culture has changed over time in terms of viability and, depending on the genetic marker being examined, for example in terms of cell composition, Expression of tumor markers or mutations changes and this leads to deviations in the native tumor immune microenvironment.
  • This can be done in particular by analyzing cellular nucleic acids for genetic tumor markers or single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the method can also be used for the endpoint analysis of drugs, for efficacy tests or for tests on drug combinations in order to analyze phenotypic and genetic characteristics of the same sample material. Another advantage is that data from model generation is comparable with the endpoint analyses because they are based on the same and automated procedure.
  • the concentration of lysed mammalian cells is high or if a target sequence is present in the lower phase at high frequency, it may be sufficient for the upper phase to rest directly on the lower phase. While the upper phase is sucrose-free, the lower phase in this case preferably contains 10 wt% to 40 wt% sucrose.
  • a sucrose solution containing amplification reagents is preferably introduced into the diffusion chamber through the second inlet before the CRISPR-Cas reagents are introduced.
  • a sucrose concentration in the middle phase is smaller than a sucrose concentration in the lower phase.
  • the sucrose concentration in the lower phase is in the range of 30 wt.% to 40 wt.% and in the middle phase in the range of 10 wt.% to 20 wt.%, while the upper phase is also sucrose-free in this process.
  • the amplification reagents can in particular be reagents for RPA (recombinase polymerase amplification).
  • they also contain a buffer system.
  • the diffusion of the nucleic acid molecules then takes place from the lower phase through the middle phase into the upper phase.
  • the diffusion chamber is preferably tempered to a temperature in the range of 20 °C to 42 °C.
  • the volume of each phase independently of each other is preferably in the range of 10 pl to 30 pl.
  • the volumes are identical.
  • Figure 1 shows schematically a microfluidic device according to an embodiment of the invention.
  • Figure 2 shows a transparent isometric representation of a diffusion chamber of a microfluidic device according to an embodiment of the invention.
  • Figure 3 shows a flow chart of an embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 4 shows a schematic representation of the diffusion chamber of a microfluidic device according to an embodiment of the invention in a step of an embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 5 shows a schematic representation of a diffusion chamber of a device according to an embodiment of the invention in another step of an embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 6 shows a flow chart of another embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 7 shows a schematic representation of a diffusion chamber of an embodiment of the microfluidic device in a step of an embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 8 shows a schematic representation of a diffusion chamber of a microfluidic device according to an embodiment of the invention in another step of an embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 9 shows a schematic representation of a diffusion chamber of a microfluidic device according to an embodiment of the invention in yet another step of a method according to an embodiment of the invention.
  • Figure 10 shows a schematic representation of a diffusion chamber of an embodiment of the microfluidic device in yet another step of a method according to an embodiment of the invention.
  • Figure 11 shows a schematic representation of a diffusion chamber of an embodiment of the microfluidic device in a step of another embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 12 shows a transparent isometric view of a diffusion chamber of a microfluidic device according to another embodiment of the invention.
  • Figure 13 shows a schematic representation of a diffusion chamber according to another embodiment of the invention in a step of the method according to the invention.
  • a microfluidic device 10 according to an embodiment of the invention is shown in Figure 1. It has a heater 11 and a microfluidic chip 12.
  • a cell culture element 13 is arranged on the microfluidic chip 12. arranged, which is designed as a 3D cell culture chamber. This is fluidically connected to a processing element 14, which is set up to carry out cell isolation and splitting processes.
  • An atmosphere control element 15 is connected to the cell culture element 13. It enables the microenvironment in the cell culture element 13 to be monitored by determining the oxygen concentration, the carbon dioxide concentration and the pH value in the cell culture element 13. In addition, the atmosphere control element 15 makes it possible to monitor the viability of the cell culture via its oxygen consumption.
  • An inlet 16 supplies the cell culture element 13 with reagents, media and cells.
  • a microscopic control element 17 monitors the morphology of cells in the cell culture element 13 and in the processing element 14.
  • Cell samples from the cell culture element 13 or the processing element 14 can be fed to an analysis element 20.
  • reagents can be fed to the analysis element 20 from a reagent reservoir 21. Waste products from the analysis element 20 and the processing element 14 can be collected in a waste reservoir 22.
  • Figure 2 shows the structure of the analysis element 20.
  • This has a diffusion chamber 30 which is divided into three segments 31 to 33 arranged one above the other.
  • a first horizontal web 34 is arranged between the lower first segment 31 and the middle second segment 32.
  • a second horizontal web 35 is arranged between the second segment 32 and the upper third segment 33.
  • a first inlet 41 opens into the first segment 31. It is fluidically connected to the cell culture element 13 and to the reagent reservoir 21.
  • a second inlet 42 opens into the second segment 32 immediately above the first web 34.
  • a third inlet 43 opens into the third segment 33 immediately above the second web 35.
  • the second inlet 42 and the third inlet 43 are fluidically connected to different reagent tanks of the reagent reservoir 21.
  • a connecting line 44 connects the first inlet 41 with the second inlet 42.
  • An outlet 45 at the bottom of the first segment 31 is fluidically connected to the waste reservoir 22.
  • Valves not shown are designed to interrupt the connection of the three inlets 41 to 43 and the outlet 45 to the diffusion chamber 30. Further valves not shown are designed to Connecting line 44 is interrupted at both ends.
