EP4493279A1 - Ligands spécifiques de la glycoprotéine pcpe-1 et leurs utilisations - Google Patents

Ligands spécifiques de la glycoprotéine pcpe-1 et leurs utilisations

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EP4493279A1
EP4493279A1 EP23714591.7A EP23714591A EP4493279A1 EP 4493279 A1 EP4493279 A1 EP 4493279A1 EP 23714591 A EP23714591 A EP 23714591A EP 4493279 A1 EP4493279 A1 EP 4493279A1
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EP
European Patent Office
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pcpe
seq
glycoprotein
nanobodies
ligand
Prior art date
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Pending
Application number
EP23714591.7A
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German (de)
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Inventor
Sandrine VADON-LE GOFF
Catherine MOALI
Priscillia LAGOUTTE
David Vandroux
Alexandra OUDOT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NVH Medicinal
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Centre Georges Francois Leclerc
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
NVH Medicinal
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Centre Georges Francois Leclerc
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Filing date
Publication date
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    • G01N2800/7052—Fibrosis

Definitions

  • the present invention relates to specific ligands for the PCPE-1 (Procollagen C-proteinase enhancer-1) protein. It also concerns their use in medical imaging and in diagnostic and treatment methods. More particularly it relates to two types of ligands: some capable of binding to PCPE-1 for use in imaging, and other so-called antagonist ligands capable of binding to PCPE-1 and inhibiting its activity, for use in therapy. In one embodiment of the invention, these antagonistic ligands are used for the diagnosis and treatment of fibrosis and cancer.
  • PCPE-1 Protein C-proteinase enhancer-1
  • Fibrillary collagens are the most abundant proteins in the human body and the main components of extracellular matrices. They shape organs and tissues and play a crucial role in maintaining their homeostasis or repair after injury. Long considered to have a structural role in tissues, collagens are now recognized as being integral players in numerous cellular processes such as adhesion, proliferation, migration and cell differentiation.
  • fibrosis which is characterized by excessive deposition of extracellular matrix composed mainly of collagen fibers, is a major common denominator of many pathologies that strongly affects disease progression, effectiveness and delivery of therapies (Henderson et coll. 2020). Furthermore, the production of abnormal collagen by tumor cells or by the microenvironment plays a major role in the immune escape of these cells and strongly contributes to their metastatic capacity as well as their dormancy and their resistance to treatments (Shi et al . 2022).
  • BTP bone morphogenetic protein- 1 (BMP1)/tolloid-like proteinases
  • BTPs are targets of choice, they possess, in addition to collagens, an activity directed against numerous other substrates involved in several pathways (activation of growth factors, angiogenesis, mineralization, tumor progression, etc.), which which means that inhibiting their activity could result in unwanted side effects.
  • PCPE-1 Protein C-Proteinase Enhancer-1
  • PCPE-1 is composed of two CUB (Complement-Uegf-BMP-1) domains and a C-terminal NTR (Netrin-like) domain, separated by a long linker.
  • CUB domains are necessary and sufficient for PCPE-1 activity (Kronenberg 2009 ; Vadon 2011 ) and this is due to their direct and close interaction with the C-propeptide of procollagens.
  • PCPE-1 protein is a therapeutic target for combating fibrosis-type diseases, in particular skin fibrosis and difficult healing.
  • the strategy considered in this document is the inhibition of the expression of PCPE-1, via the injection of siRNAs intended to block the translation of the gene into protein.
  • Nanobodies are the smallest antibody fragments (approximately 15 kDa), highly soluble and stable, they can be easily produced in large quantities in prokaryotic systems. Additionally, their convex paratope is well suited to bind to difficult-to-target cavities on the antigen surface.
  • Three types of approaches can be used to select antigen-specific nanobodies: from immune libraries, na ⁇ ve libraries or synthetic libraries.
  • An immune bank is generated by immunizing a camelid with the target. These are the most widely used nanobody banks, although with a limit for certain targets which are not immunogenic or too toxic for animal immunization. Due to these limitations, several synthetic banks have been developed. A selection can be made from these banks to identify nanobodies specific for one or more target protein(s). To date, more than 1400 VHHs have been successfully selected and are used as research tools, in biotechnological or diagnostic applications.
  • the present invention relates to a specific ligand for the glycoprotein PCPE-1, characterized in that it is a nanobody, also designated by the abbreviation VHH (Variable domain of the Heavy chain of Heavy chain-only antibodies).
  • the present invention also relates to a specific ligand for the glycoprotein PCPE-1, characterized in that it inhibits its activity.
  • This specific ligand is also called PCPE-1 antagonist ligand.
  • PCPE-1 antagonist ligand In particular, it is a PCPE-1 antagonist nanobody.
  • Another object of the invention is a specific ligand for the glycoprotein PCPE-1 consisting of a combination of two or three nanobodies as described above.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding a nanobody or a combination of two or three nanobodies, as described in the present application.
  • the present invention also relates to a specific ligand antagonist of the PCPE-1 glycoprotein for its use as a medicament, and more specifically for its medical use in the treatment of cancer or fibrosis, in particular cardiac fibrosis.
  • the present invention also relates to a specific ligand for the PCPE-1 glycoprotein as described in the present application, characterized in that it is coupled to a detectable marker, in particular a marker used in medical imaging.
  • Another object of the invention is the use of such a specific ligand for the PCPE-1 glycoprotein coupled to a detectable marker, for the in vivo monitoring of a pathological state by medical imaging.
  • Another object of the invention is a specific ligand for the PCPE-1 glycoprotein as described above, for its theranostic use for the treatment and in vivo monitoring of a pathological state by medical imaging.
  • the present application relates to a kit for determining the activity and/or quantity of the PCPE-1 glycoprotein in a biological sample in vitro or ex vivo, comprising:
  • Figure 1A Injection of 200 nM of VHHs selected by immunization on immobilized PCPE-1 (645 RU i.e. Resonance Units).
  • Figure 1 B Injection of 200 nM of VHHs selected from a synthetic library onto immobilized PCPE-1 (645 RU).
  • Figure 2A % inhibition of the interaction between VHHs (50 nM) and immobilized PCPE-1 when co-injecting the CUB1 or CUB2 domains (250 nM).
  • Figure 2B Injection of 250 nM of VHH-I5 followed by an injection of the same concentration of VHH-I5 in combination with 250 nM of a second VHH.
  • Figure 2C Injection of 250 nM of VHH-H4 followed by an injection of the same concentration of VHH-H4 in combination with 250 nM of a second VHH.
  • FIG. 2D VHHs I5 is biotinylated and immobilized on a streptavidin chip (813 RU), then increasing concentrations of PCPE-1 (in black) or PCPE-2 (in gray) are injected.
  • VHH H4 is biotinylated and immobilized on streptavidin chip (491 RU), then increasing concentrations of PCPE-1 or PCPE-2 are injected.
  • Figure 3C Immuno-detection of procollagen I and its C-terminal cleavage products in the culture medium of rat heart fibroblasts, after 48 hours of culture in the absence or presence of PCPE-1 (5 pg/ml) and of VHHs (15 pg/ml). Western blot analysis using an anti-C-propeptide antibody of procollagen I (LF41).
  • Figure 4A SPR analysis of the interaction of D1 with immobilized PCPE-1. Sequential injections of increasing concentrations of D1 (0-250 nM) and modeling of the interaction (dotted line) using the Langmuir model (Biacore T200 Evaluation software, Cytiva).
  • Figure 4B Inhibition of the PCPE-1 / mini-procollagen III interaction in the presence of diabody D1: the interaction of PCPE-1 (5 nM) with the immobilized mini-procollagen III is measured then compared to the interaction obtained when PCPE-1 (5 nM) is co-injected with increasing amounts (0-200 nM) of D1. The % of residual PCPE-1 binding is represented as a function of the D1 concentration.
  • FIG. 4C D1 inhibits the activity of PCPE-1 on procollagen III: CPU I-Long is incubated with BMP-1 and 75 nM of PCPE-1 in the absence or presence of 2 pM of monovalent or bivalent nanobody (1 h, 37°C). Analysis by SDS-PAGE (4-20% gel, Coomassie blue staining). The % inhibition is calculated by comparison with the PCPE-1 condition alone.
  • FIG. 4D D1 inhibits the activity of PCPE-1 on procollagens I and II: Mini I or Mini II are incubated with BMP-1 and 75 nM of PCPE-1, in the absence or presence of 2 pM of D1 (1 h, 37°C). The analysis is carried out by SDS-PAGE (8% gel, Coomassie blue staining). The % inhibition is calculated by comparison with the PCPE-1 condition alone.
  • Figure 4E Immuno-detection of procollagen I and its C-terminal cleavage products in the culture medium of rat heart fibroblasts, after 48 hours of culture in the absence or presence of PCPE-1 (5 pg/ml) and diabody D1 (15 pg/ml). Western blot analysis using an anti-C-propeptide antibody of procollagen I (LF41).
  • Figure 4G Immunodetection of procollagen I and its C-terminal cleavage products in the culture medium of human skin fibroblasts, after 72 hours of culture in the absence or presence of PCPE-1 (5 pg/ml), TGF- beta (5 ng/ml) and diabody D1 (15 pg/ml). Western blot analysis using an anti-C-propeptide antibody of procollagen I (LF41).
  • Figure 5 Use of a nanobody coupled to a detectable marker for the detection of PCPE-1
  • FIG. 5A SPR characterization of the PCPE-1/biotinylated VHH-H4 interaction. Biotinylation of VHH-H4 allows its oriented capture on a streptavidin chip. The presence of PCPE-1 in the injected sample is detected by its interaction with VHH-H4.
  • Figure 5B Detection by ELIS ⁇ : Calibration curve obtained by addition of increasing quantities of purified human PCPE-1. Concentration of PCPE-1 (ng/ml) in human plasma samples, mean ⁇ SD of 3 determinations, each in duplicate.
  • FIG. 6A Pharmacokinetics of VHH-H4-Ga 68 . Measurement of half-life time in blood; dosage during the 2.5 h following injection, expressed as a % of the injected dose (%ID, mean ⁇ SD, gamma count)
  • FIG. 6B Biodistribution of VHH-H4-Ga 68 determined ex-vivo 2.5 hours after injection, expressed as a % of the injected dose (%ID, mean ⁇ SD) for each organ (gamma counting)
  • Figure 6C Detection range of VHH-H4-Ga 68 on rat heart section. Autoradiography (phosphorimager) after one hour of incubation and one hour of exposure.
  • the present invention relates to a specific ligand for the glycoprotein PCPE-1, characterized in that it is a nanobody (also known as VHH).
  • glycoprotein PCPE-1 Procollagen C-proteinase enhancer-1
  • the human protein is referenced in the UniProt database under the reference Q15113, where its polypeptide sequence is described.
  • Collagens are synthesized in the form of soluble precursors called procollagens. The latter undergo proteolytic maturation before being able to assemble in the form of collagen fibers. This rate-limiting step is regulated by the glycoprotein PCPE-1, which specifically stimulates the C-terminal cleavage of fibrillar procollagen by BTP proteases, responsible for the removal of C-propeptides from fibrillar procollagens.
  • PCPE-1 interacts closely with the C-propeptide of collagen via its two CUB domains (Complement-Uegf-BMP-1).
  • telomere binding ligand designates a compound interacting with a protein in a non-covalent, reversible and specific manner.
  • a ligand is said to be “specific” when, on the one hand, it binds preferentially to its target protein among a multitude of target proteins with similar structures; and on the other hand, he presents an affinity, that is to say a force of interaction between said ligand and the target protein, judged to be sufficiently strong.
  • Affinity is quantitatively measured by the association/dissociation equilibrium constant, also called the affinity constant or equilibrium dissociation constant, abbreviated “KD”. The lower the KD value, the higher the binding affinity between the ligand and its target protein.
  • a ligand is considered to bind specifically to PCPE-1 if its affinity constant KD is less than 100 nM, or less than 80 nM, or less than 50 nM, and more preferably if it is less than 30 nM.
  • KD affinity constant
  • a nanobody means a single domain antibody, which corresponds to an antibody fragment composed of a single monomeric variable antibody domain, which corresponds to the single heavy chain variable domain of antibodies of the type found in camelids , which are naturally free of light chains.
  • a nanobody is capable of selectively binding to a specific antigen. It has the advantage of having a molecular weight of only 12 to 15 kDa, approximately 10 times less than common antibodies which have a molecular weight of 150 to 160 kDa.
  • a nanobody is also much less bulky than a classic antibody. In addition, the synthesis process, particularly in bacterial cells, is facilitated due to this simplified structure.
  • the first single-domain antibodies were designed from heavy-chain antibodies found in camelids; these are designated VH H fragments.
  • nanobody and VHH are used interchangeably and both designate a single domain antibody.
  • the nanobodies each have three CDRs, designated CDR1, CDR2, and CDR3 respectively.
  • the nanobodies according to the invention may in particular be llama nanobodies or synthetic nanobodies.
  • a combination of two nanobodies, covalently coupled, with or without a bonding agent, is designated by the term “diabody” or “diacorps” in French, or even by the term “bivalent nanobody”.
  • a combination of three nanobodies is designated by the term “tribody” or “tricorps” in French, or even “trivalent nanobody”.
  • ligands specific to the PCPE-1 glycoprotein are also included in the invention, in particular any protein structure equivalent to a nanobody, excluding antibodies.
  • protein scaffold capable of specifically binding to target epitopes are presented in the review by (Gebauer & Skerra, 2019)
  • the invention also relates to a specific ligand for the PCPE-1 glycoprotein, characterized in that it inhibits its interaction with the C-terminal domain of procollagens, which has the effect of inhibiting the activity of this PCPE-1 glycoprotein. .
  • PCPE-1 ligands have, in addition to the capacity to bind to this glycoprotein, the capacity to inhibit the activity of said PCPE-1 glycoprotein. They are then designated “PCPE-1 antagonist ligands”.
  • antagonist designates a compound interacting with a target protein exhibiting physiological activity, by reducing or even eliminating the physiological activity of said protein.
  • this inhibition of activity is characterized by an inhibition of the interaction of PCPE-1 with the C-terminal domains of procollagen.
  • This inhibition of PCPE-1 activity is considered to be significant when it is greater than 40%, or even at least 50%, and preferably greater than 60%.
  • PCPE-1 antagonist ligands may be of any nature, and in particular be synthetic chemical compounds, nucleic acids, or even protein structures, and in particular a polypeptide chain.
  • the PCPE-1 antagonist ligand is a polypeptide chain, and in particular is a nanobody (VHH). It is understood that any polypeptide structure equivalent to a nanobody is included in the invention.
