EP4457774A1 - Methode d'analyse d'images de microbes - Google Patents

Methode d'analyse d'images de microbes

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Publication number
EP4457774A1
EP4457774A1 EP21859382.0A EP21859382A EP4457774A1 EP 4457774 A1 EP4457774 A1 EP 4457774A1 EP 21859382 A EP21859382 A EP 21859382A EP 4457774 A1 EP4457774 A1 EP 4457774A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microbes
microbe
image
brightness
peak
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21859382.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Akiko Hisada
Erino Matsumoto
Yuusuke Oominami
Didier Raoult
Jacques BOU KHALIL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ihu Mediterranee Infection
Hitachi High Tech Corp
Original Assignee
Ihu Mediterranee Infection
Hitachi High Tech Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ihu Mediterranee Infection, Hitachi High Tech Corp filed Critical Ihu Mediterranee Infection
Publication of EP4457774A1 publication Critical patent/EP4457774A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing images of microbes.
  • a drug susceptibility test method in which a microbe in a liquid is incubated with a dye and then collected by filtration through a filter, and a viability test is used to enumerate a microbe stained with a substance that stains both a living cell and a dead cell in a field of view of a light microscope and a microbe stained with a substance that stains only a dead cell (se refer to JP-A-2001-509008).
  • JP-A-2001-509008 the problem is that only a method using an optical microscope is described, and the finer morphology of a microbe is not observed.
  • an object of the present invention is to provide a microbe image analysis method which can evaluate a proportion of a microbe by obtaining information on the fine morphology of an individual microbe with the resolution of an electron microscope.
  • a method for analyzing images of microbes comprises: a first step for obtaining an image of a specimen in which a sample containing microbes is stained, using an electron microscope; a second step for obtaining a brightness profile relating to the brightness of the image; a third step for defining a first standard luminosity range which meets a first condition relating to the brightness of the profile as a region where a first group of microbes exists, and defining a second standard luminosity range which meets a second condition relating to the profile brightness as a region where a second group of microbes exists; and a fourth step for calculating a proportion of the microbe that exists in each of the first and second standard brightness ranges.
  • the present invention it is possible to provide a method for analyzing images of microbes which makes it possible to evaluate a proportion of a microbe by obtaining information on the fine morphology of an individual microbe with the resolution of a electronic microscope.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an image of microbes having different image brightness and image brightness range
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the image brightness range
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of classification of images of microbes
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a viability test result of a microbe after a storage treatment
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a viability test result of a microbe exposed to oxygen
  • FIG. 6 is a diagram illustrating electronic coloring
  • FIG. 7 is a diagram illustrating an image analysis result of a microbe treated with an antibacterial agent.
  • one of the important basic techniques is microscopic observation, which uses an image of an individual microbe and a group of microbes.
  • microscopic observation uses an image of an individual microbe and a group of microbes.
  • a difference in cell wall structure of bacteria is stained with a dye and observed with a light microscope, so that Gram-positive and Gram-negative bacteria are separated and classified into bacilli and cocci based on the appearance of bacteria, and information associated with bacterial species such as staphylococcus, streptococcus and their equivalents can be obtained from an approximate form of aggregates of isolated and cultured bacteria.
  • an electron microscope is used. As the wavelength of an electron beam is much shorter than that of visible light, a high-resolution image can be obtained, and even fine morphology that cannot be captured with an optical microscope can be observed. Examples of fine morphology include species-specific structure of the microbe, structure observed during cell division, abnormal morphology caused by the influence of a drug, and their equivalents.
  • a state-of-the-art electron microscope requires large-scale mechanisms such as a mechanism that applies a high voltage to generate a beam stable electron beam, a mechanism for keeping the inside of the microscope in a vacuum state to prevent scattering of the emitted electron beam, and their equivalents that make it difficult to use the electron microscope's state of art in a daily microbial test as in clinical practice or its equivalents.
  • a benchtop electron microscope which has been achieved by improving the state-of-the-art electron microscope, has been developed, and it is also planned to apply it to a microbial sample.
  • staining method is limited.
  • stains corresponding to various purposes such as cell biology, histology, pathology and their equivalents are developed, improved, and various kinds of staining methods for staining component and function of a cell and a tissue with different colors are drawn.
  • the electron microscope uses a method of visualizing a structure of the whole microbe such as a cell membrane, nucleus and their equivalents through the contrast of black and white images by treating a sample with a dye containing a heavy metal such as uranium, lead, platinum, osmium and their equivalents, or a method of visualizing the location of a specific molecule with a marker consisting of fine gold particles.
  • a dye containing a heavy metal such as uranium, lead, platinum, osmium and their equivalents
  • An example of a second aspect of the prior art is a test for viability of a microbe, which is one of the important test items in a microbial test.
  • a test for viability of a microbe which is one of the important test items in a microbial test.
  • the viability of a microbe in a sample treated with these treatments is measured, thereby determining treatment type, treatment method, treatment intensity, treatment concentration, and their equivalents.
  • an ordinary method is a culture method such as a colony forming unit and its equivalents.
  • a culture method such as a colony forming unit and its equivalents.
  • a certain amount of a microbial suspension of known concentration is thinly spread on an agar medium and cultured for about a day, the number of colonies of bacteria growing in a certain period of time is considered as the number of bacteria surviving at the start of cultivation, a colony forming unit (CFU/ml) is calculated from the number of colonies against a liquid amount of seeded bacteria, and the calculated colony forming unit is taken as the viability at the start of the culture.
  • CFU/ml colony forming unit
  • the culture method is the most widely used method to test the viability of a microbe.
  • the problems are that it takes one or more days to perform the culture to form the colony, informed judgment is required to visually determine colony formation, and the culture method cannot be applied to a microbe whose culture conditions such as medium type and its equivalents are unknown.
  • a method using the optical microscope and its equivalents which does not require culture has been developed.
  • the method include a method for detecting a function such as enzymatic activity of a living cell and its equivalents with a chromogenic substrate, a method for performing staining and detection with a difference in permeability to substances of cell membranes of a living cell and a dead cell, a method for detecting a morphological change, and the like.
  • the methods described above are excellent in terms of speed, because it is not necessary to wait for the culture time until the bacteria grow and form a visible colony.
  • pieces of information about the fine morphology of a microbe with the resolution of the electron microscope such as a species-specific structure of the microbe, an observed structure during cell division, abnormal morphology caused by drug influence and their equivalents are harvested, and the usefulness of a technique to perform viability test on the same specimen is also considered.
  • a type and condition is harvested from morphological information of a biofilm-forming microbe, treatment is performed on the biofilm with an antimicrobial, bactericide, and their equivalents that affect the viability of the microbe, and the viability of a treated specimen and the viability of an untreated specimen are compared with each other, thus making it possible to evaluate the effect of the antimicrobial and the bactericide in situ (in situ observation).
  • the viability test method using the electron microscope is not practiced in microbial tests such as clinical and environmental tests.
  • the reason that the viability test using the electron microscope is difficult is that in the case of an ordinary electron microscope, there is an observation pretreatment to preserve the morphology of a microbe to be observed under vacuum.
  • a protein cross-linking agent such as glutaraldehyde and its equivalents is used in advance to chemically fix the microbe and then dry the microbe, at the time of fixing the microbe, the microbe loses a viability function. Therefore, it is not possible to perform a viability assay as described in the optical detection example that visualizes a viability function of a truly living microbe such as a difference and its equivalents at the l enzymatic activity and biological membrane permeability by staining.
  • An example of another method is correlative optical and electron microscopy in which a colored image obtained by the optical microscope and a morphological image obtained by the electron microscope are associated with each other.
  • this method although it is possible in principle to process the same sample and observe the same sample under the electron microscope after determining whether the sample is alive or dead under the light microscope, operations such as sample preparation , image overlay and their equivalents are not straightforward, and therefore difficult to apply to everyday microbial testing.
  • an aqueous solution of phosphotungstic acid (hereinafter PTA ) is used as a stain that strongly adheres to a microbe undergoing morphological damage associated with the life and death of the microbe, and an image showing compositional contrast is acquired with the backscattered electrons of a scanning electron microscope (referred to below). after SEM), thus providing a method for assessing a proportion of the microbe corresponding to viability.
  • PTA phosphotungstic acid
  • the proportion is acquired such that when a microbe in a suspension and its equivalents are stained with an aqueous solution of PTA, a difference of staining intensity between the microbe not undergoing the morphological damage associated with the life and death of the microbe and the microbe undergoing the morphological damage associated with the life and death of the microbe is detected as a difference in brightness of image, and each microbe is quantified.
  • This proportion is defined as the viability according to the present invention.
  • the proportion of living microbes at the time of SEM image acquisition is not shown, but the embodiment shows that a proportion equivalent to the viability by a method of the state of the art is obtained.
  • a method of using PTA as a colorant in the present invention will be described.
  • dyes such as an aqueous solution of uranium acetate, an aqueous solution of lead salt, platinum blue and their equivalents are often used.
  • These stains are excellent stains for visualizing intracellular structures such as a cell membrane, nucleus, and their equivalents by image contrast using a difference in affinity with a cell-forming component, but are not not used for a staining method to identify the life and death of the microbe.
  • Uranium is a radioactive substance and is limited by its availability and handling. Uranium, lead, and platinum are not suitable dyes for daily microbial testing due to their toxicity, stability in solution, cost of reagents, and their equivalents.
  • PTA is a reagent which is relatively cheap, easy to store and easy to use as described above, the inventor considers that PTA could be applied to staining electronics of a microbe in a daily microbial test.
