EP4605747A1 - Serologischer test zum nachweis von antikörpern gegen hpv und testkit - Google Patents

Serologischer test zum nachweis von antikörpern gegen hpv und testkit

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Publication number
EP4605747A1
EP4605747A1 EP23837947.3A EP23837947A EP4605747A1 EP 4605747 A1 EP4605747 A1 EP 4605747A1 EP 23837947 A EP23837947 A EP 23837947A EP 4605747 A1 EP4605747 A1 EP 4605747A1
Authority
EP
European Patent Office
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antibodies
antigens
linear epitope
carrier medium
predetermined amount
Prior art date
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Pending
Application number
EP23837947.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Hilfrich
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/10—Competitive assay format

Definitions

  • the present disclosure relates to a serological test for detecting antibodies against HPV and to a test kit for such a serological test.
  • the present disclosure comprises a method for qualitatively and/or quantitatively determining antibodies against HPV contained in body fluid.
  • Serological tests use antigen-antibody reactions that occur in vitro. These reactions can be used to identify, for example, the body's own antibodies in a blood sample that are specific to certain antigens and affect pathogens such as viruses and bacteria.
  • the antibodies are specifically produced by a person's immune system as an immune response to confrontation with these antigens in order to protect the body.
  • Serological tests are used, among other things, to detect antibodies against human papilloma viruses, abbreviated to HPV.
  • HPV human papilloma viruses
  • Such a test is known from the publication WO 2012/097788 A1 and is used as the basis for and described in the publication WO 2018/108957 A1, for example, a method for monitoring therapy.
  • the known test enables the identification of antibodies that are specifically effective against HPV type 16.
  • Type 16 is one of the HPV types that are referred to as high-risk types (high-risk HPV). It is now known that the high-risk types play a major role in the development of precancerous lesions (dysplasia) and the resulting carcinomas, especially in the cervix. It is also now known that only 25% of such HPV-caused precancerous lesions and carcinomas are caused by HPV type 16. However, 75% of such HPV-caused precancerous lesions and carcinomas are caused by the other High-risk types. This significant proportion is not taken into account in the current test.
  • in vitro in the present disclosure is to be understood in particular to mean that the method is carried out outside of a living organism, i.e. is not carried out on a person.
  • at least one sample for example of body fluid, is taken from the person concerned. For example, one drop (approx. 25 pL) is sufficient to carry out the method.
  • the antigens used in the improved method can be multimeric.
  • multimer in the present disclosure means a molecule or Molecular complex in which the linear epitope described above occurs at least twice.
  • the antigens can be monomeric, i.e. present as a monomer.
  • the term "monomer" in the present disclosure is understood to mean a molecule in which the linear epitope described above occurs only once.
  • the improved method can be a method for qualitatively and/or quantitatively determining antibodies against HPV contained in body fluid and in particular comprise or consist of the steps of providing a carrier medium, such as a test strip, on which a predetermined amount of the labelled antibodies is provided in a mobile manner and a predetermined amount of the antigens is present at a predetermined location, in particular is provided immobilely, for example is fixed; for bringing together a preferably predetermined volume of body fluid with the labelled antibodies, i.e. the labelled antibodies located on the carrier medium; for carrying out a qualitative and/or quantitative identification of antibodies against HPV using a Analysis of the carrier medium, for example for a change, preferably in the area of the specified location.
  • a carrier medium such as a test strip
  • the labelled antibodies are designed in such a way that they result in a measurable and/or user-perceptible change, for example in the case of binding, i.e. binding to the linear epitope of the antigens, if there is a spatial accumulation, i.e. a spatial accumulation of labelled antibodies.
  • the labelled antibodies are labelled with gold particles and/or silver particles.
  • the improved method can be a method for qualitatively and/or quantitatively determining antibodies against HPV contained in body fluid and in particular comprise or consist of the steps of providing a predetermined amount of the antigens; providing a carrier medium, such as a test strip, on which a predetermined amount of the labeled antibodies is provided in a mobile manner and a predetermined amount of capture molecules is present at a predetermined location, in particular is provided immobilely, for example is fixed; bringing together a preferably predetermined volume of body fluid with the antigens provided; bringing together the body fluid and the antigens provided with the labeled antibodies, i.e. the labeled antibodies located on the carrier medium; carrying out a qualitative and/or quantitative identification for antibodies against HPV based on an analysis of the carrier medium, for example for a change preferably in the area of the predetermined location.
  • a carrier medium such as a test strip
  • Bringing the body fluid and the antigens together with the marked antibodies particularly includes bringing the body fluid and the antigens together with the marked antibodies directly. It also particularly includes bringing the body fluid and the antigens together with the marked antibodies indirectly. This can be done via the carrier medium.
  • the body fluid and the antigens are applied to the carrier medium at a location spatially distant from the marked antibodies.
  • the body fluid and the antigens are brought together with the marked antibodies by the body fluid and the antigens flowing on the carrier medium towards the marked antibodies.
  • a capillary effect can also be used.
  • the carrier medium has or consists of a material which is designed to exert a capillary effect on a liquid.
  • the bringing together of the body fluid with the antigens and the bringing together of the body fluid and the antigens with the labelled antibodies can be understood as two preferably separate steps or as one step.
  • the Bringing the body fluid together with the antigens and bringing the body fluid and the antigens together with the labelled antibodies can, for example, be understood to mean that steps take place at separate times.
  • the body fluid is brought together with the antigens first, followed by the body fluid and the antigens being brought together with the labelled antibodies.
  • the body fluid should incubate with the antigens for a predetermined period of time and/or a freely selectable period of time before this composition is brought together with the labelled antibodies. If the body fluid contains antibodies that can bind to the linear epitope of the antigens, this can result in interactions between these antibodies and the antigens before the body fluid and the antigens are brought together with the labelled antibodies.
  • Bringing the body fluid together with the antigens and bringing the body fluid and the antigens together with the labelled antibodies can also be understood as simultaneous steps or as a common step.
  • the body fluid, the antigens and the labelled antibodies are brought together simultaneously.
  • the predetermined amount of antigens is stored, in particular dissolved, in a preferably predetermined volume of a buffer liquid, in particular buffer solution.
  • the buffer liquid containing the antigens is provided and the predetermined volume of body fluid is brought together with it. This brought together volume or a predetermined volume thereof is then brought together with the labeled antibodies located on the carrier medium.
  • the buffer liquid with the antigens contained therein, the body fluid and the labelled antibodies are also brought together at the same time.
  • any antibodies against HPV contained in the body fluid will come into close proximity to one another before this composition is brought together with the labelled antibodies. This brings the interactions between the antibodies in the body fluid and the antigens forward in time and thus takes place ahead of any interactions between the antigens and the labelled antibodies. This makes it easier for a measurable and/or user-perceptible change to occur quickly if antibodies against HPV are contained in the body fluid.
  • Bringing the body fluid together with the antigens and bringing the labelled antibodies together with the body fluid and the antigens can be understood as two, preferably separate steps, or as one step. Bringing the body fluid together with the antigens and bringing the labelled antibodies together with the body fluid and the antigens can, for example, be understood to mean that steps take place at separate times.
  • the body fluid together with the antigens is carried out first, followed by the bringing together of the labelled antibodies with the body fluid and the antigens.
  • the body fluid should incubate with the antigens for a predetermined period of time and/or a freely selectable period of time before the labelled antibodies are brought together with this composition.
  • washing is to be understood in particular as meaning that the substances on the carrier medium, with the exception of the antibodies specifically bound to the linear epitope of the antigens, are removed from the carrier medium. This removes substances contained in the body fluid, for example, from the carrier medium which could undesirably interfere with the interactions of the labeled antibodies with the linear epitope of the antigens.
  • the labeled antibodies are such that they cause a measurable and/or user-perceptible reaction in the presence of a or the reactant.
  • the reactant used in the improved method is preferably such that it causes the labeled antibodies to cause the measurable and/or user-perceptible reaction.
  • This reaction can be a color reaction, for example when the labeled antibodies are labeled with an enzyme and the reactant is a reactant of the enzyme.
  • This embodiment is also based on the known competitive approach in which any antibodies against HPV contained in the body fluid compete with the labeled antibodies for binding to the linear epitope of the antigens.
  • This embodiment offers the advantage that the time for the incubation and/or the temperature during the incubation can be freely selected.
  • the improved method can be carried out by optimizing the setting of the time for the incubation and/or the incubation temperature so that only a relatively small amount of the antigens is required.
  • the improved method can be a method for qualitatively and/or quantitatively determining substances contained in body fluid.
  • antibodies against HPV and in particular comprise or consist of the steps of providing a predetermined amount of the antigens, preferably on or at a carrier medium, in particular presented immobilely on or at the carrier medium, for example fixed; bringing a preferably predetermined volume of body fluid together with the antigens; washing the carrier medium; applying a predetermined amount of labelled antibodies to the carrier medium; washing, in particular re-washing or repeating the carrier medium; applying a predetermined volume of a reactant to the carrier medium; carrying out a qualitative and/or quantitative identification for antibodies against HPV based on an analysis, preferably of the carrier medium, for example for a reaction.
  • the labelled antibodies are designed in such a way that they can specifically bind to human antibodies that can or do bind specifically to the linear epitope of the antigens.
  • the labelled antibodies are in particular designed in such a way that they can specifically bind to a binding site on the human antibodies other than a binding site that specifically binds or can be bound to the linear epitope of the antigens. If such human antibodies are contained in the body fluid and if these human antibodies are bound to the linear epitope of the antigens, binding to these bound human antibodies will occur after the labelled antibodies are applied.
  • the labelled antibodies are such that they cause a measurable and/or user-perceptible reaction in the presence of a or the reactant.
  • the reactant used in the improved method is preferably such that it causes the labelled antibodies to cause the measurable and/or user-perceptible reaction.
  • This reaction can be a colour reaction, for example when the labelled antibodies are labelled with an enzyme and the reactant is a reactant of the enzyme.
  • the improved method of this embodiment is based on a sandwich approach known per se in which the labeled antibodies do not specifically bind directly to the antigens, but indirectly via the human antibodies.
  • the improved method of this embodiment makes it possible to qualitatively and/or quantitatively determine any antibodies against HPV contained in the body fluid and, in addition, to make a statement about the type of antibodies present. For example, it is possible to determine whether the identified antibodies are immunoglobulin A (IgA) or immunoglobulin D (IgD) or immunoglobulin E (IgE) or immunoglobulin G (IgG) or immunoglobulin M (IgM).
  • IgA immunoglobulin A
  • IgD immunoglobulin D
  • IgE immunoglobulin E
  • IgG immunoglobulin G
  • IgM immunoglobulin M
  • identified IgA antibodies indicate that a mucous membrane of the person from whom the body fluid was taken is affected.
  • identified IgM antibodies indicate that the infection is new.
  • identified IgD antibodies indicate an infection of the gastrointestinal tract.
  • the predetermined amount of antigens is smaller than the predetermined amount of labelled antibodies or corresponds to the predetermined amount of labelled antibodies. It has been shown that with such a quantitative ratio between the antigens and the labelled antibodies, the change or reaction described above and brought about by the labelled antibodies is achieved to the desired extent in order to be able to carry out a qualitative and/or quantitative identification of antibodies against HPV. This is particularly the case if the improved method is based on one of the embodiments described above with a competitive approach. In principle, the predetermined amount of antigens can also be greater than the predetermined amount of labelled antibodies.
  • the predetermined minimum amount is set at a value which is above the amount of healthy people.
  • the improved method is therefore set in such a way that it does not work on healthy people.
  • the predetermined minimum amount is set at a value which is above the amount of healthy people and below the amount of people suffering from HPV.
  • the improved method is therefore set in such a way that it works on people suffering from HPV.
  • HPV-infected is to be understood in particular as meaning that the affected person has or has had an HPV-related disease and as a result the person's immune system is forming or has formed antibodies against the HPV.
  • HPV-infected is to be understood in particular as meaning that the affected person has antibodies, in particular the body's own antibodies, which are caused by an HPV-related disease.
  • the linear epitope of the antigens is designed in such a way that the several or many antibodies that can bind to it alternatively are each effective against HPV of a different type from a class with at least two of the types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82.
  • HPV types form the high-risk group, which are significantly involved in the development of precancerous lesions (dysplasias) and resulting carcinomas.
  • the linear epitope is based on an amino acid sequence that is present in the same way in both of these HPV types. The more of these HPV types are covered by a common amino acid sequence and this amino acid sequence is mapped by the linear epitope, the better the sensitivity of the improved method with regard to detecting precancerous lesions and carcinomas.
  • the linear epitope of the antigens is in particular designed such that the several or many antibodies that can be alternatively bound to it are effective against the L1 protein of the HPV.
  • the linear epitope of the antigens can be designed such that the several or many antibodies that can be alternatively bound to it are effective against the L2 protein of the HPV.
  • the linear epitope of the antigens can be designed such that the several or many antibodies that can be alternatively bound to it are effective against the E6 protein of the HPV.
  • the linear epitope of the antigens can be designed such that the several or many antibodies that can be alternatively bound to it are effective against the Ei protein of the HPV.
  • the linear epitope of the antigens can be designed such that the several or many antibodies that can be alternatively bound to it are each effective against a different one of the HPV proteins from the group LI, L2, E6 and E7.
  • the improved test kit comprises labelled antibodies which are designed in such a way that they can specifically bind to the linear epitope of the antigens.
  • the labelled antibodies are designed in such a way that, in the presence of a reactant, they cause a reaction which is measurable and/or perceptible to a user, or in the case of spatial accumulation, in particular spatial accumulation of bound labelled antibodies, they cause a change which is measurable and/or perceptible to a user. This enables the identification of antibodies against HPV contained in body fluid.
  • the labelled antibodies are the labelled antibodies described above in relation to the improved method.
  • the improved test kit comprises a carrier medium on which a predetermined amount of the labeled antibodies is provided in a mobile manner and a predetermined amount of the antigens is present at a predetermined location, in particular is provided in an immobile manner, for example is fixed.
  • the labelled antibodies are arranged at a distance from the antigens.
  • the labelled antibodies are arranged in the area of an application site for the body fluid.
  • the labelled antibodies are designed in such a way that, for example in the case of a binding, i.e. a binding to the linear epitope of the antigens, they result in a measurable and/or user-perceptible change if there is a spatial accumulation, i.e. a spatial accumulation of labelled antibodies.
  • the improved test kit of this embodiment can be reduced to the carrier medium as the only component.
  • the antigens are already stored on the carrier medium. This is possible because the antigens do not require a physiologically active liquid to maintain their reactivity.
  • the antigens are dried, for example dried on the carrier medium.
  • the labeled antibodies can also be dried, for example dried on the carrier medium.
  • the improved test kit comprises a predetermined amount of the antigens, for example in a container, for example dissolved in a buffer liquid, in particular buffer solution.
  • the improved test kit also comprises a carrier medium on which a predetermined amount of the labeled antibodies is provided in a mobile manner and a predetermined amount of capture molecules is present at a predetermined location, in particular is provided in an immobile manner, for example is fixed. This enables the improved method to be carried out in accordance with the second embodiment described above.
  • the labelled antibodies are arranged at a distance from the capture molecules.
  • the labelled antibodies are arranged in the area of an application site for the body fluid.
  • the labelled antibodies are designed in such a way that, for example, in the case of a binding, i.e. a binding to the linear epitope of the antigens, they result in a measurable and/or user-perceptible change if there is a spatial accumulation, i.e. a spatial accumulation of labelled antibodies.
  • the capture molecules can be designed in such a way that they can specifically bind to the linear epitope of the antigens.
  • the capture molecules are based on the same antibodies that also form the basis for the labeled antibodies. This makes it possible to save development costs, since only a single antibody needs to be developed.
  • the antigens can be monomeric. This results in cost advantages because the antigens used are relatively inexpensive as monomers.
  • the capture molecules can be designed such that they can each bind specifically to a binding site on the antigens other than the linear epitope. In this case, it is possible to carry out the improved method according to the second embodiment of the second embodiment described above.
  • the other binding site can be an epitope.
  • the capture molecules are, for example, designed such that they can each bind specifically to a different epitope on the antigens other than the linear epitope.
  • the other epitope can be a linear or a conformational epitope.
  • the above mentioned buffer liquid can be a saline based solution.