  • the inventors have identified two families of nanobodies possessing either PCPE-1 binding activity for use in medical imaging and diagnosis, or PCPE-1 binding activity and inhibitory activity for use as a drug.
  • nanobodies were selected from a synthetic nanobody library or after immunization of a llama and possess PCPE-1 binding activity measured by surface plasmon resonance as presented in Figure 1. They were selected to possess a KD less than 100 nM and more precisely less than 30 nM (see Table 2 in the examples).
  • CDR1, CDR2 and CDR3 are sufficient to define an antigen binding site.
  • CDR complementarity determining region
  • the specific ligand of PCPE-1 is a nanobody whose polypeptide sequence includes three complementarity determining regions (CDRs) with PCPE-1, characterized in that among these three CDRs, at least a CDR has at least 80% identity with one of the sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 15.
  • CDRs complementarity determining regions
  • each CDR is defined as follows:
  • CDR1 presents at least 80% identity with one of the following sequences: SEQ ID NO. 1, 4, 7, 10 or 13; ii. CDR2 has at least 80% identity with one of the following sequences: SEQ ID NO.
  • CDR3 has at least 80% identity with one of the following sequences: SEQ ID NO.
  • the CDR1 of the nanobody has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with at least one of the CDR1 sequences mentioned in (i) above,
  • the CDR2 of the nanobody has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with at least one of the CDR2 sequences mentioned in (ii) above,
  • the CDR3 of the nanobody has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with at least one of the CDR3 sequences mentioned in (iii) above.
  • identity percentages to which reference is made in the context of the presentation of the present invention are determined after optimal alignment of the sequences to be compared, which may therefore include one or more additions, deletions, truncations and/or substitutions.
  • This identity percentage can be calculated by any sequence analysis method well known to those skilled in the art.
  • the percentage of identity can be determined after global alignment of the sequences to be compared taken in their entirety, over their entire length. In addition to manually, it is possible to determine the overall sequence alignment using the Needleman and Wunsch (1970) algorithm.
  • the comparison of the sequences can be carried out using any software well known to those skilled in the art, such as for example the Needle software.
  • the parameters used may in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the EDN ⁇ FULL matrix (EMBOSS version of NCBI NUC4.4).
  • the comparison of the sequences can be carried out using any software well known to those skilled in the art, such as for example the Needle software.
  • the parameters used may in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the BLOSUM62 matrix.
  • the percentage of identity defined in the context of the present invention is determined by means of a global alignment of the sequences to be compared over their entire length.
  • the specific ligand for the glycoprotein PCPE-1 is a nanobody which comprises three complementarity determining regions (CDRs) with PCPE-1, said three CDRs having at least 80% sequence identity with the combinations of following sequences: a) CDR1: SEQ ID NO. 1, CDR2: SEQ ID NO. 2 and CDR3: SEQ ID NO. 3; or b) CDR1: SEQ ID NO. 4, CDR2: SEQ ID NO. 5 and CDR3: SEQ ID NO. 6; or c) CDR1: SEQ ID NO. 7, CDR2: SEQ ID NO. 8 and CDR3: SEQ ID NO. 9; Or d) CDR1: SEQ ID NO. 10, CDR2: SEQ ID NO. 11 and CDR3: SEQ ID NO. 12; or e) CDR1: SEQ ID NO. 13, CDR2: SEQ ID NO. 14 and CDR3: SEQ ID NO. 15.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the three CDRs of the nanobody present at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the CDR sequences mentioned in (a) above, or
  • the three CDRs of the nanobody present at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the CDR sequences mentioned in (b) above, or
  • the three CDRs of the nanobody present at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the CDR sequences mentioned in (c) above, or
  • the three CDRs of the nanobody present at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the CDR sequences mentioned in (d) above, or
  • the three CDRs of the nanobody present at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the CDR sequences mentioned in (e) above.
  • the specific ligand for the PCPE-1 glycoprotein is a nanobody which comprises three complementarity determining regions (CDRs) with PCPE-1, said three CDRs having the following sequences: a) CDR1: SEQ ID NO. 1, CDR2: SEQ ID NO. 2 and CDR3: SEQ ID NO. 3; or b) CDR1: SEQ ID NO. 4, CDR2: SEQ ID NO. 5 and CDR3: SEQ ID NO. 6; or c) CDR1: SEQ ID NO. 7, CDR2: SEQ ID NO. 8 and CDR3: SEQ ID NO. 9; or d) CDR1: SEQ ID NO. 10, CDR2: SEQ ID NO. 11 and CDR3: SEQ ID NO. 12; or e) CDR1: SEQ ID NO. 13, CDR2: SEQ ID NO. 14 and CDR3: SEQ ID NO. 15.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the specific ligand for the PCPE-1 glycoprotein is a nanobody whose polypeptide sequence has at least 80% identity with one of the sequences SEQ ID NO. 16 to SEQ ID NO. 20.
  • this nanobody presents a polypeptide sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the sequences SEQ ID NO. 16 to SEQ ID NO. 20.
  • substitutions observed in the polypeptide sequences will be placed in the domains outside the CDRS, called “framework” regions of the nanobody.
  • the CDRs are conserved and present 100% identity with the sequences mentioned above in (a) for SEQ ID NO. 16; in (b) for SEQ ID NO. 17; in (c) for SEQ ID NO. 18; in (d) for SEQ ID NO. 19; and (e) for SEQ ID NO. 20.
  • the nanobody of the invention has a polypeptide sequence consisting of the sequence SEQ I D NO. 16; or SEQ I D NO. 17; or SEQ I D NO.
  • the present invention describes the association of these nanobodies within the same diabody or tribody type structure. This association is preferably carried out via the addition of a binding agent between the protein sequences of each nanobody. Those skilled in the art will know how to select the most suitable binding agent, in particular among those described in the review by Kwon, 2019. According to a preferred implementation, the sequence GSs (GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS, SEQ ID NO. 38) is used as liaison agent.
  • the specific ligand for the PCPE-1 glycoprotein consists of a combination of two or three nanobodies as described above, that is to say a diabody or a tribody, optionally comprising one or two binding agents, in particular one or two binding peptides (one for a diabody, two for a tribody).
  • a diabody consists of the association of a nanobody having a binding activity to CUB1 and another having a binding activity to CUB2, it being understood that each nanobody can be positioned either upstream or downstream of the binding peptide.
  • a diabody according to the invention may in particular consist of any combination of two polypeptide sequences each having at least 80% or 90% sequence identity with one of the sequences SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19 or 20, optionally further comprising a binding agent.
  • a diabody will consist of any combination of two polypeptide sequences each having a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO. 16 to SEQ ID NO. 20, optionally linked by a binding agent, in particular by a binding peptide.
  • This combination of two nanobodies may in particular present a polypeptide sequence having at least 80% or 90% identity with the sequence SEQ ID NO. 21, and in particular at least 95%, 98%, 99% or 100% identity with the sequence SEQ ID NO. 21.
  • the CDRs of the nanobodies are preserved and have 100% identity with the sequences mentioned above in (a) for SEQ ID NO. 16 (H4) and (c) for SEQ ID NO. 18 (I5).
  • this type of diabody can correspond to I5-Iinker-H4 or H4-Iinker-I5.
  • An example amino acid sequence for the H4-Iinker-I5 diabody corresponds to the sequence SEQ ID NO. 21.
  • a diabody according to the invention has a polypeptide sequence consisting of the sequence SEQ ID NO. 21.
  • Another object of the invention relates to a nucleic acid comprising a nucleic sequence coding for a nanobody or a combination of two or three nanobodies according to the present invention.
  • the nucleic acid according to the invention comprises or consists of a nucleic sequence encoding a nanobody defined by one of the amino acid sequences SEQ ID NO. 16 to 20 or encoding a diabody defined by the sequence SEQ ID NO. 21.
  • This nucleic acid is a DNA or RNA molecule, which can be included in any suitable vector, such as a plasmid, cosmid, episome, artificial chromosome, phage or viral vector.
  • vector designates the vehicle by which the DNA or RNA sequence can be introduced into a host cell, so as to transform the host and promote the expression (e.g. transcription and translation) of the DNA sequence. nucleic acid introduced.
  • a vector advantageously comprises regulatory elements, such as a promoter, an activator, a terminator, etc., to induce the expression of the polypeptide.
  • Another object of the invention relates to a vector comprising a nucleic acid according to the invention.
  • Another object of the invention is a host cell having integrated a vector as described above, and thus being able to express the nanobody, diabody or tribody according to the invention.
  • the present invention also relates to specific PCPE-1 ligands as defined above for use as a contrast agent in non-invasive medical imaging, for use in diagnostic methods and for use as a medicine.
  • the ligands described in the present invention having both a binding activity and an inhibitory activity of PCPE-1, are perfect candidates for a so-called theranostic approach.
  • composition comprising one of these ligands in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the compounds according to the invention can be used in immunoassays (ELISA, Westernblot, immunofluorescence, immunohistochemistry) to detect PCPE-1 in biological fluids or tissues, in vitro or ex vivo.
  • the present invention relates to a PCPE-1 glycoprotein antagonist ligand as described above, for its use as a medicament.
  • the present invention also relates to an antagonistic ligand for the PCPE-1 glycoprotein as described above, for its therapeutic use in the treatment of cancer or fibrosis, in particular cardiac fibrosis.
  • Fibrosis also called sclerosis, occurs following substantial tissue destruction or when inflammation occurs in a location where tissue does not regenerate. Fibrosis are pathologies characterized by excessive synthesis and deposition of extracellular matrix (ECM), leading to pathological scarring and stiffening which can lead to death when vital organs are affected (heart, liver, lung, etc.). .). There are several types of fibrosis: cardiac fibrosis, pulmonary fibrosis, hepatic fibrosis, renal fibrosis, muscle fibrosis, etc.
  • ECM extracellular matrix
  • Cancer is also a disease where collagen plays an important role, although this role is complex and dependent on the type of tumor (Shi et al., 2021).
  • the present invention also relates to a method of treating cancer or fibrosis, in particular cardiac fibrosis, comprising administering to a patient suffering from cancer or fibrosis, a PCPE-antagonizing ligand. 1, inhibiting its activity, as described above.
  • a "patient” designates a human or non-human mammal, such as a rodent (rat, mouse, rabbit), a primate (chimpanzee), a feline (cat), or a canine ( dog).
  • the patient is a human being, in particular suffering from cancer or fibrosis, and in particular cardiac fibrosis.
  • the present invention also relates to a specific ligand for the glycoprotein PCPE-1 as defined above, characterized in that it is coupled to a marker detectable in medical imaging.
  • PCPE-1 specific ligand coupled to a detectable marker we mean here that the detectable marker is linked, directly or indirectly, to the ligand, or is incorporated into the ligand.
  • the detectable marker may in particular be linked to the ligand by substitution, by complexion or by chelation.
  • a “detectable marker” means a compound which produces a detectable signal. When combined with a tracer, it makes it possible to monitor the fate of the tracer in the body.
  • a detectable marker here designates in particular a marker detectable in medical imaging.
  • the detectable marker used may in particular be an MRI contrast agent, a scintigraphy contrast agent, an X-ray imaging contrast agent, an ultrasound contrast agent, or an optical imaging contrast agent.
  • detectable labels include radioelements, fluorophores such as fluorescein, Alexa, cyanine; chemiluminescent compounds such as luminol; bioluminescent compounds such as luciferase or alkaline phosphatase; contrast agents such as nanoparticles or Gadolinium; and quantum dots.
  • fluorophores such as fluorescein, Alexa, cyanine
  • chemiluminescent compounds such as luminol
  • bioluminescent compounds such as luciferase or alkaline phosphatase
  • contrast agents such as nanoparticles or Gadolinium
  • quantum dots quantum dots
  • the marking can be oriented, via the introduction of a terminal cysteine, or of a recognition sequence by sortase or another ligase. Labeling can also be carried out by direct coupling after activation of the lysines.
  • the detectable marker is in particular a fluorophore, a chromophore or luminescent compound or a label detectable by an antibody. It can also be a chelator, such as NOD ⁇ G ⁇ , which is then coupled to a radioisotope, such as Ga68.
  • the ligand thus modified retains its capacity to bind to PCPE-1.
  • the PCPE-1 specific ligand coupled to a detectable marker can be used to detect the PCPE-1 protein in an immunoassay or in cell culture, as illustrated in Example 5.
  • the present invention also relates to the use of a specific PCPE-1 ligand coupled to a detectable marker as defined above, for in vivo monitoring of a pathological state by medical imaging.
  • the invention relates to the use of said specific PCPE-1 ligand coupled to a detectable marker as a contrast agent in medical imaging, in particular non-invasive, in vivo medical imaging.
  • a contrast agent designates a substance which, administered in the body, makes it possible to mark in a detectable manner organs or structures (tissue, cell, receptor) which, without a contrast agent, are little or not visible in medical imaging.
  • the specific PCPE-1 ligand coupled to the marker has pharmacokinetic characteristics compatible with its use as a contrast agent (rapid clearance but sufficient persistence to allow imaging, renal elimination, no accumulation in healthy animals). This is particularly illustrated in Example 6. These properties can if necessary be modulated by PEGylation, or other modification of the charge or lipophilicity of the molecules.
  • the present invention also relates to a method of medical imaging, in particular non-invasive in vivo medical imaging, in which a specific PCPE-1 ligand coupled to a detectable marker as defined above is administered to a patient, then the patient is subjected to a medical imaging protocol.
  • theranostics is a neologism constructed from the terms therapy and diagnosis, which corresponds to a medical approach aiming to favor the simultaneous development of diagnostic and therapeutic aspects. In particular, this involves using compounds that make it possible both to visualize the clinical situation of a patient in vivo, and to treat the condition concerned with the same compound.
  • PCPE-1 ligands according to the invention are entirely suitable for theranostic use.
  • the present invention relates to a specific PCPE-1 ligand coupled to a detectable marker, for its theranostic use for the treatment and in vivo monitoring of a pathological state by medical imaging.
  • this ligand is a PCPE-1 antagonist.
  • the present invention also relates to a kit for determining the activity and/or quantity of the PCPE-1 glycoprotein in a biological sample in vitro or ex vivo, comprising:
  • This specific PCPE-1 ligand will in particular be a ligand coupled to a detectable marker.
  • a biological sample means any type of sample from a living body, in particular from the body of a patient, and includes in particular blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid and tears.