  • PTA is widely used for the preparation of microscopic samples. For example, PTA is used as a staining mordant for light microscopy specimen in pathological examination, and used as a negative stain for microbe observation at the electronic microscope.
  • PTA is also used for positive staining at the time of observing a cell by electron microscope, and PTA can separately stain basic proteins, glycoproteins and polysaccharides by adjusting the concentration and pH of a solution and binding it to a carbohydrate part of the glycoprotein. It has been reported that when PTA is used for SEM observation of bacteria, Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria have different staining intensities.
  • the inventor found that after bacteria with known susceptibility are treated with an antibacterial agent exhibiting bactericidal action that damages cell membrane and cell wall, a PTA-stained specimen is prepared, an image of backscattered electrons from the SEM is obtained, individual bacteria with high image brightness are identified in the specimen, and a proportion of individuals with high image brightness increases as the antibacterial treatment time elapses.
  • a specimen is prepared by placing a microbe treated with a bactericide and its equivalents and a control microbe not treated with the bactericide on the equipment.
  • the specimen is fixed with 2.5% glutaraldehyde for 5 minutes, the specimen is stained with an aqueous solution of PTA at a concentration of 10% by weight for approximately 2 minutes, and a backscattered electron image is acquired at an accelerating voltage of 5 kV to 10 kV using SEM.
  • the microbe contained in the specimen treated with the bactericide is mainly classified into two groups, a microbe having high image brightness and a microbe having low image brightness.
  • the image brightness of the latter microbe having the low image brightness is identical to the image brightness of the control microbe specimen not treated with the bactericide.
  • the inventor provides a method for knowing the type of a microbe and a morphological characteristic thereof with an electron microscope, and easily identifying a microbe undergoing associated morphological damage. to life and death and a microbe not undergoing morphological damage by image brightness arising from the intensity of electron staining using PTA.
  • a first embodiment shows an example of classifying a microbe image based on a difference in image brightness of a stained microbe in an electron microscope image of the microbe.
  • FIG. 1 illustrates an example in which a microbe 1 (102) having low coloration and low image brightness and a microbe 2 (103) having strong coloration and high image brightness are mixed by means of a schematic diagram electron microscope images (101) of a specimen in which the microbe is placed on the equipment and stained.
  • the image of microbes is classified into two groups including microbe 1 and microbe 2 based on the difference in image brightness.
  • An example of an electron microscope image (104) in which microbe 1 (102) exists and an example of an electron microscope image (105) in which microbe 2 (103) exists are backscattered electron images obtained in such a way that a strain of Pseudomonas aeruginosa is placed on a polycarbonate membrane with etched tracks, the strain of Pseudomonas aeruginosa is fixed with 2.5% glutaraldehyde and stained with an aqueous solution of PTA at a concentration of 10 % by weight, a specimen in which Pseudomonas aeruginosa is placed on the membrane is inserted into a SEM sample chamber, the accelerating voltage of SEM is set to 5 kV, and the brightness contrast at the time of generation of images is set to be constant. As the conditions for generating SEM images are constant, the difference in brightness between microbe 1 (102) in image (104) and microbe 2 (103) in image (105) arises from a difference PTA staining intensity.
  • the etched track membrane made of a plastic material is used as the equipment, and the equipment is not limited thereto.
  • a brightness profile (106) associated with image brightness (104) and a brightness profile (107) associated with image brightness (105) are difference histograms obtained such that the number of pixels for each brightness is obtained for each image in which microbe 1 or microbe 2 is placed on the membrane, and the number of pixels for each brightness in a membrane image in which the microbe is not placed is subtracted therefrom.
  • an image region of microbe 1 is characterized by a range of standard luminosity 1 (108) having a peak 1 of the luminosity profile (106) relative to the luminosity
  • an image region of the microbe 2 is characterized by a standard luminosity range 2 (102) comprising a peak 2 of the luminosity profile (107) relative to brightness, such that the images of microbe 1 and microbe 2 are classified.
  • the standard luminosity range 1 when the SEM brightness contrast is set to be constant at the time of acquisition of the image (104), image (105), image in a different region of the same specimen, and of images of a plurality of specimens prepared with the same material and the same method, the standard luminosity range 1
  • FIG. 2 illustrates examples (201 and 202) of adjusting the standard luminosity range.
  • 201 and 202 are the same histograms and are brightness profiles associated with the brightness of the electron microscope image. As shown in the schematic diagram (101) of FIG. 1, since 201 and 202 arise from the image in which microbes with different image brightness are mixed, peak 1 and peak 2 exist in examples 201 and 202.
  • peak 1 Another peak located on the left of peak 1 corresponds to a region of the electron microscope image of the equipment in which the microbe is placed, and this range is thus excluded to determine the range of standard luminosity which characterizes the image of microbes.
  • the standard brightness range 1 including peak 1 from an image of microbe 1 is determined, and a standard brightness range including peak 2 from an image of microbe 2 is determined within a range that does not overlap with standard luminosity range 1, such that microbe 1 characterized by standard luminosity range 1 and microbe 2 characterized by standard luminosity range 2 are classified .
  • the range of brightness standard 1 including both peak 1 resulting from the image of microbe 1 and peak 2 resulting from the image of microbe 2 is determined, and the standard brightness range 2 including peak 2 without including peak 1 is defined , which thus makes it possible to classify all the microbes contained in the image, the microbe 2 characterized by the standard luminosity range 2, and the microbe 1 obtained by subtracting the microbe 2 from all the microbes.
  • FIG. 3 illustrates an example in which the image of microbes is classified based on a difference in brightness of the electron microscope image using image analysis software, and an image mask is generated for each classification.
  • FIG. 1 in an electron microscope image (301) of a microbial specimen, microbe 1 (102) having low staining and low image brightness and microbe 2 (103) having high staining and high image brightness picture are mixed.
  • the mask (302) is an image with mask generated in such a way that the brightness range of the equipment is excluded, the image is binarized by defining a threshold value from the standard brightness range 1 comprising at the times peak 1 from the image of microbe 1 and peak 2 from the image of microbe 2, and particles significantly smaller than microbes 1 and 2 are then removed using a particles.
  • the mask (303) is a masked image generated such that the image is binarized by setting a threshold value from the standard brightness range 2 including peak 2 without including peak 1, and particles substantially smaller than the microbe are then removed using a particle analysis algorithm.
  • the image analysis software the individual microbe classified inside the mask 1 and the mask 2 can be identified, and the number of microbes, an image area of microbes and the number of pixels can be obtained to calculate a proportion.
  • the microbial specimen is stained to generate the backscattered electron image, the brightness profile relative to the image brightness of the microbe 1 (104) having low coloration and low image brightness and microbe 2 (105) having strong coloration and high image brightness is acquired, and the microbe image is classified by the range of brightness d image, so that the proportion of microbe 1 and microbe 2 in the specimen can be easily calculated.
  • the types of standard luminosity range can amount to more than two.
  • a second embodiment describes an example in which the proportion of a microbe obtained by the method of the present invention is compared with the viability of the microbe obtained by the colony-forming unit, which is a state-of-the-art method.
  • art of a viability assay, and a flow cytometry method which is a culture-free method.
  • bacteria As an example, bacteria (Akkermansia muciniphila) are cultured under anaerobic conditions on an agar medium for 48 hours and isolated. Then, the isolated bacteria are suspended at a bacterial concentration of approximately 10 10 CFU/ml in a storage medium containing an antioxidant, and are frozen and freeze-dried at ⁇ 80° C. for 24 hours.
  • the bacteria After being frozen and lyophilized, the bacteria are stained with 10% PTA for 5 minutes at 37°C, the bacterial suspension is spread on a glass slide by centrifugation and dried at room temperature, and SEM observation is performed. at an acceleration voltage of 10 kV. Images of 500 bacterial cells are obtained, classified into two types based on staining intensity, and the proportion is obtained.
  • frozen and freeze-dried bacteria are diluted in 10 steps under anaerobic conditions using anaerobic PBS, inoculated onto a Columbia blood agar plate, and cultured at 37°C for 48 to 72 hours.
  • the viability of the bacteria is calculated as the ratio between the number of bacteria colonized by the culture and the number of bacteria at the start of the culture.
  • FIG. 4 illustrates a result obtained by measuring the viability of bacteria after freezing and lyophilization with the method of the present invention (scanning electron microscopy), the flow cytometry method, or the colony forming unit. As a result of the comparison, there is no statistically significant difference in the viability obtained by the three types of method, either after freezing or after lyophilization.
  • bacteria As another example, bacteria (Akkermansia muciniphila) are suspended in Mueller Hinton (MHB) medium or medium containing an antioxidant, and then left at room temperature for one hour under anaerobic or aerobic conditions.
  • MLB Mueller Hinton
  • FIG. 5 illustrates results of a proportion of bacteria obtained by the method of the present invention and a viability obtained by the colony forming unit, in the same manner as that of the example described above. As a result of the comparison, there is no statistically significant difference in the viability obtained by the two methods in either condition.
  • a third embodiment describes an example of quantification of the effect of performing a treatment having a bactericidal action on a microbe by analyzing an electron microscope image of the microbe stained with PTA.
  • a strain of Pseudomonas aeruginosa is used as the material
  • bacteria in a control group not treated with the antibacterial agent and bacteria in a test group treated with the antibacterial agent colistin are cultured at 37°C for 30 minutes
  • the bacteria are collected on a track-etched membrane and fixed with 2.5% glutaraldehyde
  • a specimen is prepared by performing electronic staining for 2 minutes using an aqueous solution of PTA having a concentration by weight of 10% as a dye and an aqueous solution of platinum blue for comparison
  • a backscattered electron image is obtained by SEM observation at an accelerating voltage of 5 kV.
