EP4587469A1 - Molécule hybride comprenant un fragment fc d'anticorps et au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif, impliqué dans une dermatite auto-immune, et ses utilisations - Google Patents

Molécule hybride comprenant un fragment fc d'anticorps et au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif, impliqué dans une dermatite auto-immune, et ses utilisations

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EP4587469A1
EP4587469A1 EP23793000.3A EP23793000A EP4587469A1 EP 4587469 A1 EP4587469 A1 EP 4587469A1 EP 23793000 A EP23793000 A EP 23793000A EP 4587469 A1 EP4587469 A1 EP 4587469A1
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EP
European Patent Office
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seq
peptide
fragment
spacer
coupled
Prior art date
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EP23793000.3A
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German (de)
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Inventor
Guy Serre
Cyril Clavel
Caroline CARLE
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse
Universite de Montpellier
Arthritis Recherche et Developpement SAS
Universite de Toulouse
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse
Universite de Montpellier
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Arthritis Recherche et Developpement SAS
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Publication date
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Definitions

  • Hybrid molecule comprising an antibody Fc fragment and at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune dermatitis, and its uses
  • the present invention relates to a hybrid molecule comprising at least one Fc antibody fragment covalently linked to at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte, involved in autoimmune dermatitis, the uses of a such hybrid molecule, as well as its production process.
  • Self-reactive lymphocytes express receptors on their surface.
  • Said auto-reactive lymphocyte receptors are membrane receptors of a B lymphocyte (BCR) or a T lymphocyte (TCR).
  • Autoimmune dermatitis are diseases of the skin and mucous membranes, particularly linked to the production of autoantibodies by the body and/or pro-inflammatory cytokines secreted by T lymphocytes.
  • the antigenic targets of the autoantibodies responsible for autoimmune dermatitis have been characterized and can be found in the IEDB database, Immune Epitope DataBase and analysis resource, http://www.iedb.org/home_v3.php .
  • Said autoantibodies are in particular directed specifically against the ⁇ -1 polypeptide chain of collagen XVII, the polypeptide sequence of desmoglein-1, or even the polypeptide sequence of desmoglein-3.
  • Treatments generally consist of the administration of systemic corticosteroids, or even immunosuppressive medications, which can cause serious side effects.
  • Anti-CD20 antibodies can also be used, but the latter are not specific for the B lymphocytes causing the auto-reactive antibodies and have no effect on the auto-reactive T lymphocytes.
  • An object of the present invention is thus to provide more targeted treatment of autoimmune dermatitis.
  • the present invention thus aims to provide a treatment adapted for each autoimmune dermatitis.
  • the present invention is based on the inventors' research showing that it is possible to target auto-reactive lymphocyte receptors which recognize self-peptides involved in the development of autoimmune dermatitis. More particularly, the present invention is based on the inventors' research showing that it is possible to target B lymphocyte clones expressing auto-reactive lymphocyte receptors involved in autoimmune dermatitis and/or auto-reactive T lymphocytes (by binding of a self-peptide involved in the development of autoimmune TCR dermatitis), and to eliminate them using a hybrid molecule comprising (i) at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune dermatitis and (ii) a human immunoglobulin Fc fragment.
  • hybrid molecules will specifically target B lymphocyte clones expressing autoantibodies responsible for autoimmune dermatitis and/or auto-reactive T lymphocytes (using said peptide, which is recognized by B membrane receptors and/or T expressed by said B and/or T lymphocytes) which will then be eliminated, after fixation of the Fc fragment on the Fc receptors, by macrophages (via phagocytosis) and/or NK cells (via antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC ), and/or by activation of the complement cascade.
  • the hybrid molecules of the invention thus aim to eliminate these “pathogenic” autoantibodies and the source of inappropriate inflammation from the patients' body.
  • an “Fc fragment” of an antibody means the constant region of an immunoglobulin excluding the first immunoglobulin constant region domain (i.e. CH1-CL).
  • the Fc fragment refers to a homodimer, each monomer comprising the last two constant domains of IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 and CH3), or the last three constant domains of IgE and IgM (i.e. CH2, CH3 and CH4).
  • covalently linked means a covalent bond, that is to say a chemical bond in which two atoms share two electrons. Said covalent bond may be polar or non-polar.
  • a “spacer” is a binding agent which makes it possible to covalently bind an Fc antibody fragment to said peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune dermatitis, while moving said Fc fragment away from said peptide (thus reducing possible steric hindrance). It can be any molecule, and in particular a peptide or a polypeptide. Preferably, the spacer does not modify the physicochemical properties of the hybrid molecule.
  • the presence of at least one spacer is advantageous: it makes it possible to facilitate the independent accessibility of the two partners of the hybrid molecule (the Fc fragment is more easily accessible to bind to the Fc receptors, just as said peptide is more easily accessible to bind to self-reactive lymphocytes), and/or to stabilize the hybrid molecule, and/or increase the solubility of the hybrid molecule.
  • the hybrid molecule according to the invention may comprise one or more spacers.
  • the hybrid molecule comprises one or two spacers.
  • said Fc fragment when at least one spacer is present in said hybrid molecule of the invention, said Fc fragment is covalently linked to a spacer, said spacer itself being covalently linked to said peptide.
  • said Fc fragment when at least two spacers are present in said hybrid molecule of the invention, said Fc fragment is linked covalently to a first spacer, said first spacer itself being linked covalently to a second spacer and the second spacer is itself covalently linked to said peptide.
  • the bond between the Fc fragment and the peptide can therefore be direct, or indirect in the presence of spacers.
  • the hybrid molecule according to the invention may comprise at least one peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune dermatitis.
  • the Fc fragment can be linked to one or two peptides.
  • the Fc fragment comprises two monomers, and the Fc fragment can thus be linked covalently to a peptide on only one of the two monomers, or the Fc fragment can be linked covalently to a peptide on each monomer.
  • the two peptides are identical.
  • said spacer is a polymer containing one or more repeating units containing the ether group.
  • said spacer is polyethylene glycol of formula PEG-n, in which n represents an integer between 1 and 100, preferably between 1 and 10, and in particular 1, 2, 3, 4 or 8.
  • said polyethylene glycol can be functionalized, for example with an amine group (PEG-n-amine such as PEG-NH2).
  • PEG-n-amine such as PEG-NH2
  • an integer between 1 and 100 represents all integer values between 1 and 100, i.e.; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
  • auto-reactive lymphocyte receptor involved in autoimmune dermatitis means a receptor on the surface of a T lymphocyte and/or a B lymphocyte which recognizes a self peptide involving the activation of cells leading to autoimmune dermatitis through inappropriate production of autoantibodies or pro-inflammatory cytokines. More particularly, said lymphocyte receptor is a B lymphocyte receptor (BCR) and/or a T lymphocyte receptor (TCR). The binding of the peptide to the BCR and/or the TCR is thus involved in the development of autoimmune dermatitis.
  • BCR B lymphocyte receptor
  • TCR T lymphocyte receptor
  • the self-peptide involved may comprise all or part of collagen XVII, and the autoantibody involved is an autoantibody directed against collagen XVII.
  • the binding of anti-collagen XVII autoantibodies disrupts the cohesion between the epidermis and the dermis, which causes the formation of a blister (“and consequently bullous pemphigoid”).
  • the expression “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune dermatitis” means a peptide comprising all or part of the polypeptide sequence of collagen XVII, all or part of the polypeptide sequence of desmoglein-1 (DSG1) and/or all or part of the polypeptide sequence of desmoglein-3 (DSG3).
  • the expression “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune dermatitis” means a peptide comprising all or part of the polypeptide sequence of collagen XVII, all or part of the polypeptide sequence of desmoglein-1 (DSG1) or all or part of the polypeptide sequence of desmoglein-3 (DSG3).
  • the peptide according to the invention comprises all or part of the a-1 polypeptide chain of collagen XVII.
  • said ⁇ -1 polypeptide chain of collagen XVII is represented by SEQ ID NO: 35.
  • the peptide according to the invention comprises all or part of the desmoglein-1 (DSG1) polypeptide sequence.
  • DSG1 polypeptide sequence is represented by SEQ ID NO: 36.
  • the peptide according to the invention comprises all or part of the desmogiein-3 (DSG3) polypeptide sequence.
  • DSG3 polypeptide sequence is represented by SEQ ID NO: 37.
  • a “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune dermatitis” means a peptide recognized by an autoantibody directed against collagen XVII, a peptide recognized by an autoantibody directed against DSG1 or a peptide recognized by an autoantibody directed against DSG3.
  • a “peptide binding to an auto-reactive lymphocyte involved in autoimmune dermatitis” means a peptide recognized by an autoantibody directed against the a-1 chain of collagen XVII, a peptide recognized by an autoantibody directed against DSG1 or of a peptide recognized by an autoantibody directed against DSG3.
  • Such peptides can be obtained from fragments of collagen XVII (preferably the ⁇ -1 chain), DSG1, or DSG3, whether these fragments are natural, recombinant or synthetic. Such peptides can also be directly synthesized.
  • the amino acids constituting the peptide can be of the L or D series, preferably of the L series.
  • a peptide according to the invention binds to an autoantibody directed against type XVII collagen (preferably the a-1 chain), against DSG1 or against DSG3, and the connection between said peptide and the autoantibody can for example be verified using an ELISA test (see for example “Autoimmune bullous dermatoses: the autoantibodies involved”, Dr AS. Deleplancque Pr S. Dubucquoi, https://biologiepathologie.chu-lille.fr/fichiers/377_Dermatoses%20bullates%20nov%202017.pdf).
  • said peptide comprises all or part of the polypeptide sequence of desmoglein 1, of the polypeptide sequence of desmoglein 3, or of the a-1 chain of type XVII collagen.
  • said desmoglein 1, said desmoglein 3, or said a-1 chain of type XVII collagen comes from a mammal and is preferably of human origin.
  • the peptide is linear.
  • the peptide in said hybrid molecule according to the invention, can be modified so as to improve its reactivity towards self-reactive lymphocytes.
  • the peptides can be cyclized, the peptides can be of the retro type (the amino acids of the L series are chained together in a sequence inverse to that of the peptide to be reproduced), or of the retro-inverso type (the amino acids are of type D instead of the natural L series and are chained together in a sequence opposite to that of the peptide to be reproduced).
  • the terminal carboxyl function (COOH) of said peptide is replaced by a carboxamide function (CONH2).
  • said Fc fragment has a fucosylation rate of between 0% to 60% of the glycosylated forms, in particular 50%, 40%, 30%, 20%, 10% or 0%.
  • the fucosylation rate is defined as the average proportion of fucose carried by the Fc fragment, relative to the maximum quantity of fucose that an Fc fragment can carry.
  • the Fc fragment and the peptide each have N- and C-terminal ends.
  • the Fc fragment can therefore be linked via its N- or C-terminal end to the N- or C-terminal end of the peptide.