  • the buffer liquid can be a TRIS-BSA (Tris(hydroxymethyl)-aminomethane with bovine serum albumin) or a histidine buffer.
  • the carrier medium of the above embodiments of the improved test kit can be a test strip.
  • the test strip has or consists of a material which exerts a capillary force on a liquid applied to it.
  • the test strip has or consists of an absorbent paper material.
  • the test strip can be present in a test cassette.
  • the improved test kit comprises a predetermined amount of the antigens preferably on a carrier medium, in particular immobile on the carrier medium, for example fixed.
  • the improved test kit further comprises a predetermined amount of the labeled antibodies.
  • the labeled antibodies are particularly designed to cause a measurable and/or user-perceptible reaction in the presence of a reactant.
  • the improved test kit comprises a predetermined volume of a reactant which is designed to cause the labeled antibodies to cause the measurable and/or user-perceptible reaction.
  • This embodiment enables implementation of the improved method according to the third embodiment described above.
  • This embodiment enables the detection limit for identifying any antibodies against HPV contained in the body fluid to be changed, for example reduced, by adjusting the incubation time and/or the incubation temperature.
  • the carrier medium can be a test vessel, for example a microtiter plate.
  • the antigens can be present therein, for example on the bottom and/or on the walls.
  • the antigens are preferably fixed in the test vessel, in particular on the bottom and/or on the walls.
  • the bottom and/or the walls of the test vessel are coated with the antigens.
  • the improved test kit now comprises, instead of the labelled antibodies that bind to the linear epitope of the antigens, labelled antibodies that can specifically bind to human antibodies, whereby these human antibodies are designed such that they bind or can specifically bind to the linear epitope of the antigens.
  • the labelled antibodies used here are in particular designed such that they cause a measurable and/or user-perceptible reaction in the presence of a reactant.
  • This modification makes it possible to carry out the improved method according to the fourth embodiment described above.
  • this modification makes it possible to qualitatively and/or quantitatively determine any antibodies against HPV contained in body fluid and, in addition, to make a statement about the type of these antibodies present.
  • the labeled antibodies mentioned above can be based on monoclonal antibodies, for example monoclonal mouse antibodies, which are labeled. These monoclonal antibodies can be obtained from a hybridoma cell line. This has the advantage that the antibodies obtained from them show no or at least no relevant variation from one another.
  • hybridoma cell line is understood to mean in particular a cell line which is obtained using hybridoma technology.
  • labelled antibodies are intended to produce a measurable and/or user-perceptible change when spatially concentrated, these antibodies are labelled with colloidal gold and/or colloidal silver, for example.
  • the labelled antibodies are intended to cause a measurable and/or user-perceptible reaction in the presence of a reactant
  • these antibodies are labelled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (AP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • the reactant used can be tetramethylbenzidine (TMB) or Fast-Red, so that the reaction that occurs is a colour change.
  • the improved test kit can include a photometer or other photo-optical device.
  • an antigen in the improved method and/or the improved test kit comprises a linear epitope, in particular at least one linear epitope or exclusively one linear epitope, which is designed in such a way that several or many antibodies, each of which is effective against HPV of a different type, can alternatively bind specifically to it.
  • an antibody or labelled antibody is proposed for use in a diagnostic method, in particular in a method for the qualitative and/or quantitative determination of antibodies against HPV contained in body fluid.
  • the antibody or labelled antibody is designed such that it can specifically bind to a linear epitope of an antigen.
  • the linear epitope of the antigen is designed such that several or many antibodies can alternatively bind to it. can specifically bind to antibodies that are each effective against a different type of HPV.
  • the labelled antibody is designed in such a way that, in the presence of a reactant, it causes a reaction that is measurable and/or perceptible by a user or, in the case of spatial accumulation, in particular spatial accumulation of bound labelled antibodies of this type, it results in a change that is measurable and/or perceptible by a user.
  • a labelled antibody in the improved method and/or in at least one of the above-described embodiments of the improved test kit is proposed.
  • the labelled antibody is designed such that it can specifically bind to a linear epitope of an antigen.
  • the linear epitope of the antigen is designed such that several or many antibodies, each of which is effective against HPV of a different type, can alternatively specifically bind to it.
  • the labelled antibody is designed in such a way that, in the presence of a reactant, it causes a reaction that is measurable and/or perceptible by a user or, in the case of spatial accumulation, in particular spatial accumulation of bound labelled antibodies of this type, it results in a change that is measurable and/or perceptible by a user.
  • an antibody as a capture molecule in the improved method and/or in at least one of the above-described embodiments of the improved test kit is proposed.
  • the antibody specifically binds to a linear epitope of an antigen, the linear epitope being such that several or many antibodies, each of which is effective against HPV of a different type, can alternatively bind specifically to it.
  • a molecule as a capture molecule in the improved method and/or in at least one of the above-described embodiments of the improved test kit.
  • the molecule is specifically binding to a binding site of an antigen other than a linear epitope, which is such that alternatively several or many antibodies can specifically bind to it, which each one is effective against a different type of HPV.
  • the molecule is an antibody which is designed in such a way that it can specifically bind to an epitope of the antigen other than the linear epitope.
  • Fig. 1 shows a first exemplary embodiment of a test kit for detecting antibodies against HPV in a schematic representation
  • Fig. 2 shows a second exemplary embodiment of a
  • Fig. 3 shows a third exemplary embodiment of a
  • Fig. 4 shows a fourth exemplary embodiment of a
  • Test kits for the detection of antibodies against HPV in a schematic representation
  • Figure 1 shows a first exemplary embodiment of a test kit 1 for detecting antibodies against HPV.
  • the exemplary test kit 1 comprises a carrier medium 2 on which a predetermined amount of antigens 10 and a predetermined amount of labeled antibodies 20 are present.
  • the predetermined amount of antigens 10 is preferably arranged at a predetermined location 3 of the carrier medium 2.
  • the predetermined location 3 is designed as a test line.
  • the antigens 10 are preferably immobilized, in particular fixed, at the predetermined location 3.
  • the labeled antibodies 20 are provided in a mobile manner and the predetermined amount of the labeled antibodies 20 is located at a spatial distance from the predetermined location 3.
  • the labeled antibodies 20 are arranged in the area of an application location 4.
  • the application location 4 indicates a location of the carrier medium 2, which is intended to receive a liquid to be examined.
  • the carrier medium 2 is a test strip.
  • the test strip is in a test cassette.
  • the test cassette has a test opening in the area of the specified location 3.
  • the test cassette has an application opening in the area of the application location 4, through which the liquid to be tested can be applied to the test strip.
  • the carrier medium 2 has or consists of a material which exerts a capillary force on a liquid. A liquid applied to the carrier medium 2 in the area of the application point 4 is thereby supported in its flow in the direction of the predetermined point 4.
  • the material is an absorbent paper or the like.
  • the antigens 10 have a linear epitope. This linear epitope is reactive and is designed in such a way that several or many antibodies, each of which is effective against HPV of a different type, can bind specifically to it.
  • the antigens 10 can be present as a monomer or multimer.
  • the antigens 10 are preferably present in dry form on the carrier medium 2 and/or the antigens 10 are presented in dried form on the carrier medium 2.
  • the labeled antibodies 20 are designed in such a way that they can specifically bind to the linear epitope of the antigens 10.
  • the labeled antibodies 20 also have a label, namely such that a spatial accumulation of the labeled antibodies 20 results in a measurable and/or user-perceptible change.
  • the labeled antibodies 20 are monoclonal mouse antibodies which are provided with such a label.
  • the labeled antibodies are labeled with colloidal gold and/or colloidal silver.
  • the predetermined amount of antigens 10 is smaller than the predetermined amount of labeled antibodies 20.
  • the predetermined amount of antigens 10 can also correspond to the predetermined amount of labeled antibodies 20 or be larger than the predetermined amount of labeled antibodies 20.
  • the predetermined amount of antigens 10 and the predetermined amount of labeled antibodies 20 are preferably dimensioned in relation to the volume of a liquid sample to be examined such that, when the amount of antibodies contained in the liquid sample and specifically binding to the linear epitope of the antigens 10 is above a predetermined minimum amount, the labeled antibodies 20, when spatially concentrated, result in a measurable and/or user-perceptible change.
  • the exemplary test kit 1 makes it possible to determine antibodies against HPV contained in body fluids qualitatively and/or quantitatively by serological means.
  • the antigens 10 used with their special linear epitope make it possible to make a statement about the presence of precancerous lesions and carcinomas caused by a whole group of HPV types with a single serological test.
  • the body fluid is preferably blood, such as whole blood, or serum and/or plasma from blood.
  • the blood can be obtained by venipuncture or whole blood from a fingertip.
  • This body fluid is applied to the carrier medium 2 via the application site 4. There, the body fluid comes into contact with the marked antibodies 20 and, together with at least some of the marked antibodies 20, optionally by utilizing a capillary force caused by the material of the carrier medium 2, flows over the carrier medium 2 in the direction of the predetermined site 3 and comes into contact with the antigens 10.
  • This change is caused by a local accumulation of the labelled antibodies 20, which results from their binding to the antigens 10 and are thus held at the location of the accumulation by the antigens 10.
  • the location of the accumulation can be the area of the predetermined location 3.
  • the accumulation has a linear extension, so that the change occurs along a line, as is indicated by way of example in Figure 1 using the predetermined location 3, which is shown as a dashed line.
  • the change on the carrier medium 2 is weaker when there are fewer labeled antibodies 20 binding to the antigens 10. This effect is used to make a statement about any antibodies against HPV contained in the body fluid. This is because a weaker change on the carrier medium 2 means that the body fluid contains more antibodies that can bind to the linear epitope of the antigens 10, and these antibodies are now bound to the antigens 10 instead of the labeled antibodies 20.
  • the exemplary test kit 1 is set or calibrated by measuring the amount of antigens 10 provided on the carrier medium 2 and/or by measuring the amount of labeled antibodies 20 provided on the carrier medium 2 such that the measurable and/or user-perceptible change has or exceeds a preferably predetermined maximum strength when the body fluid contains an amount of antibodies that specifically bind to the linear epitope of the antigens 10 that is below the minimum amount described above.
  • the exemplary test kit 1 thus enables a qualitative determination of antibodies against HPV contained in the body fluid, i.e. whether such antibodies are contained in the body fluid or not.
  • the exemplary test kit 1 also enables a quantitative determination of antibodies against HPV contained in the body fluid.
  • the degree of weakening of the change compared to the maximum strength can be used as a measure of the amount of antibodies against HPV contained in the body fluid.
  • the change that occurs in particular the severity of its manifestation, can be perceived by a user who then uses his perception to carry out a qualitative and/or quantitative identification for antibodies against HPV.
  • a photometer or other auxiliary device that records the severity of the change can be used to carry out a qualitative and/or quantitative identification for antibodies against HPV.
  • Figure 2 shows a second exemplary embodiment of a test kit 1 . 1 for detecting antibodies against HPV .
  • Components or functional sections of the exemplary test kit 1 . 1 which are identical to or functionally equivalent to components or functional sections of the exemplary test kit 1 in Figure 1 are provided with the same reference symbols; in this respect, reference is made to the description of the exemplary test kit 1 in Figure 1 .
  • a predetermined amount of capture molecules 30 is provided on the carrier medium 2'.
  • the predetermined amount of capture molecules 30 is arranged at the predetermined location 3 of the carrier medium 2'.
  • the capture molecules 30 are immobilized, in particular fixed, at the predetermined location 3.
  • the capture molecules 30 are designed such that they can specifically bind to the linear epitope of the antigens 10'.
  • the capture molecules 30 are based to the same antibody which is also used as the basis for the labelled antibodies 20 .
  • the exemplary test kit 1.1 in Figure 2 provides a predetermined amount of antigens 10' which are separate from the carrier medium 2'.
  • the antigens 10' like the antigens 10 in the exemplary test kit 1 in Figure 1, have the said linear epitope, which is designed in such a way that several or many antibodies, each of which is effective against HPV of a different type, can alternatively bind specifically to it.
  • the exemplary test kit 1.1 in Figure 2 is designed so that the antigens 10' are present as a multimer. The said linear epitope is therefore present at least twice in the respective antigen 10'.
  • the exemplary test kit 1 . 1 can be used as follows: Body fluid, in particular a predetermined volume of body fluid, is brought together with antigens 10 ', in particular the buffer liquid 40 with the antigens 10 ' dissolved therein.
  • the body fluid is introduced into the container 5 for this purpose.
  • the body fluid is the body fluid described above for the exemplary test kit 1 in Figure 1.
  • the mixture with the body fluid , and the antigens 10 ' in particular the mixture with the body fluid , the buffer solution 40 and the Antigens 10 ', or at least a volume portion of the mixture is applied to the carrier medium 2 ' via the application site 4.
  • the mixture comes into contact with the marked antibodies 20 and runs together with at least a portion of the marked antibodies 20, optionally by utilizing a capillary force caused by the material of the carrier medium 2 ', over the carrier medium 2 ' in the direction of the predetermined site 3 and comes into contact with the capture molecules 30. Due to the contact, the capture bodies 30 bind to those of the linear epitopes of the antigens 10 ' which are still free, in particular are not yet occupied by one of the marked antibodies 20 or an antibody contained in the body fluid.
  • the antigens 10 ' in particular the buffer liquid with the antigens 10 ' dissolved therein, and separately the body fluid , can be applied to the carrier medium 2 ', for example at the same time, i.e. brought together with the labeled antibodies 20 .
  • the antigens 10 ' are brought together with the body fluid first and then with the labeled antibodies later, the interactions between the antigens 10 ' and any antibodies contained in the body fluid and binding to the linear epitope of the antigens 10 ' are brought forward in time. These interactions therefore take place ahead of any interactions between the antigens 10 ' and the labeled antibodies 20 .
  • the exemplary test kit 1 . 1 is adjusted or calibrated by measuring the amount of the labeled antibodies 20 placed on the carrier medium 2 ' and/or by measuring the amount of the capture molecules 30 placed on the carrier medium 2 ' so that after bringing the antigens 10 ' together with the labeled antibodies 20 without the involvement of the body fluid, but with the involvement of a liquid, for example the buffer liquid, and this mixture flows towards the capture bodies 30 as a result of the bringing together, on the one hand the labeled antibodies 20 bind specifically to the antigens 10 ' and on the other hand there are still sufficient antigens of these bound antigens which still have at least one of the linear epitopes free, so that the capture molecules bind specifically to it. Only by binding to the capture molecules 30 are the labeled antibodies 20 on the carrier medium 2 ' and a local accumulation of the labelled antibodies 20 occurs, thus leading to a measurable and/or user-perceptible change on the carrier medium 2 ' .
  • the antigens 10 ' and the body fluid with the labeled antibodies 20 are now brought together, at least one of the linear epitopes of at least some of the antigens 10 ' is occupied by any antibodies contained in the body fluid and which can bind to the linear epitope of the antigens 10 ', so that a smaller number of the antigens 10 ' are bound both to the labeled antibodies 20 and to the capture molecules 30 and consequently the measurable and/or user-perceptible change is weaker.
  • the exemplary test kit 1.1 is adjusted or adjusted by measuring the amount of antigens 10' in relation to the amount of labeled antibodies 20 and/or the amount of capture molecules such that the change that is measurable and/or perceptible by a user has or exceeds a preferably predetermined maximum strength if the body fluid contains an amount of antibodies that specifically bind to the linear epitope of the antigens 10' that is below the minimum amount described above.
  • the exemplary test kit 1.1 therefore enables a qualitative and/or quantitative determination of antibodies against HPV contained in the body fluid in the same way as the exemplary test kit 1 in Figure 1. In this respect, with regard to the analysis of the change that occurs due to the accumulation of labeled antibodies, reference is made to the description of the exemplary test kit 1 in Figure 1.
  • Figure 3 shows a third exemplary embodiment of a test kit 1 . 2 for detecting antibodies against HPV .
  • Components or functional sections of the exemplary test kit 1 . 2 which are identical or functionally equivalent to components or functional sections of the exemplary test kit 1 of Figure 1 or the test kit 1 . 1 of Figure 2 are provided with the same reference numerals; in this respect, reference is made to the description of the exemplary test kit 1 of Figure 1 or the exemplary test kit 1 . 1 of Figure 2 .
