EP4634362A1 - Vorrichtung und verfahren zum splitten dreidimensionaler agglomerate - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zum splitten dreidimensionaler agglomerate

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Publication number
EP4634362A1
EP4634362A1 EP23804644.5A EP23804644A EP4634362A1 EP 4634362 A1 EP4634362 A1 EP 4634362A1 EP 23804644 A EP23804644 A EP 23804644A EP 4634362 A1 EP4634362 A1 EP 4634362A1
Authority
EP
European Patent Office
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chamber
fluidic connection
microfluidic device
splitting
agglomerates
Prior art date
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Pending
Application number
EP23804644.5A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd SCHEUFELE
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Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4634362A1 publication Critical patent/EP4634362A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
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    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads or physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M23/22—Transparent or translucent parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device, a method for operating the same and a control unit and a cartridge comprising the microfluidic device, according to the preamble of the independent claims.
  • three-dimensional agglomerates such as organoids or spheroids
  • diagnosis and treatment of diseases such as tumors has increased significantly in recent years, as such three-dimensional agglomerates can, for example, represent organ-specific properties well. They are typically handled manually using tools such as pipettes, reaction vessels and laboratory equipment.
  • microfluidics offers advantages over conventional laboratory tests, such as smaller sample volumes and reagents required, shorter analysis times and parallel processes.
  • So-called lab-on-a-chip systems, or LoC systems for short, are microfluidic systems that accommodate the functionalities of a macroscopic laboratory on a plastic substrate for automated processing. Such Systems make it possible to process biochemical processes largely or completely automatically.
  • Lab-on-a-chip systems typically comprise two main components.
  • the first is a test carrier, for example in the form of a cartridge, which comprises structures and mechanisms for manipulating a sample, in particular passive components such as channels, reaction chambers or upstream reagents or active components such as valves, pumps or mixers.
  • the second main component is a control unit for controlling the microfluidic processes in the cartridge.
  • US 2019/0329247 A1 describes a microfluidic chip.
  • Cells or cell structures are to be guided from a chamber into a predetermined region in order to prevent the cells or cell structures from arranging themselves on the sides of the chamber.
  • a vortex flow of liquid By means of a vortex flow of liquid, the cells or cell structures are swirled into the middle of the chamber and thus into the predetermined region.
  • US 8277110 B2 discloses a "micromixer biochip" that mixes substances using an active vortex flow. For this purpose, it has a mixing chamber and a fluid channel that is connected to the mixing chamber at one end. Since the axis of the fluid channel does not pass through the center of the mixing chamber, the moving liquid forms a vortex flow that causes the mixing effect.
  • tumor organoids and spheroids are used to research tumor diseases. These enable a very good reproduction of various diseased tissue conditions, which is why they are suitable for drug tests to evaluate the effectiveness and dosage of drugs.
  • a personalized drug-based cancer therapy can then be selected for each patient, for example, which takes individual characteristics into account and thus optimizes the efficiency of the therapy.
  • One way to produce tumor organoids is to remove individual cells or tissue fragments from the primary tumor of a cancer patient and then cultivate them. This involves differentiation and proliferation of these cells or tissue fragments, which ultimately self-organize into three-dimensional structures.
  • the resulting tumor organoids are therefore three-dimensional cell agglomerates that have a similar composition and architecture to the patient's primary tumor tissue. For example, they have a diameter of 100 - 750 pm.
  • Spheroids are three-dimensional cell agglomerates that can be generated by aggregation and organization of several thousand cells, for example with a diameter of 100 - 750 pm. Compared to organoids, spheroids are less complex and usually have only one type of cells.
  • the main process steps here are the cultivation of organoids or spheroids and their subsequent expansion.
  • the organoids or spheroids are split enzymatically and/or mechanically into organoid or spheroid fragments consisting of a few tens of cells and into individual organoid cells or spheroid cells.
  • the split organoid or spheroid fragments and cells are then re-seeded. In this way, the organoids or spheroids are multiplied.
  • the term "splitting" is understood to mean the dissolution of connections between individual structures of a three-dimensional agglomerate and the resulting dissociation of the three-dimensional agglomerate into agglomerate fragments and/or individual structures.
  • the term three-dimensional agglomerates is understood to mean, for example, cell agglomerates such as organoids or spheroids.
  • splitting for example, connections between cells of a cell agglomerate are dissolved, resulting in the dissociation of the cell agglomerate into multicellular cell agglomerate fragments or individual cells.
  • the splitting of three-dimensional agglomerates, such as organoids and spheroids, is carried out enzymatically by adding an enzyme solution, for example trypsin or TrypLETM Express Enzyme (Thermofisher) and/or mechanically by manually pipetting the suspension up and down.
  • the splitting must be monitored microscopically by experienced specialists in order to determine the degree of dissociation and then to stop the splitting at the right time.
  • the choice of the appropriate time and degree of dissociation to stop is crucial, since for certain types of organoids, splitting down to individual cells impairs the ability to form new organoids.
  • the dissociation of the organoids influences the subsequent organoid formation and the ultimately resulting organoid properties.
  • a buffer solution is first added to greatly dilute the enzyme solution. Centrifugation then takes place so that a pellet of fragments or cells is formed, and the supernatant is aspirated and discarded. The supernatant must be removed carefully so as not to damage the pellet and to avoid inadvertently losing any fragments or cells.
  • the fragments or cells resulting from dissociation are, for example, resuspended in an extracellular matrix and 3D cultivation steps are carried out again for the organoid expansion, which can be repeated several times.
  • the multi-stage splitting process includes, for example, repeatedly adding and removing different liquids, carrying out centrifugations and washing processes, and dissociating the organoids by pipetting up and down.
  • the first fluidic connection is arranged on a first side surface of the chamber and the second fluidic connection is arranged on a third side surface of the chamber, in particular opposite to the first fluidic connection. This is based in particular on the fact that the cross section of the chamber is 2 to 20 times larger than the cross section of the first fluidic connection, so that vortex flows can be generated.
  • the advantage here is that the vortex flows in the chamber are generated and used to distribute or mix the introduced three-dimensional agglomerates and liquids and to generate adjustable fluid-mechanical shear forces that act on the three-dimensional agglomerates, agglomerate fragments and individual structures and cause the agglomerates and agglomerate fragments to dissociate.
  • these mechanical shear forces are precisely defined and can be suitably adjusted in terms of size and duration and are therefore reproducible.
  • the key reason for the formation of vortex flows lies in the significant and abrupt change in cross-section from the first fluidic connection to the much larger chamber.
  • the shape and strength of the vortex flows that can be generated can be designed and adjusted advantageously by the geometric configuration of the fluidic connections and the chamber as well as by the flow rate of the liquid conveyed by a pump unit.
  • Another advantage is that the work steps for splitting three-dimensional cell agglomerates can be carried out automatically using the microfluidic device. This saves a lot of time by eliminating manual work steps, shortening analysis times and parallel processes. Furthermore, these work steps can therefore not only be carried out by trained and experienced specialists, which relieves their workload.
  • the cross-section of the fluid connections is, for example, rectangular or square, whereby the corners can be rounded.
  • the cross-section of the fluid connections is, for example, round or oval.
  • first fluidic connection has dimensions of 100 - 750 pm so that three-dimensional agglomerates can pass through it and if the second fluidic connection has dimensions of 25 - 150 pm so that only split individual structures and/or agglomerate fragments can pass through it, but not three-dimensional agglomerates in unsplit form.
  • the dimensions of the first and second fluidic connections can be adapted to the respective requirements or sizes of the three-dimensional agglomerates used.
  • the chamber also comprises a third and a fourth fluidic connection, in particular one opposite the third.
  • the cross-section of the chamber is 2 to 20 times larger than the cross-section of the third and fourth fluidic connections, so that vortex flows can be generated.
  • the advantage here is that liquids and media can also be introduced into the chamber via the third and fourth fluidic connections, whereby the microfluidic device can be used with great flexibility.
  • Another advantage is that further vortex flows are generated in the chamber, by means of which the liquids and components are distributed or mixed in the chamber.
  • the vortex flows generate defined, adjustable fluid-mechanical shear forces, which act on the three-dimensional agglomerates, agglomerate fragments and individual structures in the chamber and further promote and support the dissociation of the agglomerates and agglomerate fragments. These mechanical shear forces are precisely defined and can be suitably adjusted in terms of size and duration and are therefore reproducible.
  • the third and fourth fluidic connections have an integrated retaining element and/or dimensions of 5 - 75 pm.
  • the advantage here is that three-dimensional agglomerates, agglomerate fragments or individual structures cannot pass through them. This ensures that the three-dimensional agglomerates, agglomerate fragments or individual structures cannot leave the chamber via the third and fourth fluidic connections when media and liquids are introduced, removed and moved back and forth. This enables media and liquids to be introduced and removed and moved back and forth easily and without loss.
  • the integrated retaining element is designed, for example, as a micro sieve, micro filter and/or microstructured grid with pores. If the third and fourth fluidic connections are equipped with such a device, these connections can have larger dimensions, which advantageously enables higher flow rates.
  • the third fluidic connection is arranged on a second side surface (5b) lying transversely to the first and third side surfaces of the chamber, and the fourth fluidic connection is arranged on a fourth side surface of the chamber opposite the second side surface (5b).
  • the advantage here is that advantageous flow conditions are created.
  • the medium with the three-dimensional agglomerates or the enzyme solution can then be moved back and forth between the first and second fluidic connection and the third and fourth fluidic connection. Vortex flows are generated throughout the chamber and disadvantageous flow-free areas in the chamber are prevented or minimized in which liquids, three-dimensional agglomerates, agglomerate fragments or individual structures accumulate. This improves the efficiency of the splitting process.
  • the chamber has a rectangular shape, in particular with a length and a width of 2 - 15 mm and a height of 0.75 - 2 mm.
  • the microfluidic device comprises two or more microfluidic chambers, which are used simultaneously, for example.
  • the advantage here is that the throughput of the splitting process is increased and thus shorter overall process times can be achieved.
  • microfluidic chamber and the fluidic connections have a significantly smaller volume compared to conventional laboratory vessels. Significantly smaller volumes of liquid are required and consumed for the process of splitting the three-dimensional agglomerates. In addition, the exchange of liquids takes less time, so that the process times are reduced.
  • the number and position of the fluidic connections can be designed differently, such as offset connections or more connections to improve the formation of vortex flows.
  • the first fluidic connection is arranged opposite the second fluidic connection, for example, in particular on opposite chamber walls of the microfluidic device.
