EP4630025A1 - Extrait d'algue du genre ulva pour le traitement de troubles induits par un syndrome metabolique - Google Patents

Extrait d'algue du genre ulva pour le traitement de troubles induits par un syndrome metabolique

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Publication number
EP4630025A1
EP4630025A1 EP23836552.2A EP23836552A EP4630025A1 EP 4630025 A1 EP4630025 A1 EP 4630025A1 EP 23836552 A EP23836552 A EP 23836552A EP 4630025 A1 EP4630025 A1 EP 4630025A1
Authority
EP
European Patent Office
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extract
ulva
algae
mass
use according
Prior art date
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Pending
Application number
EP23836552.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Amandine Adrien
Ingrid ARNAUDIN
Stanislas Baudouin
Justine Bodin
Nicolas BRIDIAU
Julien CHERFAN
Anne-Laure DINEL
Delphine DUFOUR
Xavier FIORAMONTI
Sophie LAYE
Hugo Martin
Thierry MAUGARD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
La Rochelle Universite
Universite de Bordeaux
Institut Polytechnique de Bordeaux
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Institut Polytechnique de Bordeaux
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Universite de la Rochelle
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Bordeaux, Institut Polytechnique de Bordeaux, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement, Universite de la Rochelle filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4630025A1 publication Critical patent/EP4630025A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/05—Chlorophycota or chlorophyta (green algae), e.g. Chlorella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the subject of the present invention is an extract of algae of the genus Ulva and its use in human and animal nutrition, for the treatment of disorders induced by a metabolic syndrome, preferably inflammation, and cognitive and/or emotional disorders.
  • the present invention also relates to food supplements and food compositions comprising an extract of algae of the Ulva genus.
  • obesity induced by a high-fat diet is characterized by low-grade inflammation, and also insulin resistance, oxidative stress and mitochondrial dysfunctions.
  • This low-grade inflammation is to be distinguished from inflammation, in that low-grade inflammation is a low-noise, asymptomatic and chronic intracellular physiopathological mechanism. This chronic phenomenon leads to cellular, tissue, organic and functional damage.
  • inflammation refers to adaptive physiological changes which aim to stop the progression of tissue damage, isolate and eliminate infectious agents and activate the repair processes necessary to restore the organism to its initial state (Baumann and Gauldie, 1994).
  • algae are of growing interest for this market, in demand for new products of natural origin. Indeed, if they have been valued for decades, mainly as a source of food, for the texturizing properties of the polysaccharides they produce or, more recently, for their dermo-cosmetic properties, marine macroalgae, in particular, present a large diversity of molecules that are still little studied.
  • the protein content is between 5 and 60% by mass, preferably between 15 and 50% by mass, preferably between 25 and 35% by mass, relative to the total dry mass of the extract,
  • the content of total phenolic compounds is between 0.5 and 40% by mass, preferably between 1 and 20% by mass, preferably between 1 and 10% by mass, relative to the total dry mass of the extract,
  • the total sugar content is between 0.5 and 80% by mass, preferably between 1 and 50% by mass, preferably between 5 and 15% by mass, relative to the total dry mass of the extract.
  • the extract of algae of the Ulva genus according to the invention has a total sugar content of between 5 and 15% by mass relative to the total dry mass of the extract.
  • an extract of algae of the genus Ulva has anti-inflammatory properties, preferably against low-grade inflammation and makes it possible to protect against a deterioration of cognitive abilities and a emotional alteration induced by metabolic syndrome
  • the modulation of the protein signaling pathways involved in inflammation by the extract according to the invention was evaluated.
  • the inventors have demonstrated that the extract according to the invention induces a drastic reduction in the expression of the NLRP3 and iNOS proteins, involved in the inflammatory process in Raw 264.7 macrophages in culture.
  • the present invention also relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use for the treatment of inflammation.
  • the inflammation is inflammation induced by a metabolic syndrome.
  • the anxiety-like behavior of the animals was evaluated using the elevated cross maze test.
  • mice were also tested in the Morris water maze in order to evaluate the chronic effects of the treatment on memory.
  • supplementation with extract according to the invention makes it possible to restore the cognitive abilities of animals on a HFD diet. Indeed, they discriminate the target quadrant in a statistically significant way compared to chance (p ⁇ 0.05).
  • the extract according to the invention makes it possible to protect against a deterioration of cognitive abilities and emotional alteration induced by a metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use for the treatment of cognitive and/or emotional disorders induced by a metabolic syndrome.
  • the cognitive and emotional disorders are chosen from hippocampal-dependent long-term memory disorders and anxiety-type disorders.
  • the present invention also relates to a food supplement or a food composition for humans or pets comprising an extract of algae of the Ulva genus according to the invention.
  • the algae extract according to the invention can be used in human nutrition but also in animal nutrition.
  • FIG. 1 shows the effect of fraction P on the viability of Raw 264.7 murine macrophages in culture, after 24 h of incubation (A) or after 6 h of pre-incubation then 18 h of incubation in the presence of LPS (1 pg/ml) (B).
  • the results express the percentage relative mean of viable macrophages compared to control conditions (100%) ⁇ SEM.
  • FIG. 2 shows the effect of fraction P on the secretion of nitric oxide (NO) by Raw 264.7 murine macrophages in culture, after 24 h of incubation (A) or after 6 h of pre-incubation then 18 h of incubation in the presence of LPS (1 ⁇ g/ml) (B).
  • the results express the concentration of NO secreted in the culture medium ⁇ ETM.
  • FIG. 3 shows the effect of fraction P on the respective expression of the NLRP3 (A) and iNOS (B) proteins, by Raw 264.7 murine macrophages in culture, after 6 h of pre-incubation then 18 h of incubation in the presence of LPS.
  • the results express the expression level of the target proteins ⁇ ETM, related to the expression level of p-actin, as a housekeeping protein.
  • FIG. 4 shows the effect of fraction P on the secretion of TNF-a and IL-6 by Raw 264.7 murine macrophages in culture, after 24 h of incubation (A, C) or after 6 h of pre- incubation then 18 h of incubation in the presence of LPS (B, D).
  • the results express the concentration of TNF-a and IL-6 secreted in the culture medium ⁇ ETM.
  • FIG. 5 shows the effect of P fraction supplementation on the metabolic parameters of obese and diabetic animals fed an HFD diet: body weight (A), lean mass (B) and fat mass (C) of C57BL/6J mice fed with an HFD or standard A04 diet for 16 weeks and supplemented for the last 4 weeks with fraction P solution at 1 mg/ml in drinking water or with water (controls).
  • FIG. 6 shows the effect of P fraction supplementation on the duration of exploration of the anxiogenic open arms (BO) of the elevated cross maze, in obese and diabetic animals fed with an HFD diet: C57BL/6J mice fed with a HFD or standard A04 diet for 16 weeks and supplemented for the last 4 weeks with fraction P solution at 1 mg/ml in drinking water or with water (controls).
  • FIG. 7 shows the schematic representation of the Morris water maze behavioral test protocol.
  • the extract of algae of the genus Ulva is characterized by a protein content of between 5 and 60% by mass relative to the total dry mass of the extract, preferably between 25 and 35% by mass relative to the total dry mass of the extract and preferably, the protein content is between 28 and 32% by mass, more preferably approximately 30% by mass relative to the mass total dryness of the extract.
  • the content of total phenolic compounds can be measured by any method known to those skilled in the art. As an illustration, we will cite the method of Singleton and Rossi (Singleton VL, Rossi JA. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic. 1965 Jan 1;16(3):144), with some modifications . Total sugar content
  • the extract of algae of the genus Ulva is characterized by a total sugar content of between 0.5 and 80% by mass relative to the total dry mass of the extract, preferably comprised between 5 and 15% by mass relative to the total dry mass of the extract and preferably, the total sugar content is approximately 10% by mass, relative to the total dry mass of the extract.
  • the protein content is approximately 30% by mass relative to the total dry mass of the extract
  • the content of total phenolic compounds is approximately 4% by mass relative to the total dry mass of the extract
  • the total sugar content is approximately 10% by mass relative to the total dry mass of the extract.
  • the term "approximately”, when referring to a number or numerical range, means that the number or numerical range in question is an approximation within the limits of experimental variability (or within the limits of statistical experimental error), and therefore the number or numerical range may vary between 1% and 15% of the indicated number or numerical range.
  • using “about X” encompasses +/-1 percent, 2 percent, 3 percent, 4 percent, 5 percent, 6 percent, 7 percent, 8 percent, 9 percent , 10 percent, 11 percent, 12 percent, 13 percent, 14 percent and 15 percent of the X value.
  • the algae of the genus Ulva are ulvae, multicellular green algae distributed in the oceans with approximately 400 species.
  • the alga of the genus Ulva is chosen from all the species of the genus Ulva, preferably from the group consisting of the species Ulva lactuca, Ulva rigida, Ulva fasciata, Ulva pertusa, Ulva californica , Ulva gigantea, Ulva pseudocurvata, Ulva conglobata, Ulva armoricana, Ulva fasciculata, Ulva ohnoi, Ulva pseudolinza, Ulva reticulata, Ulva rotundata, Ulva elegans, Ulva prolifera, Ulva scandinavica, Ulva umbilicata, Ulva flexuosa, Ulva clathrata, Ulva compressa and Ulva intestinalis.
  • the alga of the Ulva genus is chosen from Ulva lactuca, Ulva rigida, Ulva conglobata, Ulva ohnoi, Ulva reticulata, Ulva prolifera, Ulva flexuosa and Ulva intestinalis.
  • the algae of the Ulva genus is Ulva lactuca or Ulva rigida.
  • the algae is a mixture of algae of the genus Ulva lactuca and Ulva rigida.
  • the extract of algae of the Ulva genus according to the invention can be obtained by the process described below.
  • the present invention also relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use in the treatment of disorders induced by metabolic syndrome.
  • metabolic syndrome usually designates energy metabolism disorders (fasting hyperglycemia, insulin resistance, hypertension, hypertriglyceridemia, accumulation of visceral fat, low plasma level of HDL cholesterol) associated with obesity or overweight. We speak of metabolic syndrome when at least three of the abnormalities listed above are present.
  • a metabolic syndrome induces low-grade inflammation and also causes a deterioration of cognitive abilities and/or emotional impairment.
  • the disorders induced by a metabolic syndrome are chosen from inflammation, preferably low-grade inflammation or inflammation induced by a metabolic syndrome and cognitive and/or emotional disorders.
  • the present invention also relates to a method for the treatment of disorders induced by a metabolic syndrome, comprising the administration of an algal extract according to the invention to a mammal in need thereof.
  • the present invention also relates to the use of an algae extract according to the invention for obtaining a medication intended for the treatment of disorders induced by a metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition comprising an algae extract according to the invention for its use for the treatment of disorders induced by a metabolic syndrome.
  • the present invention relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use in the treatment of inflammation.
  • the inventors have advantageously demonstrated, on reference models in metabolic diseases, the anti-inflammatory effect of the extract according to the invention with respect to the production of NO and the expression of proteins. keys involved in the signaling cascades linked to the inflammatory process (NLRP-3 and iNOS), and the secretion of pro-inflammatory cytokines.
  • This anti-inflammatory effect is an effect against inflammation induced by metabolic syndrome.
  • the present invention relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use in the treatment of inflammation induced by metabolic syndrome.
  • Inflammation is described as the succession of modifications occurring in living tissue when it is damaged (Punchard et al., 2004).
  • the inflammatory response corresponds to the local component of a set of host defense mechanisms grouped under the name of acute phase reaction. This term designates the adaptive physiological modifications which aim to stop the progression of tissue damage, to isolate and eliminate infectious agents and to activate the repair processes necessary for the restoration of the initial state of the organism ( Baumann and Gauldie, 1994).
  • the present invention relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use in the treatment of low-grade inflammation.
  • the present invention relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use in the treatment of low-grade inflammation induced by metabolic syndrome.
  • the present invention relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use for the improvement of at least one symptom or disorder associated with a metabolic syndrome.
  • the present invention relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use in the treatment of inflammation induced by obesity or overweight.
  • the present invention relates to an extract of algae of the genus Ulva according to the invention for its use in the treatment of low-grade inflammation induced by obesity or overweight.
  • Obesity and overweight can in particular be determined by calculating the body mass index (BMI).
  • BMI is obtained by calculating the ratio between weight and height squared. For example, a person measuring 1.62 m and weighing 55 kg has a BMI equal to 20 (that is to say: 55/1.62 2 ). Generally speaking, a person is said to have a normal weight when their IMG is between 18 and 25 kg/ m2 , to be overweight when their IMG is between 25 and 30 kg/ m2 , and to be obese if their IMG exceeds 30 kg/ m2 .
  • the present invention also relates to a method for the treatment of inflammation, comprising administering an algal extract according to the invention to a mammal in need thereof.
  • the present invention also relates to a method for the treatment of inflammation induced by a metabolic syndrome, comprising the administration of an algal extract according to the invention to a mammal in need thereof.
  • the present invention also relates to a method for the treatment of low-grade inflammation induced by metabolic syndrome, comprising the administration of an algal extract according to the invention to a mammal in need thereof.
  • the present invention also relates to a method for improving at least one symptom or disorder associated with a metabolic syndrome, comprising the administration of an algal extract according to the invention to a mammal in need thereof.
  • the present invention also relates to a method for the treatment of inflammation induced by obesity or overweight, comprising the administration of an algal extract according to the invention to a mammal in need thereof.
  • the present invention also relates to a method for the treatment of low-grade inflammation induced by obesity or overweight, comprising the administration of an algal extract according to the invention to a mammal in need thereof. .
  • the present invention also relates to the use of an algae extract according to the invention for obtaining a medication intended for the treatment of inflammation.
  • the present invention also relates to the use of an algae extract according to the invention for obtaining a medication intended for the treatment of inflammation induced by metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to the use of an algae extract according to the invention for obtaining a medication intended to improve at least one symptom or disorder associated with a metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to the use of an algae extract according to the invention for obtaining a medication intended for the treatment of inflammation induced by obesity or overweight.
  • the present invention also relates to the use of an algae extract according to the invention for obtaining a medication intended for the treatment of low-grade inflammation induced by obesity or overweight,
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition
  • a pharmaceutical or veterinary composition comprising an algae extract according to the invention for its use for the treatment of inflammation.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition
  • a pharmaceutical or veterinary composition comprising an algae extract according to the invention for its use for the treatment of inflammation induced by metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition
  • a pharmaceutical or veterinary composition comprising an algae extract according to the invention for its use for the improvement of at least one symptom or disorder associated with a metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition comprising an algae extract according to the invention for its use for the treatment of inflammation induced by obesity or overweight.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition comprising an algae extract according to the invention for its use for the treatment of low-grade inflammation induced by obesity or overweight.
  • the extract according to the invention makes it possible to protect against a deterioration of cognitive abilities and/or emotional alteration induced by a metabolic syndrome.
  • the extract according to the invention protects against the onset of anxiety-type disorders induced by the HFD diet and that it makes it possible to restore the cognitive capacities of animals fed with a diet HFD.
  • the present invention also relates to an algae extract according to the invention for the treatment of cognitive and/or emotional disorders induced by metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to an algae extract according to the invention for the treatment of cognitive and/or emotional disorders induced by obesity or overweight.
  • the present invention relates to an algae extract according to the invention for the treatment of hippocampo-dependent long-term memory disorders and/or anxiety-type disorders.
  • the present invention relates to an algae extract according to the invention for the treatment of hippocampo-dependent long-term memory disorders and/or anxiety-type disorders, induced by a metabolic syndrome.
  • the present invention relates to an algae extract according to the invention for the treatment of hippocampo-dependent long-term memory disorders and/or anxiety-type disorders, induced by obesity or overweight.
  • the extract according to the invention restores episodic memory, hippocampus-dependent spatial working memory, affected during the development of metabolic syndrome, this metabolic disease being characterized by the establishment of inflammation and peripheral and central insulin resistance.
  • the present invention relates to an algae extract according to the invention for the restoration of episodic memory, hippocampus-dependent spatial working memory.
  • the present invention also relates to a method of treating cognitive and/or emotional disorders induced by a metabolic syndrome comprising the administration of an algal extract according to the invention to a mammal in need thereof.
  • the present invention also relates to the use of an algae extract according to the invention for obtaining a medication intended for the treatment of cognitive and/or emotional disorders induced by metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition
  • a pharmaceutical or veterinary composition comprising an algae extract according to the invention for its use for the treatment of cognitive and/or emotional disorders induced by metabolic syndrome.
  • the extract according to the invention may be present in the form of a pharmaceutical or veterinary composition, a food supplement, a food composition for humans or animals as defined below.
  • treatment or “treatment method” are not absolute terms and, when applied to disorders induced by a metabolic syndrome preferentially to inflammation or to cognitive and/or emotional disorders induced by a metabolic syndrome, designate a procedure or an action plan designed, even with a low probability of success, to induce an overall beneficial effect such as delaying the appearance of the pathology, or reducing the severity of a or more symptoms.