  • the exemplary test kit 1.2 differs from the exemplary test kit 1.1 of Figure 2 in that a predetermined amount of antigens 10 '' is provided, which are present as monomers and thus each have the said linear epitope only once.
  • the antigens 10' of the exemplary test kit 1.1 of Figure 2 the antigens 10'' can be dissolved in the buffer liquid 40 and/or accommodated in the container 5.
  • the exemplary test kit 1.2 differs from the exemplary test kit 1.1 in Figure 2 in that a carrier medium 2 '' is used on which a predetermined amount of capture molecules 50 in the form of antibodies are provided, which are designed in such a way that they each specifically bind to an epitope of the antigens 10'' other than the said linear epitope.
  • the capture molecules 50 are preferably arranged in the region of the predetermined location 3 of the carrier medium 2 '' ''.
  • the capture molecules 50 are preferably arranged at the predetermined location 3 of the carrier medium 2 '' ''.
  • the capture molecules 50 are preferably immobilized, in particular fixed, at the predetermined location 3.
  • a serological test can be carried out using the exemplary test kit 1.2 in the same way as using the exemplary test kit 1.1 in Figure 2.
  • a preferably predetermined volume of the body fluid is first brought together with the antigens 10'', in particular the antigens 10'' dissolved in the buffer solution 40, and in particular incubated.
  • the body fluid and the antigens 10'', in particular the body fluid, the antigens 10'' and the buffer liquid 40 are then brought together with the labeled antibodies 20 located on the carrier medium 2'', and this mixture then runs on the carrier medium 2'' in the direction of the predetermined location 3 and comes into contact with the capture molecules 50.
  • Those of the antigens 10'' which have formed a binding complex with one of the labelled antibodies 20 will be captured by at least one of the capture molecules 50, provided that the epitope required for binding is still unoccupied on the antigens of the binding complex and that at least one capture molecule specifically binds to it.
  • the subsequent analysis of the carrier medium 2'' for a measurable and/or The change perceptible by the user can be made according to the procedure described above for the exemplary test kit 1 or the exemplary test kit 1 . 1 .
  • Figure 4 shows a fourth exemplary embodiment of a test kit 1 . 3 for detecting antibodies against HPV .
  • the exemplary test kit 1 . 3 comprises a carrier medium 2 '' ' ' on which a predetermined amount of the antigens 10 already described above are present.
  • the carrier medium 2 '' ' is preferably a reagent vessel.
  • the reagent vessel is a component of a microtiter plate.
  • the antigens 10 are preferably fixed to the bottom and/or the walls of the reagent vessel.
  • the bottom and/or the walls of the reagent vessel are coated with the antigens 10 .
  • the exemplary test kit 1 . 3 comprises a predetermined amount of labeled antibodies 60 and a predetermined volume of a reactant 70 .
  • the labeled antibodies 60 are preferably present separately from the carrier medium 2 ' ' '.
  • the reactant 70 is preferably present separately from the carrier medium 2 ' ' ' and the labeled antibodies 60 .
  • the labelled antibodies 60 are based on antibodies such as those already used as the basis for the labelled antibodies 20 of the exemplary test kits 1, 1.1 and 1.2, which are therefore designed such that they can specifically bind to the linear epitope of the antigens 10.
  • the labelled antibodies 60 are designed such that, in the presence of a reactant, they cause a reaction that is measurable and/or perceptible to a user.
  • the reactant 70 provided is designed such that it causes this reaction.
  • the labelled antibodies 60 are labelled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • the reactant is tetramethylbenzidine (TMB).
  • a serological test can be carried out using the exemplary test kit 1 . 3 as follows : A preferably predetermined volume of body fluid is brought together with the antigens 10 of the carrier medium 2 ''' and in particular incubated . For example , the body fluid is filled into the test tube .
  • Body fluid can be the body fluid described above.
  • the carrier medium 2 ' ' ' is then washed. Any antibodies contained in the body fluid and binding to the linear epitope of the antigens 10 remain on the carrier medium 2 ' ' ', in particular in the test tube, provided that a specific binding to the antigens 10 has taken place and these antibodies are thereby retained.
  • the labeled antibodies 70 are applied to the carrier medium 2 '' '' , for example, filled into the reagent vessel, in particular incubated. More or fewer interactions occur between the antigens 10 and the labeled antibodies 70, depending on how many of the antigens 10 still allow a specific binding because the said linear epitope or at least one of the said linear epitopes is not yet occupied by an antibody contained in the body fluid.
  • the carrier medium 2 ' ' ' is then washed again. Those of the labeled antibodies 70 which were able to specifically bind to the antigens 10 remain on the carrier medium 2 ' ' ', in particular in the reagent vessel. Finally, the reactant 70 is applied to the carrier medium 2 ' ' ', in particular poured into the reagent vessel. Due to the reactant 70, those of the labeled antibodies 60 which have remained on the carrier medium 2 ' ' ', in particular in the reagent vessel, will now show a reaction which is measurable and/or perceptible to a user, such as a color reaction.
  • the subsequent analysis of the reaction with a view to a qualitative and/or quantitative determination of any antibodies against HPV contained in the body fluid can in principle be carried out in the same way as for the serological tests described above, which are based on a measurable and/or user-perceptible change caused by an accumulation of the labelled antibodies 20 .
  • Figure 5 shows a fifth exemplary embodiment of a test kit 1.4 for detecting antibodies against HPV.
  • the exemplary test kit 1.4 differs from the exemplary test kit 1.3 of Figure 4 in that a predetermined amount of labeled antibodies 80 is provided, which are designed such that they can specifically bind to human antibodies.
  • the labeled antibodies 80 do not have the ability to specifically bind to the linear epitope of the antigens 10.
  • the labeled antibodies 80 can be based on a monoclonal mouse antibody.
  • the labeled antibodies 80 can be labeled in the same way as the labeled antibodies 70 of the exemplary test kit 1.3, so that they cause a measurable and/or user-perceptible reaction in the presence of a reactant.
  • a serological test can be carried out with the exemplary test kit 1 . 4 in the same way as with the exemplary test kit 1 . 3 in Figure 4; in this respect, reference is made to the above description.
  • the exemplary test kit 1 . 4 is based on a sandwich approach. This has the result that the labeled antibodies 80 bind specifically to antibodies contained in the body fluid, which are themselves specifically bound to the said linear epitope of the antigens 10 and are thus retained on the carrier medium 2 '' '' , in particular in the reagent vessel.
  • the analysis of the reaction with a view to a qualitative and/or quantitative determination of any antibodies against HPV contained in the body fluid can in principle be carried out in the same way as for the serological tests described above, which are based on a measurable and/or user-perceptible change caused by an accumulation of the labelled antibodies 20 .
  • the performance of the serological test described above is described below using the example of an examination of the body fluids of 138 women who were diagnosed with precancerous lesions or carcinomas caused by HPV.
  • a sample of whole blood was used as the body fluid.
  • the serological tests were carried out with test kits corresponding to the exemplary test kit 1. 1 in Figure 2.
  • the linear epitope of the antigens used was such that the several or many antibodies against HPV that can alternatively bind to it are each effective against HPV of a different type: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82. This covered the entire high-risk group.
  • the column "Number” indicates the number of women who were diagnosed with grade 1 cervical intraepithelial neoplasia, grade 2 cervical intraepithelial neoplasia, grade 3 cervical intraepithelial neoplasia, or cervical carcinoma. Table 1
  • the threshold for a positive result was set at 750 ng/ml of antibodies against HPV contained in the body fluid, to which the test kit used was adjusted. Results of the serological tests above the value of 750 ng/ml were considered positive and results below or equal to the value of 750 ng/ml were considered negative.
  • the number of test results classified as positive is given under the "positive” column and the number of test results classified as negative is given under the “negative” column.
  • the detection rates are given under the "sensitivity” column. As can be seen from Table 1, women diagnosed with “CIN 1” were detected 100% of the time. Women diagnosed with “CIN 2” were also detected 100% of the time. The detection rate for women diagnosed with "CIN 3” was slightly lower at 86.6%. For diagnosed cervical carcinomas, a detection rate of 82.4% was achieved. The overall detection rate was 89.9%.

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Abstract

Die vorliegende Offenbarung betrifft einen serologischen Test zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV. Bei dem serologischen Test werden Antigene mit einem linearen Epitop genutzt, welches reaktiv ist und so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind. Die vorliegende Offenbarung betrifft ferner ein Testkit (1; 1.1; 1.2; 1.3; 1.4) zur Durchführung des serologischen Tests.

Description

Serologischer Test zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV und Testkit
Technisches Gebiet
Die vorliegende Offenbarung betrifft einen serologischen Test zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV sowie ein Testkit für einen solchen serologischen Test . Insbesondere umfasst die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV .
Serologische Tests nutzen in vitro ablaufende Antigen- Antikörper-Reaktionen . Anhand dieser Reaktionen lassen sich beispielsweise körpereigene Antikörper in einer Blutprobe identifizieren, welche für bestimmte Antigene spezifisch sind und Krankheitserreger, wie beispielsweise Viren und Bakterien, betreffen . Die Antikörper werden von dem Immunsystem einer Person als Immunantwort auf eine Konfrontation mit diesen Antigenen spezifisch gebildet , um den Körper zu schützen .
Serologische Tests werden unter anderem zum Nachweis von Antikörpern gegen humane Papillomviren, abgekürzt HPV, eingesetzt . Ein solcher Test ist aus der Druckschrift WO 2012 / 097788 Al bekannt und beispielsweise in der Druckschrift WO 2018 / 108957 Al einem Verfahren zur Therapiekontrolle zugrunde gelegt und beschrieben . Auf die Druckschriften wird hier zum Zwecke der Ergänzung der Offenbarung verwiesen mit dem Hinweis , dass diese Druckschriften gleichlautenden Begriffen eventuell eine Bedeutung beilegen, die von der vorliegenden Bedeutung abweicht . Der bekannte Test ermöglicht eine Identifizierung von Antikörpern, welche gegen HPV des Typs 16 spezifisch wirksam sind .
Der Typ 16 ist einer der HPV-Typen, welche als sogenannte Hochrisikotypen ( high ris k HPV) bezeichnet werden . Man weiß heute , dass die Hochrisikotypen bei der Entstehung von Krebsvorstufen ( Dysplasien) und daraus resultierenden Karzinomen vor allem am Gebärmutterhals maßgeblich beteiligt sind . Auch weiß man heute , dass solche HPV-verursachten Krebsvorstufen und Karzinome nur zu 25 % auf den HPV-Typ 16 zurückgehen . Zu 75 % werden solche HPV-verursachten Krebsvorstufen und Karzinome j edoch durch die anderen Hochrisikotypen verursacht . Dieser erhebliche Anteil bleibt bei dem bisherigen Test unberücksichtigt .
Ein Bedarf kann daher darin gesehen werden, mit einem serologischen Test auch Antikörper zu erkennen, welche gegen andere HPV-Typen als beispielsweise dem HPV-Typ 16 wirksam sind . Dem liegt die Erwartung zugrunde , dass durch eine Erkennung möglichst vieler HPV-Typen eine weitere Verbesserung in der Vorhersage einer Bildung von HPV-verursachten Krebsvorstufen und Karzinomen auf Basis eines serologischen Tests erreicht wird .
Konzepte
Grundlegende Verbesserungen in der Erkennung bietet ein serologisches Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV, bei dem Antigene mit einem linearen Epitop , insbesondere wenigstens einem linearen Epitop oder ausschließlich einem linearen Epitop , genutzt werden, wobei das lineare Epitop vorzugsweise reaktiv ist und so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden bzw . spezifisch binden können, die j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
Unter dem Begriff „serologisches Verfahren" ist in der vorliegenden Offenbarung ein serologischer Test oder ein serologisches Testverfahren oder ein Assay oder ein Immunoassay zu verstehen oder umfasst . Das Verfahren ist bevorzugt ein In-vitro- Verfahren, also ein in vitro durchgeführtes Verfahren .
Unter dem Begriff „in vitro" ist in der vorliegenden Offenbarung insbesondere zu verstehen, dass das Verfahren außerhalb eines lebendenden Organismus ausgeführt wird, also nicht an einer Person durchgeführt wird . Um das Verfahren in vitro durchzuführen, wird von der betroffenen Person wenigstens eine Probe , beispielsweise von Körperflüssigkeit , entnommen . Beispielsweise ist für die Durchführung des Verfahrens ein Tropfen ( ca . 25 pL ) ausreichend .
Unter dem Begriff „Antigen" sind in der vorliegenden Offenbarung Proteine j eglicher Art zu verstehen, welche bei dem Immunsystem einer damit konfrontierten Person eine Immunantwort auslösen . Unter dem Begriff „Antigen" ist in der vorliegenden Offenbarung auch ein virusähnlicher Partikel (VLP, virus like particle ) umfasst . Unter dem Begriff „virusähnlicher Partikel" oder „VLP" ist in der vorliegenden Offenbarung ein Partikel zu verstehen, welcher aus viralen Kapsiden besteht bzw . umfasst , aber keine Nukleinsäuren enthält . Ein VLP ist daher dazu geeignet , das vorstehend beschriebene lineare Epitop zu präsentieren ohne selbst replikationsfähig zu sein .
Unter dem Begriff „spezifisch binden" ist in der vorliegenden Offenbarung insbesondere zu verstehen, dass ein Antikörper ausschließlich an einer speziellen Bindungsstelle eines Antigens bindet . Der Antikörper kann also nur über eine solche Bindungsstelle an dem Antigen binden . In Bezug auf die mehreren oder vielen an das lineare Epitop der Antigene bindbaren Antikörper ist somit zu verstehen, dass es sich bei den hier betrachteten Antikörpern um solche handelt , welche ausschließlich an dieses lineare Epitop binden bzw . binden können .
Indem das spezielle lineare Epitop genutzt wird, kann mit einem einzigen serologischen Test eine Aussage über das Vorhandensein von Krebsvorstufen und Karzinomen gemacht werden, welche von einer ganzen Gruppe von HPV-Typen verursacht wird . Dem liegt die überraschend gefundene Gemeinsamkeit zugrunde , dass diese HPV-Typen eine gleiche Aminosäureabfolge aufweisen . Das verbesserte Verfahren nutzt diese Gemeinsamkeit , indem das spezielle lineare Epitop der Antigene die besagte Aminosäureabfolge präsentiert .
Das lineare Epitop bietet aber auch weitere Vorteile . Die Antigene müssen nicht in einer physiologisch wirkenden Flüssigkeit vorgehalten werden, um die Reaktivität des linearen Epitops aufrecht zu erhalten . Die Antigene können auch getrocknet bzw . in fester Form vorliegen . Auch ist zur Lagerung der Antigene keine Kühlung notwendig . Die Antigene können beispielsweise bei Raumtemperatur ohne Wirkungsverlust oder zumindest ohne relevanten Wirkungsverlust gelagert werden . Dies sind wesentliche Unterschiede zu dem bekannten Test , bei dem Antigene mit einem konf ormationellen Epitop genutzt sind . Um die Reaktivität des konf ormationellen Epitops aufrecht zu erhalten, müssen dort die Antigene in einer physiologisch wirkenden Flüssigkeit gekühlt vorgehalten werden .
Die bei dem verbesserten Verfahren eingesetzten Antigene können multimer sein, also als Multimer vorliegen . Unter dem Begriff „Multimer" ist in der vorliegenden Offenbarung ein Molekül oder Molekülkomplex zu verstehen, bei dem das vorstehend beschriebene lineare Epitop wenigsten zweifach vorkommt .
Alternativ können die Antigene monomer sein, also als Monomer vorliegen . Unter dem Begriff „Monomer" ist in der vorliegenden Offenbarung ein Molekül zu verstehen, bei dem das vorstehend beschriebene lineare Epitop nur ein einziges Mal vorkommt .
Insbesondere ist vorgesehen, dass markierte Antikörper genutzt werden, welche so beschaffen sind, dass sie an das lineare Epitop der Antigene spezifisch binden bzw . spezifisch binden können . Bei den markierten Antikörpern handelt es sich also um Antikörper , welche gegen HPV-Typen mit einer solchen Aminosäureabfolge gerichtet sind, die durch das lineare Epitop der Antigene präsentiert bzw . abgebildet ist . Bevorzugt sind diese Antikörper beispielsweise mittels an sich bekannter Methoden markiert .