  • a vent opening 46, which has a filter, is arranged on the top of the diffusion chamber 30.
  • a suspension of cells from the cell culture element 13 or processing element 14 is first introduced 51 through the first inlet 41 into the diffusion chamber 30.
  • the first segment 31 of the diffusion chamber 30 is filled with a liquid phase 60.
  • Reagents for determining viability are then introduced 52 into the diffusion chamber 30 through one of the inlets 41-43.
  • a viability determination 53 is then carried out by means of fluorescence detection. This is possible because the diffusion chamber 30 is formed in a transparent substrate, which in the present embodiment is, for example, polycarbonate.
  • a lysis reagent is now introduced 54 into the diffusion chamber 30 through the second inlet 42 or the third inlet 43.
  • the connections of the first inlet 41 and the second inlet 42 to the diffusion chamber are opened, and the connection of the first inlet 41 to the cell culture element 13 and the connection of the second inlet 42 to the reagent reservoir 21 are closed. Furthermore, the connections of the first inlet 41 and the second inlet 42 to the connecting line 44 are opened.
  • the liquid phase 60 is now circulated 55 by being pumped out of the first segment 31 of the diffusion chamber 30 through the first inlet 41, passed through the connecting line 44 into the second inlet 42 and reintroduced into the second segment 32 of the diffusion chamber 30, from where it flows back into the first segment 31 following gravity. This is shown in Figure 5.
  • all components of the liquid phase 60 are thoroughly mixed with one another, so that the cells contained in the liquid phase 60 can then be lysed 56 in order to release nucleic acids contained therein.
  • a sample of the If required, nucleic acid solution can be removed via outlet 45 for further analysis. The process is then terminated 57.
  • the sequence of a second embodiment of the method according to the invention is shown in Figure 6.
  • cells are introduced 71 from the cell culture element 13 into the first segment 31 of the diffusion chamber 30. These cells are then lysed. The lysing can take place by means of steps 54 to 56 of the first embodiment of the method according to the invention, or another lysing process can also be provided.
  • This is followed by an introduction 72 of sucrose through the first inlet 41 into the diffusion chamber 30, so that a lower phase 61 is obtained which contains, for example, 40% by weight of sucrose.
  • FIG 7. The connection of the first inlet 41 to the diffusion chamber 30 is now closed, and the connection of the second inlet 42 to the diffusion chamber 30 is opened.
  • sucrose and amplification reagents are introduced from the reagent reservoir 21 into the second segment 32 of the diffusion chamber 30 in order to obtain a middle phase 62 there which contains 10 wt.% sucrose 73.
  • CRISPR-Cas reagents are introduced 74 from the reagent reservoir 21 into the third segment 33 of the diffusion chamber 30 through the third inlet 43. This produces an upper phase 63.
  • Figure 9. After closing the connection of the third inlet 43 to the diffusion chamber 30, an analysis 75 of nucleic acid molecules from the lysed cells is carried out using CRISPR-Cas-based diagnostics.
  • a diffusion D of the nucleic acid molecules takes place from the lower phase 61 into the middle phase 62, where they are isothermally amplified, and then further into the upper phase 63, where they can be subjected to fluorescence analysis.
  • the nucleic acid molecules follow the concentration gradient of the sucrose in the three phases 61 to 63.
  • the second embodiment is modified by omitting step 73.
  • the lower phase 61 is generated without prior generation a middle phase 62 is immediately covered with the upper phase 63.
  • a diffusion of nucleic acid molecules from the lower phase 61 into the upper phase 63 takes place without them being amplified.
  • the concentration of nucleic acid molecules in the lower phase is sufficiently high, a sufficiently accurate fluorescence analysis of the nucleic acid molecules in the CRISPR-Cas system can also be carried out in the third embodiment of the method.
  • Figure 12 shows the structure of the analysis element 20 in a second embodiment of the microfluidic device 10.
  • the diffusion chamber 30 differs from the first embodiment in that the third segment 33 is divided into two sub-segments 37, 38 by a horizontal partition wall 36.
  • the diffusion chamber 30 has two vent openings 46, 47 on its upper side, with each of the sub-segments 37, 38 having one of the vent openings 46, 47. While the third inlet 43 opens into the first sub-segment 37, a further third inlet 48 opens into the second sub-segment 38.
  • the second embodiment of the microfluidic device enables a modified implementation of the second embodiment of the method.
  • two different upper phases 63a, 63b are generated by the two third inlets 43, 48 by introducing different CRISPR-Cas systems into the subsegments 37, 38. This makes it possible to examine the lysed cells for different targets at the same time.
  • the entire contents of the diffusion chamber can be drained through the outlet 45 into the waste reservoir 22.