  • PCPE-1 Native human or containing an 8his tag at the C-terminal
  • Miniprocollagen I Mini I, Twinstrep tag at the N-terminal of the a2 chain
  • Mini-procollagen II Mini II, 6His tag at the N- terminal
  • Mini-procollagen III Mini III, C-myc tag in N-terminal
  • BMP-1 flag tag in C-terminal
  • the CUB domains of PCPE-1 were prepared by limited proteolysis of CUB1 NTR and CUB2NTR as described by Kronenberg et al.
  • CPI 11 - Long and PCPE-2 were produced by transient transfection of HEK 293T cells and purified as already described.
  • the antigen used for the selection of nanobodies is the CUB1 CUB2 zone of the PCPE-1 protein (corresponding to amino acids 1 to 279). It was cloned into the pHLsec vector, in fusion with a 6-His tag and an N-terminal HRV-3C protease cleavage sequence. It was then produced by transient transfection of 293-F cells, cultured at 37°C, 125 rpm, 8% CO2 in FreestyleTM 293 medium (Gibco), according to the procedure described by Pulido et al. CUB1 CUB2 was purified on a Ni-excel column (5 ml; Cytiva), then treated with HRV-3C protease at 4°C overnight to eliminate the histidine tag.
  • a biotinylated form of CUB1 CUB2 was prepared for biopanning and phage-ELISA.
  • the coding sequence for the CUB1 CUB2 region was cloned into the pHL-Avitag3 vector between the EcoRI and Kpnl sites then the protein was expressed at 293-T as above.
  • 60 pM of CUB1 CUB2avi were biotinylated using 1 pM of GST-BirA (Biotin -protein ligase) in 50 mM bicine buffer, 300 mM potassium glutamate pH 8.3 in the presence of 10 mM ATP and 50 pM d-biotin for 5 h at 30 °C.
  • GST-BirA (cloned into the pGex vector, gift from Y. Zhao, STRUBI, Oxford, GB) was produced in E. Coli BL21(DE3)pLysS bacteria. Purification on cobalt resin then gel filtration with a Superdex S75 column (20 mM HEPES buffer pH 7.4, 0.3 M NaCl) allows the elimination of excess BirA and biotin and the obtaining of a pure and 95% biotinylated.
  • the llama nanobodies were generated by the platform of the Architecture and Function of Biological Macromolecules Laboratory (Marseille, France). Briefly, a Llama ⁇ lama was immunized by five successive injections of 1 mg of CUB1 CUB2 one week apart. After 39 days, blood was collected, and the nanobody library was generated as previously described. Two biopanning steps on 50 nM of biotinylated CUB1 CUB2 made it possible to enrich phages expressing nanobodies specifically recognizing CUB1 CUB2. 48 clones (phagemid) were selected and their affinity for human PCPE-1 determined by phage ELIS ⁇ . Positive clones were sequenced and their sequences aligned and analyzed using ESPript 3.0. Eight nanobodies were selected to be characterized in more detail: 11, I2, I3, I4, I5, I7, 110 and 111.
  • the synthetic nanobodies were selected by Hybrigenics Services S ⁇ S. After three biopanning steps on biotinylated CUB1CUB2 using the hsd2ab nanobody library (Moutel et al., 2016), 90 clones were tested by phage ELISA for their ability to bind to PCPE1. After sequencing, a library of 24 unique positive clones was obtained. Ten of them were selected to be characterized in more detail: H1 to H10.
  • the synthetic nanobodies were cloned into the pET29b(+) vector, in fusion with the pelB signal sequence and a 6-His tag in the C-terminal position.
  • Llama nanobodies were cloned into the pHEN6 vector following the pelB sequence and in fusion with a 6-His tag at the C-terminal position.
  • the VHH-I5 nanobody was amplified by PCR with the addition of a Notl restriction site and a GSs sequence (GSGSGSGSGSGSGSGSGS, SEQ ID NO. 38) at the N-terminal.
  • the GSs-VHH-15 construct was then cloned following VHH-H4 into pET29b(+) by NotI/XhoI digestion to lead to the bivalent nanobody VHH-H4-GSs-VHH-l5 (D1).
  • E. coli T7 express bacteria E. coli T7 express bacteria
  • D0600 0.8
  • protein expression is triggered by treatment with 0.1 mM IPTG (B-D-1 -thiogalactopyranoside) and the cells are incubated overnight at 28° C., in Terrifie Broth medium containing 0.1% of glucose.
  • the cells are then harvested by centrifugation at 4000 rpm for 15 min at 4°C and resuspended in TES buffer (200 mM Tris HCl pH 8.0, 500 mM Sucrose, 50 nM EDTA).
  • the periplasmic fraction is prepared by osmotic shock and the nanobodies are purified by affinity chromatography on nickel resin (Qiagen) and gel filtration (Superdex 75 16/600; Cytiva) in 20 mM HEPES, 0.3 M NaCl pH 7.4 buffer.
  • nanobodies were also cloned into the pHEN vector containing the sequence LPETG (recognition site for Sortase, SEQ ID NO. 39) and a 6-His tag in the C-terminal position (gift from Dr. Leo Hanke, Karolinska Institut, Sweden), and produced and purified as described in (Hanke et al., 2020).
  • the Sortase A 5M cloned in the pET30b vector ( ⁇ ddgene #51140), with a 6-His tag at the C-terminal was produced and purified according to the supplier's instructions.
  • the nanobodies were biotinylated on their C-terminus using 50 pM Sortase ⁇ 5M and 200 pM GGGK-biotin (Covalab) in 50 mM HEPES buffer pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCb, 2 h at 25°C.
  • the 5M Sortase and the excess nanobodies were removed by passing through Ni-NT ⁇ resin (Qiagen; 2 ml), then the excess biotin by passing through Zeba spin (7K MWCO, Thermo Fisher Scientific).
  • SPR Surface plasmon resonance
  • Regeneration is obtained by successive injection of 2M guanidine chloride and 0.5M EDT ⁇ for 30 sec.
  • the sensorgrams were analyzed using the Biacore T200 Evaluation v3.2.1 evaluation software (Cytiva), using the most suitable models.
  • IC50 was determined by nonlinear regression using GraphPad Prism (v8.2.1).
  • the level of activation by PCPE-1 was assessed as the ratio between the intensity of the C-propeptide band and the intensity of all long CPI II bands (cleaved and uncleaved), after normalization with the condition BMP-1 alone, using ImageQuantTL software (Cytiva).
  • Rat heart fibroblasts were cultured in DMEM medium, 10% FCS (Eurobio), 1% ASA (Antibiotic-antimycotic solution; Thermo Fisher) at 37°C, 5% CO2. At 70% confluence of the cells, the serum was removed and replaced with serum-free medium, containing PCPE-1 (5 pg- mL'1 ) and/or 15 pg- mL'1 nanobodies. After 48 h of culture, the supernatants are harvested and the procollagen is analyzed by western blotting using a anti-C-propeptide antibody (LF41, gift from Dr. Larry W. Fisher, Bethesda, USA). Quantification of the bands is carried out using ImageQuantTL software (Cytiva).
  • VHH-H4 is bioconjugated with NODAGA then labeled with galium 68 according to the procedure described in (Renard et al, 2020). Its biodistribution is evaluated in rats after iv injection of 25 pg (12 MBq). For this, 9 blood samples (150-200 pL) were taken during the 2.5 hours following the injection, after which the animal was euthanized. The collected tissues were analyzed by gamma counting.
  • Figure 1 presents the results of the selection of PCPE-1 binding nanobodies from the llama nanobody bank or a synthetic bank.
  • the nanobodies were generated by five successive injections of recombinant CUB1 CUB2 into a llama, followed by two biopanning steps. 48 clones have were analyzed by phage-ELISA, leading to 11 unique clones after sequencing. These 11 clones can be classified into six families based on their CDR3s. The first family is the most represented with 5 clones while the others have only one or two variants. 3 members of family 1 (VHH-11, VHH-I5 and VHH-I7) and one member of each of the other families were selected, produced in the periplasm of E.coli and purified. Their affinity for PCPE-1 was measured by surface plasmon resonance (SPR) (Fig. 1A).
  • SPR surface plasmon resonance
  • VHH-110 binds to PCPE-1 (Table 2).
  • Table 2 All except VHH-110 bind to PCPE-1 (Table 2).
  • family 1 the interaction of VHH-11 with PCPE-1 appears less stable than those of VHH-I5 and -I7, leading to a significantly higher dissociation constant (Table 2).
  • VHH-I3 is a strong PCPE-1 ligand, with dissociation constants in the nanomolar range.
  • the selection of the synthetic nanobodies was carried out using three cycles of phage display, then 90 clones were chosen at random and tested by phage ELIS ⁇ for their ability to bind to PCPE-1. 32% of the clones gave a positive signal, which corresponds to 24 unique clones after sequencing. 7 of these 24 clones also gave a positive signal when tested against immobilized CUB1 NTR. 10 clones (including these 7) were finally produced and purified, and then their affinity for PCPE-1 was measured by SPR (Fig. 1 B). Of the 10, only half give a clear interaction with PCPE-1 when injected at 200 nM, the best results being obtained with VHH-H4 and VHH-H10 (Fig. 1 B) whose KDS are l nanomolar order (Table 2).
  • nanobodies from the synthetic nanobodies bank are designated by names starting with the letter H; nanobodies derived from the serum of an immunized llama are designated by names starting with I.
  • Figure 1A presents the PCPE-1 binding activity of the eight nanobodies derived from llama serum: 11, I2, I3, I4, I5, I7, 110 and 111.
  • Figure 1 B shows the PCPE-1 binding activity of the following ten synthetic nanobodies: H1 to H10.
  • Table 2 shows the KD affinity constants of seven llama-derived nanobodies (as noted above, nanobody 110 does not bind at all), and ten synthetic nanobodies. Table 2 Affinity constants less than 100 nM are representative of strong binding; this is the case for the following nanobodies: I3, I5, I7, H4 and H10.
  • Figure 2 presents the results of the determination of the PCPE-1 regions recognized by the antibodies. Competition experiments by co-injection of nanobodies with the CUB1 or CUB2 domain of PCPE-1 were carried out (Fig. 2A). When mixed with CUB2, nanobodies I3, I5 and I7 were found to be unable to bind to PCPE-1, whereas the co-injection with CUB1 has almost no effect, indicating that these nanobodies mainly interact with the CUB2 domain of PCPE-1. On the contrary, the interaction of synthetic nanobodies H4 and H10 with PCPE-1 is prevented by co-injection with CUB1 and not with CUB2, indicating that they interact with the CUB1 domain.
  • PCPE-2 is a protein in the same family as PCPE-1, with an amino acid sequence that is 43% identical. It shares certain activities with PCPE-1, but also has very different specific functions.
  • the affinity of VHH-I5 and -H4 for PCPE-1 is therefore at least 250 times stronger than for PCPE-2.
  • Example 3 Inhibitory antagonistic effects on PCPE-1 of the nanobodies according to the invention
  • Figure 3 presents the results of the inhibitory effect of the nanobodies according to the invention on the activity of PCPE-1.
  • the activity of PCPE-1 occurs through its direct interaction with C- TJ propeptides of procollagens.
  • the nanobodies were capable of preventing the attachment of PCPE-1 to a mini-procollagen III (Mini III, composed of the C-terminal domains of procollagen III: end of the triple helix, C-telopeptide and C- propeptide) using SPR competition experiments.
  • VHH-H4, -H10 and VHH-I5 are the most effective, with 50 to 75% inhibition at 250 nM.
  • VHH-H4 if complete inhibition is achieved at high concentration for VHH-H4, the addition of VHH-I5 alone does not completely block the PCPE-1/Mini III interaction, although the inhibition is total. when VHH-H4 and VHH-I5 are combined.
  • CPH l-Long (a model substrate of procollagen III) is cleaved by incubation with the protease BMP-1 and this cleavage is increased in the presence of PCPE-1 (Fig. 3B, 2.4-fold increase under these conditions).
  • the addition of VHH-11, VHH-I2, VHH-I4 or VHH-111 has very little effect on the activity of PCPE-1.
  • VHH-I3, VHH-I5, VHH-I7, VHH-H4 or VHH-H10 leads to a 25 to 45% reduction in activation, and this is completely inhibited by simultaneous use of VHH-I5 and VHH-H4.
  • the basal activity of BMP-1 does not seem to be modified by the presence of VHHs, despite the fact that BMP-1 also contains three CUB domains.
  • nanobodies were evaluated in a cellular assay for their ability to modulate procollagen I cleavage.
  • rat heart fibroblasts were treated with recombinant human PCPE-1 protein (Fig. 3C,D).
  • the addition of PCPE-1 to the medium increases the release of the C-propeptide of procollagen I by a factor of approximately 2.5 on average.
  • the presence of VHH-I5 and VHH-H4 inhibits the effect of PCPE-1 (by approximately 40%), as shown by the decrease in C-propeptide (Fig. 3C).
  • joint treatment with VHH-I5 and VHH-H4 completely blocks the effect of exogenous PCPE-1, with a return to the basal quantity of C-propeptide released.
  • treatment of cells with VHHs alone in the absence of added PCPE-1) has no effect on the release of C-propeptide. All these results suggest that the selected ligands are potent antagonists of PCPE-1, capable of blocking the stimulation of C-terminal maturation of procollagens by PCPE-1.
  • Example 4 Construction and characterization of a diabody (divalent nanobody)
  • Figure 4 presents the results obtained for the diab-D1 diabody of SEQ ID NO. 21, produced in bacteria.
  • diab-D1 had more potent antagonistic power than the nanobodies used individually (Fig. 4B).
  • the IC50 calculated for diab-D1 is estimated at 3.5 nM, it is significantly lower than that of VHH-I5 and VHH-H4 alone or co-injected (5 to 13-fold) under the same conditions.
  • the addition of diab-D1 completely blocks the stimulation of CPH I -Long cleavage by PCPE-1 (Fig. 4C).
  • the diabody diab-D1 is also capable of blocking the activity of PCPE-1 on other fibrillar collagens. Indeed, the addition of diab-D1 inhibits the activation of the cleavage of Miniprocollagen I (Mini I) and II (Mini II) by PCPE-1 as illustrated in Figure 4D.
  • diab-D1 In cell culture (Fig. 4E, 4F), diab-D1 is able to completely block the effect of the addition of PCPE-1 on the cleavage of endogenous procollagen I by rat heart fibroblasts. On the other hand, and unlike individual VHHs, the diabody also inhibits the cleavage of the C-propeptide in the absence of added PCPE-1.
  • the diabody also inhibits the cleavage of procollagen I produced by human skin fibroblasts, whether in the basal state or in “fibrotic” conditions mimicked by TGF-beta stimulation, or in the presence of added exogenous PCPE-1. .