  • treatment may involve reducing the low-grade inflammatory response.
  • inflammation induced by metabolic syndrome treatment may involve the reduction of cognitive and/or emotional disorders.
  • treatment can be understood as improving memory abilities and/or reducing anxiety.
  • the expressions “induced by a metabolic syndrome” and “associated with a metabolic syndrome” can be used interchangeably.
  • the invention aims at the use of an algae extract according to the invention for the improvement of at least one symptom associated with a metabolic syndrome, in which said improvement comprises the reduction low-grade inflammation, reduction of cognitive and/or emotional disorders, improvement of memory abilities and/or reduction of anxiety.
  • the mammal is chosen from humans and pets.
  • the algae extract according to the invention can in fact be used in human nutrition but also in animal nutrition.
  • the mammal is a human.
  • the mammal is a pet animal such as a dog or a cat.
  • the algae extract according to the invention may be administered in the form of a pharmaceutical or veterinary composition comprising, in addition to the algae extract, a pharmaceutically acceptable excipient.
  • pharmaceutically acceptable is meant a substance which is not biologically or otherwise undesirable, that is to say which can be incorporated into a pharmaceutical composition administered to a patient or an animal without causing biological effects. undesirable or without interacting in a deleterious manner with one of the other components of the composition in which it is contained, for example by inhibiting or reducing the anti-inflammatory properties of the algae extract.
  • the pharmaceutically acceptable excipient may be chosen from a diluent, a disintegrant, a binder, a gliding agent, a lubricating agent, a wetting agent, a buffering agent, a suspending agent, an adjuvant, an emulsifier , an absorbent, a preservative, a surfactant, a sweetening agent, an antioxidant, or a mixture thereof.
  • a diluent a disintegrant, a binder, a gliding agent, a lubricating agent, a wetting agent, a buffering agent, a suspending agent, an adjuvant, an emulsifier , an absorbent, a preservative, a surfactant, a sweetening agent, an antioxidant, or a mixture thereof.
  • the quantity of the algal extract according to the invention in the compositions can vary so as to administer an effective quantity of the algal extract to obtain the desired therapeutic response for a particular mammal.
  • effective amount or “therapeutically effective amount” of a compound is meant a non-toxic but sufficient quantity of the compound to provide the desired effect.
  • the quantity administered or dose depends on the activity of the algae extract according to the invention, the route of administration, the severity of the pathology, as well as the state of health. and medical history of the treated mammal, various factors such as body weight, diet, possible combination with other therapeutic agents. However, it is within the competence of those skilled in the art to determine the appropriate dosage and to initiate treatment at a dosage lower than that required to obtain the desired therapeutic effect and then to gradually increase the dose until the the desired effect is obtained.
  • the algae extract can be administered orally.
  • pharmaceutical or veterinary compositions may be in the form of food supplements intended for humans or pets or food compositions for humans or pets.
  • the present invention also relates to the use of a pharmaceutical or veterinary composition for its use in therapeutic applications as described above.
  • the algae extract according to the invention can be obtained according to the steps of the process described in patent FR 2 998 894 from the company SEPROSYS, which describes a process for treating algae comprising:
  • the inventors advantageously discovered that the permeate obtained by implementing such a process on algae of the Ulva genus had anti-inflammatory properties.
  • the permeate has anti-inflammatory properties in a context of metabolic syndrome.
  • the present invention also relates to a process for obtaining an extract of algae of the genus Ulva comprising the steps: - grinding algae
  • the present invention also relates to a process for obtaining an extract of algae of the genus Ulva comprising the steps:
  • algae extract presenting anti-inflammatory properties means an algae extract making it possible to:
  • the anti-inflammatory properties are anti-inflammatory properties in a context of metabolic syndrome.
  • these parameters can be measured on reference models in metabolic diseases, such as a Raw 264.7 murine macrophage cell line provided by ATCC Cell (“American Type Culture Collection”): code ATCC-TIB-71.
  • the algae grinding step makes it possible to obtain algae particles with a diameter of less than 10 mm, preferably less than 5 mm, preferably less than 2 mm.
  • the algae can be crushed in demineralized water, at a temperature between 25 and 100° C., preferably between 40 and 90° C., preferably between 55 and 75° C., and preferably at a temperature around 65°C.
  • Any utensil known to those skilled in the art can be used to grind the algae, typically a knife grinder.
  • the process may include a step prior to grinding, washing the algae, typically in raw water for 10 min at room temperature, followed by spinning.
  • the algae extraction or diffusion step is carried out at a temperature of between 25 and 100°C, preferably between 40 and 90°C and preferably, at a temperature of approximately 80°C. °C.
  • the duration of the algae extraction or diffusion step is between 15 min and 5 h, preferably between 1 h and 4 h, preferably between 1 h and 3 h. According to a preferred embodiment, the duration of the extraction step is approximately 2 hours.
  • the extraction step is carried out in a reduced volume of water.
  • the extraction is carried out with constant stirring.
  • the extraction is carried out with constant stirring using a paddle stirrer, at a rotation speed of 10 rpm.
  • the extraction step makes it possible to obtain an aqueous extract and algae pulps.
  • the aqueous extract obtained following the extraction is filtered.
  • the filtration steps can be carried out according to the process described in patent FR 2 998 894 from the company SEPROSYS.
  • the process includes the steps:
  • the aqueous extract obtained after the extraction step may undergo a first filtration step and be filtered using a vibrating sieve having a cut-off threshold of 50 ⁇ m. This stage of filtration of the aqueous extract makes it possible to eliminate algae residues.
  • the pulps obtained after the extraction step are pressed.
  • This step advantageously makes it possible to obtain pressing juice on the one hand and pressing pulps on the other hand, and to extract as much juice as possible.
  • the pressing juice is added to the aqueous extract.
  • the process comprises, following the first filtration step, three additional filtration steps.
  • the method according to the invention comprises a first microfiltration step.
  • a microfiltration unit of the plate filter type equipped with two filters of 1.2 pm then 0.8 pm (3M, 40*40, pore size 15 HN and 50 HN) could be used.
  • the microfiltration step makes it possible to obtain, from the pressing juice, a retentate on the one hand and a permeate on the other hand.
  • the permeate obtained following the microfiltration step can be filtered via an ultrafiltration unit.
  • the method according to the invention comprises an ultrafiltration step.
  • the method according to the invention comprises a step of ultrafiltration of the permeate obtained following microfiltration so as to obtain a retentate on the one hand and a permeate on the other hand.
  • the ultrafiltration step is carried out between 60 and 100°C, preferably at around 80°C, at a pressure of between 2 and 10 bars, preferably at around 5 bars and at a flow rate circulation of between 300 l/h and 600 l/h, preferably at 450 l/h.
  • the ultrafiltration step is carried out until a retentate of approximately 4 Bx is obtained.
  • Bx or Brix corresponds to approximately 4% of dry matter measured by the refractive index and expressed in degree brix sucrose scale.
  • the retentate can be withdrawn from the unit and the permeate can be recovered and then osmized in a reverse osmosis unit.
  • ultrafiltration could be carried out on an ultrafiltration unit equipped with a Kerasep KBW 15 kDa type membrane (Novasep Process).
  • the process according to the invention comprises a reverse osmosis step.
  • the process according to the invention comprises a step of reverse osmosis of the ultrafiltration permeate.
  • the reverse osmosis step is carried out between 20 and 50°C, preferably between 25 and 40°C and preferably, the reverse osmosis step is carried out at approximately 30°C. C, at a pressure of between 10 and 50 bars, preferably between 20 and 30 bars and at a circulation flow rate of between 80 l/h and 150 l/h, preferably at 120 l/h.
  • the reverse osmosis step could be carried out on a reverse osmosis unit equipped with a SW 30 HR (Dow) type membrane.
  • the reverse osmosis step is continued until a retentate of approximately 13 Bx corresponding to the osmosis ultrafiltration permeate is obtained.
  • 13 Bx or Brix corresponds to approximately 13% of dry matter measured by the refractive index and expressed in degree brix sucrose scale.
  • the osmosis ultrafiltration permeate obtained will undergo a drying step, for example by freeze-drying.
  • the fraction obtained of the osmosis ultrafiltration permeate type will hereinafter be referred to as the algae extract of the genus Ulva according to the invention or else permeate or even “fraction P”.
  • the process for obtaining an extract of algae of the genus Ulva comprises the following steps: a) Washing the algae to be treated b) Grinding the washed algae c) Extraction with water from the algae washed in a reduced volume of water d) Filtration of the pulps recovered after step c) then pressing the pulps so as to obtain a pressing juice on the one hand and pressing pulps on the other hand e) Microfiltration of the pressing juice obtained in step d) so as to obtain a retentate on the one hand and a permeate on the other hand f) Ultrafiltration of the microfiltration permeate obtained in step e) so as to obtain a retentate d on the one hand and a permeate on the other hand g) Reverse osmosis of the ultrafiltration permeate obtained in step f) h) Lyophilization of the osmosis ultrafiltration permeate obtained in step g).
  • the algae extract obtained by the process and having anti-inflammatory properties has the following characteristics: a protein content of approximately 30%, an average content of total phenolic compounds of about 4% and about 10% total sugars.
  • the present invention also relates to a food supplement comprising an extract of algae of the Ulva genus according to the invention.
  • the algae extract of the Ulva genus is as defined above.
  • the term “food supplement” means foodstuffs whose purpose is to supplement a normal diet and which constitute a concentrated source of nutrients or other substances having a nutritional or physiological effect.
  • the food supplement comprises, in addition to the algae extract according to the invention, at least one ingredient chosen from nutrients such as vitamins and minerals, plants and/or plant extracts , substances for nutritional or physiological purposes, food adjuvants or additives such as colorings, flavorings, preservatives.
  • the food supplement may also include all of the pharmaceutically acceptable excipient as previously defined.
  • the food supplement according to the invention can be presented in any form compatible with oral absorption in one or more daily doses. It may be presented in particular in the form of capsules, tablets, lozenges or loose powder, the latter being preferably packaged in single sachets.
  • the food supplement comprising an extract of the Ulva genus according to the invention in a food supplement, intended for the overweight or obese patient, but also for the overweight or obese pet.
  • the food supplement intended for humans is in the form of unit doses, for example in the form of capsules, capsules, tablets, lozenges or loose powder packaged in unit sachets , each unit dose comprising between 0.05 g and 2 g of algae extract according to the invention, preferably between 0.1 and 1 g, and more preferably between 0.2 and 0.8 g.
  • the food supplement intended for pets is in the form of unit doses, for example in the form of loose powder packaged in unit sachets, each unit dose comprising between 0.01 g and 2 g of algae extract according to the invention, preferably between 0.025 and 1.5 g, and more preferably between 0.03 and 1 g.
  • the extract according to the invention exhibits significant activity at very low concentrations.
  • the present invention also relates to the use of a food supplement for its use in therapeutic applications as described above.
  • the algae extract according to the invention can be integrated into any food composition intended for human consumption. Also, the algae extract according to the invention can be integrated into drinks, meal replacements, biscuits, cereals, desserts, milk preparations, etc.
  • the present invention also relates to an algae extract in the form of a food composition for humans, characterized in that the food composition for humans is in a form chosen from drinks, meal replacements, biscuits , cereals, desserts, milk preparations.
  • the present invention also relates to a food composition for pets comprising an extract of algae of the genus Ulva according to the invention.
  • these food compositions are not intended to be limited to a specific list of ingredients as these ingredients will depend on factors such as, for example, the nutritional balance desired for the specific type of pet, and availability ingredients.
  • the pet food composition may generally include vitamins, minerals and other additives such as flavors, preservatives, emulsifiers and humectants.
  • the nutritional balance including the relative proportions of the algae extract according to the invention and the other ingredients, is determined according to the dietary standards known in the veterinary art. For example, the nutritional balance of a food composition for cats is determined based on the known dietary needs of cats.
  • the present invention also relates to an algae extract in the form of a food composition for pets, characterized in that the food composition further comprises vitamins, minerals and other additives such as flavorings, preservatives , emulsifiers and humectants.
  • the food composition comprising an extract of the Ulva genus according to the invention in a food composition intended for overweight or obese pets.
  • the present invention also relates to the use of a food composition for its use in therapeutic applications as described above.
  • Example 1 Production and characterization of an extract of algae of the genus Ulva
  • This method corresponds to an adaptation of the extraction and fractionation process described in patent FR2998894B1 from the company Seprosys, making it possible to purify protein and polysaccharide fractions from green marine macroalgae.
  • the process comprises the succession of the following steps: a) Washing the algae to be treated b) Grinding the washed algae c) Diffusion with water of the washed algae in a reduced volume of water d) Filtration of the pulps recovered after the step c) then pressing the pulps so as to obtain a pressing juice on the one hand and pressing pulps on the other hand e) Microfiltration of the pressing juice obtained in step d) so as to obtain a retentate d on the one hand and a permeate on the other hand f) Ultrafiltration of the microfiltration permeate obtained in step e) so as to obtain a retentate on the one hand and a permeate on the other hand g) Reverse osmosis of the ultrafiltration permeate obtained in step f) h) Lyophilization of the osmosis ultrafiltration permeate obtained in step g).
  • the aqueous extract is then filtered using a vibrating sieve having a cut-off threshold of 50 ⁇ m (stainless steel cloth, NEGOFILTRE), in order to eliminate algae residues.
  • the algae pulps are removed from the tank then pressed using a press (60 hl/h), in order to extract as much juice as possible.
  • the juice from the press is then combined with the initial filtered aqueous extract and approximately 15 I of total extraction juice are recovered. then filtered via a plate filter type microfiltration unit equipped with two filters of 1.2 pm then 0.8 pm (3M, 40*40, pore size 15 HN and 50 HN).
  • Reverse osmosis is carried out at 30°C, between 20 and 30 bars and at a circulation flow rate of 120 l/h, i.e. a circulation speed of 1.3 m/s. Reverse osmosis is continued until a retentate of approximately 13 Bx is obtained, which is then withdrawn from the unit, then freeze-dried.
  • This fraction obtained from osmosis ultrafiltration permeate type will hereinafter be referred to as permeate type Ulva algae extract or “fraction P”.
  • Fraction P is soluble only in water and the water/ACN mixture (1:1, v/v) (Table 1), its solubility being maximum in water (1 g/l), and minimum in the water/ACN mixture (1:1, v/v).
  • the protein content is evaluated using three biochemical protocols, respectively derived from the Lowry methods (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov; 193(1):265-75), Smith (Smith PK, Krohn Rl, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985 Oct;150(1) :76-85) and Kjeldahl (Kirk PL. Kjeldahl Method for Total Nitrogen. Anal Chem. 1950 Feb 15;22(2):354—8).
  • the Lowry reagent which consists of a mixture of 100 ⁇ l of 2% (m/v) potassium and sodium double tartrate solution, 100 ⁇ l of sulfate solution 1% (m/v) copper and 10 ml of 2% (m/v) sodium carbonate solution in 0.1 M NaOH; and the Folin reagent, corresponding to a 1/20 dilution of the Folin-Ciocalteu phenol reagent in ultrapure water.
  • This method involves two successive stages, a first of mineralization and a second of distillation.
  • For mineralization 1 g of sample is added to a matra, with 2 catalyst tablets. A matra containing only the tablets is used blank and another matra containing a known quantity of urea as well as the 2 catalyst tablets is used as a control. 10 ml of 96% sulfuric acid are added to the matra. The solution is then heated for 2 hours at approximately 400°C. After mineralization, distillation is carried out for 6 min after adding 50 ml of 30% NaOH (m/v) and 50 ml of ultrapure water. The liquid is then collected in a boric acid solution (4% (m/v), pH 4.65) and titrated with 1 M HCl.
  • the absorbance is then measured at 485 nm in a 96-well microplate, using a FLUOstar Omega microplate spectrophotometer (BMG LABTECH).
  • BMG LABTECH FLUOstar Omega microplate spectrophotometer
  • fraction P The biochemical characterization of fraction P shows that this fraction has a high protein content, ranging from 28.6% to 31.6% depending on the dosage method applied and the nature of the solvent used for its solubilization. . These very similar results make it possible to average this total protein content to around 30%. Likewise, total phenolic compounds are quantified at very similar values, regardless of the solvent used, giving an average content of approximately 4%. The results obtained in terms of total sugar content are, however, very different, the content measured in the water/ACN mixture (1:1, v/v) being much lower (3.3%) than that measured in the water (10.0%).
  • Example 2 Production and characterization of an extract of algae of the genus Ulva
  • the cells are cultured in Dulbecco's ModifiedEagle Medium (DMEM) medium (PAN Biotech, Dutscher) supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum (PAN Biotech, Dutscher) and 1% (v/v) of an antibiotic solution (10,000 U/ml penicillin, 10 mg/ml streptomycin) (PAN Biotech, Dutscher).