  • the inlets 41 to 43 and optionally 48 as well as the interior of the diffusion chamber 30 can be flushed using a rinsing liquid from the reagent reservoir 21 in order to prepare the analysis element 20 for its next use. In this way, samples can be regularly taken from the cell culture element 13 and examined promptly in the analysis element 20.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung (10), aufweisend eine Diffusionskammer (30), in die mehrere Zuläufe (41-43) münden, wobei mindestens ein erster Zulauf (41) unterhalb von mindestens einem zweiten Zulauf (42) in die Diffusionskammer (30) mündet und mindestens ein dritter Zulauf (43) oberhalb des zweiten Zulaufs (42) in die Diffusionskammer (30) mündet. Ein Verfahren zur Untersuchung von Säugerzellen in der mikrofluidischen Vorrichtung (10) umfasst ein Einleiten von Säugerzellen in die Diffusionskammer durch den ersten Einlass (41) und ein Lysieren der Säugerzellen.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Säugerzellen
Die vorliegende Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung von Säugerzellen in der mikrofluidischen Vorrichtung.
Stand der Technik
Für die personalisierte Krebstherapie und Medikamentenentwicklung können Modelle für Krebserkrankungen, wie beispielsweise zirkulierende Tumorzellen, Organoidkulturen und vom Patienten stammende Transplantate, verwendet werden.
Die US 11 ,098,369 B2 beschreibt ein Verfahren zur Viabilitätsbestimmung von Turmorzell-Sphäroiden in einer dreidimensionalen mikrofluidischen Vorrichtung. Die Viabilitätsbestimmung kann über eine Gesamtfluoreszenzmessung erfolgen.
K. Yin et al., Dynamic aqueous multiphase reaction system for one-pot CRISPR- Cas12a based ultrasensitive and quantitative molecular diagnosis, Analytical Chemistry 2020, Seiten 8561 -8568, beschreibt, wie mittels getrennter Reaktionsabläufe für Zelllyse, DNA-Amplifikation und CRISPR-Cas12a-basierte DNA- Detektion in einem Saccharose-Gradienten eine quantitative genetische Analyse von genomischer DNA mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzdetektion durchgeführt werden kann.
Offenbarung der Erfindung Die mikrofluidische Vorrichtung weist eine Diffusionskammer auf, in die mehrere Zuläufe münden. Mindestens ein erster Zulauf mündet unterhalb von mindestens einem zweiten Zulauf in die Diffusionskammer. Mindestens ein dritter Zulauf mündet oberhalb des zweiten Zulaufs in die Diffusionskammer.
Die drei Zuläufe sind insbesondere derart angeordnet, dass bei bestimmungsgemäßer Benutzung der Vorrichtung der zweite Zulauf höher als der erste Zulauf und der dritte Zulauf höher als der zweite Zulauf in die Diffusionskammer münden und somit die drei Zuläufe vorzugsweise vertikal übereinander angeordnet sind.
Diese mikrofluidische Vorrichtung kann insbesondere verwendet werden, um Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, die beispielsweise aus einer 3D-Kultur von Tumorsäugerzellen stammen können, unterschiedlichen Analyseschritten zu unterwerfen.
Die Diffusionskammer ist vorzugsweise in mindestens einem Material ausgebildet, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Polycarbonaten (PC), Polymethylmetacrylaten (PMMA), Cycloolefincopolymeren (COC), Cycloolefinpolymeren (COP), Polystyrolen (PS) und Glas. Diese Materialien haben den Vorteil, dass sie transparent sind und so eine optische Untersuchung eines Inhalts der Diffusionskammer, insbesondere mittels Fluoreszenzspektroskopie, ermöglichen.
Der erste Zulauf ist vorzugsweise fluidisch mit einem Zellkulturelement und insbesondere mit einem Prozessierungselement zur Vereinzelung und zum Splitting von Säugerzellen aus 3D Zellkulturen verbunden. Auf diese Weise wird es ermöglicht, Säugerzellen aus einer Zellkultur, insbesondere aus einer 3D- Zellkultur, als Zellsuspension in den unteren Bereich der Diffusionskammer einzuleiten. Der zweite Zulauf und der dritte Zulauf sind jeweils vorzugsweise fluidisch mit einem Reagenzreservoir verbunden. Dies ermöglicht es, die Säugerzellen in der Diffusionskammer mittels durch den zweiten Zulauf und/oder den dritten Zulauf eingeleiteter Reagentien zu überschichten.
Unter dem Begriff „Splitting“ wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Auflösung von Verbindungen zwischen Zellen eines Zellagglomerats, wie beispielsweise eines Organoids oder Shäroids und die dadurch entstehende Dissoziation des Zellagglomerats in multizelluläre Zellagglomerat-Fragmente bzw. einzelne Zellen verstanden.
Das Prozessierungselement kann beispielsweise eine Kammer oder eine Struktur sein, in welcher eine Vereinzelung bzw. ein Splitting stattfindet. Die Diffusionskammer weist an ihrer Oberseite vorzugsweise mindestens eine Entlüftungsöffnung auf. Auf diese Weise kann beim Einleiten einer Zellsuspension oder beim Einleiten von Reagentien Luft aus der Diffusionskammer durch die Entlüftungsöffnung verdrängt werden. Besonders bevorzugt ist in der Entlüftungsöffnung ein Filter angeordnet, um ein Eindringen von Verunreinigungen in die Diffusionskammer durch die Entlüftungsöffnung zu verhindern.