  • the first and second fluidic connections can be arranged offset from one another on opposite chamber walls of the microfluidic device.
  • At least one side surface of the chamber is at least partially transparent.
  • This can in particular comprise a transparent polymer such as a cycloolefin copolymer (COC), a polycarbonate (PC), a polymethyl methacrylate (PMMA), a polystyrene (PS) or a glass.
  • a transparent polymer such as a cycloolefin copolymer (COC), a polycarbonate (PC), a polymethyl methacrylate (PMMA), a polystyrene (PS) or a glass.
  • the advantage here is that the degree of dissociation of the three-dimensional agglomerates and agglomerate fragments can be determined and monitored before, during and after splitting through the optically accessible chamber.
  • the microfluidic device comprises a control unit.
  • the control unit is in particular a microscopic unit which is arranged on or near the at least partially transparent side surface of the chamber.
  • the three-dimensional agglomerates, agglomerate fragments and individual structures are monitored by means of the control unit. This eliminates the need for microscopic observation and control by experienced specialist personnel in order to determine the changing degree of dissociation and to stop the splitting process at an appropriate time, which relieves the burden on them.
  • the microfluidic device comprises at least one reservoir for a fluid.
  • fluids such as media, rinsing liquids, enzyme solutions or dye solutions can be stored in the reservoir. This ensures that these fluids can be supplied quickly and easily.
  • the microfluidic device comprises a reservoir with an enzyme solution stored upstream for splitting.
  • the enzyme solution comprises in particular trypsin or TrypLETM Express Enzyme, wherein the reservoir is in fluidic connection with the third (3) and/or fourth fluidic connection (4).
  • At least one of the fluidic connections of the microfluidic device comprises a pump unit or is connected to such a pump unit.
  • the pump unit is, for example, a peristaltic, membrane or syringe pump, in particular an electrically controllable one.
  • the microfluidic device comprises at least one valve, which can be controlled electrically in particular, so that the microfluidic device can be operated electrically.
  • at least one fluidic connection and/or at least one reservoir for fluids can be individually closed and opened by means of one or more valves, so that the flow through the microfluidic device can be individually determined. In this way, various options for the supply and removal of media as well as the flow through the chamber can be easily implemented.
  • the microfluidic device has a heating device for controlling the temperature of the chamber.
  • a heating device is understood to be a device that can heat and/or cool the chamber.
  • the advantage here is that an optimal temperature can be provided for splitting the three-dimensional agglomerates.
  • the optimal temperature for splitting depends, among other things, on the cultivation of the three-dimensional agglomerates.
  • organoids in Matrigel® (Corning)
  • the enzymatic splitting can be further improved by setting an optimal active temperature of the enzyme.
  • the enzyme trypsin or TrypLETM Express Enzyme (Thermofisher) is used, for example, whose optimal operating temperature is 37° Celsius.
  • the microfluidic device comprises a device for generating and introducing ultrasound and/or a device for generating and introducing a vibration into the chamber of the microfluidic device
  • the advantage of introducing ultrasound and/or vibration is that the ultrasonic waves and/or vibrations act on the three-dimensional agglomerates in the chamber and support and improve the splitting.
  • the invention further relates to a microfluidic method for mechanically splitting, in particular to support enzymatic splitting, three-dimensional agglomerates into individual structures and/or agglomerate fragments by means of a microfluidic device with the following steps: a) feeding a first medium with three-dimensional agglomerates into the chamber of the microfluidic device via the first fluidic connection, whereby vortex flows are generated when the first medium passes from the first fluidic connection into the chamber.
  • the three-dimensional agglomerates are distributed in the chamber by means of the vortex flow.
  • the chamber can already be filled with a medium, in particular with the same medium as that in which the three-dimensional agglomerates are contained. Medium can be discharged from the chamber via the second fluidic connection.
  • the decisive reason for the formation of the vortex flows lies in the significant and abrupt cross-sectional change from the first fluidic connection to the significantly larger chamber. b) pulsatile back and forth movement of the first medium with three-dimensional agglomerates, in particular by means of a pump unit, via the first and the second fluidic connection and/or via the third and fourth fluidic connection, so that
  • Vortex flows are generated.
  • the vortex flows generate a movement of the three-dimensional agglomerates or agglomerate fragments in the chamber and, on the other hand, defined and adjustable shear forces that act on the three-dimensional agglomerates or agglomerate fragments and lead to their mechanical dissociation, or in other words, they are split.
  • the first medium moves at a higher speed than the three-dimensional agglomerates, which also leads to individual structures or agglomerate fragments being washed away or detached from the surface of the three-dimensional agglomerates.
  • the three-dimensional agglomerates themselves collide, which creates further friction.
  • a pulsatile back and forth movement of the first medium means that the conveying direction of the first medium through the microfluidic device is temporarily changed by successive, pulsed forward and backward conveying of the first medium.
  • the first medium with the three-dimensional agglomerates is moved back and forth between two fluidic connections in the chamber at a flow velocity of 0.05 - 0.2 m/s.
  • the flow rate can be constant or varying, in particular pulsating.
  • the reciprocating movement occurs, for example, in alternating sequence between the first and second fluidic connections and the third and fourth fluidic connections.
  • the advantage of the method according to the invention is that the vortex flows are generated and used in the chamber to distribute or mix the introduced three-dimensional agglomerates and liquids and to generate adjustable fluid mechanical shear forces which act on the three-dimensional agglomerates, agglomerate fragments and individual structures and cause the agglomerates and agglomerate fragments to dissociate.
  • These mechanical shear forces are - in comparison to conventional manual pipetting processes - precisely defined and can be suitably adjusted in terms of size and duration and are therefore reproducible.
  • Another advantage is that the shape and strength of the vortex flows that can be generated can be controlled by the geometric design of the fluidic Connections and the chamber as well as the flow rate of the liquid conveyed by a pump unit are advantageously designed and adjustable.
  • Another advantage is that the process for splitting three-dimensional cell agglomerates can be carried out automatically. This saves a lot of time due to the elimination of manual work steps (such as adding and removing different liquids several times, carrying out centrifugations and washing processes and dissociating the organoids by pipetting up and down), shortened analysis times and parallel processes. These work steps can therefore not only be carried out by trained and experienced specialists, which relieves them of some of the workload.
  • Another advantage is that the three-dimensional agglomerates and the agglomerate fragments, as well as the individual structures, remain viable and are available for subsequent cultivation or analysis steps with almost no losses.
  • an enzyme solution is added via a fluidic connection, in particular via the third and/or fourth fluidic connection, so that when the enzyme solution passes from the fluidic connection into the chamber, vortex flows are generated and wherein in step b) the enzyme solution is moved back and forth in a pulsating manner.
  • the enzyme solution with a splitting effect is first added to the three-dimensional agglomerates, which are then incubated with the enzyme-containing solution, for example for a period of ten minutes. During or after the incubation, the enzyme-containing solution is moved back and forth with the three-dimensional agglomerates in the chamber in a pulsatile manner in order to mechanically support the splitting process. It is advantageous that the enzymatic and mechanical action on the three-dimensional agglomerates, in particular at the same time, Agglomerates and agglomerate fragments the splitting process is enzymatically supported and improved and, in particular, accelerated.
  • the degree of dissociation of the three-dimensional agglomerates into individual structures and/or agglomerate fragments is determined during the splitting in a method step c) by means of a control unit, in particular by means of an image evaluation method.
  • the advantage here is that the degree of dissociation of the three-dimensional agglomerates and agglomerate fragments is observed and controlled, for example by means of the image evaluation method, and the point in time at which the splitting should end is determined reliably and easily. Traditionally, this step was carried out by experienced specialists, who can thus be relieved of some of their workload.
  • the splitting in a method step d) is stopped, in particular automatically, when the control unit determines that the desired degree of dissociation of the three-dimensional agglomerates into individual structures and/or agglomerate fragments has been achieved.
  • the splitting is stopped, for example, by introducing a buffer solution or a medium, in particular a cultivation medium, into the chamber.
  • the buffer solution or medium displaces the enzyme solution from the chamber.
  • the buffer solution or medium is introduced via one of the fluidic connections, and when it passes into the chamber, vortex flows are generated, which ensure rapid mixing or displacement.
  • a step e) the individual structures and/or agglomerate fragments are removed via a fluidic connection, in particular via the second fluidic connection.
  • the first, third and fourth fluidic connections are used, for example, simultaneously or in a suitable alternating sequence as inlets for the flow of a medium into the chamber. This can create advantageous flow conditions and vortex flows in the chamber. generated to remove all or as many of the organoid fragments and organoid cells as possible from the chamber.
  • the individual structures and/or agglomerate fragments can be further processed within the chamber.
  • further media for example a rinsing liquid
  • the fluidic connections in particular via the second and/or third and/or fourth fluidic connection, in particular for carrying out washing processes, wherein vortex flows are generated when the further media pass into the chamber.
  • a rinsing liquid can be used to remove any residues of the first medium and to clean the three-dimensional agglomerates as well as the microfluidic device.
  • a washing step using a rinsing liquid is advantageous, since this removes proteins of the first medium adhering to the three-dimensional agglomerates, which would otherwise, for example, inhibit the enzyme reaction.
  • the three-dimensional agglomerates are cell agglomerates, in particular organoids or spheroids and the split
  • Individual structures are cells, in particular organoid cells or spheroid cells, and the agglomerate fragments are cell agglomerate fragments, in particular organoid fragments or spheroid fragments.
  • cell agglomerates such as organoids or spheroids
  • the invention further relates to a control unit, designed to carry out and/or control the steps of the method according to the invention in corresponding units, in particular in a microfluidic cartridge, in particular by electrical actuation of the at least one valve and/or at least one pump.
  • Another subject matter of the invention is a cartridge, in particular a microfluidic cartridge, as described for example in DE102016222072A1 or DE102016222075A1, comprising the microfluidic device according to the invention.
  • the microfluidic cartridge for example, represents a system for the cultivation, expansion, drug treatment and analysis of tumor organoids.
  • Fig. 1 the schematic representation of a cross section through a microfluidic device according to the invention in a first embodiment to illustrate the generation of vortex flows
  • FIG. 2a the schematic representation of a cross section through a microfluidic device according to the invention in a second embodiment to illustrate the method step a)
  • FIG. 2b the schematic representation according to Figure 2a to illustrate the process step b)
  • FIG. 2c the schematic representation according to Figure 2a to illustrate the process step e)
  • Fig. 3 the schematic representation of a cartridge according to the invention comprising the microfluidic device according to Figure 2a, and
  • FIG. 4 the schematic representation of a flow chart of an embodiment of the method according to the invention.