  • DMEM Dulbecco's ModifiedEagle Medium
  • PAN Biotech, Dutscher Dulbecco's ModifiedEagle Medium
  • an antibiotic solution 10,000 U/ml penicillin, 10 mg/ml streptomycin
  • the cells are cultivated in an incubator at a controlled temperature of 37°C, with 5% CO2, under a humid atmosphere, in ventilated flasks of 75 cm 2 (BD Biosciences), and maintained by mechanical removal with a scraper (Sarstedt).
  • the culture medium is renewed every 2 or 3 days. All manipulations are carried out under a class 2 microbiological safety cabinet.
  • the cells are used between the nth and I6th passages.
  • the cells are seeded in sterile 96-well microplates (BD Biosciences), at a concentration of 5x10 4 cells/ml in a volume of 100 ⁇ l of complete medium. After 24 h of incubation, the complete medium is replaced by 100 ⁇ l of complete medium containing the P fraction at different concentrations (between 0.01 and 500 pg/ml), or dexamethasone at 1 ⁇ M (anti-inflammatory drug compound). inflammatory, used as a positive control A negative control containing only complete medium is also used. After 24 h of exposure, 25 ⁇ l of a solution of MTT at 5 mg/ml in PBS are added to each well, which are. then incubated for 4 h in the culture incubator.
  • BD Biosciences sterile 96-well microplates
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Figure 1A shows the impact of fraction P on the viability of Raw 264.7 macrophages, compared to control conditions, after 24 hours of exposure.
  • Figure 1 B shows the same experiment in the presence of salmonella lipopolysaccharide (LPS) at 1 pg/ml (LPS 0111, reference L2630, Merck), after 6 h of pre-incubation with the P fraction at different concentrations.
  • LPS salmonella lipopolysaccharide
  • LPS 0111, reference L2630, Merck the effect of a reference anti-inflammatory used as a positive control, dexamethasone (1 pM)
  • the results obtained demonstrate that neither the P fraction, whatever its concentration, nor dexamethasone at 1 pM have any significant effect on the cell viability of Raw 264.7 macrophages, whether they are cultured in the presence of LPS or not. .
  • Nitric oxide is a central mediator of the inflammatory process, which regulates the activity, growth and death of many types of immune and inflammatory cells (Grisham MB, Jourd'Heuil D, Wink DA. Nitric oxide. I. Physiological chemistry of nitric oxide and its metabolites: implications in inflammation. Nitric Oxide and Regulation of Inducible Nitric Oxide Synthase. Results Probl Cell Differ 2017;62:181-207). The determination of NO can be carried out from the culture supernatants of RAW 264.7 macrophages according to the protocol described by Li and Shah (Li S, Shah NP.
  • the cells and the culture conditions are the same as those described in Example 2, part A.
  • the cells are seeded in sterile 96-well microplates (BD Biosciences), at a rate of 1.5 ⁇ 10.6 cells/ml. , in complete DMEM medium. After 24 h of incubation, the initial medium is replaced by 100 ⁇ l of complete medium containing the P fraction at different concentrations (between 0.01 and 100 ⁇ g/ml), or dexamethasone at 1 ⁇ M (anti-inflammatory compound reference used as a positive control), before again 6 h of incubation. A negative control containing only complete medium is also produced.
  • the “Griess Reagent Kit for Nitrite Determination” (G-7921, InvitrogenTM, Thermo Fischer Scientific) is used to determine the concentration of NO in the cell culture supernatants, according to the protocol given by the supplier. 150 ⁇ l of cell supernatant are taken to be assayed using an equivalent volume of Griess reagent. After incubation at room temperature for 30 min, the absorbance is measured at 540 nm using a Fluostar Omega microplate reader (BMG LABTECH).
  • Figure 2 shows the effect of the P fraction on the secretion of NO in the culture medium under basal (A) or inflammatory (B) conditions.
  • An increase in NO secretion compared to control conditions is observed in the presence of LPS (positive control), as well as for the two highest concentrations of P fraction (10 and 100 pg/ml) ( Figure 2A).
  • the P fraction induces a very significant reduction in the production of NO in the presence of LPS (FIG. 2B), the concentration of NO in the culture supernatant being halved at the concentration of 1 pg/ml and by approximately 1.5 at concentrations of 0.01 and 0.1 g/ml, compared to inflammatory control conditions involving LPS alone.
  • LPS LPS
  • NLRP-3 also called inflammasome, belongs to a class of cytoplasmic protein complexes (NLRP) that modulate the activation of inflammatory mediators.
  • NLRP-3 plays a pivotal role among the NLRP class, and is activated after stimulation by microbial and non-microbial factors such as bacterial toxins, micro-particles or LPS.
  • iNOS Inducible nitric oxide synthase catalyzes the synthesis of nitric oxide (NO), which is a key mediator of inflammation.
  • LPS, interferon gamma (IFN- ⁇ ), TNF-a, and IL-1P can induce iNOS expression.
  • the Western Blot method is a process for semi-quantitative analysis of the expression of proteins present in cells.
  • the cells and the culture conditions are the same as those described in Example 2, part A.
  • the Raw 264.7 cells are seeded in sterile 6-well microplates (BD Biosciences), at 1x10 6 cells/ml, in 1 ml of complete DMEM medium. After 24 h of incubation, the initial medium is replaced by 1 ml of complete medium containing the P fraction at different concentrations or dexamethasone at 1 pM (reference anti-inflammatory compound used as a positive control), before again 6 h incubation. A negative control containing only complete medium is also produced.
  • LPS at 1 pg/ml is then added to all wells, except that corresponding to the control conditions, then the incubation is continued for 18 h.
  • the cell supernatant is removed and then a cell lysate is prepared in lysis buffer (RIPA, Thermo Fisher Scientific) supplemented with a phosphatase inhibitor (Cell Signaling).
  • the cell lysate is centrifuged for 5 min at 10,000 g, at 4°C.
  • the protein concentration in the supernatant is then obtained by application of the Smith method, with bicinchoninic acid (BCA), according to the protocol given in Example 1.
  • An equivalent quantity of proteins for each sample 25 ⁇ g is mixed.
  • the membrane is then blocked for 1 hour 30 minutes at room temperature, using a blocking solution containing 5% bovine serum albumin (BSA) in TBS-Tween 20 (Merck).
  • BSA bovine serum albumin
  • TBS-Tween 20 TBS-Tween 20
  • Table 3 Primary and secondary antibodies used for Western Blot analysis of signaling pathways involved in LPS-induced inflammation.
  • the cells and the culture conditions are the same as those described in Example 2, part A.
  • the Raw 264.7 cells are seeded in sterile 6-well microplates (BD Biosciences), at 1x10 6 cells/ml , in 1 ml of complete DMEM medium. After 24 h of incubation, the initial medium is replaced by 1 ml of complete medium containing the P fraction at different concentrations (between 0.01 and 100 pg/ml), or dexamethasone at 1 pM (anti-inflammatory compound reference used as a positive control) before again 6 h of incubation. A negative control containing only complete medium is also produced.
  • LPS at 1 pg/ml is then added to all wells, except that corresponding to the control conditions, then the incubation is continued for 18 h.
  • the culture supernatant is then removed and frozen at -80°C.
  • the concentrations of TNF-g and IL-6 in this supernatant are then determined according to the method indicated by the kit supplier (Peprotech), involving two final absorbance measurements, one for evaluation, at 405 nm, and l Another correction, at 650 nm, carried out using a Fluostar Omega microplate reader (BMG LABTECH).
  • Example 3 Demonstration of in vivo effectiveness of an extract of algae of the genus Ulva (permeate) on a model of behavioral alterations induced by a diet
  • mice were fed either with a nutritionally balanced diet (A04 diet) or with a high-calorie diet enriched in fat. and sugar (HFD diet) for 12 weeks in order to induce weight gain associated with metabolic syndrome and behavioral alterations according to a protocol classically described in the literature and used in the NutriNeuro laboratory (Zemdegs J, Quesseveur G, Jarriault D, Pénicaud L, Fioramonti X, Guiard BP. High-fat diet-induced metabolic disorders 5-HT function and anxiety-like behavior in mice.
  • A04 diet a nutritionally balanced diet
  • HFD diet high-calorie diet enriched in fat. and sugar
  • fraction P In order to evaluate the effect of the algae extract of the genus Ulva of the permeate type (fraction P) on metabolic and behavioral alterations, a supplementation of fraction P at 1 mg/ml is provided to the animals via drinking water for 4 weeks following the 12 weeks of the HFD diet. At the end of this supplementation, the metabolic parameters (weight, fat mass and lean mass) and behavioral parameters (anxiety-like behavior, memory capacity) are evaluated.
  • P fraction supplementation induced a statistically significant weight loss in supplemented HFD mice compared to mice not receiving the supplementation (p ⁇ 0.01). THE Weight of HFD mice supplemented with P fraction is not statistically different from that of control mice.
  • mice are tested in the Morris water maze.
  • mice 1 -habituation: allows mice to become familiar with swimming and getting on a platform. This step takes place in a circular basin (65 cm in diameter) filled with clear water.
  • 2-cued learning allows the presence of motor or visual deficits to be assessed and accentuates familiarization. The animals must find the submerged platform indicated by a clue.
  • mice are placed in the pool in the absence of a platform and must search for 1 min for the place where the platform was initially positioned.
  • the movements of the mouse are recorded by a video-tracking system (SMART), which allows for each trial to obtain the latency to reach the platform as well as the total distance traveled in the pool.
  • the swimming speed of the mice is deduced from these values.
  • the time spent in the different quadrants as well as the distance traveled and the number of entries in the target quadrant are calculated.

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Abstract

La présente invention a pour objet un extrait d'algue du genre Ulva et son utilisation en nutrition humaine et animale, pour le traitement de l'inflammation, préférentiellement l'inflammation associée à un syndrome métabolique, ainsi que pour le traitement de 5 troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique. La présente invention a également pour objet des compléments alimentaires et des compositions alimentaires comprenant un extrait d'algue du genre Ulva.

Description

Description
Titre : Extrait d’algue du genre Ulva pour le traitement de troubles induits par un syndrome métabolique
Domaine technique
[0001] La présente invention a pour objet un extrait d’algue du genre Ulva et son utilisation en nutrition humaine et animale, pour le traitement de troubles induits par un syndrome métabolique, préférentiellement l’inflammation, et les troubles cognitifs et/ou émotionnels. La présente invention a également pour objet des compléments alimentaires et des compositions alimentaires comprenant un extrait d’algue du genre Ulva.
Technique antérieure
[0002] La prédisposition génétique, la sédentarité, les habitudes alimentaires, les facteurs environnementaux et l'altération du métabolisme sont les facteurs principaux et convergents de l'apparition de l'obésité, une pathologie complexe et multifactorielle bien connue qui a atteint des proportions pandémiques. L'incidence de l'obésité a augmenté très rapidement au cours des 30 dernières années, ce qui suggère que des facteurs comportementaux et environnementaux, en particulier une plus grande disponibilité et une plus grande consommation d'aliments à forte teneur en graisses (régime HFD de l’anglais « High Fat Diet »), ont fortement alimenté cette affection. L'obésité induite par un régime riche en graisses est liée à plusieurs conditions pathologiques telles que le diabète, les maladies cardiovasculaires, l'hypertension, les maladies du foie, certaines formes de cancer (côlon, vésicule biliaire, sein, etc.).
[0003] La caractéristique commune de toutes les maladies métaboliques induites par l'obésité est une inflammation, en particulier une inflammation chronique de bas grade qui est étroitement liée à la physiopathologie du tissu adipeux.
[0004] En effet, l'obésité induite par un régime riche en graisses se caractérise par une inflammation de bas grade, et également une résistance à l’insuline, un stress oxydatif et des dysfonctionnements mitochondriaux.
[0005] Cette inflammation de bas grade est à distinguer de l’inflammation, en ce que l’inflammation de bas grade est un mécanisme physiopathologique intracellulaire à bas bruit, asymptomatique et chronique. Ce phénomène chronique entraîne des dommages cellulaires, tissulaires, organiques et fonctionnels. Par opposition, l’inflammation désigne les modifications physiologiques adaptatives qui ont pour objectifs de stopper la progression des lésions tissulaires, d’isoler et d’éliminer les agents infectieux et d’activer les processus de réparation nécessaires au rétablissement de l’état initial de l’organisme (Baumann and Gauldie, 1994).
[0006] Des troubles cognitifs et/ou émotionnels sont également induits par un syndrome métabolique.
[0007] De nombreuses compositions ont été développées pour prévenir ou traiter ces pathologies. Toutefois, les produits ou méthodes existants pour répondre à ces besoins sont limités par :
- soit la complexité, et donc le coût de la formulation de ces compositions comprenant des ingrédients de niveaux de pureté très variés,
- soit le manque de démonstration factuelle de l’activité anti-inflammatoire ou de l’activité neuro-protectrice des extraits.
[0008] Il existe ainsi un besoin de développer des molécules ciblant l’inflammation afin de traiter l’inflammation, préférentiellement l’inflammation de bas grade, et également pour traiter les troubles cognitifs et/ou émotionnels, induits par un syndrome métabolique, et ce afin de traiter les troubles induits par un syndrome métabolique.
[0009] Dans ce contexte, les algues présentent un intérêt croissant pour ce marché, en demande de nouveaux produits d’origine naturelle. En effet, si elles ont été valorisées depuis des décennies, majoritairement comme source d’alimentation, pour les propriétés texturantes des polysaccharides qu’elles produisent ou, plus récemment, pour leurs propriétés dermo-cosmétiques, les macroalgues marines, notamment, présentent une large diversité de molécules encore peu étudiées.
[0010] Sur la période 1999-2015, 99 composés purifiés provenant de macroalgues marines et présentant une activité neuroprotectrice ont été identifiés. Parmi ces composés, 57 proviennent de macroalgues brunes, 28 proviennent de macroalgues rouges et seulement 14 proviennent de macroalgues vertes.
[0011] Du point de vue des macroalgues marines vertes, il existe une littérature fournie mettant en évidence les propriétés de composés isolés à partir d’algues vertes ou d’extraits d’algues vertes complexes dans les domaines nutraceutique ou pharmaceutique. Mais aucune donnée relative à des activités anti-inflammatoires à l’encontre de l’inflammation de bas grade, et encore moins dans un contexte de syndrome métabolique, de ces mêmes composés ou extraits n’est retrouvée.
[0012] Il apparaît donc que les macroalgues marines, et en particulier les algues vertes, peuvent encore être considérées à ce jour comme un réservoir sous-exploité de composés anti-inflammatoires à l’encontre de l’inflammation de bas grade et plus généralement pour le traitement des troubles induits par un syndrome métabolique. Résumé de l’invention
[0013] La présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva, caractérisé en ce que :
- la teneur en protéines est comprise entre 5 et 60% en masse, préférentiellement entre 15 et 50% en masse, préférentiellement entre 25 et 35% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait,
- la teneur en composés phénoliques totaux est comprise entre 0,5 et 40% en masse, préférentiellement entre 1 et 20% en masse, préférentiellement entre 1 et 10% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait,
- la teneur en sucres totaux est comprise entre 0,5 et 80% en masse, préférentiellement entre 1 et 50% en masse, préférentiellement entre 5 et 15% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[0014] Dans un mode de réalisation, l’extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention a une teneur en protéines comprise entre 28 et 32% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[0015] Dans un mode de réalisation, l’extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention a une teneur en composés phénoliques totaux comprise entre 2 et 6% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[0016] Dans un mode de réalisation, l’extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention a une teneur en sucres totaux comprise entre 5 et 15% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[0017] Dans un mode de réalisation, l’extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention est un extrait d’algue du genre Ulva choisie parmi Ulva lactuca, Ulva rigida, Ulva conglobata, Ulva ohnoi, Ulva reticulata, Ulva proliféra, Ulva flexuosa et Ulva intestinalis.
[0018] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour le traitement des troubles induits par un syndrome métabolique.
[0019] Les inventeurs ont en effet démontré qu’un extrait d’algue du genre Ulva présente des propriétés anti-inflammatoires, préférentiellement à l’encontre de l’inflammation de bas grade et permet de protéger contre une dégradation des capacités cognitives et une altération émotionnelle induites par un syndrome métabolique
[0020] L’ effet anti-inflammatoire in vitro de l’extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention a été évalué sur une lignée cellulaire de macrophages murins Raw 264,7 fournies par ATCC Cell (« American Type Culture Collection ») : code ATCC-TIB-71 . Il s’agit de macrophages immortalisés de souris utilisés comme modèles d’étude biologique de référence dans les maladies métaboliques, pour mesurer une activité anti/pro-inflammatoire.