  • the bacteria in the control group not treated with the antibacterial agent and the bacteria in the test group treated with the antibacterial agent and therefore affected can be colored based on the difference in image brightness.
  • the influence of colistin on Pseudomonas aeruginosa is detected by PTA staining, but the purpose of the embodiment is not limited to this combination.
  • Escherichia coli or Pseudomonas aeruginosa is treated with the ⁇ -lactam antibiotic imipenem with bactericidal action, bacteria with high image brightness are enhanced by PTA staining.
  • the embodiment is not limited to this example, and when a user takes advantage of the fact that the intensity of the electronic coloring varies depending on the state of the microbe at the time of performing the treatment which affects the microbe, a control group image and a test group image are obtained, a microbe image brightness range which characterizes a control group microbe image and a microbe image brightness range which characterizes a microbes of the test group having a brightness different from that of the control specimen are determined, and the images of microbes of the control group and the test group are classified and the proportion is obtained, so that the effect of the treatment affecting the microbe can be analyzed and evaluated.
  • the antibacterial agent many agents antibacterials which affect the cell wall of bacteria, inhibit the growth of bacteria or exhibit bactericidal action are being developed. Since a human cell does not have a cell wall, a compound that acts selectively on the cell wall of bacteria should have low side effects in humans.
  • the method of this embodiment can be used to assess the effect of such compounds, or to screen a new compound based on a mechanism of action.
  • a drug susceptibility test is performed for each bacteria isolated from a patient.
  • resistance is determined from a minimum inhibitory concentration (MIC) value that inhibits the growth of bacteria, and it takes about a day of culture to obtain the MIC.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • this embodiment can also be used to evaluate a bacteriophage that infects bacteria and causes bacteriolytic action.
  • a phage destroys the membrane and peptidoglycan to kill bacteria.
  • Phage therapy is being investigated as one of the treatments for multidrug resistant bacteria, and requires a method to rapidly select a combination of phages specific to pathogenic bacteria from a phage bank in the environment of artificially modified phages.
  • the bacteriolytic property of the phage is assessed, thus allowing it to be used for phage screening.
  • evaluation can be used to select conditions of storage of the microbe or a method of sterilization.
  • FIG. 7 shows the result of the treatment of Pseudomonas aeruginosa with the antibacterial agent colistin and the analysis of the time variation of the influence of colistin by the image brightness of bacteria.
  • a strain of Pseudomonas aeruginosa whose sensitivity to colistin is known from the MIC value measured by a method of the state of the art and a strain of Pseudomonas aeruginosa whose sensitivity to colistin is known are used.
  • a bacterial solution suspended in a medium at an initial concentration of 10 6 /ml is treated with colistin at 2 mg/l, which is the concentration that distinguishes between sensitive bacteria and resistant bacteria by the state method. of the art, is treated and cultured at 37°C, and a certain amount of the bacterial solution is sampled over time.
  • a track-etched polycarbonate membrane having a hole diameter of 0.2 ⁇ m is used as the specimen equipment for SEM observation of bacteria, and the bacteria are uniformly collected in a certain area on the membrane.
  • a conductivity is conferred on the specimen by prior vaporization of platinum-palladium on the surface of the membrane.
  • the bacteria After washing a component of the medium on the bacteria collection surface with physiological saline solution, the bacteria are treated and fixed for 5 minutes with a 2.5% glutaraldehyde fixing solution having a protein cross-linking effect in order to to prevent the morphological modification of the bacteria. After washing the excess fixing solution with water, the bacteria are treated with an aqueous solution of PTA having a concentration by weight of 10% for 2 minutes and stained. After washing off the excess dye with water, the bacteria are dried on the etched track membrane to form a specimen for SEM observation.
  • the SEM observation conditions are established at an acceleration voltage of 5 kV, the detection of backscattered electrons, and a magnification of 7000 times.
  • the reason for which the accelerating voltage is set to 5 kV is that a hole image of the membrane with tracks etched by an electron beam transmitted through a bacterial cell does not overlap with an image of Pseudomonas aeruginosa.
  • the reason for setting the magnification to 7000 times is to observe the morphology of Pseudomonas aeruginosa, and the embodiment is not limited thereto.
  • the SEM brightness contrast is set to be constant such that the SEM brightness contrast is made constant in the acquisition images of all specimens. Therefore, image analysis to be performed later becomes easier.
  • the series of backscattered electron images (701) in FIG. 7 is an example of an image acquired by SEM observation using a colistin-sensitive strain of Pseudomonas aeruginosa.
  • the backscattered electron image (702) is an example of an image obtained by SEM observation of microbe 1 observed in a specimen at 0 minutes of culture.
  • the backscattered electron image (702) shows Pseudomonas aeruginosa unaffected by colistin, and is the same as an untreated control specimen.
  • the backscattered electron image (703) is an example of an image obtained by SEM observation of microbe 2 observed after 8 minutes of culture, and shows Pseudomonas aeruginosa whose membrane and cell wall are damaged by the influence of colistin and stained with PTA.
  • the brightness profile relative to the brightness of the image (702) of microbe 1 is acquired to determine the range of image brightness 1 (108) shown in FIG. 1.
  • the brightness profile relative to the brightness of image (703) of microbe 2 is acquired to determine the range of image brightness 2 (107) shown in FIG. 1.
  • a microbe image region is extracted from all images taken for each specimen, and is classified into microbe 1 characterized by image brightness range 1 (108) and microbe 2 characterized by image brightness range 2 (107), thereby determining whether an individual microbe is an individual unaffected by colistin or an individual whose membrane and cell wall are damaged by the influence of colistin.
  • the classified individuals are counted, and a proportion of microbe 1 is calculated by counting the total number of microbes 1 and 2 as the total number of microbes. Since microbe 1 is not affected by the influence of colistin and is considered to be alive, a change in the proportion of microbe 1 corresponds to a change in viability.
  • the graph (704) shows the variation over time of the proportion of microbe 1 contained in the bacteria sampled from the control group
  • the graph (705) shows the variation over time of the proportion of microbe 1 contained in the bacteria sampled from the colistin-treated test group.
  • the proportion of microbe 1 hardly changes, but in the test group, the proportion of microbe 1 is reduced to 80% after 8 minutes, 60% after 30 minutes, and 0% after 60 minutes. This result indicates that the strain of Pseudomonas aeruginosa to be analyzed is sensitive to colistin.

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Abstract

Le but de cette invention est de proposer une méthode d'analyse d'images de microbes qui nous permet d'obtenir des informations sur une structure microscopique d'un microbe individuel avec la résolution d'un microscope électronique, et d'évaluer une proportion de microbes. Un aspect de la méthode de cette invention comprend une première étape servant à obtenir une image d'un spécimen dans laquelle un échantillon comportant des microbes est coloré, au moyen d'un microscope électronique; une deuxième étape servant à obtenir un profil de luminosité relatif à une gamme de distribution de luminosité de l'image; une troisième étape servant à définir une première gamme de luminosité étalon qui respecte une première condition relative à la luminosité du profil comme une région où un premier groupe de microbes existe, et définir une deuxième gamme de luminosité étalon qui respecte une deuxième condition relative à la luminosité du profil comme une région où un deuxième groupe de microbes existe; et une quatrième étape servant à identifier des microbes individuels qui existent dans chacune des première et deuxième gammes de luminosité étalons et/ou à calculer une proportion du microbe qui existe dans chacune des première et deuxième gammes de luminosité étalons.

Description

METHODE D’ANALYSE D MAGES DE MICROBES
CONTEXTE DE L’INVENTION
1. Domaine de l’invention
La présente invention concerne une méthode d’analyse d’images de microbes.
2. Description de l’état de l’art
Avec les inquiétudes sur la propagation mondiale de bactéries résistantes aux antimicrobiens, l’identification d’un microbe provoquant une maladie infectieuse et un test de maladie infectieuse tel qu’un test de sensibilité aux antimicrobiens et ses équivalents prennent toute leur importance. Ici, comme méthode permettant d’identifier un microbe et mesurer la sensibilité à un antimicrobien, on connaît une méthode de test de sensibilité aux médicaments dans laquelle un microbe dans un liquide est incubé avec un colorant puis collecté par filtration sur un filtre, et un test de viabilité est utilisé pour dénombrer un microbe coloré avec une substance qui colore à la fois une cellule vivante et une cellule morte dans un champ de vision d’un microscope optique et un microbe coloré avec une substance qui colore uniquement une cellule morte (se référer à JP-A-2001-509008).
RESUME DE L’INVENTION
Selon JP-A-2001-509008, le problème est que seule une méthode utilisant un microscope optique est décrite, et la morphologie plus fine d’un microbe n’est pas observée.
Par conséquent, un objet de la présente invention est de proposer une méthode d’analyse d’images de microbes qui permet d’évaluer une proportion d’un microbe en obtenant des informations sur la morphologie fine d’un microbe individuel avec la résolution d’un microscope électronique.
Une méthode d’analyse d’images de microbes selon un mode de réalisation de la présente invention comporte : une première étape servant à obtenir une image d’un spécimen dans laquelle un échantillon comportant des microbes est coloré, au moyen d’un microscope électronique ; une deuxième étape servant à obtenir un profil de luminosité relatif à la luminosité de l’image ; une troisième étape servant à définir une première gamme de luminosité étalon qui respecte une première condition relative à la luminosité du profil comme une région où un premier groupe de microbes existe, et définir une deuxième gamme de luminosité étalon qui respecte une deuxième condition relative à la luminosité du profil comme une région où un deuxième groupe de microbes existe ; et une quatrième étape servant à calculer une proportion du microbe qui existe dans chacune des première et deuxième gammes de luminosité étalons.
