EP4499854A1 - Verfahren zur herstellung von l-cysteinsäure und dessen verwendung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von l-cysteinsäure und dessen verwendung

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EP4499854A1
EP4499854A1 EP22732467.0A EP22732467A EP4499854A1 EP 4499854 A1 EP4499854 A1 EP 4499854A1 EP 22732467 A EP22732467 A EP 22732467A EP 4499854 A1 EP4499854 A1 EP 4499854A1
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EP
European Patent Office
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enzyme
ops
gene
cysteic acid
serb
Prior art date
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Pending
Application number
EP22732467.0A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Günter Wich
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Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01076—Cysteate synthase (2.5.1.76)
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    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03003—Phosphoserine phosphatase (3.1.3.3)
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    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01029—Sulfinoalanine decarboxylase (4.1.1.29)

Definitions

  • the invention relates to a process for producing L-cysteic acid comprising the reaction of O-phospho-L-serine (OPS) with a salt of sulfurous acid (sulfite) and an enzyme class EC 2.5 .1.76 counting cysteate synthase (CS enzyme) in a biotransformation.
  • OPS O-phospho-L-serine
  • CS enzyme an enzyme class EC 2.5 .1.76 counting cysteate synthase
  • the L-cysteic acid produced according to the invention can be decarboxylated to taurine.
  • the invention further relates to the use of the L-cysteic acid produced for the production of taurine.
  • L-cysteic acid ((R)-2-amino-3-sulfopropionic acid, 3-sulfo-L-alanine, CAS 498-40-8) is a non-proteinogenic L-amino acid that occurs in nature as an oxidation product of the proteinogenic amino acid L -Cysteine, e.g. can be detected in sheep's wool. Cysteic acid is also an intermediate product of the coenzyme M biosynthesis (CoM, 2-mercaptoethanesulfonic acid, CAS 3375-50-6) of methanogenic archaebacteria.
  • CoM coenzyme M biosynthesis
  • OPS O-phospho-L-serine
  • CS enzyme cysteate synthase
  • (2009) 424: 467-478 describe that a gene related to threonine synthases from Methanoscarcina acetivorans, which is produced recombinantly in E. coli and is enriched as an enzymatically inactive protein in so-called inclusion bodies (protein aggregates as inclusion bodies), has detectable enzyme activity can only be measured after extensive renaturation of the inclusion bodies. After renaturation it was proven that in analytical tests (HPLC and mass spectroscopy) with the Renatured protein L-cysteic acid is formed from the reaction of commercially available (chemically synthesized) OPS and sulfite according to equation (1). With these studies, the activity of a cysteate synthase was assigned to the renatured protein from M.
  • L-cysteic acid can be produced chemically, for example by oxidation of cysteine with chlorine in alcoholic solution, with bromine in HCl or iodo-HCl in DMSO or by oxidative cleavage of cystine. Furthermore, L-cysteine acid can also be produced by oxidation of L-cysteine sulfinic acid.
  • the known processes for the chemical production of L-cysteic acid which are not considered sustainable, use chemicals that are harmful to the environment and have low consumer acceptance, especially for applications in the food, cosmetics and pharmaceutical sectors.
  • L-cysteic acid can be used, for example, in fish farming or in the cosmetics sector, for example as an ingredient in Regu®-Slim (DSM) for skin care.
  • DSM Regu®-Slim
  • L-cysteic acid is used as a water-soluble protecting group.
  • L-cysteic acid can also be converted to taurine through decarboxylation.
  • Graham et al. 2009, see above has shown that in E. coli the CS enzyme with a molecular weight of 44 kDa is not produced in active form when expressed heterologously, but is only enriched in inactive form in inclusion bodies. The solubilization of the inclusion bodies and refolding to the active enzyme led to a very low yield of 3 mg of refolded protein per L E.
  • EP 2444 481 B1 from CJ CheilJedang Corporation describes a process for producing L-cysteine, whereby a strain with reduced SerB activity is used to produce OPS, which is then converted into L-cysteine in an enzymatically catalyzed reaction with sulfide or thiosulphate. Cysteine is converted.
  • the enzyme class used here O-phosphoserine sulfhydrylases (OPSS, EC 2.5.1.65), is not known to also produce sulfite as a CS enzyme can utilize substrate.
  • OPSS O-phosphoserine sulfhydrylases
  • the OPS could then be used in a biotransformation with OPSS enzymes to produce cysteine.
  • the state of the art knows the biotechnological production of OPS.
  • the prior art does not offer a production process for the CS enzyme that would be suitable for providing CS enzyme with sufficient activity for a previously unknown industrially applicable process of biotransformation of OPS with a sulfite, in which L-cysteic acid in the preparative Scale is produced for further use.
  • the aim of the invention was a biotechnological process for the production of L-cysteic acid by biotransformation, which is suitable for use on an industrial scale.
  • the object of the present invention was, instead of a chemical process and bypassing one through Metabolic Engineering produced L-cysteic acid production strain to provide an industrially applicable process for the cost-effective production of L-cysteic acid through biotransformation of OPS and to use the L-cysteic acid produced in this way for further use, for example for the production of taurine.
  • a process for the production of L-cysteic acid comprising the reaction of O-phospho-L-serine (OPS) with a salt of sulfurous acid (sulfite) and a cysteate synthase (CS enzyme) belonging to the enzyme class EC 2.5.1.76 ) in a biotransformation.
  • OPS O-phospho-L-serine
  • CS enzyme cysteate synthase
  • manufacturing processes are differentiated as follows: 1. Chemical processes 2.
  • new or modified enzymes can be introduced into an organism or genes of endogenous enzymes can be expressed in an increased or weakened manner, thereby establishing new metabolic pathways in an organism or strengthening or weakening existing metabolic pathways.
  • the aim of metabolic engineering is for the organism to either produce a new metabolite or to produce a cell's own metabolite with increased yield.
  • no starting materials specific for the metabolite such as an enzyme substrate, such as OPS in the present invention, are used, but only a nutrient medium which is necessary for the growth of the organism in question and is composed of a C source (e.g. glucose), an N source (e.g.
  • Biotransformation is defined as the conversion of one or more starting materials into a product using enzymatic catalysis, whereby the enzyme substrate is added to a reaction mixture with the enzyme.
  • the added enzyme substrate as in the present invention OPS, is enzymatically converted, in the present invention by an enzyme selected from the class of cysteate synthases (CS enzyme, EC 2.5.1.76) in the presence of a salt of the sulfurous acid.
  • CS enzyme cysteate synthases
  • the educt or educts can come from chemical or biotechnological production.
  • the OPS used in the process according to the invention can come, for example, from chemical synthesis or from biotechnological production by cultivating a production strain.
  • the enzyme used for enzymatic catalysis preferably comes from biotechnological production through fermentation of a production strain from the Enterobacteriaceae family that heterologously expresses the CS enzyme.
  • An advantage of the present invention is that the process according to the invention for producing L-cysteic acid from OPS and sulfite using the CS enzyme is a biotransformation process. This means that this represents a very targeted, specific reaction and does not require, for example, any complex culture steps or purification steps from a microorganism culture.
  • the reaction (1) according to the invention is catalyzed by the enzyme cysteate synthase (CS enzyme), which belongs to the enzyme class EC 2.5.1.76.
  • CS enzyme cysteate synthase
  • a CS enzyme in enzymatically active form is a protein that is capable of catalyzing the synthesis of L-cysteic acid from OPS and a salt of sulfurous acid as described in the following CS enzyme activity test.
  • the CS enzyme activity test can be carried out as follows: i) A CS enzyme produced by cultivation in a shake flask or in a fermentation can be used in the reaction as follows: - as an aliquot from the culture broth that has not been further processed or - as a Aliquot of the cell suspension after re-isolation of the cells from the culture broth, e.g. by centrifugation or - in the form of an aliquot of the cell homogenate a) after mechanical disruption of the cell suspension or b) in the form of chemically permeabilized cells (e.g. by chloroform) or - as a cell extract after separation of particulate components from the cell homogenate or - as, for example, a chromatographically purified enzyme.
  • a CS enzyme produced by cultivation in a shake flask or in a fermentation can be used in the reaction as follows: - as an aliquot from the culture broth that has not been further processed or - as a Aliquot of the cell suspension after re-isolation
  • the total protein concentration obtained in each case can be determined, for example, as described in Example 3 of the present invention, with a Qubit 3.0 fluorometer from Thermo Fisher Scientific using the “ Qubit® Protein Assay Kit” according to the manufacturer's instructions.
  • OPS (10 mM final concentration) and Na sulfite (20 mM final concentration) are placed in a solution buffered to pH 7 with potassium phosphate and the reaction is started by adding the CS enzyme.
  • the sample volume of the test is 10 ml.
  • the temperature at which the test is carried out is 30°C.
  • the amount of CS enzyme used depends on the degree of purification.
  • culture broth, cell suspension of the re-isolated cells or cell homogenate are used, at least 0.1 mg of the enzyme fractions prepared in i) are used.
  • purified CS enzyme at least 10 ⁇ g of the purified enzyme fraction is used. 1 h, 2 h and 4 h after the start of the reaction, 1 ml of the test mixture is removed, centrifuged for 10 min and the content of OPS and L-cysteic acid is determined by calibrated HPLC (see Example 4), the reference substances used for calibration being commercially available are (Sigma-Aldrich).
  • the method according to the invention is preferably characterized in that the CS enzyme is produced by culturing a microorganism strain of the Enterobacteriaceae family, it being preferred that the cds encoding the CS enzyme in the microorganism strain of the Enterobacteriaceae family are heterologous and particularly preferably enzymatically active form is expressed.
  • Heterologous expression means the expression of the cds of a gene or the cds of a part of a gene in a host organism that does not naturally possess this gene or gene fragment.
  • the introduction of the cds of the heterologous gene into the host organism involves the use of recombinant DNA technology.
  • the cds of the heterologous gene can be introduced into the host organism by integration into its genome or extrachromosomally in the form of an autonomously replicating gene construct (plasmid, vector). It is preferred to introduce the cds of the heterologous gene into the host organism in the form of an autonomously replicating gene construct (plasmid, vector).
  • an autonomously replicating gene construct plasmid, vector.
  • constitutive expression gene expression is active (unregulated) during all phases of cell culture.
  • induced expression gene expression is stimulated by adding an inducer molecule to the cell culture, such as the inducer molecule IPTG to induce the tac promoter in Examples 3 and 7 of the present invention. Induced expression is preferred, in which gene expression is stimulated by adding an inducer molecule to the cell culture.
  • inducer molecule refers to the overexpression of the cds of a gene in a host organism from whose genome this gene originally comes.
  • a heterologously expressed protein for example if it is an enzyme, can be present in an enzymatically active form or can accumulate in an enzymatically inactive form, for example in inclusion bodies.
  • Heterologous expression of the CS enzyme in enzymatically active form accordingly means that i) the cds of the gene encoding the CS enzyme that is introduced into the host strain is not encoded in the genome of the host strain, ii) at least the cds of the for
  • the gene encoding the CS enzyme is chromosomally integrated into the genome of the host organism by recombinant DNA technology or, preferably, introduced into the host organism extrachromosomally by an autonomously replicating vector and iii) that a CS enzyme is expressed from this cds in an enzymatically active form.
  • the heterologously expressed CS enzyme is particularly preferably expressed by the microorganism strain in an enzymatically active form.
  • a CS enzyme is expressed from the heterologously introduced cds, which occurs after protein biosynthesis and, if necessary, post-translationally Modification, such as the incorporation of a cofactor such as pyridoxal phosphate in the case of the CS enzyme (see entry in the KEGG enzyme database under entry number EC2.5.1.76) is present in the microorganism in enzymatically active form.
  • a cofactor such as pyridoxal phosphate
  • Expressed in an enzymatically active form excludes the possibility that the protein is first produced as an inactive protein in inclusion bodies and is only present in an enzymatically active form after renaturation.
  • the method is characterized in that the CS enzyme is produced by culturing a microorganism strain of the Enterobacteriaceae family which expresses the CS enzyme heterologously and in an enzymatically active form.
  • a reaction mixture is defined as a mixture of educt (starting material), enzyme and possibly other reactants, in which the educt is converted into a product.
  • the yield of the reaction in the sense of the invention is defined as the amount of the starting material used, which is converted into the product under reaction conditions.
  • the yield can be stated as the absolute yield of the product (mmol or g), as the volume yield in absolute amount of product based on the volume (mM or g/L) or as the relative yield of product in percent of the starting material used (taking the molecular weights into account of the starting material and the product), also referred to as percentage yield.
  • cultivation or synonymous culture of microorganism cells includes both culture processes in shake flasks and fermentative processes.
  • the medium used for the cultivation or culture of the microorganisms is referred to as the cultivation medium, culture medium or, in the case of fermentation, also fermentation medium. Through cultivation/culture/fermentation of the production strain in The culture broth/fermenter broth is created as a growing, culture or fermentation medium.
  • the culture broth/fermenter broth consists of the biomass of the cells of the production strain and the culture supernatant/fermentation supernatant freed from the biomass, which was formed during the course of cultivation from the cultivation medium and the metabolic products secreted by the cells.
  • Fermentation is a process step for the production (cultivation) of cell cultures on an industrial scale (production scale), in which a preferably microbial production strain is brought to growth under defined conditions of culture medium, temperature, pH, oxygen supply and medium mixing.
  • the aim of fermentation is to produce a protein/enzyme or a metabolite, each with the highest possible yield for further use.
  • the components of the process according to the invention can be produced by fermentation.
  • the end product of the fermentation is a fermenter broth, consisting of the biomass of the cells of the production strain (fermenter cells) and the fermentation supernatant freed from the biomass, which was formed in the course of the fermentation from the cultivation medium and the metabolic products secreted by the fermenter cells.
  • the target products of the fermentation can be in the fermenter cells or in the fermentation supernatant.
  • OPS is found in the fermentation supernatant, while the CS enzyme is found in the fermenter cells.
  • Shake flask cultivation is used to cultivate microorganisms on a laboratory scale, in contrast to fermentation on a production scale.
  • a production strain is defined as a strain of microorganisms suitable for producing a product, for example by fermentation. The production strain is characterized by the fact that it is capable of (improved) production of the product through genetic modification.
  • the genetic modification can consist of a change in the genome (chromosomal change), the introduction of an autonomously replicating extrachromosomal genetic element such as a plasmid, and a combination of chromosomal and extrachromosomal changes.
  • chromosomal change an autonomously replicating extrachromosomal genetic element such as a plasmid
  • extrachromosomal changes An example of a production strain with a chromosomal change is the E. coli W3110- ⁇ serB strain described in Example 1 for the production of OPS.
  • An example of a production strain produced by introducing a plasmid is the E. coli JM105 x pCSma-pKKj strain described in Example 3 for producing the CS enzyme.
  • the microorganism strain that carries the extrachromosomal genetic element is referred to as the host strain or host organism and the extrachromosomal genetic element is referred to as a gene construct, plasmid, vector or expression vector.
  • the area of DNA or RNA that begins with a start codon and ends with a stop codon and codes for the amino acid sequence of a protein is called an open reading frame (ORF, synonymous with cds, coding sequence).
  • ORF is also called the coding region or structural gene.
  • the DNA section that contains all the basic information needed to produce a biologically active substance is called a gene contains RNA.
  • a gene contains the section of DNA from which a single-stranded RNA copy is made by transcription and the expression signals that are involved in the regulation of this copying process.
  • the expression signals include, for example, at least one promoter, a transcription start, a translation start and a ribosome binding site (RBS). Furthermore, a terminator and one or more operators are possible as expression signals.
  • An mRNA also called messenger RNA or messenger RNA, is a single-stranded ribonucleic acid (RNA) that carries the genetic information for building a protein.
  • An mRNA provides the building instructions for a specific protein in a cell.
  • the mRNA molecule carries the message from the genetic information (DNA) necessary for protein construction to the protein-building ribosomes. In a cell it is formed as a transcript of a section of DNA belonging to a gene. The genetic information stored in the DNA is not changed.
  • Genes of eukaryotic organisms are predominantly so-called mosaic genes and, in contrast to prokaryotic genes, also contain non-coding sections, so-called introns (intragenic regions). Coding sequences, so-called exons (expressed regions), are DNA sections of a eukaryotic gene that, after transcription into RNA, are translated by the ribosomes into the amino acid sequence of a protein. The introns are spliced from the primary transcript after the DNA has been transcribed into RNA. The protein-coding RNA freed from introns is called messenger RNA (mRNA), also known as “mature” mRNA. This undergoes further modifications such as capping and polyadenylation.
  • mRNA messenger RNA
  • the coding region of the mature mRNA is then translated into the protein sequence. If a eukaryotic gene with an exon/intron structure is to be expressed in prokaryotic organisms, it is necessary to convert the protein sequence or the coding region of the mature mRNA into intron-free DNA back translated, since in prokaryotes the processing of the exon/intron structure does not take place.
  • a sequence optimization ie adaptation to the codon usage of the corresponding prokaryote, takes place simultaneously with the back translation of the protein sequence or the mRNA sequence into DNA sequence (codon optimization).
  • a genetic construct is a DNA molecule in which a gene is linked to other genetic elements (e.g. promoter, terminator, selection marker, origin of replication).
  • a gene construct within the scope of the invention is a circular DNA molecule and is referred to as a plasmid, vector or expression vector.
  • the genetic elements of the gene construct cause its extrachromosomal inheritance during cell growth as well as the production of the protein encoded by the gene.
  • the abbreviation WT (Wt) denotes the wild type.
  • the wild-type gene is the form of the gene that arose naturally through evolution and is present in the wild-type genome.
  • the DNA sequence of Wt genes is publicly available in databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • a microorganism strain with a Wt genome is called a Wt strain.
  • L-cysteic acid from the biotransformation of OPS according to the invention with a salt of sulfurous acid can either be used directly without further processing steps or enriched or purified using known methods. Such methods are known to those skilled in the art from processes for isolating amino acids. They include, for example, filtration, centrifugation, extraction, adsorption, ion exchange chromatography, precipitation, crystallization.
  • the process is preferably characterized in that the reaction mixture containing the L-cysteic acid is further used without further work-up, purification or isolation steps.
  • the process is characterized in that the L-cysteic acid produced is isolated from the reaction mixture.
  • denaturation refers to a structural change in biomolecules such as proteins, which is associated with a loss of the biological function of the molecules, although their primary structure remains unchanged.
  • a denatured protein is characterized by the fact that it is not enzymatically active, that is, for CS enzymes in the sense of the present invention, they are not able to catalyze the synthesis of L-cysteic acid from OPS and a salt of sulfurous acid.
  • Denaturation can be due to physical or chemical influences. Incorrectly or incompletely folded, enzymatically inactive proteins can accumulate in the cell in protein aggregates (so-called inclusion bodies) and can be viewed as naturally denatured proteins.
  • Inclusion bodies are mainly observed at high expression levels when, due to the resulting high concentration of newly synthesized protein chains, their aggregation is preferred over their folding into the enzymatically active three-dimensional form.
  • Whether a heterologously expressed protein occurs in the form of insoluble inclusion bodies or in active form cannot be predicted and depends not only on the primary structure of the protein chain (sequence of the amino acid sequence) but also on the expression system used and parameters through which the rate of protein biosynthesis can be controlled (e.g. cultivation temperature, induction strength with inducible promoters).
  • the cysteate synthase from Methanoscarcina acetivorans could be produced in an enzymatically active form in E.
  • Renaturation refers to the transformation of the denatured proteins back into their biologically active spatial structure.
  • chaotropic compounds are used to bring denatured protein back into solution in inclusion bodies before protein renaturation is made possible by removing the chaotropic compound.
  • urea and guanidine hydrochloride are primarily used for this purpose.
  • the method is preferably characterized in that the CS enzyme is used in the reaction without a previous renaturation step.
  • the renaturation steps include the following process steps: dissolving the denatured protein in a medium containing a chaotropic compound and subsequent removal of the chaotropic compound. It depends on the protein in question to what extent the chaotropic compound must be removed.
  • the chaotropic compound can be removed, for example, by dialysis, selective binding of the chaotropic compound to a carrier material, selective binding of the protein to be renatured to a carrier material and subsequent elution under renaturing conditions or by diluting the chaotropic compound to a critical concentration below which it cannot has a more denaturing effect (see e.g. Graham et al., 2009, above). Methods of protein renaturation are described in the prior art.
  • the renaturing conditions include, for example, dissolving the denatured protein in a 6 M aqueous urea solution or 6 M aqueous guanidine-HCl solution. Dilution or removal of the chaotropic compound below a critical concentration depends on the protein in question and means that the concentration of the chaotropic compound such as urea or guanidine is reduced below a concentration at which the protein in question can resume the three-dimensional structure of its active form . Chemical substances that disrupt ordered hydrogen bonds in water are called chaotropic compounds.
  • the chaotropic compounds include barium salts such as barium chloride or barium acetate, guanidine hydrochloride, thiocyanates such as guanidinium thiocyanate, perchlorates, iodides, butanol, phenol, thiourea, urea and/or surfactants.
  • Surfactants also known as detergents or soaps
  • are organic compounds that act as surface-active substances, meaning that, thanks to their structure, they arrange themselves in the interface between two phases in such a way that they reduce the interfacial tension ( surface tension) and thereby enable wetting, for example. By reducing the surface tension, they promote the mixing of two phases, possibly even leading to the formation of an emulsion.
  • Surfactants are characterized by a polarity of the molecular structure, with one part of the molecule having hydrophilic properties, which mediate solubility in water, and the other part of the molecule having hydrophobic properties, whereby surfactants solubilize hydrophobic compounds and contribute to solubility in water.
  • the surfactants used are nonionic surfactants (polyalkylene glycol ethers, fatty alcohol propoxylates, alkyl glucosides, alkyl polyglucosides, octylphenol ethoxylates such as Triton ic surfactants based on quaternary ammonium compounds ( Distearyldimethylammonium chloride, “esterquat”) and/or zwitterionic (amphoteric) surfactants based on betaine (e.g “Cocoamidopropyl betaine”) or sulfobetaine (e.g. cocoamidopropyl hydroxysultaine).
  • nonionic surfactants polyalkylene glycol ethers, fatty alcohol propoxylates, alkyl glucosides, alkyl polyglucosides, octylphenol ethoxylates
  • Triton ic surfactants based on quaternary ammonium compounds Distearyldimethylam
  • the method is characterized in that the CS enzyme is used in the reaction without a previous renaturation step.
  • Working without a renaturation step has a great economic advantage because the complex, cost-intensive and environmentally harmful renaturation steps described above are not necessary.
  • the host cells expressing the CS enzyme do not first have to undergo a complex and cost-intensive process that pollutes the environment, for example through waste, mechanically or chemically open-minded and inclusion bodies, in which, for example, Graham et al.
  • OPS can be produced chemically or biotechnologically, for example by fermenting an OPS production strain. Possible methods for the chemical production of OPS are, for example, phosphorylation of L-serine, or the production of the racemate O-phospho-D/L-serine, which can be used directly, or OPS is previously obtained from the racemate, for example by resolution of the racemate .
  • the process for producing L-cysteic acid is preferably characterized in that the OPS used in the reaction is produced biotechnologically. This is done by cultivating an OPS production strain.
  • the biotechnological production of OPS by cultivating one is particularly preferred OPS production strain in which OPS accumulates in the cell culture supernatant (extracellular).
  • the expert can use isotope analysis to determine whether a substance such as OPS, which he wants to use as a starting material in the process, comes from chemical or biotechnological, for example fermentative, production.
  • An isotope analysis method suitable for differentiation is, for example, in Sieper et al., Rapid Commun. Mass Spectrom.
  • OPS serves as a biosynthetic precursor of L-serine in the cysteine metabolism of Escherichia coli, for example. The latter arises from dephosphorylation of OPS.
  • This reaction is enzymatically catalyzed by O-phospho-L-serine phosphatases (SerB, EC 3.1.3.3). It is known from the prior art that E. coli strains with suppressed SerB activity can accumulate OPS. A microorganism strain with suppressed SerB activity is therefore characterized by the fact that it can no longer produce L-serine by dephosphorylation of OPS and, as a result, accumulate OPS.
  • the method is preferably characterized in that the OPS used in the reaction is produced with a microorganism strain with suppressed activity of the O-phospho-L-serine phosphatase (SerB enzyme), which belongs to the enzyme class EC 3.1.3.3.