[0021] Avantageusement, les inventeurs ont démontré qu’après 6 h de pré-incubation avec l’extrait selon l’invention, la production d’oxyde nitrique (NO) induite par le LPS est drastiquement réduite, par rapport aux conditions contrôles inflammatoires impliquant le LPS seul. Ces résultats indiquent que l’extrait selon l’invention est très fortement antiinflammatoire car il induit une réduction de la sécrétion de NO proche de celle induite par la dexaméthasone, à très faible concentration. En effet, l’oxyde nitrique (NO) est un médiateur central du processus inflammatoire, qui régule l'activité, la croissance et la mort de nombreux types de cellules immunitaires et inflammatoires. Une réduction de la sécrétion de NO est le reflet d’une activité anti-inflammatoire.
[0022] De plus, la modulation des voies de signalisation protéiques impliquées dans l’inflammation par l’extrait selon l’invention a été évaluée. Avantageusement, les inventeurs ont démontré que l’extrait selon l’invention induit une réduction drastique de l’expression des protéines NLRP3 et iNOS, impliquées dans le processus inflammatoire dans les macrophages Raw 264,7 en culture.
[0023] Pour compléter ces tests, la modulation par l’extrait selon l’invention de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires dans le milieu extracellulaire a été évaluée. Avantageusement encore, les inventeurs ont démontré que l’extrait d’algue selon l’invention induit, après 6 h de pré-incubation, une diminution drastique de la sécrétion du TNF-a et de l’IL-6 induite par le LPS, atteignant un niveau similaire à celui obtenu en présence de la dexaméthasone, composé anti-inflammatoire de référence, et ce y compris à la très faible concentration de 0,1 pg/ml.
[0024] Ces résultats démontrent l’effet anti-inflammatoire à l’encontre de l’inflammation chronique de bas grade de l’extrait selon l’invention, dans un contexte de syndrome métabolique, vis-à-vis de la production de NO, de l’expression des protéines clés impliquées dans les cascades de signalisation liées au processus inflammatoire (NLRP-3 et iNOS), et de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Ainsi, la présente invention a également pour objet un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de l’inflammation.
[0025] Dans un mode de réalisation, l’inflammation est une inflammation induite par un syndrome métabolique.
[0026] Les inventeurs ont également évalué l’effet de l’extrait selon l’invention sur les altérations métaboliques et comportementales par l’évaluation des paramètres métaboliques (poids, masse grasse et masse maigre) et comportementaux (comportement de type anxieux, capacités mnésiques) dans un modèle de syndrome métabolique.
[0027] Le comportement de type anxieux des animaux a été évalué au moyen du test du labyrinthe en croix surélevé. Les inventeurs ont démontré que la supplémentation en extrait selon l’invention restaure le temps d’exploration des animaux dans les bras ouverts (F (2, 20) = 7,376, p<0,01 ). La supplémentation en extrait selon l’invention protège ainsi de la mise en place des troubles de type anxieux induits par le régime HFD.
[0028] Les souris ont également été testées dans le labyrinthe aquatique de Morris afin d’évaluer les effets chroniques du traitement sur la mémoire. De façon intéressante, la supplémentation en extrait selon l’invention permet de restaurer les capacités cognitives des animaux sous régime HFD. En effet, ils discriminent le quadrant cible de façon statistiquement significative par rapport au hasard (p<0,05).
[0029] Les inventeurs ont ainsi démontré que l’extrait selon l’invention permet de protéger contre une dégradation des capacités cognitives et une altération émotionnelle induites par un syndrome métabolique.
[0030] Ainsi, la présente invention a également pour objet un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique.
[0031] Selon un mode de réalisation, les troubles cognitifs et émotionnels sont choisis parmi les troubles de mémoire à long terme hippocampo-dependants et les troubles de type anxieux.
[0032] La présente invention concerne également un complément alimentaire ou une composition alimentaire pour l’homme ou les animaux de compagnie comprenant un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention.
[0033] En effet, l’extrait d’algue selon l’invention peut être utilisé en nutrition humaine mais également en nutrition animale.
Brève description des dessins
[0034] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
[0035] [Fig. 1] montre l’effet de la fraction P sur la viabilité de macrophages murins Raw 264,7 en culture, après 24 h d’incubation (A) ou après 6 h de pré-incubation puis 18 h d’incubation en présence de LPS (1 pg/ml) (B). Les résultats expriment le pourcentage moyen relatif de macrophages viables par rapport aux conditions contrôles (100%) ± ETM. Les différences significatives obtenues entre les échantillons et les conditions contrôles (A) ou entre les échantillons et les conditions avec LPS seul (B) sont indiquées par (n = 4) : ns (non significatif : p>0,05) (One-WAY ANOVA).
Fig. 2
[0036] [Fig. 2] montre l’effet de la fraction P sur la sécrétion d’oxyde nitrique (NO) par des macrophages murins Raw 264,7 en culture, après 24 h d’incubation (A) ou après 6 h de pré-incubation puis 18 h d’incubation en présence de LPS (1 pg/ml) (B). Les résultats expriment la concentration de NO secrétée dans le milieu de culture ± ETM. Les différences significatives obtenues entre les échantillons et les conditions contrôles (A) ou entre les échantillons et les conditions avec LPS seul (B) sont indiquées par (n = 4) : ns (non significatif : p>0,05), *** (p<0,001 ) et **** (p<0,0001 ) (One-WAY ANOVA).
Fig. 3
[0037] [Fig. 3] montre l’effet de la fraction P sur l’expression respective des protéines NLRP3 (A) et iNOS (B), par des macrophages murins Raw 264,7 en culture, après 6 h de pré-incubation puis 18 h d’incubation en présence de LPS. Les résultats expriment le niveau d’expression des protéines cibles ± ETM, rapporté au niveau d’expression de la p-actine, en tant que protéine de ménage. Les différences significatives obtenues entre les échantillons et les conditions avec LPS seul sont indiquées par (n = 6) : ns (non significatif : p>0,05), * (p<0,05), ** (p<0,01 ) et *** (p<0,001 ) (One-WAY ANOVA).
Fig. 4
[0038] [Fig. 4] montre l’effet de la fraction P sur la sécrétion de TNF-a et IL-6 par des macrophages murins Raw 264,7 en culture, après 24 h d’incubation (A, C) ou après 6 h de pré-incubation puis 18 h d’incubation en présence de LPS (B, D). Les résultats expriment la concentration de TNF-a et IL-6 secrétées dans le milieu de culture ± ETM. Les différences significatives obtenues entre les échantillons et les conditions contrôles (A, C) ou entre les échantillons et les conditions avec LPS seul (B, D) sont indiquées par (n = 4) : ns (non significatif : p>0,05), * (p<0,05), ** (p<0,01) et *** (p<0,001 ) (One-WAY ANOVA).
Fig. 5
[0039] [Fig. 5] montre l’effet de la supplémentation en fraction P sur les paramètres métaboliques d’animaux obèses et diabétiques nourris avec un régime HFD : poids corporel (A), masse maigre (B) et masse grasse (C) de souris C57BL/6J nourries avec un régime HFD ou standard A04 pendant 16 semaines et supplémentées les 4 dernières semaines avec la solution de fraction P à 1 mg/ml dans l’eau de boisson ou avec de l’eau (contrôles). Les différences significatives sont indiquées par (n = 12/groupe) : ns (non significatif : p>0,05), ** (p<0,01 ), *** (p<0,001 ) et **** (p<0,0001 ) (One-WAY ANOVA + Tuckey post- hoc test).
Fig. 6
[0040] [Fig. 6] montre l’effet de la supplémentation en fraction P sur la durée d’exploration des bras ouverts (BO) anxiogènes du labyrinthe en croix surélevé, chez des animaux obèses et diabétiques nourris avec un régime HFD : souris C57BL/6J nourries avec un régime HFD ou standard A04 pendant 16 semaines et supplémentées les 4 dernières semaines avec la solution de fraction P à 1 mg/ml dans l’eau de boisson ou avec de l’eau (contrôles). Les différences significatives sont indiquées par (n = 12/groupe) : * (p<0,05) et ** (p<0,01 ) (One-WAY ANOVA + Tuckey post-hoc test).
Fig. 7
[0041] [Fig. 7] montre la représentation schématique du protocole du test comportemental du labyrinthe aquatique de Morris.
Fig. 8
[0042] [Fig. 8] montre l’effet de la supplémentation en fraction P sur la mémoire d’animaux obèses et diabétiques nourris avec un régime HFD. La mémoire est évaluée selon le temps passé dans le cadran opposé à la plateforme (Opp (E)), les cadrans adjacents à la plateforme (Adj (N ou S)) ou dans le cadran cible où se trouve la plateforme (Cible (W)) par des souris C57BL/6J nourries avec un régime HFD ou standard A04 pendant 16 semaines, et supplémentées durant les 4 dernières semaines avec la fraction P à 1 mg/ml dans l’eau de boisson ou avec de l’eau (contrôles). Les différences significatives entre les valeurs obtenues et le hasard (valeur indicative de 25%) sont indiquées par (n = 12/groupe) : * (p<0,05) et *** (p<0,001 ) (One-WAY ANOVA + Tuckey post-hoc test).
Description Détaillée
Extrait d’algue du genre Ulva
[0043] La présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva caractérisé en ce que :
- la teneur en protéines est comprise entre 5 et 60% en masse, préférentiellement entre 15 et 50% en masse, préférentiellement entre 25 et 35% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait,
- la teneur en composés phénoliques totaux est comprise entre 0,5 et 40% en masse, préférentiellement entre 1 et 20% en masse, préférentiellement entre 1 et 10% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait, - la teneur en sucres totaux est comprise entre 0,5 et 80% en masse, préférentiellement entre 1 et 50% en masse, préférentiellement entre 5 et 15% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
Teneur en
[0044] Selon un mode de réalisation, l’extrait d’algue du genre Ulva est caractérisé par une teneur en protéines comprise entre 5 et 60% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait, préférentiellement comprise entre 25 et 35% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait et de manière préférée, la teneur en protéine est comprise entre 28 et 32% en masse, de manière encore préférée d’environ 30% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[0045] La teneur en protéines pourra être mesurée par toute méthode connue de l’homme du métier. A titre illustratif, on citera les méthodes de Lowry (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(1 ):265-75), Smith (Smith PK, Krohn Rl, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985 Oct; 150(1 ):76-85) et Kjeldahl (Kirk PL. Kjeldahl Method for Total Nitrogen. Anal Chem. 1950 Feb 15;22(2):354-8). Ces protocoles pourront être indépendamment et alternativement utilisés pour mesurer la teneur en protéines.
Teneur en composés phénoliques totaux
[0046] Selon un mode de réalisation, l’extrait d’algue du genre Ulva est caractérisé par une teneur en composés phénoliques totaux comprise entre 0,5 et 40% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait, préférentiellement comprise entre 1 et 10% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait et de manière préférée, la teneur en composés phénoliques totaux est comprise entre 2 et 6% en masse, de manière préférée encore d’environ 4% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[0047] On entend par « composés phénoliques totaux » l’ensemble des métabolites secondaires caractérisés par la présence d’un cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engagés avec un glucide, présents dans toutes les parties des végétaux supérieurs, les plus représentés étant les anthocyanes, les flavonoïdes et les tannins.
[0048] La teneur en composés phénoliques totaux pourra être mesurée par toute méthode connue de l’homme du métier. A titre illustratif, on citera la méthode de Singleton et Rossi (Singleton VL, Rossi JA. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic- phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic. 1965 Jan 1 ;16(3):144), avec quelques modifications. Teneur en sucres totaux
[0049] Selon un mode de réalisation, l’extrait d’algue du genre Ulva est caractérisé par une teneur en sucres totaux comprise entre 0,5 et 80% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait, préférentiellement comprise entre 5 et 15% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait et de manière préférée, la teneur en sucres totaux est d’environ 10% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[0050] On entend par « sucres totaux » l’ensemble des glucides : mono-, oligo-, polysaccharides et leurs dérivés.
[0051] La teneur en sucres totaux pourra être mesurée par toute méthode connue de l’homme du métier. A titre illustratif, on citera la méthode au mélange phénol/acide sulfurique introduite par Dubois (Dubois M, Gilles K, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. A Colorimetric Method for the Determination of Sugars. Nature. 1951 Jul;168(4265):167-167).
[0052] Selon un mode de réalisation préféré, l’extrait d’algue du genre Ulva est caractérisé en ce que :
- La teneur en protéines est d’environ 30% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait,
- La teneur en composés phénoliques totaux est d’environ 4% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait,
- La teneur en sucres totaux est d’environ 10% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[0053] Dans la présente invention, le terme "environ", lorsqu'il se réfère à un nombre ou à une plage numérique, signifie que le nombre ou la plage numérique en question est une approximation dans les limites de la variabilité expérimentale (ou dans les limites de l'erreur expérimentale statistique), et donc que le nombre ou la plage numérique peut varier entre 1 % et 15 % du nombre ou de la plage numérique indiqué(e). Par exemple, l'utilisation de "environ X" englobe +/-1 pour cent, 2 pour cent, 3 pour cent, 4 pour cent, 5 pour cent, 6 pour cent, 7 pour cent, 8 pour cent, 9 pour cent, 10 pour cent, 11 pour cent, 12 pour cent, 13 pour cent, 14 pour cent et 15 pour cent de la valeur X.
Algue du genre Ulva
[0054] Les algues du genre Ulva sont les ulves, des algues vertes multicellulaires réparties dans les océans avec environ 400 espèces.
[0055] Selon un mode de réalisation, l’algue du genre Ulva est choisie parmi l’ensemble des espèces du genre Ulva, de préférence dans le groupe constitué par les espèces Ulva lactuca, Ulva rigida, Ulva fasciata, Ulva pertusa, Ulva californica, Ulva gigantea, Ulva pseudocurvata, Ulva conglobata, Ulva armoricana, Ulva fasciculata, Ulva ohnoi, Ulva pseudolinza, Ulva reticulata, Ulva rotundata, Ulva elegans, Ulva proliféra, Ulva scandinavica, Ulva umbilicata, Ulva flexuosa, Ulva clathrata, Ulva compressa et Ulva intestinalis.
[0056] Selon un mode de réalisation préférée, l’algue du genre Ulva est choisie parmi Ulva lactuca, Ulva rigida, Ulva conglobata, Ulva ohnoi, Ulva reticulata, Ulva proliféra, Ulva flexuosa et Ulva intestinalis.
[0057] Selon un mode de réalisation, l’algue du genre Ulva est Ulva lactuca ou Ulva rigida.
[0058] Selon un mode de réalisation, l’algue est un mélange d’algues du genre Ulva lactuca et Ulva rigida.
[0059] Selon un mode de réalisation, l’extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention est susceptible d’être obtenu par le procédé décrit ci-après.
Troubles induits par un syndrome métabolique
[0060] La présente invention concerne également un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation dans le traitement de troubles induits par un syndrome métabolique.
[0061] Le terme « syndrome métabolique » désigne usuellement les troubles du métabolismes énergétiques (hyperglycémie à jeun, insulino-résistance, hypertension, hypertriglycéridémie, accumulation de graisse viscérale, faible taux plasmatique de cholestérol HDL) associés à l’obésité ou au surpoids. On parle de syndrome métabolique lorsque sont présentes au moins trois des anomalies listées ci-dessus.
[0062] Typiquement, un syndrome métabolique induit une inflammation de bas grade et engendre également une dégradation des capacités cognitives et/ou une altération émotionnelle.
[0063] Ainsi, selon un mode de réalisation, les troubles induits par un syndrome métabolique sont choisis parmi l’inflammation, préférentiellement l’inflammation de bas grade ou inflammation induite par un syndrome métabolique et les troubles cognitifs et/ou émotionnels.
[0064] La présente invention concerne également une méthode pour le traitement de troubles induits par un syndrome métabolique, comprenant l’administration d’un extrait d’algue selon l’invention à un mammifère en ayant besoin.
[0065] La présente invention concerne également l’utilisation d’un extrait d’algue selon l’invention pour l’obtention d’un médicament destiné au traitement de troubles induits par un syndrome métabolique. [0066] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait d’algue selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de troubles induits par un syndrome métabolique.
Inflammation
[0067] Ainsi, la présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation dans le traitement de l’inflammation.
[0068] Les inventeurs ont avantageusement démontré, sur des modèles de référence dans les maladies métaboliques, l’effet anti-inflammatoire de l’extrait selon l’invention vis-à-vis de la production de NO, de l’expression des protéines clés impliquées dans les cascades de signalisation liées au processus inflammatoire (NLRP-3 et iNOS), et de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires.
[0069] Cet effet anti-inflammatoire est un effet à l’encontre de l’inflammation induite par un syndrome métabolique.
[0070] Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation dans le traitement de l’inflammation induite par un syndrome métabolique.
[0071] Dans un contexte de syndrome métabolique, on parle alors d’inflammation de bas grade et non d’inflammation.
[0072] L’ inflammation est décrite comme la succession de modifications se produisant dans un tissu vivant lorsque celui-ci est lésé (Punchard et al., 2004). La réponse inflammatoire correspond à la composante locale d’un ensemble de mécanismes de défense de l’hôte regroupé sous le nom de réaction de phase aiguë. Ce terme désigne les modifications physiologiques adaptatives qui ont pour objectifs de stopper la progression des lésions tissulaires, d’isoler et d’éliminer les agents infectieux et d’activer les processus de réparation nécessaires au rétablissement de l’état initial de l’organisme (Baumann and Gauldie, 1994).