Selon la présente invention, il est possible de proposer une méthode d’analyse d’images de microbes qui permet d’évaluer une proportion d’un microbe en obtenant des informations sur la morphologie fine d’un microbe individuel avec la résolution d’un microscope électronique.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La FIG. 1 est un schéma illustrant une image de microbes ayant une luminosité d’image et une gamme de luminosité d’image différentes ; la FIG. 2 est un schéma illustrant un exemple de la gamme de luminosité d’image ; la FIG. 3 est un schéma illustrant un exemple de classification d’images de microbes ; la FIG. 4 est un schéma illustrant un résultat de test de viabilité d’un microbe après un traitement de stockage ; la FIG. 5 est un schéma illustrant un résultat de test de viabilité d’un microbe exposé à de l’oxygène ; la FIG. 6 est un schéma illustrant une coloration électronique ; et la FIG. 7 est un schéma illustrant un résultat d’analyse d’images d’un microbe traité avec un agent antibactérien. DESCRIPTION DE MODES DE REALISATION
Le contexte de la présente invention va être décrit avant la description d’un mode de réalisation.
Comme premier aspect de la technique antérieure, une des importantes techniques de base est l’observation au microscope, qui utilise une image d’un microbe individuel et d’un groupe de microbes. Par exemple, dans un examen clinique, une différence de structure de paroi cellulaire de bactéries est colorée avec un colorant et observée avec un microscope optique, de telle sorte que les bactéries Gram-positives et Gram-négatives sont séparées et classées en bacilles et en coques sur la base de l’apparence des bactéries, et des informations associées à des espèces bactériennes telles que le staphylocoque, le streptocoque et leurs équivalents peuvent être obtenues à partir d’une forme approximative d’agrégats de bactéries isolées et cultivées.
En plus de l’identification par cette coloration, on espère acquérir des informations sur la morphologie fine du microbe individuel. Cependant, la résolution d’un microscope optique généralement utilisé dans un examen clinique est d’environ plusieurs centaines de nanomètres, de sorte que, même s’il est possible d’obtenir la forme approximative du microbe et des informations de coloration de celui-ci, il n’est pas facile d’identifier une différence de morphologie entre les microbes individuels.
Ici, un microscope électronique est utilisé. Comme la longueur d’onde d’un faisceau d’électrons est bien plus courte que celle de la lumière visible, une image à haute résolution peut être obtenue, et même une morphologie fine qui ne peut pas être capturée avec un microscope optique peut être observée. Parmi les exemples de la morphologie fine, on citera une structure propre à l’espèce du microbe, une structure observée pendant la division cellulaire, une morphologie anormale provoquée par l’influence d’un médicament et leurs équivalents.
Comme un microscope électronique de l’état de l’art nécessite des mécanismes de grande taille tels qu’un mécanisme qui applique une haute tension pour générer un faisceau d’électrons stable, un mécanisme pour conserver l’intérieur du microscope dans un état de vide pour empêcher la diffusion du faisceau d’électrons émis, et leurs équivalents, il est difficile d’utiliser le microscope électronique de l’état de l’art dans un test microbien quotidien comme dans la pratique clinique ou ses équivalents. Cependant, ces dernières années, un microscope électronique de paillasse, qui a été obtenu en améliorant le microscope électronique de l’état de l’art, a été mis au point, et il est également prévu de l’appliquer à un échantillon microbien.
Un des problèmes avec une méthode d’observation utilisant le microscope électronique est que la méthode de coloration est limitée. Pour le microscope optique, des colorants correspondant à divers objectifs comme la biologie cellulaire, l’histologie, la pathologie et leurs équivalents sont mis au point, sont améliorés, et divers types de méthodes de coloration permettant de colorer un composant et une fonction d’une cellule et d’un tissu avec différentes couleurs sont établis.
Par exemple, le microscope électronique utilise une méthode permettant de visualiser une structure du microbe entier telle qu’une membrane cellulaire, un noyau et leurs équivalents par le contraste d’images en noir et blanc en traitant un échantillon avec un colorant contenant un métal lourd tel que l’uranium, le plomb, le platine, l’osmium et leurs équivalents, ou une méthode permettant de visualiser la localisation d’une molécule spécifique avec un marqueur constitué de fines particules d’or. Cependant, il y a peu de signalements de colorants colorant le composant spécifique du microbe et la fonction de celui-ci et présentant un contraste avec un faisceau d’électrons.
Comme décrit ci-dessus, bien qu’il soit souhaitable d’utiliser une méthode qui combine à la fois une coloration au microscope optique et une observation à haute résolution au microscope électronique, il n’existe pas de méthode pratique pour un test microbien quotidien.
Un exemple d’un deuxième aspect de la technique antérieure est un test de viabilité d’un microbe, qui est l’un des éléments à tester importants dans un test microbien. Par exemple, lors de la mise au point d’une méthode de traitement pour un médicament, la chaleur, un gaz et leurs équivalents pour retirer le microbe, ou lors de la sélection d’un agent thérapeutique pour des maladies infectieuses et leurs équivalents, la viabilité d’un microbe dans un échantillon traité avec ces traitements est mesurée, ce qui détermine ainsi un type de traitement, une méthode de traitement, une intensité de traitement, une concentration de traitement, et leurs équivalents.
Il existe diverses méthodes de test de viabilité, et une méthode ordinaire est une méthode de culture telle qu’une unité formant colonie et ses équivalents. Dans l’évaluation par formation de colonies, une certaine quantité d’une suspension microbienne de concentration connue est finement étalée sur un milieu gélosé et cultivée pendant environ une journée, le nombre de colonies de bactéries se développant dans un certain laps de temps est considéré comme le nombre de bactéries survivant au début de la culture, une unité formant colonie (CFU/ml) est calculée à partir du nombre de colonies par rapport à une quantité liquide de bactéries ensemencées, et l’unité formant colonie calculée est considérée comme la viabilité au début de la culture.
La méthode de culture est la méthode la plus largement utilisée pour tester la viabilité d’un microbe. Cependant, les problèmes sont qu’il faut un ou plusieurs jours pour effectuer la culture pour former la colonie, un jugement éclairé est nécessaire pour déterminer visuellement la formation de colonies, et la méthode de culture ne peut pas être appliquée à un microbe dont les conditions de culture telles que le type de milieu et ses équivalents sont inconnues.
Afin de résoudre les problèmes de la méthode de culture décrits ci-dessus, une méthode utilisant le microscope optique et ses équivalents ne nécessitant pas de culture a été mise au point. Parmi les exemples de la méthode, on citera une méthode permettant de détecter une fonction telle que l’activité enzymatique d’une cellule vivante et ses équivalents avec un substrat chromogène, une méthode permettant d’effectuer une coloration et une détection avec une différence de perméabilité aux substances de membranes cellulaires d’une cellule vivante et d’une cellule morte, une méthode permettant de détecter une modification morphologique, et leurs équivalents. Les méthodes décrites ci-dessus sont excellentes en terme de vitesse, parce qu’il n’est pas nécessaire d’attendre le temps de culture jusqu’à ce que les bactéries se développent et forment une colonie visible.
Ici, conjointement avec les premier et deuxième aspects décrits ci-dessus, des éléments d’information sur la morphologie fine d’un microbe avec la résolution du microscope électronique, tels qu’une structure propre à l’espèce du microbe, une structure observée pendant la division cellulaire, une morphologie anormale provoquée par l’influence d’un médicament et leurs équivalents sont récoltés, et l’utilité d’une technique permettant d’effectuer un test de viabilité sur le même spécimen est également considérée. Par exemple, un type et un état sont récoltés à partir d’informations morphologiques d’un microbe formant un biofilm, un traitement est effectué sur le biofilm avec un antimicrobien, un bactéricide et leurs équivalents qui affectent la viabilité du microbe, et la viabilité d’un spécimen traité et la viabilité d’un spécimen non traité sont comparées l’une à l’autre, ce qui permet ainsi d’évaluer l’effet de l’antimicrobien et du bactéricide in situ (observation in situ). Cependant, la méthode de test de viabilité utilisant le microscope électronique n’est pas mise en pratique dans des tests microbiens tels que les tests cliniques et environnementaux .
La raison pour laquelle le test de viabilité utilisant le microscope électronique est difficile est que dans le cas d’un microscope électronique ordinaire, il y a un prétraitement d’observation servant à préserver la morphologie d’un microbe devant être observé sous vide. Comme un agent de réticulation des protéines tel que le glutaraldéhyde et ses équivalents est utilisé à l’avance pour fixer chimiquement le microbe et sécher ensuite le microbe, au moment de la fixation du microbe, le microbe perd une fonction de viabilité. Par conséquent, il n’est pas possible d’effectuer un test de viabilité tel que décrit dans l’exemple de détection optique qui visualise une fonction de viabilité d’un microbe réellement vivant telle qu’une différence et ses équivalents au niveau de l’activité enzymatique et de la perméabilité de la membrane biologique par coloration.
Par conséquent, comme l’une des méthodes permettant d’observer la morphologie fine et déterminer la vie et la mort avec le même spécimen, il existe une méthode permettant de déterminer la morphologie associée à la vie et la mort du microbe, par exemple une méthode permettant de déterminer un endommagement de la membrane, l’effondrement d’une micro structure intracellulaire et leurs équivalents par observation d’une tranche ultramince au moyen d’un microscope électronique en transmission. Cependant, cette méthode nécessite une technique maîtrisée et un travail laborieux. Afin de calculer la viabilité en observant un nombre statistiquement significatif de microbes, une énorme quantité de travail est nécessaire, de sorte qu’il est difficile d’appliquer cette méthode à un test microbien quotidien.