Insbesondere sind, vorzugsweise durch die Markierung , die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie bei Vorhandensein eines Reaktants beispielsweise eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken oder bei räumlicher Häufung, insbesondere räumlicher Häufung gebundener markierter Antikörper, beispielsweise eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben . Dadurch ermöglichen die markierten Antikörper eine Identifizierung von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV . Eine Messung der Reaktion bzw . Veränderung kann photooptisch erfolgen .
Das verbesserte Verfahren kann nach einer ersten Ausführungsform ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV sein und insbesondere die Schritte umfassen oder aus den Schritten bestehen zum Bereitstellen eines Trägermediums , wie beispielsweise einem Teststreifen, auf dem eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge der Antigene an einer vorgegebenen Stelle vorliegt , insbesondere immobil vorgelegt ist , beispielsweise fixiert ist ; zum Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den markierten Antikörpern, also den auf dem Trägermedium befindlichen markierten Antikörpern; zum Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse des Trägermediums beispielsweise auf eine Veränderung vorzugsweise im Bereich der vorgegebenen Stelle .
Insbesondere sind in diesem Fall die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie , beispielsweise im Falle einer Bindung , also einer Bindung an das lineare Epitop der Antigene , eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben, wenn eine räumliche Häufung , also eine räumliche Häufung markierter Antikörper , vorliegt . Beispielsweise sind die markierten Antikörper mit Goldpartikeln und/oder Silberpartikeln markiert .
Unter dem Schritt des Zusammenbringens der Körperflüssigkeit mit den markierten Antikörpern ist insbesondere umfasst , dass die Körperflüssigkeit mit den markierten Antikörpern direkt zusammengebracht wird . Auch ist darunter insbesondere umfasst , dass die Körperflüssigkeit mit den markierten Antikörpern indirekt zusammengebracht wird . Dies kann über das Trägermedium erfolgen . Beispielsweise wird die Körperflüssigkeit auf das Trägermedium an einer zu den markierten Antikörpern räumlich beabstandeten Stelle aufgegeben . Beispielsweise wird in diesem Fall die Körperflüssigkeit mit den markierten Antikörpern zusammengebracht , indem die Körperflüssigkeit auf dem Trägermedium zu den markierten Antikörpern hinfließt . Ergänzend oder alternativ kann ein Kapillareffekt genutzt sein . Beispielsweise weist das Trägermedium ein Material auf oder besteht daraus , welches eingerichtet ist , auf eine Flüssigkeit einen Kapillareffekt aus zuüben .
Diese Ausführungsform beruht auf einem an sich bekannten kompetitiven Ansatz , bei dem etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV mit den markierten Antikörpern um eine Bindung an das lineare Epitop der Antigene konkurrieren . Das verbesserte Verfahren nach dieser Ausführungsform lässt sich mit wenigen Schritten durchführen . Die Körperflüssigkeit kann sofort auf das Trägermedium aufgegeben werden . Ein vorgelagerter Schritt ist im Hinblick auf die Körperflüssigkeit nicht erforderlich . Durch das eingesetzte Trägermedium mit seinen darauf mobil vorgelegten markierten Antikörpern und den darauf immobil vorgelegten Antigenen ist es ermöglicht einen Schnelltest bereitzustellen, bei dem in einer Reaktionszone eine schnell messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung auf tritt . Das verbesserte Verfahren kann nach einer zweiten, alternativen Ausführungsform ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV sein und insbesondere die Schritte umfassen oder aus den Schritten bestehen zum Bereitstellen einer vorbestimmten Menge der Antigene ; zum Bereitstellen eines Trägermediums , wie beispielsweise einem Teststreifen, auf dem eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge von Fangmolekülen an einer vorgegebenen Stelle vorliegt , insbesondere immobil vorgelegt ist , beispielsweise fixiert ist ; zum Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den bereitgestellten Antigenen; zum Zusammenbringen der Körperflüssigkeit und der bereitgestellten Antigene mit den markierten Antikörpern, also den auf dem Trägermedium befindlichen markierten Antikörpern; zum Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse des Trägermediums beispielsweise auf eine Veränderung vorzugsweise im Bereich der vorgegebenen Stelle .
Unter dem Zusammenbringen der Körperflüssigkeit und der Antigene mit den markierten Antikörpern ist insbesondere umfasst , dass die Körperflüssigkeit und die Antigene mit den markierten Antikörpern direkt zusammengebracht werden . Auch ist darunter insbesondere umfasst , dass die Körperflüssigkeit und die Antigene mit den markierten Antikörpern indirekt zusammengebracht werden . Dies kann über das Trägermedium erfolgen . Beispielsweise werden die Körperflüssigkeit und die Antigene auf das Trägermedium an einer zu den markierten Antikörpern räumlich beabstandeten Stelle aufgegeben . Beispielsweise werden in diesem Fall die Körperflüssigkeit und die Antigene mit den markierten Antikörpern zusammengebracht , indem die Körperflüssigkeit und die Antigene auf dem Trägermedium zu den markierten Antikörpern hinfließen . Ergänzend oder alternativ kann auch ein Kapillareffekt genutzt sein . Beispielsweise weist das Trägermedium ein Material auf oder besteht daraus , welches eingerichtet ist , auf eine Flüssigkeit einen Kapillareffekt aus zuüben .
Unter dem Zusammenbringen der Körperflüssigkeit mit den Antigenen und dem Zusammenbringen der Körperflüssigkeit und der Antigene mit den markierten Antikörpern können zwei vorzugsweise separate Schritte oder kann ein Schritt verstanden werden . Das Zusammenbringen der Körperflüssigkeit mit den Antigenen und das Zusammenbringen der Körperflüssigkeit und der Antigene mit den markierten Antikörpern kann beispielsweise so verstanden werden, dass zeitlich getrennte Schritte erfolgen . Insbesondere wird das Zusammenbringen der Körperflüssigkeit mit den Antigenen zeitlich zuerst und anschließend das Zusammenbringen der Körperflüssigkeit und der Antigene mit den markierten Antikörpern vorgenommen . Insbesondere sollte die Körperflüssigkeit mit den Antigenen über einen vorgegebenen Zeitraum und/oder einen frei wählbaren Zeitraum inkubieren, bevor diese Zusammensetzung mit den markierten Antikörpern zusammengebracht wird . Sofern an das lineare Epitop der Antigene bindbare Antikörper in der Körperflüssigkeit enthalten sind, können dadurch Interaktionen zwischen diesen Antikörpern und den Antigenen ablaufen, bevor die Körperflüssigkeit und die Antigene mit den markierten Antikörpern zusammengebracht werden .
Das Zusammenbringen der Körperflüssigkeit mit den Antigenen und das Zusammenbringen der Körperflüssigkeit und der Antigene mit den markierten Antikörpern kann auch so verstanden werden, dass zeitlich gleichzeitige Schritte erfolgen oder ein gemeinsamer Schritt erfolgt . Beispielsweise werden in diesem Fall die Körperflüssigkeit , die Antigene und die markierten Antikörper zeitgleich zusammengebracht .
Insbesondere sind bei dieser Ausführungsform die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie , beispielsweise im Falle einer Bindung, also einer Bindung an das lineare Epitop der Antigene , eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben, wenn eine räumliche Häufung, also eine räumliche Häufung markierter Antikörper, vorliegt . Beispielsweise sind die markierten Antikörper mit Goldpartikeln und/oder Silberpartikeln markiert .
Beispielsweise ist die vorbestimmte Menge der Antigene in einem vorzugsweise vorbestimmten Volumen einer Pufferflüssigkeit , insbesondere Pufferlösung vorgehalten, insbesondere gelöst . Es wird in diesem Fall die die Antigene enthaltende Pufferflüssigkeit bereitgestellt und das vorbestimmte Volumen der Körperflüssigkeit damit zusammengebracht . Dieses zusammengebrachte Volumen oder ein vorbestimmtes Volumen davon wird dann mit den auf dem Trägermedium befindlichen markierten Antikörpern zusammengebracht . Grundsätzlich können die Pufferflüssigkeit mit den darin enthaltenen Antigenen, die Körperflüssigkeit und die markierten Antikörper auch zeitgleich zusammengebracht werden .
Auch diese Ausführungsformen beruht auf dem an sich bekannten kompetitiven Ansatz , bei dem etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV mit den markierten Antikörpern um eine Bindung an das lineare Epitop der Antigene konkurrieren . Das verbesserte Verfahren nach dieser Ausführungsform lässt sich ebenfalls mit wenigen Schritten durchführen . Durch das eingesetzte Trägermedium mit seinen darauf mobil vorgelegten markierten Antikörpern und den darauf immobil vorgelegten Fangmolekülen ist es ebenfalls ermöglicht einen Schnelltest bereitzustellen, bei dem in einer Reaktionszone eine schnell messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung auf tritt .
Sofern in einem vorgelagerten Schritt die Körperflüssigkeit mit den Antigenen zusammengebracht wird, kommen etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV in unmittelbare räumliche Nachbarschaft zueinander, und zwar zeitlich bevor diese Zusammensetzung mit den markierten Antikörpern zusammengebracht wird . Dadurch werden die Interaktionen zwischen den Antikörpern der Körperflüssigkeit und den Antigenen zeitlich vorverlagert und haben somit einen zeitlichen Vorsprung vor etwaigen Interaktionen zwischen den Antigenen und den markierten Antiköpern . Dadurch ist es begünstigt , dass eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung schnell auftritt , wenn Antikörper gegen HPV in der Köperflüssigkeit enthalten sind .
Bei einer Ausgestaltung sind die Fangmoleküle so beschaffen, dass sie j eweils an das lineare Epitop der Antigene spezifisch binden können . Dadurch werden diej enigen Antigene , welche an den Fangmolekülen binden, an dem Ort der Fangmoleküle auf dem Trägermedium festgehalten . In diesem Fall sind die Antigene multimer bzw . liegen als Multimer vor .
Bei einer anderen Ausgestaltung sind die Fangmoleküle so beschaffen, dass sie j eweils an eine andere Bindungsstelle der Antigene als das lineare Epitop spezifisch binden können . In diesem Fall sind die Antigene monomer bzw . liegen als Monomer vor . Die andere Bindungsstelle kann grundsätzlich ein Epitop sein . In diesem Fall sind die Fangmoleküle beispielsweise so beschaffen, dass sie j eweils an ein anderes Epitop der Antigene als das lineare Epitop spezifisch binden können . Das andere Epitop kann ein lineares oder ein konf ormationelles Epitop sein .
Das verbesserte Verfahren kann nach einer dritten, alternativen Ausführungsform ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV sein und insbesondere die Schritte umfassen oder aus den Schritten bestehen zum Bereitstellen einer vorbestimmten Menge der Antigene vorzugsweise auf bzw . an einem Trägermedium, wie beispielsweise einer Mikrotiterplatte , insbesondere auf bzw . an dem Trägermedium immobil vorgelegt , beispielsweise fixiert ; zum Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den bereitgestellten Antigenen; zum Zusammenbringen einer vorbestimmten Menge der markierten Antikörper mit der Körperflüssigkeit und den bereitgestellten Antigenen; zum Waschen des Trägermediums ; zum Aufbringen eines vorbestimmten Volumens eines Reaktants auf das Trägermedium; zum Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse vorzugsweise des Trägermediums beispielsweise auf eine Reaktion .
Unter dem Zusammenbringen der Körperflüssigkeit mit den Antigenen und dem Zusammenbringen der markierten Antikörper mit der Körperflüssigkeit und den Antigenen können zwei vorzugsweise separate Schritte oder kann ein Schritt verstanden werden . Das Zusammenbringen der Körperflüssigkeit mit den Antigenen und das Zusammenbringen der markierten Antikörper mit der Körperflüssigkeit und den Antigenen kann beispielsweise so verstanden werden, dass zeitlich getrennte Schritte erfolgen . Insbesondere wird das Zusammenbringen der Körperflüssigkeit mit den Antigenen zeitlich zuerst und anschließend das Zusammenbringen der markierten Antikörper mit der Körperflüssigkeit und den Antigenen vorgenommen . Insbesondere sollte die Körperflüssigkeit mit den Antigenen über einen vorgegebenen Zeitraum und/oder einen frei wählbaren Zeitraum inkubieren, bevor die markierten Antikörper mit dieser Zusammensetzung zusammengebracht werden . Sofern an das lineare Epitop der Antigene bindbare Antikörper in der Körperflüssigkeit enthalten sind, können dadurch Interaktionen zwischen diesen Antikörpern und den Antigenen ablaufen, bevor die markierten Antikörper dazu gegeben werden . Grundsätzlich kann vorgesehen sein, dass zuerst die Körperflüssigkeit mit den Antigenen zusammengebracht wird, also beispielsweise auf das Trägermedium gegeben wird, und anschließend, beispielsweise nach einem vorgegebenen Zeitraum und/oder einen frei wählbaren Zeitraum, das Trägermedium gewaschen wird . Ferner kann vorgesehen sein, dass erst danach die markierten Antikörper zugegeben werden .
Unter dem Begriff „Waschen" ist in der vorliegenden Offenbarung insbesondere zu verstehen, dass die auf dem Trägermedium befindlichen Stoffe , bis auf die an das lineare Epitop der Antigene spezifisch gebundenen Antikörper, von dem Trägermedium entfernt werden . Dadurch werden in der Körperflüssigkeit beispielsweise enthaltene Substanzen von dem Trägermedium entfernt , welche die Interaktionen der markierten Antikörper mit dem linearen Epitop der Antigene in unerwünschter Weise stören könnten .
Insbesondere sind bei dieser Ausführungsform die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie bei Vorhandensein eines oder des Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken . Der in dem verbesserten Verfahren eingesetzte Reaktant ist vorzugsweise so beschaffen, dass durch ihn die markierten Antikörper die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken . Diese Reaktion kann eine Farbreaktion sein, beispielsweise wenn die markierten Antikörper mit einem Enzym markiert sind und der Reaktant ein Reaktant des Enzyms ist .
Auch diese Ausführungsform beruht auf dem an sich bekannten kompetitiven Ansatz , bei dem etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV mit den markierten Antikörpern um eine Bindung an das lineare Epitop der Antigene konkurrieren . Diese Ausführungsform bietet den Vorteil , dass man die Zeit für die Inkubation und/oder die Temperatur während der Inkubation frei wählen kann . Dadurch kann bei dieser Ausführungsform das verbesserte Verfahren durch optimierte Einstellung der Zeit für die Inkubation und/oder die Inkubationstemperatur so durchgeführt werden, dass nur eine relativ geringe Menge der Antigene benötigt wird .
Das verbesserte Verfahren kann nach einer vierten, alternativen Ausführungsform ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV sein und insbesondere die Schritte umfassen oder aus den Schritten bestehen zum Bereitstellen einer vorbestimmten Menge der Antigene vorzugsweise auf bzw . an einem Trägermedium, insbesondere auf bzw . an dem Trägermedium immobil vorgelegt , beispielsweise fixiert ; zum Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den Antigenen; zum Waschen des Trägermediums ; zum Aufbringen einer vorbestimmten Menge von markierten Antikörpern auf das Trägermedium; zum Waschen, insbesondere erneuten bzw . nochmaligen Waschen des Trägermediums ; zum Auf bringen eines vorbestimmten Volumens eines Reaktants auf das Trägermedium; zum Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse vorzugsweise des Trägermediums beispielsweise auf eine Reaktion .
In diesem Fall sind die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie an humane , an das lineare Epitop der Antigene spezifisch bindbare bzw . bindende Antikörper spezifisch binden können . Die markierten Antikörper sind insbesondere so beschaffen, dass sie an eine andere Bindungsstelle der humanen Antikörper als eine an das lineare Epitop der Antigene spezifisch bindende bzw . bindbare Bindungsstelle spezifisch binden können . Sofern also solche humanen Antikörper in der Körperflüssigkeit enthalten sind und sofern diese humanen Antikörper an das lineare Epitop der Antigene gebunden vorliegen, wird es nach dem Aufbringen der markierten Antikörper zur Bindung an diese gebundenen humanen Antikörper kommen .