Der erste Zulauf mündet insbesondere in ein erstes Segment der Diffusionskammer, der zweite Zulauf mündet insbesondere in ein zweites Segment der Diffusionskammer, und der dritte Zulauf mündet insbesondere in ein drittes Segment der Diffusionskammer. Jedes Segment ist dazu vorgesehen, um mit einem unterschiedlichen Fluid befüllt zu werden. Grundsätzlich können die Segmente nicht voneinander abgegrenzte Abschnitte der Diffusionskammer sein. Es ist jedoch bevorzugt, dass zwischen dem ersten Segment und dem zweiten Segment sowie zwischen dem zweiten Segment und dem dritten Segment jeweils ein Steg angeordnet ist. Die Stege verlaufen insbesondere horizontal und sind insbesondere unmittelbar unterhalb des zweiten Zulaufs und unmittelbar unterhalb des dritten Zulaufs angeordnet. Sie ermöglichen eine verbesserte kapillare Befüllung der Diffusionskammer und grenzen die Segmente gegeneinander ab.
In einer Ausführungsform der mikrofluidischen Vorrichtung ist das dritte Segment mittels mindestens einer Trennwand in mehrere Teilsegmente unterteilt. Diese Trennwand verläuft insbesondere vertikal. In jedes Teilsegment mündet jeweils ein dritter Zulauf. Dadurch wird es ermöglicht, jedes Teilsegment mit einem Reagenz zu befüllen.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass der erste Zulauf eine unterbrechbare fluidische Verbindungsleitung zum zweiten Zulauf aufweist. Dies ermöglicht es, den ersten Zulauf und den zweiten Zulauf zu verwenden, um ein in die Diffusionskammer bevorratetes Fluid umzuwälzen.
Das Verfahren zur Untersuchung von Zellen, insbesondere Säugerzellen in der mikrofluidischen Vorrichtung umfasst ein Einleiten von Zellen, insbesondere Säugerzellen durch den ersten Zulauf, insbesondere in Form einer Zellsuspension. Die Zellen, insbesondere Säugerzellen werden in der Diffusionskammer lysiert.
Grundsätzlich ist es möglich, Mischvorgänge innerhalb der Diffusionskammer, insbesondere zum Vermischen der Säugerzellen mit Lysereagenzien, durchzuführen, indem die Diffusionskammer bei geschlossenen Zuläufen vibriert oder ruckartig gedreht wird. In einer ersten Ausführungsform des Verfahrens ist allerdings vorgesehen, dass eine mikrofluidische Vorrichtung verwendet wird, deren erster Zulauf mittels einer unterbrechbaren fluidischen Verbindungsleitung mit dem zweiten Zulauf verbunden ist. Das Lysieren erfolgt, indem mindestens ein Lysereagenz, insbesondere durch den ersten Zulauf, in die Diffusionskammer eingeleitet wird. Um die Säugerzellen und das Lysereagenz gut zu vermischen und auf diese Weise ein schnelles Lysieren zu erreichen, wird der Inhalt der Diffusionskammer nach dem Einleiten des Lysereagenzes durch den ersten Zulauf aus der Diffusionskammer herausgeleitet und durch die Verbindungsleitung und den zweiten Zulauf wieder in die Diffusionskammer zurückgeleitet.
In dieser Ausführungsform des Verfahrens kann insbesondere vorgesehen sein, dass eine Viabilitätsbestimmung der Säugerzellen durchgeführt werden soll. Hierzu werden nach dem Einleiten der Säugerzellen und vor dem Lysieren durch den ersten Zulauf Reagentien zur Viabilitätsbestimmung in die Diffusionskammer eingeleitet und anschließend die Viabilitätsbestimmung durchgeführt. Diese Reagentien umfassen vorzugsweise einen Fluorophor-Farbstoff, der selektiv tote Zellen färbt, und/oder einen Fluorophor-Farbstoff, der selektiv lebende Zellen färbt. Der Fluorophor-Farbstoff kann insbesondere mit einem Antikörper konjugiert sein, mit einem Nanopartikel verbunden sein oder an freie DNA binden. Wenn zwei Fluorophor-Farbstoffe für lebende und für tote Zellen verwendet werden, dann werden hierzu Fluorophore verwendet, die bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren. Von beiden Fluorophor-Farbstoffen kann die Gesamtfluoreszenz gemessen werden, um die Viabilität zu bestimmen. Wenn mehrfach nacheinander Proben einer Zellkultur auf diese Weise untersucht werden, können Veränderungen des Verhältnisses der Fluoreszenzintensität bei den beiden Wellenlängen einen Kultivierungsfortschritt anzeigen.
Zusätzlich zu der Viabilitätsbestimmung der Säugerzellen kann insbesondere eine Analyse des Kulturmediums auf Stoffwechselprodukte erfolgen, um Informationen über die metabolische Aktivität der Säugerzellen zu erhalten. Bei den Stoffwechselprodukten kann es sich insbesondere um Glukose, Laktat und/oder Laktat-Dehydrogenase (LDH) handeln.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens umfasst dieses ein Einleiten von Saccharose in die Diffusionskammer durch den ersten Zulauf und ein Mischen der Saccharose mit den lysierten Säugerzellen, um eine untere Phase zu erhalten, die Saccharose und Nukleinsäuren, insbesondere DNA und/oder RNA, enthält. Dabei kann das Einleiten der Saccharose vor oder nach dem Einleiten der Säugerzellen erfolgen. Insbesondere kann das Lysieren der Säugerzellen mittels des Verfahrens gemäß der ersten Ausführungsform erfolgen, bevor das Lysat anschließend mit Saccharose versetzt wird.