Comme exemple d’une autre méthode, on citera la microscopie optique et électronique corrélative dans laquelle une image colorée obtenue par le microscope optique et une image morphologique obtenue par le microscope électronique sont associées l’une à l’autre. Dans cette méthode, bien qu’il soit possible en principe de traiter le même échantillon et observer le même échantillon au microscope électronique après avoir déterminé si l’échantillon est vivant ou mort au microscope optique, des opérations telles que la préparation de l’échantillon, la superposition des images et leurs équivalents ne sont pas simples, et donc difficiles à appliquer à un test microbien quotidien.
Dans les modes de réalisation suivants, comme technique permettant de récolter les informations sur la morphologie fine du microbe avec la résolution du microscope électronique et effectuer le test de viabilité avec le même échantillon, une solution aqueuse d’acide phosphotungstique (désigné ci-après PTA) est utilisée comme colorant qui adhère fortement à un microbe subissant un endommagement morphologique associé à la vie et la mort du microbe, et une image présentant un contraste de composition est acquise avec les électrons rétrodiffusés d’un microscope électronique à balayage (désigné ci-après MEB), ce qui fournit ainsi une méthode permettant d’évaluer une proportion du microbe correspondant à la viabilité.
Ici, la proportion est acquise de telle sorte que, quand un microbe dans une suspension et ses équivalents est coloré avec une solution aqueuse de PTA, une différence d’intensité de coloration entre le microbe ne subissant pas l’endommagement morphologique associé à la vie et la mort du microbe et le microbe subissant l’endommagement morphologique associé à la vie et la mort du microbe est détectée comme une différence de luminosité d’image, et chaque microbe est quantifié. Cette proportion est définie comme la viabilité selon la présente invention. Comme décrit ci-dessus, comme un prétraitement d’observation tel qu’une fixation et ses équivalents est effectué, la proportion de microbes vivants au moment de l’acquisition d’images de MEB n’est pas indiquée, mais le mode de réalisation montre qu’une proportion équivalente à la viabilité par une méthode de l’état de l’art est obtenue.
Un procédé d’utilisation du PTA comme colorant dans la présente invention va être décrit. En général, dans une coloration électronique au moment de l’observation d’un échantillon biologique au microscope électronique, des colorants tels qu’une solution aqueuse d’acétate d’uranium, une solution aqueuse de sel de plomb, du bleu de platine et leurs équivalents sont souvent utilisés. Ces colorants sont d’excellents colorants qui permettent de visualiser des structures intracellulaires telles qu’une membrane cellulaire, un noyau et leurs équivalents par le contraste d’une image en utilisant une différence d’affinité avec un composant formant la cellule, mais ne sont pas utilisés pour une méthode de coloration permettant d’identifier la vie et la mort du microbe. L’uranium est une substance radioactive et est limité par sa disponibilité et sa manipulation. L’uranium, le plomb et le platine ne sont pas des colorants adaptés à un test microbien quotidien en raison de leur toxicité, leur stabilité en solution, le prix des réactifs, et leurs équivalents.
Par conséquent, en ce qui concerne la sélection du colorant, comme le PTA est un réactif qui est relativement bon marché, facile à stocker et facile à utiliser comme décrit ci-dessus, l’inventeur considère que le PTA pourrait être appliqué à la coloration électronique d’un microbe dans un test microbien quotidien. Le PTA est largement utilisé pour la préparation d’échantillons microscopiques. Par exemple, le PTA est utilisé comme mordant de coloration pour un échantillon de microscopie optique dans un examen pathologique, et utilisé comme colorant négatif pour l’observation d’un microbe au microscope électronique. On sait que le PTA est également utilisé pour la coloration positive au moment de l’observation d’une cellule au microscope électronique, et le PTA peut colorer séparément des protéines basiques, des glycoprotéines et des polysaccharides en ajustant la concentration et le pH d’une solution et en le liant à une partie glucidique de la glycoprotéine. Il a été signalé que lorsque le PTA est utilisé pour l’observation au MEB de bactéries, les bactéries Gram-positives et les bactéries Gram-négatives ont des intensités de coloration différentes.
Ici, l’inventeur a découvert qu’après que des bactéries avec une sensibilité connue ont été traitées avec un agent antibactérien présentant une action bactéricide qui endommage la membrane cellulaire et la paroi cellulaire, un spécimen coloré au PTA est préparé, une image d’électrons rétrodiffusés du MEB est obtenue, des bactéries individuelles ayant une forte luminosité d’image sont identifiées dans le spécimen, et une proportion d’individus ayant une forte luminosité d’image augmente lorsque le temps de traitement antibactérien s’écoule.
On sait que puisqu’une caractéristique d’une image d’électrons rétrodiffusés est que le contraste de composition d’une substance peut être obtenu en plus du contraste de forme de surface d’un spécimen, une plus grande quantité de PTA est liée à des bactéries avec une membrane cellulaire et une paroi cellulaire endommagées par l’action bactéricide de l’agent antibactérien qu’à des bactéries vivantes. Ce résultat suggère que l’endommagement morphologique associé à la vie et la mort des bactéries peut être identifié avec une coloration au PTA.
Par conséquent, l’inventeur a soigneusement étudié une méthode de préparation d’échantillon comportant une étape de coloration au PTA et une condition permettant d’observer les électrons rétrodiffusés au moyen du MEB. Comme exemple, un spécimen est préparé en plaçant un microbe traité avec un bactéricide et ses équivalents et un microbe de contrôle non traité avec le bactéricide sur l’équipement. Le spécimen est fixé avec du glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 5 minutes, le spécimen est coloré avec une solution aqueuse de PTA à une concentration de 10 % en poids pendant environ 2 minutes, et une image d’électrons rétrodiffusés est acquise à une tension d’accélération de 5 kV à 10 kV au moyen du MEB.
En conséquence, le microbe contenu dans le spécimen traité avec le bactéricide est principalement classé en deux groupes, un microbe ayant une forte luminosité d’image et un microbe ayant une faible luminosité d’image. La luminosité d’image de ce dernier microbe ayant la faible luminosité d’image est identique à la luminosité d’image du spécimen de microbe de contrôle non traité avec le bactéricide. Autrement dit, on a découvert que dans un groupe de microbes traité avec un bactéricide, il est possible d’identifier, par coloration, des bactéries subissant l’endommagement morphologique provoqué par l’action bactéricide et des bactéries ne subissant pas l’endommagement morphologique, et de déterminer une proportion.
Sur la base des découvertes décrites ci-dessus, l’inventeur propose une méthode permettant de connaître le type d’un microbe et une caractéristique morphologique de celui-ci avec un microscope électronique, et d’identifier facilement un microbe subissant un endommagement morphologique associé à la vie et la mort et un microbe ne subissant pas l’endommagement morphologique par la luminosité d’image découlant de l’intensité de la coloration électronique utilisant le PTA.
Ci-après, des modes de réalisation détaillés vont être décrits. Une procédure, une concentration de médicament, un temps de traitement, une procédure d’analyse d’images et leurs équivalents décrits ci-dessus constituent des exemples, et ne limitent pas la portée de la présente invention.
[Premier mode de réalisation]
Un premier mode de réalisation montre un exemple de classification d’une image de microbe sur la base d’une différence de luminosité d’image d’un microbe coloré dans une image au microscope électronique du microbe. La FIG. 1 illustre un exemple dans lequel un microbe 1 (102) ayant une faible coloration et une faible luminosité d’image et un microbe 2 (103) ayant une forte coloration et une forte luminosité d’image sont mélangés au moyen d’un diagramme schématique d’images au microscope électronique (101) d’un spécimen dans lesquelles le microbe est placé sur l’équipement et coloré. Dans cet exemple, l’image de microbes est classée en deux groupes incluant le microbe 1 et le microbe 2 sur la base de la différence de luminosité d’image.
Un exemple d’une image au microscope électronique (104) dans laquelle le microbe 1 (102) existe et un exemple d’une image au microscope électronique (105) dans laquelle le microbe 2 (103) existe sont des images d’électrons rétrodiffusés obtenues de telle sorte qu’une souche de Pseudomonas aeruginosa est placée sur une membrane de polycarbonate à pistes gravées, la souche de Pseudomonas aeruginosa est fixée avec du glutaraldéhyde à 2,5 % et colorée avec une solution aqueuse de PTA à une concentration de 10 % en poids, un spécimen dans lequel Pseudomonas aeruginosa est placé sur la membrane est inséré dans une chambre à échantillon de MEB, la tension d’accélération du MEB est réglée à 5 kV, et le contraste de luminosité au moment de la génération d’images est réglé pour être constant. Comme les conditions de génération d’images de MEB sont constantes, la différence de luminosité entre le microbe 1 (102) dans l’image (104) et le microbe 2 (103) dans l’image (105) découle d’une différence d’intensité de coloration au PTA.
Comme exemple, la membrane à pistes gravées constituée d’un matériau plastique est utilisée comme équipement, et l’équipement n’y est pas limité. Ici, du point de vue d’une analyse d’images ultérieure, il est souhaitable qu’un utilisateur sélectionne un équipement constitué d’un matériau ayant une luminosité d’image différente de celle des microbes 1 et 2 colorés devant être analysés dans l’image d’électrons rétrodiffusés.