  • FIGS 4G and 4H show immunodetection of procollagen I and its C-terminal cleavage products in the culture medium of human skin fibroblasts, after 72 hours of culture in the absence or presence of PCPE-1 , TGF-beta and diab-D1.
  • Other measurements were carried out by immunofluorescence on human fibroblasts in culture (results not shown). It was found that the matrix deposited by the cells is also affected, since the addition of diab-D1 leads to a decrease in collagen deposition detected by immunofluorescence.
  • Example 5 Nanobody coupled to a detectable marker
  • Nanobodies containing the LPETG sequence were coupled to biotin using Sortase as described above.
  • the nanobodies thus coupled can be fixed on streptavidin, allowing the detection of PCPE1 in a complex mixture, by SPR, ELIS ⁇ or Western Blot.
  • Figure 5A represents the SPR study of the interaction of PCPE-1 with the biotinylated H4 nanobody, captured on a chip coupled to streptavidin.
  • Figure 5B shows the detection of PCPE-1 using a sandwich ELIS ⁇ .
  • the sample containing PCPE-1 is captured by an anti-PCPE-1 antibody.
  • biotinylated VHH-I5 allows its detection, via the use of streptavidin coupled to HRP or to a fluorophore such as Alexafluor488.
  • the method is very sensitive and can easily detect 0-1 ng of PCPE-1. We can thus determine the quantity of PCPE-1 present in human plasma, which is approximately 510 ⁇ 70 ng/ml.
  • PCPE-1 can be detected by ELIS ⁇ sandwiched between H4 and I5.
  • the nanobodies were also coupled to a radioactive label, NODAGA-Ga 68 .
  • VHH-H4 was first bioconjugated with NODAGA, then labeled with galium 68 according to the procedure described in (Renard, 2020).
  • the biodistribution and pharmacokinetics of the nanobody were then evaluated in rats after intravenous injection of 25 pg (12 MBq) of H4-Ga 68 , in order to determine the elimination routes and areas of accumulation of the molecule.
  • the H4-Ga 68 nanobody can also be used to detect PCPE-1 on tissue sections and detection by phosphorimager: see Figure 6C.
  • PCPE-1 Procollagen C-proteinase enhancer-1
  • PCPE-1 Procollagen C-Proteinase Enhancer 1
  • Needleman SB Wunsch CD. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53. doi: 10.1016/0022-2836(70)90057-4. PMID: 5420325.

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Abstract

La présente demande concerne un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un nanocorps. Elle concerne également un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu'il inhibe son activité.

Description

Ligands spécifiques de la glycoprotéine PCPE-1 et leurs utilisations
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des ligands spécifiques de la protéine PCPE-1 (Procollagen C-proteinase enhancer- 1). Elle concerne également leur utilisation en imagerie médicale et dans des méthodes de diagnostic et de traitement. Plus particulièrement elle porte sur deux types de ligands : certains capables de se lier à PCPE-1 pour une utilisation en imagerie, et d’autres ligands dit antagonistes capables de se lier à PCPE-1 et d’inhiber son activité, pour une utilisation en thérapeutique. Dans un mode de réalisation de l’invention, ces ligands antagonistes sont utilisés pour le diagnostic et le traitement des fibroses et du cancer.
ARRIERE PLAN DE L'INVENTION
Les collagènes fibrillaires sont les protéines les plus abondantes dans le corps humain et les principaux composants des matrices extracellulaires. Ils façonnent les organes et les tissus et jouent un rôle crucial dans le maintien de leur homéostasie ou de leur réparation après des blessures. Longtemps considérés comme ayant un rôle structurel dans les tissus, les collagènes sont maintenant reconnus comme étant des acteurs à part entière de nombreux processus cellulaires tels que l’adhésion, la prolifération, la migration et la différenciation cellulaire.
Cependant ces collagènes sont également associés à de nombreux processus pathologiques et sont des cibles de choix pour le développement de nouveaux outils de diagnostic ou de nouveaux traitements.
Ainsi, la fibrose, qui se caractérise par un dépôt excessif de matrice extracellulaire composée principalement de fibres de collagène, est un dénominateur commun majeur de nombreuses pathologies qui affecte fortement la progression de la maladie, l’efficacité et la délivrance de thérapies (Henderson et coll. 2020). Par ailleurs, la production de collagène anormal par des cellules tumorales ou par le microenvironnement joue un rôle majeur dans l’échappement immunitaire de ces cellules et contribue fortement à leur capacité métastatique ainsi qu’à leur dormance et leur résistance aux traitements (Shi et coll. 2022).
De fait, le ciblage du collagène et plus précisément de toutes les étapes clés permettant sa biosynthèse, sa sécrétion, sa maturation ou sa macro structuration sont autant de cibles d’intérêt pour limiter la production excessive de collagène associée à ces processus. On peut citer LARP6, le complexe P4H, l’HSP47, SHMT2, les LOX, ... (Shi et coll. 2022). Parmi les cibles évoquées, celles impliquées dans la maturation protéolytique des régions N- et C- terminales semblent particulièrement intéressantes. Ainsi les BTP (bone morphogenetic protein- 1 (BMP1)/tolloid-like proteinases) sont les principales protéases responsables de l'élimination des C-propeptides des procollagènes fibrillaires, un processus généralement considéré comme l'étape limitant la vitesse de formation des fibrilles de collagène de type 1. Cependant, bien que les BTP soient des cibles de choix, elles possèdent, outre les collagènes, une activité dirigée contre de nombreux autres substrats impliqués dans plusieurs voies (activation de facteurs de croissance, angiogenèse, minéralisation, progression tumorale...), ce qui signifie qu'inhiber leur activité pourrait entraîner des effets secondaires indésirables.
Un autre régulateur clé de la fibrillogenèse du collagène est PCPE-1 (Procollagen C- Proteinase Enhancer- 1), une glycoprotéine sécrétée qui stimule spécifiquement le clivage C-terminal du procollagène fibrillaire par les BTP. PCPE-1 est composé de deux domaines CUB (Complement-Uegf-BMP-1 ) et d'un domaine C-terminal NTR (Netrin-like), séparés par un long linker. Les domaines CUB sont nécessaires et suffisants pour l'activité de PCPE-1 (Kronenberg 2009 ; Vadon 2011 ) et cela est dû à leur interaction directe et étroite avec le C-propeptide des procollagènes. On pense que cette interaction permet la déstructuration locale du trimère du procollagène qui facilite le clivage par les BTP, et explique pourquoi PCPE-1 n'a aucun effet sur les autres substrats de BMP-1 . Par ailleurs, des données ont décrit la surexpression de PCPE-1 dans différents contextes fibrotiques (Lagoutte et al. Matrix Biol Plus 2021 ), la désignant comme une cible prometteuse pour suivre et/ou traiter la fibrose. En particulier, une corrélation entre le taux d’expression de PCPE-1 et les fibroses, en particulier la fibrose cardiaque, a été établie (Lagoutte et al., BioRxiv, 2021 ). La détection directe de PCPE-1 dans les fluides biologiques par immuno-essai a également été proposée comme méthode de diagnostic (US2012270246 pour la formation des os, W02017065206À1 pour la NASH).
Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode robuste pour détecter PCPE-1 de manière non invasive dans les tissus, et ainsi suivre l’accumulation du collagène fibrotique. D’autre part, l’absence d’outils performants permettant d’inhiber l’action de PCPE-1 empêchait jusqu’à présent d’évaluer une stratégie pharmacologique ciblant cette protéine.
La demande internationale WO 2019/080284 enseigne que la protéine PCPE-1 est une cible thérapeutique pour combattre les maladies de type fibrose, notamment la fibrose de la peau et les cicatrisations difficiles. La stratégie considérée dans ce document est l’inhibition de l’expression de PCPE-1 , via l’injection de siRNAs destinés à bloquer la traduction du gène en protéine.
Néanmoins, dans certains cas thérapeutiques, il est préférable d’inhiber l’activité d’une protéine plutôt que de limiter son expression. Or, à ce jour, aucun médicament capable de bloquer l'interaction entre la protéine PCPE-1 et les C-propeptides du procollagène n'a été rapporté. Àu niveau du diagnostic de la fibrose cardiaque, l’analyse histologique de biopsies cardiaques reste la technique traditionnelle, malgré son caractère invasif et le fait que cette technique ne permet d’analyser qu’une petite portion du tissu cardiaque, pas forcément représentative de l’ensemble. L’utilisation de l’ IRM associée à l’injection de gadolinium permet désormais l’imagerie de grandes zones fibrotiques mais n’est pas complètement spécifique de la fibrose, et ne détecte pas la fibrose interstitielle.
Une des caractéristiques des pathologies fibrosantes et des cancers est leur caractéristique évolutive, ce qui implique que même si, notamment dans le cas de la fibrose elle est la résultante d’un stress ou d’une blessure, la production excessive de collagène est continue et ne conduit à des effets pathologiques et fonctionnels qu’au terme d’une période parfois très longue. De-là un besoin important de pouvoir détecter précocement et suivre dans le temps l’évolution de cette production excessive de collagène. À ce titre, l’imagerie moléculaire, couplée à des systèmes de détection de plus en plus sensibles (imagerie isotopique, fluorescence, ...), apparaît aujourd’hui comme un outil indispensable pour le suivi longitudinal de ces pathologies ainsi que pour le suivi de l’effet thérapeutique de nouveaux traitements.
À ce jour, la principale approche retenue pour l’imagerie moléculaire directe du collagène, notamment dans des contextes fibrotiques, repose sur l’utilisation de sondes ciblant directement le collagène, principalement par hybridation. On peut citer les peptides collagelin, EP-3533 ou CBP8 (Désogère et al., 2019).
Bien que les résultats soient prometteurs, d’autres voies indirectes, comme celle décrite dans la présente invention, présenteraient des avantages certains en limitant possiblement le rapport signal/bruit de fond. C’est le cas notamment des sondes ciblant les récepteurs intégrines au collagène.
Le recours à des immunoglobulines pour le ciblage de protéines d’intérêt a largement fait ses preuves, aussi bien dans une finalité thérapeutique que d’imagerie moléculaire et celles- ci représentent aujourd’hui la majorité des biomédicaments commercialisés. Àu cours des dernières années, les échafaudages d'immunoglobulines, dépourvus des propriétés indésirables des immunoglobulines conventionnelles (grand poids moléculaire, composition hétérotétramérique, liaisons disulfure), sont apparus comme des alternatives aux anticorps classiques. Parmi eux, les nanocorps, également appelés VHH (Variable Heavy-chain domains of Heavy-chain antibodies), dérivés de la chaîne lourde des immunoglobulines de camélidés, découverts au début des années 90, ont démontré leur intérêt aussi bien en thérapeutique qu’en diagnostic (Muyldermans, 2021 ). Les nanocorps sont les plus petits fragments d'anticorps (environ 15 kDa), hautement solubles et stables, ils peuvent être facilement produits en grande quantité dans des systèmes procaryotes. De plus, leur paratope convexe est bien adapté pour se lier aux cavités difficiles à cibler à la surface de l'antigène. Trois types d’approches peuvent être utilisés pour sélectionner des nanocorps spécifiques d'un antigène : à partir de banques immunitaires, de banques naïves ou de banques synthétiques. Une banque immunitaire est générée par l'immunisation d'un camélidé avec la cible. Ce sont les banques de nanocorps les plus utilisées, avec cependant une limite pour certaines cibles qui ne sont pas immunogènes ou trop toxiques pour l'immunisation des animaux. En raison de ces limitations, plusieurs banques synthétiques ont été développées. Une sélection peut être effectuée parmi ces banques, pour identifier des nanocorps spécifiques d’une ou plusieurs protéine(s) cible(s). À ce jour, plus de 1400 VHH ont été sélectionnés avec succès et sont utilisés comme outils de recherche, dans des applications biotechnologiques ou diagnostiques.
BREVE DESCRIPTION DE L’INVENTION
La présente invention concerne un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 , caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps, aussi désigné par l’abbréviation VHH (Variable domain of the Heavy chain of Heavy chain-only antibodies).
La présente invention est également relative à un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE- 1 , caractérisé en ce qu’il inhibe son activité. Ce ligand spécifique est également dénommé ligand antagoniste de PCPE-1. Il s’agit en particulier d’un nanocorps antagoniste de PCPE-1.
Un autre objet de l’invention est un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 constitué d’une combinaison de deux ou trois nanocorps tels que décrits ci-dessus.
La présente invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un nanocorps ou une combinaison de deux ou trois nanocorps, tel(le) que décrit(e) dans la présente demande.
La présente invention a également pour objet un ligand spécifique antagoniste de la glycoprotéine PCPE-1 pour son utilisation en tant que médicament, et plus spécifiquement pour son utilisation médicale dans le traitement du cancer ou d’une fibrose, notamment de la fibrose cardiaque.
La présente invention concerne aussi un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit dans la présente demande, caractérisé en ce qu’il est couplé à un marqueur détectable, notamment un marqueur utilisé en imagerie médicale.
Un autre objet de l’invention est l’utilisation d’un tel ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 couplé à un marqueur détectable, pour le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale.
Un autre objet de l’invention est un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation théranostique pour le traitement et le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale. Enfin, la présente demande concerne un kit pour déterminer l’activité et/ou la quantité de la glycoprotéine PCPE-1 dans un échantillon biologique in vitro ou ex vivo, comprenant :
- un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, et
- des réactifs de détection.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Caractérisation par SPR de l’interaction PCPE-1 / VHHs
Figure 1A : Injection de 200 nM de VHHs sélectionnés par immunisation sur PCPE-1 immobilisé (645 RU c’est-à-dire Resonance Units).
Figure 1 B : Injection de 200 nM de VHHs sélectionnés à partir d’une banque synthétique sur PCPE-1 immobilisé (645 RU).
Figure 2 : Spécificité des VHHs
Figure 2A : % d’inhibition de l’interaction entre VHHs (50 nM) et PCPE-1 immobilisé lorsque l’on co-injecte le domaines CUB1 ou CUB2 (250 nM).
Figure 2B : Injection de 250 nM de VHH-I5 suivie d’une injection de la même concentration de VHH-I5 en combinaison avec 250 nM d’un second VHH.
Figure 2C : Injection de 250 nM de VHH-H4 suivie d’une injection de la même concentration de VHH-H4 en combinaison avec 250 nM d’un second VHH.
Figure 2D : Le VHHs I5 est biotinylé et immobilisé sur puce streptavidine (813 RU), puis des concentrations croissantes de PCPE-1 (en noir) ou PCPE-2 (en gris) sont injectées.