  • Embodiments of the invention Figure 1 shows the microfluidic device 10 according to the invention in a first embodiment.
  • the microfluidic device 10 comprises a first fluidic connection 1 and a second fluidic connection 2, which open into a chamber 5.
  • the first fluidic connection 1 is arranged on the first side surface 5a of the chamber 5 and the second fluidic connection 2 is arranged on the opposite side surface 5c of the chamber 5.
  • the fluidic connections 1, 2 are aligned orthogonal to the side surfaces 5a, 5c of the chamber 5.
  • the cross section 55 of the chamber 5 is 2 to 20 times larger than the cross section 11 of the first fluidic connection 1.
  • the chamber 5 has a rectangular shape, for example with a length and a width of 2 - 15 mm and a height of 0.75 - 2 mm.
  • the first fluidic connection 1 has, for example, dimensions of 100 - 750 pm, and the second fluidic connection 2 has, for example, dimensions of 25 - 150 pm.
  • at least one side surface 5a, 5b, 5c, 5d of the chamber 5 is at least partially transparent.
  • Figure 1 serves to illustrate the generation of vortex flows 6b.
  • An inflow 6a of a liquid into the chamber 5 is shown via the fluidic connection 1.
  • vortex flows 6b are generated due to the significant and abrupt change in cross-section from the first fluidic connection 1 to the much larger chamber 5.
  • the shape and strength of the vortex flows 6b that can be generated can be adjusted by the geometric design of the fluidic connections 1, 2 and the chamber 5 as well as by the flow rate of the liquid.
  • the outflow 6c of the liquid from the chamber 5 occurs via the second fluidic connection 2.
  • the microfluidic device 10 according to the invention according to Figure 1 is shown in a second embodiment with two further fluidic connections, namely a third fluidic connection 3 and a fourth fluidic connection 4.
  • the third fluidic connection 3 is arranged on the second side surface 5b of the chamber 5 and the fourth fluidic connection 4 is arranged on the fourth side surface 5d of the chamber 5 opposite thereto.
  • the third 3 and the fourth fluidic connection 4 have dimensions of 5-75 pm, for example.
  • an embodiment of the method according to the invention is described using the microfluidic device 10 in the second embodiment shown in Figure 2.
  • the mechanical splitting of organoids 7 into organoid cells 9 and/or organoid fragments 8 is described as an example for the mechanical splitting of three-dimensional agglomerates 7 into individual structures 9 and/or agglomerate fragments 8.
  • first fluidic connection 1 and the second fluidic connection 2 are opened and the third 3 and fourth fluidic connection 4 are closed or their pump unit is not active.
  • the dimensions of the first fluidic connection 1 are suitably selected so that organoids 7 of the desired size can pass through.
  • the dimensions of the second fluidic connection 2 are suitably smaller in comparison so that only dissociated or split organoid fragments 8 and organoid cells 9 or very small organoids 7 can pass through it from the chamber 5.
  • a first medium with organoids 7 is introduced into the chamber 5 of the microfluidic device 10 via the first fluidic connection 1 via a pump unit (not shown).
  • the first medium is, for example, a cultivation medium or a buffer solution in which the organoids 7 are suspended.
  • the chamber 5 is, for example, already filled, in particular with the first medium without organoids.
  • the first medium with organoids 7 passes from the first fluidic connection 1 into the chamber 5, the vortex flows 6b described in Figure 1 are generated.
  • the organoids 7 are distributed in the chamber 5 by means of the vortex flow 6b.
  • the first medium can be discharged from the chamber 5 via the second fluidic connection 2.
  • an enzyme solution is added to the chamber 5.
  • the addition takes place, for example, via the third fluidic connection 3 as an inlet and the fourth fluidic connection 4 as an outlet. This continues until the desired enzyme concentration is present within the chamber 5.
  • the vortex flows 6b generated in this process support the formation of a homogeneously distributed enzyme concentration within the chamber 5.
  • the dimensions of the third 3 and the fourth fluidic connection 4 are suitably selected so that no organoids 7, organoid fragments 8 or organoid cells 9 escape from the chamber 5 during the addition of the enzyme solution. are transported out and lost.
  • retention elements such as microfilters or sieves are integrated into the third 3 and fourth microfluidic connection 4 so that they can also have larger dimensions.
  • Figure 2b shows a second step b) of the method according to the invention.
  • a suitably executed pulsatile back and forth movement of the enzyme solution with organoids 7 takes place in alternating sequence via the third 3 and fourth fluidic connection 4.
  • the first 1 and the second fluidic connection 2 are closed or the pump unit connected to it is not active.
  • the back and forth movement takes place in particular via at least one pump unit.
  • the resulting vortex flows 6b generate, on the one hand, a movement of the organoids 7 and possibly organoid fragments 8 in the chamber 5 and, on the other hand, defined and adjustable shear forces which act on the organoids 7 and organoid fragments 8 and mechanically support the enzymatic splitting, so that a dissociation of the organoids 7 and organoid fragments 8 occurs.
  • At least one side surface 5a, 5b, 5c, 5d of the chamber 5 is at least partially transparent.
  • a step c) which takes place simultaneously with step b), the interior of the chamber 5 with the organoids 7, organoid fragments 8 and organoid cells 9 is monitored, for example by means of a control unit not shown in the figures.
  • the control unit comprises, for example, a microscope or a microscope unit connected to the chamber 5.
  • the optical control allows in particular the decision as to when the desired degree of dissociation of the organoids 7 and organoid fragments 8 has been reached. This can be done automatically using suitable image evaluation methods, for example by recognizing the dimensions and number of organoids 7, organoid fragments 8 and organoid cells 9 in the chamber 5.
  • the splitting process is stopped in a step d) not shown in Figure 2b, in particular automatically.
  • a buffer solution or a Medium in particular a cultivation medium, is introduced into the chamber 5, whereby when the buffer solution or the medium passes into the chamber 5, vortex flows 6b are generated.
  • the enzyme solution is first diluted and then removed from the chamber 5.
  • the fluidic connections 3 and 4 can be used alternately as an inlet or outlet in a suitable manner.
  • the vortex flows 6b that occur in the chamber 5 support the efficiency of the liquid exchange in terms of improved mixing and reduction of the required time.
  • Figure 2c shows a further method step e), in which the organoid fragments 8 and organoid cells 9 are removed from the microfluidic chamber 5. These are conveyed out via an outflow 6c via the second fluidic connection 2.
  • the first 1, the third 3 and the fourth fluidic connection 4 are used simultaneously or in a suitable alternating sequence as inlets for the inflow 6a of a buffer solution or a medium, in particular cultivation medium, into the chamber 5.
  • This makes it possible to generate advantageous flow conditions and vortex flows 6b in the chamber 5 in order to remove all or as many of the organoid fragments 8 and organoid cells 9 as possible from the chamber 5.
  • the interior of the optically accessible chamber 5 can be observed microscopically, for example, which enables monitoring and optimization of the conveying out of the organoid fragments 8 and/or organoid cells 9 from the chamber 5.
  • the generated and extracted organoid fragments 8 and/or organoid cells 9 are then available for subsequent cultivation or analysis steps.

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Abstract

Es wird ein mikrofluidisches Verfahren (500) zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten (7) zu Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmenten (8) mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung (10) mit folgenden Schritten beschrieben: a) Zuführen eines ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten (7) in eine Kammer (5) über einen ersten fluidischen Anschluss (1), wobei beim Übertreten des ersten Mediums aus dem ersten fluidischen Anschluss (1) in die Kammer (5) Wirbelströmungen (6b) erzeugt werden, b) pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten (7), insbesondere mittels einer Pumpeinheit, über den ersten (1) und einen zweiten fluidischen Anschluss (2) und/oder über einen dritten (3) und vierten fluidischen Anschluss (4), sodass Wirbelströmungen (6b) erzeugt werden, aufgrund welcher die dreidimensionalen Agglomerate (7) mechanisch gesplittet werden.

Description

Beschreibung
Titel
Vorrichtung und Verfahren zum Splitten dreidimensionaler Agglomerate
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung, ein Verfahren zum Betrieb derselben sowie auf eine Steuereinheit und eine, die mikrofluidische Vorrichtung umfassende Kartusche, nach dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche.
Stand der Technik das Interesse an der Verwendung von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Organoiden oder Sphäroiden für die Erforschung, Diagnose und Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise Tumorerkrankungen, hat in den vergangenen Jahren stark zugenommen, da solche dreidimensionalen Agglomerate zum Beispiel organspezifische Eigenschaften gut abbilden können. Typischerweise erfolgt deren Handhabung manuell mit Hilfsmitteln wie Pipetten, Reaktionsgefäßen und Laborgeräten. Hier bietet die Mikrofluidik im Vergleich zu herkömmlichen Labortests Vorteile wie beispielsweise geringere benötigte Probenvolumina und Reagenzien, verkürzte Analysezeiten sowie parallel ablaufende Vorgänge.
Bei der Implementierung erforderlicher Prozessschritte in ein mikrofluidisches System gibt es jedoch aufgrund deren Komplexität zahlreiche Herausforderungen, die es zu meistern gilt. Eine dieser Herausforderungen ist beispielsweise die Kultivierung und Vermehrung solcher dreidimensionaler Zellagglomerate in einem mikrofluidischen System.
Sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, kurz LoC-Systeme, sind mikrofluidische Systeme, welche Funktionalitäten eines makroskopischen Labors auf einem Kunststoffsubstrat für eine automatisierte Prozessierung unterbringen. Solche Systeme ermöglichen es, biochemische Prozesse weitestgehend oder vollständig automatisiert zu prozessieren.
Lab-on-a-Chip-Systeme umfassen typischerweise zwei Hauptkomponenten. Die erste ist ein Testträger, beispielsweise in Form einer Kartusche, welcher Strukturen und Mechanismen für die Manipulation einer aufgenommenen Probe umfasst, insbesondere passive Komponenten wie Kanäle, Reaktionskammern oder vorgelagerte Reagenzien oder auch aktiven Komponenten wie Ventile, Pumpen oder Mischer. Die zweite Hauptkomponente ist eine Steuereinheit zur Steuerung der mikrofluidischen Abläufe in der Kartusche.
Die US 2019/0329247 A1 beschreibt einen mikrofluidischen Chip. Zellen bzw. Zellstrukturen sollen von einer Kammer in eine vorbestimmte Region geführt werden, um zu verhindern, dass sich die Zellen bzw. Zellstrukturen an den Seiten der Kammer anordnen. Mittels eines Wirbelstroms aus Flüssigkeit werden die Zellen bzw. Zellstrukturen in die Mitte der Kammer und somit in die vorbestimmte Region gestrudelt.