[0073] Cependant il existe également une inflammation de bas grade correspondant à un mécanisme physiopathologique intracellulaire à bas bruit, asymptomatique et chronique. Ce phénomène chronique entraîne des dommages cellulaires, tissulaires, organiques et fonctionnels. Cette inflammation de bas grade est présente dans de nombreuses pathologies et notamment dans le cadre du syndrome métabolique, où elle participe à la mise en place des altérations induites par le syndrome.
[0074] L’ inflammation de bas grade se distingue donc de l’inflammation. [0075] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation dans le traitement de l’inflammation de bas grade.
[0076] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation dans le traitement de l’inflammation de bas grade induite par un syndrome métabolique.
[0077] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation pour l’amélioration d’au moins un symptôme ou trouble associé à un syndrome métabolique.
[0078] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation dans le traitement de l’inflammation induite par l’obésité ou le surpoids.
[0079] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention pour son utilisation dans le traitement de l’inflammation de bas grade induite par l’obésité ou le surpoids.
[0080] L’ obésité et le surpoids peuvent notamment être déterminés par le calcul de l’indice de masse corporelle (IMG). L’IMC s’obtient en calculant le rapport entre le poids et la taille au carré. Par exemple, une personne mesurant 1 ,62 m et pesant 55 kg a un IMG égal à 20 (c’est-à-dire : 55/1 ,622). De manière générale, on dit qu’une personne a un poids normal lorsque son IMG est compris entre 18 et 25 kg/m2, est en surpoids lorsque son IMG est compris entre 25 et 30 kg/m2, et est obèse si son IMG dépasse 30 kg/m2. La présente invention concerne également une méthode pour le traitement de l’inflammation, comprenant l’administration d’un extrait d’algue selon l’invention à un mammifère en ayant besoin.
[0081] La présente invention concerne également une méthode pour le traitement de l’inflammation induite par un syndrome métabolique, comprenant l’administration d’un extrait d’algue selon l’invention à un mammifère en ayant besoin.
[0082] La présente invention concerne également une méthode pour le traitement de l’inflammation de bas grade induite par un syndrome métabolique, comprenant l’administration d’un extrait d’algue selon l’invention à un mammifère en ayant besoin.
[0083] La présente invention concerne également une méthode pour l’amélioration d’au moins un symptôme ou trouble associé à un syndrome métabolique, comprenant l’administration d’un extrait d’algue selon l’invention à un mammifère en ayant besoin. [0084] La présente invention concerne également une méthode pour le traitement de l’inflammation induite par l’obésité ou le surpoids, comprenant l’administration d’un extrait d’algue selon l’invention à un mammifère en ayant besoin.
[0085] La présente invention concerne également une méthode pour le traitement de l’inflammation de bas grade induite par l’obésité ou le surpoids, comprenant l’administration d’un extrait d’algue selon l’invention à un mammifère en ayant besoin.
[0086] La présente invention concerne également l’utilisation d’un extrait d’algue selon l’invention pour l’obtention d’un médicament destiné au traitement de l’inflammation.
[0087] La présente invention concerne également l’utilisation d’un extrait d’algue selon l’invention pour l’obtention d’un médicament destiné au traitement de l’inflammation induite par un syndrome métabolique.
[0088] La présente invention concerne également l’utilisation d’un extrait d’algue selon l’invention pour l’obtention d’un médicament destiné à améliorer au moins un symptôme ou trouble associé à un syndrome métabolique.
[0089] La présente invention concerne également l’utilisation d’un extrait d’algue selon l’invention pour l’obtention d’un médicament destiné au traitement de l’inflammation induite par l’obésité ou le surpoids.
[0090] La présente invention concerne également l’utilisation d’un extrait d’algue selon l’invention pour l’obtention d’un médicament destiné au traitement de l’inflammation de bas grade induite par l’obésité ou le surpoids,
[0091] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait d’algue selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de l’inflammation.
[0092] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait d’algue selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de l’inflammation induite par un syndrome métabolique.
[0093] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait d’algue selon l’invention pour son utilisation pour l’amélioration d’au moins un symptôme ou trouble associé à un syndrome métabolique.
[0094] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait d’algue selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de l’inflammation induite par l’obésité ou le surpoids. [0095] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait d’algue selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de l’inflammation de bas grade induite par l’obésité ou le surpoids.
Traitement des troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique.
[0096] Les inventeurs ont en effet démontré que l’extrait selon l’invention permet de protéger contre une dégradation des capacités cognitives et/ou une altération émotionnelle induites par un syndrome métabolique.
[0097] En effet, il a été démontré que l’extrait selon l’invention protège de la mise en place des troubles de type anxieux induits par le régime HFD et qu’il permet de restaurer les capacités cognitives des animaux nourris avec un régime HFD.
[0098] Ainsi, la présente invention concerne également un extrait d’algue selon l’invention pour le traitement de troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique.
[0099] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne également un extrait d’algue selon l’invention pour le traitement des troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par l’obésité ou le surpoids.
[0100] Parmi les troubles cognitifs et émotionnels, on citera les troubles de mémoire à long terme hippocampo-dependants et les troubles de type anxieux.
[0101] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue selon l’invention pour le traitement des troubles de mémoire à long terme hippocampo- dépendants et/ou les troubles de type anxieux.
[0102] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue selon l’invention pour le traitement des troubles de mémoire à long terme hippocampo- dépendants et/ou les troubles de type anxieux, induits par un syndrome métabolique.
[0103] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue selon l’invention pour le traitement des troubles de mémoire à long terme hippocampo- dépendants et/ou les troubles de type anxieux, induits par l’obésité ou le surpoids.
[0104] Avantageusement, l’extrait selon l’invention restaure la mémoire épisodique, la mémoire spatiale de travail hippocampe-dépendante, affectées lors de development du syndrome métabolique, cette maladie métabolique se caractérisant par la mise en place d’une inflammation et d’une insulino-resistance périphérique et centrale. [0105] Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un extrait d’algue selon l’invention pour la restauration de la mémoire épisodique, de la mémoire spatiale de travail hippocampe-dépendante.
[0106] La présente invention concerne également une méthode de traitement des troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique comprenant l’administration d’un extrait d’algue selon l’invention à un mammifère en ayant besoin.
[0107] La présente invention concerne également l’utilisation d’un extrait d’algue selon l’invention pour l’obtention d’un médicament destiné au traitement de troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique.
[0108] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait d’algue selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique.
[0109] L’ extrait selon l’invention pourra être présent sous la forme d’une composition pharmaceutique ou vétérinaire, d’un complément alimentaire, d’une composition alimentaire pour l’humain ou l’animal tels que définis ci-après.
[0110] Ainsi, la présente invention concerne également un extrait d’algue selon l’invention caractérisé en ce que l’extrait d’algue est présent sous la forme d’une composition pharmaceutique, d’une composition vétérinaire, d’un complément alimentaire ou d’une composition alimentaire pour l’homme ou pour les animaux de compagnie.
Traitement
[0111] Les termes « traitement » ou « méthode de traitement » ne sont pas des termes absolus et, lorsqu’ils sont appliqués à des troubles induits par un syndrome métabolique préférentiellement à l’inflammation ou à des troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique, désignent une procédure ou un plan d’action conçu, même avec une probabilité de succès faible, devant induire un effet bénéfique global tel que le retard d’apparition de la pathologie, ou la diminution de la gravité d’un ou plusieurs symptômes. Typiquement, dans le cas de l’inflammation induite par un syndrome métabolique le traitement peut s’entendre de la diminution de la réponse inflammatoire de bas grade. Typiquement, dans le cas de l’inflammation induite par un syndrome métabolique, le traitement peut s’entendre de la diminution de troubles cognitifs et/ou émotionnels. Typiquement, dans le cas de l’inflammation induite par un syndrome métabolique le traitement peut s’entendre comme l’amélioration des capacités mnésiques et/ou la diminution de l’anxiété. [0112] Les expressions « induite par un syndrome métabolique » et « associée à un syndrome métabolique » peuvent être utilisées de manière interchangeable.
[0113] Selon un mode de réalisation, l’invention vise l’utilisation d’un extrait d’algue selon l’invention pour l’amélioration d’au moins un symptôme associé à un syndrome métabolique, dans laquelle ladite amélioration comprend la diminution de l’inflammation de bas grade, la diminution de troubles cognitifs et/ou émotionnels, l’amélioration des capacités mnésiques et/ou la diminution de l’anxiété.
[0114] Que ce soit pour le traitement de l’inflammation ou le traitement des troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique, le mammifère est choisi parmi les humains et les animaux de compagnie.
[0115] L’ extrait d’algue selon l’invention peut en effet être utilisé en nutrition humaine mais également en nutrition animale.
[0116] Selon un mode de réalisation, le mammifère est un humain.
[0117] Selon un autre mode de réalisation, le mammifère est un animal de compagnie tel qu’un chien ou un chat.
[0118] Selon un mode de réalisation, l’extrait d’algue selon l’invention pourra être administré sous forme d’une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant, outre l’extrait d’algue, un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0119] On entend par « pharmaceutiquement acceptable » une substance qui n'est pas biologiquement ou autrement indésirable, c'est-à-dire qui peut être incorporée dans une composition pharmaceutique administrée à un patient ou un animal sans causer d'effets biologiques indésirables ou sans interagir de manière délétère avec l'un des autres composants de la composition dans laquelle elle est contenue, par exemple en inhibant ou diminuant les propriétés anti-inflammatoires de l’extrait d’algue.
[0120] Typiquement, l’excipient pharmaceutiquement acceptable pourra être choisi parmi un diluant, un désintégrant, un liant, un agent de glissement, un agent lubrifiant, un agent mouillant, un agent tampon, un agent de suspension, un adjuvant, un émulsifiant, un absorbant, un conservateur, un agent de surface, un agent édulcorant, un antioxydant, ou un mélange de ceux-ci. Ces excipients sont par exemple décrits dans « The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Pa ».
[0121] La quantité de l’extrait d’algue selon l’invention dans les compositions peut varier de manière à administrer une quantité efficace de l’extrait d’algue pour obtenir la réponse thérapeutique souhaitée pour un mammifère particulier. [0122] Par « quantité efficace » ou « quantité thérapeutiquement efficace » d’un composé, on entend une quantité non toxique mais suffisante du composé pour fournir l’effet souhaité.
[0123] Typiquement, la quantité administrée ou dose, dépend de l’activité de l’extrait d’algue selon l’invention, de la voie d’administration, de la gravité de la pathologie, ainsi que de l’état de santé et des antécédents médicaux du mammifère traité, de divers facteurs tels que le poids corporel, du régime alimentaire, de l’éventuelle combinaison avec d’autres agents thérapeutiques. Il est toutefois de la compétence de l’homme du métier de déterminer le dosage adéquat et d’initier le traitement à un dosage inférieur à celui requis pour obtenir l’effet thérapeutique souhaité puis d’augmenter progressivement la dose jusqu’à ce que l’effet souhaité soit obtenu.
[0124] L’ extrait d’algue pourra être administré par voie orale. Typiquement, les compositions pharmaceutiques ou vétérinaires pourront se présenter sous forme de complément alimentaire à destination de l’homme ou des animaux de compagnie ou de compositions alimentaires pour l’homme ou les animaux de compagnie.
[0125] La présente invention concerne également l’utilisation d’une composition pharmaceutique ou vétérinaire pour son utilisation dans les applications thérapeutiques telles que ci-avant décrites.
Procédé d’obtention de l’extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention
[0126] Avantageusement, l’extrait d’algue selon l’invention pourra être obtenu selon les étapes du procédé décrit dans le brevet FR 2 998 894 de la société SEPROSYS, qui décrit un procédé de traitement d’algues comprenant :
- une étape de broyage,
- de diffusion à l’eau des algues à traiter,
- de filtration des pulpes récupérées après l’étape de diffusion de façon à obtenir un jus de pressage d’une part et des pulpes de pressage d’autre part,
- d’ultrafiltration du jus de pressage de façon à obtenir un rétentat d’une part et un perméat d’autre part.
[0127] Les inventeurs ont avantageusement découvert que le perméat obtenu en mettant en oeuvre un tel procédé sur des algues du genre Ulva présentait des propriétés antiinflammatoires.
[0128] Préférentiellement, le perméat présente des propriétés anti-inflammatoires dans un contexte de syndrome métabolique.
[0129] Ainsi, la présente invention concerne également un procédé d’obtention d’un extrait d’algue du genre Ulva comprenant les étapes : - de broyage des algues
- d’extraction des algues
- de filtration afin d’obtenir un extrait d’algue présentant des propriétés anti-inflammatoires.
[0130] La présente invention concerne également un procédé d’obtention d’un extrait d’algue du genre Ulva comprenant les étapes :
- de broyage des algues
- d’extraction des algues
- de filtration afin d’obtenir un extrait d’algue présentant des propriétés anti-inflammatoires dans un contexte de syndrome métabolique.
[0131] On entend par « extrait d’algue présentant des propriétés anti-inflammatoires », un extrait d’algue permettant de :
- diminuer la production de NO, ou
- réduire l’expression des protéines NLRP3 et iNOS, ou
- réduire la sécrétion du TNF-a et de l’IL-6.
[0132] Préférentiellement, les propriétés anti-inflammatoires sont des propriétés antiinflammatoires dans un contexte de syndrome métabolique. Typiquement, ces paramètres pourront être mesurés sur des modèles de référence dans les maladies métaboliques, tels qu’une lignée cellulaire de macrophages murins Raw 264,7 fournis par ATCC Cell (« American Type Culture Collection ») : code ATCC-TIB-71 .
[0133] Selon un mode de réalisation, l’étape de broyage des algues permet d’obtenir des particules d’algues d’un diamètre inférieur à 10 mm, préférentiellement inférieur à 5 mm, préférentiellement inférieur à 2 mm.
[0134] Typiquement, les algues pourront être broyées dans de l’eau déminéralisée, à une température comprise entre 25 et 100°C, préférentiellement entre 40 et 90°C, préférentiellement entre 55 et 75°C, et préférentiellement, à une température d’environ 65°C.
[0135] Tout ustensile connu de l’homme du métier pourra être utilisé pour broyer les algues, typiquement un broyeur à couteau.
[0136] Selon un mode de réalisation, le procédé pourra comprendre une étape préalable au broyage, de lavage des algues, typiquement dans de l’eau brute pendant 10 min à température ambiante, suivi d’un essorage.
[0137] Selon un mode de réalisation, l’étape d’extraction des algues ou de diffusion est réalisée à une température comprise entre 25 et 100°C, préférentiellement entre 40 et 90°C et préférentiellement, à une température d’environ 80°C. [0138] Selon un mode de réalisation, la durée de l’étape d’extraction des algues ou de diffusion est comprise entre 15 min et 5 h, préférentiellement entre 1 h et 4 h, préférentiellement entre 1 h et 3 h. Selon un mode de réalisation préféré, la durée de l’étape d’extraction est d’environ 2 h.
[0139] Selon un mode de réalisation, l’étape d’extraction est réalisée dans un volume d’eau réduit.
[0140] Selon un mode de réalisation, l’extraction est réalisée sous agitation constante. A titre illustratif, l’extraction est réalisée sous agitation constante à l’aide d’un agitateur à pales, à une vitesse de rotation de 10 tours/min.
[0141] L’étape d’extraction permet d’obtenir un extrait aqueux et des pulpes d’algue.
[0142] Selon un mode de réalisation, l’extrait aqueux obtenu suite à l’extraction est filtré.
[0143] Selon un mode de réalisation, les étapes de filtration pourront être réalisées selon le procédé décrit dans le brevet FR 2 998 894 de la société SEPROSYS. Ainsi, le procédé comprend les étapes :
- de filtration des pulpes récupérées après l’étape de diffusion, de façon à obtenir un jus de pressage d’une part et des pulpes de pressage d’autre part,
- d’ultrafiltration du jus de pressage de façon à obtenir un rétentat d’une part et un perméat d’autre part.
[0144] Alternativement, les étapes suivantes de filtration pourront être réalisées après l’étape d’extraction.
[0145] Typiquement, l’extrait aqueux obtenu après l’étape d’extraction pourra subir une première étape de filtration et être filtré au moyen d’un tamis vibrant présentant un seuil de coupure de 50 pm. Cette étape de filtration de l’extrait aqueux permet d’éliminer les résidus d’algues.
[0146] Selon un mode de réalisation, les pulpes obtenues après l’étape d’extraction sont pressées.
[0147] Cette étape permet avantageusement d’obtenir un jus de pressage d’une part et des pulpes de pressage d’autre part, et d’extraire le plus de jus possible. Selon un mode de réalisation, le jus de pressage est adjoint à l’extrait aqueux.