Figure 2E : Le VHH H4 est biotinylé et immobilisé sur puce streptavidine (491 RU), puis des concentrations croissantes de PCPE-1 ou PCPE-2 sont injectées.
D, E : Les interactions sont modélisées (en pointillé) à l’aide du modèle de Langmuir (logiciel Biacore T200 Evaluation, Cytiva)
Figure 3 : Inhibition de l’activité de PCPE-1 par les VHHs
Figure 3A : % d’inhibition de l’interaction PCPE-1 / mini-procollagène III en présence des VHHs : l’interaction de PCPE-1 (5 nM) avec le mini-procollagène III immobilisé est mesurée puis comparée à l’interaction obtenue lorsque l’on co-injecte PCPE-1 (5 nM) avec 250 nM de VHHs. Moyenne ± SD, n = 3.
Figure 3B : Effet des VHHs sur l’activité de PCPE-1 : CPU I -Long est incubé avec BMP-1 et 75 nM de PCPE-1 en absence ou présence de 2 pM de VHHs (1 h, 37° C). Analyse par SDS-PAGE (gel 4-20%, en présence de DTT, coloration au bleu de Coomassie). Le % d’inhibition est calculé par comparaison avec la condition PCPE-1 seul (gel représentatif de n=3 expériences). Figure 3C : Immuno-détection du procollagène I et de ses produits de clivage C-terminaux dans le milieu de culture de fibroblastes de cœur de rats, après 48h de culture en absence ou en présence de PCPE-1 (5 pg/ml) et de VHHs (15 pg/ml). Analyse par western blot à l’aide d’un anticorps anti C-propeptide du procollagène I (LF41 ).
Figure 3D : Quantification relative du C-propeptide libéré, dans les conditions de la Fig. 3C, par densitométrie (moyenne ± SD, n = 3).
Figure 4 : Caractérisation du diacorps D1 (H4-GSs-l5) de séquence SEQ ID NO. 21
Figure 4A : Analyse par SPR de l’interaction de D1 avec PCPE-1 immobilisé. Injections séquentielles de concentrations croissantes de D1 (0-250 nM) et modélisation de l’interaction (en pointillé) à l’aide du modèle de Langmuir (logiciel Biacore T200 Evaluation, Cytiva).
Figure 4B : Inhibition de l’interaction PCPE-1 / mini-procollagène III en présence du diacorps D1 : l’interaction de PCPE-1 (5 nM) avec le mini-procollagène III immobilisé est mesurée puis comparée à l’interaction obtenue lorsque l’on co-injecte PCPE-1 (5 nM) avec des quantités croissantes (0-200 nM) de D1. Le % de fixation résiduelle de PCPE-1 est représenté en fonction de la concentration en D1 .
Figure 4C : D1 inhibe l’activité de PCPE-1 sur le procollagène III : CPU I -Long est incubé avec BMP-1 et 75 nM de PCPE-1 en absence ou présence de 2 pM de nanocorps monovalent ou bivalent (1 h, 37° C). Analyse par SDS-PAGE (gel 4-20%, coloration au bleu de Coomassie). Le % d’inhibition est calculé par comparaison avec la condition PCPE-1 seul.
Figure 4D : D1 inhibe l’activité de PCPE-1 sur les procollagènes I et II : Les Mini I ou Mini II sont incubés avec BMP-1 et 75 nM de PCPE-1 , en absence ou présence de 2 pM de D1 (1 h, 37° C). L’analyse est réalisée par SDS-PAGE (gel 8%, coloration au bleu de Coomassie). Le % d’inhibition est calculé par comparaison avec la condition PCPE-1 seul.
Figure 4E : Immuno-détection du procollagène I et de ses produits de clivage C-terminaux dans le milieu de culture de fibroblastes de cœur de rats, après 48h de culture en absence ou en présence de PCPE-1 (5 pg/ml) et du diacorps D1 (15 pg/ml). Analyse par western blot à l’aide d’un anticorps anti C-propeptide du procollagène I (LF41 ).
Figure 4F : Quantification relative du C-propeptide libéré, dans les conditions de la Fig. 4E, par densitométrie (moyenne ± SD, n = 3).
Figure 4G : Immunodétection du procollagène I et de ses produits de clivage C-terminaux dans le milieu de culture de fibroblastes de peau humains, après 72h de culture en absence ou en présence de PCPE-1 (5 pg/ml), de TGF-béta (5 ng/ml) et du diacorps D1 (15 pg/ml). Analyse par western blot à l’aide d’un anticorps anti C-propeptide du procollagène I (LF41 ).
Figure 4H : Quantification relative du C-propeptide libéré, dans les conditions de la Fig. 4G, par densitométrie (moyenne ± SD, n = 3). Figure 5 : Utilisation d’un nanocorps couplé à un marqueur détectable pour la détection de PCPE-1
Figure 5A : Caractérisation par SPR de l’interaction PCPE-1 / VHH-H4 biotinylé. La biotinylation du VHH-H4 permet sa capture orientée sur une puce streptavidine. La présence de PCPE-1 dans l’échantillon injecté est détectée par son interaction avec VHH-H4.
Figure 5B : Détection par ELISÀ : Courbe de calibration obtenue par addition de quantités croissantes de PCPE-1 humain purifié. Concentration de PCPE-1 (ng/ml) dans des échantillons de plasma humain, moyenne ± SD de 3 déterminations, chacune en duplicat.
Figure 6 : Caractéristiques du nanocorps VHH-H4-Ga68 pour l’utilisation en imagerie
Figure 6A : Pharmacocinétique de VHH-H4-Ga68. Mesure du temps de demi-vie dans le sang ; dosage durant les 2,5 h suivant l’injection, exprimé en % de la dose injectée (%ID, moyenne ± SD, comptage gamma)
Figure 6B : Biodistribution de VHH-H4-Ga68 déterminée ex-vivo 2,5h après injection, exprimée en % de la dose injectée (%ID, moyenne ± SD) pour chaque organe (comptage gamma)
Figure 6C : Gamme de détection de VHH-H4-Ga68 sur coupe de cœur de rat. Autoradiographie (phosphorimager) après une heure d’incubation et une heure d’exposition.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 , caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps (aussi dit VHH).
La glycoprotéine PCPE-1 (Procollagen C-proteinase enhancer-1 ) est un régulateur clé de la fibrillogenèse des collagènes. La protéine humaine est référencée dans la base UniProt sous la référence Q15113, où sa séquence polypeptidique est décrite.
Les collagènes sont synthétisés sous la forme de précurseurs solubles désignés procollagènes. Ces derniers subissent une maturation protéolytique avant de pouvoir s’assembler sous forme de fibres de collagène. Cette étape limitante est régulée par la glycoprotéine PCPE-1 , qui stimule spécifiquement le clivage C-terminal du procollagène fibrillaire par les protéases BTP, responsables de l'élimination des C-propeptides des procollagènes fibrillaires. Pour cela, PCPE-1 interagit de manière étroite avec le C- propeptide du collagène via ses deux domaines CUB (Complement-Uegf-BMP-1 ).
Le terme « ligand spécifique » désigne un composé interagissant avec une protéine de manière non-covalente, réversible et spécifique.
Un ligand est dit « spécifique » lorsque d’une part il se lie préférentiellement à sa protéine cible parmi une multitude de protéines cibles de structures proches ; et d’autre part, il présente une affinité, c’est-à-dire une force d’interaction entre ledit ligand et la protéine cible, jugée comme suffisamment forte. L’affinité est quantitativement mesurée par la constante d’équilibre association/dissociation, également appelée constante d’affinité ou constante de dissociation à l’équilibre, en abrégé « KD ». Plus la valeur KD est basse, plus l'affinité de liaison entre le ligand et sa protéine cible est élevée.
Àu sens de la présente invention, un ligand est considéré comme se liant spécifiquement à PCPE-1 si sa constante d’affinité KD est inférieure à 100 nM, ou inférieure à 80 nM, ou inférieure à 50 nM, et plus préférentiellement si elle est inférieure à 30 nM. Àu regard de ces indications chiffrées, la personne de l'art saura déterminer quels sont les ligands spécifiques de l’invention.
Un nanocorps désigne un anticorps à domaine unique, qui correspond à un fragment d'anticorps composé d'un seul domaine d'anticorps variable monomère, qui correspond au domaine variable de la chaîne lourde unique d'anticorps du type de ceux trouvés chez les camélidés, qui sont naturellement dépourvus de chaînes légères. Un nanocorps est capable de se lier sélectivement à un antigène spécifique. Il a l’avantage de présenter un poids moléculaire de seulement 12 à 15 kDa, soit environ 10 fois moins que les anticorps communs qui ont un poids moléculaire de 150 à 160 kDa. Un nanocorps est également bien moins encombrant qu’un anticorps classique. De plus, le procédé de synthèse, notamment en cellules bactériennes, est facilité du fait de cette structure simplifiée. Les premiers anticorps à domaine unique ont été conçus à partir d'anticorps à chaîne lourde trouvés chez les camélidés ; ceux-ci sont désignés fragments VH H.
Dans la présente demande, les termes nanocorps et VHH sont utilisés indifféremment et désignent tous deux un anticorps à domaine unique.
Les nanocorps ont chacun trois CDRs, désignés CDR1 , CDR2, et CDR3 respectivement.
Les nanocorps selon l'invention peuvent en particulier être des nanocorps de lama ou des nanocorps synthétiques.
Une combinaison de deux nanocorps, couplés de façon covalente, avec ou sans agent de liaison, est désignée par le terme « diabody » ou « diacorps » en français, ou encore par le terme « nanocorps bivalent ».
Une combinaison de trois nanocorps est désignée par le terme « tribody » ou « tricorps » en français, ou encore « nanocorps trivalent ».
D’autres ligands spécifiques de la glycoprotéine PCPE-1 sont également inclus dans l’invention, notamment toute structure protéique équivalente à un nanocorps, à l’exclusion des anticorps. Des exemples de telles structures protéiques (« protein scaffold ») capables de se lier spécifiquement à des épitopes cibles sont présentés dans la revue de (Gebauer & Skerra, 2019) L’invention concerne également un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 , caractérisé en ce qu’il inhibe son interaction avec le domaine C-terminal des procollagènes, ce qui a pour effet d’inhiber l’activité de cette glycoprotéine PCPE-1.
Certains ligands spécifiques de PCPE-1 ont, outre la capacité de se lier à cette glycoprotéine, la capacité d’inhiber l’activité de ladite glycoprotéine PCPE-1 . On les désigne alors « ligands antagonistes de PCPE-1 ».
Le terme « antagoniste » désigne un composé interagissant avec une protéine cible présentant une activité physiologique, en diminuant voire en supprimant l’activité physiologique de ladite protéine.
Comme cela est montré dans l’exemple 3, une inhibition significative de l’activité de PCPE- 1 correspond à :
- soit une inhibition de son interaction avec les domaines C-terminaux du procollagène ;
- soit une action inhibitrice sur le clivage du procollagène, qui est en conditions normales stimulé par l’action de PCPE-1.
Plus particulièrement, cette inhibition de l’activité se caractérise par une inhibition de l’interaction de PCPE-1 avec les domaines C-terminaux du procollagène.
Cette inhibition de l’activité de PCPE-1 est considérée comme étant significative dès lors qu’elle est supérieure à 40%, voire d’au moins 50%, et préférentiellement supérieure à 60%.
Ces ligands antagonistes de PCPE-1 pourront être de toute nature, et notamment être des composés chimiques synthétiques, des acides nucléiques, ou encore des structures protéiques, et en particulier une chaîne polypeptidique.
Selon une mise en oeuvre préférée, le ligand antagoniste de PCPE-1 est une chaîne polypeptidique, et en particulier est un nanocorps (VHH). Il est entendu que toute structure polypeptidique équivalente à un nanocorps est incluse dans l’invention.
Nanocorps spécifiques
Les inventeurs ont identifié deux familles de nanocorps possédant soit une activité de liaison à PCPE-1 pour une utilisation en imagerie médicale et en diagnostic, soit une activité de liaison et une activité inhibitrice de PCPE-1 pour une utilisation comme médicament.
Ces nanocorps ont été sélectionnés à partir d’une banque synthétique de nanocorps ou après immunisation d’un lama et possèdent une activité de liaison à PCPE-1 mesurée par résonance plasmonique de surface comme présenté dans la figure 1. Ils ont été sélectionnés pour posséder un KD inférieur à 100 nM et plus précisément inférieur à 30 nM (voir tableau 2 dans les exemples).
Ces nanocorps ont été séquencés, ainsi que leurs CDRs ; les séquences sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1. Séquences
Comme il est bien connu de l’homme du métier, la combinaison des CDR1 , CDR2 et CDR3 suffit pour définir un site de liaison à l’antigène.
Àu sens de l'invention, le terme « CDR » pour « région déterminant la complémentarité » fait référence aux séquences d'acides aminés, qui, ensemble, définissent l'affinité de liaison et la spécificité de la région Fv naturelle d'un site de liaison natif d'une immunoglobuline.
Selon une mise en oeuvre spécifique de l’invention, le ligand spécifique de PCPE-1 est un nanocorps dont la séquence polypeptidique inclut trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE-1 , caractérisé en ce que parmi ces trois CDRs, au moins un CDR présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 1 à SEQ ID NO. 15.
Selon une autre mise en oeuvre spécifique, parmi ces trois CDRs dénommés CDR1 , CDR2 et CDR3, chaque CDR est ainsi défini :
1, CDR1 présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences suivantes : SEQ ID NO. 1 , 4, 7, 10 ou 13; ii. CDR2 présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences suivantes : SEQ ID NO.
2, 5, 8, 1 1 ou 14; et iii. CDR3 présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences suivantes : SEQ ID NO.
3, 6, 9, 12 ou 15. Selon une autre mise en oeuvre particulière :
- le CDR1 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec au moins l’une des séquences de CDR1 mentionnées au (i) ci-dessus, et
- le CDR2 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec au moins l’une des séquences de CDR2 mentionnées au (ii) ci-dessus, et
- le CDR3 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec au moins l’une des séquences de CDR3 mentionnées au (iii) ci-dessus.
Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés après alignement optimal des séquences à comparer, qui peuvent donc comprendre une ou plusieurs additions, délétions, troncatures et/ou substitutions.
Ce pourcentage d’identité peut être calculé par toute méthode d’analyse de séquences bien connue de l’homme du métier.
Le pourcentage d’identité peut être déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité, sur toute leur longueur. Outre manuellement, il est possible de déterminer l’alignement global de séquences au moyen de l’algorithme de Needleman et Wunsch (1970).
Pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice EDNÀFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4).
Pour les séquences d’acides aminés, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice BLOSUM62.
De préférence, le pourcentage d’identité défini dans le cadre de la présente invention est déterminé au moyen d’un alignement global des séquences à comparer sur toute leur longueur.
Selon une autre mise en oeuvre, le ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 est un nanocorps qui comprends trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE- 1 , lesdits trois CDRs présentant au moins 80% d’identité de séquence avec les combinaisons de séquences suivantes : a) CDR1 : SEQ ID NO. 1 , CDR2 : SEQ ID NO. 2 et CDR3 : SEQ ID NO. 3 ; ou b) CDR1 : SEQ ID NO. 4, CDR2 : SEQ ID NO. 5 et CDR3 : SEQ ID NO. 6 ; ou c) CDR1 : SEQ ID NO. 7, CDR2 : SEQ ID NO. 8 et CDR3 : SEQ ID NO. 9 ; ou d) CDR1 : SEQ ID NO. 10, CDR2 : SEQ ID NO. 11 et CDR3 : SEQ ID NO. 12 ; ou e) CDR1 : SEQ ID NO. 13, CDR2 : SEQ ID NO. 14 et CDR3 : SEQ ID NO. 15.
Selon une mise en oeuvre particulière :
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (a) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (b) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (c) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (d) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (e) ci-dessus.
Selon une autre mise en oeuvre, le ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 est un nanocorps qui comprends trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE- 1 , lesdits trois CDRs présentant les séquences suivantes : a) CDR1 : SEQ ID NO. 1 , CDR2 : SEQ ID NO. 2 et CDR3 : SEQ ID NO. 3 ; ou b) CDR1 : SEQ ID NO. 4, CDR2 : SEQ ID NO. 5 et CDR3 : SEQ ID NO. 6 ; ou c) CDR1 : SEQ ID NO. 7, CDR2 : SEQ ID NO. 8 et CDR3 : SEQ ID NO. 9 ; ou d) CDR1 : SEQ ID NO. 10, CDR2 : SEQ ID NO. 11 et CDR3 : SEQ ID NO. 12 ; ou e) CDR1 : SEQ ID NO. 13, CDR2 : SEQ ID NO. 14 et CDR3 : SEQ ID NO. 15.
Selon une autre mise en oeuvre de l’invention, le ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 est un nanocorps dont la séquence polypeptidique présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20.
En particulier, ce nanocorps présente une séquence polypeptidique ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20.
De préférence, les substitutions observées dans les séquences polypeptidiques seront placées dans les domaines en dehors des CDRS, dénommés régions « charpente » du nanocorps.
Plus préférentiellement, les CDRs sont conservés et présentent 100% d’identité avec les séquences mentionnées ci-dessus au (a) pour SEQ ID NO. 16 ; au (b) pour SEQ ID NO. 17 ; au (c) pour SEQ ID NO. 18 ; au (d) pour SEQ ID NO. 19 ; et au (e) pour SEQ ID NO. 20.
Selon une mise en oeuvre préférée, le nanocorps de l’invention présente une séquence polypeptidique consistant en la séquence SEQ I D NO. 16 ; ou SEQ I D NO. 17 ; ou SEQ I D NO.
18 ; ou SEQ ID NO. 19 ; ou SEQ ID NO. 20. Combinaison de nanocorps
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention décrit l’association de ces nanocorps au sein d’une même structure de type diacorps ou tricorps. Cette association est réalisée de préférence via l’ajout d’un agent de liaison entre les séquences protéiques de chaque nanocorps. L’homme de métier saura sélectionner l’agent de liaison le plus adapté, notamment parmi ceux décrits dans la revue de Kwon, 2019. Selon une mise en oeuvre préférée, la séquence GSs (GSGSGSGSGSGSGSGS, SEQ ID NO. 38) est utilisée comme agent de liaison.
Selon une mise en oeuvre de l’invention, le ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 est constitué d’une combinaison de deux ou trois nanocorps tels que décrits ci-dessus, c’est-à- dire d’un diacorps ou d’un tricorps, optionnellement comprenant un ou deux agents de liaison, notamment un ou deux peptides de liaison (un pour un diacorps, deux pour un tricorps).
Selon une mise en oeuvre particulière de l’invention, un diacorps est constitué de l’association d’un nanocorps possédant une activité de liaison à CUB1 et un autre ayant une activité de liaison à CUB2, étant entendu que chaque nanocorps peut être positionné soit en amont soit en aval du peptide de liaison.
Un diacorps selon l’invention pourra notamment être constitué de toute combinaison de deux séquences polypeptidiques présentant chacune au moins 80% ou 90% d’identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19 ou 20, optionnellement comprenant de plus un agent de liaison.
Plus spécifiquement, un diacorps sera constitué de toute combinaison de deux séquences polypeptidiques présentant chacune une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20, optionnellement reliées par un agent de liaison, en particulier par un peptide de liaison.
Cette combinaison de deux nanocorps (diacorps) pourra notamment présenter une séquence polypeptidique ayant au moins 80% ou 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO. 21 , et en particulier au moins 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO. 21.
Plus préférentiellement, dans ce diacorps, les CDRs des nanocorps sont conservés et présentent 100% d’identité avec les séquences mentionnées ci-dessus au (a) pour SEQ ID NO. 16 (H4) et au (c) pour SEQ ID NO. 18 (I5).
Selon la présente invention, ce type de diacorps peut correspondre à I5-Iinker-H4 ou H4- Iinker-I5. Un exemple de séquence d’acides aminés pour le diacorps H4-Iinker-I5 correspond à la séquence SEQ ID NO. 21 . Selon une mise en œuvre préférée, un diacorps selon l’invention présente une séquence polypeptidique consistant en la séquence SEQ ID NO. 21 .
Un autre objet de l’invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence nucléique codant pour un nanocorps ou une combinaison de deux ou trois nanocorps selon la présente invention.
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique selon l’invention comprend ou consiste en une séquence nucléique codant un nanocorps défini par l’une des séquences d’acides aminés SEQ ID NO. 16 à 20 ou codant pour un diacorps défini par la séquence SEQ ID NO. 21.
Cet acide nucléique est une molécule d'ÀDN ou d'ÀRN, qui peut être incluse dans n'importe quel vecteur approprié, tel qu'un plasmide, un cosmide, un épisome, un chromosome artificiel, un phage ou un vecteur viral.
Le terme "vecteur" désigne le véhicule par lequel la séquence d'ÀDN ou d'ÀRN peut être introduite dans une cellule hôte, de manière à transformer l'hôte et promouvoir l'expression (e.g. transcription et traduction) de la séquence d’acide nucléique introduite. Un tel vecteur comprend avantageusement des éléments régulateurs, tels qu'un promoteur, un activateur, un terminateur, etc., pour induire l'expression du polypeptide.
Par conséquent, un autre objet de l'invention concerne un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Un autre objet de l’invention est une cellule hôte ayant intégré un vecteur tel que décrit ci- dessus, et pouvant ainsi exprimer le nanocorps, diacorps ou tricorps selon l’invention.
Utilisations des ligands spécifiques de PCPE-1 selon l’invention
La présente invention concerne également les ligands spécifiques de PCPE-1 tels que définis ci-dessus pour une utilisation comme agent de contraste dans l’imagerie médicale non invasive, pour une utilisation dans des méthodes de diagnostic et pour une utilisation comme médicament.
Par ailleurs, les ligands décrits dans la présente invention, possédant à la fois une activité de liaison et une activité inhibitrice de PCPE-1 , sont des candidats parfaits pour une approche dite théranostique.
Elle concerne enfin une composition pharmaceutique comprenant un de ces ligands en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les composés selon l’invention peuvent être utilisés dans des immunoessais (ELISA, Westernblot, immunofluorescence, immunohistochimie) pour détecter PCPE-1 dans des fluides biologiques ou des tissus, in vitro ou ex vivo. En particulier, la présente invention concerne un ligand antagoniste de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation en tant que médicament.
La présente invention concerne également un ligand antagoniste de la glycoprotéine PCPE- 1 tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement du cancer ou d’une fibrose, notamment de la fibrose cardiaque.
La fibrose, également désignée sclérose, survient à la suite d'une destruction substantielle des tissus ou lorsqu'une inflammation a lieu à un endroit où les tissus ne se régénèrent pas. Les fibroses sont des pathologies caractérisées par une synthèse et un dépôt excessif de matrice extracellulaire (MEC), conduisant à une cicatrisation pathologique et à une rigidification qui peuvent conduire à la mort lorsque des organes vitaux sont touchés (cœur, foie, poumon etc...). Il existe plusieurs types de fibrose : fibrose cardiaque, fibrose pulmonaire, fibrose hépatique, fibrose rénale, fibrose musculaire, etc.
Le cancer est également une maladie où le collagène joue un rôle important, bien que ce rôle soit complexe et dépendant du type de tumeur (Shi et al., 2021 ).
La présente invention concerne également une méthode de traitement du cancer ou d’une fibrose, en particulier de la fibrose cardiaque, comprenant l’administration à un patient souffrant d’un cancer ou d’une fibrose, d’un ligand antagoniste de PCPE-1 , inhibant son activité, tel que décrit ci-dessus.
Dans le contexte de l'invention, un "patient" désigne un mammifère humain ou non-humain, tel qu'un rongeur (rat, souris, lapin), un primate (chimpanzé), un félin (chat), ou un canin (chien). De préférence, le patient est un être humain, en particulier souffrant d’un cancer ou d’une fibrose, et notamment d’une fibrose cardiaque.
Ligands couplés à des marqueurs détectables
La présente invention est également relative à un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE- 1 tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il est couplé à un marqueur détectable en imagerie médicale.
Par "ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable", on entend ici que le marqueur détectable est lié, de manière directe ou indirecte, au ligand, ou est incorporé dans le ligand. Le marqueur détectable peut en particulier être lié au ligand par substitution, par complexion ou par chélation.
Àu sens de la présente invention, un "marqueur détectable" désigne un composé qui produit un signal détectable. Lorsqu'il est associé à un traceur, il permet de suivre le devenir du traceur dans l'organisme. Un marqueur détectable désigne ici en particulier un marqueur détectable en imagerie médicale. Le marqueur détectable utilisé peut notamment être un agent de contraste IRM, un agent de contraste en scintigraphie, un agent de contraste en imagerie aux rayons X, un agent de contraste ultrason, ou un agent de contraste en imagerie optique.
Des exemples de marqueurs détectables incluent des radioéléments, des fluorophores tels que la fluorescéine, l'Àlexa, la cyanine ; les composés chimioluminescents tels que le luminol ; les composés bioluminescents tels que la luciférase ou la phosphatase alcaline ; les agents de contraste tels que les nanoparticules ou le Gadolinium ; et les quantum dots.
Le choix du marqueur détectable approprié, qui dépend du système de détection utilisé, est à la portée de l'homme du métier.
Le marquage peut être orienté, via l’introduction d’une cystéine terminale, ou d’une séquence de reconnaissance par la sortase ou d’une autre ligase. Le marquage peut aussi être réalisé par couplage direct après activation des lysines.
Le marqueur détectable est notamment un fluorophore, un composé chromophore ou luminescent ou une étiquette détectable par un anticorps. Il peut également s’agir d’un chélatant, comme le NODÀGÀ, qui est ensuite couplé à un radioisotope, comme le Ga68.
Avantageusement, le ligand ainsi modifié conserve ses capacités à se lier à PCPE-1.
Le ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable peut être utilisé pour détecter la protéine PCPE-1 dans un immuno-essai ou en culture cellulaire, comme cela est illustré dans l’exemple 5.
La présente invention est également relative à l’utilisation d’un ligand spécifique de PCPE- 1 couplé à un marqueur détectable tel que défini ci-dessus, pour le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale.
En particulier, l’invention se rapporte à l’utilisation dudit ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable comme agent de contraste dans l'imagerie médicale, en particulier l'imagerie médicale in vivo, non invasive.
Au sens de l’invention, un agent de contraste désigne une substance qui, administrée dans l'organisme, permet de marquer de manière détectable des organes ou des structures (tissu, cellule, récepteur) qui, sans agent de contraste, sont peu ou non visibles en imagerie médicale.
Avantageusement, le ligand spécifique de PCPE-1 couplé au marqueur possède des caractéristiques pharmacocinétiques compatibles avec son utilisation comme agent de contraste (clairance rapide mais persistance suffisante pour permettre l’imagerie, élimination rénale, pas d’accumulation chez l’animal sain). Ceci est notamment illustré dans l’exemple 6. Ces propriétés peuvent si nécessaire être modulées par PEGylation, ou autre modification de la charge ou de la lipophilicité des molécules. La présente invention concerne également une méthode d'imagerie médicale, en particulier d'imagerie médicale in vivo, non invasive, dans laquelle un ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable tel que défini ci-dessus est administré à un patient, puis le patient est soumis à un protocole d’imagerie médicale.
Elle concerne également l'utilisation d'un ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un agent de contraste utile pour l'imagerie médicale, en particulier l'imagerie médicale in vivo, non invasive.
Utilisation théranostique
Le terme théranostique est un néologisme construit à partir des termes thérapie et diagnostic, qui correspond à une approche médicale visant à privilégier le développement simultané des aspects diagnostic et thérapeutique. En particulier, il s’agit d’utiliser des composés permettant à la fois de visualiser in vivo la situation clinique d’un patient, et de traiter l’affection concernée avec le même composé.
Les ligands spécifiques de PCPE-1 selon l’invention, en particulier ceux présentant une action inhibitrice de l’activité de PCPE-1 et couplés à un marqueur détectable, sont tout à fait adaptés à une utilisation théranostique.
Ainsi, la présente invention concerne un ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable, pour son utilisation théranostique pour le traitement et le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale. De préférence, ce ligand est un antagoniste de PCPE- 1.
Kit de détection
La présente invention concerne également un kit pour déterminer l’activité et/ou la quantité de la glycoprotéine PCPE-1 dans un échantillon biologique in vitro ou ex vivo, comprenant :
- un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’invention, et
- des réactifs de détection.
Ce ligand spécifique de PCPE-1 sera en particulier un ligand couplé à un marqueur détectable.