Insbesondere sind die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie bei Vorhandensein eines oder des Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken . Der in dem verbesserten Verfahren eingesetzte Reaktant ist vorzugsweise so beschaffen, dass durch ihn die markierten Antikörper die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken . Diese Reaktion kann eine Farbreaktion sein, beispielsweise wenn die markierten Antikörper mit einem Enzym markiert sind und der Reaktant ein Reaktant des Enzyms ist .
Das verbesserte Verfahren dieser Ausführungsform beruht aufgrund der hier eingesetzten markierten Antikörper auf einem an sich bekannten Sandwichansatz , bei dem die markierten Antikörper nicht direkt an die Antigene spezifisch binden, sondern indirekt über die humanen Antikörper . Das verbesserte Verfahren dieser Ausführungsform ermöglicht es , etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen und darüber hinaus eine Aussage über den vorliegenden Typus dieser Antikörper zu treffen . Beispielsweise kann festgestellt werden, ob es sich bei den identifizierten Antikörpern um Immunglobulin A ( IgA) oder Immunglobulin D ( IgD ) oder Immunglobulin E ( IgE ) oder Immunglobulin G ( IgG) oder Immunglobulin M ( IgM) handelt . Dazu ist den markierten Antikörpern lediglich ein Antikörper zugrunde zu legen, welcher an einen solchen humanen Antikörper spezifisch bindet , der IgA oder IgD oder IgE oder IgG oder IgM präsentiert . Sofern die humanen Antikörper beispielsweise IgA präsentieren und es zu der messbaren und/oder von einem Benutzer wahrnehmbaren Reaktion kommt , bedeutet dies , dass die festgestellten Antikörper gegen HPV solche Antikörper des Typs IgA sind .
Durch die Erkennung des Antikörpertyps können wichtige Informationen gewonnen werden . Beispielsweise geben erkannte Antikörper des Typs IgA einen Hinweis , dass eine Schleimhaut der Person betroffen ist , von der die Körperflüssigkeit entnommen wurde . Beispielsweise geben erkannte Antikörper des Typs IgM einen Hinweis , dass es sich um eine neue Infektion handelt . Beispielsweise geben erkannte Antikörper des Typs IgD einen Hinweis auf eine Infektion des Magen-Darm-Traktes .
Bei dem verbesserten Verfahren ist insbesondere vorgesehen, dass die vorbestimmte Menge der Antigene kleiner als die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper oder entsprechend der vorbestimmten Menge der markierten Antikörper ist . Es hat sich gezeigt , dass bei einem derartigen Mengenverhältnis zwischen den Antigenen und den markierten Antikörpern die vorstehend beschriebene und durch die markierten Antikörper bewirkte Veränderung bzw . Reaktion in einem gewünschten Maße erzielt wird, um eine qualitative und/oder quantitative Identifizierung auf Antikörper gegen HPV vornehmen zu können . Dies ist insbesondere der Fall , wenn das verbesserte Verfahren auf einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen mit kompetitivem Ansatz beruht . Grundsätzlich kann die vorbestimmte Menge der Antigene auch größer als die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper sein . Bei dem verbesserten Verfahren sind die vorbestimmte Menge der Antigene und die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper gegenüber dem Volumen der Körperflüssigkeit insbesondere so bemessen, dass bei einer Menge von in der Körperflüssigkeit enthaltenen und an das lineare Epitop der Antigene spezifisch bindenden Antikörpern oberhalb einer vorgegebenen Mindestmenge die markierten Antikörper bei Vorhandensein eines Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken oder bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben . Es kann auf diese Weise die Sensitivität des Verfahrens eingestellt werden . Zur Einstellung der vorbestimmten Mindestmenge können Daten aus gesicherten klinischen Diagnosen und/oder von nachweislich gesunden Personen herangezogen werden .
Insbesondere ist die vorgegebene Mindestmenge auf einen Wert festgelegt , welcher oberhalb derj enigen Menge von gesunden Personen ist . Das verbesserte Verfahren ist dadurch so eingestellt , dass es bei gesunden Personen nicht anschlägt . Insbesondere ist die vorgegebene Mindestmenge auf einen Wert festgelegt , welcher oberhalb derj enigen Menge von gesunden Personen ist und unterhalb derj enigen Menge von HPV-erkrankten Personen ist . Das verbesserte Verfahren ist dadurch so eingestellt , dass es bei HPV-erkrankten Personen anschlägt .
Unter dem Begriff „HPV-erkrankt" ist in der vorliegenden Offenbarung insbesondere zu verstehen, dass die betroffene Person eine HPV-bedingte Erkrankung aufweist oder hatte und dadurch das Immunsystem der Person Antikörper gegen die HPV bildet oder gebildet hat . Mit anderen Worten ist unter „HPV-erkrankt" insbesondere zu verstehen, dass die betrof fene Person Antikörper, insbesondere körpereigene Antikörper , aufweist , welche durch eine HPV-bedingte Erkrankung bewirkt sind .
Bei dem verbesserten Verfahren ist das lineare Epitop der Antigene insbesondere so beschaffen, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper j eweils gegen HPV eines anderen Typs aus einer Klasse mit wenigstens zwei der Typen 16 , 18 , 31 , 33 , 35 , 39 , 45 , 51 , 52 , 56 , 58 , 59 , 68 , 73 , 82 wirksam sind . Diese HPV-Typen bilden die Hochrisikogruppe , welche bei der Entstehung von Krebsvorstufen ( Dysplasien) und daraus resultierenden Karzinomen maßgeblich beteiligt sind . Im Falle , dass durch das lineare Epitop zwei dieser HPV-Typen abgedeckt werden, stellt das lineare Epitop auf eine Aminosäureabfolge ab, welche bei diesen beiden HPV-Typen in gleicher Weise vorhanden sind . Je mehr dieser HPV-Typen durch eine gemeinsame Aminosäureabfolge erfasst sind und diese Aminosäureabfolge von dem linearen Epitop abgebildet ist , desto besser ist die Sensitivität des verbesserten Verfahrens im Hinblick auf ein Erkennen von Krebsvorstufen und Karzinomen .
Bei dem verbesserten Verfahren ist das lineare Epitop der Antigene insbesondere so beschaffen, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper gegen das Ll-Protein der HPV wirksam ist . Alternativ kann das lineare Epitop der Antigene so beschaffen sein, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper gegen das L2-Protein der HPV wirksam sind . Alternativ kann das lineare Epitop der Antigene so beschaffen sein, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper gegen das E 6-Protein der HPV wirksam ist . Alternativ kann das lineare Epitop der Antigene so beschaffen sein, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper gegen das Ei- Protein der HPV wirksam ist . Alternativ kann das lineare Epitop der Antigene so beschaffen sein, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper j eweils gegen ein anderes der HPV- Proteine aus der Gruppe LI , L2 , E 6 und E7 wirksam ist .
Unter dem Begriff „Körperflüssigkeit" ist in der vorliegenden Offenbarung insbesondere das in den verschiedenen Kompartimenten des menschlichen Körpers vorkommende Wasser einschließlich der darin gelösten Stoffe zu verstehen . Die Körperflüssigkeit kann Blut und/oder Lymphe und/oder Speichel und/oder Urin und/oder Schweiß sein . Beispielsweise handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um Vollblut oder um Serum und/oder Plasma des Vollblutes . Beispielsweise handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um Serum und/oder Plasma aus einer durch Venenpunktion erhaltenen Blutprobe . Die Körperflüssigkeit kann auch Kapillarblut oder Vollblut aus der Fingerbeere einer Person sein . Insbesondere handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um eine Probe von Körperflüssigkeit .
Die Verbesserungen in der Erkennung können mit einem Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV erreicht werden, umfassend Antigene mit einem linearen Epitop , insbesondere wenigstens einem linearen Epitop oder ausschließlich einem linearen Epitop , welches vorzugsweise reaktiv ist und so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind . Insbesondere handelt es sich bei den Antigenen um die vorstehend zu dem verbesserten Verfahren beschriebenen Antigene . Durch das Testkit ist eine Durchführung des verbesserten Verfahrens ermöglicht . Insofern können mittels des Testkits die Vorteile des verbesserten Verfahrens erreicht werden .
Darüber hinaus bietet das verbesserte Testkit aufgrund der verwendeten speziellen Antigene den Vorteil , dass zu seiner Lagerung keine Kühlung notwendig ist . Das Testkit kann beispielsweise bei Raumtemperatur ohne Wirkungsverlust oder zumindest ohne relevanten Wirkungsverlust gelagert werden . Auch bietet das verbesserte Testkit den Vorteil , dass es keiner physiologisch wirkenden Flüssigkeit bedarf , in denen die Antigene vorzuhalten sind, um die Reaktivität der Antigene aufrecht zu erhalten . Die Antigene bleiben auch reaktiv, wenn sie beispielsweise in fester Form und/oder in trockenem Zustand und/oder in einer nicht physiologisch wirkenden Flüssigkeit vorliegen .
Insbesondere umfasst das verbesserte Testkit markierte Antikörper, welche so beschaffen sind, dass sie an das lineare Epitop der Antigene spezifisch binden können . Insbesondere sind die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie bei Vorhandensein eines Reaktants beispielsweise eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken oder bei räumlicher Häufung , insbesondere räumlicher Häufung gebundener markierter Antikörper, beispielsweise eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben . Dadurch ist eine Identifizierung von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV ermöglicht . Insbesondere handelt es sich bei den markierten Antikörpern um die vorstehend zu dem verbesserten Verfahren beschriebenen markierten Antikörper .
Bei einer Ausführungsform umfasst das verbesserte Testkit ein Trägermedium, auf dem eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge der Antigene an einer vorgegebenen Stelle vorliegt , insbesondere immobil vorgelegt ist , beispielsweise fixiert ist . Dadurch ist eine Durchführung des verbesserten Verfahrens gemäß der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform ermöglicht . Insbesondere sind die markierten Antikörper beabstandet zu den Antigenen angeordnet . Insbesondere sind die markierten Antikörper im Bereich einer Auftragsstelle für die Körperflüssigkeit angeordnet . Insbesondere sind die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie , beispielsweise im Falle einer Bindung, also einer Bindung an das lineare Epitop der Antigene , eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben, wenn eine räumliche Häufung, also eine räumliche Häufung markierter Antikörper, vorliegt .
Das verbesserte Testkit dieser Ausführungsform kann auf das Trägermedium als einzigem Bestandteil reduziert sein . Auf dem Trägermedium sind bereits die Antigene vorgehalten . Dies ist dadurch ermöglicht , dass die Antigene keine physiologisch wirkende Flüssigkeit zur Aufrechterhaltung ihrer Reaktivität benötigen . Beispielsweise liegen die Antigene getrocknet , beispielsweise auf dem Trägermedium getrocknet vor . Grundsätzlich können auch die markierten Antikörper getrocknet , beispielsweise auf dem Trägermedium getrocknet vorliegen .
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das verbesserte Testkit eine vorbestimmte Menge der Antigene , beispielsweise in einem Behältnis , beispielsweise gelöst in einer Pufferflüssigkeit , insbesondere Pufferlösung . Ferner umfasst das verbesserte Testkit ein Trägermedium, auf dem eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge von Fangmolekülen an einer vorgegebenen Stelle vorliegt , insbesondere immobil vorgelegt ist , beispielsweise fixiert ist . Dadurch ist eine Durchführung des verbesserten Verfahrens gemäß der vorstehend beschriebenen zweiten Ausführungsform ermöglicht .
Insbesondere sind die markierten Antikörper beabstandet zu den Fangmolekülen angeordnet . Insbesondere sind die markierten Antikörper im Bereich einer Auftragsstelle für die Körperflüssigkeit angeordnet . Insbesondere sind die markierten Antikörper so beschaffen, dass sie beispielsweise im Falle einer Bindung, also einer Bindung an das lineare Epitop der Antigene , eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben, wenn eine räumliche Häufung , also eine räumliche Häufung markierter Antikörper, vorliegt . Sofern die Antigene multimer sind, also als Multimer vorliegen, können die Fangmoleküle so beschaffen sein, dass sie j eweils an das lineare Epitop der Antigene spezifisch binden können . In diesem Fall ist eine Durchführung des verbesserten Verfahrens gemäß der ersten Ausgestaltung der vorstehend beschriebenen zweiten Ausführungsform ermöglicht . Beispielsweise beruhen die Fangmoleküle auf die gleichen Antikörper , welche auch den markierten Antikörpern zugrunde gelegt sind . Dadurch können Entwicklungskosten eingespart werden, da lediglich ein einziger Antikörper zu entwickeln ist .
Alternativ können die Antigene monomer sein . Dadurch ergeben sich Kostenvorteile , da die eingesetzten Antigene als Monomer relativ kostengünstig sind . Sofern die Antigene monomer sind, also als Monomer vorliegen, können die Fangmoleküle so beschaffen sein, dass sie j eweils an eine andere Bindungsstelle der Antigene als das lineare Epitop spezifisch binden können . In diesem Fall ist eine Durchführung des verbesserten Verfahrens gemäß der zweiten Ausgestaltung der vorstehend beschriebenen zweiten Ausführungsform ermöglicht . Die andere Bindungsstelle kann ein Epitop sein . In diesem Fall sind die Fangmoleküle beispielsweise so beschaffen, dass sie j eweils an ein anderes Epitop der Antigene als das lineare Epitop spezifisch binden können . Das andere Epitop kann ein lineares oder ein konf ormationelles Epitop sein .
Die vorstehend genannte Pufferflüssigkeit kann eine Kochsalzbasierte Lösung sein . Alternativ kann die Pufferflüssigkeit ein TRIS-BSA ( Tris (hydroxymethyl ) -aminomethan mit Bovines Serumalbumin) oder ein Histidin-Puffer sein .
Bei dem Trägermedium der vorstehenden Ausführungsformen des verbesserten Testkits kann es sich um einen Teststreifen handeln . Beispielsweise weist der Teststreifen ein Material auf oder besteht daraus , welches eine Kapillarkraft auf eine darauf auf gegebene Flüssigkeit ausübt . Beispielsweise hat der Teststreifen ein saugfähiges Papiermaterial oder besteht daraus . Der Teststreifen kann in einer Testkassette vorliegen .
Bei einer wiederum anderen Ausführungsform umfasst das verbesserte Testkit eine vorbestimmte Menge der Antigene vorzugsweise auf einem Trägermedium, insbesondere auf dem Trägermedium immobil vorgelegt , beispielsweise fixiert . Das verbesserte Testkit umfasst ferner eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper . Die markierten Antikörper sind insbesondere so beschaffen, dass sie bei Vorhandensein eines Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken . Darüber hinaus umfasst das verbesserte Testkit ein vorbestimmtes Volumen eines Reaktants , welches so beschaffen ist , dass durch ihn die markierten Antikörper die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken .
Durch diese Ausführungsform ist eine Durchführung des verbesserten Verfahrens gemäß der vorstehend beschriebenen dritten Ausführungsform ermöglicht . Diese Ausführungsform ermöglicht es , dass die Nachweisgrenze für die Identifizierung etwaiger in der Körperflüssigkeit enthaltener Antikörper gegen HPV durch Einstellung der Zeit für die Inkubation und/oder die Inkubationstemperatur verändert , beispielsweise herabgesetzt werden kann .
Das Trägermedium kann in diesem Fall ein Reagenzgefäß , beispielsweise einer Mikrotiterplatte , sein . Darin können, beispielsweise auf dem Boden und/oder an den Wänden, die Antigene vorliegen . Bevorzugt sind die Antigene in dem Reagenzgefäß , insbesondere am Boden und/oder an den Wänden fixiert . Beispielsweise ist der Boden und/oder sind die Wände des Reagenzgefäßes mit den Antigenen beschichtet .
Bei einer Abwandlung der vorstehenden Ausführungsform umfasst das verbesserte Testkit anstelle der an das lineare Epitop der Antigene bindenden markierten Antikörper nunmehr solche markierten Antikörper, die an humane Antikörper spezifisch binden können, wobei diese humanen Antikörper so beschaffen sind, dass sie an das lineare Epitop der Antigene spezifisch binden bzw . binden können . Die hier zum Einsatz kommenden markierten Antikörper sind insbesondere so beschaffen, dass sie bei Vorhandensein eines Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken .
Durch diese Abwandlung ist eine Durchführung des verbesserten Verfahrens gemäß der vorstehend beschriebenen vierten Ausführungsform ermöglicht . Insofern ermöglicht diese Abwandlung etwaige in Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen und darüber hinaus eine Aussage über den vorliegenden Typus dieser Antikörper zu treffen . Bei den vorstehend genannten markierten Antikörpern können monoklonale Antikörper, beispielsweise monoklonale Mausantikörper zugrunde gelegt sein, welche markiert sind . Diese monoklonalen Antikörper können aus einer Hybridom-Zelllinie erhalten sein . Dadurch ist begünstigt , dass die daraus erhaltenen Antikörper keine oder zumindest keine relevante Varianz zueinander aufweisen . Unter dem Begriff „Hybridom-Zelllinie" ist insbesondere eine Zelllinie zu verstehen, welche mittels Hybridom-Technik erhalten wird .
Sofern die markierten Antikörper bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben sollen, sind diese Antikörper beispielsweise mit kolloidalem Gold und/oder kolloidalem Silber markiert .
Sofern die markierten Antikörper bei Vorhandensein eines Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken sollen, sind diese Antikörper mit einem Enzym, wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase ( HRP ) oder alkalischer Phosphatase (AP ) , markiert . Der eingesetzte Reaktant kann Tetramethylbenzidin ( TMB ) oder Fast-Red sein, so dass durch ihn die eintretende Reaktion ein Farbumschlag ist .
Sofern die bewirkte Reaktion bzw . Veränderung gemessen werden soll , kann das verbesserte Testkit ein Photometer oder eine sonstige photooptische Einrichtung umfassen .
Nach einem Aspekt wird eine Verwendung eines Antigens in dem verbesserten Verfahren und/oder dem verbesserten Testkit vorgeschlagen . Das Antigen umfasst ein lineares Epitop , insbesondere wenigstens ein lineares Epitop oder ausschließlich ein lineares Epitop , welches so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
Nach einem weiteren Aspekt wird ein Antikörper oder markierter Antikörper zur Anwendung in einem diagnostischen Verfahren, insbesondere in einem Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV, vorgeschlagen . Der Antikörper oder markierte Antikörper ist so beschaffen, dass er an ein lineares Epitop eines Antigens spezifisch binden kann . Das lineare Epitop des Antigens ist so beschaffen, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
Insbesondere ist der markierte Antikörper so beschaffen, dass er bei Vorhandensein eines Reaktanten eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirkt oder bei räumlicher Häufung, insbesondere räumlicher Häufung gebundener markierter Antikörper dieser Art , eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergibt .
Nach einem weiteren Aspekt wird eine Verwendung eines markierten Antikörpers in dem verbesserten Verfahren und/oder in wenigstens einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen des verbesserten Testkits vorgeschlagen . Der markierte Antikörper ist so beschaffen, dass er an ein lineares Epitop eines Antigens spezifisch binden kann . Das lineare Epitop des Antigens ist so beschaffen, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
Insbesondere ist der markierte Antikörper so beschaffen, dass er bei Vorhandensein eines Reaktanten eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirkt oder bei räumlicher Häufung, insbesondere räumlicher Häufung gebundener markierter Antikörper dieser Art , eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergibt .
Nach einem weiteren Aspekt wird eine Verwendung eines Antikörpers als Fangmolekül in dem verbesserten Verfahren und/oder in wenigstens einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen des verbesserten Testkits vorgeschlagen . Der Antikörper ist spezifisch bindend an ein lineares Epitop eines Antigens , wobei das lineare Epitop so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
Nach einem weiteren Aspekt wird eine Verwendung eines Moleküls als Fangmolekül in dem verbesserten Verfahren und/oder in wenigstens einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen des verbesserten Testkits vorgeschlagen . Das Molekül ist spezifisch bindend an eine andere Bindungsstelle eines Antigens als ein lineares Epitop, welches so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind . Insbesondere ist das Molekül ein Antikörper , welcher so beschaffen ist , dass er an ein anderes Epitop des Antigens als das lineare Epitop spezifisch binden kann .
Kurzbeschreibung der Figuren
Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung mehrerer Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnung . Es zeigen
Fig . 1 eine erste exemplarische Ausführungsform eines Testkits zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV in einer schematisierten Darstellung ,
Fig . 2 eine zweite exemplarische Ausführungsform eines
Testkits zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV in einer schematisierten Darstellung ,
Fig . 3 eine dritte exemplarische Ausführungsform eines
Testkits zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV in einer schematisierten Darstellung ,
Fig . 4 eine vierte exemplarische Ausführungsform eines
Testkits zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV in einer schematisierten Darstellung, und
Fig . 5 eine fünfte exemplarische Ausführungsform eines
Testkits zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV in einer schematisierten Darstellung .
Ausführungsbeispiele
Figur 1 zeigt eine erste exemplarische Ausführungsform eines Testkits 1 zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV . Das exemplarische Testkit 1 umfasst ein Trägermedium 2 , auf dem eine vorbestimmte Menge von Antigenen 10 und eine vorbestimmte Menge von markierten Antikörpern 20 vorliegen . Bevorzugt ist die vorbestimmte Menge der Antigene 10 an einer vorgegebenen Stelle 3 des Trägermediums 2 angeordnet . Beispielsweise ist die vorgegebenen Stelle 3 als Testlinie ausgebildet . Bevorzugt sind die Antigene 10 an der vorgegebenen Stelle 3 immobilisiert , insbesondere fixiert . Bevorzugt sind die markierten Antikörper 20 mobil vorgelegt und die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper 20 befindet sich in einem räumlichen Abstand zu der vorgegebenen Stelle 3 . Bevorzugt sind die markierten Antikörper 20 im Bereich einer Auftragsstelle 4 angeordnet . Die Auftragsstelle 4 gibt dabei einen Ort des Trägermediums 2 an, welcher zur Aufnahme einer zu untersuchenden Flüssigkeit vorgesehen ist .
Beispielsweise handelt es sich bei dem Trägermedium 2 um einen Teststreifen . Beispielsweise liegt der Teststreifen in einer Testkassette vor . Beispielsweise hat die Testkassette im Bereich der vorgegebenen Stelle 3 eine Testöffnung . Beispielsweise hat die Testkassette im Bereich der Auftragsstelle 4 eine Auftragsöffnung , über welche die zu untersuchende Flüssigkeit auf den Teststreifen auf getragen werden kann .
Beispielsweise weist das Trägermedium 2 ein Material auf oder besteht aus einem Material , welches auf eine Flüssigkeit eine Kapillarkraf t ausübt . Eine im Bereich der Auftragsstelle 4 auf das Trägermedium 2 aufgegebene Flüssigkeit wird dadurch bei ihrem Fließen in Richtung der vorgegebenen Stelle 4 unterstützt . Beispielsweise handelt es sich bei dem Material um ein saugfähiges Papier oder dergleichen .
Bei dem exemplarischen Testkit 1 weisen die Antigene 10 ein lineares Epitop auf . Dieses lineare Epitop ist reaktiv und so beschaffen, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind . Die Antigene 10 können als Monomer oder Multimer vorliegen . Bevorzugt liegen die Antigene 10 auf dem Trägermedium 2 trocken vor und/oder sind die Antigene 10 auf dem Trägermedium 2 getrocknet vorgelegt .
Entsprechend der Antigene 10 sind die markierten Antikörper 20 so beschaffen, dass sie an das lineare Epitop der Antigene 10 spezifisch binden können . Die markierten Antikörper 20 weisen ferner eine Markierung auf , und zwar derart , dass sich bei räumlicher Häufung der markierten Antikörper 20 eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergibt . Beispielsweise handelt es sich bei dem markierten Antikörpern 20 um monoklonale Mausantikörper , welcher mit einer solchen Markierung versehen sind . Beispielsweise sind die markierten Antikörper mit kolloidalem Gold und/oder kolloidalem Silber markiert .
Bevorzugt ist die vorbestimmte Menge der Antigene 10 kleiner als die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper 20 . Grundsätzlich kann die vorbestimmte Menge der Antigene 10 auch der vorbestimmten Menge der markierten Antikörper 20 entsprechen oder größer als die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper 20 sein . Bevorzugt ist ferner die vorbestimmte Menge der Antigene 10 und die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper 20 gegenüber dem Volumen einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe so bemessen, dass bei einer Menge von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen und an das lineare Epitop der Antigene 10 spezifisch bindenden Antikörper oberhalb einer vorgegebenen Mindestmenge die markierten Antikörper 20 bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben .
Das exemplarische Testkit 1 ermöglicht es , in Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV auf serologischem Wege qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen . Durch die eingesetzten Antigene 10 mit ihrem speziellen linearen Epitop kann mit einem einzigen serologischen Test eine Aussage über das Vorhandensein von Krebsvorstufen und Karzinomen gemacht werden, welche von einer ganzen Gruppe von HPV-Typen verursacht wird .
Zur Durchführung des serologischen Tests ist eine Probe von Körperflüssigkeit einer Person bereitzustellen . Bevorzugt handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um Blut , wie beispielsweise Vollblut , oder Serum und/oder Plasma von Blut . Das Blut kann durch Venenpunktion erhalten sein oder Vollblut aus einer Fingerbeere sein . Diese Körperflüssigkeit wird über die Auftragsstelle 4 auf das Trägermedium 2 auf gegeben . Dort kommt die Körperflüssigkeit mit den markierten Antikörpern 20 in Kontakt und läuft zusammen mit zumindest einem Teil der markierten Antikörper 20 , gegebenenfalls durch Ausnutzung einer durch das Material des Trägermediums 2 bedingten Kapillarkraf t , über das Trägermedium 2 in Richtung zu der vorgegebenen Stelle 3 und gelangt in Kontakt mit den Antigenen 10 . Aufgrund des Kontaktes kommt es zu Interaktionen zwischen den Antigenen 10 einerseits und den markierten Antikörpern 20 und etwaigen in der Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern andererseits , wobei die markierten Antikörper 20 und die in der Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörper miteinander um eine Bindung an das lineare Epitop der Antigene 10 konkurrieren .
Je mehr der markierten Antikörper 20 an die Antigene 10 binden, desto stärker tritt auf dem Trägermedium 2 eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung auf . Diese Veränderung ist durch eine lokale Häufung der markierten Antikörper 20 bewirkt , welche aus ihrer Anbindung an die Antigene 10 resultiert und damit durch die Antigene 10 am Ort der Häufung festgehalten sind . Der Ort der Häufung kann der Bereich der vorgegebenen Stelle 3 sein . Beispielsweise weist die Häufung eine linienförmige Erstreckung auf , so dass die Veränderung entlang einer Linie auftritt , wie beispielhaft in der Figur 1 anhand der vorgegebenen Stelle 3 angedeutet ist , welche als gestrichelte Linie dargestellt ist .
Umgekehrt ist es so , dass mit weniger an die Antigene 10 bindenden markierten Antikörpern 20 die Veränderung auf dem Trägermedium 2 schwächer ausfällt . Dieser Effekt wird sich zu Nutze gemacht , um eine Aussage über etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV zu treffen . Denn eine schwächer ausfallende Veränderung auf dem Trägermedium 2 bedeutet , dass mehr Antikörper in der Körperflüssigkeit enthalten sind, welche an das lineare Epitop der Antigene 10 binden können, und diese Antikörper nunmehr anstelle der markierten Antikörper 20 an den Antigenen 10 gebunden vorliegen .
Bevorzugt ist das exemplarische Testkit 1 durch eine Bemessung der auf dem Trägermedium 2 vorgelegten Menge der Antigene 10 und/oder eine Bemessung der auf dem Trägermedium 2 vorlegten Menge der markierten Antikörper 20 so eingestellt bzw . kalibriert , dass die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung eine vorzugsweise vorgegebene Maximalstärke aufweist oder überschreitet , wenn in der Körperflüssigkeit eine Menge von an das lineare Epitop der Antigene 10 spezifisch bindenden Antikörpern unterhalb der vorstehend beschriebenen Mindestmenge enthalten ist . Dadurch ermöglicht das exemplarische Testkit 1 eine qualitative Bestimmung von in der Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV, also ob solche Antikörper in der Körperflüssigkeit enthalten sind oder nicht .
Vor dem Hintergrund, das s mit zunehmender Menge von in der Körperflüssigkeit enthaltener und gegen das spezifische Epitop der Antigene 10 spezifisch bindender Antikörper sich die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung gegenüber der Maximalstärke abschwächt , ermöglicht das exemplarische Testkit 1 auch eine quantitative Bestimmung von in der Körperflüssigkeit enthaltener Antikörper gegen HPV . In diesem Fall kann der Grad der Abschwächung der Veränderung gegenüber der Maximalstärke als Maß für die Menge in der Körperflüssigkeit enthaltener Antikörper gegen HPV herangezogen werden .
Die auftretende Veränderung, insbesondere die Stärke ihrer Ausprägung , kann einerseits von einem Benutzer wahrgenommen werden, welcher aufgrund seiner Wahrnehmung dann eine qualitative und/oder quantitative Identifizierung auf Antikörper gegen HPV vornimmt . Ergänzend oder alternativ kann ein Photometer oder eine sonstiges die Ausprägung der Veränderung erfassende Hilfseinrichtung genutzt sein, um eine qualitative und/oder quantitative Identifizierung auf Antikörper gegen HPV vorzunehmen .
Figur 2 zeigt eine zweite exemplarische Ausführungsform eines Testkits 1 . 1 zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV . Bauteile oder Funktionsabschnitte des exemplarischen Testkits 1 . 1 , welche mit Bauteilen oder Funktionsabschnitten des exemplarischen Testkits 1 der Figur 1 identisch oder funktionsgleich sind, sind mit gleichen Bezugs zeichen versehen; insofern wird auf die Beschreibung zu dem exemplarischen Testkit 1 der Figur 1 verwiesen .
Bei diesem exemplarischen Testkit 1 . 1 ist ein Trägermedium 2 ' , beispielsweise in Art des Trägermediums 2 des exemplarischen Testkits 1 der Figur 1 , vorgesehen und es sind auch bei diesem Trägermedium 2 ' die markierten Antikörper 20 mobil vorgelegt , beispielsweise im Bereich der Auftragsstelle 4 .
Im Unterschied zu dem exemplarischen Testkit 1 der Figur 1 ist bei dem exemplarischen Testkit 1 . 1 der Figur 2 eine vorbestimmte Menge von Fangmolekülen 30 auf dem Trägermedium 2 ' vorgesehen . Bevorzugt ist die vorbestimmte Menge der Fangmoleküle 30 an der vorgegebenen Stelle 3 des Trägermediums 2 ' angeordnet . Bevorzugt sind die Fangmoleküle 30 an der vorgegebenen Stelle 3 immobilisiert , insbesondere fixiert . Bevorzugt sind die Fangmoleküle 30 so beschaffen, dass sie j eweils an das lineare Epitop der Antigene 10 ' spezifisch binden können . Beispielsweise beruhen die Fangmoleküle 30 auf den gleichen Antikörper , welcher auch den markierten Antikörpern 20 zugrunde gelegt ist .
Im Unterschied zu dem exemplarischen Testkit 1 der Figur 1 ist bei dem exemplarischen Testkit 1 . 1 der Figur 2 eine vorbestimmte Menge von Antigenen 10 ' vorgesehen, welche separat zu dem Trägermedium 2 ' vorliegt . Die Antigene 10 ' haben, wie die Antigene 10 des exemplarischen Testkits 1 der Figur 1 , das besagte lineare Epitop , welches so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind . Bei dem exemplarischen Testkit 1 . 1 der Figur 2 ist darauf abgestellt , dass die Antigene 10 ' als Multimer vorliegen . Das besagte lineare Epitop liegt also bei dem j eweiligen Antigen 10 ' wenigstens zweimal vor .
Beispielsweise sind die Antigene 10 ' in einem vorzugsweise vorbestimmten Volumen einer Pufferflüssigkeit 40 gelöst . Die Pufferflüssigkeit 40 dient dazu, die Antigene 10 ' in Lösung zu halten und eine etwaige Kapillareigenschaft des Trägermediums 2 ' nutzen zu können . Die Pufferflüssigkeit 40 braucht im Hinblick auf die Antigene 10 ' nicht physiologisch wirkend sein, da die Reaktivität des linearen Epitops der Antigene 10 ' auch bei einer nicht-physiologisch wirkenden Pufferflüssigkeit erhalten bleibt . Beispielsweise handelt es sich bei der Pufferflüssigkeit um eine Kochsalz- , Tris- oder Histidin-basierte Lösung . Beispielsweise ist die Pufferflüssigkeit 40 mit den Antigenen 10 ' in einem vorzugsweise separaten Behälter 5 aufgenommen . Beispielsweise hat der Behälter 5 eine Öffnung zum Befüllen und/oder Entleeren .