In der US 8277110 B2 wird ein „mikromixer biochip“ offenbart, der Substanzen mittels einer aktiven Wirbelströmung mischt. Hierzu weist er eine Mischkammer und einen Fluidkanal auf, der an einem Ende mit der Mischkammer verbunden ist. Da die Achse des Fluidkanals nicht durch das Zentrum der Mischkammer führt, bildet die sich bewegende Flüssigkeit eine Wirbelströmung aus, die den Mischeffekt bewirkt.
Offenbarung der Erfindung
Zur Erforschung von Tumorerkrankungen kommen zum Beispiel so genannte Tumor-Organoide und -Sphäroide zum Einsatz. Diese ermöglichen eine sehr gute Reproduktion verschiedener krankhafter Gewebezustände, weswegen sie sich für Medikamententests zur Evaluierung der Wirksamkeit und Dosierung von Medikamenten anbieten. Mittels dieser Beobachtungen kann dann beispielsweise für den einzelnen Erkrankten eine personalisierte medikamentöse Krebstherapie ausgewählt werden, die individuelle Besonderheiten berücksichtigt und so die Effizienz der Therapie optimiert. Eine Möglichkeit zur Herstellung von Tumor-Organoiden ist die Entnahme einzelner Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärtumor eines Krebspatienten und deren anschließende Kultivierung. Hierbei erfolgt eine Differenzierung und Vermehrung dieser Zellen oder Gewebefragmente, die sich schließlich zu dreidimensionalen Strukturen selbstorganisieren. Die daraus entstehenden Tumor-Organoide sind somit dreidimensionale Zellagglomerate, welche eine ähnliche Zusammensetzung und Architektur aufweisen wie das primäre Tumorgewebe des Patienten. Sie weisen beispielsweise einen Durchmesser von 100 - 750 pm auf.
Sphäroide sind dreidimensionale Zellagglomerate, die durch Aggregation und Organisation einiger Tausend Zellen erzeugt werden können, beispielsweise mit einem Durchmesser von 100 - 750 pm. Im Vergleich zu Organoiden sind Sphäroide weniger komplex und weisen in der Regel nur eine Art Zellen auf.
Um über einen längeren Zeitraum von mehreren Wochen oder Monaten mit Organoiden oder Sphäroiden arbeiten zu können, werden aktuell etablierte Methoden der 3D-Zellkultivierung angewandt.
Hauptprozessschritte hierbei sind die Kultivierung von Organoiden oder Sphäroiden und deren anschließende Expansion. Bei der Expansion werden die Organoide oder Sphäroide enzymatisch und/oder mechanisch in Organoid- oder Sphäroid-Fragmente aus einigen wenigen zehn Zellen und in einzelne Organoid- Zellen oder Sphäroid-Zellen gesplittet. Anschließend werden die gesplitteten Organoid- oder Sphäroid-Fragmente und -Zellen neu ausgesät. Auf diese Weise erfolgt eine Vermehrung der Organoide oder Sphäroide.
Unter dem Begriff „Splitten“ wird im Sinne der vorliegenden Erfindung also eine Auflösung von Verbindungen zwischen Einzelstrukturen eines dreidimensionalen Agglomerats, und die dadurch entstehende Dissoziierung des dreidimensionalen Agglomerats in Agglomerat-Fragmente und/oder Einzelstrukturen verstanden. Unter dem Begriff dreidimensionale Agglomerate werden im Sinne der vorliegenden Erfindung beispielsweise Zellagglomerate wie Organoide oder Sphäroide verstanden.
Beim Splitten erfolgt also beispielsweise eine Auflösung von Verbindungen zwischen Zellen eines Zellagglomerats, und die dadurch entstehende Dissoziation des Zellagglomerats in multizelluläre Zellagglomerat-Fragmente bzw. einzelne Zellen. Das Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Organoiden und Sphäroiden, erfolgt enzymatisch durch Zugabe einer Enzymlösung, beispielsweise Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym (Thermofisher) und/oder mechanisch durch manuelles Auf- und Abpipettieren der Suspension. Das Splitten ist von erfahrenen Fachleuten mikroskopisch zu überwachen, um den Grad der Dissoziation zu bestimmen und dann zur richtigen Zeit das Splitten zu beenden. Die Wahl des geeigneten Zeitpunkts und Dissoziationsgrads zur Beendigung ist entscheidend, da bei bestimmten Organoidtypen ein Splitten bis auf einzelne Zellen die Fähigkeit der erneuten Organoidbildung beeinträchtigt. Die Dissoziation der Organoide hat Einfluss auf die nachfolgende Organoidbildung sowie die sich letztlich ergebenden Organoideigenschaften. Für das Stoppen des Splittens wird zunächst eine Pufferlösung zugegeben, um die Enzymlösung stark zu verdünnen. Dann erfolgt eine Zentrifugation, so dass sich ein Pellet aus Fragmenten bzw. Zellen bildet, und der Überstand wird abgesaugt und verworfen. Das Entfernen des Überstands ist vorsichtig durchzuführen, um das Pellet nicht zu beschädigen und keine Fragmente bzw. Zellen ungewollt zu verlieren. Die nach der Dissoziation entstandenen Fragmente bzw. Zellen werden beispielswiese erneut in einer extrazellulären Matrix suspendiert und 3D Kultivierungsschritte für die mehrfach wiederholbare Organoid-Expansion erneut ausgeführt.
Hierbei umfasst die Durchführung des mehrstufigen Splitting-Vorgangs beispielsweise mehrmaliges Zugeben und Entfernen von verschiedenen Flüssigkeiten, Durchführen von Zentrifugationen und Waschvorgängen sowie Dissoziieren der Organoide mittels Auf- und Abpipettieren.
Im Labormaßstab werden hierfür die Gefäße gewechselt sowie Zentrifugationsschritte und visuell zu überwachende Pipettiervorgänge realisiert. Diese Prozessschritte zur Kultivierung und Expansion sind sehr arbeits- und zeitintensiv und können nur von ausgebildetem und erfahrenem Fachpersonal in geeignet ausgestatteten Laboren durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung adressiert eine mikrofluidische Implementierung der Prozesse zum Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Tumor-Organoiden oder Tumor-Sphäroiden.
Erfindungsgemäß werden eine mikrofluidische Vorrichtung zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmenten mit einer Kammer und einem ersten und zweiten fluidischen Anschluss, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche bereitgestellt.
Hierbei ist der erste fluidische Anschluss an einer ersten Seitenfläche der Kammer angeordnet und der zweite fluidische Anschluss ist, insbesondere zu dem ersten fluidischen Anschluss gegenüberliegend, an einer dritten Seitenfläche der Kammer angeordnet. Dies beruht insbesondere darauf, dass der Querschnitt der Kammer um das 2- bis 20-fache, größer ist als der Querschnitt des ersten fluidischen Anschlusses, sodass Wirbelströmungen erzeugbar sind.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Wirbelströmungen in der Kammer generiert und genutzt werden, um zum einen die eingebrachten dreidimensionalen Agglomerate und Flüssigkeiten zu verteilen bzw. zu mischen und zum anderen einstellbare fluidmechanische Scherkräfte zu erzeugen, welche auf die dreidimensionalen Agglomerate, Agglomerat-Fragmente und Einzelstrukturen einwirken und eine Dissoziation der Agglomerate und Agglomerat-Fragmente bewirken. Diese mechanischen Scherkräfte sind - im Vergleich zu herkömmlichen manuellen Pipettier-Vorgängen - genau definiert und hinsichtlich Größe und Dauer geeignet einstellbar und somit reproduzierbar.
Der entscheidende Grund für die Entstehung der Wirbelströmungen liegt in der signifikanten und abrupten Querschnittsveränderung von dem ersten fluidischen Anschluss zur deutlich ausgedehnteren Kammer. Die Form und Stärke der generierbaren Wirbelströmungen sind durch die geometrische Ausgestaltung der fluidischen Anschlüsse und der Kammer sowie durch die Flussrate der mittels einer Pumpeinheit geförderten Flüssigkeit vorteilhaft design- und einstellbar. Desweiteren vorteilhaft ist es, dass mittels der mikrofluidischen Vorrichtung die Arbeitsschritte zum Splitten von dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert durchgeführt werden können. Somit wird viel Zeit eingespart aufgrund der Einsparung händischer Arbeitsschritte, verkürzter Analysezeiten und parallel ablaufender Vorgänge. Desweiteren sind diese Arbeitsschritte somit nicht nur von ausgebildetem und erfahrenen Fachpersonal durchführbar, wodurch dieses entlastet wird.
Durch die Automatisierung von Prozessschritten, ist wiederum deren Standardisierung möglich, welche insbesondere für klinische und industrielle Anwendungen, beispielsweise im Bereich der Wirkstofftestung und personalisierten Medizin große Vorteile bietet. Weiterhin vorteilhaft ist, dass die dreidimensionalen Agglomerate und die Agglomerat-Fragmente, sowie die Einzelstrukturen hierbei viabel bleiben und nahezu ohne Verluste für nachfolgende Kultivierungs- oder Analyseschritte zur Verfügung stehen.
Dadurch, dass die Prozessschritte innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, ist zudem die Gefahr von unerwünschten bzw. problematischen Verunreinigungen der Probe reduziert.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Der Querschnitt der fluidischen Anschlüsse ist beispielsweise rechteckig oder quadratisch, wobei die Ecken abgerundet ausgeführt sein können. Alternativ ist der Querschnitt der fluidischen Anschlüsse beispielsweise rund oder oval.
Es ist vorteilhaft, wenn der erste fluidische Anschluss Abmessungen von 100 - 750 pm aufweist, sodass diesen dreidimensionale Agglomerate passieren können und wenn der zweite fluidische Anschluss Abmessungen von 25 - 150 pm aufweist, sodass diesen nur gesplittete Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente passieren können, nicht jedoch dreidimensionale Agglomerate in ungesplitteter Form.
Auf diese Weise ist sichergestellt, dass über den zweiten fluidischen Anschluss nur gesplittete Einzelstrukturen und/oder Agglomerat Fragmente abgeführt werden.