  • said covalent bond is located between the C-terminal end of said Fc fragment and the N-terminal end of said peptide, or between the N-terminal end of said Fc fragment and the N-terminal end of said peptide.
  • the spacer when a spacer is present, the spacer can be linked to the Fc fragment via its N- or C-terminal end.
  • this when at least one spacer is present in said hybrid molecule of the invention, this makes it possible to link the Fc fragment to an azide or to an alkyne which will itself be involved in the covalent bond with said peptide. According to one embodiment, when at least one spacer is present in said hybrid molecule of the invention, this can also make it possible to link the peptide to an alkyne or to an azide which will itself be involved in the covalent bond with the Fc fragment.
  • the hybrid molecule according to the invention comprises at least two spacers: a first spacer which makes it possible to link the Fc fragment to an azide or to an alkyne and a second spacer which makes it possible to link the peptide to an azide (when the Fc fragment is linked to an alkyne) or to an alkyne (when the Fc fragment is linked to an azide).
  • - is coupled to at least one azide or to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, or
  • - is linked to at least one spacer which is itself coupled to an azide or an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, and said peptide is:
  • the Fc fragment is coupled to at least one alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, and said peptide is coupled to an azide, the covalent bond between said Fc fragment and said peptide being created between the azide and alkyne.
  • alkyne such as a cyclooctyne, and in particular DBCO
  • the Fc fragment is linked to at least one spacer, itself coupled to an azide, and said peptide is coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO or
  • the Fc fragment is linked to at least one spacer, itself coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO, and said peptide is coupled to an azide or
  • the Fc fragment is linked to at least one spacer, itself coupled to an azide, and said peptide is linked to a spacer, itself coupled to an alkyne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO or
  • the creation of the covalent bond between the azide and the alkyne corresponds to a so-called “chemistry-click” step, the N3 part of the azide reacting with an alkyne.
  • Azide means salts of hydrogen azide HN3, or organic azides in which one of the nitrogen atoms is covalently bonded to a carbon atom of an organic compound (e.g. methyl azide CH3N3).
  • the azide is represented by the formula N3.
  • Alkyne refers to molecules having the general formula C n H2n-2, and which are characterized by the presence of at least one triple bond.
  • the alkyne is a cyclooctyne, even more preferably dibenzocyclooctyne (DBCO).
  • transglutaminase substrate is for example a peptide comprising a glutamyl residue (a Qtag), as represented by SEQ ID NO: 34 (LLQG).
  • a chemical conjugation means for example a covalent bond between a cysteine isolated or participating in a disulfide bridge after reduction thereof and for example a maleimide. An example of such a conjugation is shown in Figure 4.
  • the Fc fragment comprises a Qtag peptide and said Fc fragment is linked to a spacer (itself coupled to an azide), thanks to the action of the transglutaminase which will create a covalent bond between the glutamyl residue of Qtag and the NH2 group carried by the PEGn spacer.
  • the term “coupled” or “molecular coupling” means the establishment of a covalent bond, thus the Fc fragment and/or the peptide and/or the spacer is linked in such a manner. covalent to an alkyne or azide.
  • the term “bonded” also means a covalent bond.
  • the expression “the Fc fragment is coupled to an azide and said peptide is linked to a spacer, itself coupled to an alcycne, such as a cyclooctyne, and in particular DBCO” can also read “the Fc fragment is covalently linked to an azide and said peptide is covalently linked to a spacer, said spacer itself being covalently linked to an alcycne, such as a cyclooctyne, and in particular the DBCO”.
  • the present invention also relates to a hybrid molecule as defined above, for its use as a drug.
  • said hybrid molecules are intended to target and lyse in the body of patients, by ADCC and/or phagocytosis and/or complement activation, all cells expressing self-lymphocyte receptors.
  • autoimmune dermatitis reactive in the context of autoimmune dermatitis: namely B cells (lymphocytes) expressing on their surface BCRs recognizing at least one of the peptides of the invention (autoantibodies responsible for autoimmune dermatitis, binding to at least one peptide according to the invention) and the T lymphocytes expressing on their surface the TCRs recognizing at least one of the peptides according to the invention.
  • the hybrid molecule according to the invention binds to these cells thanks to the peptide: it is the epitope target of said auto-reactive lymphocyte receptor.
  • the hybrid molecule according to the invention binds also to cells allowing the destruction of B and/or T lymphocytes expressing on their surface the auto-reactive lymphocyte receptors involved in autoimmune dermatitis thanks to its Fc fragment, a natural ligand for Fc receptors (for example Fc-gamma receptor (FcyR ) if the Fc fragment comes from an IgG), present in particular on the surface of macrophages but also of NK (“Natural Killers”) cells.
  • Fc-gamma receptor Fc-gamma receptor
  • the invention relates to a hybrid molecule, as defined above, for its use in the treatment of autoimmune dermatitis, in particular pemphigus or bullous pemphigoid.
  • pemphigus means more particularly pemphigus vulgaris or foliiate pemphigus.
  • the invention relates to a hybrid molecule as defined above and comprising a peptide chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48, for its use in the treatment of pemphigus, in particular pemphigus vulgaris.
  • the peptides derived from desmoglein 1 include peptide 1 YRISGVGIDQPPYGIFVINQKTGEIN (SEQ ID NO: 41), sequence included in that of SEQ ID NO: 36 and which comprises the peptide SEQ ID NO: 12 and the peptide SEQ ID NO: 13; peptide 2: RALNSMGQDLERPLELRVRVLDIN (SEQ ID NO: 42), sequence included in that of SEQ ID NO: 36 and which comprises the peptide SEQ ID NO: 10 and the peptide SEQ ID NO: 21; peptide 3: FKIIRQEPSDSPMFIINRNTGEIRT (SEQ ID NO: 43), sequence included in that of SEQ ID NO:
  • hybrid molecules are incubated for 2 hours, 8 hours, 16 hours, 24 hours and 48 hours at 37°C.
  • the attachment of the hybrid molecules to the surface of the macrophages is demonstrated and quantified by cytofluorimetry (FACS Canto II) after incubation of the macrophages with an anti-Fc antibody coupled to FITC, used 1/1000.
  • NM and ANTI FC respectively represent the well containing the macrophages incubated without antibodies or with the anti-Fc antibody alone.
  • Wt and “LALAPG” respectively represent the well containing the hybrid molecule with the wild-type Fc fragment or with the LALAPG mutation or with the GASDIE mutation.
  • the cells were placed in contact with macrophages (marked PKH-26 red), at a rate of 1 B lymphocyte for 1 macrophage, for 2 hours at 37°C.
  • the cells were then detached and analyzed by flow cytometry.
  • the cells showing double fluorescence correspond to macrophages which have phagocytosed lymphocytes.
  • the different cell populations are expressed as a percentage of the total cell population: percentage of phagocytosis and percentage of B lymphocytes.
  • NK cells were incubated for 30 min, 24 hours or 48 hours at 37°C in the presence of FcGASDIE-N3-DBCO-A488 (an Fc fragment comprising the G236A, S239D and I332E mutations which is linked to at least one PEGn spacer which is itself coupled to an azide covalently linked to a DBCO, the molecule being labeled with fluorochrome A488) or FcGASDIE-N3-DBCO-PEG3-peptide-lysineA488 (an Fc fragment comprising the mutations G236A, S239D and I332E which is linked to at least one PEGn spacer which is itself coupled to an azide covalently linked to a DBCO which is coupled to a PEGn spacer linked to a peptide according to the invention (represented by any one of SEQ ID NO : 1 to SEQ ID NO: 30) the molecule being labeled with fluorochrome A488 which is linked
  • NM represents unlabeled NK cells, without antibodies.
  • Example 6 Reactivity of 10 sera from patients suffering from bullous pemphigoid (BP) with respect to 3 immunodominant peptides derived from the polypeptide sequence of collagen XVII
  • ELISA plate wells were coated using 100 pL of a solution containing the peptide EEVRKLKARVDELERIRRS (represented by SEQ ID NO: 38, sequence included in the peptide SEQ ID NO: 3, also called peptide 1 ) or the peptide RIRRSILPYGDSMDRIEK (represented by SEQ ID NO: 39, sequence included in the peptide SEQ ID NO: 3, is partly included in the peptide SEQ ID NO: 1, 4, 7 and included in the peptide SEQ ID NO: 6, also called peptide 2) or the peptide MDRIEKDRLQGMAP (represented by SEQ ID NO: 40, sequence included in the peptides SEQ ID NO: 1, 3, 4 and 7 and partly included in the peptide SEQ ID NO: 1, also called peptide 3), at a concentration of 10 pg/mL in PBS (Phosphate Buffered Saline) 0.15M NaCI buffer, incubated overnight at 4°C.
  • PBS Phosphate B
  • FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Cter) an Fc fragment comprising the G236A, S239D and I332E mutations, which is linked to at least one PEGn spacer which is itself coupled to an azide covalently linked to a DBCO cyclooctyne coupled to a PEGn spacer which is itself linked to the Cterminal end of peptide 1 EEVRKLKARVDELERIRRS (SEQ ID NO:
  • FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Nter) an Fc fragment comprising the G236A, S239D and I332E mutations, which is linked to at least one PEGn spacer which is itself coupled to an azide covalently linked to a DBCO cyclooctyne coupled to a PEGn spacer which is itself linked to the Nterminal end of peptide 2 RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO:
  • FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Cter) an Fc fragment comprising the G236A, S239D and I332E mutations, which is linked to at least one PEGn spacer which is itself coupled to an azide covalently linked to a DBCO cyclooctyne coupled to a PEGn spacer which is itself linked to the Cterminal end of peptide 2 RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO: 39)).
  • the attachment of hybrid molecules labeled with fluorochrome AF647 to the surface of monocytes and macrophages is demonstrated by cytofluorimetry (FACS Canto II). More than 10,000 events were analyzed per condition.
  • Example 8 Reactivity of 4 sera from patients suffering from pemphigus vulgaris (PV) with respect to 5 immunodominant peptides from DSG-1

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Abstract

L'invention concerne une molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d'anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif responsable d'une dermatite auto-immune, les utilisations d'une telle molécule hybride, ainsi que son procédé de production.

Description

Titre : Molécule hybride comprenant un fragment Fc d’anticorps et au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune, et ses utilisations
[0001] La présente invention concerne une molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d’anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif, impliqué dans une dermatite auto-immune, les utilisations d’une telle molécule hybride, ainsi que son procédé de production. Les lymphocytes auto-réactifs expriment à leur surface des récepteurs. Lesdits récepteurs lymphocytaires auto-réactifs sont des récepteurs membranaires d’un lymphocyte B (BCR) ou d’un lymphocyte T (TCR).
Contexte de l’invention
[0002] Les dermatites auto-immunes sont des maladies de la peau et des muqueuses, notamment liées à la production d’auto-anticorps par l’organisme et/ou de cytokines pro-inflammatoires secrétées par les lymphocytes T.