Un profil de luminosité (106) associé à la luminosité de l’image (104) et un profil de luminosité (107) associé à la luminosité de l’image (105) sont des histogrammes de différences obtenus de telle sorte que le nombre de pixels pour chaque luminosité est obtenu pour chaque image dans laquelle le microbe 1 ou le microbe 2 est placé sur la membrane, et le nombre de pixels pour chaque luminosité dans une image de membrane dans laquelle le microbe n’est pas placé en est soustrait.
Par exemple, une région d’image du microbe 1 est caractérisée par une gamme de luminosité étalon 1 (108) comportant un pic 1 du profil de luminosité (106) relatif à la luminosité, une région d’image du microbe 2 est caractérisée par une gamme de luminosité étalon 2 (102) comportant un pic 2 du profil de luminosité (107) relatif à la luminosité, de telle sorte que les images du microbe 1 et du microbe 2 sont classées.
Comme décrit ci-dessus, quand le contraste de luminosité du MEB est réglé pour être constant au moment de l’acquisition de l’image (104), de l’image (105), d’une image dans une région différente du même spécimen, et d’images d’une pluralité de spécimens préparés avec le même matériau et la même méthode, la gamme de luminosité étalon 1
(108) qui caractérise la région d’image du microbe 1 et la gamme de luminosité étalon 2
(109) qui caractérise la région d’image du microbe 2 peuvent être réglées à la même valeur, quand une analyse d’images est effectuée.
La FIG. 2 illustre des exemples (201 et 202) de réglage de la gamme de luminosité étalon. 201 et 202 sont les mêmes histogrammes et sont des profils de luminosité associés à la luminosité de l’image au microscope électronique. Comme l’illustre le diagramme schématique (101) de la FIG. 1, comme 201 et 202 découlent de l’image dans laquelle des microbes ayant une luminosité d’image différente sont mélangés, le pic 1 et le pic 2 existent dans les exemples 201 et 202.
Un autre pic situé sur la gauche du pic 1 correspond à une région de l’image au microscope électronique de l’équipement dans lequel est placé le microbe, et cette gamme est ainsi exclue pour déterminer la gamme de luminosité étalon qui caractérise l’image de microbes.
Comme le montre l’histogramme 1 (201), la gamme de luminosité étalon 1 comportant le pic 1 découlant d’une image du microbe 1 est déterminée, et une gamme de luminosité étalon comportant le pic 2 découlant d’une image du microbe 2 est déterminée à l’intérieur d’une gamme qui ne chevauche pas la gamme de luminosité étalon 1, de telle sorte que le microbe 1 caractérisé par la gamme de luminosité étalon 1 et le microbe 2 caractérisé par la gamme de luminosité étalon 2 sont classés.
En variante, comme l’illustre l’histogramme 2 (202), la gamme de luminosité étalon 1 comportant à la fois le pic 1 découlant de l’image du microbe 1 et le pic 2 découlant de l’image du microbe 2 est déterminée, et la gamme de luminosité étalon 2 comportant le pic 2 sans comporter le pic 1 est définie, ce qui permet ainsi de classer tous les microbes contenus dans l’image, le microbe 2 caractérisé par la gamme de luminosité étalon 2, et le microbe 1 obtenu par soustraction du microbe 2 de tous les microbes.
La FIG. 3 illustre un exemple dans lequel l’image de microbes est classée sur la base d’une différence de luminosité de l’image au microscope électronique au moyen d’un logiciel d’analyse d’images, et un masque d’image est généré pour chaque classification. Comme l’illustre le diagramme schématique (101) de la FIG. 1, dans une image au microscope électronique (301) d’un spécimen microbien, le microbe 1 (102) ayant une faible coloration et une faible luminosité d’image et le microbe 2 (103) ayant une forte coloration et une forte luminosité d’image sont mélangés.
Comme l’illustre l’histogramme 2 (202) de la FIG. 2, le masque (302) est une image avec masque générée de telle sorte que la gamme de luminosité de l’équipement est exclue, l’image est binarisée en définissant une valeur seuil à partir de la gamme de luminosité étalon 1 comportant à la fois le pic 1 découlant de l’image du microbe 1 et le pic 2 découlant de l’image du microbe 2, et les particules sensiblement plus petites que les microbes 1 et 2 sont ensuite retirées au moyen d’un algorithme d’analyse de particules. Comme l’illustre l’histogramme 2 (202) de la FIG. 2, le masque (303) est une image avec masque générée de telle sorte que l’image est binarisée en définissant une valeur seuil à partir de la gamme de luminosité étalon 2 comportant le pic 2 sans comporter le pic 1, et les particules sensiblement plus petites que le microbe sont ensuite retirées au moyen d’un algorithme d’analyse de particules. Au moyen du logiciel d’analyse d’images, le microbe individuel classé à l’intérieur du masque 1 et du masque 2 peut être identifié, et le nombre de microbes, une aire d’image de microbes et le nombre de pixels peuvent être obtenus pour calculer une proportion.
Comme décrit ci-dessus, le spécimen microbien est coloré pour générer l’image d’électrons rétrodiffusés, le profil de luminosité relatif à la luminosité d’image du microbe 1 (104) ayant une faible coloration et une faible luminosité d’image et du microbe 2 (105) ayant une forte coloration et une forte luminosité d’image est acquis, et l’image de microbes est classée par la gamme de luminosité d’image, de telle sorte que la proportion du microbe 1 et du microbe 2 dans le spécimen peut être facilement calculée.
Dans le premier mode de réalisation, bien que la différence dans l’intensité de coloration du microbe soit assignée à deux types, et deux types de gamme de luminosité étalon dans le profil de luminosité relatif à la luminosité d’image soient déterminés, les types de gamme de luminosité étalon peuvent s’élever à plus de deux.
[Deuxième mode de réalisation]
<Test de viabilité d’un microbe>
Un deuxième mode de réalisation décrit un exemple dans lequel la proportion d’un microbe obtenue par la méthode de la présente invention est comparée à la viabilité du microbe obtenue par l’unité formant colonie, qui est une méthode de l’état de l’art d’un test de viabilité, et une méthode de cytométrie en flux qui est une méthode sans culture.
Comme exemple, des bactéries (Akkermansia muciniphila) sont cultivées dans des conditions anaérobies sur un milieu gélosé pendant 48 heures et isolées. Ensuite, les bactéries isolées sont mises en suspension à une concentration bactérienne d’environ 1O10 CFU/ml dans un milieu de stockage contenant un antioxydant, et sont congelées et lyophilisées à -80 °C pendant 24 heures.
Après avoir été congelées et lyophilisées, les bactéries sont colorées avec du PTA à 10 % pendant 5 minutes à 37 °C, la suspension bactérienne est étalée sur une lame de verre par centrifugation et séchée à température ambiante, et une observation au MEB est effectuée à une tension d’accélération de 10 kV. Des images de 500 cellules bactériennes sont obtenues, classées en deux types en fonction de l’intensité de coloration, et la proportion est obtenue.
Dans l’unité formant colonie, les bactéries une fois congelées et lyophilisées sont diluées en 10 étapes dans des conditions anaérobies au moyen de PBS anaérobie, ensemencées sur une plaque de gélose au sang Columbia, et cultivées à 37 °C pendant 48 à 72 heures. La viabilité des bactéries est calculée comme le rapport entre le nombre de bactéries colonisées par la culture et le nombre de bactéries au début de la culture.
La FIG. 4 illustre un résultat obtenu en mesurant la viabilité des bactéries après congélation et lyophilisation avec la méthode de la présente invention (microscopie électronique à balayage), la méthode de cytométrie en flux, ou l’unité formant colonie. Comme résultat de la comparaison, il n’existe pas de différence statistiquement significative dans la viabilité obtenue par les trois types de méthode, que ce soit après congélation ou après lyophilisation.
Comme autre exemple, des bactéries (Akkermansia muciniphila) sont mises en suspension dans un milieu de Mueller Hinton (MHB) ou un milieu contenant un antioxydant, et ensuite laissées à température ambiante pendant une heure dans des conditions anaérobies ou aérobies.
La FIG. 5 illustre des résultats d’une proportion de bactéries obtenue par la méthode de la présente invention et d’une viabilité obtenue par l’unité formant colonie, de la même manière que celle de l’exemple décrit ci-dessus. Comme résultat de la comparaison, il n’existe pas de différence statistiquement significative dans la viabilité obtenue par les deux méthodes dans l’une ou l’autre condition.
Comme l’illustrent ces exemples, une corrélation est observée entre la viabilité obtenue par la méthode de test de viabilité de l’état de l’art pour le microbe et la proportion du microbe obtenue par la méthode de la présente invention. Dans la méthode de la présente invention, en observant la morphologie du microbe individuel avec la résolution du microscope électronique, il est également possible d’analyser la présence ou l’absence de l’antioxydant dans le milieu et la morphologie anormale provoquée par exposition à l’oxygène. Autrement dit, on peut voir que, selon le mode de réalisation, le type et la caractéristique morphologique du microbe peuvent être observés au microscope électronique et la viabilité peut être évaluée.
[Troisième mode de réalisation]
Un troisième mode de réalisation décrit un exemple de quantification de l’effet de la réalisation d’un traitement ayant une action bactéricide sur un microbe par analyse d’une image au microscope électronique du microbe coloré avec du PTA.