Die Abmessungen des ersten und des zweiten fluidischen Anschlusses können an die jeweiligen Anforderungen bzw. Größen der verwendeten dreidimensionalen Agglomerate angepasst werden.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform umfasst die Kammer zudem einen dritten und einen, insbesondere diesem gegenüberliegenden, vierten fluidischen Anschluss. Hierbei ist der Querschnitt der Kammer um das 2- bis 20- fache größer als der Querschnitt des dritten und des vierten fluidischen Anschlusses, sodass Wirbelströmungen erzeugbar sind.
Vorteilhaft hierbei ist, dass über den dritten und den vierten fluidischen Anschluss ebenfalls Flüssigkeiten und Medien in die Kammer eingebracht werden können, wodurch die mikrofluidische Vorrichtung mit hoher Flexibilität genutzt werden kann. Desweiteren vorteilhaft ist, dass in der Kammer weitere Wirbelströmungen generiert werden mittels denen zum einen die Flüssigkeiten und Bestandteile in der Kammer verteilt bzw. gemischt werden. Zum anderen werden durch die Wirbelströmungen definiert einstellbare fluidmechanische Scherkräfte erzeugt, welche auf die dreidimensionalen Agglomerate, Agglomerat-Fragmente und Einzelstrukturen in der Kammer einwirken und die Dissoziation der Agglomerate und Agglomerat-Fragmente weiter vorantreiben und unterstützen. Diese mechanischen Scherkräfte sind genau definiert und hinsichtlich Größe und Dauer geeignet einstellbar und somit reproduzierbar.
Hierbei ist es vorteilhaft, wenn der dritte und der vierte fluidische Anschluss ein integriertes Rückhalteelement und/oder Abmessungen von 5 - 75 pm aufweisen. Vorteilhaft hierbei ist, dass dreidimensionale Agglomerate, Agglomerat- Fragmente oder Einzelstrukturen diese nicht passieren können. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass die dreidimensionalen Agglomerate, Agglomerat- Fragmente oder Einzelstrukturen die Kammer über den dritten und den vierten fluidischen Anschluss beim Einbringen, Abführen und Hin- und Herbewegen von Medien und Flüssigkeiten nicht verlassen können. Dies ermöglicht ein einfaches und verlustfreies Zu- und Abführen und Hin- und Herbewegen von Medien und Flüssigkeiten.
Das integrierte Rückhalteelement ist beispielsweise als Mikrosieb, Mikrofilter und/oder mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet. Sind der dritte und der vierte fluidische Anschluss mit einem solchen ausgestattet, so können diese Anschlüsse größere Abmessungen aufweisen, wodurch vorteilhaft höhere Flussraten möglich sind.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist der dritte fluidische Anschluss an einer quer zu der ersten und dritten Seitenfläche der Kammer liegenden zweiten Seitenfläche (5b) angeordnet, und der vierte fluidische Anschluss an einer der zweiten Seitenfläche (5b) gegenüberliegenden vierten Seitenfläche der Kammer.
Vorteilhaft hierbei ist, dass vorteilhafte Strömungsbedingungen geschaffen werden. Beim Vorgang des Splittens beispielsweise kann das Medium mit den dreidimensionalen Agglomeraten oder die Enzymlösung dann zwischen dem ersten und zweiten fluidischen Anschluss und dem dritten und vierten fluidischen Anschluss abwechselnd hin- und herbewegt werden. Es werden dadurch Wirbelströmungen in der gesamten Kammer generiert und unvorteilhafte strömungsfreie Bereiche in der Kammer verhindert oder minimiert, in denen sich Flüssigkeiten, dreidimensionale Agglomerate, Agglomerat-Fragmente oder Einzelstrukturen ansammeln. Dadurch ist die Effizienz des Splitting-Vorgangs verbessert.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist die Kammer eine rechteckige Form auf, insbesondere mit einer Länge und einer Breite von 2 - 15 mm und einer Höhe von 0,75 - 2 mm.
Diese Abmessungen sind vorteilhaft, da damit eine für die Generierung der Wirbelströmungen vorteilhaftes Querschnittsverhältnis von Kammer und fluidischen Anschlüssen realisiert ist.
Alternativ sind auch weitere geometrische Ausgestaltungen der Kammer und der fluidischen Anschlüsse möglich, um insbesondere die Erzeugung stärkerer bzw. genauer einstellbarer Wirbelströmungen im Inneren der Kammer zu erlauben. In einer alternativen Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung zwei oder mehrere mikrofluidische Kammern, welche beispielsweise gleichzeitig verwendet werden. Vorteilhaft hierbei ist, dass der Durchsatz des Vorgangs des Splittens erhöht ist und so kürzere Gesamtprozesszeiten realisiert werden können.
Zudem ist es vorteilhaft, dass die mikrofluidische Kammer und die fluidischen Anschlüsse im Vergleich zu üblichen Laborgefäßen ein deutlich geringeres Volumen aufweisen. Es werden signifikant geringere Flüssigkeitsvolumina für den Vorgang des Splittens der dreidimensionalen Agglomerate benötigt und verbraucht. Außerdem erfordern die Austauschvorgänge von Flüssigkeiten weniger Zeit, sodass sich die Prozesszeiten verringern.
Zudem ist es von Vorteil, wenn die fluidischen Anschlüsse orthogonal zu den Seitenwänden der Kammer ausgerichtet sind. Vorteilhaft ist hierbei, dass eine größtmögliche abrupte Querschnittsveränderung am Übergang eines fluidischen Anschlusses zur Kammer realisiert wird und die Generierung der Wirbelströmung in der Kammer befördert.
Die Anzahl und Position der fluidischen Anschlüsse können alternativ auch anders ausgeführt sein, wie beispielsweise zueinander versetzte Anschlüsse oder mehr Anschlüsse, um die Ausbildung der Wirbelströmungen zu verbessern. Der erste fluidische Anschluss ist zu dem zweiten fluidischen Anschluss beispielsweise gegenüberliegend, insbesondere an gegenüberliegenden Kammerwänden der mikrofluidischen Vorrichtung, angeordnet. Alternativ können der erste und der zweite fluidische Anschluss versetzt zueinander an gegenüberliegenden Kammerwänden der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet sein.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist zumindest eine Seitenfläche der Kammer zumindest teilweise transparent ausgeführt. Diese kann insbesondere ein transparentes Polymer umfassen wie beispielsweise ein Cycloolefin- Copolymer (COC), ein Polycarbonat (PC), ein Polymethylmethacrylat (PMMA), ein Polystyrol (PS) oder ein Glas.
Vorteilhaft hierbei ist, dass durch die optisch zugängliche Kammer vor, während und nach dem Splitten der Dissoziationsgrad der dreidimensionalen Agglomerate und Agglomerat-Fragmente bestimmt und überwacht werden kann.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass die mikrofluidische Vorrichtung eine Kontrolleinheit umfasst. Die Kontrolleinheit ist insbesondere eine mikroskopische Einheit, welche an oder nahe an der zumindest teilweise transparenten Seitenfläche der Kammer angeordnet ist. Mittels der Kontrolleinheit werden die dreidimensionalen Agglomerate, Agglomerat-Fragmente und Einzelstrukturen überwacht. Somit entfällt eine mikroskopische Beobachtung und Kontrolle durch erfahrenes Fachpersonal, um den sich verändernden Dissoziationsgrad zu ermitteln und den Vorgang des Splittens zu einem geeigneten Zeitpunkt zu stoppen, wodurch dieses entlastet wird.
Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn die mikrofluidische Vorrichtung zumindest ein Reservoir für ein Fluid umfasst. Vorteilhaft hierbei ist, dass in dem Reservoir Fluide wie beispielsweise Medien, Spülflüssigkeiten, Enzymlösungen oder Färbelösungen vorlagerbar sind. So ist eine schnelle und einfache Zuführung dieser Fluide sichergestellt.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung ein Reservoir mit einer für das Splitten vorgelagerten Enzymlösung. Die Enzymlösung umfasst insbesondere Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym, wobei das Reservoir mit dem dritten (3) und/oder vierten fluidischen Anschluss (4) in fluidischer Verbindung steht.
In einer vorteilhaften Ausführungsform umfasst zumindest einer der fluidischen Anschlüsse der mikrofluidischen Vorrichtung eine Pumpeinheit oder ist mit einer solchen verbunden. Die Pumpeinheit ist beispielsweise eine, insbesondere elektrisch ansteuerbare, Peristaltik-, Membran- oder Spritzenpumpe.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung zumindest ein Ventil, welches insbesondere elektrisch ansteuerbar ist, sodass die mikrofluidische Vorrichtung elektrisch betreibbar ist. Vorteilhaft hierbei ist, dass mittels eines oder mehreren Ventilen zumindest ein fluidischen Anschluss und/oder zumindest ein Reservoir für Fluide individuell schließ- und öffenbar ist, sodass der Fluss durch die mikrofluidische Vorrichtung individuell festlegbar ist. Auf diese Weise sind verschiedene Möglichkeiten der Zu- und Abführung von Medien sowie des Durchflusses durch die Kammer einfach realisierbar.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform sieht vor, dass die mikrofluidische Vorrichtung eine Heizeinrichtung aufweist zur Temperierung der Kammer. Unter einer Heizeinrichtung wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Einrichtung verstanden, welche die Kammer beheizen und/oder kühlen kann.
Vorteilhaft hierbei ist, dass auf diese Weise eine optimale Temperatur für das Splitten der dreidimensionalen Agglomerate bereitgestellt werden kann.
Die optimale Temperatur für das Splitten hängt unter anderem beispielsweise von der Kultivierung der dreidimensionalen Agglomerate ab. Bei einer Kultivierung von Organoiden in Matrigel® (Corning) ist es beispielsweise vorteilhaft die Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung zu kühlen, da sich Matrigel bei Temperaturen von circa 4°C verflüssigt.
In einer Ausführungsform, in welcher ein enzymatisches Splitten der dreidimensionalen Agglomerate durch ein mechanisches Splitten unterstützt wird, kann das enzymatische Splitten durch Einstellen einer optimalen Wirk- Temperatur des Enzyms noch weiter verbessert werden.