Das exemplarische Testkit 1 . 1 kann wie folgt genutzt werden : Es wird Körperflüssigkeit , insbesondere ein vorbestimmtes Volumen von Körperflüssigkeit mit Antigenen 10 ' , insbesondere der Pufferflüssigkeit 40 mit den darin gelösten Antigenen 10 ' , zusammengebracht . Beispielsweise wird dazu die Körperflüssigkeit in den Behälter 5 eingebracht . Beispielsweise handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um die vorstehend zu dem exemplarischen Testkit 1 der Figur 1 beschriebenen Körperflüssigkeit .
Es wird anschließend, vorzugsweise nach einer vorbestimmten Wirkzeit der Körperflüssigkeit mit den Antigenen 10 ' , das Gemisch mit der Körperflüssigkeit , und den Antigenen 10 ' , insbesondere das Gemisch mit der Körperflüssigkeit , der Pufferlösung 40 und den Antigenen 10 ' , oder zumindest ein Volumenteil des Gemisches über die Auftragsstelle 4 auf das Trägermedium 2 ' auf gegeben . Dort kommt das Gemisch, insbesondere die Körperflüssigkeit , mit den markierten Antikörpern 20 in Kontakt und läuft zusammen mit zumindest einem Teil der markierten Antikörper 20 , gegebenenfalls durch Ausnutzung einer durch das Material des Trägermediums 2 ' bedingten Kapillarkraft , über das Trägermedium 2 ' in Richtung zu der vorgegebenen Stelle 3 und gelangt in Kontakt mit den Fangmolekülen 30 . Aufgrund des Kontaktes kommt es zur Bindung der Fangkörper 30 an solche der linearen Epitope der Antigene 10 ' , welche noch frei sind, insbesondere noch nicht durch einen der markierten Antikörper 20 oder einen in der Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörper besetzt sind .
Grundsätzlich können die Antigene 10 ' , insbesondere die Pufferflüssigkeit mit den darin gelösten Antigenen 10 ' , und separat dazu die Körperflüssigkeit , beispielsweise zeitgleich, auf das Trägermedium 2 ' aufgegeben werden, also mit den markierten Antikörpern 20 zusammengebracht werden . Sofern aber die Antigene 10 ' zuerst mit der Körperflüssigkeit und zeitlich später mit den markierten Antikörpern zusammengebracht werden, sind die Interaktionen zwischen den Antigenen 10 ' und etwaigen in der Körperflüssigkeit enthaltenen und an das lineare Epitop der Antigene 10 ' bindenden Antikörpern zeitlich vorverlagert . Diese Interaktionen haben somit einen zeitlichen Vorsprung vor etwaigen Interaktionen zwischen den Antigenen 10 ' und den markierten Antikörpern 20 .
Bevorzugt ist das exemplarische Testkit 1 . 1 durch eine Bemessung der auf dem Trägermedium 2 ' vorgelegten Menge der markierten Antikörper 20 und/oder eine Bemessung der auf dem Trägermedium 2 ' vorgelegten Menge der Fangmoleküle 30 so eingestellt bzw . kalibriert , dass nach einem Zusammenbringen der Antigene 10 ' mit dem markierten Antikörpern 20 ohne Mitwirkung der Körperflüssigkeit , aber unter Mitwirkung einer Flüssigkeit , beispielsweise der Pufferflüssigkeit , und einem durch das Zusammenbringen bewirkten Laufen dieses Gemisches in Richtung zu den Fangkörpern 30 einerseits die markierten Antikörper 20 an die Antigene 10 ' spezifisch binden und andererseits von diesen in Bindung gegangenen Antigenen noch ausreichend solche Antigene vorliegen, welche noch wenigsten eines der linearen Epitope frei haben, so dass daran die Fangmoleküle spezifisch binden . Erst durch die Bindung an die Fangmoleküle 30 werden die markierten Antikörper 20 auf dem Trägermedium 2 ' festgehalten und es kommt zu einer lokalen Häufung der markierten Antikörper 20 und damit zu einer messbaren und/oder von einem Benutzer wahrnehmbaren Veränderung auf dem Trägermedium 2 ' .
Sofern nunmehr die Antigene 10 ' und die Körperflüssigkeit mit den markierten Antikörpern 20 zusammengebracht werden, ist wenigstens eines der linearen Epitope zumindest eines Teils der Antigene 10 ' durch etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene und an das lineare Epitop der Antigene 10 ' bindbare Antikörper belegt , so dass dadurch eine geringere Anzahl der Antigene 10 ' sowohl eine Bindung mit den markierten Antikörpern 20 und ebenso eine Bindung mit den Fangmolekülen 30 aufweisen und folglich die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung schwächer ausfällt .
Bevorzugt ist das exemplarische Testkit 1 . 1 durch eine Bemessung der Menge der Antigene 10 ' gegenüber der Menge der markierten Antikörper 20 und/oder der Menge der Fangmoleküle so eingestellt bzw . bemessen, dass die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung eine vorzugsweise vorgegebene Maximalstärke aufweist oder überschreitet , wenn in der Körperflüssigkeit eine Menge von an das lineare Epitop der Antigene 10 ' spezifisch bindenden Antikörpern unterhalb der vorstehend beschriebenen Mindestmenge enthalten ist . Dadurch ermöglicht das exemplarische Testkit 1 . 1 eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung von in der Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV in gleicher Weise wie das exemplarische Testkit 1 der Figur 1 . Insofern wird bezüglich der Analyse der sich durch Häufung der markierten Antikörper einstellenden Veränderung auf die Beschreibung zum exemplarischen Testkit 1 der Figur 1 verwiesen .
Figur 3 zeigt eine dritte exemplarische Ausführungsform eines Testkits 1 . 2 zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV . Bauteile oder Funktionsabschnitte des exemplarischen Testkits 1 . 2 , welche mit Bauteilen oder Funktionsabschnitten des exemplarischen Testkits 1 der Figur 1 oder des Testkits 1 . 1 der Figur 2 identisch oder funktionsgleich sind, sind mit gleichen Bezugszeichen versehen; insofern wird auf die Beschreibung zu dem exemplarischen Testkit 1 der Figur 1 bzw . dem exemplarischen Testkit 1 . 1 der Figur 2 verwiesen . Das exemplarische Testkit 1.2 unterscheidet sich von dem exemplarischen Testkit 1.1 der Figur 2 dadurch, dass eine vorbestimmte Menge von Antigenen 10 ' ' vorgesehen ist, welche als Monomer vorliegen und insofern das besagte lineare Epitop jeweils lediglich ein einziges Mal aufweisen. Die Antigene 10' ' können anstelle der Antigene 10' des exemplarischen Testkits 1.1 der Figur 2, in der Pufferflüssigkeit 40 gelöst vorliegen und/oder in dem Behälter 5 auf genommen sein.
Das exemplarische Testkit 1.2 unterscheidet sich von dem exemplarischen Testkit 1.1 der Figur 2 ferner dadurch, dass ein Trägermedium 2 ' ' eingesetzt wird, auf dem eine vorbestimmte Menge von als Antikörper ausgebildeten Fangmolekülen 50 vorgelegt sind, die so beschaffen sind, dass sie jeweils an ein anderes Epitop der Antigene 10' ' als das besagte lineare Epitop spezifisch binden. Bevorzugt sind die Fangmoleküle 50 im Bereich der vorgegebenen Stelle 3 des Trägermediums 2' ' ' angeordnet. Bevorzugt sind die Fangmoleküle 50 an der vorgegebenen Stelle 3 des Trägermediums 2 ' ' ' angeordnet. Bevorzugt sind die Fangmoleküle 50 an der vorgegebenen Stelle 3 immobilisiert, insbesondere fixiert.
Die Durchführung eines serologischen Tests mit dem exemplarischen Testkit 1.2 kann in gleicher Weise wie mit dem exemplarischen Testkit 1.1 der Figur 2 erfolgen. Beispielsweise wird ein vorzugsweise vorbestimmtes Volumen der Körperflüssigkeit zuerst mit den Antigenen 10' ', insbesondere in der Pufferlösung 40 gelösten Antigenen 10' ', zusammengebracht und insbesondere inkubiert . Danach werden die Körperflüssigkeit und die Antigene 10' ', insbesondere die Körperflüssigkeit, die Antigene 10' ' und die Pufferflüssigkeit 40, mit den auf dem Trägermedium 2 ' ' befindlichen markierten Antikörpern 20 zusammengebracht und dieses Gemisch läuft dann auf dem Trägermedium 2 ' ' in Richtung zu der vorgegebenen Stelle 3 und gelangt in Kontakt mit den Fangmolekülen 50.
Diejenigen der Antigene 10' ', welche mit einem der markierten Antikörper 20 einen Bindungs komplex gebildet haben, werden von wenigstens einem der Fangmoleküle 50 festgehalten werden, sofern an den Antigenen des Bindungskomplexes das zur Anbindung notwendige Epitop noch unbesetzt ist und daran das wenigstens eine Fangmolekül spezifisch bindet. Die sich daran anschließende Analyse des Trägermediums 2 ' ' auf eine durch Häufung der festgehaltenen markierten Antikörper 20 bewirkte messbaren und/oder von einem Benutzer wahrnehmbaren Veränderung kann entsprechend der vorstehend zum dem exemplarischen Testkit 1 oder dem exemplarischen Testkit 1 . 1 beschriebenen Vorgehensweise vorgenommen werden .
Figur 4 zeigt eine vierte exemplarische Ausführungsform eines Testkits 1 . 3 zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV . Das exemplarische Testkit 1 . 3 umfasst ein Trägermedium 2 ' ' ' , auf dem eine vorbestimmte Menge der bereits vorstehend beschriebenen Antigene 10 vorliegen . Bevorzugt handelt es sich bei dem Trägermedium 2 ' ' ' um ein Reagenzgefäß . Beispielsweise ist das Reagenzgefäß ein Bestandteil einer Mikrotiterplatte . Bevorzugt sind die Antigene 10 am Boden und/oder an den Wänden des Reagenzgefäßes fixiert . Beispielsweise ist der Boden und/oder sind die Wände des Reagenzgefäßes mit den Antigenen 10 beschichtet .
Weiterhin umfasst das exemplarische Testkit 1 . 3 eine vorbestimmte Menge von markierten Antikörpern 60 und ein vorbestimmtes Volumen eines Reaktants 70 . Bevorzugt liegen die markierten Antikörper 60 getrennt von dem Trägermedium 2 ' ' ' vor . Bevorzugt liegt der Reaktant 70 getrennt von dem Trägermedium 2 ' ' ' und den markierten Antikörpern 60 vor .
Den markierten Antikörpern 60 sind solche Antikörper zugrunde gelegt , wie sie bereits den markierten Antikörpern 20 der exemplarischen Testkits 1 , 1 . 1 und 1 . 2 zugrunde gelegt sind, welche also so beschaffen sind, dass sie an das lineare Epitop der Antigene 10 spezifisch binden können . Hinsichtlich der Markierung sind die markierten Antikörper 60 so beschaffen, dass sie bei Vorhandensein eines Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken . Der bereitgestellte Reaktant 70 ist insofern so beschaffen, dass durch ihn diese Reaktion stattfindet . Beispielsweise sind die markierten Antikörper 60 mit einem Enzym, wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase ( HRP ) markiert . Beispielsweise handelt es sich bei dem Reaktant um Tetramethylbenzidin ( TMB ) .
Die Durchführung eines serologischen Tests mit dem exemplarischen Testkit 1 . 3 kann wie folgt erfolgen : Es wird ein vorzugsweise vorbestimmtes Volumen an Körperflüssigkeit mit den Antigenen 10 des Trägermediums 2 ' ' ' zusammengebracht und insbesondere inkubiert . Beispielsweise wird dazu die Körperflüssigkeit in das Reagenzgefäß eingefüllt . Bei der Körperflüssigkeit kann es sich um die vorstehend beschriebene Körperflüssigkeit handeln .
Anschließend wird das Trägermedium 2 ' ' ' gewaschen . Etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene und an das lineare Epitop der Antigene 10 bindende Antikörper verbleiben auf dem Trägermedium 2 ' ' ' , insbesondere im Reagenzgefäß , sofern eine spezifische Bindung an die Antigene 10 stattgefunden hat und diese Antikörper dadurch festgehalten sind .
Nach dem Waschen werden die markierten Antikörper 70 auf das Trägermedium 2 ' ' ' aufgebracht , beispielsweise in das Reagenzgefäß eingefüllt , insbesondere inkubiert . Es kommt zu mehr oder weniger Interaktionen zwischen den Antigenen 10 und den markierten Antikörpern 70 , j e nachdem wie viele der Antigene 10 noch eine spezifische Bindung noch zulassen, weil das besagte lineare Epitop oder wenigstens eines der besagten linearen Epitope noch nicht durch ein in der Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörper besetzt ist .
Danach wird das Trägermedium 2 ' ' ' erneut gewaschen . Diej enigen der markierten Antikörper 70 , die an die Antigene 10 spezifisch binden konnten, verbleiben auf dem Trägermedium 2 ' ' ' , insbesondere im Reagenzgefäß . Schließlich wird der Reaktant 70 auf das Trägermedium 2 ' ' ' aufgebracht , insbesondere in das Reagenzgefäß eingefüllt . Durch den Reaktant 70 werden diej enigen der markierten Antikörper 60 , welche auf dem Trägermedium 2 ' ' ' , insbesondere im Reagenzgefäß verblieben sind, nunmehr eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion, wie beispielsweise eine Farbreaktion, zeigen .
Je mehr der markierten Antikörper 60 an die Antigene 10 binden konnten, desto stärker fällt die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion aus . Umgekehrt ist es so , dass mit weniger an die Antigene 10 gebundenen markierten Antikörpern 60 die Reaktion schwächer ausfällt . Dieser Effekt wird sich zu Nutze gemacht , um eine Aussage über etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV zu treffen . Denn eine schwächer ausfallende Reaktion bedeutet , dass mehr Antikörper in der Körperflüssigkeit enthalten sind, welche an das lineare Epitop der Antigene 10 binden konnten, und diese Antikörper anstelle der markierten Antikörper an den Antigenen 10 gebunden vorliegen . Die sich anschießende Analyse der Reaktion im Hinblick auf eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung etwaiger in der Körperflüssigkeit enthaltener Antikörper gegen HPV kann grundsätzlich auf die gleiche Art und Weise erfolgen, wie bei den vorstehend beschriebenen serologischen Tests , denen eine durch Häufung der markierten Antikörper 20 bewirkte messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung zugrunde liegt .
Figur 5 zeigt eine fünfte exemplarische Ausführungsform eines Testkits 1 . 4 zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV . Das exemplarische Testkit 1 . 4 unterscheidet sich von dem exemplarischen Testkit 1 . 3 der Figur 4 dadurch, dass eine vorbestimmte Menge von markierten Antikörpern 80 bereitgestellt ist , welche so beschaffen sind, dass sie an humane Antikörper, spezifisch binden können . Beispielsweise haben die markierten Antikörper 80 nicht die Eignung, dass sie an das lineare Epitop der Antigene 10 spezifisch binden können . Den markierten Antikörpern 80 kann ein monoklonaler Mausantikörper zugrunde gelegt sein . Die markierten Antikörper 80 können in gleicher Weise wie die markierten Antikörper 70 des exemplarischen Testkits 1 . 3 markiert sein, so dass sie bei Vorhandensein eines Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken .
Die Durchführung eines serologischen Tests mit dem exemplarischen Testkit 1 . 4 kann in gleicher Weise wie mit dem exemplarischen Testkit 1 . 3 der Figur 4 erfolgen; insofern wird auf die vorstehende Beschreibung verwiesen . Durch die markierten Antikörper 80 basiert der exemplarische Testkit 1 . 4 auf einem Sandwichansatz . Dies hat zur Folge , dass die markierten Antikörper 80 an in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper spezifisch binden, welche selbst an das besagte lineare Epitop der Antigene 10 spezifisch gebunden vorliegen und dadurch auf dem Trägermedium 2 ' ' ' , insbesondere in dem Reagenzgefäß festgehalten sind .