[0003] Les dermatites auto-immunes sont souvent classées en fonction de l’auto-anticorps en cause. Par exemple, la présence d’auto-anticorps de classe G dirigés contre des desmogléines (les protéines des desmosomes inter-kératinocytaires) est hautement spécifique du pemphigus. Au contraire, la présence d’auto-anticorps anti-collagène XVII est plutôt représentative d’une pemphigoïde bulleuse.
[0004] Ces auto-anticorps sont au cœur des réactions auto-immunes propres aux dermatites auto-immunes (e.g. Di Zenzo G, Thoma-Uszynski S, Calabresi V, Fontao L, Hofmann SC, Lacour JP, Sera F, Bruckner-Tuderman L, Zambruno G, Borradori L, Hertl M. Demonstration of epitopespreading phenomena in bullous pemphigoid: results of a prospective multicenter study. J Invest Dermatol. 2011 Nov;131(11 ):2271-80. doi: 10.1038/jid.2011.180. Epub 2011 Jun 23. PMID: 21697892 ; ou encore Peng B, Temple BR, Yang J, Geng S, Culton DA, Qian Y. Identification of a primary antigenic target of epitope spreading in endemic pemphigus foliaceus. J Autoimmun. 2021 Jan;116:102561. doi: 10.1016/j.jaut.2020.102561. Epub 2020 Nov 4. PMID: 33158670; PMCID: PMC7770069). Ces auto-anticorps représentent donc une cible thérapeutique de choix.
[0005] Les cibles antigéniques des auto-anticorps responsables des dermatites auto-immunes ont été caractérisées et peuvent être retrouvées dans la base de données IEDB, Immune Epitope DataBase and analysis resource, http://www.iedb.org/home_v3.php. Lesdits auto-anticorps sont notamment dirigés spécifiquement contre la chaîne polypeptidique a-1 du collagène XVII, la séquence polypeptidique de la desmogléine-1 , ou encore la séquence polypeptidique de la desmogléine-3.
[0006] A ce jour il n’existe pas de traitement spécifique des dermatites auto-immunes. Les traitements consistent généralement en l'administration de corticoïdes systémiques, voire des médicaments immunosuppresseurs, qui peuvent provoquer des effets secondaires graves. Des anticorps anti-CD20 peuvent également être utilisés, mais ces derniers ne sont pas spécifiques des lymphocytes B à l’origine des anticorps auto-réactifs et sont sans effet sur les lymphocytes T autoréactifs.
[0007] Un objet de la présente invention est ainsi de fournir un traitement plus ciblé des dermatites auto-immunes. En ciblant les cellules B à l’origine des anticorps auto-réactifs (auto-anticorps) spécifiques des dermatites auto-immunes, et/ou les lymphocytes T auto-réactifs sources de cytokines pro-inflammatoires, la présente invention vise ainsi à fournir un traitement adapté pour chaque dermatite auto-immune.
[0008] La présente invention repose sur les recherches des Inventeurs montrant qu’il est possible de cibler les récepteurs lymphocytaires auto-réactifs qui reconnaissent les peptides du soi impliqués dans le développement d’une dermatite auto-immune. Plus particulièrement, la présente invention repose sur les recherches des Inventeurs montrant qu’il est possible de cibler les clones lymphocytaires B exprimant les récepteurs lymphocytaires auto-réactifs impliqués dans une dermatite auto-immune et/ou les lymphocytes T auto-réactifs (par liaison d’un peptide du soi impliqué dans le développement d’une dermatite auto-immune au TCR), et de les éliminer à l’aide d’une molécule hybride comprenant (i) au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune et (ii) un fragment Fc d’immunoglobuline humaine. Ces molécules hybrides cibleront spécifiquement les clones lymphocytaires B exprimant des auto-anticorps responsables d’une dermatite auto-immune et/ou les lymphocytes T auto-réactifs (à l’aide dudit peptide, qui est reconnu par les récepteurs membranaires B et/ou T exprimés par lesdits lymphocytes B et/ou T) qui seront ensuite éliminés, après fixation du fragment Fc sur les récepteurs Fc, par des macrophages (via phagocytose) et/ou des cellules NK (via cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps - ADCC), et/ou par activation de la cascade du complément.
[0009] En ciblant les clones lymphocytaires B exprimant des auto-anticorps responsables d’une dermatite auto-immune et les cellules qui se différencient en plasmocytes qui sécrètent eux-mêmes lesdits auto-anticorps et/ou les lymphocytes T auto-réactifs sources de cytokines pro-inflammatoires, les molécules hybrides de l’invention visent ainsi à faire disparaître ces auto-anticorps « pathogènes » et la source de l’inflammation inappropriée de l’organisme des patients.
Exposé de l’invention
[00010] Molécule hybride selon l’invention
[00011] Dans un premier aspect, l’invention concerne une molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d’anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune, au moins un espaceur étant optionnellement présent entre ledit fragment Fc et ledit peptide. Le schéma d’une telle construction est présenté en Figure 1. [00012] Selon l’invention, une « molécule hybride » s’entend d’une molécule ayant au moins deux composants de nature différente, en l’espèce le fragment Fc d’anticorps et ledit peptide.
[00013] Selon l’invention, un « fragment Fc » d’anticorps s’entend de la région constante d'une immunoglobuline à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (i.e. CH1- CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4).
[00014] Selon l’invention, l’expression « lié de façon covalente » s’entend d’une liaison covalente, c’est-à-dire une liaison chimique dans laquelle deux atomes se partagent deux électrons. Ladite liaison covalente peut être polaire ou non-polaire.
[00015] Selon l’invention, un « espaceur » est un agent de liaison qui permet de lier de façon covalente un fragment Fc d’anticorps audit peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune, tout en éloignant ledit fragment Fc dudit peptide (diminuant ainsi un éventuel encombrement stérique). Il peut s’agir de toute molécule, et notamment d’un peptide ou d’un polypeptide. De manière préférée, l’espaceur ne modifie pas les propriétés physico-chimiques de la molécule hybride.
[00016] La présence d’au moins un espaceur est avantageuse : elle permet de faciliter l’accessibilité indépendante des deux partenaires de la molécule hybride (le fragment Fc est plus facilement accessible pour se lier aux récepteurs Fc, de même que ledit peptide est plus facilement accessible pour se lier aux lymphocytes auto-réactifs), et/ou de stabiliser la molécule hybride, et/ou augmenter la solubilité de la molécule hybride.
[00017] Selon un mode de réalisation, la molécule hybride selon l’invention peut comprendre un ou plusieurs espaceurs. De préférence, la molécule hybride comprend un ou deux espaceurs. Selon un mode de réalisation, lorsqu’au moins un espaceur est présent dans ladite molécule hybride de l’invention, ledit fragment Fc est lié de façon covalente à un espaceur, ledit espaceur étant lui-même lié de façon covalente audit peptide. Selon un autre mode de réalisation, lorsqu’au moins deux espaceurs sont présents dans ladite molécule hybride de l’invention, ledit fragment Fc est lié de façon covalente à un premier espaceur, ledit premier espaceur étant lui-même lié de façon covalente à un deuxième espaceur et le deuxième espaceur est lui-même lié de façon covalente audit peptide. La liaison entre le fragment Fc et le peptide peut donc être directe, ou bien indirecte en présence d’espaceurs.
[00018] Selon un mode de réalisation, la molécule hybride selon l’invention peut comprendre au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune. Cela signifie que le fragment Fc peut être lié à un ou deux peptides. En effet, le fragment Fc comprend deux monomères, et le fragment Fc peut ainsi être lié de façon covalente à un peptide sur un seul des deux monomères, ou bien le fragment Fc peut être lié de façon covalente à un peptide sur chaque monomère. De préférence, lorsque deux peptides sont liés sur le fragment Fc, les deux peptides sont identiques.
[00019] Selon un mode de réalisation, ledit espaceur est un polymère contenant un ou plusieurs motifs de répétition contenant le groupe éther. Selon un mode de réalisation particulier, ledit espaceur est le polyéthylène glycol de formule PEG-n, dans laquelle n représente un nombre entier compris entre 1 et 100, préférentiellement entre 1 et 10, et notamment 1 , 2, 3, 4 ou 8. Selon l’invention ledit polyéthylène glycol peut être fonctionnalisé, par exemple avec un groupement amine (PEG-n-amine tel que PEG-NH2). Selon l’invention « un nombre entier compris entre 1 et 100 » représente toutes les valeurs entières comprises entre 1 et 100, i.e. ; 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63,
64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 et 100.
[00020] L’expression « récepteur lymphocytaire auto-réactif impliqué dans une dermatite autoimmune » s’entend d’un récepteur à la surface d’un lymphocyte T et/ou d’un lymphocyte B qui reconnaît un peptide du soi impliquant l’activation des cellules conduisant à la dermatite autoimmune par une production inappropriée d’auto-anticorps ou de cytokines pro-inflammatoires. Plus particulièrement, ledit récepteur lymphocytaire est un récepteur de lymphocyte B (BCR) et/ou un récepteur d’un lymphocyte T (TCR). La liaison du peptide au BCR et/ou au TCR est ainsi impliqué dans le développement d’une dermatite auto-immune. Par exemple, dans le cas d’une pemphigoïde bulleuse le peptide du soi impliqué peut comprendre tout ou partie du collagène XVII, et l’auto- anticorps impliqué est un auto-anticorps dirigé contre le collagène XVII. Typiquement, la fixation des auto-anticorps anti-collagène XVII perturbe la cohésion entre l'épiderme et le derme, ce qui provoque la formation d'une cloque (« et en conséquence la pemphigoïde bulleuse »).
[00021] L’expression « lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune » s’entend d’un lymphocyte exprimant à sa surface un récepteur qui reconnaît un peptide du soi impliquant l’activation des cellules conduisant à la dermatite auto-immune par une production inappropriée d’auto-anticorps ou de cytokines pro-inflammatoires. De préférence, il s’agit d’un lymphocyte T et/ou d’un lymphocyte B.
[00022] Selon un mode de réalisation, l’expression « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune » s’entend d’un peptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique du collagène XVII, tout ou partie de la séquence polypeptidique de la desmogléine-1 (DSG1 ) et/ou tout ou partie de la séquence polypeptidique de la desmogléine-3 (DSG3). Selon un mode de réalisation, l’expression « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune » s’entend d’un peptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique du collagène XVII, tout ou partie de la séquence polypeptidique de la desmogléine-1 (DSG1 ) ou tout ou partie de la séquence polypeptidique de la desmogléine-3 (DSG3). De préférence, il s’agit d’un peptide comprenant tout ou partie de la chaîne polypeptidique a-1 du collagène XVII, de la séquence polypeptidique de la desmogléine- 1 (DSG1) ou de la séquence polypeptidique de la desmogiéine-3 (DSG3).
[00023] Selon un mode de réalisation, le peptide selon l’invention comprend tout ou partie de la chaîne polypeptidique a-1 du collagène XVII. De préférence, ladite chaine polypeptidique a-1 du collagène XVII est représentée par la SEQ ID NO : 35.