Zum enzymatischen Splitten von Organiden und/oder Sphäroiden wird beispielsweise das Enzym Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym (Thermofisher) eingesetzt, dessen optimale Wirk-Temperatur bei 37° Celsius liegt. Eine Alternative oder zusätzlich Ausführungsform sieht vor, dass die mikrofluidische Vorrichtung eine Einrichtung zur Erzeugung und Einleitung von Ultraschall und/oder eine Einrichtung zur Erzeugung und Einleitung einer Vibration in die Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung umfasst
Vorteilhaft bei der Einleitung von Ultraschall und/oder einer Vibration ist, dass die Ultraschallwellen und/oder Vibrationen auf die dreidimensionalen Agglomerate in der Kammer einwirken und das Splitten unterstützen und verbessern.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Mikrofluidisches Verfahren zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmenten mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung mit folgenden Schritten: a) Zuführen eines ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten in die Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung über den ersten fluidischen Anschluss, wobei beim Übertreten des ersten Mediums aus dem ersten fluidischen Anschluss in die Kammer Wirbelströmungen erzeugt werden. Mittels der Wirbelströmung werden die dreidimensionalen Agglomerate in der Kammer verteilt. Die Kammer kann hierbei bereits mit einem Medium, insbesondere mit demselben Medium wie jenes in welchem die dreidimensionalen Agglomerate enthalten sind, befüllt sein. Über den zweiten fluidischen Anschluss kann Medium aus der Kammer abgeführt werden. Der entscheidende Grund für die Entstehung der Wirbelströmungen liegt in der signifikanten und abrupten Querschnittsveränderung vom ersten fluidischen Anschluss zur deutlich ausgedehnteren Kammer. b) pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten, insbesondere mittels einer Pumpeinheit, über den ersten und den zweiten fluidischen Anschluss und/oder über den dritten und vierten fluidischen Anschluss, sodass
Wirbelströmungen erzeugt werden. Die Wirbelströmungen erzeugen zum einen eine Bewegung der dreidimensionalen Agglomerate bzw. Agglomerat-Fragmente in der Kammer und zum anderen definierte und einstellbare Scherkräfte, die auf die dreidimensionalen Agglomerate bzw. Agglomerat-Fragmente einwirken und zu deren mechanischen Dissoziation führen, oder mit anderen Worten gesplittet werden. Das erste Medium nimmt hierbei eine höhere Geschwindigkeit auf als die dreidimensionalen Agglomerate, was auch zu einem Abwaschen oder Ablösen von Einzelstrukturen oder Agglomerat-Fragmenten an der Oberfläche der dreidimensionalen Agglomerate führt. Zudem treffen auch die dreidimensionalen Agglomerate selbst aufeinander, wodurch eine weitere Reibung erzeugt wird. Durch diese Reibungsvorgänge lösen sich die Verbindungen zwischen den Einzelstrukturen, die für den Zusammenhalt des dreidimensionalen Agglomerats verantwortlich sind, immer weiter auf. Es spalten sich immer mehr Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente von den dreidimensionalen Agglomeraten ab. Auf diese Weise werden die dreidimensionalen Agglomerate mechanisch dissoziiert.
Mit einem pulsatilen Hin- und Herbewegen des ersten Mediums ist gemeint, dass die Förderrichtung des ersten Mediums durch die mikrofluidische Vorrichtung temporär gewechselt wird durch aufeinanderfolgendes stoßweises Vorwärts- und Rückwärtsfördern des ersten Mediums.
Das erste Medium mit den dreidimensionalen Agglomeraten wird beispielsweise mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,05 - 0,2 m/s zwischen zwei fluidischen Anschlüssen in der Kammer hin- und herbewegt. Hierbei ist die Flussrate beispielsweise konstant oder variierend, insbesondere pulsierend.
Bei einem pulsatilen Hin- und Herbewegen unter Beteiligung des ersten, zweiten, dritten und vierten fluidischen Anschlusses erfolgt das Hin- und Herbewegen beispielsweise in abwechselnder Folge zwischen dem ersten und zweiten fluidischen Anschluss und dem dritten und vierten fluidischen Anschluss.
Vorteilhaft bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass die Wirbelströmungen in der Kammer generiert und genutzt werden, um zum einen die eingebrachten dreidimensionalen Agglomerate und Flüssigkeiten zu verteilen bzw. zu mischen und zum anderen einstellbare fluidmechanische Scherkräfte zu erzeugen, welche auf die dreidimensionalen Agglomerate, Agglomerat-Fragmente und Einzelstrukturen einwirken und eine Dissoziation der Agglomerate und Agglomerat-Fragmente bewirken. Diese mechanischen Scherkräfte sind - im Vergleich zu herkömmlichen manuellen Pipettier-Vorgängen - genau definiert und hinsichtlich Größe und Dauer geeignet einstellbar und somit reproduzierbar. Desweiteren vorteilhaft ist, dass Form und Stärke der generierbaren Wirbelströmungen durch die geometrische Ausgestaltung der fluidischen Anschlüsse und der Kammer sowie durch die Flussrate der mittels einer Pumpeinheit geförderten Flüssigkeit vorteilhaft design- und einstellbar sind. Desweiteren vorteilhaft ist es, dass das Verfahren zum Splitten von dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert durchgeführt werden kann. Somit wird viel Zeit eingespart aufgrund der Einsparung händischer Arbeitsschritte (wie mehrmaliges Zugeben und Entfernen von verschiedenen Flüssigkeiten, Durchführen von Zentrifugationen und Waschvorgängen sowie Dissoziieren der Organoide mittels Auf- und Abpipettieren), verkürzte Analysezeiten und parallel ablaufende Vorgänge. Diese Arbeitsschritte sind somit nicht nur von ausgebildetem und erfahrenen Fachpersonal durchführbar, wodurch dieses entlastet wird.
Durch die Automatisierung von Verfahrensschritten, ist wiederum deren Standardisierung möglich, welche insbesondere für klinische und industrielle Anwendungen, beispielsweise im Bereich der Wirkstofftestung und personalisierten Medizin große Vorteile bietet.
Weiterhin vorteilhaft ist, dass die dreidimensionalen Agglomerate und die Agglomerat-Fragmente, sowie die Einzelstrukturen hierbei viabel bleiben und nahezu ohne Verluste für nachfolgende Kultivierungs- oder Analyseschritte zur Verfügung stehen.
Dadurch, dass die Verfahrensschritte innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, ist zudem die Gefahr von unerwünschten bzw. problematischen Verunreinigungen der Probe reduziert.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird in einem Schritt a') eine Enzymlösung über einen fluidischen Anschluss, insbesondere über den dritten und/oder vierten fluidischen Anschluss zugegeben, sodass beim Übertreten der Enzymlösung aus dem fluidischen Anschluss in die Kammer Wirbelströmungen erzeugt werden und wobei in Schritt b) die Enzymlösung pulsatil hin- und herbewegt wird.
Hierzu wird beispielsweise zuerst die Enzymlösung mit splittender Wirkung zu den dreidimensionalen Agglomeraten gegeben, welche dann mit der enzymhaltigen Lösung, beispielsweise für einen Zeitraum von zehn Minuten, inkubiert werden. Während der Inkubation oder anschließend erfolgt das pulsatile Hin- und Herbewegen der enzymhaltigen Lösung mit den dreidimensionalen Agglomeraten in der Kammer, um den Split-Vorgang mechanisch zu unterstützen. Vorteilhaft ist, dass durch das, insbesondere gleichzeitige, enzymatische und mechanische Einwirken auf die dreidimensionalen Agglomerate und Agglomerat-Fragmente der Split-Vorgang enzymatisch unterstützt und verbessert sowie insbesondere beschleunigt wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Dissoziationsgrad der dreidimensionalen Agglomerate zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmenten während des Splitten in einem Verfahrensschritt c) mittels einer Kontrolleinheit ermittelt wird, insbesondere mittels eines Bildauswertungsverfahrens.
Vorteilhaft hierbei ist, dass der Dissoziationsgrad der dreidimensionalen Agglomerate und Agglomerat-Fragmente, beispielsweise mittels des Bildauswertungsverfahrens, beobachtet und kontrolliert wird und der Zeitpunkt zur Beendigung des Splittens zuverlässig und auf einfache Weise ermittelt wird. Herkömmlich wurde dieser Schritt von erfahrenem Fachpersonal ausgeführt, welches hierdurch entlastet werden kann.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird das Splitten in einem Verfahrensschritt d), insbesondere automatisch, gestoppt, wenn durch die Kontrolleinheit festgestellt wird, dass der gewünschte Dissoziationsgrad der dreidimensionalen Agglomerate zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmenten erreicht ist.
Wurde das mechanische Splitten enzymatisch unterstützt, so erfolgt das Stoppen des Splittens beispielsweise durch Einbringen einer Pufferlösung oder eines Mediums, insbesondere eines Kultivierungsmediums, in die Kammer. Hierbei verdrängt die Pufferlösung oder das Medium die Enzymlösung aus der Kammer. Das Einbringen der Pufferlösung oder des Mediums erfolgt über einen der fluidischen Anschlüsse, wobei beim Übertreten dieser in die Kammer Wirbelströmungen erzeugt werden, welche für eine rasche Durchmischung bzw. Verdrängung sorgen.
In einem Schritt e) erfolgt ein Abführen der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente über einen fluidischen Anschluss, insbesondere über den zweiten fluidischen Anschluss.
Der erste, der dritte und der vierte fluidische Anschluss werden dabei beispielsweise gleichzeitig oder in geeigneter wechselnder Abfolge als Einlass zur Einströmung eines Mediums in die Kammer eingesetzt. Es können dadurch vorteilhafte Strömungsverhältnisse und Wirbelströmungen in der Kammer generiert werden, um alle bzw. möglichst viele der Organoid-Fragmente und Organoid-Zellen aus der Kammer zu entfernen.
Alternativ können die Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente innerhalb der Kammer weiter prozessiert werden.
Es können außerhalb oder innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung weitere Kultivierungs- oder Analyseschritte mit den Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmenten durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform ist es vorteilhaft, wenn über die fluidischen Anschlüsse, insbesondere über den zweiten und/oder dritten und/oder vierten fluidischen Anschluss, weitere Medien, beispielsweise eine Spülflüssigkeit, in die Kammer ein- und ausgelassen werden, insbesondere zur Durchführung von Waschvorgängen, wobei beim Übertreten der weiteren Medien in die Kammer Wirbelströmungen erzeugt werden.
Durch eine Spülflüssigkeit können eventuelle Rückstände des ersten Mediums entfernt und die dreidimensionalen Agglomerate sowie auch die mikrofluidische Vorrichtung gereinigt werden.
In einer Ausführungsform, in welcher ein kombiniertes mechanisches und enzymatisches Splitten der dreidimensionalen Agglomerate erfolgt, ist ein Waschschritt mittels einer Spülflüssigkeit vorteilhaft, da hierdurch an den dreidimensionalen Agglomeraten anhaftende Proteine des ersten Mediums entfernt werden, welche sonst beispielsweise die Enzymreaktion hemmen.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform sind die dreidimensionalen Agglomerate Zellagglomerate, insbesondere Organoide oder Sphäroide und die gesplitteten
Einzelstrukturen sind Zellen, insbesondere Organoid-Zellen oder Sphäroid-Zellen und die Agglomerat-Fragmente sind Zellagglomerat-Fragmente, insbesondere Organoid-Fragmente oder Sphäroid-Fragmente.