Je mehr der markierten Antikörper 80 an solche aus der Körperflüssigkeit stammende Antikörper binden, desto stärker fällt die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion aus . Das bedeutet folglich, dass j e stärker die Reaktion ausfällt , desto mehr an das lineare Epitop der Antigene spezifisch bindende Antikörper sind in der Körperflüssigkeit enthalten . Vorliegend wird sich dieser Effekt zu Nutze gemacht , um eine Aussage über etwaige in der Körperflüssigkeit enthaltene Antikörper gegen HPV zu treffen . Die Analyse der Reaktion im Hinblick auf eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung etwaiger in der Körperflüssigkeit enthaltener Antikörper gegen HPV kann grundsätzlich auf die gleiche Art und Weise erfolgen, wie bei den vorstehend beschriebenen serologischen Tests , denen eine durch Häufung der markierten Antikörper 20 bewirkte messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung zugrunde liegt .
Unter suchungs er gebnisse
Die Leistungsfähigkeit des vorstehend beschriebenen serologischen Tests wird nachfolgend am Beispiel einer Untersuchung der Körperflüssigkeit von 138 Frauen beschrieben, bei denen HPV- verursachte Krebsvorstufen bzw . Karzinomen diagnostiziert wurden . Als Körperflüssigkeit wurde eine Probe von Vollblut genutzt . Die serologischen Tests wurden mit Testkits entsprechend dem exemplarischen Testkit 1 . 1 der Figur 2 ausgeführt . Bei den eingesetzten Antigenen war das lineare Epitop so beschaffen, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper gegen HPV j eweils gegen HPV eines anderen der Typen 16 , 18 , 31 , 33 , 35 , 39 , 45 , 51 , 52 , 56 , 58 , 59 , 68 , 73 , 82 wirksam sind . Dadurch wurde die gesamte Hochrisikogruppe abgedeckt .
Die Ergebnisse der serologischen Tests sind in Tabelle 1 zusammengefasst . Unter der Spalte mit der Bezeichnung „Diagnose" ist zwischen einer cervicalen intraepithelialen Neoplasie ( „CIN" ) und einem Zervixkarzinom ( „CxCa" ) unterschieden . Bei der cervicalen intraepithelialen Neoplasie ist zwischen drei Schwergraden unterschieden, wobei ein Schweregrad 1 ( „CIN 1" ) nur leichte Veränderungen der betroffenen Körperzellen, ein Schweregrad 2 ( „CIN 2" ) mäßige Veränderungen der betroffenen Körperzellen und ein Schweregrad 3 ( „CIN 3" ) schwere Veränderungen der betroffenen Körperzellen angibt .
Unter der Spalte „Anzahl" ist diej enige Anzahl der Frauen angeben, bei denen eine cervicale intraepitheliale Neoplasie des Schwergrades 1 bzw . eine cervicale intraepitheliale Neoplasie des Schwergrades 2 bzw . eine cervicale intraepitheliale Neoplasie des Schwergrades 3 bzw . ein Zervixkarzinom diagnostiert wurde . Tabelle 1
Im Zuge der durchgeführten serologischen Tests wurde eine qualitative Bestimmung vorgenommen . Als Schwelle für einen positiven Befund war ein Wert von 750 ng/ml an in der Körperflüssigkeit enthaltener Antikörper gegen HPV festgelegt , auf den eingesetzte Testkit eingestellt wurde . Ergebnisse der serologischen Tests über dem Wert von 750 ng/ml wurden als positiv und Ergebnisse unter oder gleich dem Wert von 750 ng/ml wurden als negativ gewertet .
Die Anzahl der j eweils als positiv gewerteten Testergebnisse ist unter der Spalte „positiv" und die Anzahl der j eweils als negativ gewerteten Testergebnisse ist unter der Spalte „negativ" angegeben . Die Erkennungsquoten sind unter der Spalte „Sensitivität" angegebenen . Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich ist , wurden „CIN 1" diagnostizierte Frauen zu 100 % erkannt . Ebenso wurden „CIN 2" diagnostizierte Frauen zu 100 % erkannt . Eine etwas geringere Erkennungsquote lag bei „CIN 3" diagnostizierten Frauen vor , welche bei 86 , 6 % lag . Bei diagnostizierten Zervixkarzinomen konnte noch eine Erkennungsquote von 82 , 4 % erreicht werden . In der Gesamtheit lag die Erkennungsquote bei 89 , 9 % .
B e z u g s z e i c h e n l i s t e
1 Testkit
1.1 Testkit
1.2 Testkit
1.3 Testkit
1.4 Testkit
2 Trägermedium
2 ' Trägermedium
2 ' ' Trägermedium
2 ' ' ' Trägermedium
3 vorgegebene Stelle
4 Auftragsstelle
5 Behälter
10 Antigene
10' Antigene, multimer
10' ' Antigene, monomer
20 markierte Antikörper
30 Fangmoleküle
40 Pufferflüssigkeit
50 Fangmoleküle
60 markierte Antikörper
70 Reaktant
80 markierte Antikörper

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Serologisches Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV, bei dem Antigene mit einem linearen Epitop genutzt werden, welches reaktiv ist und so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind.
2. Serologisches Verfahren nach Anspruch 1, bei dem markierte Antikörper genutzt werden, welche so beschaffen sind, dass sie an das lineare Epitop der Antigene spezifisch binden können und bei Vorhandensein eines Reaktants eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken oder bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben .
3. Serologisches Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV, umfassend die Schritte oder bestehend aus den Schritten: i) Bereitstellen eines Trägermediums (2) , auf dem eine vorbestimmte Menge von markierten Antikörpern (20) mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge von Antigenen (10) an einer vorgegebenen Stelle (3) vorliegt, wobei die Antigene (10) ein lineares Epitop aufweisen, welches reaktiv ist und so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind, und wobei die markierten Antikörper (20) so beschaffen sind, dass sie an das lineare Epitop der Antigene (10) spezifisch binden können und bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung bewirken; ii) Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den markierten Antikörpern (20) ; iii ) Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse des Trägermediums (2) auf eine Veränderung im Bereich der vorgegebenen Stelle (3) .
4. Serologisches Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV, umfassend die Schritte oder bestehend aus den Schritten:
36 i) Bereitstellen einer vorbestimmten Menge von Antigenen (10') , wobei die Antigene (10') multimer sind und ein lineares Epitop aufweisen, welches reaktiv ist und so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind; ii) Bereitstellen eines Trägermediums (2 ') , auf dem eine vorbestimmte Menge von markierten Antikörpern (20) mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge von Fangmolekülen (30) an einer vorgegebenen Stelle (3) vorliegt, wobei die markierten Antikörper (20) und die Fangmoleküle (30) so beschaffen sind, dass sie jeweils an das lineare Epitop der Antigene (10') spezifisch binden können und die markierten Antikörper (20) bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung bewirken; iii) Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den Antigenen (10') ; iv) Zusammenbringen der Körperflüssigkeit und der Antigene (10') mit den markierten Antikörpern (20) ; v) Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse des Trägermediums (2 ') auf eine Veränderung im Bereich der vorgegebenen Stelle (3) .
5. Serologisches Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV, umfassend die Schritte oder bestehend aus den Schritten: i) Bereitstellen einer vorbestimmten Menge von Antigenen (10' ') , wobei die Antigene (10' ') monomer sind und ein lineares Epitop aufweisen, welches reaktiv ist und so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind; ii) Bereitstellen eines Trägermediums (1' ') , auf dem eine vorbestimmte Menge von markierten Antikörpern (20) mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge von Fangmolekülen (50) an einer vorgegebenen Stelle (3) vorliegt, wobei die markierten Antikörper (20) so beschaffen sind, dass sie jeweils an das lineare Epitop der Antigene (10' ') spezifisch binden können und die markierten Antikörper (20)
37 bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung bewirken, wobei die Fangmoleküle (50) so beschaffen sind, dass sie jeweils an eine andere Bindungsstelle der Antigene (10' ') als das lineare Epitop spezifisch binden können; iii) Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den Antigenen (10' ') ; iv) Zusammenbringen der Körperflüssigkeit und der Antigene (10' ') mit den markierten Antikörpern (20) ; v) Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse des Trägermediums (2 ' ') auf eine Veränderung im Bereich der vorgegebenen Stelle (3) .
6. Serologisches Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV, umfassend die Schritte oder bestehend aus den Schritten: i) Bereitstellen einer vorbestimmten Menge von Antigenen (10) auf einem Trägermedium (2' ' ') , wobei die Antigene (10) ein lineares Epitop aufweisen, welches reaktiv ist und so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind; ii) Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den Antigenen (10) ; iii) Zusammenbringen einer vorbestimmten Menge von markierten Antikörpern (60) mit der Körperflüssigkeit und den Antigenen (10) , wobei die markierten Antikörper (60) so beschaffen sind, dass sie an das lineare Epitop der Antigene (10) spezifisch binden können und bei Vorhandensein eines Reaktants (70) eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken; iv) Waschen des Trägermediums (2 ' ' ') ; v) Aufbringen eines vorbestimmten Volumens eines Reaktants (70) auf das Trägermedium (2' ' ') , wobei der Reaktant (70) so beschaffen ist, dass durch ihn die markierten Antikörper (60) die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken; vi) Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse des Trägermediums (2 ' ' ') auf eine Reaktion.
7. Serologisches Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmen von in Körperflüssigkeit enthaltenen Antikörpern gegen HPV, umfassend die Schritte oder bestehend aus den Schritten: i) Bereitstellen einer vorbestimmten Menge von Antigenen (10) auf einem Trägermedium (2' ' ') , wobei die Antigene (10) ein lineares Epitop aufweisen, welches reaktiv ist und so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, die jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind; ii) Zusammenbringen eines vorzugsweise vorbestimmten Volumens an Körperflüssigkeit mit den Antigenen (10) ; iii) Waschen des Trägermediums (2 ' ' ') ; iv) Aufbringen einer vorbestimmten Menge von markierten Antikörpern (80) auf das Trägermedium (2 ' ' ') , wobei die markierten Antikörper (80) so beschaffen sind, dass sie an humane, an das lineare Epitop der Antigene (10) spezifisch bindbare Antikörper spezifisch binden können und bei Vorhandensein eines Reaktants (70) eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken; v) Waschen des Trägermediums (2 ' ' ') ; vi) Aufbringen eines vorbestimmten Volumens eines Reaktants (70) auf das Trägermedium (2' ' ') , wobei der Reaktant (70) so beschaffen ist, dass durch ihn die markierten Antikörper (80) die messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken; vii ) Durchführen einer qualitativen und/oder quantitativen Identifizierung auf Antikörper gegen HPV anhand einer Analyse des Trägermediums (2 ' ' ') auf eine Reaktion.
8. Serologisches Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die vorbestimmte Menge der Antigene kleiner als die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper oder entsprechend der vorbestimmten Menge der markierten Antikörper ist.
9. Serologisches Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die vorbestimmte Menge der Antigene und die vorbestimmte Menge der markierten Antikörper gegenüber dem Volumen der Körperflüssigkeit so bemessen sind, dass bei einer Menge von in der Körperflüssigkeit enthaltenen und an das lineare Epitop der Antigene spezifisch bindenden Antikörpern oberhalb einer vorgegebenen Mindestmenge die markierten Antikörper bei Vorhandensein eines Reaktanten eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken oder bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben.
10. Serologisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das lineare Epitop der Antigene so beschaffen ist, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper jeweils gegen HPV eines anderen Typs aus einer Klasse mit wenigstens zwei der Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 wirksam sind.
11. Serologisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das lineare Epitop der Antigene so beschaffen ist, dass die mehreren oder vielen daran alternativ bindbaren Antikörper gegen das Ll-Protein der HPV wirksam sind.
12. Testkit (1; 1.1; 1.2; 1.3; 1.4) zum Nachweis von Antikörpern gegen HPV, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend Antigene (10; 10'; 10' ') mit einem linearen Epitop, welches reaktiv ist und so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
13. Testkit nach Anspruch 12, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend markierte Antikörper (20; 60) , welche so beschaffen sind, dass sie an das lineare Epitop der Antigene (10; 10'; 10' ') spezifisch binden können und bei Vorhandensein eines Reaktants (70) eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken oder bei räumlicher Häufung eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Veränderung ergeben.
14. Testkit nach Anspruch 13, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 3, umfassend ein Trägermedium (2) , auf dem eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper (20) mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge der Antigene (10) an einer vorgegebenen Stelle (3) vorliegt.
15. Testkit nach Anspruch 13, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 4, umfassend eine vorbestimmte Menge der Antigene (10') und ein Trägermedium (2 ') , auf dem eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper (20) mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge von Fangmolekülen (30) an einer vorgegebenen Stelle (3) vorliegt, wobei die Antigene (10') multimer sind und die Fangmoleküle (30) so beschaffen sind, dass sie jeweils an das lineare Epitop der Antigene (10') spezifisch binden können.
16. Testkit nach Anspruch 13, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 5, umfassend eine vorbestimmte Menge der Antigene (10' ') und ein Trägermedium (2 ' ') , auf dem eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper (20) mobil vorgelegt ist und eine vorbestimmte Menge von Fangmolekülen (50) an einer vorgegebenen Stelle (3) vorliegt, wobei die Antigene (10' ') monomer sind und die Fangmoleküle (50) so beschaffen sind, dass sie jeweils an eine andere Bindungsstelle der Antigene (10' ') als das lineare Epitop spezifisch binden können.
17. Testkit nach Anspruch 13, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 6, umfassend eine vorbestimmte Menge der Antigene (10) vorzugsweise auf einem Trägermedium (2' ' ') , eine vorbestimmte Menge der markierten Antikörper (60) und ein vorbestimmtes Volumen eines Reaktants (70) , welcher so beschaffen ist, dass durch ihn die markierten Antikörper (60) eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken.
18. Testkit nach Anspruch 12, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 7, umfassend eine vorbestimmte Menge der Antigene (10) vorzugsweise auf einem Trägermedium (2' ' ') , eine vorbestimmte Menge von markierten Antikörpern (80) , welche so beschaffen sind, dass sie an humane, an das lineare Epitop der Antigene (10) spezifisch bindbare Antikörper spezifisch binden können und bei Vorhandensein eines Reaktants (70) eine messbare und/oder von einem Benutzer wahrnehmbare Reaktion bewirken, und umfassend ein vorbestimmtes Volumen eines Reaktants (70) , welcher so beschaffen ist, dass durch ihn die Reaktion stattfindet.
19. Verwendung eines Antigens in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder in einem Testkit nach einem der Ansprüche 12 bis 18, das Antigen umfassend ein lineares Epitop, welches so beschaffen ist, dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche jeweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind.
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20 . Antikörper oder markierte Antikörper , welcher so beschaffen ist , dass er an ein lineares Epitop eines Antigens spezifisch binden kann, wobei das lineare Epitop so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
21 . Verwendung eines markierten Antikörpers in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 und/oder in einem Testkit nach einem der Ansprüche 12 bis 17 , der markierte Antikörper spezifisch bindend an ein lineares Epitop eines Antigens , wobei das lineare Epitop so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
22 . Verwendung eines Antikörpers als Fangmolekül in einem Verfahren nach Anspruch 4 und/oder in einem Testkit nach Anspruch 15 , der Antikörper spezifisch bindend an ein lineares Epitop eines Antigens , wobei das lineare Epitop so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
23 . Verwendung eines Moleküls als Fangmolekül in einem Verfahren nach Anspruch 5 und/oder in einem Testkit nach Anspruch 16 , das Molekül spezifisch bindend an eine andere Bindungsstelle eines Antigens als ein lineares Epitop, welches so beschaffen ist , dass daran alternativ mehrere oder viele Antikörper spezifisch binden können, welche j eweils gegen HPV eines anderen Typs wirksam sind .
24 . Verwendung nach Anspruch 23 , wobei das Molekül ein Antikörper ist , welcher so beschaffen ist , dass er an ein anderes Epitop des Antigens als das lineare Epitop spezifisch binden kann .
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