Comme exemple, sur la FIG. 6, une souche de Pseudomonas aeruginosa est utilisée comme matériau, des bactéries dans un groupe de contrôle non traité avec l’agent antibactérien et des bactéries dans un groupe de test traité avec l’agent antibactérien colistine sont cultivées à 37 °C pendant 30 minutes, les bactéries sont collectées sur une membrane à pistes gravées et fixées avec du glutaraldéhyde à 2,5 %, un spécimen est préparé en réalisant une coloration électronique pendant 2 minutes au moyen d’une solution aqueuse de PTA ayant une concentration pondérale de 10 % comme colorant et une solution aqueuse de bleu de platine pour comparaison, et une image d’électrons rétrodiffusés est obtenue par observation au MEB à une tension d’accélération de 5kV.
Dans le spécimen coloré avec la solution aqueuse de PTA, une image de bactéries ayant une faible luminosité d’image est observée dans le groupe de contrôle, et une image de bactéries ayant une forte luminosité d’image est observée dans le groupe de test. Par ailleurs, dans le spécimen coloré avec la solution aqueuse de bleu de platine, la luminosité d’image des bactéries à la fois dans le groupe de contrôle et le groupe de test est forte, et aucune différence significative n’est observée entre le groupe de contrôle et le groupe de test.
Comme autre colorant non présenté sur la figure, dans un spécimen coloré avec une solution aqueuse de PTA dont le pH est ajusté à une valeur neutre, la luminosité de l’image de bactéries dans le groupe de test est aussi faible que dans le groupe de contrôle. Par ailleurs, dans une solution aqueuse de tungstate de sodium ou une solution aqueuse de molybdate d’ammonium, aucune image en coloration positive n’est observée à la fois dans le groupe de contrôle et le groupe de test. Par conséquent, on peut voir qu’aucune différence significative n’est observée entre le groupe de contrôle et le groupe de test dans ces trois types de coloration.
Comme décrit ci-dessus, en sélectionnant la solution aqueuse de PTA ayant une concentration pondérale de 10 % comme colorant, les bactéries dans le groupe de contrôle non traité avec l’agent antibactérien et les bactéries dans le groupe de test traité avec l’agent antibactérien et donc affecté peuvent être colorées sur la base de la différence de luminosité d’image.
Sur la FIG. 6, l’influence de la colistine sur Pseudomonas aeruginosa est détectée par la coloration au PTA, mais le but du mode de réalisation n’est pas limité à cette combinaison. Comme autre exemple, quand Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa est traité avec l’antibiotique à base de P-lactame imipénem ayant une action bactéricide, les bactéries ayant une forte luminosité d’image sont rehaussées par la coloration au PTA.
Comme décrit ci-dessus, quand une coloration électronique qui augmente l’intensité de coloration d’un microbe sensible à une action bactéricide est sélectionnée, il est possible de classer des images de bactéries subissant un endommagement par l’action bactéricide et de bactéries ne subissant pas l’endommagement sur la base d’une différence de luminosité d’image au microscope électronique. En particulier, une forte coloration au PTA pour des bactéries traitées à la colistine est considérée comme étant associée à la vie et la mort provoquée par l’endommagement de la membrane et de la paroi cellulaire. Autrement dit, en classant et en quantifiant les bactéries colorées avec le PTA, l’effet bactéricide de l’agent antibactérien colistine peut être analysé et évalué.
Le mode de réalisation n’est pas limité à cet exemple, et quand un utilisateur tire avantage du fait que l’intensité de la coloration électronique varie en fonction de l’état du microbe au moment d’effectuer le traitement qui affecte le microbe, une image du groupe de contrôle et une image du groupe de test sont obtenues, une gamme de luminosité d’image de microbes qui caractérise une image de microbes du groupe de contrôle et une gamme de luminosité d’image de microbes qui caractérise une image de microbes du groupe de test ayant une luminosité différente de celle du spécimen de contrôle sont déterminées, et les images de microbes du groupe de contrôle et du groupe de test sont classées et la proportion est obtenue, de telle sorte que l’effet du traitement affectant le microbe peut être analysé et évalué.
Par exemple, comme action de l’agent antibactérien, de nombreux agents antibactériens qui affectent la paroi cellulaire de bactéries, empêchent la croissance de bactéries ou présentent une action bactéricide sont mis au point. Comme une cellule humaine ne possède pas de paroi cellulaire, un composé qui agit sélectivement sur la paroi cellulaire de bactéries devrait avoir de faibles effets secondaires sur les humains. La méthode de ce mode de réalisation peut être utilisée pour évaluer l’effet de tels composés, ou pour cribler un nouveau composé sur la base d’un mécanisme d’action.
Afin de traiter une maladie infectieuse et contrôler une infection à l’hôpital, il est important de déterminer rapidement si les bactéries pathogènes sont résistantes ou non, et un test de sensibilité aux médicaments est effectué pour chaque bactérie isolée à partir d’un patient. Dans une méthode de l’état de l’art, la résistance est déterminée à partir d’une valeur de concentration inhibitrice minimale (MIC) qui inhibe la croissance de bactéries, et il faut environ une journée de culture pour obtenir la MIC. En revanche, dans ce mode de réalisation, il est possible d’analyser la présence ou l’absence d’endommagement provoqué par l’influence de l’agent antibactérien, et de déterminer rapidement la sensibilité des bactéries pathogènes.
Comme autre exemple, ce mode de réalisation peut aussi être utilisé pour évaluer un bactériophage qui infecte des bactéries et provoque une action bactériolytique. Un phage détruit la membrane et le peptidoglycane pour tuer les bactéries. La thérapie phagique est en train d’être étudiée comme l’un des traitements pour les bactéries multirésistantes, et nécessite une méthode permettant de sélectionner rapidement une combinaison de phages spécifiques des bactéries pathogènes à partir d’une banque de phages dans l’environnement de phages modifiés artificiellement. Dans ce mode de réalisation, la propriété bactériolytique du phage est évaluée, ce qui permet ainsi de l’utiliser pour le criblage de phages.
Comme autre exemple, quand le microbe est exposé à de la chaleur ou de l’oxygène, en incluant non seulement les bactéries, mais aussi les champignons et les archéobactéries, et la détérioration de la viabilité provoquée par l’endommagement du microbe est évaluée, l’évaluation peut être utilisée pour sélectionner des conditions de stockage du microbe ou une méthode de stérilisation.
Comme exemple spécifique d’analyse du traitement qui affecte le microbe, la FIG. 7 montre le résultat du traitement de Pseudomonas aeruginosa avec l’agent antibactérien colistine et l’analyse de la variation dans le temps de l’influence de la colistine par la luminosité d’image de bactéries.
Une souche de Pseudomonas aeruginosa dont la sensibilité à la colistine est connue à partir de la valeur de MIC mesurée par une méthode de l’état de l’art et une souche de Pseudomonas aeruginosa dont la sensibilité à la colistine est connue sont utilisées. Une solution bactérienne en suspension dans un milieu à une concentration initiale de 106/ml est traitée avec de la colistine à 2 mg/1, qui est la concentration qui établit une distinction entre bactéries sensibles et bactéries résistantes par la méthode de l’état de l’art, est traitée et cultivée à 37 °C, et une certaine quantité de la solution bactérienne est échantillonnée dans le temps.
Une membrane de polycarbonate à pistes gravées ayant un diamètre de trou de 0,2 pm est utilisée comme équipement pour le spécimen pour l’observation au MEB des bactéries, et les bactéries sont collectées uniformément dans une certaine zone sur la membrane. Une conductivité est conférée au spécimen par vaporisation préalable de platine -palladium sur la surface de la membrane.
Après lavage d’un composant du milieu sur la surface de collecte de bactéries avec une solution saline physiologique, les bactéries sont traitées et fixées pendant 5 minutes avec une solution de fixation au glutaraldéhyde à 2,5 % ayant un effet de réticulation des protéines afin d’empêcher la modification morphologique des bactéries. Après lavage de l’excès de solution de fixation à l’eau, les bactéries sont traitées avec une solution aqueuse de PTA ayant une concentration pondérale de 10 % pendant 2 minutes et colorées. Après lavage de l’excès de colorant à l’eau, les bactéries sont séchées sur la membrane à pistes gravées pour former un spécimen pour l’observation au MEB.
Les conditions d’observation au MEB sont établies à une tension d’accélération de 5 kV, la détection des électrons rétrodiffusés, et un grossissement de 7000 fois. La raison pour laquelle la tension d’accélération est réglée à 5 kV est qu’une image de trou de la membrane à pistes gravées par un faisceau d’électrons transmis à travers une cellule bactérienne ne se superpose pas à une image de Pseudomonas aeruginosa. La raison du réglage du grossissement à 7000 fois est d’observer la morphologie de Pseudomonas aeruginosa, et le mode de réalisation n’y est pas limité.
Comme étape d’observation, avant d’observer le spécimen bactérien, un échantillon étalon de luminosité est utilisé et le contraste de luminosité du MEB est réglé pour être constant de telle sorte que le contraste de luminosité du MEB est rendu constant dans l’acquisition des images de tous les spécimens. Par conséquent, l’analyse d’images devant être effectuée ultérieurement devient plus facile.
La série d’images d’électrons rétrodiffusés (701) sur la FIG. 7 est un exemple d’une image acquise par observation au MEB en utilisant une souche de Pseudomonas aeruginosa sensible à la colistine. L’image d’électrons rétrodiffusés (702) est un exemple d’une image obtenue par observation au MEB du microbe 1 observé dans un spécimen à 0 minute de culture. L’image d’électrons rétrodiffusés (702) montre Pseudomonas aeruginosa non affecté par la colistine, et est la même que celle d’un spécimen de contrôle non traité. L’image d’électrons rétrodiffusés (703) est un exemple d’une image obtenue par observation au MEB du microbe 2 observé après 8 minutes de culture, et montre Pseudomonas aeruginosa dont la membrane et la paroi cellulaire sont endommagées par l’influence de la colistine et colorées avec le PTA.