Vorteilhaft bei der Verwendung von Zellagglomeraten wie beispielsweise von Organoiden oder Sphäroiden ist, dass deren Viabilität gut erhalten bleibt und somit weitere Kultivierungs- und Expansionsschritte möglich sind.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Steuereinheit, eingerichtet um die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in entsprechenden Einheiten, insbesondere in einer mikrofluidischen Kartusche, auszuführen und/oder anzusteuern, insbesondere durch eine elektrische Aktuation des zumindest einen Ventils und/oder der zumindest einen Pumpe.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, wie beispielsweise in DE102016222072A1 oder DE102016222075A1 beschrieben, umfassend die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung.
Die mikrofluidische Kartusche bildet beispielsweise ein System zur Kultivierung, Expansion, Medikamentenbehandlung und Analyse von Tumor-Organoiden ab.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 : die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung in einer ersten Ausführungsform zur Veranschaulichung der Erzeugung von Wirbelströmungen,
Fig. 2a: die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung in einer zweiten Ausführungsform zur Veranschaulichung des Verfahrensschritts a)
Fig. 2b: die schematische Darstellung gemäß Figur 2a zur Veranschaulichung des Verfahrensschritts b)
Fig. 2c: die schematische Darstellung gemäß Figur 2a zur Veranschaulichung des Verfahrensschritts e),
Fig. 3: die schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Kartusche umfassend die mikrofluidische Vorrichtung gemäß Figur 2a, und
Fig. 4: die schematische Darstellung eines Flussdiagramms eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ausführungsformen der Erfindung in Figur 1 ist die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 in einer ersten Ausführungsform dargestellt. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 umfasst einen ersten fluidischen Anschluss 1 und einen zweiten fluidischen Anschluss 2, welche in eine Kammer 5 münden. Der erste fluidische Anschluss 1 ist an der ersten Seitenfläche 5a der Kammer 5 angeordnet und der zweite fluidische Anschluss 2 ist an der dieser gegenüberliegenden Seitenflächen 5c der Kammer 5 angeordnet. Die fluidischen Anschlüsse 1 , 2 sind orthogonal zu den Seitenflächen 5a, 5c der Kammer 5 ausgerichtet. Der Querschnitt 55 der Kammer 5 ist um das 2- bis 20-fache größer als der Querschnitt 11 des ersten fluidischen Anschlusses 1. Die Kammer 5 weist eine rechteckige Form auf, beispielsweise mit einer Länge und einer Breite von 2 - 15 mm und einer Höhe von 0,75 - 2 mm. Der erste fluidische Anschluss 1 weist beispielsweise Abmessungen von 100 - 750 pm auf, und der zweite fluidische Anschluss 2 weist beispielsweise Abmessungen von 25 - 150 pm auf. Vorteilhaft, jedoch in Figur 1 nicht dargestellt, ist zumindest eine Seitenfläche 5a, 5b, 5c, 5d der Kammer 5 zumindest teilweise transparent ausgeführt.
Figur 1 dient der Veranschaulichung der Erzeugung von Wirbelströmungen 6b. Über den fluidischen Anschluss 1 ist eine Einströmung 6a einer Flüssigkeit in die Kammer 5 dargestellt. Beim Übergang der Flüssigkeit vom fluidischen Anschluss 1 in die Kammer 5 werden Wirbelströmungen 6b erzeugt aufgrund der signifikanten und abrupten Querschnittsveränderung von dem ersten fluidischen Anschluss 1 zur deutlich ausgedehnteren Kammer 5. Die Form und Stärke der generierbaren Wirbelströmungen 6b sind durch die geometrische Ausgestaltung der fluidischen Anschlüsse 1 , 2 und der Kammer 5 sowie durch die Flussrate der Flüssigkeit einstellbar. Über den zweiten fluidischen Anschluss 2 erfolgt die Ausströmung 6c der Flüssigkeit aus der Kammer 5 heraus.
In Figur 2a ist die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 gemäß Figur 1 in einer zweiten Ausführungsform mit zwei weiteren fluidischen Anschlüssen, nämlich einem dritten fluidischen Anschluss 3 und einem vierten fluidischen Anschluss 4 dargestellt. Der dritte fluidische Anschluss 3 ist an der zweiten Seitenfläche 5b der Kammer 5 angeordnet und der vierte fluidische Anschluss 4 ist an der dieser gegenüberliegenden vierten Seitenfläche 5d der Kammer 5 angeordnet. Der dritte 3 und der vierte fluidische Anschluss 4 weisen beispielsweise Abmessungen von 5-75 pm auf. Im Folgenden wird ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels der mikrofluidischen Vorrichtung 10 in der in Figur 2 dargestellten zweiten Ausführungsform beschrieben. Hierbei wird beispielhaft für das mechanische Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten 7 in Einzelstrukturen 9 und/oder Agglomerat-Fragmente 8 das mechanische Splitten von Organoiden 7 in Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid-Fragmente 8 beschrieben.
In einem ersten Schritt a) des mikrofluidischen Verfahrens sind der erste fluidische Anschluss 1 und der zweite fluidische Anschluss 2 geöffnet und der dritte 3 und vierte fluidische Anschluss 4 geschlossen bzw. deren Pumpeinheit ist nicht aktiv. Die Abmessung des ersten fluidischen Anschlusses 1 sind geeignet gewählt, sodass Organoide 7 mit gewünschten Größe passieren können. Die Abmessung des zweiten fluidischen Anschlusses 2 sind im Vergleich dazu geeignet kleiner gewählt, sodass nur dissoziierte bzw. gesplittete Organoid- Fragmente 8 und Organoid-Zellen 9 oder sehr kleine Organoide 7 über diesen aus der Kammer 5 hinausgelangen. Über den ersten fluidischen Anschluss 1 wird über eine nicht dargestellte Pumpeinheit ein erstes Medium mit Organoiden 7 in die Kammer 5 der mikrofluidischen Vorrichtung 10 eingebracht. Das erste Medium ist beispielsweise ein Kultivierungsmedium oder eine Pufferlösung, in welchem die Organoide 7 suspendiert sind. Die Kammer 5 ist beispielsweise bereits befüllt, insbesondere mit dem ersten Medium ohne Organoide. Beim Übertritt des ersten Mediums mit Organoiden 7 von dem ersten fluidischen Anschluss 1 in die Kammer 5 werden die in Figur 1 beschriebenen Wirbelströmungen 6b generiert. Mittels der Wirbelströmung 6b werden die Organoide 7 in der Kammer 5 verteilt. Über den zweiten fluidischen Anschluss 2 kann das erste Medium aus der Kammer 5 abgeführt werden.
Optional erfolgt in einem Schritt a') die Zugabe einer Enzymlösung in die Kammer 5. die Zugabe erfolgt beispielsweise über den dritten fluidischen Anschluss 3 als Einlass und den vierten fluidischen Anschluss 4 als Auslass. Dies geschieht so lange, bis die gewünschte Enzymkonzentration innerhalb der Kammer 5 vorliegt. Die hierbei erzeugten Wirbelströmungen 6b unterstützen die Ausbildung einer homogen verteilten Enzymkonzentration innerhalb der Kammer 5. Die Abmessungen des dritten 3 und des vierten fluidischen Anschluss 4 sind geeignet gewählt, sodass während der Zugabe der Enzymlösung keine Organoide 7, Organoid-Fragmente 8 oder Organoid-Zellen 9 aus der Kammer 5 heraus transportiert werden und verloren gehen. Alternativ sind in den dritten 3 und vierten mikrofluidischen Anschluss 4 Rückhalteelemente wie beispielsweise Mikrofilter oder -siebe integriert, sodass diese auch größere Abmessungen aufweisen können.
In Figur 2b ist ein zweiter Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Es erfolgt beispielsweise in abwechselnder Folge ein geeignet ausgeführtes pulsatiles Hin- und Herbewegen der Enzymlösung mit Organoiden 7 über den dritten 3 und vierten fluidischen Anschluss 4. Der erste 1 und der zweite fluidische Anschluss 2 sind hierbei geschlossen bzw. die mit ihm verbundene Pumpeinheit ist nicht aktiv. Das Hin- und Herbewegen erfolgt insbesondere über zumindest eine Pumpeinheit. Die dabei entstehenden Wirbelströmungen 6b erzeugen zum einen eine Bewegung der Organoide 7 und ggf. Organoid-Fragmente 8 in der Kammer 5 und zum anderen definierte und einstellbare Scherkräfte, die auf die Organoide 7 und Organoid-Fragmente 8 einwirken und das enzymatische Splitten mechanisch unterstützen, sodass es zu einer Dissoziation der Organoide 7 und Organoid-Fragmente 8 kommt.
Für die optische Beobachtung und Kontrolle des Dissoziationsvorgangs der Organoide 7 ist zumindest eine Seitenfläche 5a, 5b, 5c, 5d der Kammer 5 zumindest teilweise transparent ausgeführt.
In einem mit Schritt b) gleichzeitig stattfindenden Schritt c) wird das Innere der Kammer 5 mit den Organoiden 7, Organoid-Fragmenten 8 und Organoid-Zellen 9 beispielsweise mittels einer in den Figuren nicht dargestellten Kontrolleinheit überwacht. Die Kontrolleinheit umfasst beispielsweise ein Mikroskop oder eine mit der Kammer 5 verbundenen Mikroskopeinheit. Die optische Kontrolle erlaubt insbesondere die Entscheidung, wann der gewünschte Dissoziationsgrad der Organoide 7 und Organoid-Fragmente 8 erreicht ist. Dies kann automatisiert durch geeignete Bildauswertungsverfahren erfolgen, beispielsweise durch Erkennung der Abmessungen und Anzahl von Organoiden 7, Organoid- Fragmenten 8 und Organoid-Zellen 9 in der Kammer 5.