  • a microorganism strain with suppressed SerB activity is considered an OPS Production strain is used, wherein the suppression of SerB activity involves a genetic change in the microorganism strain.
  • the SerB activity of the genetically unmodified microorganism strain (Wt strain) is set at 100%, and a microorganism strain with suppressed SerB activity is defined as having a lower SerB activity than the 100% activity in the Wt strain contains, preferably a maximum of 20%, particularly preferably a maximum of 10% and particularly preferably 0% (inactivation of the serB gene) of the activity of the wild-type strain, which is set to 100%.
  • a microorganism strain with suppressed SerB activity is characterized by one or more of the following genetic changes: - Deletion of the chromosomal gene encoding the enzyme SerB. - Introducing a mutation in the chromosomal gene encoding the enzyme SerB to reduce the activity of the endogenous gene. - Substitution of the chromosomal gene encoding the enzyme SerB with a gene mutated to reduce the activity of the endogenous gene. - Introducing a mutation in a regulatory region for the gene encoding the enzyme SerB to reduce endogenous enzyme activity.
  • L-3-phosphoserine phosphatase enzyme activity can, as described in the prior art, be determined by enzymatic release of phosphate from L-3-phosphoserine, the released phosphate being quantitatively determined as a molybdate complex photometrically at 340 nm.
  • the serB activity determined for the WT strain using this enzyme assay is set to 100% activity and the residual activity for a microorganism strain with suppressed SerB activity is measured under identical conditions.
  • the process according to the invention for producing L-cysteic acid is particularly preferably characterized in that the OPS used in the reaction is produced with a microorganism strain in which the chromosomal gene which encodes the enzyme SerB has been deleted. This is also referred to as a knock out of the serB gene.
  • the microorganism strain with suppressed SerB activity is preferably characterized in that the chromosomal nucleotide sequence of the serB gene, comprising the complete serB cds, which codes for the enzyme SerB, as well as flanking sequences up to 1000 nt 5 'upstream of the serB cds comprising the sequence of the serB promoter and 1000 nt 3' downstream of the serB cds comprising the sequence of the serB terminator is deleted.
  • a particularly preferred deletion is the deletion of the serB cds described in Example 1, which codes for the enzyme SerB.
  • the microorganism strain with suppressed SerB activity is preferably selected from the families Corynebacteriaceae or Enterobacteriaceae, particularly preferably selected from the genera Corynebacterium, Pantoea or Escherichia and particularly preferably selected from the species Pantoea ananatis or Escherichia coli.
  • the microorganism strain with suppressed SerB activity for producing OPS for the reaction according to the invention is preferably the E. coli K12 W3110 strain.
  • a microorganism strain with suppressed SerB activity is preferably characterized by serine auxotrophy, ie the strain cannot produce the amino acid L-serine itself for growth.
  • the auxotrophy can be reversed by adding serine or glycine to the culture medium (growing medium), either as a pure substance or as a component a complex media component such as yeast extract, peptone or tryptone as well as a mixture of pure substance and complex media component.
  • a mixture of pure substance, selected from glycine and L-serine, and complex media component is preferred, including particularly preferably a mixture of glycine and complex media component.
  • the addition of glycine to the cultivation medium is particularly preferred.
  • the content of glycine as a pure substance in the cultivation medium is preferably 0.1 g/L to 10 g/L, particularly preferably 0.2 g/L to 5 g/L and particularly preferably 0.3 g/L to 2 g/L .
  • the serB gene or part of the gene can be isolated and a foreign DNA cloned into the serB gene, thereby interrupting the open reading frame of the serB gene that defines the protein.
  • a DNA construct suitable for the targeted inactivation of the serB gene can therefore consist of a 5' DNA section that is homologous to the genomic serB gene, followed by a gene section comprising the foreign DNA and connected to this by a 3' DNA - Section which in turn is homologous to the genomic serB gene.
  • the region of the serB gene that is suitable for homologous recombination cannot only include the region coding for the O-phospho-L-serine phosphatase.
  • the region in question can also include DNA sequences flanking the serB gene, namely in the 5' region before the beginning of the coding region (promoter of gene transcription) and in the 3' region after the end of the coding region (terminator of the Gene transcription), the alteration of which by homologous recombination as well as the alteration of the coding region can lead to inactivation of the serB gene.
  • the foreign DNA is preferably a selection marker expression cassette. This consists of a gene transcription promoter, which is functionally linked to the actual selection marker gene and, if necessary, followed by a gene transcription terminator. The In this case, the selection marker also contains 5' and 3' flanking homologous sequences of the serB gene.
  • the selection marker preferably contains 5' and 3' flanking homologous sequences of the serB gene, each at least 30 nucleotides long, particularly preferably at least 50 nucleotides long.
  • the DNA construct for inactivating the serB gene can therefore, starting from the 5' end, consist of a sequence homologous to the serB gene, followed by the expression cassette of the selection marker, for example selected from the class of antibiotic resistance genes and followed by another one serB gene homologous sequence.
  • the DNA construct for inactivating the serB gene starting from the 5' end, consists of a sequence homologous to the serB gene of at least 30 nucleotides in length, particularly preferably at least 50 nucleotides in length, followed by the expression cassette of the selection marker , selected from the class of antibiotic resistance genes and followed by a further sequence homologous to the serB gene of at least 30 nucleotides in length, particularly preferably at least 50 nucleotides in length.
  • the selection marker genes are generally genes whose gene product enables the parent strain to grow under selective conditions under which the original parent strain cannot grow.
  • Preferred selection marker genes are selected from the group of antibiotic resistance genes such as the ampicillin resistance gene, the tetracycline resistance gene, the kanamycin resistance gene, the chloramphenicol resistance gene or even the neomycin resistance gene.
  • Other preferred selection marker genes enable parental strains with a metabolic defect (e.g. amino acid auxotrophies) to grow under selective conditions by their expression correcting the metabolic defect.
  • selection marker genes are also possible whose gene product chemically modifies and thus inactivates a compound that is toxic to the original strain (e.g. the gene for the enzyme acetamidase, which breaks down the compound acetamide, which is toxic to many microorganisms, into the non-toxic products acetate and ammonia).
  • selection marker genes are the ampicillin resistance gene, the tetracycline resistance gene, the kanamycin resistance gene and the chloramphenicol resistance gene.
  • the tetracycline resistance gene and the kanamycin resistance gene are particularly preferred.
  • One such system is, for example, the so-called Lambda-Red technology, commercially available as a “Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit”, based on the Red®/ET® technology from Gene Bridges GmbH (see “Technical Protocol, Quick & Easy E.
  • Example 1 of the present invention describes an example of producing a microorganism strain with suppressed SerB activity by deleting the serB gene.
  • a microorganism strain with suppressed SerB activity produced using the Red ® /ET ® technology can be suitable for the extracellular production of OPS, as described, for example, in the second example of the present invention for the strain E. coli W3110- ⁇ serB.
  • OPS can accumulate both intracellularly and extracellularly, with the amount of intracellularly accumulated OPS depending on the cultivation conditions (Steinfeld et al., see above).
  • the culture conditions chosen in Example 2 of the present invention enable the extracellular accumulation of OPS.
  • the extracellular OPS content is preferably at least 1 g/L, particularly preferably at least 3 g/L and particularly preferably at least 6 g/L.
  • OPS present extracellularly in a culture broth such as that obtained in a cultivation carried out as in the 2nd example
  • purification or isolation steps such as, among others, extraction, adsorption, ion exchange chromatography, precipitation, crystallization. This approach is particularly economical and avoids isolating OPS.
  • the method for producing L-cysteic acid is therefore particularly preferably characterized in that OPS is used, which is obtained from the cell culture supernatant of the cultivation of a microorganism strain with suppressed activity of the O-phospho-L-serine phosphatase (SerB-), which belongs to the enzyme class EC 3.1.3.3. enzyme).
  • the process for producing L-cysteic acid is characterized in that, in addition to the CS enzyme used in the reaction, the OPS used in the reaction is produced biotechnologically, particularly preferably by fermentation.
  • the CS enzyme is preferably produced by culture of a microorganism strain of the Enterobacteriaceae family which heterologously expresses the CS enzyme.
  • This microorganism strain is also called a CS enzyme production strain, which consists of the host strain and a genetic construct for expressing the CS gene.
  • the method is preferably characterized in that the CS enzyme is produced by culturing a microorganism strain of the genus Escherichia, particularly preferably the species Escherichia coli and particularly preferably the microorganism strain E. coli K12 JM105, which expresses the CS enzyme heterologously and in particular preferably in an enzymatically active form, is produced.
  • the preferred gene construct for expressing the CS gene is an expression vector in plasmid form, particularly preferably including the expression vector pCSma-pKKj disclosed in Example 3 (FIG. 3).
  • Cysteate synthases are known as enzymes in the coenzyme M biosynthesis of, for example, methanobacteria.
  • the process for producing L-cysteic acid is preferably characterized in that the CS enzyme comes from Methanoscarcina acetivorans or the CS enzyme is a sequence homologous thereto, particularly preferably the CS enzyme comes from Methanoscarcina acetivorans.
  • the coding DNA sequence is SEQ ID NO: 3, which codes for a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, or a nucleotide sequence homologous thereto.
  • Homologous nucleotide sequences mean that the DNA sequences of these genes or DNA sections are at least 80%, preferably at least 90% and particularly preferably at least 95% identical.
  • the preferred homologous nucleotide sequences are the sequences of the genes from Methanocella paludicola (NCBI Gene ID: 8682885), Methanosarcina barkeri (NCBI Gene ID: 24822660), Methanoculleus marisnigri (NCBI Gene ID: 4845938) or nucleotide sequences homologous thereto.
  • the degree of DNA identity is determined by the “nucleotide blast” program, found at http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, which is based on the blastn algorithm.
  • the preset parameters were used as algorithm parameters for an alignment of two or more nucleotide sequences.
  • the method is characterized in that the CS enzyme has the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence homologous thereto, an amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 4 having a sequence identity of at least 50%, preferably at least 70 % and particularly preferably at least 80% to SEQ ID NO: 4 and at the same time has cysteate synthase enzyme activity. Cysteate synthase enzyme activity can be detected as defined above in the CS activity assay.
  • Amino acid sequences of homologous CS enzymes can be found in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) using the search term “cysteate synthase” or using the “Protein BLAST” subprogram by entering the amino acid sequence SEQ ID NO: 4.
  • Enzymes homologous to the CS enzyme from Methanoscarcina acetivorans are preferably selected from Methanocella paludicola (NCBI No.: WP_012900738.1), Methanolinea mesophila (NCBI No.: WP_245249687.1), Methanosarcina barkeri (NCBI No.: WP_011308449.1), Methanoculleus marisnigri (NCBI No.: WP_011842967.1).
  • the “Protein BLAST” search for genes for CS enzymes found homologous protein sequences from a large number of bacteria from the archaebacteria domain, including thermophilic organisms (growth at temperatures >50°C up to 110°C).
  • the invention also includes CS enzymes from the archaebacteria domain with an activity optimum of >50°C.
  • the method is preferably characterized in that the CS enzyme is not a fusion protein.
  • fusion protein means that the DNA sequence encoding a protein or part of a protein is fused in the reading frame in the laboratory with one or more DNA sequences encoding another protein or part of another protein and thus for a modified (extended) protein that does not occur in nature.
  • the fused DNA sequences can be attached at the 5' end, at the 3' end, or at both the 5' and 3' ends.
  • the fusion protein is also called a hybrid or hybrid enzyme.
  • the protein according to the invention with cysteate synthase enzyme activity is only encoded by the cds of the relevant gene and the CS-cds is not extended by additional sequences added to the CS-cds.
  • a protein whose cds has been fused to a nucleotide sequence which codes for a protein sequence which is cleaved off again during protein biosynthesis or during post-translational modification, such as an export signal sequence mediating protein secretion, is not included in the term fusion protein.
  • the term fusion protein always refers to the mature protein.
  • the production of the CS enzyme by cultivating a CS enzyme production strain refers to the production of the CS enzyme as an enzymatically active protein without refolding and preferably without resort to expression as a fusion protein.
  • Particularly preferred is the production of the CS enzyme from M. acetivorans by cultivating a CS enzyme production strain as an enzymatically active protein without refolding and without resorting to expression as a fusion protein, a host strain of the species Escherichia coli being used to produce the production strain.
  • Particular preference is given to producing the CS enzyme from M. acetivorans by cultivating the E.
  • the CS enzyme obtained by culturing the production strain can be used in the process according to the invention either as a culture broth that has not been further processed or as a cell suspension after the cells have been re-isolated from the culture broth, for example by centrifugation or filtration.
  • the CS enzyme can be used in the form of a cell homogenate after mechanical disruption of the cell suspension or in the form of chemically permeabilized cells (e.g. by chloroform) or also as a cell extract after separation of particulate components from the cell homogenate or also as, for example, a chromatographically purified enzyme.
  • the CS enzyme is preferred to use as a culture broth that has not been further processed, particularly preferably as a fermenter broth, as a cell suspension after re-isolation of the cells from the culture broth or as a cell homogenate after mechanical disruption of the cell suspension or in the form of chemically permeabilized cells (e.g. by chloroform).
  • Particular preference is given to using the CS enzyme as a cell suspension after re-isolation of the cells from the culture broth or as a cell homogenate, particularly preferably as a cell homogenate.
  • CS enzyme is used as a cell homogenate produced and used directly in the biotransformation process according to the invention as a CS enzyme.
  • Example 3 of the present invention A possible preferred embodiment is disclosed in Example 3 of the present invention.
  • salts of sulfurous acid are suitable for the reaction in the process for producing L-cysteic acid, including the known salts Na 2 SO 3 , K 2 SO 3 , (NH 4 ) 2 SO 3 , NaHSO 3 (or its anhydride Na 2 S 2 O 5 ) or KHSO 3 .
  • gaseous sulfur dioxide the anhydride of sulfurous acid, which can be introduced into the reaction mixture, where it hydrates to the sulfurous acid H 2 SO 3 and, depending on the pH, in an equilibrium with the deprotonated forms HSO 3 - and SO 3 2- is present.
  • Na 2 SO 3 or NaHSO 3 (or its anhydride Na 2 S 2 O 5 ) is used as the salt of the sulfurous acid in the process for producing L-cysteic acid.
  • the reaction temperature is chosen between 5°C and 80°C.
  • a reaction temperature between 10°C and 60°C is preferred, particularly preferably between 15°C and 50°C and particularly preferably between 20°C and 40°C.
  • the reaction can be carried out at a pH between 4.0 and 9.0, preferably at a pH between 5.0 and 8.5, particularly preferably at a pH between 5.5 and 8.0 and particularly preferably at a pH between 6, 0 and 7.5 can be carried out.
  • Water is preferably used as the solvent for the process for producing L-cysteic acid.
  • the process according to the invention for producing L-cysteic acid can be operated in a batch or continuous manner.
  • discontinuous operation In discontinuous operation (batch operation), all reactants are added to the batch during the course of the reaction and the batch is processed after the reaction has ended.
  • the CS enzyme In continuous operation, the CS enzyme is introduced as a stationary phase, for example immobilized in a membrane reactor or on a support, and the substrate OPS and a salt of sulfurous acid are metered in as a mobile phase. The contact time of the mobile phase with the stationary phase is adjusted so that the substrate OPS can react with the salt of the sulfurous acid to form the product L-cysteic acid.
  • Discontinuous (batch) operation is preferred.
  • the concentration of the salt of the sulfurous acid is preferably selected in the batch so that it is present at least in an equimolar concentration to OPS, preferably at least in a 1.5-fold molar excess, particularly preferably in at least a 2-fold molar excess and particularly preferably at least five-fold molar excess to OPS is present.
  • the OPS concentration in the batch is preferably at least 80 mg/L, particularly preferably at least 1 g/L and particularly preferably at least 5 g/L.
  • the process for producing L-cysteic acid is preferably characterized in that the molar yield of L-cysteic acid, based on the molar amount of OPS used, is at least 60%, particularly preferably at least 80% and particularly preferably at least 90%.
  • the process according to the invention is suitable for use on an industrial scale.
  • a batch volume >10 ml is preferred, particularly preferably >1L and particularly preferably >100 L.
  • recombinantly produced CS enzyme heterologously in a CS enzyme production strain without refolding (renaturation) and preferably without Recourse to a fusion partner in a cell homogenate is enzymatically active and suitable for the efficient production of L-cysteic acid in a previously unknown biotransformation.
  • OPS produced by fermentation from the cell culture supernatant of growing an OPS production strain with preferably suppressed activity of the SerB enzyme or commercially available OPS can be reacted with a salt of the sulfurous acid according to equation (1) by cultivation.
  • a further preferred method for producing taurine is characterized in that the L-cysteic acid produced according to the invention is decarboxylated.
  • the decarboxylation of L-cysteic acid to taurine occurs according to equation (2): (2) L-cysteic acid -> taurine + CO 2
  • the process for producing taurine is characterized in that the L-cysteic acid produced in the process according to the invention is used directly, that is to say without further processing, purification or isolation steps, for the production of taurine, as for example in Examples 8 and 9 of the present Invention disclosed.
  • the decarboxylation of L-cysteic acid to taurine can occur chemically or enzymatically catalyzed in a biotransformation.
  • the decarboxylation reaction is preferably a biotransformation, with L-cysteic acid being enzymatically decarboxylated to taurine.
  • L-cysteic acid produced in the process according to the invention can be used directly as a reaction mixture without further work-up steps.
  • enzymes from the Class of L-cysteine sulfinic acid decarboxylases (CSAD, EC 4.1.1.29), aspartate-1-decarboxylases (EC 4.1.1.11) or glutamate decarboxylases (EC 4.1.1.15).
  • the process for producing taurine is preferably characterized in that the decarboxylation is carried out using a cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD enzyme) belonging to the enzyme class EC 4.1.1.29.
  • CSAD enzymes are known to decarboxylate L-cysteine sulfinic acid to hypotaurine according to equation (3).
  • these enzymes are able to decarboxylate L-cysteine acid as a substrate to taurine.
  • the CSADcc enzyme from Cyprinus carpio is suitable for decarboxylating L-cysteic acid to taurine according to equation (2).
  • CSAD enzymes are mainly found in metazoans (multicellular animals), including mammals such as humans (Homo sapiens), cattle (Bos taurus), rats (Rattus norvegicus), and mice (Mus musculus). in fish, such as carp (Cyprinus carpio).
  • Enzymes with CSAD activity can also be found in single-celled organisms, such as in algae, for example from the genus Synechococcus, as well as in bacteria and fungi.
  • CSAD enzymes from mammals, selected from humans (Homo sapiens), cattle (Bos taurus), rats (Rattus norvegicus) or mice (Mus musculus) as well as from fish, such as carp (Cyprinus carpio).
  • CSAD enzymes from humans (Homo sapiens), rats (Rattus norvegicus) or carp (Cyprinus carpio) are particularly preferred.
  • the CSAD enzyme particularly preferably comes from carp (Cyprinus carpio) and is referred to as CSADcc.
  • a CSADcc-cds DNA sequence that is codon-optimized for expression in the specifically selected microorganism is preferably derived from the corresponding amino acid sequence (for example for E. coli specified in SEQ ID NO: 5, nt 31 - 1530, coding for a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6).
  • Publicly accessible software programs are available for codon optimization, such as the Eurofins Genomics GENEius software used in Example 7.
  • the process for producing taurine is preferably characterized in that the amino acid sequence of the CSAD enzyme is SEQ ID NO. 6 acts.
  • the CSAD enzyme particularly preferably CSADcc, is preferably produced recombinantly by a microorganism production strain.
  • the production of the CSAD enzyme by recombinant production in an E. coli production strain is disclosed, for example, in Example 7.
  • the CSAD-cds is cloned in a known manner into an expression vector, for example the vector pKKj (see Example 3), and a gene construct, for example pCSADcc-pKKj (FIG. 4), is produced.
  • the gene construct containing the CSAD-cds is also transformed in a known manner into a microorganism host strain, for example the E. coli JM105 strain, and the resulting production strain, for example E. coli JM105 x pCSADcc-pKKj, is also transformed is known to be used to produce the CSAD enzyme.
  • the CSAD enzyme can be produced for laboratory purposes on a shake flask scale (as described, for example, in Example 7) or in a known manner by fermentation.
  • CSAD enzymes contain pyridoxal phosphate (PLP, CAS No. 54-47-7) as a cofactor.
  • the supplementation of the cultivation medium or of biotransformation approaches for the conversion of L- Cysteic acid to taurine with PLP therefore offers an opportunity for process improvement.
  • PLP belongs to the B6 vitamin family
  • supplementation with other members of the vitamin B6 family such as pyridoxine (CAS no. 65-23-6), pyridoxal (CAS no. 66-72-8) or pyridoxamine is also suitable (CAS No. 85-87-0) for process improvement.
  • the CSAD enzyme, preferably CSADcc obtained by cultivation in a shake flask or by fermentation can be used either as a culture broth that is not further processed or as a cell suspension after the cells have been re-isolated by, for example, centrifugation.
  • the CSAD enzyme preferably CSADcc
  • the CSAD enzyme can be used in the form of a cell homogenate after mechanical disruption of the cell suspension or in the form of chemically permeabilized cells (for example by chloroform) or also as a cell extract after separation of particulate components from the cell homogenate or also as, for example, a chromatographically purified enzyme .
  • the biotransformation of L-cysteic acid to taurine by the CSAD enzyme is carried out under pH and temperature conditions that allow efficient decarboxylation of L-cysteic acid to taurine.
  • a pH range between pH 5.0 and 9.0 and a temperature range between 20 ° C and 70 ° C at which the biotransformation is carried out is preferred.
  • the biotransformation to produce taurine from L-cysteic acid can be carried out in a batch or continuous manner. In discontinuous operation (batch operation), all reactants are added to the batch during the course of the reaction and the batch is processed after the reaction has ended. In continuous operation, the CSAD enzyme is presented as a stationary phase, for example in a Membrane reactor or immobilized on a support, and the substrate L-cysteic acid is added as a mobile phase. The contact time of the mobile phase with the stationary phase is adjusted so that the substrate L-cysteic acid can react to form the product taurine.
  • the L-cysteic acid concentration in the biotransformation to produce taurine is preferably at least 80 mg/L, particularly preferably at least 1 g/L, particularly preferably at least 5 g/L.
  • the process for producing taurine is preferably characterized in that the molar yield of taurine, based on the molar amount of L-cysteic acid used, is at least 60%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% and particularly preferably at least 95%.
  • the process steps for producing L-cysteic acid (biotransformation 1) and for producing taurine preferably take place sequentially, ie one after the other.
  • the process for producing taurine is characterized in that all process steps take place in one reaction batch. If all process steps take place in one reaction batch, it is also referred to as a one-pot process or a one-pot reaction.
  • Example 9 of the present invention discloses a possibility of carrying out such a one-pot reaction, in which the biotransformation according to the invention of OPS to L-cysteic acid according to equation (1) and the biotransformation of L-cysteic acid to taurine according to equation (2) are carried out simultaneously, ie in one reaction batch , where OPS is reacted with a sulfite (sulfurous acid salt) in the presence of the CS and CSAD enzyme.
  • L-cysteic acid is formed, which is released “in situ” by CSAD Enzyme is decarboxylated to taurine.
  • the product distribution of L-cysteic acid and taurine is determined by the activity of the CS enzyme relative to that of the CSAD enzyme. With sufficient dosage of the CSAD enzyme, the L-cysteic acid can be quantitatively converted to taurine. Preference is given to a process in which the OPS used is converted to L-cysteic acid and taurine, the total molar yield of L-cysteic acid and taurine being more than 60%, particularly preferably more than 70% and particularly preferably more than 80%.
  • the genes for cysteate synthase, preferably CSma, and L-cysteine sulfinic acid decarboxylase, preferably CSADcc are expressed together in one strain and the cells from the cultivation of this strain are reacted with OPS in the presence of a sulfite taurine is formed as the end product.
  • a biotransformation process for producing taurine is preferred, in which the process components OPS, the CS enzyme and the CSAD enzyme are produced separately.
  • Taurine can either be used directly without further processing steps or enriched or purified using known methods. Such methods are known to those skilled in the art, for example from processes for isolating amino acids known.