Durch den dritten Zulauf werden CRISPR-Cas-Reagentien in die Diffusionskammer eingeleitet. Auf diese Weise wird eine, insbesondere saccharosefreie, obere Phase erhalten, die oberhalb der unteren Phase in der Diffusionskammer angeordnet ist. Es folgt eine Diffusion von Nukleinsäuremolekülen von der unteren Phase in die obere Phase und eine Analyse der Nukleinsäuremoleküle mittels CRISPR-Cas-basierter Diagnostik. Hierbei wird ausgenutzt, dass kleine Nukleinsäurefragmente schneller von der saccharosehaltigen unteren Phase in die obere Phase diffundieren als größere Moleküle. Hierdurch ist beispielsweise eine quantitative genetische Analyse mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzdetektion in einem CRISPR-Cas12a-System oder CRISPR-Cas13-System möglich. Hierdurch ermöglicht das Verfahren eine Überprüfung, ob sich die Qualität einer Zellkultur über die Zeit hinsichtlich Viabilität und je nach untersuchtem genetischem Marker beispielsweise hinsichtlich Zellzusammensetzung, Expression von Tumormarkern oder Mutationen ändert und es damit zu Abweichungen des nativen Tumor Immun-Mikroenvironments kommt Dazu kann insbesondere eine Analyse von zellulären Nukleinsäuren auf genetische Tumormarker oder Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) erfolgen. Diese Informationen ermöglichen eine zeitnahe Anpassung eines Tumormodells. Das Verfahren kann neben der Qualitätskontrolle ebenfalls für die Endpunkt-Analyse von Medikamenten, für Wirksamkeitstests oder für Tests zu Wirkstoffkombinationen eingesetzt werden, um phänotypische und genetische Merkmale vom gleichen Probenmaterial zu analysieren. Ein weiterer Vorteil ist, dass Daten aus der Modellgenerierung mit den Endpunkt-Analysen vergleichbar sind, da sie auf dem gleichen und automatisierten Verfahren basieren.
Bei einer hohen Konzentration der lysierten Säugerzellen oder einer großen Häufigkeit einer Target-Sequenz in der unteren Phase kann es ausreichen, dass die obere Phase unmittelbar auf der unteren Phase ruht. Während die obere Phase saccharosefrei ist, enthält die untere Phase in diesem Fall vorzugsweise 10 Gew.-% bis 40 Gew.-% Saccharose.
Ist es hingegen erforderlich, die Nukleinsäurekonzentration für eine zuverlässige Analyse der Nukleinsäuremoleküle zu erhöhen, so wird vorzugsweise vor dem Einleiten der CRISPR-Cas-Reagentien eine Saccharose-Lösung durch den zweiten Zulauf in die Diffusionskammer eingeleitet, welche Amplifikationsreagentien enthält. Dadurch wird eine mittlere Phase erhalten, die zwischen der unteren Phase und der oberen Phase angeordnet ist. Eine Saccharose- Konzentration der mittleren Phase ist kleiner als eine Saccharose- Konzentration der unteren Phase. Insbesondere liegt die Saccharose- Konzentration in der unteren Phase im Bereich von 30 Gew.-% bis 40 Gew.-% und in der mittleren Phase im Bereich von 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, während die obere Phase auch bei dieser Verfahrensführung saccharosefrei ist. Die Amplifikationsreagentien können insbesondere Reagentien für eine RPA (recombinase polymerase amplification) sein. Dabei beinhalten sie insbesondere auch ein Puffersystem. Die Diffusion der Nukleinsäuremoleküle erfolgt dann von der unteren Phase durch die mittlere Phase in die obere Phase. Für eine insbesondere isothermale Amplifikation der Nukleinsäuremoleküle in der mittleren Phase erfolgt vorzugsweise eine Temperierung der Diffusionskammer auf eine Temperatur im Bereich von 20 °C bis 42 °C.