Un échantillon biologique désigne tout type d’échantillon issu d’un corps vivant, notamment du corps d’un patient, et inclut notamment le sang, le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien et les larmes. EXEMPLES
MATERIELS ET METHODES
Production et purification des protéines
Les protéines PCPE-1 (humaine native ou comportant une étiquette 8his en C-terminal), Miniprocollagène I (Mini I, étiquette Twinstrep en N-terminal de la chaîne a2), Mini-procollagène Il (Mini II, étiquette 6His en N-terminal), Mini-procollagène III (Mini III, étiquette C-myc en N-terminal), et BMP-1 (étiquette flag en C-terminal) ont été produites en cellules HEK 293- EBNA ou 293-F et purifiées comme déjà décrit. Les domaines CUB de PCPE-1 ont été préparés par protéolyse limitée de CUB1 NTR et CUB2NTR comme décrit par Kronenberg et coll. CPI 11 - Long et PCPE-2 (avec une étiquette 6-his en N-terminal) ont été produits par transfection transitoire de cellules HEK 293T et purifiés comme déjà décrit.
L’antigène utilisé pour la sélection des nanocorps est la zone CUB1 CUB2 de la protéine PCPE- 1 (correspondant aux acides aminés 1 à 279). Il a été cloné dans le vecteur pHLsec, en fusion avec un tag 6-His et une séquence de clivage par la protéase HRV-3C en N-terminal. Il a ensuite été produit par transfection transitoire de cellules 293-F, cultivées à 37° C, 125 rpm, 8% CO2 en milieu Freestyle™ 293 (Gibco), selon la procédure décrite par Pulido et al. CUB1 CUB2 a été purifié sur colonne Ni-excel (5 ml; Cytiva), puis traité par la protéase HRV- 3C à 4°C pendant une nuit pour éliminer l’étiquette histidine. Après filtration sur gel avec une colonne HiLoad Superdex 75 16/600 SEC (size exclusion chromatography, Cytiva) équilibrée en 20 mM HEPES pH 7.4, 0.3 M NaCl, la protéine est stockée à -80° C dans le même tampon. La concentration des protéines a été déterminée à l’aide d’un Nanodrop 2000 (Thermo Scientific).
Une forme biotinylée de CUB1 CUB2 a été préparée pour le bio-panning et le phage-ELISA. Pour cela, la séquence codante pour la région CUB1 CUB2 a été clonée dans le vecteur pHL-Avitag3 entre les sites EcoRI et Kpnl puis la protéine a été exprimée en 293-T comme ci-dessus. Après purification sur résine Cobalt, 60 pM de CUB1 CUB2avi ont été biotinylés à l’aide de 1 pM de GST-BirA (Biotin -protein ligase) dans 50 mM de tampon bicine, 300 mM potassium glutamate pH 8.3 en présence de 10 mM ATP et 50 pM de d-biotine pendant 5 h at 30 °C. La GST-BirA (clonée dans le vecteur pGex, don de Y. Zhao, STRUBI, Oxford, GB) a été produite en bactéries E. Coli BL21(DE3)pLysS. Une purification sur résine cobalt puis une filtration sur gel avec une colonne Superdex S75 (tampon 20 mM HEPES pH 7.4, 0.3 M NaCl) permettent l’élimination de la BirA et de la biotine en excès et l’obtention d’une protéine pure et biotinylée à 95%.
Sélection des nanocorps chez le lama
Les nanocorps de lama ont été générés par la plateforme du Laboratoire Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (Marseille, France). Brièvement, un Llama ÿlama a été immunisé par cinq injections successives de 1 mg de CUB1 CUB2 à une semaine d’intervalle. Àu bout de 39 jours, le sang a été collecté, et la bibliothèque de nanocorps a été générée comme décrit précédemment. Deux étapes de bio-panning sur 50 nM de CUB1 CUB2 biotinylé ont permis d’enrichir des phages exprimant des nanocorps reconnaissant spécifiquement CUB1 CUB2. 48 clones (phagemid) ont été sélectionnés et leur affinité pour PCPE-1 humain déterminée par phage ELISÀ. Les clones positifs ont été séquencés et leurs séquences alignées et analysées à l’aide de ESPript 3.0. Huit nanocorps ont été retenus pour être caractérisés plus en détail : 11 , I2, I3, I4, I5, I7, 110 et 111.
Génération des nanocorps synthétiques
Les nanocorps synthétiques ont été sélectionnés par Hybrigenics Services SÀS. Après trois étapes de bio-panning sur CUB1CUB2 biotinylé utilisant la bibliothèque de nanocorps hsd2ab (Moutel et al., 2016), 90 clones ont été testés par phage ELISA pour leur capacité à se fixer sur PCPE1. Après séquençage, une librairie de 24 clones uniques positifs a été obtenue. Dix d’entre eux ont été sélectionnés pour être caractérisés plus en détail : H1 à H10.
Production et purification des nanocorps
Les nanocorps synthétiques ont été clonés dans le vecteur pET29b(+), en fusion avec la séquence signale pelB et une étiquette 6-His en position C-terminale. Les nanocorps de lama ont été clonés dans le vecteur pHEN6 à la suite de la séquence pelB et en fusion avec une étiquette 6-His en position C-terminale.
Pour construire le diabody, le nanobody VHH-I5 a été amplifié par PCR avec addition d’un site de restriction Notl et d’une séquence GSs (GSGSGSGSGSGSGSGS, SEQ ID NO. 38) en N- terminal. La construction GSs-VHH-15 a ensuite été clonée à la suite du VHH-H4 en pET29b(+) par digestion Notl/ Xhol pour conduire au nanobody bivalent VHH-H4-GSs-VHH-l5 (D1 ) .
Les plasmides obtenus sont ensuite transformés en bactéries E. coli T7 express (NEB). Lorsque la densité bactérienne atteint D0600 = 0.8, l’expression protéique est déclenchée par traitement avec 0.1 mM IPTG (B-D-1 -thiogalactopyranoside) et les cellules sont incubées pendant une nuit à 28° C, dans un milieu Terrifie Broth contenant 0.1 % de glucose. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation à 4000 rpm 15 min à 4 °C et resuspendues en tampon TES (200 mM Tris HCl pH 8.0, 500 mM Sucrose, 50 nM EDTA). La fraction périplasmique est préparée par choc osmotique et les nanocorps sont purifiés par chromatographie d’affinité sur résine nickel (Qiagen) et filtration sur gel (Superdex 75 16/600; Cytiva) en tampon 20 mM HEPES, 0.3 M NaCl pH 7.4.
Certains nanocorps ont également été clonés dans le vecteur pHEN contenant la séquence LPETG (site de reconnaissance pour la Sortase, SEQ ID NO. 39) et une étiquette 6-His en position C-terminale (don du Dr. Leo Hanke, Karolinska Institut, Stockholm, Suède), et produits et purifiés comme décrit dans (Hanke et al., 2020). En parallèle, la Sortase A 5M clonée dans le vecteur pET30b (Àddgene #51140), avec une étiquette 6-His en C-terminal, a été produite et purifiée selon les instructions du fournisseur. Les nanocorps ont été biotinylés sur leur extrémité C-terminale à l’aide de 50 pM de Sortase À 5M et 200 pM de GGGK-biotin (Covalab) en tampon 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCb, 2 h à 25 °C. La Sortase À 5M et l’excès de nanocorps ont été éliminés par passage sur résine Ni-NTÀ (Qiagen; 2 ml), puis l’excès de biotine par un passage sur Zeba spin (7K MWCO, Thermo Fisher Scientific).
Analyses par SPR
Les expériences de résonance plasmonique de surface (SPR) ont été réalisées sur un appareil Biacore T200 (Cytiva). Les protéines ligands, en solution dans un tampon 10 mM HEPES pH 7.4 pour PCPE-1 ou 10 mM acétate de sodium pH 4.5 pour le mini-procollagen III et la streptavidine, sont immobilisées sur puce CM5 par couplage amine. Les analytes sont dilués en tampon de course (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCb, 0.05 % P20) et injectés à un débit de 30 ou 50 pL/min. Les expériences de compétition, d’épitope binning et de cinétique ont toutes été réalisées à 25° C. La régénération est obtenue par injection successive de chlorure de guanidine 2M et d’EDTÀ 0.5 M pendant 30 sec. Les sensorgrammes ont été analysés à l'aide du logiciel d'évaluation Biacore T200 Evaluation v3.2.1 (Cytiva), en utilisant les modèles les plus adaptés. La CI50 a été déterminée par régression non linéaire à l'aide de GraphPad Prism (v8.2.1 ).
Tests d’activité
Pour caractériser les effets des nanocorps sur l'activité de PCPE-1 , 400 nM de CPIII-Long (ou de Mini I ou de Mini II) ont été incubés pendant 1 h à 37 °C avec 2.5 nM de BMP-1 et 75 nM de PCPE-1 (lorsqu'il est présent) en présence ou en l'absence de 2 pM de nanocorps dans le tampon suivant : 20 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.02 % n-octyl-B-D- glucopyranoside. Les échantillons ont été analysés par SDS-PÀGE sur gels gradient 4-20 % (Criterion ; Biorad) et coloration Instant Blue (Euromedex). Le niveau d'activation par PCPE- 1 a été évalué comme le rapport entre l'intensité de la bande du C-propeptide et l'intensité de toutes les bandes de CPI II long (clivé et non clivé), après normalisation avec la condition BMP-1 seul, en utilisant le logiciel ImageQuantTL (Cytiva).
Effet des nanocorps sur la maturation C-terminale des collagènes fibrillaires in vitro
Des fibroblastes de cœur de rats ont été cultivés dans un milieu DMEM, 10 % SVF (Eurobio), 1 % AÀS (Antibiotic-antimycotic solution; Thermo Fisher) à 37 °C, 5 % CO2. A 70 % de confluence des cellules, le sérum a été éliminé et remplacé par du milieu sans sérum, contenant PCPE-1 (5 pg-mL'1) ou/et 15 pg-mL'1 nanocorps. Après 48 h de culture, les surnageants sont récoltés et le procollagène est analysé par western-blotting à l’aide d’un anticorps anti-C-propeptide (LF41 , don du Dr. Larry W. Fisher, Bethesda, USA). La quantification des bandes est réalisée à l’aide du logiciel ImageQuantTL (Cytiva).
Des fibroblastes de peau humains (don de la banque de tissus et cellules de l’hôpital Edouard Herriot, Lyon) ont été cultivés de la même manière.
Analyses par ELISA
100 ng d’un anticorps anti-PCPE-1 en solution dans un tampon carbonate pH 9.6 sont coatés au fond d’une microplaque une nuit à 4°C. Après blocage avec une solution de BSA 1%, des quantités croissantes de PCPE-1 (protéine humaine purifiée) sont ajoutés et laissées en contact pendant 1 h30 à température ambiante. PCPE-1 est détecté par addition d’un VHH biotinylé, par exemple VHH-I5 (100 ng) pendant 1 h à température ambiante, puis ajout d’extravidine-HRP et détection à l’aide de solution de TMB. Pour détection de PCPE-1 dans le sang, des échantillons de plasma humains sont dilués au 50ème, puis analysés comme ci- dessus.
Marquage du VHH-H4 et étude de ses caractéristiques
Le VHH-H4 est bioconjugué au NODAGA puis marqué au galium 68 selon la procédure décrite dans (Renard et al, 2020). Sa biodistribution est évaluée chez le rat après injection iv de 25 pg (12 MBq). Pour cela 9 échantillons sanguins (150-200 pL) ont été prélevés durant les 2h30 suivant l’injection, après quoi l’animal a été euthanasie. Les tissus prélevés ont été analysés par comptage gamma.
Analyses statistiques
Sauf mention contraire, les données représentent la moyenne ± écart type d’au moins trois expériences indépendantes, calculées à l’aide du logiciel Graphpad Prism 8.2
RESULTATS
Exemple 1. Sélection et caractérisation de nanocorps dirigés contre PCPE-1
La figure 1 présente les résultats de la sélection des nanocorps de liaison à PCPE-1 issus de la banque de nanocorps de lama ou d’une banque synthétique.
Les domaines CUB1 et CUB2 de PCPE-1 étant nécessaires et suffisants à son activité, nous avons choisi d’utiliser comme antigène une protéine contenant ces deux domaines, mais dépourvue du domaine NTR. Les étiquettes utilisées pour la purification ont été éliminées pour éviter la sélection de ligands non spécifiques. Deux stratégies ont été menées en parallèle : une sélection in vivo de nanocorps de lama par immunisation de l’animal et une sélection in vitro à partir d’une bibliothèque de nanocorps synthétiques.
Pour la banque immune, les nanocorps ont été générés par cinq injections successives de CUB1 CUB2 recombinant dans un lama, suivies de deux étapes de biopanning. 48 clones ont été analysés par phage-ELISÀ, conduisant à 11 clones uniques après séquençage. Ces 11 clones peuvent être classés en six familles en fonction de leurs CDR3. La première famille est la plus représentée avec 5 clones alors que les autres n’ont qu’un ou deux variants. 3 membres de la famille 1 (VHH-11 , VHH-I5 et VHH-I7) et un membre de chacune des autres familles ont été sélectionnés, produits dans le périplasme de E.coli et purifiés. Leur affinité pour PCPE-1 a été mesurée par résonance plasmonique de surface (SPR) (Fig. 1À). Tous, sauf le VHH-110, se fixent sur PCPE-1 (Table 2). On note que les nanocorps appartenant à une même famille ont des comportements très différents. Dans la famille 1 , l’interaction du VHH-11 avec PCPE-1 semble moins stable que celles des VHH-I5 et -I7, conduisant à une constante de dissociation nettement supérieure (Table 2). Parmi les autres nanocorps de lama, seul le VHH-I3 est un ligand puissant de PCPE-1 , avec des constantes de dissociation de l’ordre du nanomolaire.
La sélection des nanocorps synthétiques a été effectuée à l’aide de trois cycles de phage display, puis 90 clones ont été choisis au hasard et testés par phage ELISÀ pour leur capacité à se fixer sur PCPE-1. 32 % des clones ont donné un signal positif, ce qui correspond à 24 clones uniques après séquençage. 7 de ces 24 clones ont également donné un signal positif lorsque testés contre CUB1 NTR immobilisé. 10 clones (incluant ces 7) ont finalement été produits et purifiés, puis leur affinité pour PCPE-1 a été mesurée par SPR (Fig. 1 B). Sur les 10, seule la moitié donnent une interaction nette avec PCPE-1 lorsqu’ils sont injectés à 200 nM, les meilleurs résultats étant obtenus avec les VHH-H4 et VHH-H10 (Fig. 1 B) dont les KDS sont de l’ordre du nanomolaire (Table 2).
Mesure de la constante d’affinité KD des différents nanocorps étudiés
Les nanocorps issus de la banque de nanocorps synthétiques sont désignés par des appellations commençant par la lettre H ; les nanocorps issus du sérum d’un lama immunisé sont désignés par des appellations commençant par I.