  • a further subject of the invention is the use of the resulting L-cysteic acid in a process for producing taurine.
  • the use of the L-cysteic acid produced in the process according to the invention for producing taurine enables a biotechnological process from plant raw materials.
  • a biotechnological process for the production of taurine is of particular interest for applications in the food, animal feed or cosmetics sectors due to the sustainable production process.
  • the invention is further illustrated by the following examples without being limited by them:
  • Example 1 Production of a serB deletion mutant in Escherichia coli
  • the strain Escherichia coli K12 W3110 was used (commercially available under the strain number DSM 5911 from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH).
  • the target of the gene inactivation was the coding sequence of the serB gene from E. coli.
  • the DNA sequence of the cds of the serB gene from E. coli K12 (SEQ ID NO: 1, nt 67 to nt 1032), encoding a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, is accessible in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) gene database with the Gene ID 948913.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • coli serB gene was inactivated using the Red ® /ET ® technology from Gene Bridges GmbH, as detailed below (described in the user manual of the “Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit”, see “Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red ® /ET ® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, June 2012 and the literature cited therein, e.g. Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000): 6640-6645).
  • the plasmids pKD13, pKD46 and pCP20 were used for this purpose: - The 3.4 kb plasmid pKD13 (Fig. 1) is disclosed in the “GenBank” gene database under the accession number AY048744.1. - The 6.3 kb plasmid pKD46 (Fig. 2) is disclosed in the “GenBank” gene database under the accession number AY048746.1. - The 9.4 kb plasmid pCP20 is disclosed in Cherepanov and Wackernagel, Gene 158 (1995): 9-14. To inactivate the serB gene in E.
  • E. coli W3110 by homologous recombination with the Lambda Red system, the following steps were carried out: 1. E. coli W3110 was transformed with the plasmid pKD46 (so-called “Red Recombinase” plasmid, Fig. 2) and isolated an ampicillin-resistant clone, designated W3110 x pKD46. 2. A serB-specific DNA fragment suitable for its inactivation was in a PCR reaction (“Phusion TM High-Fidelity” DNA polymerase, Thermo Scientific TM ) with DNA from the plasmid pKD13 (Fig. 1) and the primers serb-1f (SEQ ID NO: 7) and serb-2r (SEQ ID NO: 8).
  • the PCR reaction produced a 1.4 kb PCR product which contained a DNA section of 30 nt at the 5' and 3' ends, which was specific for the serB gene from E. coli W3110.
  • the PCR product contained the expression cassette of the kanamycin resistance gene contained in pKD13 and, flanking the 5' and 3' ends of the kanamycin expression cassette, so-called “FRT direct repeats” (referred to as “FRT1” and “FRT2” in Fig. 1), short DNA sections that were used in a later step to remove the antibiotic marker kanamycin as a recognition sequence for the “FLP recombinase” (contained on the plasmid pCP20).
  • Primer serb-1f contained 30 nucleotides (nt) from the 5' region of the serB gene (nt 67-96 in SEQ ID NO: 1) and connected thereto 20 nt specific for the plasmid pKD13 (referred to as “pr-1" in Fig. 1).
  • Primer serb-2r contained 30 nt from the 3' region of the serB gene (nt 1006-1035 in SEQ ID NO: 1, in reverse complementary form) and attached to it 20 nt specific for the plasmid pKD13 (referred to as “pr- 2” in Fig. 1). 3.
  • the 1.4 kb PCR product was isolated and treated with the restriction endonuclease Dpn I, which cuts only methylated DNA and is familiar to those skilled in the art, in order to remove residual pKD13 plasmid DNA. Non-methylated DNA from the PCR reaction is not degraded. 4.
  • the 1.4 kb PCR product specific for the serB gene and containing an expression cassette for the kanamycin resistance gene was transformed into E. coli W3110 x pKD46 and kanamycin-resistant clones were produced on LBkan-glycine plates at 30°C isolated.
  • LBkan-glycine plates contained LB medium (10 g/L tryptone from GIBCO TM , 5 g/L yeast extract from BD Biosciences, 5 g/L NaCl), 1.5% agar, 15 mg/L kanamycin (Sigma-Aldrich) and 1 g/L glycine (Sigma-Aldrich). 5. Four of the obtained kanamycin-resistant clones were purified on LBkan-glycine plates (ie, isolating a clone by dicing) and checked in a PCR reaction whether the kanamycin resistance cassette had been correctly integrated into the serB gene.
  • the genomic DNA used for the PCR reaction (“Phusion TM High-Fidelity” DNA polymerase, Thermo Scientific TM ) was isolated from cells growing kanamycin-resistant clones of E. coli W3110 x pKD46 using a DNA isolation kit (Qiagen). isolated in LBkan-glycine medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 15 mg/L kanamycin, 1 g/L glycine). Genomic DNA from the E. coli W3110 wild-type strain served as a control.
  • the primers used for the PCR reaction were serb-3f (SEQ ID NO: 9, 5'-flanking the serB gene, nt 1-22 in SEQ ID NO: 1) and serb-4r (SEQ ID NO: 10, the serB gene 3'-flanking, nt 1066-1085 in SEQ ID NO 1, in reverse complementary form).
  • E. coli W3110 wild-type DNA yielded a DNA fragment of 1.1 kb in the PCR reaction, as expected for the intact gene.
  • a clone with inactivated serB gene was selected and treated at 42°C to remove the temperature-sensitive plasmid pKD46, rendering the strain ampicillin sensitive again.
  • the strain was named W3110- ⁇ serB::kan. 6.
  • W3110- ⁇ serB::kan was transformed with the plasmid pCP20 and transformants were selected at 30°C.
  • the 9.4 kb vector pCP20 is disclosed in Cherepanov and Wackernagel (1995), Gene 158: 9-14.
  • the vector pCP20 contains the FLP recombinase gene.
  • the FLP recombinase recognizes the FRT sequences that flank the expression cassette of the kanamycin resistance gene and causes the removal of the kanamycin expression cassette. For this purpose, the clones obtained at 30°C were incubated at 37°C.
  • W3110- ⁇ serB::kan was kanamycin sensitive again after treatment with the pCP20 plasmid, which was checked as follows: - by plating on LB-glycine and LBkan-glycine plates: growth on LB-glycine plates was positive, while no growth could be observed on LBkan-glycine plates, indicating the successful removal of the kanamycin cassette from the genome.
  • genomic DNA was isolated from the kanamycin-sensitive clones (Qiagen DNA isolation kit) and in a PCR reaction (“Phusion TM High-Fidelity” DNA polymerase, Thermo Scientific TM ) with the primers serb- 3f (SEQ ID NO: 9) and serb-4r (SEQ ID NO: 10) are used.
  • E. coli W3110 wild-type DNA yielded a DNA fragment of 1.1 kb in the PCR reaction, as expected for the intact serB gene.
  • the kanamycin-sensitive clone produced a DNA fragment of approximately 250 nt in the PCR reaction, which corresponded to the expected size of the 5' and 3' fragments of the inactivated serB gene remaining after homologous recombination.
  • the strain isolated from this step was named E. coli W3110- ⁇ serB. This strain was characterized by the fact that it contained an inactivated serB gene and that this strain was again sensitive to the antibiotic kanamycin.
  • Example 2 Production of OPS Production in a shake flask: OPS was produced by culturing the E. coli W3110- ⁇ serB strain in a shake flask. For comparison, the OPS production of the WT strain E.
  • coli W3110 was examined. As a preculture for cultivation in the shake flask, 3 ml of LB-glycine medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl, 0.1 g/L glycine) with the strains E. coli W3110 were used and E. coli W3110- ⁇ serB and incubated at 30 ° C and 135 rpm for 16 h in a shaker.
  • LB-glycine medium 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl, 0.1 g/L glycine
  • Main culture Part of the respective preculture was then placed in a 300 ml Erlenmeyer flask (with baffle) with 30 ml SM1 medium containing 15 g/L glucose, 5 mg/L vitamin B1 (Sigma-Aldrich), 0.1 g/ L of the amino acids L-isoleucine, D, L-methionine, L-threonine and 0.5 g/L glycine (all Sigma-Aldrich).
  • Composition of SM1 medium 12 g/LK 2 HPO 4 , 3 g/L KH 2 PO 4 , 5 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.3 g/L MgSO 4 x 7 H 2 O, 0.015 g/L CaCl 2 x 2 H 2 O, 0.002 g/L FeSO 4 x 7 H 2 O, 1 g/L Na 3 citrate x 2 H 2 O, 0.1 g/L NaCl; 1 ml/L trace element solution.
  • composition of the trace element solution 0.15 g/L Na 2 MoO 4 x 2 H 2 0, 2.5 g/LH 3 BO 3 , 0.7 g/L CoCl 2 x 6 H 2 0, 0.25 g/L CuSO 4 x 5 H 2 0, 1.6 g/L MnC12 x 4 H20, 0.3 g/L ZnSO4 x 7 H20.
  • the main cultures were inoculated with so much preculture that an initial cell density OD 600 / ml (optical density of Main culture, measured at 600 nm) was set at 0.3/ml each. Based on this, the 30 ml batches were incubated for 24 h at 30°C and 135 rpm.
  • the HPLC device was equipped with a fluorescence detector. The detector was set to an excitation wavelength of 330 nm and an emission wavelength of 450 nm.
  • Mobile phase A 25 mM Na phosphate, pH 6.0.
  • Mobile phase B methanol. The separation was carried out in gradient mode: 0 – 10 min, 1% - 15% mobile phase B, followed by 15 min 15% mobile phase B, at a flow rate of 1.0 ml/min.
  • OPS Retention time of L-cysteic acid: 6.95 min.
  • Retention time of OPS 7.65 min.
  • Retention time of taurine 21.9 min.
  • Preparation of OPS by fermentation OPS was prepared by fermentation of the E. coli W3110- ⁇ serB strain. Preculture 1: 20 ml of LB-glycine medium were inoculated with the strain E. coli W3110- ⁇ serB in a 100 ml Erlenmeyer flask and incubated for 7 h on a shaker (150 rpm, 32 ° C).
  • Preculture 2 The preculture 1 was then completely immersed in 100 ml SM1 medium, supplemented with 10 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, 0.3 g/LD, L-methionine, 1 g/L glycine, and 5 mg /L vitamin B1 transferred.
  • the culture was shaken in an Erlenmeyer flask (1 L volume) at 32°C for 17 h at 150 rpm (Infors chest shaker). After this incubation, the cell density OD 600 /ml was 5.7/ml.
  • Main culture The fermentation was carried out in a “DASGIP ® Parallel Bioreactor Systems for Microbiology” fermenter from Eppendorf. Culture vessels with 1.81 total volume were used.
  • the fermentation medium (600 ml) contained 10 g/L glucose, 5 g/L yeast extract, 5 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 , 5 g/L KH 2 PO 4 , 0.5 g/L NaC1, 0.225 g /L CaCl 2 x 2 H 2 O, 1.2 g/L MgSO 4 x 7 H 2 O, 0.075 g/L FeSO 4 x 7 H 2 O, 1 g/L Na 3 citrate x 2 H 2 O, 1 g/L glycine, 1 g/L L-threonine, 0.018 g/L vitamin Bl, 0.09 g/L vitamin B6 and 10 ml trace element solution (see shake flask cultivation).
  • the pH value in the fermenter was initially adjusted to 7.0 by pumping in a 25% NH 4 OH solution. During the fermentation, the pH value was kept at a value of 7.0 by automatic correction with 25% NH 4 OH or 4 MH 3 PO 4 . Foam was combated by automatically adding 4% v/v Struktol J673 in H 2 O (Schill & Seilacher). For inoculation, 60 ml of the preculture 2 were pumped into the fermenter vessel. The initial volume was therefore approximately 660 ml. The cultures were initially stirred at 400 rpm and gassed with an aeration rate of 2 vvm (vol. air per vol. culture medium per min) of compressed air that had been sterilized via a sterile filter.
  • 2 vvm vol. air per vol. culture medium per min
  • the oxygen probe was calibrated to 100% saturation before inoculation.
  • the target value for O2 saturation during fermentation was set to 30%. After the O 2 saturation fell below the target value, a regulation cascade was started to bring the O 2 saturation back to the target value.
  • the gas supply was continuously increased (to a maximum of 5 vvm) and then the stirring speed was continuously increased (to a maximum of 1,600 rpm).
  • the fermentation was carried out at a temperature of 32°C. As soon as the glucose content in the fermenter had dropped from the initial 10 g/L to approx. 2 g/L, a 56% (w/w) glucose solution was continuously added. The feeding rate was adjusted so that the glucose concentration in the fermenter no longer exceeded 2 g/L.
  • the glucose determination was carried out using a glucose analyzer from YSI (Yellow Springs, Ohio, USA). 23 h after the start of fermentation, the fermentation mixture was topped up with 3.5 ml of a 200 g/L glycine solution in H 2 O. The fermentation time was 53 h. 23 h, 30 h, 47 h and 53 h after the start of the fermentation, samples were taken from the fermentation mixture and the cell density OD 600 /ml was determined from an aliquot. Another aliquot was incubated at 80°C for 5 min, centrifuged and the OPS content of the cell culture supernatant was determined by HPLC. Cell density and OPS content are summarized in Table 2.
  • Table 2 Time course of cell density and OPS content in the fermentation of the E. coli W3110- ⁇ serB strain
  • Example 3 Production of CSma enzyme Cysteate synthase from Methanosarcina acetivorans (CSma) was used. The amino acid sequence of the CSma enzyme is accessible in the NCBI database under accession ID WP_048066469. Out of From the amino acid sequence, a DNA sequence codon-optimized for expression in E. coli was derived (publicly available Eurofins Genomics GENEius software) and produced synthetically (Eurofins Genomics).
  • the synthetically produced DNA had the sequence disclosed in SEQ ID NO: 3 and contained the cds of the gene, hereinafter referred to as CSma-cds (SEQ ID NO: 3), encoding a protein with the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 4 and referred to as CSma.
  • the synthetically produced DNA contained an EcoRI site at the 5' end and a HindIII site at the 3' end.
  • the expression vector pKKj disclosed in EP2670837A1 (Wacker application), is a derivative of the expression vector pKK223-3.
  • the DNA sequence of pKK223-3 is disclosed in the GenBank gene database under accession number M77749.1. Approximately 1.7 kb was removed from the 4.6 kb plasmid (bp 262 - 1947 of the DNA sequence disclosed in M77749.1), creating the 2.9 kb expression vector pKKj.
  • the vector pCSma-pKKj was transformed in a known manner into the E. coli K12 JM105 strain.
  • the E. coli K12 JM105 strain is available for purchase under the strain number DSM 3949 from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH. Transformation clones were selected on LBamp plates. LBamp contained 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 15 g/L agar, and 100 mg/L ampicillin (Sigma-Aldrich). One clone was selected and cultured in a shake flask. The CSma producing strain was named E.
  • coli JM105 x pCSma-pKKj The expression of the CSma-cds was carried out in E. coli JM105 x pCSma-pKKj in a known manner under the control of the IPTG-inducible tac promoter (IPTG: isopropyl-ß-thiogalactoside, Sigma-Aldrich) which is functionally linked to the CSma-cds.
  • IPTG isopropyl-ß-thiogalactoside, Sigma-Aldrich
  • Cultivation in a shake flask A preculture of the E. coli JM105 x pCSma-pKKj strain was prepared in LBamp medium (cultivation at 37°C and 120 rpm overnight, Infors chest shaker).
  • Two ml of preculture (OD 600 3.4 / ml) were used as inoculum of a main culture (0.3 L Erlenmeyer flask) of 50 ml SM1 medium (Example 2), supplemented with 15 g / L glucose; 5 g/L peptone (oxoid); 2.5 g/L yeast extract; 0.005 g/L vitamin B1 (Sigma-Aldrich); 5 mg/L pyridoxal phosphate (PLP, Sigma-Aldrich) and 100 mg/L ampicillin, used.
  • the main culture was shaken in a chest shaker (Infors) at 30°C and 140 rpm. After 4 h of incubation, a cell density OD 600 of 2.0 was achieved.
  • the inducer IPTG (Sigma-Aldrich, 0.4 mM final concentration) was added and cultivation continued for another 20 h in a chest shaker (Infors) at 30 ° C and 140 rpm. At the end of the cultivation, the cell density OD 600 was 3.1/ml.
  • the cells from the shake flask culture were isolated by centrifugation (10 min 15,000 rpm, Sorvall centrifuge RC5C, equipped with an SS34 rotor). To prepare a cell suspension, the cell pellet was cultured from 50 ml of shake flask in 2 ml of 100 mM K-phosphate, pH 7.0; 100 mM KCl (KPi7.0 buffer) was added and used to prepare a cell homogenate.
  • a cell homogenate was produced using the FastPrep-24TM 5G cell homogenizer from MP Biomedicals as described in Example 2.
  • the cell homogenate obtained (2 ml volume) was used without further processing for the biotransformation of OPS to L-cysteic acid (Example 5).
  • the protein content of the cell homogenate was determined with a Qubit 3.0 fluorometer from Thermo Fisher Scientific using the “Qubit ® Protein Assay Kit” according to the manufacturer's instructions.
  • the protein content of the cell homogenate from shake flask cultivation was 5.3 mg/ml.
  • Example 4 Production of L-cysteic acid from commercially available OPS and Na2SO3 by biotransformation with CSma enzyme
  • Approach 1 8.15 ml of KPi7.0 buffer were placed in a 100 ml Erlenmeyer flask and 1 ml of one in succession 0.2 M solution of Na 2 SO 3 in KPi7.0 buffer buffer, 0.5 ml CSma cell homogenate from shake flask cultivation (Example 3) and 350 ⁇ l of a 0.2 M solution of OPS (Sigma-Aldrich) in KPi7 .0 buffer added. The batch volume was 10 ml.
  • Batch 2 The batch (comparison batch without Na 2 SO 3 ) had the same composition as batch 1.
  • Table 3 Time course of the production of L-cysteic acid by biotransformation of OPS and Na 2 SO 3 with CSma-containing cell homogenate
  • Example 5 Production of L-cysteic acid from OPS-containing culture supernatant from shake flask cultivation and Na2SO3 by biotransformation with CSma enzyme. 9 ml of cell culture supernatant from shake flask cultivation of the strain E.
  • coli W3110- ⁇ serB (Example 2) were added to a 100 ml Erlenmeyer flask an OPS content of 113.6 mg/L and 0.3 ml 3 M KCl, 0.5 ml 0.2 M Na 2 SO 3 in KPi7.0 buffer and 1 ml CSma cell homogenate from the shake flask culture (Example 3) admitted.
  • the batch volume was 10.8 ml.
  • the batch was incubated in a chest shaker (Infors) at 30 ° C and 140 rpm.
  • the molar yield of L-cysteic acid was 97.6%
  • Table 4 Time course of the production of L-cysteic acid from cell culture supernatant containing OPS and Na 2 SO 3 by catalysis with cell homogenate containing CSma
  • Example 6 Preparative production of L-cysteic acid by biotransformation of OPS at constant pH OPS substrate: 10 ml of fermenter broth from the fermentation of the E.
  • coli W3110- ⁇ serB strain (Example 2) were centrifuged (10 min 15,000 rpm, Sorvall centrifuge RC5C , equipped with an SS34 rotor) and the OPS content in the fermentation supernatant was determined by HPLC. The OPS content was 5.6 g/L.
  • CSma homogenate Cell homogenate of the E. coli JM105 x pCSma-pKKj strain was prepared from 2 x 50 ml shake flask culture as described in Example 3. The homogenate was supplemented with 15 ⁇ l 500 mg/L PLP. The total volume of the homogenate was 4 ml.
  • Biotransformation approach A double-walled, conically tapering 50 ml thermostatable reaction vessel (accessory for the titrator TitroLine alpha, Schott) was connected to a thermostat (Lauda) via a hose connection and heated to 30 ° C.
  • the reaction mixture contained 6 ml of OPS-containing fermentation supernatant with an OPS content of 5.6 g/L, 4 ml of CSma homogenate, 0.2 ml of 3 M KCl, 0.1 ml of 0.1 M DTE (dithioerythrol, sigma- Aldrich), and 0.3 ml of a 1 M solution of Na 2 SO 3 in KPi7.0 buffer.
  • the batch volume was 10.6 ml.
  • the OPS concentration in the batch was 17.1 mM (0.18 mmol OPS in 10.6 ml batch volume).
  • the batch was stirred with a magnetic stirrer.
  • the approach was further equipped with a pH electrode (Mettler Toledo), which was connected to a pH control unit (Titrator TitroLine alpha, Schott), which was operated in pH-Stat mode according to the manufacturer's specifications.
  • the pH in the reaction vessel was kept constant at the set pH 7.0 throughout the entire duration of the reaction by adding 0.5 M NaOH from a burette connected to the control unit.
  • the reaction time was 4 hours.
  • coli CSADcc gene The mRNA-derived cDNA sequence of the cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD) from Cyprinus carpio (carp) is in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) under the Genbank Sequence ID: AB220585.1 (cds: nt 82 - 1584).
  • a DNA sequence codon-optimized for expression in E. coli was derived from the corresponding amino acid sequence (publicly available Eurofins Genomics GENEius software) and produced synthetically (Eurofins Genomics).
  • the synthetically produced DNA had the sequence disclosed in SEQ ID NO: 5 and contained the cds of the gene, hereinafter referred to as CSADcc-cds (SEQ ID NO: 5, nt 31 - 1530), encoding a protein with the in SEQ ID NO: 6 disclosed amino acid sequence and referred to as CSADcc.
  • the synthetically produced DNA contained an EcoRI site at the 5' end (SEQ ID NO: 5, nt 25 to 30) and a HindIII site at the 3' end (SEQ ID NO: 5, nt 1532 to 1537).
  • Vector pCSADcc-pKKj To produce the vector pCSADcc-pKKj (FIG.
  • the synthetically produced DNA was cut with EcoRI and HindIII and converted in a known manner as an EcoRI / HindIII fragment into the one with EcoRI and HindIII cut vector pKKj (see Example 3) cloned. This resulted in the vector pCSADcc-pKKj.
  • the vector pCSADcc-pKKj was transformed in a known manner into the E. coli K12 JM105 strain. Transformation clones were selected on LBamp plates. One clone was selected and cultured in a shake flask.
  • the strain producing CSADcc was named E. coli JM105 x pCSADcc-pKKj.
  • the expression of the CSADcc-cds was carried out in E. coli JM105 x pCSADcc-pKKj analogously to that described in Example 3 for E. coli JM105 x pCSma-pKKj by cultivation in a shake flask.
  • Cultivation in a shake flask 10 ml of a preculture (OD 600 3.1/ml) were used as inoculum of a main culture (1 L Erlenmeyer flask) of 100 ml SM1 medium, supplemented with 15 g/L glucose; 5 g/L peptone; 2.5 g/L yeast extract; 0.005 g/L vitamin B1; 5 mg/L pyridoxal phosphate and 100 mg/L ampicillin, used. Cultivation and induction of the main culture was carried out as in Example 3 described.
  • Example 8 Production of Taurine from L-Cysteic Acid by Biotransformation 9 ml of the mixture from Example 5 with a content of 84.5 mg/L L-cysteic acid (Table 4) were placed in a 100 ml Erlenmeyer flask and 1 ml of cell suspension of the CSADcc- Enzyme from Example 7 added. The batch volume was 10 ml. The batch was incubated in a chest shaker (Infors) at 37 ° C and 140 rpm.
  • Example 9 Production of taurine from OPS by biotransformation 9 ml of a mixture from shake flask cultivation of the strain E.
  • coli W3110- ⁇ serB (Example 2) containing 94.7 mg/L OPS were placed in a 100 ml Erlenmeyer flask and 0 .5 ml of a 0.2 M solution of Na 2 SO 3 in KPi7.0 buffer buffer, 1 ml of CSma cell homogenate from shake flask cultivation (Example 3) and 1 ml of cell suspension of the CSADcc enzyme (Example 7) were added.
  • the batch volume was 11.5 ml.
  • the batch was incubated in a chest shaker (Infors) at 30 ° C and 140 rpm.