[00024] Selon un autre mode de réalisation, le peptide selon l’invention comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique de la desmogléine- 1 (DSG1 ). De préférence, ladite séquence polypeptidique de la DSG1 est représentée par la SEQ ID NO : 36.
[00025] Selon un autre mode de réalisation, le peptide selon l’invention comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique de la desmogiéine-3 (DSG3). De préférence, ladite séquence polypeptidique de la DSG3 est représentée par la SEQ ID NO : 37.
[00026] Selon un mode de réalisation, un « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune » s’entend d’un peptide reconnu par un auto-anticorps dirigé contre le collagène XVII, d’un peptide reconnu par un auto-anticorps dirigé contre la DSG1 ou d’un peptide reconnu par un auto-anticorps dirigé contre la DSG3. De préférence, un « peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune » s’entend d’un peptide reconnu par un auto-anticorps dirigé contre la chaine a-1 du collagène XVII, d’un peptide reconnu par un auto-anticorps dirigé contre la DSG1 ou d’un peptide reconnu par un auto-anticorps dirigé contre la DSG3. De tels peptides peuvent être obtenus à partir de fragments du collagène XVII (de préférence la chaine a-1 ), de DSG1 , ou de DSG3, que ces fragments soient naturels, recombinants ou de synthèse. De tels peptides peuvent également être directement synthétisés. Les acides aminés constituant le peptide peuvent être de série L ou D, de préférence de série L. Un peptide selon l’invention se lie à un auto-anticorps dirigé contre le collagène de type XVII (de préférence la chaine a-1 ), contre la DSG1 ou contre la DSG3, et la liaison entre ledit peptide et l’auto-anticorps peut par exemple être vérifiée à l’aide d’un test ELISA (voir par exemple « Dermatoses bulleuses autoimmunes : les auto-anticorps impliqués », Dr AS. Deleplancque Pr S. Dubucquoi, https://biologiepathologie.chu-lille.fr/fichiers/377_Dermatoses%20bulleuses%20nov%202017.pdf).
[00027] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique de la desmogléine 1 , de la séquence polypeptidique de la desmogléine 3, ou de la chaine a-1 du collagène de type XVII. Encore plus particulièrement, ladite desmogléine 1 , ladite desmogléine 3, ou ladite chaine a-1 du collagène de type XVII est issue de mammifère et est de préférence d’origine humaine.
[00028] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide a une taille d’au moins 2 acides aminés consécutifs, 3 acides aminés consécutifs, 4 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 5 acides aminés consécutifs. Selon un mode de réalisation, ledit peptide a une taille comprise entre 5 et 70 acides aminés, notamment entre 10 et 70. Selon l’invention, « entre 5 et 70 » s’entend de toutes les valeurs : 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,
69, 70.
[00029] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide est linéaire.
[00030] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide peut être modifié de façon à améliorer sa réactivité vis-à-vis des lymphocytes auto-réactifs. A titre d’exemple, les peptides peuvent être cyclisés, les peptides peuvent être de type rétro (les acides aminés de série L sont enchainés selon une séquence inverse de celle du peptide à reproduire), ou de type rétro-inverso (les acides aminés sont de type D au lieu de la série naturelle L et sont enchainés selon une séquence inverse de celle du peptide à reproduire). Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, la fonction carboxyle (COOH) terminale dudit peptide est remplacée par une fonction carboxamide (CONH2).
[00031] Selon un autre mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, le peptide peut être modifié de façon à faciliter sa synthèse et/ou améliorer sa stabilité, par exemple par alkylation. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, la fonction amine (NH2) terminale dudit peptide est acétylée.
[00032] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, les fonctions amine et carboxyle du peptide peuvent être sous forme du sel correspondant à l’acide ou à la base.
[00033] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, et SEQ ID NO : 30.
[00034] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48.
[00035] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48.
[00036] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8 (Collagène XVII).
[00037] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, de préférence SEQ ID NO : 38 ou SEQ ID NO : 39.
[00038] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39 et SEQ ID NO : 40 (Collagène XVII).
[00039] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 (DSG1 ).
[00040] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44 (DSG1 ).
[00041] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44 (DSG1 ).
[00042] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44 (DSG1 ).
[00043] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30 (DSG3). [00044] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48 (DSG3).
[00045] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48 (DSG3).
[00046] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48 (DSG3).
[00047] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit fragment Fc est un fragment Fc humain, notamment d’IgG, plus particulièrement d’IgGI . L’IgGI peut correspondre à n’importe quel variant allotypique, par exemple G1 m3 ou G1 m17. A titre d’exemple, le fragment Fc d’IgGI est représenté par SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32 (Fc+Qtag) ou SEQ ID NO : 33 (Fc+Qtag bis).
[00048] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit fragment Fc est de type sauvage ou muté. La ou les mutations peuvent viser à augmenter la demi-vie plasmatique, la diminuer, modifier les fonctions effectrices du fragment Fc. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, ledit fragment Fc muté comprend au moins les mutations suivantes :
- L234A et L235A (LALA), ou
- L234A, L235A et P329G (LALAPG), ou
- G236A, S239D et I332E (GASDIE), ou
- G236A, S239D, A330L et I332E (GASDALIE), ou
- S239D, H268F, S324T et I332E (SDHFSTIE ou SDH), la numérotation étant indiquée dans la séquence d’une lgG1 humaine selon l’index EU. De telles mutations sont notamment décrites dans l’article Bruhns and Jonsson, Immunol Rev. 2015 Nov;268(1 ):25-51. De préférence, lorsque la molécule hybride est utilisée en thérapie, ledit fragment Fc muté comprend au moins les mutations GASDIE, GASDALIE, ou SDH.
[00049] Selon un mode de réalisation, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit fragment Fc présente un taux de fucosylation compris entre 0% à 100% des formes glycosylées. Selon l’invention « entre 0% et 100% » représente toutes les valeurs entières comprises entre 0 et 100, i.e ; 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 et 100%. Une faible fucosylation du fragment Fc provoque une forte réponse ADCC. C’est pourquoi selon un mode de réalisation particulier, ledit fragment Fc présente un taux de fucosylation compris entre 0% à 60% des formes glycosylées, notamment 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 0%. Selon l’invention, le taux de fucosylation est défini comme la proportion moyenne de fucose portée par le fragment Fc, par rapport à la quantité maximale de fucose que peut porter un fragment Fc.
[00050] Le fragment Fc et le peptide ont chacun des extrémités N- et C-terminale. Le fragment Fc peut donc être lié via son extrémité N- ou C-terminale à l’extrémité N- ou C-terminale du peptide. Selon un mode de réalisation préféré, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ladite liaison covalente se situe entre l’extrémité C-terminale dudit fragment Fc et l’extrémité N-terminale dudit peptide, ou entre l’extrémité N-terminale dudit fragment Fc et l’extrémité N-terminale dudit peptide. Selon un mode de réalisation, lorsqu’un espaceur est présent, l’espaceur peut être lié au fragment Fc via son extrémité N- ou C-terminale. Selon un autre mode de réalisation, lorsque deux espaceurs sont présents, le premier espaceur peut être lié au fragment Fc via son extrémité N- ou C-terminale et le deuxième espaceur peut être lié au peptide via son extrémité N- ou C-terminale, notamment N- terminale. Alternativement, ladite liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide (éventuellement en présence d’un ou plusieurs espaceurs) peut être créée sur tout ou partie du fragment Fc. Selon l’invention « tout ou partie du fragment Fc » signifie que différents acides aminés constituant le fragment Fc peuvent être impliqués dans une liaison covalente avec ledit peptide.
[00051] Selon un mode de réalisation préféré, lorsqu’au moins un espaceur est présent dans ladite molécule hybride de l’invention, celui-ci permet de lier le fragment Fc à un azoture ou à un alcyne qui sera lui-même impliqué dans la liaison covalente avec ledit peptide. Selon un mode de réalisation, lorsqu’au moins un espaceur est présent dans ladite molécule hybride de l’invention, celui-ci peut également permettre de lier le peptide à un alcyne ou à un azoture qui sera lui-même impliqué dans la liaison covalente avec le fragment Fc. Selon un mode de réalisation préféré, la molécule hybride selon l’invention comprend au moins deux espaceurs : un premier espaceur qui permet de lier le fragment Fc à un azoture ou à un alcyne et un deuxième espaceur qui permet de lier le peptide à un azoture (lorsque le fragment Fc est lié à un alcyne) ou à un alcyne (lorsque le fragment Fc est lié à un azoture).
[00052] Selon un mode de réalisation selon l’invention, dans ladite molécule hybride selon l’invention, ledit fragment Fc :
- est couplé à au moins un azoture ou à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, ou
- est lié à au moins un espaceur qui est lui-même couplé à un azoture ou à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est :
- soit couplé à un azoture ou à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO,
- soit lié à un espaceur qui est lui-même couplé à un azoture ou à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, la liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide, éventuellement en présence d’un ou plusieurs espaceurs, étant créée entre l’azoture et l’alcyne.
[00053] Selon un mode de réalisation selon l’invention, dans ladite molécule hybride selon l’invention,
- le fragment Fc est couplé à au moins un azoture et ledit peptide est couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est couplé à un azoture, la liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide étant créée entre l’azoture et l’alcyne.
[00054] Selon un mode de réalisation selon l’invention, dans ladite molécule hybride selon l’invention :
- le fragment Fc est couplé à au moins un azoture et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un azoture ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un azoture, et ledit peptide est couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est couplé à un azoture ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un azoture, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un azoture, la liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide, en présence d’un ou plusieurs espaceurs, étant créée entre l’azoture et l’alcyne.
[00055] Selon l’invention, la création de la liaison covalente entre l’azoture et l’alcyne correspond à une étape dite de « chimie-click », la partie N3 de l’azoture réagissant avec un alcyne. L’azoture s’entend des sels de l'acide azothydrique HN3, ou des azotures organiques dans lesquels un des atomes d'azote est lié de façon covalente avec un atome de carbone d'un composé organique (par exemple l’azoture de méthyle CH3N3). Préférentiellement l’azoture est représenté par la formule N3. L’alcyne s’entend des molécules ayant pour formule générale CnH2n-2, et qui sont caractérisées par la présence d’au moins une triple liaison. Préférentiellement l’alcyne est un cyclooctyne, encore plus préférentiellement le dibenzocyclooctyne (DBCO).