[0148] Selon un mode de réalisation, le procédé comprend, suite à la première étape de filtration, trois étapes supplémentaires de filtration.
[0149] Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une première étape de microfiltration. [0150] A titre illustratif, une unité de microfiltration de type filtre à plaques équipée de deux filtres de 1 ,2 pm puis 0,8 pm (3M, 40*40, taille de pores 15 HN et 50 HN) pourra être utilisée.
[0151] L’étape de microfiltration permet d’obtenir, à partir du jus de pressage, un rétentat d’une part et un perméat d’autre part.
[0152] Le perméat obtenu suite à l’étape de microfiltration pourra être filtré via une unité d’ultrafiltration.
[0153] Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape d’ultrafiltration.
[0154] Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape d’ultrafiltration du perméat obtenu suite à la microfiltration de façon à obtenir un rétentat d’une part et un perméat d’autre part.
[0155] Selon un mode de réalisation, l’étape d’ultrafiltration est réalisée entre 60 et 100°C, préférentiellement à environ 80°C, à une pression comprise entre 2 et 10 bars, préférentiellement à environ 5 bars et à un débit de circulation compris entre 300 l/h et 600 l/h, préférentiellement à 450 l/h.
[0156] Selon un mode de réalisation, l’étape d’ultrafiltration est réalisée jusqu’à l’obtention d’un rétentat d’environ 4 Bx.
[0157] 4 Bx ou Brix correspond à environ 4% de matière sèche mesuré par l’indice de réfraction et exprimé en degré brix échelle saccharose.
[0158] Le rétentat pourra être soutiré de l’unité et le perméat pourra être récupéré puis osmosé une unité d’osmose inverse.
[0159] A titre illustratif, l’ultrafiltration pourra être réalisée sur une unité d’ultrafiltration équipée d’une membrane de type Kerasep KBW 15 kDa (Novasep Process).
[0160] Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape d’osmose inverse.
[0161] Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape d’osmose inverse du perméat d’ultrafiltration.
[0162] Selon un mode de réalisation, l’étape d’osmose inverse est réalisée entre 20 et 50°C, préférentiellement entre 25 et 40°C et de manière préférée, l’étape d’osmose inverse est réalisée à environ 30°C, à une pression comprise entre 10 et 50 bars, préférentiellement entre 20 et 30 bars et à un débit de circulation compris entre 80 l/h et 150 l/h, préférentiellement à 120 l/h. [0163] A titre illustratif, l’étape d’osmose inverse pourra être réalisée sur une unité d’osmose inverse équipée d’une membrane de type SW 30 HR (Dow).
[0164] Selon un mode de réalisation, l’étape d’osmose inverse est poursuivie jusqu’à l’obtention d’un rétentat d’environ 13 Bx correspondant au perméat d’ultrafiltration osmosé.
[0165] 13 Bx ou Brix correspond à environ 13% de matière sèche mesuré par l’indice de réfaction et exprimé en degré brix échelle saccharose.
[0166] Selon un mode de réalisation, le perméat d’ultrafiltration osmosé obtenu subira une étape de séchage, par exemple par lyophilisation.
[0167] La fraction obtenue de type perméat d’ultrafiltration osmosé sera ci-après dénommée l’extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention ou encore perméat ou encore « fraction P ».
[0168] Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé d’obtention d’un extrait d’algue du genre Ulva comprend les étapes suivantes : a) Lavage des algues à traiter b) Broyage des algues lavées c) Extraction à l’eau des algues lavées dans un volume d’eau réduit d) Filtration des pulpes récupérées après l’étape c) puis pressage des pulpes de façon à obtenir un jus de pressage d’une part et des pulpes de pressage d’autre part e) Microfiltration du jus de pressage obtenu à l’étape d) de façon à obtenir un rétentat d’une part et un perméat d’autre part f) Ultrafiltration du perméat de microfiltration obtenu à l’étape e) de façon à obtenir un rétentat d’une part et un perméat d’autre part g) Osmose inverse du perméat d’ultrafiltration obtenu à l’étape f) h) Lyophilisation du perméat d’ultrafiltration osmosé obtenu à l’étape g).
[0169] Selon un mode de réalisation, l’extrait d’algue obtenu par le procédé et ayant des propriétés anti-inflammatoires présente les caractéristiques suivantes : une teneur en protéines d’environ 30%, une teneur moyenne en composés phénoliques totaux d’environ 4% et environ 10% de sucres totaux.
Complément alimentaire
[0170] Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne également un complément alimentaire comprenant un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention.
[0171] L’ extrait d’algue du genre Ulva est tel que ci-avant défini. [0172] On entend par « complément alimentaire » des denrées alimentaires dont le but est de compléter un régime alimentaire normal et qui constituent une source concentrée de nutriments ou d’autres substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique.
[0173] Selon un mode de réalisation, le complément alimentaire comprend, outre l’extrait d’algue selon l’invention, au moins un ingrédient choisi parmi les nutriments tels que les vitamines et les minéraux, les plantes et/ou extraits de plantes, les substances à but nutritionnel ou physiologique, les adjuvants ou additifs alimentaires tels que les colorants, les arômes, les agents conservateurs.
[0174] Le complément alimentaire pourra comprendre en outre tout l’excipient pharmaceutiquement acceptable tel que préalablement défini.
[0175] Le complément alimentaire selon l'invention peut se présenter sous n'importe quelle forme compatible avec une absorption orale en une ou plusieurs prises journalières. Il peut se présenter notamment sous forme de gélules, de capsules, de comprimés, de pastilles ou de poudre libre, cette dernière étant conditionnée de préférence en sachets unitaires.
[0176] Il est particulièrement intéressant d'utiliser le complément alimentaire comprenant un extrait du genre Ulva selon l'invention dans un complément alimentaire, destiné au patient en surpoids ou obèse, mais également à l’animal de compagnie en surpoids ou obèse.
[0177] Selon un mode de réalisation, le complément alimentaire destiné à l’humain se présente sous la forme de doses unitaires, par exemple sous la forme de gélules, de capsules, de comprimés, de pastilles ou de poudre libre conditionnée en sachets unitaires, chaque dose unitaire comprenant entre 0,05 g et 2 g d’extrait d’algue selon l’invention, préférentiellement entre 0,1 et 1 g, et de manière préférée encore entre 0,2 et 0,8 g.
[0178] Selon un autre mode de réalisation, le complément alimentaire destiné aux animaux de compagnie se présente sous la forme de doses unitaires, par exemple sous la forme de poudre libre conditionnée en sachets unitaires, chaque dose unitaire comprenant entre 0,01 g et 2 g d’extrait d’algue selon l’invention, préférentiellement entre 0,025 et 1 ,5 g, et de manière préférée encore entre 0,03 et 1 g.
[0179] De manière surprenante, l’extrait selon l’invention présente une activité significative à de très faibles concentrations.
[0180] Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, il est de l’avis des inventeurs que des mécanismes d’induction et d’inhibition concentration-dépendantes interviennent ou s’annulent en dessous d’une concentration seuil de l’extrait selon l’invention étant donné que cet extrait est un mélange complexe de molécules différentes qui peuvent logiquement associer des effets de synergie et/ou d’antagonisme.
[0181] La présente invention concerne également l’utilisation d’un complément alimentaire pour son utilisation dans les applications thérapeutiques telles que ci-avant décrites.
Composition alimentaire pour l’homme
[0182] L’ extrait d’algue selon l’invention pourra être intégré dans toute composition alimentaire destinée à l’alimentation humaine. Aussi, l’extrait d’algue selon l’invention pourra être intégré dans des boissons, des substituts de repas, des biscuits, des céréales, des desserts, des préparations lactées, etc.
[0183] La présente invention concerne également un extrait d’algue sous forme de composition alimentaire pour l’homme, caractérisé en ce que la composition alimentaire pour l’homme est sous une forme choisie parmi les boissons, les substituts de repas, les biscuits, les céréales, les desserts, les préparations lactées.
[0184] Il sera particulièrement intéressant d'utiliser la composition alimentaire comprenant un extrait du genre Ulva selon l'invention dans une composition alimentaire, destinée au patient en surpoids ou obèse.
Composition alimentaire pour animaux de compagnie
[0185] La présente invention concerne également une composition alimentaire pour animaux de compagnies comprenant un extrait d’algue du genre Ulva selon l’invention.
[0186] Ces compositions alimentaires ne sont pas destinées à être limitées à une liste spécifique d'ingrédients car ces ingrédients dépendront de facteurs tels que, par exemple, l'équilibre nutritionnel souhaité pour le type spécifique d'animal de compagnie, et la disponibilité des ingrédients. En plus de l’extrait d’algue selon l’invention, la composition alimentaire pour animaux de compagnie peut généralement inclure des vitamines, des minéraux et d'autres additifs tels que des arômes, des conservateurs, des émulsifiants et des humectants. L'équilibre nutritionnel, y compris les proportions relatives de l’extrait d’algue selon l’invention et des autres ingrédients, est déterminé selon les normes diététiques connues dans l'art vétérinaire. Par exemple, l'équilibre nutritionnel d'une composition alimentaire pour chats est déterminé en fonction des besoins alimentaires connus des chats.
[0187] La présente invention concerne également un extrait d’algue sous forme de composition alimentaire pour animaux de compagnie, caractérisé en ce que la composition alimentaire comprend en outre des vitamines, des minéraux et d'autres additifs tels que des arômes, des conservateurs, des émulsifiants et des humectants. [0188] Il sera particulièrement intéressant d'utiliser la composition alimentaire comprenant un extrait du genre Ulva selon l'invention dans une composition alimentaire, destinée aux animaux de compagnie en surpoids ou obèses.
[0189] La présente invention concerne également l’utilisation d’une composition alimentaire pour son utilisation dans les applications thérapeutiques telles que ci-avant décrites.
Exemples
[0190] Exemple 1 : Production et caractérisation d’un extrait d’algue du genre Ulva
[0191] A. Production de l’extrait
[0192] Cette méthode correspond à une adaptation du procédé d’extraction et de fractionnement décrit dans le brevet FR2998894B1 de la société Seprosys, permettant de purifier des fractions protéique et polysaccharidique issues de macroalgues marines vertes.
[0193] Le procédé comprend la succession des étapes suivantes : a) Lavage des algues à traiter b) Broyage des algues lavées c) Diffusion à l’eau des algues lavées dans un volume d’eau réduit d) Filtration des pulpes récupérées après l’étape c) puis pressage des pulpes de façon à obtenir un jus de pressage d’une part et des pulpes de pressage d’autre part e) Microfiltration du jus de pressage obtenu à l’étape d) de façon à obtenir un rétentat d’une part et un perméat d’autre part f) Ultrafiltration du perméat de microfiltration obtenu à l’étape e) de façon à obtenir un rétentat d’une part et un perméat d’autre part g) Osmose inverse du perméat d’ultrafiltration obtenu à l’étape f) h) Lyophilisation du perméat d’ultrafiltration osmosé obtenu à l’étape g).
[0194] 1 kg d’algues sèches est trempé dans 30 I d’eau brute pendant 10 min à température ambiante. Les algues sont ensuite essorées et pressées à l’aide d’un cône en tissu afin de retirer le plus d’eau possible. Les algues lavées sont alors broyées dans 5 I d’eau déminéralisée à 65°C, à l’aide d’un broyeur à couteau, jusqu’à l’obtention de particules de moins de 2 mm de diamètre. Les 5 I de broyât sont transférés dans une cuve thermostatée à 80°C contenant 10 I d’eau déminéralisée à température. L’extraction est réalisée sous agitation constante à l’aide d’un agitateur à pales, à une vitesse de rotation de 10 tours/min pendant 2 h. L’extrait aqueux est ensuite filtré au moyen d’un tamis vibrant présentant un seuil de coupure de 50 pm (toile inox, NEGOFILTRE), afin d’éliminer les résidus d’algues. Les pulpes d’algues sont quant à elles soutirées de la cuve puis pressées à l’aide d’un pressoir (60 hl/h), afin d’extraire le plus de jus possible. Le jus issu du pressoir est alors associé à l’extrait aqueux initial filtré et environ 15 I de jus total d’extraction sont récupérés puis filtrés via une unité de microfiltration de type filtre à plaques équipée de deux filtres de 1 ,2 pm puis 0,8 pm (3M, 40*40, taille de pores 15 HN et 50 HN). Environ 15 I de perméat sont récupérés, puis filtrés à nouveau via une unité d’ultrafiltration équipée d’une membrane de type Kerasep KBW 15 kDa (Novasep Process). La filtration est réalisée à 80°C, 5 bars et à un débit de circulation de 450 l/h, soit une vitesse de circulation de 5 m/s. La filtration est poursuivie jusqu’à obtenir un rétentat d’environ 4 Bx, qui est alors soutiré de l’unité. Le perméat est quant à lui récupéré puis osmosé sur une unité d’osmose inverse équipée d’une membrane de type SW 30 HR (Dow), permettant de concentrer la fraction. L’osmose inverse est réalisée à 30°C, entre 20 et 30 bars et à un débit de circulation de 120 l/h, soit une vitesse de circulation de 1 ,3 m/s. L’osmose inverse est poursuivie jusqu’à obtenir un rétentat d’environ 13 Bx, qui est alors soutiré de l’unité, puis lyophilisé. Cette fraction obtenue de type perméat d’ultrafiltration osmosé sera ci-après dénommée extrait d’algue du genre Ulva de type perméat ou « fraction P ».
[0195] Caractérisation de l’extrait
F01961 a) Solubilité
[0197] Plusieurs solvants différents sont utilisés pour évaluer la solubilité de l’extrait d’algue du genre Ulva de type perméat (fraction P) : eau, acétonitrile (ACN), méthanol, éthanol, acétone, hexane, mélange eau/ACN (1 :1 , v/v), et mélange méthanol/acétone (1 :1 , v/v). Différentes quantités massiques d’extrait solide sont mélangées sous vortex avec les différents solvants puis l’absorbance de la solution ou suspension obtenue est mesurée à 600 nm au moyen d’un spectrophotomètre microplaque FLUOstar Omega (BMG LABTECH). Après soustraction du blanc obtenu à partir de chaque solvant pur, la solution est considérée limpide et l’extrait soluble si l’absorbance obtenue est inférieure à 0,02.
[0198] La fraction P est soluble uniquement dans l’eau et le mélange eau/ACN (1 :1 , v/v) (Tableau 1 ), sa solubilité étant maximale dans l’eau (1 g/l), et minimale dans le mélange eau/ACN (1 :1 , v/v).
[0199] [Tableau 1]
[0200] Tableau 1 : Solubilité de la fraction P dans l’eau et le mélange eau/acétonitrile (1 :1 , v/v).
[0201] b) Caractérisation biochimique [0202] Deux solvants, eau et mélange eau/ACN (1 :1 , v/v), sont utilisés pour préparer deux solutions de fraction P à 20 mg/ml. Celles-ci sont ensuite centrifugées à 15000 rpm durant 2 min puis filtrées sur 0,22 pm afin d’obtenir une solution finale contenant uniquement les composés solubles. En raison de l’influence de la couleur de ces deux solutions sur la mesure d’absorbance, celles-ci sont ensuite diluées au 1/18 au moyen du même solvant, avant analyse.
[0203] L’ ensemble des analyses est réalisé sous forme de triplicatas.
[0204] Teneurs en protéines
[0205] La teneur en protéines est évaluée au moyen de trois protocoles biochimiques, issus respectivement des méthodes de Lowry (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov; 193(1 ):265- 75), Smith (Smith PK, Krohn Rl, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985 Oct;150(1 ):76- 85) et Kjeldahl (Kirk PL. Kjeldahl Method for Total Nitrogen. Anal Chem. 1950 Feb 15;22(2):354— 8).
[0206] - Méthode de Lowry :
[0207] Celle-ci implique l’utilisation de deux réactifs : le réactif de Lowry qui consiste en un mélange de 100 pl de solution de tartrate double de potassium et sodium à 2% (m/v), 100 pl de solution de sulfate de cuivre à 1 % (m/v) et 10 ml de solution de carbonate de sodium à 2% (m/v) dans NaOH 0,1 M ; et le réactif de Folin, correspondant à une dilution au 1/20 du réactif au phénol de Folin-Ciocalteu dans l’eau ultrapure.
[0208] Dans une microplaque 96 puits (NUNC 96 A/S, Danemark), 25 pl de solution à doser sont ajoutés à 75 pl de réactif de Lowry avant incubation durant 20 min à température ambiante et dans l’obscurité. Puis 125 pl de réactif de Folin sont ajoutés au mélange réactionnel. Une seconde incubation de 30 min, à température ambiante et à l’obscurité, est appliquée avant mesure de l’absorbance à 750 nm au moyen d’un spectrophotomètre microplaque FLUOstar Omega (BMG LABTECH). Une gamme étalon d’albumine de sérum bovin (ASB) de 50 à 600 pg.ml-1 est réalisée simultanément dans les mêmes conditions.