Zur Realisierung des Verfahrens in der mikrofluidischen Vorrichtung liegt das Volumen jeder Phase unabhängig voneinander vorzugsweise im Bereich von 10 pl bis 30 pl. Insbesondere sind die Volumina identisch.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
Figur 1 zeigt schematisch eine mikrofluidische Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Figur 2 zeigt eine transparente isometrische Darstellung einer Diffusionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Figur 3 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung der Diffusionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einem Schritt eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer einer Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einem anderen Schritt eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 6 zeigt ein Ablaufdiagramm eines anderen Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Figur 7 zeigt eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer eines Ausführungsbeispiels der mikrofluidischen Vorrichtung in einem Schritt eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 8 zeigt eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einem anderen Schritt eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 9 zeigt eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in noch einem anderen Schritt eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Figur 10 zeigt eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer eines Ausführungsbeispiels der mikrofluidischen Vorrichtung in noch einem anderen Schritt eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Figur 11 zeigt eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer eines Ausführungsbeispiels der mikrofluidischen Vorrichtung in einem Schritt eines anderen Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 12 zeigt eine transparente isometrische Darstellung einer Diffusionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Figur 13 zeigt eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung in einem Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsbeispiele der Erfindung
Eine mikrofluidische Vorrichtung 10 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in Figur 1 dargestellt. Sie weist einen Heizer 11 und einen Mikro- fluidik-Chip 12 auf. Auf dem Mikrofluidik-Chip 12 ist ein Zellkulturelement 13 angeordnet, das als 3D-Zellkultur-Kammer ausgeführt ist. Dieses ist fluidisch mit einem Prozessierungselement 14 verbunden, das eingerichtet ist, um Zellvereinzelungs- und Splittingprozesse durchzuführen. Ein Atmosphärekontrollelement 15 ist mit dem Zellkulturelement 13 verbunden. Es ermöglicht, über die Ermittlung der Sauerstoffkonzentration, der Kohlendioxidkonzentration und des pH-Werts im Zellkulturelement 13 die Mikroumgebung in diesem zu überwachen. Außerdem ermöglicht es das Atmosphärekontrollelement 15, die Viabilität der Zellkultur über deren Sauerstoffverbrauch zu überwachen. Ein Zulauf 16 versorgt das Zellkulturelement 13 mit Reagentien, Medien und Zellen. Ein mikroskopisches Kontrollelement 17 überwacht die Morphologie von Zellen im Zellkulturelement 13 und im Prozessierungselement 14. Einem Analyseelement 20 können Zellproben aus dem Zellkulturelement 13 oder dem Prozessierungselement 14 zugeführt werden. Weiterhin können aus einem Reagenzreservoir 21 dem Analyseelement 20 Reagentien zugeführt werden. Abfallprodukte aus dem Analyseelement 20 und dem Prozessierungselement 14 können in einem Abfallreservoir 22 gesammelt werden.
Figur 2 zeigt den Aufbau des Analyseelements 20. Dieses weist eine Diffusionskammer 30 auf, die sich in drei übereinander angeordnete Segmente 31 bis 33 unterteilt. Zwischen dem unteren ersten Segment 31 und dem mittleren zweiten Segment 32 ist ein erster horizontaler Steg 34 angeordnet. Zwischen dem zweiten Segment 32 und dem oberen dritten Segment 33 ist ein zweiter horizontaler Steg 35 angeordnet. Ein erster Zulauf 41 mündet in das erste Segment 31. Er ist fluidisch mit dem Zellkulturelement 13 und mit dem Reagenzreservoir 21 verbunden. Ein zweiter Zulauf 42 mündet unmittelbar oberhalb des ersten Steges 34 in das zweite Segment 32. Ein dritter Zulauf 43 mündet unmittelbar oberhalb des zweiten Steges 35 in das dritte Segment 33. Der zweite Zulauf 42 und der dritte Zulauf 43 sind fluidisch mit unterschiedlichen Reagentientanks des Reagenzreservoirs 21 verbunden. Eine Verbindungsleitung 44 verbindet den ersten Zulauf 41 mit dem zweiten Zulauf 42. Ein Ablauf 45 am Boden des ersten Segments 31 ist fluidisch mit dem Abfallreservoir 22 verbunden. Nicht dargestellte Ventile sind dazu eingerichtet, um die Verbindung der drei Zuläufe 41 bis 43 und des Ablaufes 45 zur Diffusionskammer 30 zu unterbrechen. Weitere nicht dargestellte Ventile sind dazu eingerichtet, um die Verbindungsleitung 44 an ihren beiden Enden zu unterbrechen. An der Oberseite der Diffusionskammer 30 ist eine Entlüftungsöffnung 46 angeordnet, welche einen Filter aufweist.
Der Ablauf eines ersten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Figur 3 dargestellt. Nach dem Start 50 des Verfahrens erfolgt zunächst ein Einleiten 51 einer Suspension von Zellen aus dem Zellkulturelement 13 oder Prozessierungselement 14 durch den ersten Zulauf 41 in die Diffusionskammer 30. Wie in Figur 4 dargestellt ist, wird das erste Segment 31 der Diffusionskammer 30 dabei mit einer Flüssigkeitsphase 60 befüllt. Mit Ausnahme des Ventils, welches die fluidische Verbindung des Zulaufs 41 zur Diffusionskammer 30 öffnet, sind alle weiteren Ventile geschlossen. Nun folgt ein Einleiten 52 von Reagentien zur Viabilitätsbestimmung in die Diffusionskammer 30 durch einen der Zuläufe 41 -43. Anschließend wird eine Viabilitätsbestimmung 53 mittels Fluoreszenzdetektion durchgeführt. Dies ist möglich, da die Diffusionskammer 30 in einem transparenten Substrat ausgebildet ist, bei dem es sich im vorliegenden Ausführungsbeispiel beispielsweise um Polycarbonat handelt. Durch den zweiten Zulauf 42 oder den dritten Zulauf 43 wird nun ein Lysereagenz in die Diffusionskammer 30 eingeleitet 54. Zum Vermischen der Flüssigkeitsphase 60 mit dem frisch eingeleiteten Lysereagenz werden die Verbindungen des ersten Zulaufs 41 und des zweiten Zulaufs 42 zur Diffusionskammer geöffnet, und die Verbindung des ersten Zulaufs 41 zum Zellkulturelement 13 und die Verbindung des zweiten Zulaufs 42 zum Reagenzreservoir 21 werden geschlossen. Weiterhin werden die Verbindungen des ersten Zulaufs 41 und des zweiten Zulaufs 42 zur Verbindungsleitung 44 geöffnet. Die Flüssigkeitsphase 60 wird nun umgewälzt 55, indem sie durch den ersten Zulauf 41 aus dem ersten Segment 31 der Diffusionskammer 30 herausgepumpt, durch die Verbindungsleitung 44 in den zweiten Zulauf 42 geleitet und in das zweite Segment 32 der Diffusionskammer 30 wieder eingeleitet wird, von wo sie der Schwerkraft folgend in das erste Segment 31 zurückströmt. Dies ist in Figur 5 dargestellt. Durch diese Umwälzung werden alle Bestandteile der Flüssigkeitsphase 60 gründlich miteinander vermischt, so dass anschließend ein Lysieren 56 der in der Flüssigkeitsphase 60 enthaltenen Zellen erfolgen kann, um darin enthaltene Nukleinsäuren freizusetzen. Eine Probe der Nukleinsäure-Lösung kann bei Bedarf über den Ablauf 45 für weitere Analysen entnommen werden. Anschließend erfolgt ein Beenden 57 des Verfahrens.