Wenn durch die Kontrolleinheit festgestellt wird, dass der gewünschte Dissoziationsgrad der Organoide 7 zu Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid- Fragmenten 8 erreicht ist, so wird der Vorgang des Splittens in einem nicht in Figur 2b dargestellten Schritt d), insbesondere automatisch, gestoppt. Hierzu wird über einen der fluidischen Anschlüsse 1 , 2, 3, 4, insbesondere über den dritten 3 oder den vierten fluidischen Anschluss 4, eine Pufferlösung oder ein Medium, insbesondere ein Kultivierungsmedium, in die Kammer 5 eingebracht, wobei beim Übertreten der Pufferlösung oder des Mediums in die Kammer 5 Wirbelströmungen 6b erzeugt werden. Dadurch wird die Enzymlösung zunächst verdünnt und schließlich aus der Kammer 5 entfernt. Für die Durchführung des Flüssigkeitsaustauschs und evtl, weiterer Waschvorgänge können die fluidischen Anschlüsse 3 und 4 in geeigneter Weise als Ein- bzw. Auslass auch abwechselnd verwendet werden. Die dabei auftretenden Wirbelströmungen 6b in der Kammer 5 unterstützen die Effizienz des Flüssigkeitsaustauschs hinsichtlich verbesserter Durchmischung und Reduktion der benötigten Dauer.
In Figur 2c ist ein weiterer Verfahrensschritt e) dargestellt, in welchem die Organoid-Fragmente 8 und Organoid-Zellen 9 aus der mikrofluidischen Kammer 5 entfernt werden. Das Herausfördern dieser erfolgt über eine Ausströmung 6c über den zweiten fluidischen Anschluss 2. Der erste 1 , der dritte 3 und der vierte fluidische Anschluss 4 werden dabei gleichzeitig oder in geeigneter wechselnder Abfolge als Einlass zur Einströmung 6a einer Pufferlösung bzw. eines Mediums, insbesondere Kultivierungsmediums, in die Kammer 5 eingesetzt. Es können dadurch vorteilhafte Strömungsverhältnisse und Wirbelströmungen 6b in der Kammer 5 generiert werden, um alle bzw. möglichst viele der Organoid- Fragmente 8 und Organoid-Zellen 9 aus der Kammer 5 zu entfernen. Hierbei kann das Innere der optisch zugänglichen Kammer 5 beispielsweise mikroskopisch beobachtet werden, wodurch eine Überwachung sowie eine Optimierung des Herausförderns der Organoid-Fragmente 8 und/oder Organoid- Zellen 9 aus der Kammer 5 erfolgt.
Die erzeugten und herausgeförderten Organoid-Fragmente 8 und/oder Organoid- Zellen 9 stehen anschließend für nachfolgende Kultivierungs- oder Analyseschritte zur Verfügung.
In einer alternativen Ausführungsform werden die Organoid-Fragmente 8 und/oder Organoid-Zellen 9 nicht aus der mikrofluidischen Kammer 5 entfernt, sondern es erfolgen weitere Kultivierungs- oder Analyseschritte innerhalb der Kammer 5.
In Figur 3 ist eine erfindungsgemäße Kartusche 100 dargestellt, welche beispielhaft für alle erfindungsgemäßen Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung 10, eine mikrofluidische Vorrichtung 10 in der zweiten Ausführungsform gemäß Figur 2a umfasst. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 ist beispielsweise auf einem Kunststoffsubstrat bzw. Chip untergebracht.
Figur 4 zeigt ein Flussdiagramm mit einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten 7 zu Einzelstrukturen 9 und/oder Agglomerat-Fragmenten 8, beispielsweise mittels der in den Fig. 2a - 2c dargestellten mikrofluidischen Vorrichtung und den dort beschriebenen Ausführungsbeispielen und Verfahrensschritten.
Figur 4 zeigt einen Schritt a) in welchem ein Zuführen der dreidimensionalen Agglomerate 7 in die Kammer 5 der mikrofluidischen Vorrichtung 10 erfolgt. In einem optionalen Schritt a') wird eine Enzymlösung in die Kammer 5 zugegeben zur enzymatischen Unterstützung eines in Schritt b) erfolgenden mechanischen Splittens. Hierbei wird das Medium bzw. die Enzymlösung mit den dreidimensionalen Agglomeraten 7 pulsatil hin- und herbewegt, sodass Wirbelströmungen 6b ausgebildet werden. Insbesondere gleichzeitig erfolgt in Schritt c) eine Ermittlung des Dissoziationsgrades der dreidimensionalen Agglomerate 7 zu Einzelstrukturen 9 und/oder Agglomerat-Fragmenten 8 mittels einer Kontrolleinheit. In Schritt d) erfolgt ein Stoppen des Vorgangs des Splittens, wenn durch die Kontrolleinheit festgestellt wird, dass der gewünschte Dissoziationsgrad erreicht ist. In einem Schritt e) werden die Einzelstrukturen 9 und Agglomerat-Fragmente 8 wieder aus der Kammer 5 herausgeführt.

Claims

Ansprüche
1. Mikrofluidisches Verfahren (500) zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten (7) zu Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmenten (8) mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6 bis 15 mit folgenden Schritten: a) Zuführen eines ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten (7) in eine Kammer (5) über einen ersten fluidischen Anschluss (1), wobei beim Übertreten des ersten Mediums aus dem ersten fluidischen Anschluss (1) in die Kammer (5) Wirbelströmungen (6b) erzeugt werden, b) pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten (7), insbesondere mittels einer Pumpeinheit, über den ersten (1) und einen zweiten fluidischen Anschluss (2) und/oder über einen dritten (3) und vierten fluidischen Anschluss (4), sodass Wirbelströmungen (6b) erzeugt werden, aufgrund welcher die dreidimensionalen Agglomerate (7) mechanisch gesplittet werden.
2. Verfahren (500) nach Anspruch 1 , wobei in einem dem Schritt a) nachfolgenden Schritt a') eine Enzymlösung über einen fluidischen Anschluss (1 ,
2, 3, 4), insbesondere über den dritten (3) und/oder vierten fluidischen Anschluss (4), zugegeben wird, sodass beim Übertreten der Enzymlösung aus dem fluidischen Anschluss (1 , 2, 3, 4) in die Kammer (5) Wirbelströmungen (6b) erzeugt werden und wobei in Schritt b) die Enzymlösung pulsatil hin- und herbewegt wird.
3. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Dissoziationsgrad der dreidimensionalen Agglomerate (7) zu Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmenten (8) während des Splittens mittels einer Kontrolleinheit ermittelt wird, insbesondere durch ein Bildauswertungsverfahren, und wobei der Vorgang des Splittens gestoppt wird, insbesondere automatisch, wenn durch die Kontrolleinheit festgestellt wird, dass der gewünschte Dissoziationsgrad erreicht ist
4. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Splitten gestoppt wird durch Einbringen einer Pufferlösung oder eines Mediums, über einen der fluidischen Anschlüsse (1 , 2, 3, 4), in die Kammer (5), wobei beim Übertreten der Pufferlösung oder des Mediums in die Kammer (5) Wirbelströmungen (6b) erzeugt werden.
5. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Agglomerate (7) Zellagglomerate, insbesondere Organoide (7) oder Sphäroide sind und wobei die gesplitteten Einzelstrukturen (9) Zellen, insbesondere Organoid- Zellen (9) oder Sphäroid-Zellen sind und wobei die Agglomerat-Fragmente (8) Zellagglomerat-Fragmente, insbesondere Organoid-Fragmente (8) oder Sphäroid-Fragmente sind.
6. Mikrofluidische Vorrichtung (10) zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten (7) zu Einzelstrukturen (8) und/oder Agglomerat-Fragmenten (9), umfassend eine Kammer (5) mit einem ersten fluidischen Anschluss (1), welcher an einer ersten Seitenfläche (5a) der Kammer (5) angeordnet ist, und einem zweiten fluidischen Anschluss (2), welcher zu dem ersten fluidischen Anschluss (1) insbesondere gegenüberliegend an einer dritten Seitenfläche (5c) der Kammer (5) angeordnet ist, wobei der Querschnitt der Kammer (5) um das 2- bis 20-fache größer ist, als der Querschnitt des ersten fluidischen Anschlusses (1), sodass Wirbelströmungen (6b) für das Splitten erzeugbar sind.
7. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 6, wobei der erste fluidische Anschluss (1) Abmessungen von 100 - 700 pm aufweist, und wobei der zweite fluidische Anschluss (1) Abmessungen von 25 - 150 pm aufweist.
8. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei die Kammer (5) desweiteren einen dritten (3) und einen, insbesondere diesem gegenüberliegenden, vierten fluidischen Anschluss (4) umfasst, wobei der Querschnitt der Kammer (5) um das 2- bis 20-fache größer ist als der Querschnitt des dritten (3) und des vierten fluidischen Anschlusses (4), sodass Wirbelströmungen (6b) erzeugbar sind.
9. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 8, wobei dritte (3) und der vierte fluidische Anschluss (4) ein integriertes Rückhalteelement und/oder Abmessungen von 5 - 75 pm aufweisen.
10. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 8 oder 9, wobei der dritte fluidische Anschluss (3) an einer quer zu der ersten (5a) und dritten Seitenfläche (5c) der Kammer (5) liegenden zweiten Seitenfläche (5b) angeordnet ist, und wobei der vierte fluidische Anschluss (4) an einer der zweiten Seitenfläche (5b) gegenüberliegenden vierten Seitenfläche (5d) der Kammer (5) angeordnet ist.
11 . Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6-10, wobei die Kammer (5) eine rechteckige Form aufweist, insbesondere mit einer Länge und einer Breite von 2 - 15 mm und einer Höhe von 0,75 - 2 mm
12. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6-11 , wobei die fluidischen Anschlüsse (1 , 2, 3, 4) orthogonal zu den Seitenflächen (5a, 5b, 5c, 5d) der Kammer (5) ausgerichtet sind.
13. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6-12, wobei zumindest eine Seitenfläche (5a, 5b, 5c, 5d) der Kammer (5) zumindest teilweise transparent ausgeführt ist, und insbesondere ein transparentes Polymer, beispielsweise ein Cycloolefin-Copolymer (COC), ein Polycarbonat (PC), ein Polymethylmethacrylat (PMMA), ein Polystyrol (PS) oder ein Glas umfasst.
14. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6-13, wobei die mikrofluidische Vorrichtung (10) eine Kontrolleinheit umfasst, insbesondere eine mikroskopische Kontrolleinheit.
15. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6-14, umfassend weiterhin ein Reservoir mit einer für das Splitten vorgelagerten Enzymlösung, insbesondere umfassend Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym, wobei das Reservoir mit dem dritten (3) und/oder vierten fluidischen Anschluss (4) in fluidischer Verbindung steht.
16. Kartusche (100), insbesondere mikrofluidische Kartusche, umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6-15.
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