Le profil de luminosité relatif à la luminosité de l’image (702) du microbe 1 est acquis pour déterminer la gamme de luminosité d’image 1 (108) illustrée sur la FIG. 1. Le profil de luminosité relatif à la luminosité de l’image (703) du microbe 2 est acquis pour déterminer la gamme de luminosité d’image 2 (107) illustrée sur la FIG. 1.
Ensuite, une observation au MEB est effectuée sur chaque spécimen à partir duquel la série d’images d’électrons rétrodiffusés (701) a été obtenue et un spécimen dans le groupe de contrôle préparé au même moment, et vingt-cinq images par spécimen et des images de 300 à 500 cellules bactériennes sont acquises. Le nombre d’images prises et le nombre de cellules bactériennes à imager ne sont pas limités aux nombres indiqués ci-dessus tant que la reproductibilité de l’analyse quantitative peut être assurée.
Une région d’image de microbes est extraite de toutes les images prises pour chaque spécimen, et est classée en microbe 1 caractérisé par la gamme de luminosité d’image 1 (108) et en microbe 2 caractérisé par la gamme de luminosité d’image 2 (107), ce qui permet de déterminer ainsi si un microbe individuel est un individu non affecté par la colistine ou un individu dont la membrane et la paroi cellulaire sont endommagées par l’influence de la colistine. Les individus classés sont dénombrés, et une proportion du microbe 1 est calculée en comptant le nombre total de microbes 1 et 2 comme le nombre total de microbes. Comme le microbe 1 n’est pas affecté par l’influence de la colistine et est considéré comme étant vivant, une variation de la proportion du microbe 1 correspond à un changement de viabilité.
Le graphe (704) montre la variation dans le temps de la proportion du microbe 1 contenu dans les bactéries échantillonnées à partir du groupe de contrôle, et le graphe (705) montre la variation dans le temps de la proportion du microbe 1 contenu dans les bactéries échantillonnées à partir du groupe de test traité à la colistine. Dans le groupe de contrôle, la proportion du microbe 1 change à peine, mais dans le groupe de test, la proportion du microbe 1 est réduite à 80 % après 8 minutes, 60 % après 30 minutes, et 0 % après 60 minutes. Ce résultat indique que la souche de Pseudomonas aeruginosa à analyser est sensible à la colistine.
Par ailleurs, quand la souche de Pseudomonas aeruginosa résistante à la colistine est traitée avec de la colistine de la même manière que les bactéries sensibles, la proportion du microbe 1 dans le groupe de contrôle correspondant au graphe (704) et la proportion du microbe 1 dans le groupe de test correspondant au graphe (705) sont à peine réduites, et sont d’environ 95 %, même après 60 minutes. Ce résultat indique que la colistine n’a aucune influence sur la souche de Pseudomonas aeruginosa à analyser.
Comme décrit ci-dessus, il est possible de montrer une différence entre les bactéries sensibles et les bactéries résistantes en analysant quantitativement et en comparant l’influence d’un traitement à la colistine sur Pseudomonas aeruginosa, et le résultat de la détermination de la sensibilité et de la résistance est cohérent avec la détermination basée sur la valeur de MIC qui est la méthode de l’état de l’art.
Alors qu’il faut environ une journée de culture pour obtenir la MIC avec la méthode de l’état de l’art, selon le mode de réalisation, il est possible de déterminer rapidement la sensibilité et la résistance des bactéries pathogènes en analysant la présence ou l’absence de l’endommagement morphologique provoqué par l’influence de l’agent antibactérien.
Ici, des caractéristiques du spécimen dans le mode de réalisation vont être décrites. D’autres tests de viabilité utilisant une technique d’observation microscopique sont décrits, et un réactif permettant de déterminer la vie et la mort dédié au microscope optique est basé sur l’activité enzymatique de la cellule vivante et la perméabilité sélective de la membrane cellulaire, et le caractère vivant au moment de l’observation constitue un prérequis pour la coloration. Par ailleurs, comme une cible devant être colorée avec du PTA est endommagée morphologiquement dans le procédé conduisant à tuer les bactéries, la cible peut être colorée et observée même après avoir été fixée avec du glutaraldéhyde et ses équivalents et stockée, ce qui améliore ainsi le caractère pratique du test de viabilité. Puisqu’un MEB de bureau peut être utilisé depuis ces dernières années, le MEB de bureau peut être appliqué à des tests microbiens quotidiens tels qu’un test de maladie infectieuse pour un microbe, une surveillance environnementale, et un test de sécurité alimentaire.

Claims

23 Revendications
1. Méthode d’analyse d’images de microbes, comprenant : une première étape servant à obtenir une image d’un spécimen dans laquelle un échantillon comportant des microbes est coloré, au moyen d’un microscope électronique ; une deuxième étape servant à obtenir un profil de luminosité relatif à une gamme de distribution de luminosité de l’image ; une troisième étape servant à définir une première gamme de luminosité étalon qui respecte une première condition relative à la luminosité du profil comme une région où un premier groupe de microbes existe, et définir une deuxième gamme de luminosité étalon qui respecte une deuxième condition relative à la luminosité du profil comme une région où un deuxième groupe de microbes existe ; et une quatrième étape servant à identifier des microbes individuels qui existent dans chacune des première et deuxième gammes de luminosité étalons et/ou à calculer une proportion du microbe qui existe dans chacune des première et deuxième gammes de luminosité étalons.
2. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 1, dans laquelle la première condition comporte un premier pic du profil de luminosité et ne comporte pas un deuxième pic qui est différent du premier pic, la deuxième condition ne comporte pas le premier pic et comporte le deuxième pic, et la quatrième étape sert à identifier la vie ou la mort d’un microbe individuel et/ou de microbes individuels qui sont endommagés morphologiquement dans chacune des première et deuxième gammes de luminosité étalons et/ou à calculer la viabilité de microbes et/ou une proportion d’un microbe qui est endommagé morphologiquement sur la base du nombre de microbes et/ou d’une aire d’image de microbes, et du nombre de pixels d’image dans chacune des première et deuxième gammes de luminosité étalons.
3. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 1, dans laquelle le spécimen est un spécimen étalé qui est préparé à partir d’une suspension microbienne afin d’empêcher les microbes et les matières solides de se chevaucher.
4. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 1, dans laquelle la première étape sert à effectuer une opération de fixation chimique sur des microbes en utilisant au moins un composé parmi le glutaraldéhyde, la formaline et un alcool afin d’arrêter la modification morphologique et de préserver la forme des microbes.
5. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 1, dans laquelle la première étape sert à colorer l’échantillon au moyen d’une solution d’acide pho sphotung stique .
6. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 5, dans laquelle la solution d’acide phosphotungstique est une solution acide qui est ajustée de pH 0,0 à pH 7,0.
7. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 5, dans laquelle la solution d’acide phosphotungstique est une solution acide qui est ajustée de pH 0,0 à pH 3,0.
8. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 5, dans laquelle la concentration de la solution d’acide phosphotungstique est de 0,1 % à 20 %.
9. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 5, dans laquelle la concentration de la solution d’acide phosphotungstique est de 2 % à 10 %.
10. Kit destiné à mettre en œuvre la méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 5, comprenant : une solution contenant des fixateurs chimiques qui contient au moins un composé parmi le glutaraldéhyde, la formaline, et un alcool ; un colorant qui contient au moins de l’acide phosphotungstique ; et un solvant de lavage qui contient au moins un élément parmi une solution saline physiologique, de l’eau, et une solution tampon.
11. Méthode d’analyse d’images de microbes, comprenant : une première étape servant à obtenir une première image d’un spécimen de contrôle dans laquelle un échantillon comportant des microbes est coloré sans exécuter de traitement qui affecte les microbes, au moyen d’un microscope électronique ; une deuxième étape servant à obtenir une deuxième image d’un spécimen de test dans laquelle un échantillon comportant des microbes est coloré sans exécuter de traitement qui affecte les microbes, au moyen du microscope électronique ; une troisième étape servant à obtenir un profil de luminosité relatif à la luminosité de la première image, et un premier pic de la luminosité du profil ; et une quatrième étape servant à obtenir un profil de luminosité relatif à la luminosité de la deuxième image, et un deuxième pic de la luminosité du profil.
12. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 11, dans 26 laquelle la troisième étape sert à obtenir une première gamme de luminosité étalon comportant le premier pic sur la base d’une espèce microbienne, d’un type de traitement qui affecte les microbes et d’un type de colorant, et la quatrième étape sert à obtenir une deuxième gamme de luminosité étalon comportant le deuxième pic sur la base d’une espèce microbienne, d’un type de traitement qui affecte les microbes et d’un type de colorant.
13. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 12, comprenant en outre : une cinquième étape servant à obtenir le nombre de microbes, une aire d’image de microbes et/ou le nombre de pixels et calculer une proportion du microbe qui existe dans chacune des première et deuxième gammes de luminosité étalons, et quantifier un effet de traitements qui affectent des microbes en comparant le spécimen de contrôle et le spécimen de test.
14. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 11, dans laquelle le traitement qui affecte les microbes consiste à donner aux microbes au moins un traitement parmi un antimicrobien, de la chaleur, de l’oxygène, un détergent, et un bactériophage.
15. Méthode d’analyse d’images de microbes selon la revendication 12, dans laquelle le colorant est l’acide phosphotungstique.
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