[00056] Le fragment Fc, ledit peptide et éventuellement le(s)dit(s) espaceur(s), sont couplés à l’alcyne ou à l’azoture par toute technique de couplage moléculaire classiquement utilisée (telle qu’une conjugaison). Toute technique peut également être utilisée pour lier de façon covalente le fragment Fc à l’espaceur et/ou le peptide à l’espaceur. [00057] Plus particulièrement, une technique de conjugaison s’entend d’une conjugaison enzymatique ou d’une conjugaison chimique. Une conjugaison enzymatique s’entend par exemple d’une conjugaison à l’aide d’une transglutaminase qui catalyse la formation de liaisons covalentes entre des groupes amines libres et des résidus de glutamine ou de lysine ou encore à l’aide d’une transpeptidase telle que la sortase. Pour de plus amples informations concernant la conjugaison enzymatique, voir par exemple la demande de brevet US20160361434 ou US20170313787, ou encore la publication Ohtsuka et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume 64, 2000 - Issue 12, Comparison of Substrate Specificities of Transglutaminases Using Synthetic Peptides as Acyl donors. Le substrat de la transglutaminase est par exemple un peptide comportant un résidu glutamyl (un Qtag), tel que représenté par SEQ ID NO : 34 (LLQG). Une conjugaison chimique s’entend par exemple d’une liaison covalente entre une cystéine isolée ou participant à un pont disulfure après réduction de celui-ci et par exemple un maléimide. Un exemple d’une telle conjugaison est représenté en Figure 4. Dans cet exemple, le fragment Fc comprend un peptide Qtag et ledit fragment Fc est lié à un espaceur (lui-même couplé à un azoture), grâce à l’action de la transglutaminase qui va créer une liaison covalente entre le résidu glutamyl du Qtag et le groupe NH2 porté par l’espaceur PEGn.
[00058] Selon l’invention, le terme « couplé » ou « couplage moléculaire » s’entend de l’établissement d’une liaison covalente, ainsi le fragment Fc et/ou le peptide et/ou l’espaceur est lié de façon covalente à un alcyne ou un azoture. Le terme « lié » s’entend également d’une liaison covalente. Ainsi, à titre d’exemple, l’expression « le fragment Fc est couplé à un azoture et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un alcycne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO » peut également se lire « le fragment Fc est lié de façon covalente à un azoture et ledit peptide est lié de façon covalente à un espaceur, ledit espaceur étant lui-même lié de façon covalente à un alcycne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ».
[00059] Utilisation des molécules hybrides selon l’invention
[00060] Dans un second aspect, la présente invention concerne également une molécule hybride telle que définie précédemment, pour son utilisation comme médicament.
[00061] Plus particulièrement, selon l’invention, lesdites molécules hybrides sont destinées à cibler et à lyser dans l’organisme des patients, par ADCC et/ou phagocytose et/ou activation du complément, toutes les cellules exprimant des récepteurs lymphocytaires auto-réactifs dans le cadre d’une dermatite auto-immune : à savoir les cellules B (lymphocytes) exprimant à leur surface les BCR reconnaissant au moins un des peptides de l’invention (auto-anticorps responsables d’une dermatite auto-immune, se liant à au moins un peptide selon l’invention) et les lymphocytes T exprimant à leur surface les TCR reconnaissant au moins un des peptides selon l’invention. En effet, la molécule hybride selon l’invention se lie à ces cellules grâce au peptide : il s’agit de la cible épitopique dudit récepteur lymphocytaire auto-réactif. La molécule hybride selon l’invention se lie aussi aux cellules permettant de détruire les lymphocytes B et/ou T exprimant à leur surface les récepteurs lymphocytaires auto-réactifs impliqués dans une dermatite auto-immune grâce à son fragment Fc, ligand naturel des récepteurs Fc (par exemple Fc-gamma récepteur (FcyR) si le fragment Fc est issu d’une IgG), présents notamment à la surface des macrophages mais aussi des cellules NK (“Natural Killers").
[00062] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride, telle que définie précédemment, pour son utilisation dans le traitement d’une dermatite auto-immune, en particulier le pemphigus ou la pemphigoïde bulleuse. Selon un mode de réalisation le pemphigus s’entend plus particulièrement du pemphigus vulgaire ou foliacié.
[00063] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, pour son utilisation dans le traitement d’une pemphigoïde bulleuse.
[00064] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39 et SEQ ID NO : 40, pour son utilisation dans le traitement d’une pemphigoïde bulleuse, de préférence SEQ ID NO : 38 ou SEQ ID NO : 40.
[00065] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , pour son utilisation dans le traitement d’un pemphigus, notamment le pemphigus foliacé.
[00066] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30, pour son utilisation dans le traitement d’un pemphigus, notamment le pemphigus vulgaire.
[00067] Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48, pour son utilisation dans le traitement d’un pemphigus, notamment un pemphigus vulgaire. Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une molécule hybride telle que défini précédemment et comprenant un peptide choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48 pour son utilisation dans le traitement d’un pemphigus vulgaire.
[00068] Selon un mode de réalisation, l’invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une molécule hybride selon l’invention, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[00069] Selon l’invention « un véhicule pharmaceutiquement acceptable » s’entend de toute formulation rendant la composition apte à être administrée à un patient, sous n’importe quelle forme galénique.
[00070] La présente invention concerne également une méthode de traitement d’une dermatite auto-immune, en particulier le pemphigus ou la pemphigoïde bulleuse, comprenant l’administration d’une quantité thérapeutiquement efficace d’une molécule hybride selon l’invention.
[00071] L’invention concerne également l’utilisation d’une molécule hybride selon l’invention pour la préparation d’un médicament destiné au traitement d’une dermatite auto-immune, en particulier le pemphigus ou la pemphigoïde bulleuse.
[00072] Selon un autre mode de réalisation, la molécule hybride selon l’invention peut être couplée à au moins un radioisotope ou à au moins un fluorochrome, tels que A488 ou A647. De telles molécules peuvent avantageusement être utilisées comme outils moléculaires traceurs.
[00073] Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne ainsi l’utilisation in vitro ou ex vivo d’une molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d’anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune, au moins un espaceur étant optionnellement présent entre ledit fragment Fc et ledit peptide, comme outil moléculaire. De telles constructions peuvent notamment être utilisées pour analyser la fixation des molécules hybrides aux auto-anticorps et aux récepteurs Fc des macrophages et des cellules NK, ainsi que pour analyser la réactivité des macrophages et des cellules NK à la fixation des hybrides suivie du pontage de ceux-ci par les auto-anticorps.... Les radioisotopes et/ou fluorochromes sont de préférence couplés sur le fragment Fc, encore plus particulièrement au niveau du Qtag (si présent) ou au niveau des lysines.
[00074] Procédé de production des molécules hybrides selon l’invention
[00075] Dans un autre aspect, l’invention concerne également un procédé permettant d’obtenir une molécule hybride telle que définie précédemment. [00076] Selon un mode de réalisation, l’invention concerne ainsi un procédé de production d’une molécule hybride telle que définie précédemment, comprenant les étapes suivantes :
- (i) obtention d’un azoture couplé à un fragment Fc ou obtention d’un alcyne couplé à un fragment Fc,
- (ii) obtention d’un alcyne couplé à un peptide ou obtention d’un azoture couplé à un peptide,
- (iii) réalisation de la liaison covalente entre l’azoture et l’alcyne,
- l’étape (i) pouvant être réalisée avant ou après l’étape (ii), ou bien de façon concomitante.
[00077] Selon un mode de réalisation, l’invention concerne ainsi un procédé de production d’une molécule hybride telle que définie précédemment, comprenant les étapes suivantes :
- (i) couplage d’au moins un azoture et d’un fragment Fc, éventuellement en présence d’au moins un espaceur, ou couplage d’au moins un alcyne et d’au moins un fragment Fc, éventuellement en présence d’un espaceur,
- (ii) couplage d’un alcyne et d’un peptide, éventuellement en présence d’un espaceur, ou couplage d’un azoture et d’un peptide, éventuellement en présence d’un espaceur,
- (iii) réalisation de la liaison covalente entre l’azoture et l’alcyne,
- l’étape (i) pouvant être réalisée avant ou après l’étape (ii), ou bien de façon concomitante.
[00078] Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne ainsi un procédé de production d’une molécule hybride telle que définie précédemment, comprenant les étapes suivantes :
- (i) couplage d’au moins un azoture sur chaque monomère du fragment Fc, éventuellement en présence d’au moins un espaceur, ou couplage d’au moins un alcyne sur chaque monomère du fragment Fc, éventuellement en présence d’un espaceur,
- (ii) couplage d’un alcyne et d’un peptide, éventuellement en présence d’un espaceur, ou couplage d’un azoture et d’un peptide, éventuellement en présence d’un espaceur,
- (iii) réalisation de la ou les liaison(s) covalente(s) entre l’azoture et l’alcyne,
- l’étape (i) pouvant être réalisée avant ou après l’étape (ii), ou bien de façon concomitante.
[00079] Selon un mode de réalisation, les molécules hybrides selon l’invention peuvent également être obtenues par des méthodes de bioproduction et codées par un ADN recombinant codant le peptide selon l’invention et le fragment Fc, ledit peptide et ledit fragment Fc étant optionnellement séparés par un linker polypeptidique. Dans un tel cas, le peptide de la molécule hybride est non- modifié (e.g. non cyclisé, non rétro, non rétro-inverso), et peut-être orienté N-terminal ou C-terminal. Le peptide peut être en C-terminal ou en N-terminal du fragment Fc, l’ADNc incluant sa séquence codante nucléotidique en amont ou en aval de l’ADNc du Fc.
[00080] Les séquences de l’invention sont représentées dans le Tableau 1 ci-après.
[00081] [Tableau 1]
00082] [Tableau 1]. Tableau récapitulatif des séquences de l’invention
[00083] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées et des exemples qui illustrent l’invention et ne visent en aucun cas à la limiter.
Brève description des Figures
Fig. 1
[00084] [Fig. 1] représente le schéma d’un exemple de molécule hybride selon l’invention.
[00085] Un espaceur (qui est optionnel) est représenté entre le fragment Fc d’anticorps et le peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune (dénommé « peptide selon l’invention »).
Fig. 2
[00086] [Fig. 2] représente un lymphocyte B exprimant à sa surface des BCR/auto-anticorps transmembranaires liés à une molécule hybride selon l’invention, ladite molécule hybride étant elle- même liée par le fragment Fc à une cellule NK.
[00087] La cellule NK va ainsi pouvoir détruire le lymphocyte B par ADCC. Plus spécifiquement, cette Figure montre une cellule B (ou lymphocyte B) qui exprime à sa surface un BCR (l’auto- anticorps) qui interagit spécifiquement avec le peptide selon l’invention porté par la molécule hybride. L’engagement du fragment Fc porté par la même molécule hybride au FcyRIIIa (CD16a) exprimé à la surface d’une cellule NK va activer l’ADCC et induire la destruction spécifique du lymphocyte B. (ADCC, Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity; BCR, B-Cell Receptor; FcyR, Fc-gamma Receptor; NK cell, Natural Killer cell).
[00088] Nb : une représentation similaire pourrait être réalisée en remplaçant le lymphocyte B par un lymphocyte T, et le BCR par un TCR (T-Cell Receptor).