La figure 1À présente l’activité de liaison à PCPE-1 des huit nanocorps issus de sérum de lama : 11 , I2, I3, I4, I5, I7, 110 et 111.
La figure 1 B présente l’activité de liaison à PCPE-1 des dix nanocorps synthétiques suivants : H1 à H10.
Le tableau 2 ci-dessous présente les constantes d’affinité KD de sept nanocorps issus de lama (comme indiqué ci-dessus, le nanocorps 110 ne se fixe pas du tout), et des dix nanocorps synthétiques. Tableau 2 Les constantes d’affinité inférieures à 100 nM sont représentatives d’une liaison forte ; c’est le cas des nanocorps suivants : I3, I5, I7, H4 et H10.
Exemple 2. Détermination des régions reconnues par les nanocorps
La figure 2 présente les résultats de la détermination des régions de PCPE-1 reconnues par les anticorps. Des expériences de compétitions par co-injection des nanocorps avec le domaine CUB1 ou CUB2 de PCPE-1 ont été réalisées (Fig. 2À). Lorsqu’ils sont mélangés à CUB2, les nanocorps I3, I5 et I7 se sont révélés incapables de se lier à PCPE-1 , alors que la co-injection avec CUB1 n’a pratiquement aucun effet, ce qui indique que ces nanocorps interagissent principalement avec le domaine CUB2 de PCPE-1. Àu contraire, l’interaction des nanocorps synthétiques H4 et H10 avec PCPE-1 est empêchée par la co-injection avec CUB1 et pas avec CUB2, indiquant qu’ils interagissent avec le domaine CUB1.
Pour les meilleurs ligands de chaque banque (I5 et H4), nous avons ensuite déterminé si les autres nanocorps possédaient le même épitope ou s’ils étaient capables de se fixer simultanément à PCPE-1 . Pour cela, la puce PCPE-1 a d’abord été saturée avec le nanocorps- I5 ou -H4. Si l’on n’observe pas de changement du signal lorsque le VHH-I5 est ensuite coinjecté avec les autres nanocorps de lama, la co-injection de VHH-I5 et des VHH-H4 ou -H10 conduit à une forte augmentation du signal (Fig. 2B), indiquant qu’ils se fixent simultanément sur des sites distincts de PCPE-1. De la même manière, quand la surface est d’abord saturée avec le VHH-H4 (Fig. 2C), les nanocorps de lama sont toujours capables d’interagir avec PCPE-1 alors que le VHH-H10 ne peut plus se fixer. Ces résultats confirment que les deux bibliothèques ont des épitopes différents, mais qu’à l’intérieur d’une bibliothèque, les épitopes sont plutôt conservés.
PCPE-2 est une protéine de la même famille que PCPE-1 , avec une séquence en acides aminés à 43 % identique. Elle partage avec PCPE-1 certaines activités, mais possède également des fonctions spécifiques bien différentes. La spécificité de l’interaction des nanocorps pour PCPE-1 par rapport à PCPE-2 a été analysée par SPR. Pour cela les VHH-I5 et VHH-H4 ont été biotinylés sur leur extrémité C-terminale grâce à la sortase, puis immobilisés sur une surface streptavidine. Dans les deux cas, l’interaction avec PCPE-2 est quasi indétectable (KD > 1 pM) alors que PCPE-1 se fixe très fortement (KD = 1.5 nM (VHH-I5) et KD = 3.9 nM (VHH-H4), Fig. 2D-E et tableau 3 ci-dessous). L’affinité des VHH-I5 et -H4 pour PCPE-1 est donc au moins 250 fois plus forte que pour PCPE-2.
Tableau 3
Exemple 3 : Effets antagonistes inhibiteurs sur PCPE-1 des nanocorps selon l’invention
La figure 3 présente les résultats de l’effet inhibiteur des nanocorps selon l’invention sur l’activité de PCPE-1. L’activité de PCPE-1 passe par son interaction directe avec les C- TJ propeptides des procollagènes. Nous avons donc observé si les nanocorps étaient capables d’empêcher la fixation de PCPE-1 sur un mini-procollagène III (Mini III, composé des domaines C-terminaux du procollagène III : fin de la triple hélice, C-télopeptide et C-propeptide) à l’aide d’expériences de compétition par SPR.
Les résultats montrent que les VHH-I3, -I5, -I7, -H4 et -H10 inhibent la fixation de PCPE-1 sur le Mini III alors que les VHH-11 , -I2, -I4 et -111 n’ont pas d’effet (Fig. 3À).
Les VHH-H4, -H10 et VHH-I5 sont les plus efficaces, avec 50 à 75 % d’inhibition à 250 nM.
De plus leurs effets antagonistes sont additifs, et la co-injection d’un mélange de VHH-I5 et VHH-H4 avec PCPE-1 élimine pratiquement son interaction avec le Mini III. Cet effet inhibiteur augmente avec la concentration, avec des CI50 estimées à environ 45 nM (VHH- H4), 24 nM (VHH-I5) et 20 nM (mix VHH-I5 et VHH-H4) en présence de 5 nM de PCPE-1 .
Cependant, si l’on atteint une inhibition complète à forte concentration pour le VHH-H4, l’ajout de VHH-I5 seul ne permet pas de bloquer totalement l’interaction PCPE-1 / Mini III, alors que l’inhibition est totale lorsque VHH-H4 et VHH-I5 sont combinés.
Puisque les nanocorps empêchent la fixation de PCPE-1 sur les procollagènes, l’étape suivante était de voir s’ils inhibent également l’activité de PCPE-1 in vitro. CPH l-Long (un substrat modèle du procollagène III) est clivé par incubation avec la protéase BMP-1 et ce clivage est augmenté en présence de PCPE-1 (Fig. 3B, augmentation d’un facteur 2.4 dans ces conditions). L’ajout des VHH-11 , VHH-I2, VHH-I4 ou VHH-111 n’a que très peu d’effet sur l’activité de PCPE-1. Par contre, l’ajout de VHH-I3, VHH-I5, VHH-I7, VHH-H4 ou VHH-H10 conduit à une baisse de 25 à 45 % de l’activation, et celle-ci est totalement inhibée par l’utilisation simultanée des VHH-I5 et VHH-H4. Il faut également noter que l’activité basale de BMP-1 ne semble pas modifiée par la présence des VHHs, et ce malgré le fait que BMP-1 contient aussi trois domaines CUB.
Enfin, les nanocorps ont été évalués dans un test cellulaire pour leur capacité à moduler le clivage du procollagène I.
Pour mimer des conditions fibrotiques, des fibroblastes de cœur de rats ont été traités avec la protéine recombinante PCPE-1 humaine (Fig. 3C,D). L’ajout de PCPE-1 dans le milieu augmente la libération du C-propeptide du procollagène I d’un facteur environ 2.5 en moyenne. La présence des VHH-I5 et VHH-H4 inhibe l’effet de PCPE-1 (d’environ 40%), comme le montre la diminution du C-propeptide (Fig. 3C). De façon très nette, le traitement conjoint par les VHH-I5 et VHH-H4 bloque complètement l’effet du PCPE-1 exogène, avec un retour à la quantité basale de C-propeptide libérée. Par ailleurs le traitement des cellules par les VHHs seuls (en absence de PCPE-1 ajouté) n’a pas d’effet sur la libération du C- propeptide. Tous ces résultats suggèrent que les ligands sélectionnés sont des antagonistes puissants de PCPE-1 , capables de bloquer la stimulation de la maturation C-terminale des procollagènes par PCPE-1.
Exemple 4 : Construction et caractérisation d’un diacorps (nanocorps divalent)
Les résultats précédents suggèrent que combiner les nanocorps I5 et H4 dans une même chaine polypeptidique pourrait encore améliorer leur affinité pour PCPE-1 grâce à la coopérativité des sites.
La figure 4 présente les résultats obtenus pour le diacorps diab-D1 de SEQ ID NO. 21 , produit en bactéries.
L’interaction du diab-D1 avec PCPE-1 a été évaluée par SPR, par injection de concentrations croissantes de diab-D1 sur PCPE-1 immobilisé. Le bénéfice lié à la fusion des VHHs est clairement visible avec l’avidité qu’elle procure, et qui se manifeste par une constante de dissociation améliorée (KD =0.32 nM) et une dissociation beaucoup plus lente (Fig. 4À).
D’autre part, des expériences de compétition ont été réalisées pour déterminer si diab-D1 avait un pouvoir antagoniste plus puissant que les nanocorps utilisés individuellement (Fig. 4B). La CI50 calculée pour le diab-D1 est estimée à 3.5 nM, elle est sensiblement plus faible que celle des VHH-I5 et VHH-H4 seuls ou co-injectés (5 à 13-fois) dans les mêmes conditions. De même, l’ajout de diab-D1 bloque totalement la stimulation du clivage du CPH I -Long par PCPE-1 (Fig. 4C).
Effet de diab-D1 sur le clivage des procollagènes I et II
Le diacorps diab-D1 est également capable de bloquer l’activité de PCPE-1 sur les autres collagènes fibrillaires. En effet, l’addition de diab-D1 inhibe l’activation du clivage des Miniprocollagène I (Mini I) et II (Mini II) par PCPE-1 comme illustré sur la figure 4D.
Modulation de la maturation des collagènes par diab-D1
En culture cellulaire (Fig. 4E, 4F), diab-D1 est capable de bloquer totalement l’effet de l’ajout de PCPE-1 sur le clivage du procollagène I endogène par les fibroblastes de cœur de rat. D’autre part, et au contraire des VHHs individuels, le diacorps inhibe également le clivage du C-propeptide en absence de PCPE-1 ajouté.
Le diacorps inhibe également le clivage du procollagène I produit par des fibroblastes de peau humains, que ce soit à l’état basal ou en conditions « fibrotiques » mimées par la stimulation au TGF-béta, ou bien en présence de PCPE-1 exogène ajouté.
Ceci est illustré sur les figures 4G et 4H, qui montrent une immunodétection du procollagène I et de ses produits de clivage C-terminaux dans le milieu de culture de fibroblastes de peau humains, après 72h de culture en absence ou en présence de PCPE-1 , de TGF-béta et de diab-D1 . D’autres mesures ont été réalisées par immunofluorescence, sur des fibroblastes humains en culture (résultats non montrés). Il a été constaté que la matrice déposée par les cellules est également affectée, puisque l’addition de diab-D1 entraine une diminution du dépôt de collagène détecté par immunofluorescence.
Exemple 5 : Nanocorps couplé à un marqueur détectable
Les nanocorps contenant la séquence LPETG (SEQ ID NO. 39) ont été couplés à la biotine à l’aide de la Sortase comme décrit ci-dessus. Les nanocorps ainsi couplés peuvent être fixés sur la streptavidine, permettant la détection de PCPE1 dans un mélange complexe, par SPR, ELISÀ ou Western Blot.
La figure 5À représente l’étude par SPR de l’interaction de PCPE-1 avec le nanocorps H4 biotinylé, capturé sur une puce couplée à la streptavidine.
La figure 5B montre la détection de PCPE-1 à l’aide d’un ELISÀ sandwich. L’échantillon contenant PCPE-1 est capturé par un anticorps anti-PCPE-1. L’ajout du VHH-I5 biotinylé permet sa détection, via l’utilisation de streptavidine couplée à la HRP ou à un fluorophore tel que l’Alexafluor488. La méthode est très sensible et permet de détecter facilement 0-1 ng de PCPE-1. On peut ainsi déterminer la quantité de PCPE-1 présente dans le plasma humain, qui est d’environ 510 ± 70 ng/ml.
Alternativement, PCPE-1 peut être détecté par ELISÀ sandwich entre H4 et I5.
Les nanocorps ont également été couplés à un marqueur radioactif, le NODAGA-Ga68.
Pour cela VHH-H4 a d’abord été bioconjugué au NODAGA, puis marqué au galium 68 selon la procédure décrite dans (Renard, 2020).
La biodistribution et la pharmacocinétique du nanocorps ont ensuite été évaluées chez le rat après injection intra-veineuse de 25 pg (12 MBq) de H4-Ga68, afin de déterminer les voies d’élimination et les zones d’accumulation de la molécule.
Les résultats sont présentés en figure 6A (pharmacocinétique) et 6B (biodistribution dans les principaux organes : cœur, poumons, sang, foie, rate, reins et vessie).
Le nanocorps H4-Ga68 peut également être utilisé pour détecter PCPE-1 sur des coupes de tissus et détection par phosphorimager : voir figure 6C. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps.
2. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 caractérisé en ce qu’il inhibe son interaction avec le domaine C-terminal des procollagènes.
3. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 2, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps.
4. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que ledit nanocorps comprend trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE-1 , et que parmi ces trois CDRs, au moins un CDR présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 1 à SEQ ID NO. 15.
5. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 4, caractérisé en ce que chacun des trois CDRs dénommés CDR1 , CDR2 et CDR3 est ainsi défini : i. CDR1 présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences suivantes : SEQ ID NO.
1 , 4, 7, 10 ou 13; ii. CDR2 présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences suivantes : SEQ ID NO.
2, 5, 8, 11 ou 14; et iii. CDR3 présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences suivantes : SEQ ID NO.
3, 6, 9, 12 ou 15.
6. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 ou 3 à 5, dont la séquence peptidique présente au moins 80% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20.
7. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 constitué d’une combinaison de deux ou trois nanocorps selon l’une des revendications 1 , 3, 4, 5 ou 6, en particulier d’une combinaison de deux séquences polypeptidiques présentant chacune au moins 80% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20, optionnellement comprenant de plus un ou deux agents de liaison.
8. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 7, dont la séquence polypeptidique présente au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO. 21 .
9. Acide nucléique codant pour un nanocorps selon l’une des revendications 1 ou 3 à 6, ou codant pour une combinaison de deux ou trois nanocorps selon l’une des revendications 7 ou 8.
10. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendication 2 à 8, pour son utilisation en tant que médicament.
11. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendication 2 à 8, pour son utilisation médicale dans le traitement du cancer ou d’une fibrose, notamment de la fibrose cardiaque.
12. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu’il est couplé à un marqueur détectable.
13. Utilisation d’un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 12, pour le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale.
14. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 12, pour son utilisation théranostique pour le traitement et le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale.
15. Kit pour déterminer l’activité et/ou la quantité de la glycoprotéine PCPE-1 dans un échantillon biologique in vitro ou ex vivo, comprenant :
- un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 à 8 ou 12, et - des réactifs de détection.
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