Der Ablauf eines zweiten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Figur 6 dargestellt. Nach dem Start 70 des Verfahrens erfolgt ein Einleiten 71 von Zellen aus dem Zellkulturelement 13 in das erste Segment 31 der Diffusionskammer 30. Diese Zellen werden anschließend lysiert. Das Lysieren kann mittels der Schritte 54 bis 56 des ersten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen, oder es kann auch ein anderer Lysierungsprozess vorgesehen sein. Anschließend folgt ein Einleiten 72 von Saccharose durch den ersten Zulauf 41 in die Diffusionskammer 30, so dass eine untere Phase 61 erhalten wird, welche beispielsweise 40 Gew.-% Saccharose enthält. Dies ist in Figur 7 dargestellt. Die Verbindung des ersten Zulaufs 41 zur Diffusionskammer 30 wird nun geschlossen, und die Verbindung des zweiten Zulaufs 42 zur Diffusionskammer 30 wird geöffnet. Durch diesen werden aus dem Reagenzreservoir 21 Saccharose und Amplifikationsreagentien in das zweite Segment 32 der Diffusionskammer 30 eingeleitet, um dort eine mittlere Phase 62 zu erhalten, die 10 Gew.-% Saccharose enthält 73. Dies ist in Figur 8 dargestellt. Nach dem Schließen der Verbindung des zweiten Zulaufs 42 zur Diffusionskammer 30 und dem Öffnen der Verbindung des dritten Zulaufs 43 zur Diffusionskammer 30 werden durch den dritten Zulauf 43 aus dem Reagenzreservoir 21 CRISPR-Cas-Reagentien in das dritte Segment 33 der Diffusionskammer 30 eingeleitet 74. Dadurch wird eine obere Phase 63 erhalten. Dies ist in Figur 9 dargestellt. Nach dem Schließen der Verbindung des dritten Zulaufs 43 zur Diffusionskammer 30 erfolgt eine Analyse 75 von Nukleinsäuremolekülen aus den lysierten Zellen mittels CRISPR-Cas-basierter Diagnostik. Hierbei erfolgt eine Diffusion D der Nukleinsäuremoleküle aus der unteren Phase 61 in die mittlere Phase 62, wo sie isothermal amplifiziert werden, und dann weiter in die obere Phase 63, wo sie einer Fluoreszenzanalyse unterzogen werden können. Dabei folgen die Nukleinsäuremoleküle dem Konzentrationsgradienten der Saccharose in den drei Phasen 61 bis 63.
In einem dritten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zweite Ausführungsbeispiel durch Verzicht auf den Schritt 73 modifiziert. Wie in Figur 11 dargestellt ist, wird die untere Phase 61 ohne vorheriges Erzeugen einer mittleren Phase 62 sofort mit der oberen Phase 63 überschichtet. Es erfolgt eine Diffusion von Nukleinsäuremolekülen aus der unteren Phase 61 in die obere Phase 63, ohne dass diese dabei amplifiziert werden. Bei ausreichend hoher Konzentration der Nukleinsäuremoleküle in der unteren Phase kann allerdings auch im dritten Ausführungsbeispiel des Verfahrens eine ausreichend genaue Fluoreszenzanalyse der Nukleinsäuremoleküle im CRISPR-Cas-System erfolgen.
Figur 12 zeigt den Aufbau des Analyseelements 20 in einem zweiten Ausführungsbeispiel der mikrofluidischen Vorrichtung 10. Die Diffusionskammer 30 unterscheidet sich dabei vom ersten Ausführungsbeispiel darin, dass das dritte Segment 33 durch eine horizontale Trennwand 36 in zwei Teilsegmente 37, 38 unterteilt ist. Die Diffusionskammer 30 verfügt über zwei Entlüftungsöffnungen 46, 47 an ihrer Oberseite, wobei jedes der Teilsegmente 37, 38 eine der Entlüftungsöffnungen 46, 47 aufweist. Während der dritte Zulauf 43 im ersten Teilsegment 37 mündet, mündet ein weiterer dritter Zulauf 48 im zweiten Teilsegment 38. Das zweite Ausführungsbeispiel der mikrofluidischen Vorrichtung ermöglicht eine modifizierte Durchführung des zweiten Ausführungsbeispiels des Verfahrens. Wie in Figur 13 dargestellt ist, werden durch die beiden dritten Zuläufe 43, 48 zwei unterschiedliche obere Phasen 63a, 63b erzeugt, indem unterschiedliche CRISPR-Cas-Systeme in die Teilsegmente 37, 38 eingeleitet werden. Hierdurch ist es möglich, die lysierten Zellen gleichzeitig auf unterschiedliche Targets zu untersuchen.