Fig. 3
[00089] [Fig. 3] représente un lymphocyte B exprimant à sa surface des BCR transmembranaires liés à une molécule hybride selon l’invention, ladite molécule hybride étant elle-même liée par le fragment Fc à un macrophage.
[00090] Le macrophage va ainsi pouvoir détruire le lymphocyte B par phagocytose. Plus spécifiquement, cette Figure montre des cellules B (ou lymphocytes B) qui expriment à leur surface un BCR (l’auto-anticorps sous forme membranaire) et qui interagissent spécifiquement avec des peptides selon l’invention portés par les molécules hybrides. L’engagement des fragments Fc portés par ces mêmes molécules hybrides à différents FcyRs exprimés à la surface d’un macrophage va activer l’ADCP, c’est-à-dire la phagocytose, et induire la destruction spécifique des lymphocytes B. (ADCP, Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis; BCR, B-Cell Receptor; FcyR, Fc-gamma Receptor).
[00091] Nb : une représentation similaire pourrait être réalisée en remplaçant le lymphocyte B par un lymphocyte T, et le BCR par un TCR (T-Cell Receptor).
Fig. 4
[00092] [Fig. 4] représente un procédé de fabrication d’une molécule hybride selon l’invention, comprenant le schéma de dérivation et de conjugaison des fragments Fc.
Fig. 5
[00093] [Fig. 5] représente la réactivité de 10 sérums issus de patients atteints de pemphigoïde bulleuse (PB) sur trois peptides issus de la séquence polypeptidique du collagène XVII. Les sérums issus de patients atteints de pemphigoïde bulleuse contiennent des auto-anticorps.
[00081] Ces peptides comprennent le peptide 1 EEVRKLKARVDELERIRRS (SEQ ID NO : 38) dont la séquence est incluse dans le peptide SEQ ID NO : 3, le peptide 2 RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO : 39) dont la séquence est incluse dans le peptide SEQ ID NO : 3, est en partie incluse dans le peptide SEQ ID NO : 1 , 4, 7 et inclus le peptide SEQ ID NO : 6 ; enfin le peptide 3 MDRIEKDRLQGMAP (SEQ ID NO : 40) dont la séquence est incluse dans les peptides SEQ ID NO : 1 , 3, 4 et 7 et en partie incluse dans le peptide SEQ ID NO : 1 .
[00082] L’ordonnée représente la DO mesurée à 492 nm et l’abscisse représente le sérum testé.
Les sérums PB1 à PB10 représentent les sérums collectés auprès de dix patients atteints de pemphigoïde bulleuse, les sérums PR1 et PR2 représentent les sérums de deux patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et les sérums SS1 et SS2 représentent les sérums de deux patients sains.
Fig. 6
[00083] [Fig. 6] représente la fixation sur des monocytes et macrophages humains des molécules hybrides selon l’invention
[00084] Analyse en cytométrie de flux de la fixation à la membrane des monocytes (Figure 6C) et des macrophages (Figure 6F), des 4 molécules hybrides FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Nter), FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Cter), FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Nter) et FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Cter) selon l’invention, couplées au fluorochrome Alexa Fluor (AF) 647.
[00085] FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Nter) correspond à un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui- même lié à l’extrémité Nterminale du peptide 1 EEVRKLKARVDELERIRRS (SEQ ID NO : 38).
[00086] FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Cter) correspond à un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui- même lié à l’extrémité Cterminale du peptide 1 EEVRKLKARVDELERIRRS (SEQ ID NO : 38).
[00087] FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Nter) correspond à un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui- même lié à l’extrémité Nterminale du peptide 2 RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO : 39).
[00088] FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Cter) correspond à un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui- même lié à l’extrémité Cterminale du peptide 2 RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO : 39).
[00089] En A, la Figure montre un diagramme de cytométrie de flux représentant sous forme de nuage de points (« density plot »), les monocytes non marqués (NM). En B, la Figure montre un résultat représentatif du marquage des monocytes par un anticorps anti-CD11 b (AC BV421 ), les monocytes ayant également fixé la molécule hybride FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Nter) couplée à l’AF647. En C, la Figure montre sous forme d’histogrammes, les profils de fixation des 4 molécules hybrides à la surface des monocytes, ainsi que celui du contrôle isotypique couplé à TAF647 et celui des monocytes non marqués (NM). En D, la Figure montre un diagramme de cytométrie de flux représentant sous forme de nuage de points (« density plot »), les macrophages non marqués (NM). En E la Figure montre un résultat représentatif du marquage de macrophages par un anticorps anti- CD1 1b (par exemple l’anticorps BV421 ), les macrophages ayant également fixé la molécule hybride FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Nter) couplée à l’AF647. En F, la Figure montre sous forme d’histogrammes, les profils de fixation des 4 molécules hybrides à la surface des macrophages ainsi que celui du contrôle isotypique couplé à l’AF647 et celui des macrophages non marqués (NM).
Fig. 7
[00090] [Fig. 7] représente la réactivité de 4 sérums issus de patients atteints de pemphigus vulgaire (PV) sur 5 peptides immuno-dominants issus de la desmogléine 1 (DSG-1 ). Les sérums des patients atteints de pemphigus vulgaire contiennent des auto-anticorps.
[00091] Les peptides issus de la desmogléine 1 comprennent le peptide 1 YRISGVGIDQPPYGIFVINQKTGEIN (SEQ ID NO : 41 ), séquence comprise dans celle de SEQ ID NO : 36 et qui comprend le peptide SEQ ID NO : 12 et le peptide SEQ ID NO : 13 ; le peptide 2 : RALNSMGQDLERPLELRVRVLDIN (SEQ ID NO : 42), séquence comprise dans celle de SEQ ID NO : 36 et qui comprend le peptide SEQ ID NO : 10 et le peptide SEQ ID NO : 21 ; le peptide 3 : FKIIRQEPSDSPMFIINRNTGEIRT (SEQ ID NO : 43), séquence comprise dans celle de SEQ ID NO :
36 et qui comprend le peptide SEQ ID NO : 11 , 14 et 15 ; le peptide 4 : NERTNVGILKVVKPLDYE (SEQ ID NO : 44), séquence comprise dans celle de SEQ ID NO : 36 et qui comprends le peptide SEQ ID NO : 9 le peptide 5 : ALNSMGQDLERPLELR (SEQ ID NO : 10) séquence comprise dans celle de SEQ ID NO : 36.
[00092] L’ordonnée représente la DO mesurée à 492 nm et l’abscisse représente le sérum testé. Les sérums PV1 à PV4 représentent les sérums collectés auprès de quatre patients atteints de pemphigus vulgaire.
Fig. 8
[00093] [Fig. 8] représente la réactivité de 4 sérums issus de patients atteints de pemphigus vulgaire (PV) sur 5 peptides immuno-dominants issus de la desmogléine 3 (DSG-3). Les sérums des patients atteints de pemphigus vulgaire contiennent des auto-anticorps.
[00094]
[00095] Les peptides issus de la desmogléine 3 comprennent : le peptide 1 INVREGIAFRPASKTFTVQKGISSKK (SEQ ID NO : 45), correspondant à un assemblage recouvrant des séquences INVREGIAFRPASKT SEQ ID NO : 27 et PASKTFTVQKGISSK SEQ ID NO : 28 et à la séquence comprise dans celle de SEQ ID NO : 37 ; le peptide 2 : REGEDNSKRNPIAKITSDYQ (SEQ ID NO : 46) : séquence comprise dans celle de SEQ ID NO : 27 et dans celle de SEQ ID NO :
37 ; le peptide 3 : GTSYPTTSPGTRYGRPHSG (SEQ ID NO : 47) : séquence comprise dans celle de SEQ ID NO : 24 et dans celle de SEQ ID NO : 37 ; le peptide 4 : KVVKALDYEQLQSVK (SEQ ID NO : 26), séquence comprise dans celle de SEQ ID NO : 37 et le peptide 5 : KFVKNMNRDSTFIVNK (SEQ ID NO : 48) : incluant le peptide SEQ ID NO : 29) : et séquence comprise dans celle du peptide SEQ ID NO : 37. [00096] L’ordonnée représente la DO mesurée à 492 nm et l’abscisse représente le sérum testé. Les sérums PV1 à PV4 représentent les sérums collectés auprès de quatre patients atteints de pemphigus vulgaire.
[00097] Exemples
[00098] Exemple 1 : Exemple de production d’une molécule hybride selon l’invention
[00099] La molécule hybride ici décrite comprend la construction suivante : un fragment Fc lié de façon covalente à au moins un espaceur PEGn, lui-même couplé à un azoture, ledit azoture étant lié de façon covalente à un alcyne, qui est lui-même couplé à un espaceur PEGn lié à un peptide selon l’invention. Une telle molécule peut se lire : Fc-PEGn-Ns-DBCO-PEGn-peptide. Les deux PEGn peuvent être identiques ou bien différents (par exemple le premier PEGn est PEG3 et le deuxième PEGn est PEG2).
[000100] 1. Synthèse d’un NH2-PEGn-N3 (i.e. un espaceur couplé à un azoture à une extrémité et possédant une fonction amine libre à une autre extrémité).
[000101] 2. Mise en présence du NFh-PEGn-Ns, avec un fragment Fc possédant un Qtag, et une transglutaminase, de préférence pendant 16h à 37°C. Cette étape dite « de dérivation » est par exemple réalisée avec 20 fois plus de moles de NFL-PEGn-Ns que de moles de fragment Fc. La transglutaminase est utilisée, par exemple à hauteur de 15U/pmol par Qtag présent (sur un ou sur les deux monomères). Eventuellement un dessalage peut être réalisé pour retirer l’excédent d’espaceur non lié au fragment Fc à l’issue de l’étape. Un Fc-PEGn-Ns est ainsi obtenu. Si le fragment Fc comporte 2Qtag (un porté sur chaque monomère), alors le fragment Fc peut porter deux PEGn-N3.
[000102] 3. Synthèse d’un Cys-PEGn-peptide (i.e. un espaceur lié à un peptide à une extrémité et possédant une cystéine libre à une autre extrémité). Un alcyne, par exemple un DBCO est ensuite couplé au Cys-PEGn-peptide au niveau de la cystéine, et un DBCO-PEGn-peptide est ainsi obtenu.
[000103] 4. Réalisation du « click » : couplage entre le N3 et le DBCO. Le DBCO-PEGn-peptide est mis en présence du Fc-PEGn-Ns avec, de préférence, 11 fois plus de moles de DBCO-PEGn-peptide que de moles de Fc-PEGn-Ns. La réaction du click se déroule notamment à température ambiante et est presque complète au bout de 4h.
[000104] 5. Obtention de la molécule hybride : Fc-PEGn-Ns-DBCO-PEGn-peptide. Ce mode de réalisation est illustré en Figure 4.