[0209] - Méthode de Smith, à l’acide bicinchoninique (BCA) :
[0210] Dans une microplaque 96 puits (NUNC 96 A/S, Danemark), sont ajoutés 200 pl de réactif BCA (acide bicinchoninique/sulfate de cuivre à 4% (m/v) (50:1 , v/v)), et 10 pl de solution à doser. Après incubation à 37°C dans une étuve durant 30 min, l’absorbance à 562 nm est mesurée en utilisant un spectrophotomètre microplaque FLUOstar Omega (BMG LABTECH). Une gamme-étalon d’ASB allant de 50 à 600 mg/l est réalisée simultanément dans les mêmes conditions.
[0211] - Méthode de Kjeldahl :
[0212] Cette méthode implique deux étapes successives, une première de minéralisation et une seconde de distillation. Pour la minéralisation, 1 g d’échantillon est ajouté dans un matra, avec 2 comprimés de catalyseur. Un matra contenant uniquement les comprimés est utilisé à blanc et un autre matra contenant une quantité connue d'urée ainsi que les 2 comprimés de catalyseur est utilisé comme témoin. 10 ml d'acide sulfurique 96% sont ajoutés dans le matra. La solution est ensuite chauffée durant 2 h à environ 400°C. Après la minéralisation, la distillation est effectuée durant 6 min après addition de 50 ml de NaOH 30% (m/v) et de 50 ml d'eau ultrapure. Le liquide est ensuite recueilli dans une solution d'acide borique (4% (m/v), pH 4,65) et titré avec de l’HCI 1 M.
[0213] Teneur en sucres totaux
[0214] Le dosage des sucres totaux est effectué par la méthode au mélange phénol/acide sulfurique introduite par Dubois (Dubois M, Gilles K, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. A Colorimetric Method for the Determination of Sugars. Nature. 1951 Jul;168(4265):167— 167). Dans des vials en verre, 40 pl de la solution à doser sont ajoutés à 40 pl de phénol 5% (m/v) et à 200 pl d’acide sulfurique 96%. Le mélange réactionnel est incubé durant 30 min, à 90°C et dans l’obscurité. Les échantillons sont par la suite refroidis dans la glace. L’absorbance est ensuite mesurée à 485 nm dans une microplaque 96 puits, au moyen d’un spectrophotomètre microplaque FLUOstar Omega (BMG LABTECH). Une gamme- étalon de rhamnose, monomère représentatif, allant de 0,025 à 0,6 mg/ml, est réalisée simultanément dans les mêmes conditions.
[0215] Teneur en composés phénoliques totaux
[0216] Le dosage des composés phénoliques totaux est effectué en utilisant la méthode de Singleton et Rossi (Singleton VL, Rossi JA. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic. 1965 Jan 1 ; 16(3): 144), avec quelques modifications.
[0217] Dans des tubes à centrifuger sont introduits 10 pl d’échantillon à doser et 790 pl d’eau ultrapure. Après mélange, 20 pl de Na2CO3 20% (m/v) puis 50 pl de réactif de Folin- Ciocalteu 2 N sont ajoutés. Les tubes sont incubés à température ambiante, à l’obscurité, durant 2 h. 200 pl de milieu réactionnel sont ensuite transférés dans une microplaque 96 puits et l’absorbance à 730 nm est mesurée en utilisant un spectrophotomètre microplaque FLUOstar Omega (BMG LABTECH). Une gamme-étalon d’acide gallique, composé phénolique de référence, allant de 10 à 150 pg/ml, est réalisée simultanément dans les mêmes conditions.
[0218] La caractérisation biochimique de la fraction P montre que cette fraction présente une teneur importante en protéines, allant de 28,6% à 31 ,6% en fonction de la méthode de dosage appliquée et de la nature du solvant utilisé pour sa solubilisation. Ces résultats très proches permettent de moyenner cette teneur en protéines totales à environ 30%. De la même manière, les composés phénoliques totaux sont quantifiés à des valeurs très similaires, quel que soit le solvant utilisé, donnant une teneur moyenne d’environ 4%. Les résultats obtenus en termes de teneur en sucres totaux sont en revanche très différents, la teneur mesurée dans le mélange eau/ACN (1 :1 , v/v) étant beaucoup plus faible (3,3%) que celle mesurée dans l’eau (10,0%). Ceci est cohérent, compte-tenu de la moindre solubilité des oligo- et/ou poly-saccharides resuspendus dans un mélange composé d’eau et d’ACN, qui est un solvant moins polaire, alors qu’ils ont été initialement extraits dans l’eau pure. En conclusion, l’extrait contient 10% de sucres totaux.
[0219] [Tableau 2]
[0220] Exemple 2 : Production et caractérisation d’un extrait d’algue du genre Ulva
[0221] Afin d’évaluer l’effet anti-inflammatoire in vitro de l’extrait d’algue du genre Ulva de type perméat (fraction P), ce dernier a été testé sur une lignée cellulaire de macrophages murins Raw 264,7 fournies par ATCC Cell (« American Type Culture Collection ») : code ATCC-TIB-71. Il s’agit de macrophages immortalisés de souris utilisés comme modèles d’étude biologique de référence dans les maladies métaboliques, pour mesurer une activité anti/pro-inflammatoire (Jones E, Adcock IM, Ahmed BY, Punchard NA. Modulation of LPS stimulated NF-kappaB mediated Nitric Oxide production by PKCc and JAK2 in RAW macrophages. Journal of Inflammation. 2007 Nov 24;4(1 ):23). [0222] Pour l’ensemble de ces évaluations, un test statistique one-way ANOVA a été réalisé à l’aide du logiciel Origin 6 (OriginLab Corporation).
[0223] A. Effet d’un extrait d’algue du genre Ulva (perméat) sur la viabilité cellulaire de macrophages Raw 264,7 en culture :
[0224] Les cellules sont cultivées dans un milieu Dulbecco’s ModifiedEagle Medium (DMEM) (PAN Biotech, Dutscher) supplémenté par 10% (v/v) de sérum de veau foetal (PAN Biotech, Dutscher) et 1% (v/v) d’une solution antibiotique (10,000 U/ml de pénicilline, 10 mg/ml de streptomycine) (PAN Biotech, Dutscher). Ce milieu, ci-après dénommé « milieu complet », est stérilisé par filtration sur 0,22 pm. Les cellules sont cultivées dans un incubateur à température contrôlée de 37°C, avec 5% de CO2, sous atmosphère humide, dans des flasques ventilées de 75 cm2 (BD Biosciences), et entretenues par arrachage mécanique avec scrapeur (Sarstedt). Le milieu de culture est renouvelé tous les 2 ou 3 jours. Toutes les manipulations sont effectuées sous un poste de sécurité microbiologique de classe 2. Pour les expériences, les cellules sont utilisées entre les nème et I6ème passages.
[0225] L’ effet de l’extrait d’algue du genre Ulva de type perméat (fraction P) sur la viabilité cellulaire est déterminé via la conversion enzymatique du MTT (bromure de 3-(4,5- diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) (Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16;65(1-2):55-63). Ce test repose sur la réduction du sei de tétrazolium par la succinate déshydrogènase mitochondriale en cristaux de Formazan. Les cellules sont ensemencées dans des microplaques 96 puits stériles (BD Biosciences), à une concentration de 5x104 cellules/ml dans un volume de 100 pi de milieu complet. Après 24 h d’incubation, le milieu complet est remplacé par 100 pl de milieu complet contenant la fraction P à différentes concentrations (comprises entre 0,01 et 500 pg/ml), ou de la dexaméthasone à 1 pM (composé médicamenteux anti-inflammatoire, utilisé comme témoin positif. Un témoin négatif contenant uniquement du milieu complet est également utilisé. Après 24 h d’exposition, 25 pl d’une solution de MTT à 5 mg/ml dans le PBS sont ajoutés dans chaque puits, lesquels sont alors incubés pendant 4 h dans l’étuve de culture. Le milieu est ensuite retiré puis 200 pl de DMSO (diméthyl-sulfoxide) sont ajoutés dans chaque puits afin de solubiliser les cristaux de Formazan formés. Après 10 min d’incubation à température ambiante, l’absorbance à 550 nm est mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaque Fluostar Omega (BMG LABTECH).
[0226] La viabilité cellulaire est déterminée selon la formule suivante :
[0227] [Math.1]
[0228] La figure 1A montre l’impact de la fraction P sur la viabilité des macrophages Raw 264,7, comparée aux conditions contrôles, après 24h d’exposition. La figure 1 B montre la même expérience en présence de lipopolysaccharide (LPS) de salmonelle à 1 pg/ml (LPS 0111 , référence L2630, Merck), après 6 h de pré-incubation avec la fraction P à différentes concentrations. Dans les deux cas, l’effet d’un anti-inflammatoire de référence utilisé en tant que témoin positif, la dexaméthasone (1 pM), est également comparé. Les résultats obtenus démontrent que ni la fraction P, quelle que soit sa concentration, ni la dexaméthasone à 1 pM ne présentent d’effet significatif sur la viabilité cellulaire des macrophages Raw 264,7, qu’ils soient cultivés en présence de LPS ou non.
[0229] B, Effet d’un extrait d’algue du genre Ulva (perméat) sur la sécrétion d’oxyde nitrique (NO) par des macrophages Raw 264,7 en culture, en conditions basales ou proinflammatoires
[0230] L’oxyde nitrique (NO) est un médiateur central du processus inflammatoire, qui régule l'activité, la croissance et la mort de nombreux types de cellules immunitaires et inflammatoires (Grisham MB, Jourd’Heuil D, Wink DA. Nitric oxide. I. Physiological chemistry of nitric oxide and its metabolites:implications in inflammation. Am J Physiol. 1999 Feb;276(2):G315-321 , Lee M, Rey K, Besler K, Wang C, Choy J. Immunobiology of Nitric Oxide and Regulation of Inducible Nitric Oxide Synthase. Results Probl Cell Differ. 2017;62:181-207). Le dosage du NO peut être réalisé à partir des surnageants de culture des macrophages RAW 264.7 selon le protocole décrit par Li et Shah (Li S, Shah NP. Characterization, Anti-Inflammatory and Antiproliferative Activities of Natural and Sulfonated Exo-Polysaccharides from Streptococcus thermophilus ASCC 1275. Journal of Food Science. 2016;81 (5):M1167-76), qui implique la réaction du réactif de Griess avec le NO, donnant lieu à la formation d’un chromophore stable absorbant à 540 nm.
[0231] Les cellules et les conditions de culture sont les mêmes que celles décrites dans l’exemple 2, partie A. Les cellules sont ensemencées dans des microplaques 96 puits stériles (BD Biosciences), à raison de 1 ,5.106 cellules/ml, dans du milieu DMEM complet. Après 24 h d’incubation, le milieu initial est remplacé par 100 pi de milieu complet contenant la fraction P à différentes concentrations (comprises entre 0,01 et 100 pg/ml), ou de la dexaméthasone à 1 pM (composé anti-inflammatoire de référence utilisé comme témoin positif), avant à nouveau 6 h d’incubation. Un témoin négatif contenant uniquement du milieu complet est également réalisé. Pour évaluer les effets anti-inflammatoires de l’extrait d’algue du genre Ulva de type perméat (fraction P), la même expérience est menée en parallèle, cette fois avec 6 h de prétraitement en présence de perméat à diverses concentrations, ou de dexaméthasone à 1 pM, suivi d’une incubation en présence de lipopolysaccharide (LPS) de salmonelle à 1 pg/ml (LPS 0111 , référence L2630, Merck) durant 18 h.
[0232] Le kit « Griess Reagent Kit for Nitrite Determination » (G-7921 , Invitrogen™, Thermo Fischer Scientific), est utilisé afin de doser la concentration en NO dans les surnageants de culture cellulaire, selon le protocole donné par le fournisseur. 150 pi de surnageant cellulaire sont prélevés pour être dosés à l’aide d’un volume équivalent de réactif de Griess. Après incubation à température ambiante pendant 30 min, l’absorbance est mesurée à 540 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque Fluostar Omega (BMG LABTECH).
[0233] La figure 2 montre l’effet de la fraction P sur la sécrétion de NO dans le milieu de culture en conditions basales (A) ou inflammatoires (B). Une augmentation de la sécrétion de NO par rapport aux conditions contrôles est observée en présence de LPS (contrôle positif), ainsi que pour les deux concentrations les plus importantes en fraction P (10 et 100 pg/ml) (figure 2A).
[0234] Au contraire, la fraction P induit une diminution très significative de la production de NO en présence de LPS (figure 2B), la concentration de NO dans le surnageant de culture étant divisée par deux à la concentration de 1 pg/ml et par environ 1 ,5 aux concentrations de 0,01 et 0,1 g/ml, par rapport aux conditions contrôles inflammatoires impliquant le LPS seul. Ces résultats indiquent que la fraction P est très fortement anti-inflammatoire car elle induit une réduction de la sécrétion de NO proche de celle induite par la dexaméthasone, à très faible concentration.
[0235] C. Effet d’un extrait d’algue du genre Ulva (perméat) sur l’expression de protéines clés impliguées dans les voies de signalisation liées à l’inflammation provoguée par le LPS, par des macrophages Raw 264,7 en culture
[0236] L’ évaluation de la modulation par l’extrait d’algue du genre Ulva de type perméat (fraction P) de voies de signalisation protéiques impliquées dans l’inflammation, vient compléter et préciser celle de la sécrétion d’oxyde nitrique par les macrophages Raw 264,7 en culture. Celle-ci est réalisée par analyse Western Blot de biomarqueurs protéiques impliqués dans le processus inflammatoire : NLRP-3 et iNOS. NLRP-3, aussi dénommé inflammasome, appartient à une classe de complexes protéiques cytoplasmiques (NLRP) qui modulent l’activation des médiateurs inflammatoires. NLRP-3 joue un rôle pivot parmi la classe des NLRP, et est activé après stimulation par des facteurs microbiens et non microbiens tels que des toxines bactériennes, des micro-particules ou des LPS. Il promeut l’expression, la maturation et la sécrétion d’une multitude de cytokines pro-inflammatoires (Wang Z, Zhang S, Xiao Y, Zhang W, Wu S, Qin T, et al. NLRP3 Inflammasome and Inflammatory Diseases. Oxid Med Cell Longev. 2020 Feb 17;2020:4063562). L’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) catalyse la synthèse de l’oxyde nitrique (NO), qui est un médiateur clé de l’inflammation. Le LPS, l’interféron gamma (IFN-y), le TNF-a et l'IL-1 P peuvent induire l'expression de l’iNOS. (Lee M, Rey K, Besler K, Wang C, Choy J. Immunobiology of Nitric Oxide and Regulation of Inducible Nitric Oxide Synthase. Results Probl Cell Differ. 2017;62:181-207).
[0237] La méthode Western Blot est un procédé d’analyse semi-quantitative d’expression des protéines présentes dans les cellules. Les cellules et les conditions de culture sont les mêmes que celles décrites dans l’exemple 2, partie A. Les cellules Raw 264,7 sont ensemencées dans des microplaques 6 puits stériles (BD Biosciences), à 1x106 cellules/ml, dans 1 ml de milieu DMEM complet. Après 24 h d’incubation, le milieu initial est remplacé par 1 ml de milieu complet contenant la fraction P à différentes concentrations ou de la dexaméthasone à 1 pM (composé anti-inflammatoire de référence utilisé comme témoin positif), avant à nouveau 6 h d’incubation. Un témoin négatif contenant uniquement du milieu complet est également réalisé. Le LPS à 1 pg/ml est alors ajouté dans tous les puits, excepté celui correspondant aux conditions contrôles, puis l’incubation est poursuivie pendant 18 h. Le surnageant cellulaire est éliminé puis un lysat cellulaire est préparé dans le tampon de lyse (RIPA, Thermo Fisher Scientific) supplémenté avec un inhibiteur de phosphatase (Cell Signaling). Le lysat cellulaire est centrifugé durant 5 min à 10000 g, à 4°C. La concentration protéique dans le surnageant est ensuite obtenue par application de la méthode de Smith, à l’acide bicinchoninique (BCA), selon le protocole donné dans l’exemple 1. Une quantité équivalente de protéines pour chaque échantillon (25 pg) est mélangée avec du tampon de charge (Bio-Rad) et du p-mercaptoethanol (Merck) de manière à atteindre un volume final de 50 pl. Les échantillons sont alors chauffés à 95 °C pendant 5 min puis 10 pl sont déposés, après retour après température ambiante, dans des gels à différentes concentrations de polyacrylamide en fonction du poids moléculaire de la protéine étudiée. Des marqueurs de taille sont également ajoutés dans le gel (Seeblue® plus 2, Thermo Fisher Scientific). La migration est effectuée à 150 V pendant 45 min dans un tampon de migration. Les protéines sont ensuite transférées du gel à une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad), à 100 V pendant 7 min dans un tampon de transfert grâce au procédé de transfert semi-liquide (Bio-Rad). La membrane est ensuite bloquée pendant 1 h30 à température ambiante, à l’aide d’une solution de blocage contenant 5% d’albumine de sérum bovin (ASB) dans du TBS-Tween 20 (Merck). La membrane est incubée en présence de l’anticorps primaire, durant une nuit à 4°C, puis en présence de l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort, durant 1 h30 à température ambiante (15).