In allen Ausführungsbeispielen der mikrofluidischen Vorrichtung 10 und in allen Ausführungsbeispielen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach Abschluss einer Analyse der gesamte Inhalt der Diffusionskammer durch den Auslass 45 in das Abfallreservoir 22 abgeleitet werden. Die Zuläufe 41 bis 43 und gegebenenfalls 48 sowie der Innenraum der Diffusionskammer 30 können mittels einer Spülflüssigkeit aus dem Reagenzreservoir 21 durchgespült werden, um das Analyseelement 20 für seinen nächsten Einsatz bereitzumachen. Auf diese Weise können dem Zellkulturelement 13 regelmäßig Proben entnommen und im Analyseelement 20 zeitnah untersucht werden.

Claims

Ansprüche
1 . Mikrofluidische Vorrichtung (10), aufweisend eine Diffusionskammer (30), in die mehrere Zuläufe (41 -43, 48) münden, wobei mindestens ein erster Zulauf (41) unterhalb von mindestens einem zweiten Zulauf (42) in die Diffusionskammer (30) mündet und mindestens ein dritter Zulauf (43, 48) oberhalb des zweiten Zulaufs (42) in die Diffusionskammer (30) mündet.
2. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der erste Zulauf (41) fluidisch mit einem Zellkulturelement (13) und insbesondere mit einem Prozessierungselement (14) zur Vereinzelung und zum Splitting von Säugerzellen verbunden ist und der zweite Zulauf (42) und der dritte Zulauf (43, 48) jeweils fluidisch mit einem Reagenzreservoir (21) verbunden sind.
3. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Diffusionskammer (30) an ihrer Oberseite mindestens eine Entlüftungsöffnung (46, 47) aufweist.
4. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Zulauf (41) in ein erstes Segment (31) der Diffusionskammer (30) mündet, der zweite Zulauf (42) in ein zweites Segment (32) der Diffusionskammer (30) mündet und der dritte Zulauf (43, 48) in ein drittes Segment (43) der Diffusionskammer (30) mündet.
5. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem ersten Segment (31) und dem zweiten Segment (32) sowie zwischen dem zweiten Segment (32) und dem dritten Segment (33) jeweils ein Steg (34, 35) angeordnet ist.
6. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Segment (33) mittels mindestens einer Trennwand (36) in mehrere Teilsegmente (37, 38) unterteilt ist, wobei jeweils ein dritter Zulauf (43, 48) in jedes Teilsegment (37, 38) mündet.
7. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Zulauf (41) eine unterbrechbare fluidische Verbindungsleitung (44) zum zweiten Zulauf (42) aufweist.
8. Verfahren zur Untersuchung von Säugerzellen in einer mikrofluidischen Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend ein Einleiten (51 , 71) von Säugerzellen in die Diffusionskammer durch den ersten Einlass (41) und ein Lysieren (56) der Säugerzellen.
9. Verfahren nach Anspruch 8 unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung (10) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Lysieren erfolgt, indem mindestens ein Lysereagenz in die Diffusionkammer (30) eingeleitet wird (54), und der Inhalt der Diffusionskammer (30) durch den ersten Zulauf (41) aus der Diffusionskammer (30) herausgeleitet wird und durch die Verbindungsleitung (44) und den zweiten Zulauf (42) wieder in die Diffusionskammer (30) zurückgeleitet wird (55).
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Einleiten (51) der Säugerzellen und vor dem Lysieren durch den ersten Einlass (41) Reagenzien zur Viabilitätsbestimmung in die Diffusionskammer (30) eingeleitet werden (52) und anschließend eine Viabilitätsbestimmung durchgeführt wird (53).
11 . Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, weiterhin umfassend die folgenden Schritte:
Einleiten (72) von Saccharose in die Diffusionskammer (30) durch den ersten Einlass (41),
Mischen der Saccharose mit den lysierten Säugerzellen, um eine untere Phase (61) zu erhalten, die Saccharose und Nukleinsäuren enthält,
Einleiten (74) von CRISPR-Cas-Reagentien in die Diffusionskammer (30) durch den dritten Zulauf (43), um eine obere Phase (63) zu erhalten, Diffusion (D) von Nukleinsäuremolekülen von der unteren Phase (61) in die obere Phase (63), und
Analyse (75) der Nukleinsäuremoleküle mittels CRISPR-Cas-basierter Diagnostik.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Einleiten (73) der CRISPR-Cas-Reagentien eine Saccharose-Lösung, welche Amplifikationsreagentien enthält, durch den zweiten Zulauf (42) in die Diffusionskammer (30) eingeleitet wird (74), um eine mittlere Phase (62) zu erhalten, wobei eine Saccharose- Konzentration der mittleren Phase kleiner ist als eine Saccharose- Konzentration in der unteren Phase.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Volumen jeder Phase jeweils im Bereich von 10 pl bis 30 pl liegt.
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