[000105] De façon similaire un Fc-PEGn-DBCO et un Ns-PEGn-peptide peuvent être obtenus, puis couplés pour obtenir Fc-PEGn-DBCO-Ns-PEGn-peptide. [000106] De façon similaire un Fc-PEGn-DBCO et un Ns-peptide peuvent être obtenus, ou un Fc- PEGn-Ns et un DBCO-peptide, puis couplés pour obtenir respectivement Fc-PEGn-DBCO-Ns- peptide ou Fc-PEGn-Ns-DBCO-peptide.
[0001071 Exemple 2 : Réactivité de sérums de patients atteints de dermatites auto-immunes vis-à-vis des molécules hybrides selon l’invention
[000108] Les sérums utilisés sont des sérums de patients atteints de dermatite auto-immune, plus particulièrement de pemphigus ou de pemphigoïde bulleuse, qui contiennent des auto-anticorps spécifiques.
[000109] Des puits de plaque de microtitration ELISA ont été revêtus par adsorption passive à l’aide de 100 pL d’une solution contenant soit un peptide choisi parmi SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30, soit une combinaison d’au moins deux peptides liés de façon covalente, soit une molécule hybride selon l’invention, dont le fragment Fc est sauvage (WT) ou le fragment Fc comprend la mutation GASDIE. Une telle molécule hybride est par exemple « FcWT-PEG-SEQ ID NO : 1-30 », « FcLALAPG-PEG-SEQ ID NO : 1-30 » ou « FcGASDIE-PEG-SEQ ID NO : 1-30 ». « FcWT-PEG-SEQ ID NO : 1-30 » représente un fragment Fc de type sauvage qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui- même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui-même lié à un peptide représenté par l’une quelconque des SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 30, « FcWT-LALAPG-SEQ ID NO : 1-30 » représente un fragment Fc comprenant les mutations L234A, L235A et P329G qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui- même lié à un peptide représenté par l’une quelconque des SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 30, et « FcGASDIE-PEG-SEQ ID NO : 1-30 » représente un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui-même lié à un peptide représenté par l’une quelconque des SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 30. Dans les constructions, n représente un nombre entre 1 et 10 lorsqu’un espaceur PEGn est utilisé, de préférence 1 , 2, 3, 4 ou 8. La molécule hybride peut contenir un ou une combinaison d’au moins 2 peptides liés de façon covalente.
[000110] Ces solutions ont été utilisées chacune à la concentration de 5 pg/mL en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) et incubées pendant une nuit à 4°C. Les peptides choisis et les molécules hybrides construites avec lesdits peptides synthétisés en séquence aléatoire (scramble) ont été utilisés à la même concentration comme contrôles négatifs. Après lavage en PBS Tween 0.05% les puits ont ensuite été saturés par du lait à 5%, pendant 1 h à température ambiante. Après lavages, les sérums ont été incubés en dilution sérielle en tampon PBS + lait 5% pendant 1 h à température ambiante. Après lavages, la réactivité des sérums a été détectée à l’aide d’un anticorps de détection anti-Fab d’IgG humaines couplé HRP dilué au 1/2500 en tampon PBS 5% lait incubé également 1 h à température ambiante. Après lavage, la présence d’auto-anticorps reconnus par la molécule hybride est révélée par ajout de TMB et arrêt de la réaction enzymatique par ajout d’H2SO4 et une lecture au spectrophotomètre à 450nm.
[000111] Les résultats sont exprimés en A DO (Delta-Densité Optique), correspondant à la DO obtenue avec un hybride peptide scramble ou avec la molécule hybride construite avec ledit peptide.
[000112] Les résultats montrent une réactivité dose-dépendante des sérums sur les peptides vis-à- vis des molécules hybrides. Ils montrent qu’inclus dans les différents hybrides, les peptides restent parfaitement réactifs aux sérums comprenant les auto-anticorps.
[0001131 Exemple 3 : Cinétique de fixation des molécules hybrides sur macrophages, à température physiologique
[000114] Des macrophages humains, différenciés in vitro en présence de M-CSF (100 ng/mL) à partir de monocytes CD14+ isolés du sang périphérique d’un sujet sain ont été incubés à 500.000 cellules/puits, en présence de molécules hybrides à 5 pg/MI. Les molécules hybrides sont par exemple celles décrites dans [Exemple 2.
[000115] Les molécules hybrides sont incubées pendant 2h, 8h 16h, 24h et 48h à 37°C. La fixation des molécules hybrides à la surface des macrophages est mise en évidence et quantifiée par cytofluorimétrie (FACS Canto II) après incubation des macrophages avec un anticorps anti-Fc couplé au FITC, utilisé 1/1000.
[000116] « NM » et « ANTI FC » représentent respectivement le puits contenant les macrophages incubés sans anticorps ou avec l’anticorps anti-Fc seul. « Wt », « LALAPG » et « GASDIE » représentent respectivement le puits contenant la molécule hybride avec le fragment Fc sauvage ou avec la mutation LALAPG ou avec la mutation GASDIE.
[000117] Les résultats montrent que les molécules hybrides à la température physiologique de 37°C, se fixent à la membrane des macrophages. Ces résultats montrent également que la fixation de l’hybride comprenant un fragment Fc comprenant la mutation GASDIE est supérieure à celle de la forme sauvage. [0001181 Exemple 4 : Phagocytose induite par l’hybride Fc-WT ou l’hybride Fc-GASDIE lorsqu’on arme les lymphocytes B via leurs FcyRIIb (CD32b) en présence des sérums
[000119] Des lymphocytes B humains fraîchement purifiés à partir de sang périphérique de donneurs sains par tri magnétique CD19+, ont été marqués au PKH-67 vert (Paul Karl Horan / marqueur lipidique fluorescent) puis incubés avec des sérums de patients atteints de dermatite autoimmune à une concentration de 5 pg/mL durant 30 à 60min à 37°C. Par la suite, les cellules ont été lavées puis mises en présence de l’hybride selon l’invention comprenant un fragment Fc sauvage (Wt) ou comprenant les mutations GASDIE. Les molécules hybrides sont par exemple celles décrites dans [Exemple 2. Les cellules ont été mises en présence des hybrides à 10 pg/mL durant 30 à 60min à 37°C. Après lavage, les cellules ont été mises au contact des macrophages (marqués PKH- 26 rouge), à raison de 1 lymphocyte B pour 1 macrophage, durant 2h à 37°C. Les cellules ont ensuite été décollées puis analysées par cytométrie en flux. Les cellules présentant la double fluorescence (PKH-67 vert/PKH-26 rouge) correspondent aux macrophages qui ont phagocyté des lymphocytes. Les différentes populations cellulaires sont exprimées en pourcentage de la population cellulaire totale : pourcentage de phagocytose et pourcentage de lymphocytes B.
[000120] Les résultats obtenus confirment que l’activité de phagocytose est majorée en présence des hybrides (augmentation de la phagocytose associée à une diminution de la population de lymphocytes B). En effet, une augmentation significative du pourcentage de phagocytose, toujours associée à une diminution significative de la population de lymphocytes B, a été observée lorsque les lymphocytes B étaient recouverts de l’hybride.
[000121] Exemple 5 : Stabilité de la fixation des Fc-GASDIE A488 et des hybrides Fc-GASDIE peptide, sur des cellules NK après 30min, 24h et 48h, à température physiologique
[000122] Les cellules NK ont été incubées 30min, 24h ou 48h à 37°C en présence de FcGASDIE- N3-DBCO-A488 (un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un DBCO, la molécule étant marquée avec le fluorochrome A488) ou de FcGASDIE-N3-DBCO-PEG3-peptide- lysineA488 (un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un DBCO qui est couplé à espaceur PEGn lié à un peptide selon l’invention (représentée par l’une quelconque des SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 30) la molécule étant marquée avec le fluorochrome A488 qui est liée à la molécule via une lysine). La fixation de ces 2 sondes fluorescentes aux cellules NK a été analysée par cytofluorimétrie. Dans les constructions, n représente un nombre entre 1 et 10 lorsqu’un espaceur PEGn est utilisé, de préférence 1 , 2, 3, 4 ou 8.
[000123] Les résultats sont présentés à 30 minutes, à 24 heures et à 48 heures. NM représente les cellules NK non marquées, sans anticorps. [0001241 Exemple 6 : Réactivité de 10 sérums de patients atteints de pemphigoïde bulleuse (PB) vis-à-vis de 3 peptides immunodominants issus de la séquence polypeptidique du collagène XVII
[000125] Des puits de plaque ELISA ont été revêtus à l’aide de 100 pL d’une solution contenant le peptide EEVRKLKARVDELERIRRS (représenté par SEQ ID NO : 38, séquence comprise dans le peptide SEQ ID NO : 3, également dénommé peptide 1 ) ou le peptide RIRRSILPYGDSMDRIEK (représenté par SEQ ID NO : 39, séquence comprise dans le peptide SEQ ID NO : 3, est en partie incluse dans le peptide SEQ ID NO : 1 , 4, 7 et inclus dans le peptide SEQ ID NO : 6, également dénommé peptide 2) ou encore le peptide MDRIEKDRLQGMAP (représenté par SEQ ID NO : 40, séquence comprise dans les peptides SEQ ID NO : 1 , 3, 4 et 7 et en partie incluse dans le peptide SEQ ID NO : 1 , également dénommé peptide 3), à la concentration de 10 pg/mL en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) 0,15M NaCI, incubée pendant une nuit à 4°C.
[000126] Une saturation des puits a ensuite été réalisée par la BSA (Bovine Serum Albumin) à 2% en tampon PBS 0,15M NaCI pendant 1 h à 4°C. Après lavages, les 10 sérums de patients PB, 2 sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (nommés PR1 et PR2) et 2 sérums issus de sujets sains (nommés SS1 et SS2) ont été incubés dilués 1/100 en tampon PBS 2% BSA 2M NaCI pendant 1 h à 4°C. Après lavages, la réactivité des sérums a été détectée à l’aide d’un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG humaines couplé à la peroxydase (HRP : Horse Radish Peroxidase) dilué au 1/2500 en tampon PBS 2% BSA. Les résultats sont exprimés en DO (Densité Optique), lue à 492 nm. La ligne horizontale représente le seuil de significativité.
[000127] Les résultats présentés en Figure 5 montrent que 7 des 10 sérums de patients atteints de PB présentent une réactivité significative d’intensité très variable vis-à-vis du peptide 2, trois d’entre eux présentant une très forte réactivité, alors que 5 des 10 présentent des réactivités significatives mais plus faibles vis-à-vis du peptide 1 et que seulement 2 sur 10 présentent une très faible réactivité vis-à-vis du peptide 3. Il existe une hétérogénéité importante de réactivité interindividuelle et pour un patient donné une hétérogénéité de réactivité vis-à-vis des 3 peptides. Comme attendu, les sérums utilisés comme contrôles (PR1 , PR2, SS1 et SS2) ne présentent pas de réactivités significatives vis- à-vis des peptides testés, à l’exception d’une faible réactivité de l’un des patients atteint de polyarthrite rhumatoïde vis-à-vis du peptide 3.