[0238] [Tableau 3]
[0239] Tableau 3 : Anticorps primaires et secondaire utilisés pour l’analyse Western Blot des voies de signalisation impliquées dans l’inflammation induite par le LPS.
[0240] La solution de révélation (SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Fischer Scientific) est appliquée à la membrane pendant 1 min, puis l’acquisition est réalisée par un système Chemidoc (Bio-Rad). L’analyse des densités des bandes est réalisée par le logiciel ImageLab (Bio-Rad) et les résultats sont exprimés par rapport à la quantité de la protéine 0-actine présente dans les échantillons, choisie comme protéine de ménage.
[0241] Cette analyse par western blot prouve que la fraction P induit une réduction drastique de l’expression des protéines NLRP3 et iNOS, impliquées dans le processus inflammatoire dans les macrophages Raw 264,7 en culture (figure 3). Cet effet est obtenu de manière dose-dépendante pour NLRP-3, la fraction P inhibant son expression dès la concentration de 1 pg/ml.
[0242] A l’inverse, l’expression de iNOS n’est réduite qu’à faible concentration (0,1 et 1 pg/ml), la fraction P n’ayant pas d’activité significative à 10 pg/ml. Cet effet dose-réponse inversé peut trouver son origine dans deux causes principales. Soit l’intervention de mécanismes d’induction et d’inhibition concentration-dépendants, qui interviennent ou s’annulent en dessous d’une concentration seuil, la fraction P étant en effet un mélange très complexe de molécules différentes qui peuvent logiquement associer des effets de synergie ou/et d’antagonisme. Soit l'éventuelle implication d’un phénomène d’hormésis, terme de toxicologie désignant une réponse biologique en deux phases à un composé, caractérisée par une stimulation à faible dose associée à un effet bénéfique, et par une inhibition à forte dose associée à un effet toxique. La seconde hypothèse est très peu probable, compte-tenu que la fraction P n'est pas cytotoxique aux concentrations étudiées, comme l’a prouvé le test de viabilité cellulaire MTT communément utilisé, présenté dans l’exemple 2 (partie A), et ce en présence ou non de LPS.
[0243] Dans leur ensemble, ces résultats corroborent totalement l’effet anti-inflammatoire démontré par la fraction P vis-à-vis de la production de NO par les macrophages Raw 264,7 en culture, présenté dans l’exemple 1 (partie B). [0244] D. Effet d’un extrait d’algue du genre Ulva (perméat) sur la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par des macrophages Raw 264,7 en culture, en présence de LPS :
[0245] L’ évaluation de la modulation par la fraction P de la sécrétion de cytokines proinflammatoires dans le milieu extracellulaire vient également compléter et préciser celle de la sécrétion d’oxyde nitrique par les macrophages Raw 264,7 en culture, ainsi que des voies de signalisation protéiques impliquées dans l’inflammation. Celle-ci est réalisée par méthode ELISA, pour l’analyse quantitative de deux cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les cellules et présentes dans le milieu extracellulaire : le TNF-g et l’IL-6.
[0246] Les cellules et les conditions de culture sont les mêmes que celles décrites dans l’exemple 2, partie A. Les cellules Raw 264,7 sont ensemencées dans des microplaques 6 puits stériles (BD Biosciences), à 1x106 cellules/ml, dans 1 ml de milieu DMEM complet. Après 24 h d’incubation, le milieu initial est remplacé par 1 ml de milieu complet contenant la fraction P à différentes concentrations (comprises entre 0,01 et 100 pg/ml), ou de la dexaméthasone à 1 pM (composé anti-inflammatoire de référence utilisé comme témoin positif) avant à nouveau 6 h d’incubation. Un témoin négatif contenant uniquement du milieu complet est également réalisé. Le LPS à 1 pg/ml est alors ajouté dans tous les puits, excepté celui correspondant aux conditions contrôles, puis l’incubation est poursuivie pendant 18 h. Le surnageant de culture est ensuite retiré et congelé à -80°C. Les concentrations de TNF-g et IL-6 dans ce surnageant sont alors déterminées selon la méthode indiquée par le fournisseur du kit (Peprotech), impliquant deux mesures finales d’absorbance, l’une d’évaluation, à 405 nm, et l’autre de correction, à 650 nm, effectuées à l’aide d’un lecteur de microplaque Fluostar Omega (BMG LABTECH).
[0247] La sécrétion des deux cytokines pro-inflammatoires est considérablement augmentée en présence du LPS, comparé aux conditions contrôles (figure 4). La fraction P présente également cet effet pro-inflammatoire à forte concentration : à partir de 1 pg/ml pour la sécrétion du TNF-g et 10 pg/ml pour la sécrétion de l’IL-6. En-dessous de ces concentrations seuils, aucune différence significative n’est observée par rapport aux conditions contrôles.
[0248] Après 6 h de pré-incubation avec la fraction P et en présence de LPS, la sécrétion du TNF-o et de l’IL-6 est drastiquement réduite, atteignant un niveau similaire à celui obtenu en présence de la dexaméthasone, composé anti-inflammatoire de référence, et ce y compris à la très faible concentration de 0,1 pg/ml.
[0249] Dans leur ensemble, ces résultats démontrent l’effet anti-inflammatoire de la fraction P vis-à-vis de la production de NO, de l’expression des protéines clés impliquées dans les cascades de signalisation liées au processus inflammatoire (NLRP-3 et iNOS), et de la production de cytokines pro-inflammatoires.
[0250] Exemple 3 : Démonstration d’efficacité in vivo d’un extrait d’algue du genre Ulva (perméat) sur un modèle d’altérations comportementales induites par un régime
[0251] Des souris adultes mâles C57BI/6J, fournies par la société Janvier et hébergées au sein de l’animalerie du laboratoire NutriNeuro, ont été nourries soit avec un régime nutritionnellement équilibré (régime A04), soit avec un régime hypercalorique enrichi en gras et en sucre (régime HFD) pendant 12 semaines afin d’induire une prise de poids associée à un syndrome métabolique et à des altérations comportementales selon un protocole classiquement décrit dans la littérature et utilisé au sein du laboratoire NutriNeuro (Zemdegs J, Quesseveur G, Jarriault D, Pénicaud L, Fioramonti X, Guiard BP. High-fat diet- induced metabolic disorders impairs 5-HT function and anxiety-like behavior in mice. Br J Pharmacol. 2016 Jul; 173(13):2095— 110, Zemdegs J, Martin H, Pintana H, Bullich S, Manta S, Marqués MA, et al. Metformin Promotes Anxiolytic and Antidepressant-Like Responses in Insulin-Resistant Mice by Decreasing Circulating Branched-Chain Amino Acids. J Neurosci. 2019 Jul 24;39(30):5935-48).
[0252] Afin d’évaluer l’effet de l’extrait d’algue du genre Ulva de type perméat (fraction P) sur les altérations métaboliques et comportementales, une supplémentation en fraction P à 1 mg/ml est apportée aux animaux via l’eau de boisson pendant 4 semaines à la suite des 12 semaines de régime HFD. A l’issue de cette supplémentation, les paramètres métaboliques (poids, masse grasse et masse maigre) et comportementaux (comportement de type anxieux, capacité mnésique) sont évalués.
[0253] Pour l’ensemble de ces évaluations, un test statistique one-way ANOVA associé à un test Tuckey post-hoc a été réalisé à l’aide du logiciel GraphPad Prism 7 (Graph PadSotfware).
[0254] A. Impact d’une supplémentation en extrait d’algue du genre Ulva (perméat) sur les paramètres métaboliques
[0255] A l’issue de la supplémentation, les animaux sont pesés afin d’évaluer l’impact de la supplémentation sur la prise de poids. Comme attendu, les souris nourries avec un régime HFD présentent un poids significativement plus important que les souris nourries avec le régime contrôle (AO4) (F (2, 22) = 12,34, p<0,001 ) (figure 5). De plus, la supplémentation en fraction P induit une perte de poids statistiquement significative chez les souris HFD supplémentées par rapport aux souris ne recevant pas la supplémentation (p<0,01 ). Le poids des souris HFD supplémentées en fraction P n’est pas statistiquement différent de celui des souris contrôles.
[0256] Une analyse via un dispositif d’IRM 3T à séquences en écho de spin a permis de quantifier la masse maigre et la masse grasse des souris. Comme attendu, les souris nourries avec un régime HFD présentent une quantité de masse maigre significativement plus faible que les souris contrôles (F (2, 22) = 35,11 , p<0,001 ), sans effet de la supplémentation. Cependant, les souris HFD non supplémentées présentent une quantité de masse grasse significativement plus importante que les souris contrôles (F (2, 22) = 36,59, p<0,001 ). Mais la supplémentation en fraction P permet de diminuer significativement les quantités de masse grasse chez les souris nourries avec un régime HFD (F (2, 22) = 36,59, p<0, 01 ).
[0257] La supplémentation en fraction P protège ainsi contre la prise de masse grasse induite par le régime HFD.
[0258] B. Impact d’une supplémentation en extrait d’algue du genre Ulva (perméat) sur les >
[0259] a) Evaluation des troubles de type anxieux
[0260] Le comportement de type anxieux des animaux a été évalué dans le test du labyrinthe en croix surélevé. Deux bras opposés sont sans parois (ouverts) et les deux autres ont des parois de 10 cm de haut (fermés). Au centre se situe une plateforme ouverte sur les quatre bras. Les souris sont placées sur la plateforme centrale au début du test et sont libres d’explorer le labyrinthe pendant 5 min. Le temps passé dans les différentes zones a été mesuré par le système de vidéo-tracking SMART (Bioseb). Ce dispositif permet de déterminer l’état d’anxiété des animaux qui vont spontanément éviter les bras ouverts naturellement anxiogènes et préférer les bras fermés. Il a été montré au moyen de ce dispositif que des traitements pharmacologiques par des anxiolytiques étaient efficaces pour contrecarrer l’aversion naturelle procurée par les bras ouverts.
[0261] Comme attendu, les animaux nourris avec un régime HFD et non supplémentés présentent une diminution significative du temps passé dans les bras ouverts du labyrinthe en croix surélevé (F (2, 20) = 7,376, p<0,05) et présentent donc des troubles de type anxieux (figure 5). La supplémentation en fraction P restaure le temps d’exploration des animaux dans les bras ouverts (F (2, 20) = 7,376, p<0,01 ). La supplémentation en fraction P protège ainsi de la mise en place des troubles de type anxieux induits par le régime HFD.
[0262] Evaluation des altérations mnésiciues [0263] Afin d’évaluer les effets chroniques du traitement sur la mémoire, les souris sont testées dans le labyrinthe aquatique de Morris.
[0264] Le test du labyrinthe aquatique mis au point par Morris (Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 1984 May;11 (1 ):47-60.), permet de mesurer les capacités d’apprentissage et de mémoire spatiale chez l’animal. Dans ce protocole expérimental, cette épreuve met plus particulièrement en jeu la mémoire spatiale de référence dépendante de l’hippocampe. L’animal est placé dans une piscine et doit apprendre à localiser une plateforme refuge en utilisant les indices visuels répartis sur les murs de la salle.
[0265] Pour effectuer ce test, nous disposons d’une piscine circulaire (150 cm de diamètre), remplie d’eau (35 cm de profondeur, température : 22±2°C), rendue opaque par l’ajout de peinture blanche. La plateforme (10 cm de diamètre) est immergée à 5 cm sous la surface de l’eau et se trouve à 30 cm du bord de la piscine. Le protocole choisi se déroule en 4 étapes (figure 7) :
1 -l’habituation : permet aux souris de se familiariser à la nage et au fait de monter sur une plateforme. Cette étape se déroule dans une bassine circulaire (65 cm de diamètre) remplie d’eau claire.
2-l’apprentissage indicé : permet d’évaluer la présence de déficits moteurs ou visuels et accentue la familiarisation. Les animaux doivent trouver la plateforme immergée indiquée par un indice.
3-l’apprentissage spatial de référence : les animaux doivent trouver une plateforme immergée et non visible en utilisant les indices visuels distaux.
4-le test de restitution : permet d’évaluer la mémoire spatiale. Les souris sont placées dans la piscine en absence de plateforme et doivent chercher pendant 1 min l’endroit où la plateforme était initialement positionnée.
[0266] Les déplacements de la souris sont enregistrés par un système de vidéo-tracking (SMART), qui permet pour chaque essai d’obtenir la latence pour atteindre la plateforme ainsi que la distance totale parcourue dans la piscine. La vitesse de nage des souris est déduite de ces valeurs. Le temps passé dans les différents quadrants ainsi que la distance parcourue et le nombre d’entrées dans le quadrant cible sont calculés.
[0267] Dans notre protocole, les animaux contrôles nourris avec un régime équilibré ne présentent pas d’altération cognitive et discriminent de façon significative le quadrant cible par rapport à une exploration au hasard (p<0,001 ). Comme attendu, les animaux sous régime HFD ne sont pas capables de reconnaître le quadrant cible et présentent donc des altérations de leur mémoire spatiale à long terme (figure 8). De façon intéressante, la supplémentation en fraction P permet de restaurer les capacités cognitives des animaux puisqu’ils différencient de façon statistiquement significative le quadrant cible par rapport au hasard (p<0,05). Il n’y a pas de différence d’apprentissage entre les groupes.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Extrait d’algue du genre Ulva caractérisé en ce que :
- la teneur en protéines est comprise entre 5 et 60% en masse, préférentiellement entre 15 et 50% en masse, préférentiellement entre 25 et 35% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait,
- la teneur en composés phénoliques totaux est comprise entre 0,5 et 40% en masse, préférentiellement entre 1 et 20% en masse, préférentiellement entre 1 et 10% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait,
- la teneur en sucres totaux est comprise entre 0,5 et 80% en masse, préférentiellement entre 1 et 50% en masse, préférentiellement entre 5 et 15% en masse, par rapport à la masse sèche totale de l’extrait, pour son utilisation pour le traitement de troubles induits par un syndrome métabolique.
[Revendication 2] Extrait d’algue pour son utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les troubles induits par un syndrome métabolique sont choisis parmi l’inflammation induite par un syndrome métabolique et les troubles cognitifs et/ou émotionnels induits par un syndrome métabolique.
[Revendication 3] Extrait d’algue pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’inflammation ou les troubles cognitifs et/ou émotionnels sont induits par l’obésité ou le surpoids.
[Revendication 4] Extrait d’algue pour son utilisation selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que les troubles cognitifs et émotionnels sont choisis parmi les troubles de mémoire à long terme hippocampo-dependants et les troubles de type anxieux.
[Revendication 5] Extrait d’algue pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la teneur en protéines est comprise entre 28 et 32% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[Revendication 6] Extrait d’algue pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la teneur en composés phénoliques totaux est comprise entre 2 et 6% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[Revendication 7] Extrait d’algue pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la teneur en sucres totaux est comprise entre 5 et 15% en masse par rapport à la masse sèche totale de l’extrait.
[Revendication 8] Extrait d’algue pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l’algue du genre Ulva est choisie parmi Ulva lactuca, Ulva rigida, Ulva conglobata, Ulva ohnoi, Ulva reticulata, Ulva proliféra, Ulva flexuosa et Ulva intestinalis.
[Revendication 9] Extrait d’algue pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l’algue du genre Ulva est choisie parmi Ulva lactuca et Ulva rigida.
[Revendication 10] Extrait d’algue pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l’extrait d’algue est présent sous la forme d’une composition pharmaceutique, d’une composition vétérinaire, d’un complément alimentaire ou d’une composition alimentaire pour l’homme ou pour les animaux de compagnie.
[Revendication 11] Extrait d’algue pour son utilisation selon la revendication 10 caractérisé en ce que la composition pharmaceutique ou vétérinaire comprend en outre un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[Revendication 12] Extrait d’algue pour son utilisation selon la revendication 10 caractérisé en ce que le complément alimentaire comprend en outre au moins un ingrédient choisi parmi les nutriments tels que les vitamines et les minéraux, les plantes et/ou extraits de plantes, les substances à but nutritionnel ou physiologique, les adjuvants ou additifs alimentaires tels que les colorants, les arômes, les agents conservateurs, et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[Revendication 13] Extrait d’algue pour son utilisation selon la revendication 10 caractérisé en ce que la composition alimentaire pour l’homme est sous une forme choisie parmi les boissons, les substituts de repas, les biscuits, les céréales, les desserts, les préparations lactées.
[Revendication 14] Extrait d’algue pour son utilisation selon la revendication 10 caractérisé en ce que la composition alimentaire comprend en outre des vitamines, des minéraux et d'autres additifs tels que des arômes, des conservateurs, des émulsifiants et des humectants.
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