  • bla gene that confers resistance to ampicillin (ß-lactamase) kanR: gene that confers resistance to kanamycin
  • kanR gene that confers resistance to kanamycin
  • ORI origin of replication pr-1: binding site 1 for primer pr-2 : Binding site 2 for primers
  • FRT1 Recognition sequence 1 for FLP recombinase
  • FRT2 Recognition sequence 2 for FLP recombinase araC: araC gene (repressor gene)
  • P araC promoter of the araC gene
  • P araB promoter of the araB gene
  • Gam lambda phage
  • Bet Lambda Phage Bet recombination gene
  • Exo Lambda Phage Exo recombination gene
  • ORI101 Temperature-sensitive replication origin
  • RepA Gene for the plasmid replication protein
  • Ptac tac Promoter
  • EcoRI Interface for the restriction enzyme
  • EcoRI HindIII Interface for the restriction enzyme

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure umfassend die Reaktion von O-Phospho-L-Serin (OPS) mit einem Salz der schwefligen Säure (Sulfit) und einer zur Enzymklasse EC 2.5.1.76 zählenden Cysteatsynthase (CS-Enzym) in einer Biotransformation. Die erfindungsgemäß hergestellte L-Cysteinsäure kann zu Taurin decarboxyliert werden. Die Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung der hergestellten L-Cysteinsäure zur Herstellung von Taurin.

Description

Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure und dessen Verwendung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L- Cysteinsäure umfassend die Reaktion von O-Phospho-L-Serin (OPS) mit einem Salz der schwefligen Säure (Sulfit) und einer zur Enzymklasse EC 2.5.1.76 zählenden Cysteatsynthase (CS- Enzym) in einer Biotransformation. Die erfindungsgemäß hergestellte L-Cysteinsäure kann zu Taurin decarboxyliert werden. Die Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung der hergestellten L-Cysteinsäure zur Herstellung von Taurin. L-Cysteinsäure ((R)-2-Amino-3-Sulfopropionsäure, 3-Sulfo-L- Alanin, CAS 498-40-8) ist eine nicht-proteinogene L- Aminosäure, die in der Natur als Oxidationsprodukt der proteinogenen Aminosäure L-Cystein, z.B. in Schafwolle nachgewiesen werden kann. Cysteinsäure ist auch ein Zwischenprodukt der Coenzym M Biosynthese (CoM, 2- Mercaptoethansulfonsäure, CAS 3375-50-6) methanogener Archaebakterien. Der Biosyntheseweg von L-Cysteinsäure in methanogenen Bakterien geht aus von O-Phospho-L-Serin (OPS, L- Serin-O-Phosphat, L-2-Amino-3-Hydroxypropionsäure-3-Phosphat, CAS 407-41-0), das in einer durch eine Cysteatsynthase (CS- Enzym) katalysierten Reaktion mit Sulfit zu L-Cysteinsäure reagiert, nach Gleichung (1): (1) OPS + SO3 2- -> L-Cysteinsäure + HPO42- Graham et al., Biochem. J. (2009) 424: 467-478 beschreiben, dass für ein mit Threoninsynthasen verwandtes Gen aus Methanoscarcina acetivorans, das rekombinant in E. coli produziert und als enzymatisch inaktives Protein in sog. inclusion bodies (Proteinaggregate als Einschlusskörperchen) angereichert wird, nachweisbare Enzymaktivität erst nach aufwendiger Renaturierung der inclusion bodies messbar ist. Nach Renaturierung konnte nachgewiesen werden, dass in analytischen Tests (HPLC und Massenspektroskopie) mit dem renaturierten Protein L-Cysteinsäure aus der Reaktion von käuflich erhältlichem (chemisch synthetisiertem) OPS und Sulfit nach Gleichung (1) entsteht. Mit diesen Untersuchungen wurde dem renaturierten Protein aus M. acetivorans die Aktivität einer Cysteatsynthase zugewiesen sowie dessen genetische Verwandtschaft zu Threoninsynthasen festgestellt. L-Cysteinsäure kann chemisch hergestellt werden, z.B. durch Oxidation von Cystein mit Chlor in alkoholischer Lösung, mit Brom in HCl oder Jod-HCl in DMSO oder durch oxidative Spaltung von Cystin. Des Weiteren kann L-Cysteinsäure auch durch Oxidation von L-Cysteinsulfinsäure hergestellt werden. Die bekannten, nicht als nachhaltig anzusehenden Verfahren zur chemischen Herstellung von L-Cysteinsäure benutzen umweltgefährdende Chemikalien und besitzen beim Verbraucher geringe Akzeptanz, insbesondere bei Anwendungen im Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmabereich. Mögliche Verwendung findet L-Cysteinsäure z.B. in der Fischzucht oder im Kosmetikbereich, z.B. als Inhaltsstoff von Regu®-Slim (DSM) für die Hautpflege. In der Peptidchemie findet L-Cysteinsäure Verwendung als wasserlösliche Schutzgruppe. L-Cysteinsäure kann darüber hinaus durch Decarboxylierung zu Taurin umgewandelt werden. Graham et al. (2009, s.o.) hat gezeigt, dass in E. coli das CS-Enzym mit einem Molekulargewicht von 44 kDa bei heterologer Expression nicht in aktiver Form produziert, sondern nur in inaktiver Form in inclusion bodies angereichert wird. Die Solubilisierung der inclusion bodies und Rückfaltung zum aktiven Enzym führte zu einer sehr geringen Ausbeute von 3 mg rückgefaltetem Protein je L E. coli-Kultur und war damit für ein präparatives Biotransformationsverfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure im industriellen Maßstab nicht geeignet. Ohne Rückfaltung war in Graham et al. (2009, s.o.) Enzymaktivität nur nachweisbar, wenn das CS-Enzym als 103 kDa großes CS-Fusionsprotein exprimiert wurde, wobei sowohl Enzymausbeute als auch spezifische Enzymaktivität von 0,015 U/mg Protein sehr gering waren. Dieser Stand der Technik zeigt, dass aktives CS-Enzym in E. coli nur mit großem Aufwand in einem kostspieligen Verfahren und mit geringen Ausbeuten herstellbar ist. Joo et al. (2018), J. Agric. Food Chem. 66: 13454 – 13463, beschreiben in einem Metabolic Engineering Ansatz einen gentechnisch veränderten und für die Schwefelverwertung optimierten Stamm des Bakteriums Corynebakterium glutamicum zur Herstellung von Taurin, bei dem das CS-Gen aus M. acetivorans zum Einsatz kam. Für das in C. glutamicum exprimierte Gen wurde durch Enzymtests die CS-Aktivität analytisch nachgewiesen. Auf die Aktivität des CS-Enzyms in Taurin-produzierenden Stämmen wurde indirekt geschlossen. Wie in Fig. S2 der „Supporting Information“ zu Joo et al. (2018, s.o.) dargestellt, häufen CS-exprimierende C. glutamicum Zellen OPS, das Substrat der CS-Reaktion, und daneben Serin, Cystein und Taurin vorwiegend intrazellulär an. Es wurden keine Angaben über die Produktion von L-Cysteinsäure gemacht. Joo et al. (2018, s.o.) zeigt, dass das gleichzeitige Vorhandensein von OPS und CS-Enzym in einer Zelle nicht für die effektive Produktion von L-Cysteinsäure ausreicht, auch wenn im gleichen Stamm die intrazelluläre Produktion anderer Schwefel-haltiger Verbindungen wie Cystein und Taurin mit messbaren Ausbeuten erfolgt. Tevatia et al., Algal Research (2015) 9: 21-26, beschreiben die natürliche Produktion von Taurin in Mikroalgen, wobei als Zwischenprodukt auch L-Cysteinsäure nachgewiesen wurde. Wie in Fig. 1 von Tevatia et al. (2015, s.o.) beschrieben, führt in Algen ein Biosyntheseweg von L-Serin zu L-Cysteinsäure („Cysteate“ in Fig. 1). Der Syntheseweg beinhaltet jedoch nicht die enzymatische Reaktion eines CS-Enzyms nach Gleichung (1). Keiner der beschriebenen Biosynthesewege führt über OPS zu L-Cysteinsäure. Der intrazelluläre L-Cysteinsäure-Gehalt war sehr gering und begleitet von mehreren, eine Aufarbeitung erschwerenden Nebenprodukten wie Methionin, Cystein, Cysteinsulfinsäure, Hypotaurin und Taurin, sodass sich die Anzucht von Mikroalgen nicht für die Produktion von L- Cysteinsäure eignet. US 2019/0062757A1 (KnipBio) beschreibt in einem Metabolic Engineering Ansatz heterologe Produktionsstämme zur Herstellung von Taurin oder seiner Vorläufersubstanzen. Es wurden Stämme beschrieben, die in verschiedenen Konfigurationen das CS-Enzym und andere biosynthetische Gene aus dem Taurin-Stoffwechsel exprimieren. Die erzielten Ausbeuten für Hypotaurin und Taurin waren mit max. 419 ng/ml sehr gering. Ausbeuten für die Produktion von L-Cysteinsäure wurden nicht genannt. In diesem Stand der Technik wurden CS- Genkonstrukte verwendet, aber kein Enzymassay zum Nachweis der CS-Enzymaktivität durchgeführt. Es wurde weiterhin nicht gezeigt, dass mit diesem Ansatz des Metabolic Engineering L- Cysteinsäure biotechnologisch in präparativen Mengen herstellbar ist. Ebenso wurde nicht offenbart, ob die im Dokument beschriebenen Stämme zur Produktion von OPS oder CS- Enzym geeignet sind, um sie in einer Biotransformation zur Herstellung von L-Cysteinsäure nach Gleichung (1) einzusetzen. Steinfeld et al., ACS Chem. Biol. (2014) 9: 1104-1112 beschreiben die verstärkte intrazelluläre Produktion von OPS in einem E. coli-Stamm mit deletiertem serB-Gen. Eine verstärkte extrazelluläre Produktion von OPS wurde nicht beschrieben (siehe Fig. 5 in Steinfeld et al.). EP 2444 481 B1 der CJ CheilJedang Corporation (KR) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Cystein, wobei ein Stamm mit reduzierter SerB-Aktivität zur Herstellung von OPS eingesetzt wird, das anschließend in einer enzymatisch katalysierten Reaktion mit Sulfid oder Thiosulfat zu L-Cystein umgesetzt wird. Von der dabei verwendeten Enzymklasse der O- Phosphoserin-Sulfhydrylasen (OPSS, EC 2.5.1.65) ist nicht bekannt, dass sie im Sinne eines CS-Enzyms auch Sulfit als Substrat verwerten können. Tatsächlich untersuchen Steiner et al. J. Bacteriol. (2014), 196: 3410-3420 den Reaktionsmechanismus des OPSS-Enzyms aus Mycobacterium tuberculosis und finden, dass sich im Gegensatz zu Na2S (Sulfid) und Na2S2O3 (Thiosulfat) Salze der schwefeligen Säure, wie Na2S2O5 und Na2SO3 nicht als S-Donoren für die Reaktion mit einer Enzym-gebundenen Aminoacrylat-Zwischenstufe eignen, wobei die Aminoacrylat-Zwischenstufe aus der Bindung von OPS an das OPSS-Enzym unter Abspaltung von Phosphat stammte (siehe Fig. 2 in Steiner et al., 2014, s.o.). EP 2444 481 B1 offenbart somit die auch aus Steinfeld et al. (2014, s.o.) bekannte Inaktivierung des serB-Gens zur Herstellung von Stämmen, welche dann OPS produzieren. Das OPS konnte dann in einer Biotransformation mit OPSS-Enzymen zur Herstellung von Cystein eingesetzt werden. Der Stand der Technik kennt die biotechnologische Herstellung von OPS. Der Stand der Technik bietet jedoch kein Herstellungsverfahren für das CS-Enzym, das geeignet wäre, CS- Enzym in ausreichender Aktivität für ein bisher nicht bekanntes industriell anwendbares Verfahren der Biotransformation von OPS mit einem Sulfit bereit zu stellen, bei der L-Cysteinsäure im präparativen Maßstab für die weitere Verwendung hergestellt wird. Daher besteht Bedarf an einem umweltschonenden und nachhaltigen Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure im präparativen Maßstab, wofür sich ein biotechnologisches Verfahren anbietet. Mit dem von Konsumentenwünschen beförderten Trend weg von chemisch hergestellten Inhaltsstoffen war ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure durch Biotransformation, das für den Einsatz im industriellen Maßstab geeignet ist, Ziel der Erfindung. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, anstelle eines chemischen Verfahrens und unter Umgehung eines durch Metabolic Engineering erzeugten L-Cysteinsäure-Produktionsstammes ein industriell anwendbares Verfahren zur kostengünstigen Herstellung von L-Cysteinsäure durch Biotransformation von OPS bereitzustellen und die so hergestellte L-Cysteinsäure in der weiteren Verwendung einzusetzen, z.B. zur Herstellung von Taurin. Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure umfassend die Reaktion von O-Phospho-L- Serin (OPS) mit einem Salz der schwefligen Säure (Sulfit) und einer zur Enzymklasse EC 2.5.1.76 zählenden Cysteatsynthase (CS-Enzym) in einer Biotransformation. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Herstellverfahren wie folgt unterschieden: 1. Chemische Verfahren 2. Biotechnologische Verfahren: a) durch Metabolic Engineering Metabolic Engineering (auch „Pathwaydesign“ genannt) ist im Gegensatz zur Biotransformation eine Methode der Biotechnologie, bei der Stoffwechselwege eines Organismus durch Optimierung bzw. Veränderung genetischer und regulatorischer Prozesse verändert werden. Dabei können durch Ergänzung des Genoms mit Genen von Enzymen neue oder veränderte Enzyme in einen Organismus eingeführt bzw. Gene endogener Enzyme verstärkt oder abgeschwächt exprimiert werden und dadurch neue Stoffwechselwege in einem Organismus etabliert oder bestehende Stoffwechselwege verstärkt oder abgeschwächt werden. Ziel des Metabolic Engineering ist, dass der Organismus ein Stoffwechselprodukt entweder neu oder ein zelleigenes Stoffwechselprodukt mit erhöhter Ausbeute produziert. In ein Metabolic Engineering-Verfahren werden keine für das Stoffwechselprodukt spezifischen Ausgangsstoffe wie ein Enzymsubstrat, wie z.B. OPS in der vorliegenden Erfindung, eingesetzt, sondern lediglich ein Nährstoffmedium, welches für das Wachstum des betreffenden Organismus erforderlich ist und zusammengesetzt ist aus einer C-Quelle (z.B. Glucose), einer N-Quelle (z.B. ein Ammoniumsalz oder ein komplexes Aminosäuregemisch wie z.B. Pepton oder Hefeextrakt) und weiteren für das Wachstum erforderlichen Salzen. Solche Nährstoffmedien sind dem Fachmann aus der mikrobiologischen Praxis bekannt. b) durch Biotransformation Biotransformation ist definiert als Überführung eines oder mehrerer Edukte in ein Produkt unter enzymatischer Katalyse, wobei das Enzymsubstrat mit dem Enzym in einen Reaktionsansatz gegeben wird. Im Reaktionsansatz wird das zugesetzte Enzymsubstrat, wie in der vorliegenden Erfindung OPS, enzymatisch umgesetzt, in der vorliegenden Erfindung durch ein Enzym ausgewählt aus der Klasse der Cysteatsynthasen (CS-Enzym, EC 2.5.1.76) in Gegenwart eines Salzes der schwefligen Säure. Das oder die Edukte können dabei aus chemischer oder biotechnologischer Herstellung stammen. Das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte OPS kann z.B. aus chemischer Synthese oder aus biotechnologischer Produktion durch Anzucht eines Produktionsstammes stammen. Das für die enzymatische Katalyse eingesetzte Enzym stammt bevorzugt aus biotechnologischer Herstellung durch Fermentation eines Produktionsstammes aus der Familie der Enterobacteriaceae, der das CS-Enzym heterolog exprimiert. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass es sich beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von L- Cysteinsäure aus OPS und Sulfit mit Hilfe des CS-Enzyms um ein Biotransformationsverfahren handelt. Das bedeutet, dass dieses eine sehr gezielte, spezifische Reaktion darstellt und z.B. keine aufwendigen Kulturschritte oder Aufreinigungsschritte aus einer Mikrorganismenkultur erfordert. Darüber hinaus können mit der Biotransformation durch Optimierung der Reaktionsbedingungen sowie der Einsatzmenge der Edukte und des Enzyms einfach hohe Raum-Zeitausbeuten erzielt werden, was durch Stammoptimierung beim Metabolic Engineering ungleich schwieriger ist. Insgesamt ist das erfindungsgemäße Verfahren wirtschaftlich einfach umsetzbar und kontrollierbar. Die erfindungsgemäße Reaktion (1) wird katalysiert durch das zur Enzymklasse EC 2.5.1.76 zählende Enzym Cysteatsynthase (CS-Enzym). Als CS-Enzym in enzymatisch aktiver Form wird ein Protein bezeichnet, das in der Lage ist, die Synthese von L- Cysteinsäure aus OPS und einem Salz der schwefligen Säure wie im folgenden CS-Enzym-Aktivitätstest beschrieben zu katalysieren. Der CS-Enzym-Aktivitätstest kann wie folgt durchgeführt werden: i) Ein durch Anzucht im Schüttelkolben oder in einer Fermentation produziertes CS-Enzym kann wie folgt in die Reaktion eingesetzt werden: - als ein Aliquot aus der nicht weiter aufgearbeiteten Kulturbrühe oder - als ein Aliquot der Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen aus der Kulturbrühe, z.B. durch Zentrifugation oder - in Form eines Aliquots des Zellhomogenats a) nach mechanischem Aufschluss der Zellsuspension oder b) in Form chemisch permeabilisierter Zellen (z.B. durch Chloroform) oder - als Zellextrakt nach Abtrennung partikulärer Bestandteile aus dem Zellhomogenat oder - als z.B. chromatographisch gereinigtes Enzym. Die jeweils erhaltene Gesamtproteinkonzentration kann z.B., wie im Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung beschrieben, mit einem Qubit 3.0 Fluorometer der Fa. Thermo Fisher Scientific unter Einsatz des „Qubit® Protein Assay Kits“ nach Angaben des Herstellers bestimmt werden. ii) In einer mit Kaliumphosphat auf pH 7 gepufferten Lösung werden OPS (10 mM Endkonzentration) und Na-Sulfit (20 mM Endkonzentration) vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe des CS-Enzyms gestartet. Das Ansatzvolumen des Tests beträgt 10 ml. Die Temperatur, bei der der Test durchgeführt wird, beträgt 30°C. Die Menge des eingesetzten CS-Enzyms ist abhängig vom Reinigungsgrad. Werden Kulturbrühe, Zellsuspension der reisolierten Zellen oder Zellhomogenat verwendet, werden mindestens 0,1 mg der in i) hergestellten Enzymfraktionen eingesetzt. Im Falle von gereinigtem CS-Enzym werden mindestens 10 µg der gereinigten Enzymfraktion eingesetzt. 1 h, 2 h und 4 h nach Start der Reaktion werden je 1 ml des Testansatzes entnommen, 10 min zentrifugiert und der Gehalt an OPS und L-Cysteinsäure durch kalibrierte HPLC bestimmt (siehe Beispiel 4), wobei die zur Kalibrierung verwendeten Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich sind (Sigma- Aldrich). Das erfindungsgemäße Verfahren ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym durch Anzucht eines Mikroorganismenstamms der Familie der Enterobacteriaceae hergestellt wird, wobei es bevorzugt ist, dass die das CS- Enzym kodierende cds im Mikroorganismenstamm der Familie der Enterobacteriaceae heterolog und besonders bevorzugt in enzymatisch aktiver Form exprimiert wird. Unter heterologer Expression versteht man die Expression der cds eines Gens oder der cds eines Teils eines Gens in einem Wirtsorganismus, der dieses Gen oder Genfragment von Natur aus nicht besitzt. Die Einbringung der cds des heterologen Gens in den Wirtsorganismus umfasst die Verwendung rekombinanter DNS- Technologie. Dabei kann die cds des heterologen Gens in den Wirtsorganismus eingebracht werden durch Integration in dessen Genom oder extrachromosomal in Form eines autonom replizierenden Genkonstrukts (Plasmid, Vektor). Bevorzugt ist das Einbringen der cds des heterologen Gens in den Wirtsorganismus in Form eines autonom replizierenden Genkonstrukts (Plasmid, Vektor). Abhängig davon, durch welches genetische Element (Promotor) die Expression der cds des heterologen Gens gesteuert wird, unterscheidet man konstitutive Expression und induzierte Expression. Bei der konstitutiven Expression ist die Genexpression während aller Phasen der Zellkultivierung aktiv (nicht reguliert). Bei der induzierten Expression (reguliert) wird die Genexpression durch Zugabe eines Induktormoleküls zur Zellkultur stimuliert, wie z.B. des Induktormoleküls IPTG zur Induktion des tac-Promotors in den Beispielen 3 und 7 der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt ist die induzierte Expression, bei der die Genexpression durch Zugabe eines Induktormoleküls zur Zellkultur stimuliert wird. Die homologe Expression hingegen bezieht sich auf die Überexpression der cds eines Gens in einem Wirtsorganismus, aus dessen Genom dieses Gen ursprünglich stammt. Ein heterolog exprimiertes Protein, wenn es sich z.B. um ein Enzym handelt, kann in enzymatisch aktiver Form vorliegen oder sich in enzymatisch inaktiver Form z.B. in inclusion bodies anreichern. Heterologe Expression des CS-Enzyms in enzymatisch aktiver Form bedeutet dementsprechend, dass i) die cds des für das CS- Enzym codierenden Gens, das in den Wirtsstamm eingebracht wird, im Genom des Wirtsstamms nicht codiert wird, ii) mindestens die cds des für das CS-Enzym codierenden Gens durch rekombinante DNS-Technologie im Genom des Wirtsorganismus chromosomal integriert oder bevorzugt extrachromosomal durch einen autonom replizierenden Vektor in den Wirtsorganismus eingebracht wird und iii) dass von dieser cds ein CS-Enzym in enzymatisch aktiver Form exprimiert wird. Besonders bevorzugt wird das heterolog exprimierte CS-Enzym vom Mikroorganismenstamm in enzymatisch aktiver Form exprimiert. Das bedeutet, dass von der heterolog eingebrachten cds ein CS-Enzym exprimiert wird, das nach der Proteinbiosynthese und gegebenenfalls posttranslationalen Modifikation, wie z.B. des Einbaus eines Cofaktors wie Pyridoxalphosphat im Falle des CS-Enzyms (siehe Eintrag in der KEGG Enzymdatenbank unter der Eintragsnummer EC2.5.1.76) im Mikroorganismus in enzymatisch aktiver Form vorliegt. In enzymatisch aktiver Form exprimiert schließt aus, dass das Protein zuerst als inaktives Protein in inclusion bodies produziert wird und erst nach Renaturierung in enzymatisch aktiver Form vorliegt. Zusammengefasst ist das Verfahren in einer speziell bevorzugten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym durch Anzucht eines Mikroorganismenstamms der Familie der Enterobacteriaceae, der das CS-Enzym heterolog und in enzymatisch aktiver Form exprimiert, hergestellt wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Reaktionsansatz definiert als eine Mischung aus Edukt (Ausgangsstoff), Enzym und ggf. weiteren Reaktanden, bei dem das Edukt in ein Produkt überführt wird. Die Ausbeute der Reaktion im Sinne der Erfindung ist definiert als die Menge des eingesetzten Edukts, welches unter Reaktionsbedingungen zum Produkt umgewandelt wird. Die Ausbeute kann angegeben werden als absolute Ausbeute des Produkts (mmol oder g), als Volumenausbeute in absoluter, auf das Volumen bezogene Menge Produkt (mM oder g/L) oder als relative Ausbeute von Produkt in Prozent des eingesetzten Edukts (unter Berücksichtigung der Molekulargewichte des Edukts und des Produkts), auch bezeichnet als prozentuale Ausbeute. Im Rahmen dieser Erfindung fallen unter den Begriff Anzucht bzw. synonym Kultur von Mikroorganismenzellen sowohl Kulturverfahren