[0001281 Exemple 7 : Fixation sur les monocytes et macrophages humains des molécules hybrides selon l’invention
[000129] Des monocytes CD14+ isolés du sang périphérique d’un sujet sain et des macrophages, différenciés in vitro en présence de M-CSF (100ng/mL) à partir de ces mêmes monocytes, ont été incubés à 100.000 cellules/puits pendant 1 h à 37°C, en présence de molécules hybrides suivantes à 10pg/mL : FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Nter) (un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui-même lié à l’extrémité Nterminale du peptide 1 EEVRKLKARVDELERIRRS (SEQ ID NO : 38)),
FcGASDIE- DBCO-peptide 1(Cter) (un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui-même lié à l’extrémité Cterminale du peptide 1 EEVRKLKARVDELERIRRS (SEQ ID NO :
38)),
FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Nter) (un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui-même lié à l’extrémité Nterminale du peptide 2 RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO :
39)),
FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Cter) (un fragment Fc comprenant les mutations G236A, S239D et I332E, qui est lié à au moins un espaceur PEGn qui est lui-même couplé à un azoture lié de façon covalente à un cyclooctyne DBCO couplé à un espaceur PEGn qui est lui-même lié à l’extrémité Cterminale du peptide 2 RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO : 39)).
[000130] Ces 4 molécules hybrides selon l’invention, FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Nter), FcGASDIE-DBCO-peptide 1(Cter), FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Nter), FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Cter), ont été marquées avec un fluorochrome Alexa Fluor 647 (Kit « Lightning link » ; Abeam). La fixation des molécules hybrides marquées au fluorochrome AF647 à la surface des monocytes et macrophages est mise en évidence par cytofluorimétrie (FACS Canto II). Plus de 10.000 évènements ont été analysés par condition. Les conditions « NM » et « contrôle isotypique AF647 » représentent respectivement les puits contenant des monocytes ou des macrophages incubés sans anticorps ou avec un anticorps non spécifique correspondant à un contrôle isotypique couplé au fluorochrome Alexa Fluor (AF) 647. Le marquage CD11 b-BV421 permet de mettre en évidence les monocytes et les macrophages.
[000131] Les résultats présentés dans la Figure 6 et dans le Tableau 2 ci-dessous, montrent qu’à la température physiologique de 37°C les quatre molécules hybrides selon l’invention, se fixent dès la 1ère heure à la membrane des monocytes et macrophages. Plus de 90% des monocytes et plus de 55% des macrophages fixent les molécules hybrides. Pour chaque molécule hybride, l’hétérogénéité de marquage à la surface des macrophages est plus importante que celle observée à la surface des monocytes. On note que la molécule hybride FcGASDIE-DBCO-peptide 2(Cter) présente un marquage plus intense que celui des 3 autres molécules hybrides (déplacement de l’histogramme vers les hautes valeurs).
[000132] [Tableau 2]. Résultats de fixation à 37°C des molécules hybrides à la surface des monocytes et macrophages. MFI : Intensité Moyenne de Fluorescence ; Ratio : rapport entre la MFI obtenue avec chaque molécule hybride sur celle obtenue avec le contrôle isotypique.
[000133] Exemple 8 : Réactivité de 4 sérums de patients atteints de pemphigus vulgaire (PV) vis-à-vis de 5 peptides immuno-dominants issus de la DSG-1
[000134] Des puits de plaque ELISA ont été revêtus à l’aide de 100 pL d’une solution contenant un peptide issu de la desmogléine 1 :
- le peptide 1 : YRISGVGIDQPPYGIFVINQKTGEIN (SEQ ID NO : 41 ), ou
- le peptide 2 : RALNSMGQDLERPLELRVRVLDIN (SEQ ID NO : 42), ou
- le peptide 3 : FKIIRQEPSDSPMFIINRNTGEIRT (SEQ ID NO : 43), ou
- le peptide 4 : NERTNVGILKWKPLDYE (SEQ ID NO : 44), ou
- le peptide 5 : ALNSMGQDLERPLELR (SEQ ID NO : 10), ou d’un peptide contrôle issu du collagène XVII :
- le peptide 1 : EEVRKLKARVDELERIRRS (SEQ ID NO : 38, également dénommé peptide PB1 dans la Figure 7), ou
- le peptide 2 : RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO : 39, également dénommé peptide PB2 dans la Figure 7).
[000135] Les peptides sont incubés à la concentration de 10 pg/mL en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) 0.15M NaCI, pendant une nuit à 4°C.
[000136] Une saturation des puits a ensuite été réalisée par la BSA (Bovine Serum Albumin) à 2% en tampon PBS 0.15M NaCI pendant 1 h à 4°C. Après lavages, les 4 sérums de patients Pg ont été incubés dilués 1/100 en tampon PBS 2% BSA 2M NaCI pendant 1 h à 4°C. Après lavages, la réactivité des sérums a été détectée à l’aide d’un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG humaines couplé à la peroxydase (HRP : Horse Radish Peroxidase) dilué au 1/2500 en tampon PBS 2% BSA. Les résultats sont exprimés en DO (Densité Optique), lue à 492 nm. La ligne horizontale représente le seuil de significativité. [000137] Les résultats présentés en Figure 7 montrent que seul le sérums PV3 montre une faible réactivité vis-à-vis du peptide 1 et du peptide 2, que seul le sérum PV1 présente une nette réactivité vis-à-vis du peptide 3, que seul le sérum PV5 reconnaît le peptide 4, très fortement, et le peptide 5, significativement. Comme attendu, aucun des 4 sérums ne reconnaît significativement les 2 peptides PB1 et PB2, cibles des auto-anticorps associés à la pemphigoïde bulleuse.
[000138] Exemple 9 : Réactivité de 4 sérums de patients atteints de pemphigus vulgaire (PV) vis-à-vis de 5 peptides immuno-dominants issus de la DSG-3
[000139] Des puits de plaque ELISA ont été revêtus à l’aide de 100 pL d’une solution contenant un peptide issu de la desmogléine 3 :
- le peptide 1 : INVREGIAFRPASKTFTVQKGISSKK (SEQ ID NO : 45) ;
- le peptide 2 : REGEDNSKRNPIAKITSDYQ (SEQ ID NO : 46) ;
- le peptide 3 : GTSYPTTSPGTRYGRPHSG (SEQ ID NO : 47) ;
- le peptide 4 : KVVKALDYEQLQSVK (SEQ ID NO : 26), et
- le peptide 5 : KFVKNMNRDSTFIVNK (SEQ ID NO : 48), ou d’un peptide contrôle issu du collagène XVII :
- le peptide 1 EEVRKLKARVDELERIRRS (SEQ ID NO : 38, également dénommé peptide PB1 dans la Figure 8), ou
- le peptide 2 RIRRSILPYGDSMDRIEK (SEQ ID NO : 39, également dénommé peptide PB2 dans la Figure 8).
[000140] Les peptides sont incubés à la concentration de 10 pg/mL en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) 0.15M NaCI, pendant une nuit à 4°C.
[000141] Une saturation des puits a ensuite été réalisée par la BSA (Bovine Serum Albumin) à 2% en tampon PBS 0.15M NaCI pendant 1 h à 4°C. Après lavages, les 4 sérums de patients Pg ont été incubés dilués 1/100 en tampon PBS 2% BSA 2M NaCI pendant 1 h à 4°C. Après lavages, la réactivité des sérums a été détectée à l’aide d’un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG humaines couplé à la peroxydase (HRP : Horse Radish Peroxidase) dilué au 1/2500 en tampon PBS 2% BSA. Les résultats sont exprimés en DO (Densité Optique), lue à 492 nm. La ligne horizontale représente le seuil de significativité.
[000142] Les résultats présentés en Figure 8 montrent que seuls les sérums PV3 et PV4 montrent une faible réactivité vis-à-vis du peptide 1 et du peptide 2, que seuls les sérums PV2, PV3 et PV4 présentent une nette réactivité vis-à-vis du peptide 3, qu’aucun des sérums ne reconnaît le peptide 4, enfin que seul le sérum PV4 reconnaît nettement le peptide 5. Comme attendu, aucun des 4 sérums ne reconnaît significativement les 2 peptides PB1 et PB2, cibles des auto-anticorps associés à la pemphigoïde bulleuse.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Molécule hybride comprenant au moins un fragment Fc d’anticorps lié de façon covalente à au moins un peptide se liant à un lymphocyte auto-réactif impliqué dans une dermatite auto-immune, au moins un espaceur étant optionnellement présent entre ledit fragment Fc et ledit peptide.
[Revendication 2] Molécule hybride selon la revendication précédente, dans laquelle ledit peptide comprend tout ou partie de la séquence de la desmogléine 1 , de la desmogléine 3, et/ou du collagène de type XVII, notamment la chaine a-1 du collagène de type XVII.
[Revendication 3] Molécule hybride selon la revendication précédente, dans laquelle la séquence de la desmogléine 1 , de la desmogléine 3, ou du collagène de type XVII est d’origine humaine.
[Revendication 4] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit espaceur est un polymère contenant un ou plusieurs motifs de répétition contenant le groupe éther, ledit espaceur étant de préférence le polyéthylène glycol de formule PEGn, dans laquelle n représente un nombre entier compris entre 1 et 100, préférentiellement entre 1 et 10 et notamment 1 , 2, 3, 4 ou 8.
[Revendication 5] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit peptide est choisi dans le groupe constitué par : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48.
[Revendication 6] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit fragment Fc est un fragment Fc humain, notamment d’IgG, plus particulièrement d’IgGI .
[Revendication 7] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit fragment Fc est de type sauvage ou muté, ledit fragment Fc muté comprenant de préférence au moins les mutations suivantes :
- L234A et L235A, ou
- L234A, L235A et P329G, ou
- G236A, S239D et I332E, ou
- G236A, S239D, A330L et I332E, ou
- S239D, H268F, S324T et I332E, la numérotation étant indiquée dans la séquence d’une IgG 1 humaine selon l’index EU.
[Revendication 8] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle :
- le fragment Fc est couplé à au moins un azoture et ledit peptide est couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est couplé à un azoture, ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un azoture et ledit peptide est lié à un espaceur lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est couplé à au moins un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est lié à un espaceur lui-même couplé à un azoture ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un azoture, et ledit peptide est couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est couplé à un azoture ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un azoture, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO ou
- le fragment Fc est lié à au moins un espaceur, lui-même couplé à un alcyne, tel qu’un cyclooctyne, et en particulier le DBCO, et ledit peptide est lié à un espaceur, lui-même couplé à un azoture, la liaison covalente entre ledit fragment Fc et ledit peptide, éventuellement en présence d’un ou plusieurs espaceurs, étant créée entre l’azoture et l’alcyne.
[Revendication 9] Molécule hybride selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation comme médicament, notamment pour son utilisation dans le traitement d’une dermatite auto-immune, en particulier le pemphigus vulgaire ou la pemphigoïde bulleuse.
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