im Schüttelkolben als auch fermentative Verfahren. Das für die Anzucht bzw. Kultur der Mikroorganismen verwendete Medium wird als Anzucht-, Kulturmedium oder im Falle der Fermentation auch Fermentationsmedium bezeichnet. Durch Anzucht/Kultur/Fermentation des Produktionsstamms im Anzucht-, Kultur-, bzw. Fermentationsmedium entsteht die Kulturbrühe/Fermenterbrühe. Die Kulturbrühe/Fermenterbrühe besteht aus der Biomasse der Zellen des Produktionsstamms und dem von der Biomasse befreiten Kulturüberstand/ Fermentationsüberstand, der sich im Verlauf der Anzucht aus dem Anzuchtmedium und den von den Zellen sekretierten Stoffwechselprodukten gebildet hat. Fermentation ist ein Verfahrensschritt zur Herstellung (Kultivierung) von Zellkulturen im technischen Maßstab (Produktionsmaßstab), bei dem ein bevorzugt mikrobieller Produktionsstamm unter definierten Bedingungen von Kulturmedium, Temperatur, pH, Sauerstoffzufuhr und Mediumdurchmischung zum Wachstum gebracht wird. Ziel der Fermentation ist, abhängig von der Konfiguration (genetischen Ausstattung) des Produktionsstammes, die Produktion eines Proteins/Enzyms oder eines Stoffwechselprodukts, jeweils mit möglichst hoher Ausbeute für die weitere Verwendung. Die Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens, OPS und CS- Enzym, können durch Fermentation hergestellt werden. Endprodukt der Fermentation ist eine Fermenterbrühe, bestehend aus der Biomasse der Zellen des Produktionsstammes (Fermenterzellen) und dem von der Biomasse befreiten Fermentationsüberstand, der sich im Verlauf der Fermentation aus dem Anzuchtmedium und den von den Fermenterzellen sekretierten Stoffwechselprodukten gebildet hat. Die Zielprodukte der Fermentation können sich in den Fermenterzellen oder im Fermentationsüberstand befinden. So findet sich OPS im Fermentationsüberstand wieder, während sich das CS-Enzym in den Fermenterzellen wiederfindet. Zur Kultivierung von Mikroorganismen im Labormaßstab dient die Schüttelkolbenanzucht, im Gegensatz zum Produktionsmaßstab durch Fermentation. Zwar wird auch bei der Schüttelkolbenkultur ein bestimmtes Medium und ein pH vorgegeben und in Gegenwart von Sauerstoff und unter permanenter Bewegung (Schütteln) kultiviert, aber definiertere Bedingungen betreffend das Medium, Temperatur, pH, Sauerstoffzufuhr und Mediumsdurchmischung lassen sich im Fermenter einstellen und regulieren. Die Kultur in einem kleineren Maßstab, z.B. im Schüttelkolben, kann auch als Vorkultur zum Animpfen einer Kultur im größeren Maßstab, z.B. eines Fermenters, genutzt werden. Ein Produktionsstamm ist definiert als ein Mikroorganismenstamm, der zur Herstellung eines Produkts, z.B. durch Fermentation, geeignet ist. Der Produktionsstamm zeichnet sich dadurch aus, dass er durch genetische Modifikation zur (verbesserten) Herstellung des Produkts befähigt ist. Die genetische Modifikation kann durch eine Veränderung des Genoms (chromosomale Veränderung), durch Einführung eines autonom replizierenden extrachromosomalen genetischen Elements wie einem Plasmid sowie durch Kombination aus chromosomaler und extrachromosomaler Veränderung bestehen. Beispiel für einen Produktionsstamm mit chromosomaler Veränderung ist der in Beispiel 1 zur Herstellung von OPS beschriebene Stamm E. coli W3110- ^serB. Beispiel für einen durch Einführung eines Plasmids hergestellten Produktionsstamm ist der in Beispiel 3 zur Herstellung des CS-Enzyms beschriebene Stamm E. coli JM105 x pCSma-pKKj. Dabei wird der Mikroorganismenstamm, der das extrachromosomale genetische Element trägt, als Wirtsstamm oder Wirtsorganismus bezeichnet und das extrachromosomale genetische Element als Genkonstrukt, Plasmid, Vektor oder Expressionsvektor. Als offener Leserahmen (open reading frame, ORF, gleichbedeu- tend mit cds, coding sequence) wird derjenige Bereich der DNS bzw. RNS bezeichnet, der mit einem Startcodon beginnt und mit einem Stoppcodon endet und für die Aminosäuresequenz eines Proteins codiert. Der ORF wird auch als codierende Region oder Strukturgen bezeichnet. Als Gen wird der DNS-Abschnitt bezeichnet, der alle Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNS enthält. Ein Gen enthält den DNS-Abschnitt, von dem durch Transkription eine einzelsträngige RNS-Kopie hergestellt wird und die Expressionssignale, die an der Regulation dieses Kopiervorgangs beteiligt sind. Zu den Expressionssignalen zählen z.B. mindestens ein Promotor, ein Transkriptions-, ein Translationsstart und eine Ribosomenbindestelle (RBS). Des Weiteren sind als Expressionssignale ein Terminator und ein oder mehrere Operatoren möglich. Eine mRNS, auch messenger-RNS oder Boten-RNS genannt, ist eine einzelsträngige Ribonukleinsäure (RNS), welche die genetische Information für den Aufbau eines Proteins trägt. Mit einer mRNS steht die Bauanleitung für ein bestimmtes Protein in einer Zelle zur Verfügung. Das mRNS-Molekül trägt die zum Proteinaufbau notwendige Botschaft aus der Erbinformation (DNS) an die proteinaufbauenden Ribosomen. In einer Zelle wird es gebildet als Transkript eines zu einem Gen gehörenden Teilabschnitts der DNS. Die in der DNS gespeicherte genetische Information wird dabei nicht verändert. Gene eukaryotischer Organismen sind überwiegend sogenannte Mosaikgene und enthalten im Gegensatz zu prokaryotischen Genen auch nichtcodierende Abschnitte, sogenannte Introns (engl. intragenic regions). Codierende Sequenzen, sogennannte Exons (engl. expressed regions), sind DNS-Abschnitte eines eukaryotischen Gens, die nach der Transkription in RNS von den Ribosomen in die Aminosäure-Sequenz eines Proteins übersetzt werden. Die Introns werden nach der Transkription der DNS zur RNS aus dem Primärtranskript gespleißt. Die von Introns befreite proteincodierende RNS wird als messenger-RNS (mRNS), auch als „reife“ mRNS bezeichnet. Diese wird weiteren Modifikationen wie dem Capping und der Polyadenylierung unterzogen. Der codierende Bereich der reifen mRNS wird dann in die Proteinsequenz übersetzt. Soll ein eukaryotisches Gen mit Exon/Intronstruktur in prokaryotischen Organismen exprimiert werden, ist es notwendig, die Proteinsequenz oder den codierenden Bereich der reifen mRNS in Intron-freie DNS zurückzuübersetzen, da bei Prokaryoten die Prozessierung der Exon/Intronstruktur nicht stattfindet. Wenn im Rahmen dieser Erfindung von aus der Proteinsequenz oder von aus der mRNS abgeleiteten Gensequenzen die Rede ist, ist genau dieser Prozess der Rückübersetzung gemeint. Es ist bevorzugt, dass gleichzeitig mit der Rückübersetzung der Proteinsequenz oder der mRNS-Sequenz in DNS-Sequenz eine Sequenzoptimierung, d.h. Anpassung an die Codon-Nutzung des entsprechenden Prokaryoten erfolgt (Codon-Optimierung). Als Genkonstrukt wird ein DNS-Molekül bezeichnet, bei dem ein Gen verknüpft ist mit weiteren genetischen Elementen (z.B. Promotor, Terminator, Selektionsmarker, Replikationsursprung). Ein Genkonstrukt im Rahmen der Erfindung ist ein zirkuläres DNS-Molekül und wird als Plasmid, Vektor, bzw. Expressionsvektor bezeichnet. Die genetischen Elemente des Genkonstrukts bewirken seine extrachromosomale Vererbung während des Zellwachstums sowie die Produktion des vom Gen codierten Proteins. Die Abkürzung WT (Wt) bezeichnet den Wildtyp. Als Wildtyp-Gen wird die Form des Gens bezeichnet, die natürlicherweise durch die Evolution entstanden und im Wildtyp-Genom vorhanden ist. Die DNS-Sequenz von Wt-Genen ist in Datenbanken wie NCBI (National Center for Biotechnology Information) öffentlich zugänglich. Ein Mikroorganismenstamm mit Wt-Genom wird als Wt- Stamm bezeichnet. L-Cysteinsäure aus der erfindungsgemäßen Biotransformation von OPS mit einem Salz der schwefligen Säure kann entweder ohne weitere Aufarbeitungsschritte direkt weiterverwendet oder aber mittels bekannter Methoden angereichert oder gereinigt werden. Solche Methoden sind dem Fachmann aus Verfahren zur Isolierung von Aminosäuren bekannt. Sie umfassen z.B. Filtration, Zentrifugation, Extraktion, Adsorption, Ionenaustauscher- Chromatographie, Präzipitation, Kristallisation. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass der die L-Cysteinsäure enthaltende Reaktionsansatz ohne weitere Aufarbeitungs-, Reinigungs- oder Isolierungsschritte weiterverwendet wird. In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellte L- Cysteinsäure aus dem Reaktionsansatz isoliert wird. Denaturierung bezeichnet im Rahmen dieser Erfindung eine strukturelle Veränderung von Biomolekülen wie Proteinen, die mit einem Verlust der biologischen Funktion der Moleküle verbunden ist, obgleich deren Primärstruktur unverändert bleibt. Ein denaturiertes Protein ist dadurch gekennzeichnet, dass es enzymatisch nicht aktiv ist, d.h. für CS-Enzyme im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass diese nicht in der Lage sind, die Synthese von L-Cysteinsäure aus OPS und einem Salz der schwefligen Säure zu katalysieren. Eine Denaturierung kann auf physikalische oder auf chemische Einflüsse zurückzuführen sein. Fehlerhaft oder unvollständig gefaltete, enzymatisch nicht aktive Proteine können sich in der Zelle in Proteinaggregaten (sogenannten inclusion bodies, Einschlusskörperchen) ansammeln und können als natürlicherweise denaturierte Proteine betrachtet werden. Inclusion bodies werden vor allem bei hoher Expressionsleistung beobachtet, wenn aufgrund der resultierenden hohen Konzentration neu synthetisierter Proteinketten deren Aggregation gegenüber ihrer Faltung in die enzymatisch aktive dreidimensionale Form bevorzugt ist. Ob ein heterolog exprimiertes Protein in Form unlöslicher inclusion bodies oder in aktiver Form anfällt, kann nicht vorhergesagt werden und hängt neben der Primärstruktur der Proteinkette (Abfolge der Aminosäuresequenz) auch vom verwendeten Expressionssystem und Parametern ab, durch welche die Geschwindigkeit der Proteinbiosynthese gesteuert werden kann (z.B. Anzuchttemperatur, Induktionsstärke bei induzierbaren Promotoren). Im Fall der vorliegenden Erfindung war es jedoch überraschend, dass die Cysteatsynthase aus Methanoscarcina acetivorans in enzymatisch aktiver Form in E. coli produziert werden konnte, da das gleiche Protein nach dem Stand der Technik (Graham et al., 2009, s.o.) bei heterologer Expression in E. coli nur in inaktiver Form in inclusion bodies produziert wurde. Renaturierung bezeichnet die Rückverwandlung der denaturierten Proteine in ihre biologisch aktive Raumstruktur. Bei der Renaturierung in der Proteinbiochemie werden chaotrope Verbindungen eingesetzt, um denaturiertes Protein in inclusion bodies wieder in Lösung zu bringen, bevor man durch Entfernung der chaotropen Verbindung die Proteinrenaturierung ermöglicht. In der Proteinchemie werden dazu vor allem Harnstoff und Guanidinhydrochlorid verwendet. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym ohne einen vorherigen Renaturierungsschritt in die Reaktion eingesetzt wird. Zu den Renaturierungsschritten zählen folgende Verfahrensschritte: Lösen des denaturierten Proteins in einem Medium, das eine chaotrope Verbindung enthält und anschließende Entfernung der chaotropen Verbindung. Dabei ist es abhängig vom jeweiligen Protein, bis zu welchem Grad die chaotrope Verbindung entfernt werden muss. Die Entfernung der chaotropen Verbindung kann erfolgen z.B. durch Dialyse, selektive Bindung der chaotropen Verbindung an ein Trägermaterial, selektive Bindung des zu renaturierenden Proteins an ein Trägermaterial und anschließende Elution unter renaturierenden Bedingungen oder durch Verdünnung der chaotropen Verbindung unter eine kritische Konzentration, unter der es nicht mehr denaturierend wirkt (siehe z.B. Graham et al., 2009, s.o.). Methoden der Protein-Renaturierung sind im Stand der Technik beschrieben. Zu den renaturierenden Bedingungen zählen z.B. Lösen des denaturierten Proteins in einer 6 M wässrigen Harnstoff-Lösung oder 6 M wässrigen Guanidin-HCl-Lösung. Verdünnung bzw. Entfernung der chaotropen Verbindung unter eine kritische Konzentration hängt ab vom jeweiligen Protein und bedeutet, dass die Konzentration der chaotropen Verbindung wie z.B. Harnstoff oder Guanidin unter eine Konzentration gesenkt wird, bei der das betreffende Protein wieder die dreidimensionale Struktur seiner aktiven Form einnehmen kann. Als chaotrope Verbindung werden chemische Substanzen bezeichnet, die geordnete Wasserstoffbrückenbindungen im Wasser stören. Zu den chaotropen Verbindungen zählen Bariumsalze wie z.B. Bariumchlorid oder Bariumacetat, Guanidinhydrochlorid, Thiocyanate wie Guanidiniumthiocyanat, Perchlorate, Iodide, Butanol, Phenol, Thioharnstoff, Harnstoff und/oder Tenside. Tenside (auch als Detergentien oder Seifen bezeichnet) sind organische Verbindungen, die als grenzflächenaktive Substanzen wirken, d.h. dass sie sich dank ihrer Struktur in der Grenzfläche zwischen zwei Phasen so anordnen, dass sie die Grenzflächenspannung (=Oberflächenspannung) erniedrigen und dadurch z.B. Benetzung ermöglichen. Durch Herabsetzen der Oberflächenspannung fördern sie die Durchmischung von zwei Phasen, unter Umständen bis zur Bildung einer Emulsion. Tenside zeichnen sich durch eine Polarität der Molekülstruktur aus, wobei ein Teil des Moleküls hydrophile Eigenschaften hat, welche die Löslichkeit in Wasser vermitteln und der andere Teil des Moleküls hydrophobe Eigenschaften, wodurch Tenside hydrophobe Verbindungen solubilisieren und zur Lösungsvermittlung in Wasser beitragen. Als Tenside eingesetzt werden nichtionische Tenside (Polyalkylenglycolether, Fettalkoholpropoxylate, Alkylglucoside, Alkylpolyglucoside, Oktylphenolethoxylate wie Triton X-100, Nonylphenolethoxylate), anionische Tenside (Alkylcarboxylate, Alkylbenzolsulfonate, Alkylsulfonate, Fettalkoholsulfate wie Natriumlaurylsulfat, Alkylethersulfate, Sulfoacetate), kationische Tenside auf Basis quartärer Ammoniumverbindungen (Distearyldimethylammonium-Chlorid, „Esterquat“) und/oder zwitterionische (amphotere) Tenside auf Basis von Betain (z.B. „Cocoamidopropylbetain“) oder Sulfobetain (z.B. Cocoamidopropyl-Hydroxysultain). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym ohne einen vorherigen Renaturierungsschritt in die Reaktion eingesetzt wird. Ohne einen Renaturierungsschritt zu arbeiten, hat einen großen wirtschaftlichen Vorteil, denn die oben beschriebenen aufwendigen, kostenintensiven und umweltbelastenden Renaturierungsschritte sind nicht erforderlich. Im Falle der Herstellung des CS-Enzyms durch Anzucht eines Produktionsstamms, insbesondere wenn das CS-Enzym fermentativ hergestellt wird, müssen zudem die das CS-Enzym exprimierenden Wirtszellen nicht erst in einem aufwendigen und kostenintensiven sowie die Umwelt z.B. durch Abfälle belastenden Prozess mechanisch oder chemisch aufgeschlossen und inclusion bodies, in denen sich beispielsweise bei Graham et al. (2009) das Enzym in inaktiver Form anreichert, aus dem Zelllysat isoliert und renaturiert werden, um das Protein für enzymatische Reaktionen verwenden zu können. Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure durch Biotransformation ist die Verfügbarkeit von OPS. OPS kann chemisch hergestellt werden oder biotechnologisch, z.B. durch Fermentation eines OPS- Produktionsstammes. Mögliche Methoden zur chemischen Herstellung von OPS sind z.B. Phosphorylierung von L-Serin, oder auch die Herstellung des Racemats O-Phospho-D/L-Serin, das direkt verwendet werden kann, bzw. aus dem Racemat wird vorher OPS gewonnen, z.B. durch Racematspaltung. Bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure dadurch gekennzeichnet, dass das in die Reaktion eingesetzte OPS biotechnologisch hergestellt wird. Dieses erfolgt durch Anzucht eines OPS-Produktionsstammes. Besonders bevorzugt ist die biotechnologische Herstellung von OPS durch Anzucht eines OPS-Produktionsstammes, bei der OPS im Zellkulturüberstand (extrazellulär) akkumuliert. Der Fachmann kann mittels Isotopenanalyse feststellen, ob ein Stoff wie beispielsweise OPS, den er als Edukt in das Verfahren einsetzen will, aus chemischer oder biotechnologischer, z.B. fermentativer Herstellung stammt. Ein zur Unterscheidung geeignetes Verfahren der Isotopenanalyse ist z.B. in Sieper et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. (2006) 20: 2521-2527 beschrieben und beruht auf der Bestimmung der Isotopenverhältnisse für z.B. C oder N, welche verschieden sind, je nachdem, ob ein Produkt aus chemischer (Erdöl- basierter) oder biotechnologischer, z.B. fermentativer (Pflanzen-basierter) Herstellung stammt. Ein Verfahren zur Herstellung von OPS zählt dabei zu den Verfahren biotechnologischer, z.B. fermentativer (Pflanzen-basierter) Herstellung, wenn z.B. die zur Anzucht des Produktionsstammes verwendete Glucose aus pflanzlicher Produktion stammt, was auch für das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren gilt. OPS dient im Cystein-Stoffwechsel z.B. von Escherichia coli als biosynthetischer Vorläufer von L-Serin. Letzteres entsteht durch Dephosphorylierung von OPS. Diese Reaktion wird enzymatisch von O-Phospho-L-Serin-Phosphatasen (SerB, EC 3.1.3.3) katalysiert. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass E. coli-Stämme mit unterdrückter SerB-Aktivität OPS akkumulieren können. Ein Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität ist somit dadurch gekennzeichnet, dass er L-Serin nicht mehr durch Dephosphorylierung von OPS herstellen und infolgedessen OPS akkumulieren kann. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das in die Reaktion eingesetzte OPS mit einem Mikroorganismenstamm mit unterdrückter Aktivität der zur Enzymklasse EC 3.1.3.3 zählenden O-Phospho-L-Serin Phosphatase (SerB-Enzym) hergestellt wird. Das heißt, dass in diesem Fall ein Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität als OPS- Produktionsstamm verwendet wird, wobei die Unterdrückung der SerB-Aktivität eine genetische Veränderung im Mikroorganismenstamm umfasst. Die SerB-Aktivität des genetisch nicht veränderten Mikroorganismenstammes (Wt-Stamm) wird dabei auf 100% festgelegt, und ein Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität ist definiert dadurch, dass er eine gegenüber der 100%-Aktivität im Wt-Stamm geringere SerB- Aktivität enthält, bevorzugt noch maximal 20%, besonders bevorzugt noch maximal 10% und insbesondere bevorzugt 0% (Inaktivierung des serB-Gens) der auf 100% festgelegten Aktivität des Wildtypstammes. Die prozentual auf die Aktivität im Wt-Stamm bezogene, im veränderten Mikroorganismenstamm noch messbare SerB-Aktivität wird als Restaktivität bezeichnet. Ein Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität ist durch eine oder mehrere der folgenden genetischen Veränderungen gekennzeichnet: - Deletion des chromosomalen Gens, welches das Enzym SerB codiert. - Einführen einer Mutation in das chromosomale Gen, welches für das Enzym SerB codiert, um die Aktivität des endogenen Gens herabzusetzen. - Substitution des chromosomalen Gens, das das Enzym SerB codiert, durch ein Gen, das mutiert ist, um die Aktivität des endogenen Gens herabzusetzen. - Einführen einer Mutation in eine regulatorische Region für das Gen, welches für das Enzym SerB codiert, um die endogene Enzymaktivität herabzusetzen. - Einführen eines Antisense-Oligonucleotids, das zum Transkript des Gens komplementär ist, welches für das Enzym SerB codiert, um die Translation der mRNS zu inhibieren. L-3-Phosphoserin Phosphatase Enzymaktivität (SerB-Aktivität) kann, wie im Stand der Technik beschrieben, durch enzymatische Freisetzung von Phosphat aus L-3-Phosphoserin bestimmt werden, wobei das freigesetzte Phosphat quantitativ als Molybdatkomplex photometrisch bei 340 nm bestimmt wird. Die mit diesem Enzymtest für den WT-Stamm bestimmte serB-Aktivität wird auf 100% Aktivität festgesetzt und die Restaktivität für einen Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität unter identischen Bedingungen gemessen. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure dadurch gekennzeichnet, dass das in die Reaktion eingesetzte OPS mit einem Mikroorganismenstamm hergestellt wird, bei dem das chromosomale Gen, welches das Enzym SerB codiert, deletiert wurde. Man spricht auch von einem knock out des serB-Gens. Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB- Aktivität in diesem Fall dadurch gekennzeichnet, dass die chromosomale Nukleotidsequenz des serB-Gens, umfassend die vollständige serB-cds, welche für das Enzym SerB codiert, sowie flankierende Sequenzen bis zu 1000 nt 5‘-stromaufwärts der serB-cds, umfassend die Sequenz des serB-Promotors und 1000 nt 3‘-stromabwärts der serB-cds, umfassend die Sequenz des serB-Terminators, deletiert ist. Eine besonders bevorzugte Deletion ist die in Beispiel 1 beschriebene Deletion der serB- cds, welche für das Enzym SerB codiert. Der Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität ist bevorzugt ausgewählt aus den Familien Corynebacteriaceae oder Enterobacteriaceae, besonders bevorzugt ausgewählt aus den Gattungen Corynebacterium, Pantoea oder Escherichia und insbesondere bevorzugt ausgewählt aus den Arten Pantoea ananatis oder Escherichia coli. Im speziellen bevorzugt handelt es sich beim Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität zur Herstellung von OPS für die erfindungsgemäße Reaktion um den Stamm E. coli K12 W3110. Ein Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität ist bevorzugt durch eine Serin-Auxotrophie gekennzeichnet, d.h. der Stamm kann die Aminosäure L-Serin für das Wachstum nicht selber bilden. Die Auxotrophie kann durch Zugabe von Serin oder Glycin zum Kulturmedium (Anzuchtmedium) aufgehoben werden, entweder jeweils als Reinsubstanz oder als Bestandteil einer komplexen Medienkomponente wie z.B. Hefeextrakt, Pepton oder Trypton sowie als Gemisch aus Reinsubstanz und komplexer Medienkomponente. Bevorzugt ist ein Gemisch aus Reinsubstanz, ausgewählt aus Glycin und L-Serin, und komplexer Medienkomponente, darunter besonders bevorzugt ein Gemisch aus Glycin und komplexer Medienkomponente. Insbesondere bevorzugt ist die Zugabe von Glycin zum Anzuchtmedium. Der Gehalt an Glycin als Reinsubstanz im Anzuchtmedium beträgt dabei bevorzugt 0,1 g/L bis 10 g/L, besonders bevorzugt 0,2 g/L bis 5 g/L und insbesondere bevorzugt 0,3 g/L bis 2 g/L. Dem Stand der Technik entsprechend kann das serB-Gen oder ein Teil des Gens isoliert und eine Fremd-DNS in das serB-Gen klo- niert werden, wodurch der das Protein definierende offene Leserahmen des serB-Gens unterbrochen wird. Ein für die gezielte Inaktivierung des serB-Gens geeignetes DNS-Konstrukt kann also aus einem 5‘-DNS-Abschnitt, der zum genomischen serB-Gen homolog ist, gefolgt von einem die Fremd-DNS umfassenden Genabschnitt und daran angeschlossen einem 3‘-DNS- Abschnitt, der wiederum zum genomischen serB-Gen homolog ist, bestehen. Der für die homologe Rekombination in Frage kommende Bereich des serB-Gens kann dabei also nicht nur den für die O-Phospho- L-Serin-Phosphatase kodierenden Bereich umfassen. Der in Fra- ge kommende Bereich kann auch das serB-Gen flankierende DNS- Sequenzen umfassen, nämlich im 5‘-Bereich vor Beginn des kodierenden Bereichs (Promotor der Gentranskription) sowie im 3‘-Bereich nach dem Ende des kodierenden Bereichs (Terminator der Gentranskription), deren Veränderung durch homologe Rekombination ebenso wie die Veränderung des kodierenden Bereichs zur Inaktivierung des serB-Gens führen kann. Bei der Fremd-DNS handelt es sich bevorzugt um eine Selektionsmarker-Expressionskassette. Diese besteht aus einem Promotor der Gentranskription, der funktionell verbunden ist mit dem eigentlichen Selektionsmarkergen und gegebenenfalls gefolgt von einem Terminator der Gentranskription. Der Selektionsmarker enthält in diesem Fall außerdem 5‘- und 3‘- flankierende homologe Sequenzen des serB-Gens. Vorzugsweise enthält der Selektionsmarker 5‘- und 3‘- flankierende homologe Sequenzen des serB-Gens von jeweils mindestens 30 Nukleotiden Länge, besonders bevorzugt jeweils mindestens 50 Nukleotiden Länge. Das DNS-Konstrukt zur Inaktivierung des serB-Gens kann also, beginnend vom 5‘-Ende, aus einer zum serB-Gen homologen Sequenz, gefolgt von der Expressionskassette des Selektionsmarkers, z.B. ausgewählt aus der Klasse der Antibiotikaresistenzgene sowie gefolgt von einer weiteren, zum serB-Gen homologen Sequenz, bestehen. In einer bevorzugten Ausführung besteht das DNS-Konstrukt zur Inaktivierung des serB-Gens, beginnend vom 5‘-Ende, aus einer zum serB-Gen homologen Sequenz von mindestens 30 Nukleotiden Länge, insbesondere bevorzugt mindestens 50 Nukleotiden Länge, gefolgt von der Expressionskassette des Selektionsmarkers, ausgewählt aus der Klasse der Antibiotikaresistenzgene sowie gefolgt von einer weiteren, zum serB-Gen homologen Sequenz von mindestens 30 Nukleotiden Länge, insbesondere bevorzugt mindestens 50 Nukleotiden Länge. Bei den Selektionsmarkergenen handelt es sich im Allgemeinen um Gene, deren Genprodukt dem Ausgangsstamm das Wachstum unter selektiven Bedingungen ermöglicht, unter denen der ursprüngliche Ausgangsstamm nicht wachsen kann. Bevorzugte Selektionsmarkergene sind ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotika-Resistenzgene wie z.B. das Ampicillin- Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin- Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen oder aber auch das Neomycin-Resistenzgen. Andere bevorzugte Selektionsmarkergene ermöglichen Ausgangsstämmen mit einem Stoffwechseldefekt (z.B. Aminosäureauxotrophien) das Wachstum unter selektiven Bedingungen, indem ihre Expression den Stoffwechseldefekt korrigiert. Schließlich sind auch Selektionsmarkergene möglich, deren Genprodukt eine an sich für den Ausgangsstamm toxische Verbindung chemisch verändert und somit inaktiviert (z.B. das Gen des Enzyms Acetamidase, welches die für viele Mikroorganismen toxische Verbindung Acetamid in die ungiftigen Produkte Acetat und Ammoniak spaltet). Unter den Selektionsmarkergenen besonders bevorzugt sind das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen. Insbesondere bevorzugt sind das Tetracyclin-Resistenzgen und das Kanamycin-Resistenzgen. Auf Basis der homologen Rekombination gibt es weiterhin Systeme, die zusätzlich zur gezielten Geninaktivierung auch die Möglichkeit bieten, den Selektionsmarker wieder aus dem Genom zu entfernen, womit die Möglichkeit der Herstellung von Doppel- und Mehrfachmutanten gegeben ist. Ein solches System ist z.B. die sog. Lambda-Red Technologie, käuflich erhältlich als „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit“, basierend auf der Red®/ET®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012” und darin zitierte Literatur, z.B. Datsenko und Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000): 6640-6645). Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung beschreibt ein Beispiel zur Herstellung eines Mikroorganismenstammes mit unterdrückter SerB-Aktivität durch Deletion des serB-Gens. Ein mit der Red®/ET®-Technologie hergestellter Mikroorganismenstamm mit unterdrückter SerB-Aktivität kann sich zur extrazellulären Herstellung von OPS eignen, wie z.B. im 2. Beispiel der vorliegenden Erfindung für den Stamm E. coli W3110- ^serB beschrieben. OPS kann sowohl intra- wie auch extrazellulär akkumulieren, wobei die Menge von intrazellulär akkumuliertem OPS von den Anzuchtbedingungen abhängt (Steinfeld et al., s.o.). Die im Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung gewählten Kulturbedingungen ermöglichen die extrazelluläre Akkumulation von OPS. Der Gehalt an extrazellulärem OPS beträgt bevorzugt mindestens 1 g/L, besonders bevorzugt mindestens 3 g/L und insbesondere bevorzugt mindestens 6 g/L. Ein Vorteil des beschriebenen Verfahrens zur biotechnologischen Herstellung von OPS ist es, dass extrazellulär in einer Kulturbrühe, wie sie z.B. in einer wie im 2. Beispiel durchgeführten Anzucht erhalten wird, vorliegendes OPS als OPS-Quelle nach Abtrennen der partikulären Biomasse wie z.B. durch Zentrifugation oder Filtration bevorzugt ohne weitere Aufarbeitungs-, Reinigungs- oder Isolierungsschritte wie u.a. Extraktion, Adsorption, Ionenaustauscher-Chromatographie, Präzipitation, Kristallisation direkt in das erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure eingesetzt werden kann. Diese Vorgehensweise ist besonders ökonomisch und vermeidet die Isolierung von OPS. Insbesondere bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure daher dadurch gekennzeichnet, dass OPS eingesetzt wird, das aus dem Zellkulturüberstand der Anzucht eines Mikroorganismenstammes mit unterdrückter Aktivität der zur Enzymklasse EC 3.1.3.3 zählenden O-Phospho-L-Serin Phosphatase (SerB-Enzym) stammt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zum in die Reaktion eingesetzten CS-Enzym das in die Reaktion eingesetzte OPS biotechnologisch, insbesondere bevorzugt durch Fermentation hergestellt wird. Bevorzugt wird das CS-Enzym durch Kultur eines Mikroorganismenstammes der Familie der Enterobacteriaceae, der das CS-Enzym heterolog exprimiert, hergestellt. Dieser Mikroorganismenstamm wird auch als CS-Enzym- Produktionsstamm bezeichnet, der aus dem Wirtsstamm und einem Genkonstrukt zur Expression des CS-Gens besteht. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym durch Anzucht eines Mikroorganismenstamms der Gattung Escherichia, besonders bevorzugt der Art Escherichia coli und insbesondere bevorzugt des Mikroorganismenstamms E. coli K12 JM105, der das CS-Enzym heterolog und im speziellen bevorzugt in enzymatisch aktiver Form exprimiert, hergestellt wird. Bevorzugtes Genkonstrukt zur Expression des CS-Gens ist ein Expressionsvektor in Plasmidform, darunter besonders bevorzugt der in Beispiel 3 offenbarte Expressionsvektor pCSma-pKKj (Fig. 3). Cysteatsynthasen sind als Enzyme der Coenzym M-Biosynthese von z.B. Methanobakterien bekannt. Bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym aus Methanoscarcina acetivorans stammt oder es sich beim CS-Enzym um eine dazu homologe Sequenz handelt, besonders bevorzugt stammt das CS-Enzym aus Methanoscarcina acetivorans. Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei der codierenden DNS-Sequenz um SEQ ID NO: 3, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 codiert, oder eine dazu homologe Nukleotidsequenz. Unter homologen Nukleotidsequenzen ist zu verstehen, dass die DNS-Sequenzen dieser Gene bzw. DNS-Abschnitte zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% identisch sind. Als homologe Nukleotidsequenzen sind bevorzugt die Sequenzen der Gene aus Methanocella paludicola (NCBI Gene ID: 8682885), Methanosarcina barkeri (NCBI Gene ID: 24822660), Methanoculleus marisnigri (NCBI Gene ID: 4845938) oder dazu homologe Nukleotidsequenzen. Der Grad der DNS-Identität wird durch das Programm „nucleotide blast“, zu finden auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, bestimmt, welches auf dem blastn-Algorithmus basiert. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Nukleotidsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = “Automatically adjust parameters for short input sequences”; Expect Threshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die entsprechenden voreingestellten Scoring Parameter sind: Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap Costs = Linear. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym die in SEQ ID NO: 4 angegebene oder eine dazu homologe Aminosäuresequenz besitzt, wobei eine zu SEQ ID NO: 4 homologe Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität von mindestens 50%, bevorzugt mindestens 70% und insbesondere bevorzugt mindestens 80% zu SEQ ID NO: 4 und gleichzeitig Cysteatsynthase-Enzymaktivität aufweist. Cysteatsynthase-Enzymaktivität kann, wie oben im CS- Aktivitätstest definiert, nachgewiesen werden. Aminosäuresequenzen homologer CS-Enzyme können in der NCBI- Datenbank (National Center for Biotechnology Information) mit dem Suchbegriff „cysteate synthase“ oder mit dem Unterprogramm „Protein BLAST“ durch Eingabe der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 gefunden werden. Zum CS-Enzym aus Methanoscarcina acetivorans homologe Enzyme sind bevorzugt ausgewählt aus Methanocella paludicola (NCBI Nr.: WP_012900738.1), Methanolinea mesophila (NCBI Nr.: WP_245249687.1), Methanosarcina barkeri (NCBI Nr.: WP_011308449.1), Methanoculleus marisnigri (NCBI Nr.: WP_011842967.1). Bei der „Protein BLAST“ Suche nach Genen für CS-Enzyme finden sich homologe Proteinsequenzen aus einer Vielzahl von Bakterien aus der Domäne der Archaebakterien, worunter auch thermophile Organismen (Wachstum bei Temperaturen >50°C bis zu 110°C) sind. Deren Enzyme haben üblicherweise ebenfalls Aktivitätsoptima >50°C. Von der Erfindung sind auch CS-Enzyme aus der Domäne der Archaebakterien mit Aktivitätsoptimum >50°C umfasst. Für den Vergleich von Proteinsequenzen wird das Programm „Protein BLAST“, auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, genutzt. Dieses Programm greift auf den blastp-Algorithmus zurück. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Proteinsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = “Automatically adjust parameters for short input sequences”; Expect Threshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die voreingestellten Scoring Parameter sind: Matrix = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Compositional adjustments = Conditional compositional score matrix adjustment. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim CS-Enzym nicht um ein Fusionsprotein handelt. Der Begriff Fusionsprotein bedeutet, dass die für ein Protein oder einen Teil eines Proteins kodierende DNS-Sequenz im Labor mit einer oder mehreren DNS-Sequenzen, die für ein weiteres Protein oder einen Teil eines weiteren Proteins codieren, im Leserahmen fusioniert wird und somit für ein verändertes (verlängertes) Protein kodiert, wie es so in der Natur nicht vorkommt. Dabei können die fusionierten DNS-Sequenzen am 5‘- Ende, am 3‘-Ende, bzw. sowohl am 5‘- und 3‘-Ende angebracht werden. Es ist auch denkbar, die fusionierte DNS-Sequenz innerhalb der für das Protein codierenden Sequenz einzufügen (z.B. als Verbindung zwischen zwei Domänen eines Proteins). Das Fusionsprotein wird auch als Hybrid oder Hybridenzym bezeichnet. Das bedeutet, dass das erfindungsgemäße Protein mit Cysteatsynthase-Enzymaktivität nur durch die cds des betreffenden Gens codiert wird und die CS-cds nicht durch der CS-cds zusätzlich hinzugefügte Sequenzen verlängert wird. Ein Protein, dessen cds mit einer Nucleotidsequenz fusioniert wurde, welche für eine Proteinsequenz codiert, die während der Proteinbiosynthese oder bei der posttranslationalen Modifikation wieder abgespalten wird, wie z.B. einer die Protein-Sekretion vermittelnden Export-Signalsequenz, ist nicht vom Begriff Fusionsprotein umfasst. Der Begriff Fusionsprotein bezieht sich im Rahmen der Erfindung immer auf das reife Protein. Im Rahmen der Erfindung bezeichnet die Produktion des CS- Enzyms durch Anzucht eines CS-Enzym-Produktionsstammes die Produktion des CS-Enzyms als enzymatisch aktives Protein ohne Rückfaltung und bevorzugt ohne Rückgriff auf die Expression als Fusionsprotein. Besonders bevorzugt ist die Produktion des CS-Enzyms aus M. acetivorans durch Anzucht eines CS-Enzym- Produktionsstammes als enzymatisch aktives Protein ohne Rückfaltung und ohne Rückgriff auf die Expression als Fusionsprotein, wobei zur Herstellung des Produktionsstammes ein Wirtsstamm der Art Escherichia coli verwendet wird. Insbesondere bevorzugt ist die Produktion des CS-Enzyms aus M. acetivorans durch Anzucht des in Beispiel 3 beschriebenen Produktionsstammes E. coli JM105 x pCSma-pKKj. Das durch Anzucht des Produktionsstammes gewonnene CS-Enzym kann im erfindungsgemäßen Verfahren entweder als nicht weiter aufgearbeitete Kulturbrühe eingesetzt werden oder als Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen aus der Kulturbrühe, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration. Weiterhin kann das CS-Enzym in Form eines Zellhomogenats nach mechanischem Aufschluss der Zellsuspension oder in Form chemisch permeabilisierter Zellen (z.B. durch Chloroform) eingesetzt werden oder aber auch als Zellextrakt nach Abtrennung partikulärer Bestandteile aus dem Zellhomogenat oder auch als z.B. chromatographisch gereinigtes Enzym. Bevorzugt ist die Verwendung des CS-Enzyms als nicht weiter aufgearbeitete Kulturbrühe, insbesondere bevorzugt Fermenterbrühe, als Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen aus der Kulturbrühe oder aber als Zellhomogenat nach mechanischem Aufschluss der Zellsuspension oder in Form chemisch permeabilisierter Zellen (z.B. durch Chloroform). Besonders bevorzugt ist die Verwendung des CS-Enzyms als Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen aus der Kulturbrühe oder als Zellhomogenat, insbesondere bevorzugt als Zellhomogenat. In einer bevorzugten Ausführung wird nach Anzucht eines CS- Enzym-Produktionsstammes CS-Enzym als Zellhomogenat hergestellt und direkt im erfindungsgemäßen Biotransformationsverfahren als CS-Enzym eingesetzt. Eine mögliche bevorzugte Ausführung ist in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung offenbart. Grundsätzlich sind alle denkbaren Salze der schwefligen Säure im Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure für die Reaktion geeignet, darunter die bekannten Salze Na2SO3, K2SO3, (NH4)2SO3, NaHSO3 (bzw. dessen Anhydrid Na2S2O5) oder auch KHSO3. Denkbar ist außerdem die Verwendung von gasförmigem Schwefeldioxid, das Anhydrid der schwefligen Säure, das in den Reaktionsansatz eingebracht werden kann, wo es zur schwefligen Säure H2SO3 hydratisiert und je nach pH in einem Gleichgewicht mit den deprotonierten Formen HSO3- und SO3 2- vorliegt. Bevorzugt ist die Verwendung von Na2SO3, K2SO3, (NH4)2SO3, NaHSO3 (bzw. dessen Anhydrid Na2S2O5), KHSO3, besonders bevorzugt von Na2SO3, NaHSO3 (bzw. dessen Anhydrid Na2S2O5) und (NH4)2SO3 und insbesondere bevorzugt von Na2SO3 und NaHSO3 (bzw. dessen Anhydrid Na2S2O5). In einer speziell bevorzugten Ausführung wird als Salz der schwefligen Säure im Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure Na2SO3 oder NaHSO3 (bzw. dessen Anhydrid Na2S2O5) eingesetzt. Entsprechend Gleichung (1) wird bei der Reaktion von OPS zu L- Cysteinsäure Phosphorsäure in stöchiometrischen Mengen freigesetzt, was im Verlauf der Reaktion zu einer Absenkung des pH-Werts im Ansatz führen kann. Da ein zu niedriger pH- Wert die Aktivität des CS-Enzyms beeinträchtigt, muss ein zu starkes Absinken des pH-Werts verhindert werden. Dies kann passiv durch einen geeigneten hochkonzentrierten Puffer im Ansatz erfolgen oder auch aktiv durch eine Mess- und Regeleinheit bewerkstelligt werden. Bevorzugt ist die aktive pH-Kontrolle (wie z.B. in Beispiel 6 beschrieben) durch eine Mess- und Regeleinheit, die bei Abweichung des pH-Wertes vom Sollwert durch Zudosierung einer Lauge oder Säure den gewünschten pH-Wert wieder einstellt (sog. pH-Stat Methode). Die Reaktionstemperatur wird zwischen 5°C und 80°C gewählt. Bevorzugt ist eine Reaktionstemperatur zwischen 10°C und 60°C, besonders bevorzugt zwischen 15°C und 50°C und insbesondere bevorzugt zwischen 20°C und 40°C. Die Reaktion kann bei einem pH zwischen 4,0 und 9,0, bevorzugt bei einem pH zwischen 5,0 und 8,5, besonders bevorzugt bei einem pH zwischen 5,5 und 8,0 und insbesondere bevorzugt bei einem pH zwischen 6,0 und 7,5 durchgeführt werden. Als Lösemittel für das Verfahren zur Herstellung von L- Cysteinsäure wird bevorzugt Wasser verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L- Cysteinsäure kann in diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Weise betrieben werden. Im diskontinuierlichen Betrieb (Batch Betrieb) werden dem Ansatz im Verlauf der Reaktion alle Reaktanden zugeführt und nach Beendigung der Reaktion der Ansatz aufgearbeitet. Im kontinuierlichen Betrieb wird das CS- Enzym als stationäre Phase vorgelegt, z.B. in einem Membranreaktor oder an einen Träger immobilisiert und das Substrat OPS und ein Salz der schwefligen Säure als mobile Phase zudosiert. Die Kontaktzeit der mobilen Phase mit der stationären Phase wird dabei so eingestellt, dass das Substrat OPS mit dem Salz der schwefligen Säure zum Produkt L- Cysteinsäure abreagieren kann. Bevorzugt ist der diskontinuierliche (Batch) Betrieb. Die Konzentration des Salzes der schwefligen Säure wird im Ansatz vorzugsweise so gewählt, dass es mindestens in äquimolarer Konzentration zu OPS vorliegt, bevorzugt mindestens in 1,5-fach molarem Überschuss, besonders bevorzugt in mindestens 2-fach molarem Überschuss und insbesondere bevorzugt in mindestens fünffach molarem Überschuss zu OPS vorliegt. Die OPS Konzentration im Ansatz beträgt bevorzugt mindestens 80 mg/L, besonders bevorzugt mindestens 1 g/L und insbesondere bevorzugt mindestens 5 g/L. Bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure dadurch gekennzeichnet, dass die molare Ausbeute an L- Cysteinsäure bezogen auf die eingesetzte molare Menge OPS mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80% und insbesondere bevorzugt mindestens 90% beträgt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Anwendung im industriellen Maßstab geeignet. Bevorzugt ist ein Ansatzvolumen >10 ml, besonders bevorzugt >1L und insbesondere bevorzugt >100 L. Entgegen dem Stand der Technik wurde überraschend gefunden, dass rekombinant in einem CS-Enzym-Produktionsstamm heterolog hergestelltes CS-Enzym ohne Rückfaltung (Renaturierung) und bevorzugt ohne Rückgriff auf einen Fusionspartner in einem Zellhomogenat enzymatisch aktiv und in einer bisher nicht bekannten Biotransformation zur effizienten Produktion von L- Cysteinsäure geeignet ist. Zu diesem Zweck kann durch Kultivierung z.B. fermentativ hergestelltes OPS aus dem Zellkulturüberstand der Anzucht eines OPS-Produktionstammes mit bevorzugt unterdrückter Aktivität des SerB-Enzyms oder kommerziell erhältliches OPS mit einem Salz der schwefligen Säure nach Gleichung (1) zur Reaktion gebracht werden. Bevorzugt ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Taurin, dadurch gekennzeichnet, dass die erfindungsgemäß hergestellte L-Cysteinsäure decarboxyliert wird. Die Decarboxylierung von L-Cysteinsäure zu Taurin erfolgt nach Gleichung (2): (2) L-Cysteinsäure -> Taurin + CO2 Insbesondere bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von Taurin dadurch gekennzeichnet, dass die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte L-Cysteinsäure direkt, d.h. ohne weitere Aufarbeitungs-, Reinigungs- oder Isolierungsschritte zur Herstellung von Taurin weiterverwendet wird, wie beispielsweise in den Beispielen 8 und 9 der vorliegenden Erfindung offenbart. Die Decarboxylierung von L-Cysteinsäure zu Taurin kann chemisch erfolgen oder enzymatisch katalysiert in einer Biotransformation. Bekannt ist die nicht als nachhaltig anzusehende thermische Decarboxylierung bei hohen Temperaturen unter Metallkatalyse, die allerdings darunter leidet, dass sie energieintensiv ist und ein hoher Anteil an Nebenprodukten entsteht. Bevorzugt handelt es sich bei der Decarboxylierungsreaktion um eine Biotransformation, wobei L- Cysteinsäure enzymatisch zu Taurin decarboxyliert wird. Zur Herstellung von Taurin durch enzymatische Decarboxylierung kann die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte L- Cysteinsäure direkt als Reaktionsansatz ohne weitere Aufarbeitungsschritte eingesetzt werden. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, vor der enzymatischen Decarboxylierung partikuläre Biomasse, z.B. durch Zentrifugation, aus dem Reaktionsansatz abzutrennen oder L-Cysteinsäure vorher aus dem Reaktionsansatz zu isolieren. Bevorzugt ist die direkte Verwendung des L-Cysteinsäure enthaltenden Reaktionsansatzes oder aber die Verwendung des L- Cysteinsäure enthaltenden Reaktionsansatzes nach Abtrennung partikulärer Biomasse. Besonders bevorzugt ist die direkte Verwendung des L- Cysteinsäure enthaltenden Reaktionsansatzes ohne weitere Aufarbeitungsschritte, wie z.B. in Beispiel 8 zur Herstellung von Taurin offenbart. Zur enzymatisch katalysierten Decarboxylierung von L- Cysteinsäure zu Taurin nach Gleichung (2) sind Enzyme aus der Klasse der L-Cysteinsulfinsäure Decarboxylasen (CSAD, EC 4.1.1.29), der Aspartat-1-Decarboxylasen (EC 4.1.1.11) oder Glutamat Decarboxylasen (EC 4.1.1.15) geeignet. Bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von Taurin dadurch gekennzeichnet, dass die Decarboxylierung mittels einer zur Enzymklasse EC 4.1.1.29 zählenden Cysteinsulfinsäure- Decarboxylase (CSAD-Enzym) erfolgt. CSAD-Enzyme sind dafür bekannt, dass sie entsprechend Gleichung (3) L- Cysteinsulfinsäure zu Hypotaurin decarboxylieren. (3) L-Cysteinsulfinsäure -> Hypotaurin + CO2 In unterschiedlichem Ausmaß sind diese Enzyme in der Lage, auch L-Cysteinsäure als Substrat zu Taurin zu decarboxylieren. Wie u.a. in den Beispielen 8 und 9 gezeigt, ist z.B. das CSADcc-Enzym aus Cyprinus carpio (Karpfen) dazu geeignet, L- Cysteinsäure entsprechend Gleichung (2) zu Taurin zu decarboxylieren. CSAD-Enzyme findet man hauptsächlich in Metazoen (vielzellige Tiere), darunter in Säugetieren wie z.B. im Menschen (Homo sapiens), im Rind (Bos taurus), in der Ratte (Rattus norvegicus), in der Maus (Mus musculus), aber auch in Fischen, wie z.B. im Karpfen (Cyprinus carpio). Auch in Einzellern sind Enzyme mit CSAD-Aktivität zu finden wie in Algen, z.B. aus der Gattung Synechococcus, außerdem auch in Bakterien oder Pilzen. Bevorzugt sind CSAD-Enzyme aus Säugetieren, ausgewählt aus Mensch (Homo sapiens), Rind (Bos taurus), Ratte (Rattus norvegicus) oder Maus (Mus musculus) sowie aus Fischen, wie z.B. aus Karpfen (Cyprinus carpio). Besonders bevorzugt sind CSAD-Enzyme aus dem Menschen (Homo sapiens), der Ratte (Rattus norvegicus) oder dem Karpfen (Cyprinus carpio). Insbesondere bevorzugt stammt das CSAD-Enzym aus dem Karpfen (Cyprinus carpio) und wird als CSADcc bezeichnet. Die der CSADcc-Aminosäuresequenz zugrundeliegende DNS-Sequenz ist zugänglich in der NCBI Datenbank unter der Genbank Sequence ID: AB220585.1 (cds: nt 82 – 1584). Aus der korrespondierenden Aminosäuresequenz wird bevorzugt eine für die Expression im konkret gewählten Mikroorganismus (wie beispielsweise E. coli) codon-optimierte CSADcc-cds DNS-Sequenz abgeleitet (beispielsweise für E. coli angegeben in SEQ ID NO: 5, nt 31 – 1530, kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6). Für die Codon-Optimierung stehen öffentlich zugängliche Software-Programme zur Verfügung, wie z.B. die in Beispiel 7 verwendete Eurofins Genomics GENEius Software. Bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von Taurin dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Aminosäuresequenz des CSAD-Enzyms um SEQ ID NO. 6 handelt. Bevorzugt wird das CSAD-Enzym, besonders bevorzugt CSADcc, rekombinant durch einen Mikroorganismen-Produktionsstamm hergestellt. Die Herstellung des CSAD-Enzyms durch rekombinante Produktion in einem E. coli-Produktionsstamm ist beispielsweise in Beispiel 7 offenbart. Die CSAD-cds wird in bekannter Weise in einen Expressionsvektor, z.B. den Vektor pKKj (siehe Beispiel 3), kloniert und ein Genkonstrukt, z.B. pCSADcc-pKKj (Fig. 4) hergestellt. Zur Herstellung eines Produktionsstammes wird das die CSAD-cds enthaltene Genkonstrukt z.B. pCSADcc-pKKj in ebenfalls bekannter Weise in einen Mikroorganismen-Wirtsstamm, z.B. den Stamm E. coli JM105, transformiert und der resultierende Produktionsstamm z.B. E. coli JM105 x pCSADcc-pKKj in ebenfalls bekannter Weise zur Herstellung des CSAD-Enzyms verwendet. Die Herstellung des CSAD-Enzyms kann dabei für Laborzwecke im Schüttelkolbenmaßstab erfolgen (wie beispielsweise in Beispiel 7 beschrieben) oder in bekannter Weise auch durch Fermentation. CSAD-Enzyme enthalten Pyridoxalphosphat (PLP, CAS Nr. 54-47-7) als Cofaktor. Die Supplementierung des Anzuchtmediums oder auch von Biotransformationsansätzen zur Umwandlung von L- Cysteinsäure zu Taurin mit PLP bietet daher eine Möglichkeit zur Verfahrensverbesserung. Da PLP zur Familie der B6-Vitamine gehört, eignet sich auch die Supplementierung mit anderen Vertretern der Vitamin B6-Familie wie z.B. Pyridoxin (CAS Nr. 65-23-6), Pyridoxal (CAS Nr. 66-72-8) oder Pyridoxamin (CAS Nr. 85-87-0) zur Verfahrensverbesserung. Das durch Anzucht im Schüttelkolben oder durch Fermentation gewonnene CSAD-Enzym, bevorzugt CSADcc, kann entweder als nicht weiter aufgearbeitete Kulturbrühe eingesetzt werden oder aber auch als Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen durch z.B. Zentrifugation. Weiterhin kann das CSAD-Enzym, bevorzugt CSADcc in Form eines Zellhomogenats nach mechanischem Aufschluss der Zellsuspension oder in Form chemisch permeabilisierter Zellen (z.B. durch Chloroform) eingesetzt werden oder aber auch als Zellextrakt nach Abtrennung partikulärer Bestandteile aus dem Zellhomogenat oder auch als z.B. chromatographisch gereinigtes Enzym. Bevorzugt ist die Verwendung des CSAD-Enzyms als Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen aus der Kulturbrühe, wie z.B. in den Beispielen 7 und 8 beschrieben. Die Biotransformation von L-Cysteinsäure zu Taurin durch das CSAD-Enzym wird unter pH- und Temperaturbedingungen durchgeführt, die eine effiziente Decarboxylierung von L- Cysteinsäure zu Taurin ermöglichen. Bevorzugt ist ein pH- Bereich zwischen pH 5,0 und 9,0 und ein Temperaturbereich zwischen 20°C und 70°C, bei dem die Biotransformation durchgeführt wird. Die Biotransformation zur Herstellung von Taurin aus L- Cysteinsäure kann in diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Weise betrieben werden. Im diskontinuierlichen Betrieb (Batch Betrieb) werden dem Ansatz im Verlauf der Reaktion alle Reaktanden zugeführt und nach Beendigung der Reaktion der Ansatz aufgearbeitet. Im kontinuierlichen Betrieb wird das CSAD-Enzym als stationäre Phase vorgelegt, z.B. in einem Membranreaktor oder an einen Träger immobilisiert, und das Substrat L-Cysteinsäure als mobile Phase zudosiert. Die Kontaktzeit der mobilen Phase mit der stationären Phase wird dabei so eingestellt, dass das Substrat L-Cysteinsäure zum Produkt Taurin abreagieren kann. Bevorzugt ist der diskontinuierliche (Batch) Betrieb. Die L-Cysteinsäure-Konzentration in der Biotransformation zur Herstellung von Taurin beträgt bevorzugt mindestens 80 mg/L, besonders bevorzugt mindestens 1 g/L, insbesondere bevorzugt mindestens 5 g/L. Bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von Taurin dadurch gekennzeichnet, dass die molare Ausbeute an Taurin bezogen auf die eingesetzte molare Menge L-Cysteinsäure mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und insbesondere bevorzugt mindestens 95% beträgt. Bevorzugt laufen die Verfahrensschritte zur Herstellung von L- Cysteinsäure (Biotransformation 1) und zur Herstellung von Taurin sequenziell, d.h. nacheinander ab. In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstellung von Taurin dadurch gekennzeichnet, dass alle Verfahrensschritte in einem Reaktionsansatz stattfinden. Wenn alle Verfahrensschritte in einem Reaktionsansatz stattfinden, spricht man auch von einem Eintopf-Verfahren bzw. einer Eintopfreaktion. Beispiel 9 der vorliegenden Erfindung offenbart eine Möglichkeit der Durchführung einer solchen Eintopfreaktion, bei der die erfindungsgemäße Biotransformation von OPS zu L- Cysteinsäure nach Gleichung (1) und die Biotransformation von L-Cysteinsäure zu Taurin nach Gleichung (2) gleichzeitig, d.h. in einem Reaktionsansatz, ablaufen, wobei OPS mit einem Sulfit (Salz der schwefligen Säure) in Gegenwart des CS- und CSAD- Enzyms zur Reaktion gebracht wird. Dabei entsteht in der ersten Reaktion L-Cysteinsäure, welche „in situ“ durch CSAD- Enzym zu Taurin decarboxyliert wird. Die Produktverteilung von L-Cysteinsäure und Taurin wird bestimmt durch die Aktivität des CS-Enzyms im Verhältnis zu der des CSAD-Enzyms. Bei ausreichender Dosierung des CSAD-Enzyms kann die L- Cysteinsäure quantitativ zu Taurin umgewandelt werden. Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem das eingesetzte OPS zu L- Cysteinsäure und Taurin umgewandelt wird, wobei die aufsummierte molare Ausbeute von L-Cysteinsäure und Taurin mehr als 60 %, besonders bevorzugt mehr als 70 % und insbesondere bevorzugt mehr als 80 % beträgt. Das Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure und die Decarboxylierung zu Taurin in einem Reaktionsansatz durchzuführen, ist insbesondere wirtschaftlich gesehen von Interesse. Es ist auch denkbar, dass im Sinne eines Metabolic Engineering-Ansatzes die Expression der Gene für die Cysteatsynthase, bevorzugt CSma, und die L-Cysteinsulfinsäure- Decarboxylase, bevorzugt CSADcc, im OPS-Produktionsstamm erfolgt und Taurin durch Anzucht eines solchen Produktionsstammes in Gegenwart einer Schwefelquelle, bevorzugt eines Sulfits (Salz der schwefligen Säure) produziert wird. Ebenso ist es denkbar, dass die Expression der Gene für die Cysteatsynthase, bevorzugt CSma, und die L- Cysteinsulfinsäure-Decarboxylase, bevorzugt CSADcc, gemeinsam in einem Stamm erfolgt und die Zellen aus der Anzucht dieses Stammes in Gegenwart eines Sulfits mit OPS zur Reaktion gebracht werden, wobei als Endprodukt Taurin entsteht. Bevorzugt ist ein Biotransformationsverfahren zur Herstellung von Taurin, bei dem die Verfahrenskomponenten OPS, das CS- Enzym und das CSAD-Enzym getrennt hergestellt werden. Taurin kann entweder ohne weitere Aufarbeitungsschritte direkt weiterverwendet oder aber mittels bekannter Methoden angereichert oder gereinigt werden. Solche Methoden sind dem Fachmann z.B. aus Verfahren zur Isolierung von Aminosäuren bekannt. Sie umfassen z.B. Filtration, Zentrifugation, Extraktion, Adsorption, Ionenaustauscher-Chromatographie, Präzipitation, Kristallisation. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der entstandenen L-Cysteinsäure in einem Verfahren zur Herstellung von Taurin. Gegenüber den bekannten chemischen Verfahren zur Herstellung von Taurin aus fossilen Rohstoffen ermöglicht die Verwendung der im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten L- Cysteinsäure zur Herstellung von Taurin ein biotechnologisches Verfahren aus pflanzlichen Rohstoffen. Ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Taurin ist wegen des nachhaltigen Produktionsprozesses vor allem für Anwendungen im Lebensmittel-, Futtermittel- oder Kosmetikbereich von Interesse. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, ohne durch sie beschränkt zu werden:
Beispiel 1: Herstellung einer serB-Deletionsmutante in Escherichia coli Verwendet wurde der Stamm Escherichia coli K12 W3110 (käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 5911 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Ziel der Geninaktivierung war die kodierende Sequenz des serB- Gens aus E. coli. Die DNS-Sequenz der cds des serB-Gens aus E. coli K12 (SEQ ID NO: 1, nt 67 bis nt 1032), kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2, ist zugänglich in der NCBI (National Center for Biotechnology Information) Gendatenbank mit der Gene-ID 948913. Das E. coli serB-Gen wurde mit der Red®/ET®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH, wie unten detailliert aufgeführt, inaktiviert (beschrieben im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit“, siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012 und darin zitierter Literatur, z.B. Datsenko und Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000): 6640-6645). Dazu wurden die Plasmide pKD13, pKD46 und pCP20 verwendet: - Das 3,4 kb große Plasmid pKD13 (Fig. 1) ist offenbart in der „GenBank“ Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048744.1. - Das 6,3 kb große Plasmid pKD46 (Fig. 2) ist offenbart in der „GenBank“ Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048746.1. - Das 9,4 kb große Plasmid pCP20 ist offenbart in Cherepanov und Wackernagel, Gene 158 (1995): 9–14. Zur Inaktivierung des serB-Gens in E. coli W3110 durch homologe Rekombination mit dem Lambda Red System wurden folgende Schritte durchgeführt: 1. E. coli W3110 wurde mit dem Plasmid pKD46 (sog. „Red Recombinase“ Plasmid, Fig. 2) transformiert und ein Ampicillin-resistenter Klon isoliert, bezeichnet als W3110 x pKD46. 2. Ein serB-spezifisches, zu dessen Inaktivierung geeignetes DNS-Fragment, wurde in einer PCR-Reaktion („PhusionTM High- Fidelity“ DNS-Polymerase, Thermo ScientificTM) mit DNS des Plasmids pKD13 (Fig. 1) und den Primern serb-1f (SEQ ID NO: 7) und serb-2r (SEQ ID NO: 8) hergestellt. Bei der PCR- Reaktion entstand ein 1,4 kb PCR-Produkt, das am 5‘- und am 3‘-Ende jeweils einen DNS-Abschnitt von 30 nt enthielt, der spezifisch für das serB-Gen aus E. coli W3110 war. Darüber hinaus enthielt das PCR-Produkt die Expressionskassette des in pKD13 enthaltenen Kanamycin Resistenzgens und, jeweils flankierend zum 5‘- und 3‘-Ende der Kanamycin Expressionskassette, sog. „FRT direct repeats“ (bezeichnet als „FRT1“ und „FRT2“ in Fig. 1), kurze DNS-Abschnitte, die in einem späteren Arbeitsschritt zur Entfernung des Antibiotikamarkers Kanamycin als Erkennungssequenz für die „FLP Rekombinase“ (enthalten auf dem Plasmid pCP20) dienten. Primer serb-1f enthielt 30 Nukleotide (nt) aus dem 5‘- Bereich des serB-Gens (nt 67-96 in SEQ ID NO: 1) und daran angeschlossen 20 nt spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „pr-1“ in Fig. 1). Primer serb-2r enthielt 30 nt aus dem 3‘-Bereich des serB- Gens (nt 1006–1035 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form) und daran angeschlossen 20 nt spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „pr-2“ in Fig. 1). 3. Das 1,4 kb große PCR-Produkt wurde isoliert und mit der dem Fachmann geläufigen nur methylierte DNS schneidenden Restriktionsendonuclease Dpn I behandelt, um restliche pKD13 Plasmid-DNS zu entfernen. Nicht-methylierte DNS aus der PCR- Reaktion wird dabei nicht abgebaut. 4. Das 1,4 kb große, für das serB-Gen spezifische und eine Expressionskassette für das Kanamycin Resistenzgen enthaltende PCR-Produkt wurde in E. coli W3110 x pKD46 transformiert und auf LBkan-Glycin-Platten bei 30°C Kanamycin-resistente Klone isoliert. LBkan-Glycin-Platten enthielten LB-Medium (10 g/L Trypton von GIBCOTM, 5 g/L Hefeextrakt von BD Biosciences, 5 g/L NaCl), 1,5% Agar, 15 mg/L Kanamycin (Sigma-Aldrich) und 1 g/L Glycin (Sigma- Aldrich). 5. Vier der erhaltenen Kanamycin-resistenten Klone wurden auf LBkan-Glycin-Platten gereinigt (d.h. Isolieren eines Klons durch Vereinzeln) und in einer PCR-Reaktion überprüft, ob die Kanamycin-Resistenz Kassette korrekt im serB-Gen integriert worden war. Die für die PCR-Reaktion („PhusionTM High-Fidelity“ DNS- Polymerase, Thermo ScientificTM) verwendete genomische DNS wurde mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von Kanamycin-resistenten Klonen von E. coli W3110 x pKD46 in LBkan-Glycin-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 15 mg/L Kanamycin, 1 g/L Glycin) isoliert. Dabei diente genomische DNS des E. coli W3110 Wildtyp Stammes als Kontrolle. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren serb-3f (SEQ ID NO: 9, das serB-Gen 5‘-flankierend, nt 1-22 in SEQ ID NO: 1) und serb-4r (SEQ ID NO: 10, das serB-Gen 3‘-flankierend, nt 1066-1085 in SEQ ID NO 1, in revers komplementärer Form). E. coli W3110 Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von 1,1 kb, wie für das intakte Gen erwartet. Die vier untersuchten Kanamycin-resistenten Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 1,6 kb, wie für den Fall erwartet, dass das 1,4 kb PCR-Produkt an den durch die Primer serb-1f und serb-2r definierten Stellen im serB-Gen integriert worden war. Dieses Ergebnis zeigte, dass am Genort des serB-Gens erfolgreich das Kanamycin-Resistenzgen integriert werden konnte und somit das serB-Gen inaktiviert worden war. Ein Klon mit inaktiviertem serB-Gen wurde ausgewählt und zur Entfernung des temperatur-sensitiven Plasmids pKD46 bei 42°C behandelt, wodurch der Stamm wieder Ampicillin-sensitiv wurde. Der Stamm erhielt die Bezeichnung W3110- ^serB::kan. 6. Zur Eliminierung des Kanamycin Selektionsmarkers wurde W3110- ^serB::kan mit dem Plasmid pCP20 transformiert und Transformanten bei 30°C selektiert. Der 9,4 kb Vektor pCP20 ist offenbart in Cherepanov und Wackernagel (1995), Gene 158: 9-14. Auf dem Vektor pCP20 ist das Gen der FLP- Rekombinase enthalten. Die FLP-Rekombinase erkennt die FRT- Sequenzen, welche die Expressionskassette des Kanamycin- Resistenzgens flankieren, und bewirkt die Entfernung der Kanamycin Expressionskassette. Dazu wurden die bei 30°C erhaltenen Klone bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurde zum einen die Expression der FLP- Rekombinase induziert und zum zweiten die Replikation des pCP20 Vektors unterbunden. Das Resultat dieses Schrittes waren Klone, in denen zum einen das serB-Gen inaktiviert worden war und die zum anderen wieder sensitiv gegen Kanamycin waren (sog. „Curing“ des Antibiotika Selektionsmarkers). Die Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom der ^serB-Mutanten ermöglicht die Einführung weiterer Mutationen, um Doppel- oder auch Mehrfachmutanten herzustellen. W3110- ^serB::kan war nach der Behandlung mit dem pCP20 Plasmid wieder Kanamycin-sensitiv, was wie folgt überprüft wurde: - durch Plattieren auf LB-Glycin und LBkan-Glycin-Platten: Wachstum auf LB-Glycin-Platten war positiv, während auf LBkan-Glycin-Platten kein Wachstum mehr beobachtet werden konnte, was auf die erfolgreiche Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom hindeutete. - durch PCR-Reaktion: Dazu wurde von den Kanamycin-sensitiven Klonen genomische DNS isoliert (Qiagen DNS-Isolierungskit) und in einer PCR-Reaktion („PhusionTM High-Fidelity“ DNS-Polymerase, Thermo ScientificTM) mit den Primern serb-3f (SEQ ID NO: 9) und serb-4r (SEQ ID NO: 10) eingesetzt. E. coli W3110 Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von 1,1 kb, wie für das intakte serB-Gen erwartet. Der Kanamycin-sensitive Klon hingegen ergab bei der PCR- Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 250 nt, was der erwarteten Größe der nach der homologen Rekombination verbliebenen 5‘- und 3‘-Fragmente des inaktivierten serB- Gens entsprach. Der aus diesem Schritt isolierte Stamm erhielt die Bezeichnung E. coli W3110- ^serB. Dieser Stamm zeichnete sich dadurch aus, dass er ein inaktiviertes serB-Gen enthielt, und dass dieser Stamm wieder sensitiv gegen das Antibiotikum Kanamycin war. Beispiel 2: Herstellung von OPS Herstellung im Schüttelkolben: OPS wurde durch Anzucht des Stammes E. coli W3110- ^serB im Schüttelkolben hergestellt. Zum Vergleich wurde die OPS- Produktion des WT-Stammes E. coli W3110 untersucht. Als Vorkultur für die Kultivierung im Schüttelkolben wurden jeweils 3 ml LB-Glycin-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl, 0,1 g/L Glycin) mit den Stämmen E. coli W3110 und E. coli W3110- ^serB beimpft und bei 30°C und 135 rpm für 16 h in einem Schüttler inkubiert. Hauptkultur: Anschließend wurde ein Teil der jeweiligen Vorkultur in einen 300 ml Erlenmeyerkolben (mit Schikane) mit 30 ml SM1-Medium, enthaltend 15 g/L Glucose, 5 mg/L Vitamin B1 (Sigma-Aldrich), je 0,1 g/L der Aminosäuren L-Isoleucin, D,L- Methionin, L-Threonin und 0,5 g/L Glycin (alle Sigma-Aldrich) überführt. Zusammensetzung des SM1-Mediums: 12 g/L K2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 5 g/L (NH4)2SO4, 0,3 g/L MgSO4 x 7 H2O, 0,015 g/L CaCl2 x 2 H2O, 0,002 g/L FeSO4 x 7 H2O, 1 g/L Na3Citrat x 2 H2O, 0,1 g/L NaCl; 1 ml/L Spurenelementlösung. Zusammensetzung der Spurenelementlösung: 0,15 g/L Na2MoO4 x 2 H20, 2,5 g/L H3BO3, 0,7 g/L CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/L CuSO4 x 5 H20, 1,6 g/L MnC12 x 4 H20, 0,3 g/L ZnSO4 x 7 H20. Die Hauptkulturen wurden mit so viel Vorkultur beimpft, dass eine anfängliche Zelldichte OD600/ml (optischen Dichte der Hauptkultur, gemessen bei 600 nm) von jeweils 0,3/ml eingestellt wurde. Davon ausgehend wurden die 30 ml-Ansätze für 24 h bei 30°C und 135 rpm inkubiert. Nach 24 h wurden Proben entnommen und die Zelldichte OD600/ml sowie der OPS-Gehalt sowohl im Kulturüberstand wie im Zellpellet bestimmt. Dazu wurden jeweils 2 ml der Zellkultur 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (HeraeusTM FrescoTM 21 Zentrifuge). Die Zellkulturüberstände wurden direkt durch HPLC auf den Gehalt an OPS untersucht. Die Zellpellets wurden in jeweils 2 ml H2O aufgenommen und Zellextrakte hergestellt. Dazu wurde der Zellhomogenisator FastPrep-24TM 5G der Fa. MP Biomedicals verwendet. Je 2 x 1 ml der in H2O suspendierten Zellpellets wurden in vom Hersteller vorgefertigten 1,5 ml Röhrchen mit Glaskugeln („Lysing Matrix B“) aufgeschlossen (3 x 20 sec bei einer Schüttelfrequenz von 6000 rpm mit jeweils 30 sec Pause zwischen den Intervallen). Die erhaltenen Zellhomogenate wurden jeweils vereinigt und 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert, um einen Zellextrakt herzustellen. Der Zellextrakt wurde durch HPLC auf den Gehalt an OPS untersucht. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Tab.1: Anzucht der Stämme E. coli W3110 und E. coli W3110- ^serB und HPLC-Analyse des OPS-Gehalts von Zellkulturüberstand und Zellextrakt HPLC-Analytik von OPS, L-Cysteinsäure und Taurin: Zur quantitativen Bestimmung der in den Beispielen analysierten Verbindungen wurde eine jeweils für OPS, L-Cysteinsäure und Taurin kalibrierte HPLC-Methode eingesetzt, wobei alle zur Kalibrierung verwendeten Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich waren (Sigma-Aldrich). Verwendet wurde ein HPLC- Gerät der Fa. Agilent, Modell 1260 Infinity II, ausgerüstet mit einer aus der Analytik von Aminosäuren bekannten Vorsäulenderivatisierung mit o-Phtaldialdehyd (OPA- Derivatisierung) vom gleichen Hersteller. Zum Nachweis der OPA-derivatisierten Produkte von OPS, L-Cysteinsäure und Taurin war das HPLC-Gerät mit einem Fluoreszenzdetektor ausgerüstet. Der Detektor war eingestellt auf eine Excitationswellenlänge von 330 nm und eine Emissionswellenlänge von 450 nm. Des Weiteren verwendet wurde eine Luna® C18(2) Säule der Fa. Phenomenex, Länge 250 mM, innerer Durchmesser 4,6 mm, Partikelgröße 5 µm, im Säulenofen auf 40°C temperiert. Laufmittel A: 25 mM Na-Phosphat, pH 6,0. Laufmittel B: Methanol. Die Trennung erfolgte im Gradientenmodus: 0 – 10 min, 1% - 15% Laufmittel B, gefolgt von 15 min 15% Laufmittel B, bei einer Flussrate von 1,0 ml/min. Retentionszeit von L- Cysteinsäure: 6,95 min. Retentionszeit von OPS: 7,65 min. Retentionszeit von Taurin: 21,9 min. Herstellung von OPS durch Fermentation: OPS wurde durch Fermentation des Stammes E. coli W3110- ^serB hergestellt. Vorkultur 1: 20 ml LB-Glycin-Medium wurden in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit dem Stamm E. coli W3110- ^serB beimpft und 7 h auf einem Schüttler (150 rpm, 32°C) inkubiert. Vorkultur 2: Anschließend wurde die Vorkultur 1 vollständig in 100 ml SM1- Medium, supplementiert mit 10 g/L Glucose, 10 g/L Hefeextrakt, 0,3 g/L D,L-Methionin, 1 g/L Glycin, und 5 mg/L Vitamin B1 überführt. Die Kultur wurde in einem Erlenmeyerkolben (1 L Volumen) bei 32°C für 17 h bei 150 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler). Nach dieser Inkubation lag die Zelldichte OD600/ml bei 5,7/ml. Hauptkultur: Die Fermentation wurde in einem Fermenter des Typs „DASGIP® Parallel Bioreactor Systems für die Mikrobiologie“ der Firma Eppendorf durchgeführt. Es wurden Kulturgefäße mit 1,81 Gesamtvolumen verwendet. Das Fermentationsmedium (600 ml) enthielt 10 g/L Glucose, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaC1, 0,225 g/L CaCl2 x 2 H2O, 1,2 g/L MgSO4 x 7 H2O, 0,075 g/L FeSO4 x 7 H2O, 1 g/L Na3Citrat x 2 H2O, 1 g/L Glycin, 1 g/L L-Threonin, 0,018 g/L Vitamin Bl, 0,09 g/L Vitamin B6 und 10 ml Spurenelementlösung (siehe Schüttelkolbenanzucht). Der pH-Wert im Fermenter wurde zu Beginn durch Zupumpen einer 25% NH4OH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische Korrektur mit 25% NH4OH, bzw. 4 M H3PO4 auf einem Wert von 7.0 gehalten. Schaumbekämpfung erfolgte durch automatische Zudosierung von 4 % v/v Struktol J673 in H2O (Schill & Seilacher). Zum Animpfen wurden 60 ml der Vorkultur 2 in das Fermentergefäß gepumpt. Das Anfangsvolumen betrug somit etwa 660 ml. Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit einer Belüftungsrate von 2 vvm (Vol. Luft pro Vol. Kulturmedium pro min) einer über einen Sterilfilter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingungen war die Sauerstoff-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden. Der Soll-Wert für die O2-Sättigung während der Fermentation wurde auf 30% eingestellt. Nach Absinken der O2-Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die O2-Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max. 5 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit (auf max. 1.600 rpm) kontinuierlich gesteigert. Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 32°C durchgeführt. Sobald der Glucose-Gehalt im Fermenter von anfänglich 10 g/L auf ca. 2 g/L abgesunken war, erfolgte eine kontinuierliche Zudosierung einer 56% (w/w) Glucose-Lösung. Die Fütterungsrate wurde so eingestellt, dass die Glucosekonzentration im Fermenter 2 g/L fortan nicht mehr überstieg. Die Glucose- Bestimmung erfolgte mit einem Glucoseanalysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA). 23 h nach Beginn der Fermentation wurde der Fermentationsansatz mit 3,5 ml einer 200 g/L Glycinlösung in H2O aufgestockt. Die Fermentationsdauer betrug 53 h. 23 h, 30 h, 47 h und 53 h nach Start der Fermentation wurden Proben vom Fermentationsansatz entnommen und von einem Aliquot die Zelldichte OD600/ml bestimmt. Ein weiteres Aliquot wurde jeweils 5 min bei 80°C inkubiert, zentrifugiert und vom Zellkulturüberstand der Gehalt von OPS durch HPLC bestimmt. Zelldichte und OPS-Gehalt sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tab. 2: Zeitlicher Verlauf von Zelldichte und OPS-Gehalt der Fermentation des Stammes E. coli W3110- ^serB Beispiel 3: Herstellung von CSma-Enzym Verwendet wurde Cysteatsynthase aus Methanosarcina acetivorans (CSma). Die Aminosäuresequenz des CSma-Enzyms ist zugänglich in der NCBI Datenbank unter der Zugangs-ID WP_048066469. Aus der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz abgeleitet (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) und synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics). Die synthetisch hergestellte DNS hatte die in SEQ ID NO: 3 offenbarte Sequenz und enthielt die cds des Gens, im Folgenden als CSma-cds bezeichnet (SEQ ID NO: 3), kodierend für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 offenbarten Aminosäuresequenz und bezeichnet als CSma. Für Klonierungszwecke enthielt die synthetisch hergestellte DNS am 5‘-Ende eine EcoRI Schnittstelle und am 3‘-Ende eine HindIII Schnittstelle. Zur Herstellung des zur rekombinanten Expression der CSma-cds geeigneten Vektors pCSma-pKKj (Fig. 3) wurde die synthetisch hergestellte DNS mit EcoRI und HindIII geschnitten und in bekannter Weise als EcoRI/HindIII-Fragment in den mit EcoRI und HindIII geschnittenen Vektor pKKj kloniert. Der Expressionsvektor pKKj, offenbart in EP2670837A1 (Wacker Anmeldung), ist ein Derivat des Expressionsvektors pKK223-3. Die DNS-Sequenz von pKK223-3 ist offenbart in der GenBank Gendatenbank unter der Zugangsnummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262 – 1947 der in M77749.1 offenbarten DNS-Sequenz), wodurch der 2,9 kb Expressionsvektor pKKj entstand. Zur Expression der CSma-cds in E. coli wurde der Vektor pCSma- pKKj in bekannter Weise in den Stamm E. coli K12 JM105 transformiert. Der Stamm E. coli K12 JM105 ist käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 3949 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Klone der Transformation wurden auf LBamp Platten selektiert. LBamp enthielt 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 15 g/l Agar und 100 mg/L Ampicillin (Sigma-Aldrich). Ein Klon wurde ausgewählt und in einer Schüttelkolbenanzucht kultiviert. Der CSma produzierende Stamm erhielt die Bezeichnung E. coli JM105 x pCSma-pKKj. Die Expression der CSma-cds erfolgte in E. coli JM105 x pCSma-pKKj in bekannter Weise unter Kontrolle des mit der CSma-cds funktionell verknüpften, IPTG-induzierbaren tac-Promotors (IPTG: Isopropyl-ß-Thiogalactosid, Sigma-Aldrich). Anzucht im Schüttelkolben: Vom Stamm E. coli JM105 x pCSma-pKKj wurde in LBamp-Medium eine Vorkultur hergestellt (Anzucht bei 37°C und 120 rpm über Nacht, Infors Truhenschüttler). Zwei ml Vorkultur (OD6003,4/ml) wurden als Inokulum einer Hauptkultur (0,3 L Erlenmeyerkolben) von 50 ml SM1-Medium (Beispiel 2), supplementiert mit 15 g/L Glucose; 5 g/L Pepton (Oxoid); 2,5 g/L Hefeextrakt; 0,005 g/L Vitamin B1 (Sigma- Aldrich); 5 mg/L Pyridoxalphosphat (PLP, Sigma-Aldrich) und 100 mg/L Ampicillin, verwendet. Die Hauptkultur wurde in einem Truhenschüttler (Infors) bei 30°C und 140 rpm geschüttelt. Nach 4 h Inkubationsdauer wurde eine Zelldichte OD600 von 2,0 erreicht. Dann wurde der Induktor IPTG (Sigma-Aldrich, 0,4 mM Endkonzentration) zugegeben und die Anzucht für weitere 20 h in einem Truhenschüttler (Infors) bei 30°C und 140 rpm fortgesetzt. Bei Beendigung der Anzucht betrug die Zelldichte OD6003,1/ml. Die Zellen aus der Schüttelkolbenanzucht wurden durch Zentrifugation isoliert (10 min 15000 rpm, Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem SS34 Rotor). Zur Herstellung einer Zellsuspension wurde das Zellpellet aus 50 ml Schüttelkolbenanzucht in 2 ml 100 mM K-Phosphat, pH 7,0; 100 mM KCl (KPi7,0-Puffer) aufgenommen und zur Herstellung eines Zellhomogenats verwendet. Die Herstellung eines Zellhomogenats unter Verwendung des Zellhomogenisators FastPrep-24TM 5G der Fa. MP Biomedicals erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben. Das erhaltene Zellhomogenat (2 ml Volumen) wurde ohne weitere Aufarbeitung für die Biotransformation von OPS zu L- Cysteinsäure (Beispiel 5) verwendet. Der Proteingehalt des Zellhomogenats wurde mit einem Qubit 3.0 Fluorometer der Fa. Thermo Fisher Scientific unter Einsatz des „Qubit® Protein Assay Kits“ nach Angaben des Herstellers bestimmt. Der Proteingehalt des Zellhomogenats aus der Schüttelkolbenanzucht betrug 5,3 mg/ml. Beispiel 4: Herstellung von L-Cysteinsäure aus kommerziell erhältlichem OPS und Na2SO3 durch Biotransformation mit CSma-Enzym Zwei Ansätze wurden parallel durchgeführt: Ansatz 1: In einem 100 ml Erlenmeyerkolben wurden 8,15 ml KPi7,0-Puffer vorgelegt und nacheinander 1 ml einer 0,2 M Lösung von Na2SO3 in KPi7,0-Puffer-Puffer, 0,5 ml CSma Zellhomogenat aus der Schüttelkolbenanzucht (Beispiel 3) und 350 µl einer 0,2 M Lösung von OPS (Sigma-Aldrich) in KPi7,0- Puffer zugegeben. Das Ansatzvolumen betrug 10 ml. Ansatz 2: Der Ansatz (Vergleichsansatz ohne Na2SO3) hatte die gleiche Zusammensetzung wie Ansatz 1. Anstelle der Na2SO3- Lösung erhielt Ansatz 21 ml KPi7,0-Puffer-Puffer. Beide Ansätze wurden in einem Truhenschüttler (Infors) bei 30°C und 140 rpm inkubiert. Nach 1 h, 2 h und 4 h wurden jeweils 1 ml der Ansätze 5 min bei 80°C inkubiert, zentrifugiert und der Überstand durch HPLC analysiert. Der zeitliche Verlauf der Produktion von L-Cysteinsäure aus OPS ist in Tabelle 3 dargestellt. Tab. 3: Zeitlicher Verlauf der Produktion von L-Cysteinsäure durch Biotransformation von OPS und Na2SO3 mit CSma- haltigem Zellhomogenat Beispiel 5: Herstellung von L-Cysteinsäure aus OPS-haltigem Kulturüberstand aus der Schüttelkolbenanzucht und Na2SO3 durch Biotransformation mit CSma- Enzym In einem 100 ml Erlenmeyerkolben wurden 9 ml Zellkulturüberstand aus der Schüttelkolbenanzucht des Stammes E. coli W3110- ^serB (Beispiel 2) mit einem Gehalt an OPS von 113,6 mg/L vorgelegt und 0,3 ml 3 M KCl, 0,5 ml 0,2 M Na2SO3 in KPi7,0-Puffer sowie 1 ml CSma-Zellhomogenat aus der Schüttelkolbenanzucht (Beispiel 3) zugegeben. Das Ansatzvolumen betrug 10,8 ml. Der Ansatz wurde in einem Truhenschüttler (Infors) bei 30°C und 140 rpm inkubiert. Zu Beginn und nach 6 h Inkubationsdauer wurden jeweils 1 ml des Ansatzes 5 min bei 80°C inkubiert, zentrifugiert und der Überstand durch HPLC auf den Gehalt an OPS und L-Cysteinsäure analysiert. Der zeitliche Verlauf der Reaktion ist in Tabelle 4 zusammengefasst. Die molare Ausbeute an L-Cysteinsäure, bezogen auf die eingesetzte molare Menge OPS, betrug 97,6 % Tab. 4: Zeitlicher Verlauf der Produktion von L-Cysteinsäure aus OPS-haltigem Zellkulturüberstand und Na2SO3 durch Katalyse mit CSma-haltigem Zellhomogenat Beispiel 6: Präparative Herstellung von L-Cysteinsäure durch Biotransformation von OPS bei konstantem pH OPS-Substrat: 10 ml Fermenterbrühe aus der Fermentation des Stammes E. coli W3110- ^serB (Beispiel 2) wurden zentrifugiert (10 min 15000 rpm, Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem SS34 Rotor) und der OPS-Gehalt im Fermentationsüberstand durch HPLC bestimmt. Der OPS-Gehalt betrug 5,6 g/L. CSma-Homogenat: Zellhomogenat des Stammes E. coli JM105 x pCSma-pKKj wurde aus 2 x 50 ml Schüttelkolbenanzucht hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Das Homogenat wurde mit 15 µl 500 mg/L PLP supplementiert. Das Gesamtvolumen des Homogenats betrug 4 ml. Biotransformationsansatz: Ein doppelwandiges, nach unten sich konisch verjüngendes 50 ml thermostatisierbares Reaktionsgefäß (Zubehör zum Titrator TitroLine alpha, Schott) wurde über eine Schlauchverbindung an einen Thermostaten (Lauda) angeschlossen und auf 30°C temperiert. Der Reaktionsansatz enthielt 6 ml OPS-haltigen Fermentationsüberstand mit einem OPS-Gehalt von 5,6 g/L, 4 ml CSma-Homogenat, 0,2 ml 3 M KCl, 0,1 ml 0,1 M DTE (Dithioerythrol, Sigma-Aldrich), sowie 0,3 ml einer 1 M Lösung von Na2SO3 in KPi7,0-Puffer. Das Ansatzvolumen betrug 10,6 ml. Die OPS-Konzentration im Ansatz betrug 17,1 mM (0,18 mmol OPS in 10,6 ml Ansatzvolumen). Der Ansatz wurde mit einem Magnetrührer gerührt. Der Ansatz wurde weiterhin mit einer pH- Elektrode (Mettler Toledo) ausgestattet, welche mit einer pH- Kontrolleinheit (Titrator TitroLine alpha, Schott) verbunden war, die nach den Vorgaben des Herstellers im pH-Stat Modus betrieben wurde. Unter pH-Stat Bedingungen wurde der pH im Reaktionsgefäß während der gesamten Laufzeit der Reaktion konstant beim eingestellten pH 7,0 gehalten durch Zudosierung von 0,5 M NaOH aus einer mit der Kontrolleinheit verbundenen Bürette. Die Reaktionsdauer betrug 4 h. Da dem Ansatz zur Konstanthaltung des pH-Werts 7,0 aus der Bürette 0,5 M NaOH zugeführt wurde, betrug das Ansatzvolumen nach 4 h Reaktionsdauer 13,0 ml. 2 h und 4 h nach Start der Reaktion wurden je 50 µl Aliquots des Ansatzes entnommen und der Gehalt an OPS und L-Cysteinsäure durch HPLC analysiert. Der zeitliche Reaktionsverlauf ist in Tabelle 5 zusammengefasst. Nach 4 h Reaktionsdauer betrug der L-Cysteinsäure Gehalt im Ansatz 2399,6 mg/L (14,2 mM), was bei einem Ansatzvolumen von 13,0 ml einer absoluten molaren Ausbeute von 0,18 mmol L-Cysteinsäure entsprach. OPS war vollständig verbraucht. Bezogen auf die eingesetzte Menge OPS von 0,18 mmol entsprach dies einer Ausbeute von 100 %. Tab. 5: Mittels HPLC nachgewiesene Menge an OPS und L- Cysteinsäure in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, wobei ein OPS-haltiger Fermentationsüberstand, Na2SO3 und ein CSma-haltiges Zellhomogenat aus der Schüttelkolbenanzucht eingesetzt wurden Beispiel 7: Rekombinante Produktion der CSADcc aus Cyprinus carpio (Karpfen) in E. coli CSADcc-Gen: Die aus der mRNS abgeleitete cDNS-Sequenz der Cysteinsulfinsäure-Decarboxylase (CSAD) aus Cyprinus carpio (Karpfen) ist in der NCBI-Datenbank (National Center for Biotechnology Information) unter der Genbank Sequence ID: AB220585.1 (cds: nt 82 – 1584) offenbart. Aus der korrespondierenden Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz abgeleitet (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) und synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics). Die synthetisch hergestellte DNS hatte die in SEQ ID NO: 5 offenbarte Sequenz und enthielt die cds des Gens, im Folgenden als CSADcc-cds bezeichnet (SEQ ID NO: 5, nt 31 - 1530), kodierend für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 6 offenbarten Aminosäuresequenz und bezeichnet als CSADcc. Für Klonierungszwecke enthielt die synthetisch hergestellte DNS am 5‘-Ende eine EcoRI Schnittstelle (SEQ ID NO: 5, nt 25 bis 30) und am 3‘-Ende eine HindIII Schnittstelle (SEQ ID NO: 5, nt 1532 bis 1537). Vektor pCSADcc-pKKj: Zur Herstellung des zur rekombinanten Expression der CSADcc- cds geeigneten Vektors pCSADcc-pKKj (Fig. 4) wurde die synthetisch hergestellte DNS mit EcoRI und HindIII geschnitten und in bekannter Weise als EcoRI/HindIII-Fragment in den mit EcoRI und HindIII geschnittenen Vektor pKKj (siehe Beispiel 3) kloniert. Dadurch wurde der Vektor pCSADcc-pKKj erhalten. Zur Expression der CSADcc-cds in E. coli wurde der Vektor pCSADcc- pKKj in bekannter Weise in den Stamm E. coli K12 JM105 transformiert. Klone der Transformation wurden auf LBamp Platten selektiert. Ein Klon wurde ausgewählt und in einer Schüttelkolbenanzucht kultiviert. Der CSADcc produzierende Stamm erhielt die Bezeichnung E. coli JM105 x pCSADcc-pKKj. Die Expression der CSADcc-cds erfolgte in E. coli JM105 x pCSADcc-pKKj analog wie in Beispiel 3 für E. coli JM105 x pCSma-pKKj beschrieben durch Anzucht im Schüttelkolben. Anzucht im Schüttelkolben: 10 ml einer Vorkultur (OD6003,1/ml) wurden als Inokulum einer Hauptkultur (1 L Erlenmeyerkolben) von 100 ml SM1-Medium, supplementiert mit 15 g/L Glucose; 5 g/L Pepton; 2,5 g/L Hefeextrakt; 0,005 g/L Vitamin B1; 5 mg/L Pyridoxalphosphat und 100 mg/L Ampicillin, verwendet. Anzucht und Induktion der Hauptkultur erfolgten wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Zellen aus 100 ml der Schüttelkolbenanzucht (OD6007,1/ml) wurden durch Zentrifugation isoliert und das Zellpellet in 4 ml KPi7,0-Puffer aufgenommen. Die Zellsuspension wurde direkt für Biotransformationsversuche verwendet. Beispiel 8: Herstellung von Taurin aus L-Cysteinsäure durch Biotransformation In einem 100 ml Erlenmeyerkolben wurden 9 ml des Ansatzes aus Beispiel 5 mit einem Gehalt von 84,5 mg/L L-Cysteinsäure (Tabelle 4) vorgelegt und 1 ml Zellsuspension des CSADcc- Enzyms aus Beispiel 7 zugegeben. Das Ansatzvolumen betrug 10 ml. Der Ansatz wurde in einem Truhenschüttler (Infors) bei 37°C und 140 rpm inkubiert. Nach 2 h wurde 1 ml des Ansatzes 5 min 80°C inkubiert, zentrifugiert und der Überstand durch HPLC analysiert. Die eingesetzte L-Cysteinsäure war vollständig verbraucht worden. Die gebildete Menge Taurin betrug 66,4 mg/L. Beispiel 9: Herstellung von Taurin aus OPS durch Biotransformation In einem 100 ml Erlenmeyerkolben wurden 9 ml eines Ansatzes aus der Schüttelkolbenanzucht des Stammes E. coli W3110- ^serB (Beispiel 2) mit einem Gehalt von 94,7 mg/L OPS vorgelegt und 0,5 ml einer 0,2 M Lösung von Na2SO3 in KPi7,0-Puffer-Puffer, 1 ml CSma Zellhomogenat aus der Schüttelkolbenanzucht (Beispiel 3) sowie 1 ml Zellsuspension des CSADcc-Enzyms (Beispiel 7) zugegeben. Das Ansatzvolumen betrug 11,5 ml. Der Ansatz wurde in einem Truhenschüttler (Infors) bei 30°C und 140 rpm inkubiert. Nach 4 h wurde 1 ml des Ansatzes 5 min 80°C inkubiert, zentrifugiert und der Überstand durch HPLC analysiert. Das eingesetzte OPS war vollständig verbraucht. Gleichzeitig waren 34,4 mg/L L-Cysteinsäure und 40,4 mg/L Taurin gebildet worden. In den Figuren verwendete Abkürzungen: bla: Gen, das Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht (ß- Lactamase) kanR: Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht ORI: Replikationsursprung („origin of replication“) pr-1: Bindungsstelle 1 für Primer pr-2: Bindungsstelle 2 für Primer FRT1: Erkennungssequenz 1 für FLP Recombinase FRT2: Erkennungssequenz 2 für FLP Recombinase araC: araC-Gen (Repressorgen) P araC: Promotor des araC-Gens P araB: Promotor des araB-Gens Gam: Lambda Phage Gam-Rekombinationsgen Bet: Lambda Phage Bet-Rekombinationsgen Exo: Lambda Phage Exo-Rekombinationsgen ORI101: Temperatur-sensitiver Replikationsursprung RepA: Gen für das Plasmid-Replikationsprotein A Ptac: tac Promotor EcoRI: Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRI HindIII: Schnittstelle für das Restriktionsenzym HindIII CSma: cds des Cysteatsynthasegens aus M. acetivora CSADcc: cds des Cysteinsulfinsäuredecarboxylasegens aus C. carpio

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von L-Cysteinsäure umfassend die Reaktion von O-Phospho-L-Serin (OPS) mit einem Salz der schwefligen Säure (Sulfit) und einer zur Enzymklasse EC 2.5.1.76 zählenden Cysteatsynthase (CS-Enzym) in einer Biotransformation.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym durch Anzucht eines Mikroorganismenstamms der Familie der Enterobacteriaceae, der das CS-Enzym heterolog und in enzymatisch aktiver Form exprimiert, hergestellt wird.
3. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym ohne einen vorherigen Renaturierungsschritt in die Reaktion eingesetzt wird.
4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym durch Anzucht eines Mikroorganismenstamms der Art Escherichia coli, der das CS-Enzym heterolog und in enzymatisch aktiver Form exprimiert, hergestellt wird.
5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das in die Reaktion eingesetzte OPS biotechnologisch hergestellt wird.
6. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das in die Reaktion eingesetzte OPS mit einem Mikroorganismenstamm mit unterdrückter Aktivität der zur Enzymklasse EC 3.1.3.3 zählenden O-Phospho-L-Serin Phosphatase (SerB-Enzym) hergestellt wird.
7. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das CS-Enzym die in SEQ ID NO: 4 angegebene oder eine dazu homologe Aminosäuresequenz besitzt, wobei eine zu SEQ ID NO: 4 homologe Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität von mindestens 50% zu SEQ ID NO: 4 und gleichzeitig Cysteatsynthase- Enzymaktivität aufweist.
8. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die molare Ausbeute an L- Cysteinsäure, bezogen auf die eingesetzte molare Menge OPS, mindestens 60% beträgt.
9. Verfahren zur Herstellung von Taurin, dadurch gekennzeichnet, dass L-Cysteinsäure in einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 hergestellt und decarboxyliert wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Decarboxylierung mittels einer zur Enzymklasse EC 4.1.1.29 zählenden Cysteinsulfinsäure-Decarboxylase (CSAD- Enzym) erfolgt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Aminosäuresequenz des CSAD-Enzyms um SEQ ID NO. 6 handelt.
12. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die molare Ausbeute an Taurin, bezogen auf die eingesetzte molare Menge L-Cysteinsäure, mindestens 60% beträgt.
13. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass alle Verfahrensschritte in einem Reaktionsansatz stattfinden (Eintopfverfahren).
14. Verwendung der L-Cysteinsäure hergestellt in einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von Taurin.
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