CN115461466A

CN115461466A - 自动分析装置、自动分析方法

Info

Publication number: CN115461466A
Application number: CN202080100175.3A
Authority: CN
Inventors: 杉山清隆; 藤田浩子
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2022-12-09
Also published as: KR20220158051A; US20230167480A1; WO2021229667A1; JP7371245B2; EP4151744A1; EP4151744A4; JPWO2021229667A1

Abstract

本发明提供一种从混存有细菌和杂质的试样推断细菌浓度并将试样中的细菌浓度调整为期望的值的技术。本发明的自动分析装置对混存有细菌和杂质的试样导入破坏所述杂质的物质，并将被破坏后的所述杂质与所述细菌分离，之后利用滤件取出所述细菌，按照留在所述滤件上的所述杂质的量与所述试样内的所述细菌的浓度之间的对应关系数据来推断所述试样内的所述细菌的浓度(参考图5)。

Description

自动分析装置、自动分析方法

技术领域

本发明涉及对包含细菌和杂质的试样进行分析的自动分析装置。

背景技术

败血症是一种高致死率的感染症，迅速实施诊断以及基于诊断的恰当治疗就比较重要。在判定败血症时，通常会实施血液培养检查。这是判定作为无菌试样的血液中是否存在细菌。通常在血液培养检查后实施涂片检查，接着实施鉴别检查和敏感性检查。鉴别检查是对血液培养阳性的试样进行分离培养，针对得到的菌落确定细菌的种类。敏感性检查是测定该细菌对抗菌药的敏感性。以上的一系列检查中，血液培养试验需要1天，分离培养需要1天，并且敏感性检查需要1天，所以整体上需要2～3天的检查时间。即，到判明正在实施的治疗中投放的抗菌药是否恰当为止目前需要2～3天。因而，在投放的是无效果的抗菌药的情况下，败血症的致死率将变得极高。

在血液培养试验中，使败血症的情况下包含的10CFU/mL(CFU：菌落形成单位)左右的极少的细菌在培养瓶中增殖。通常实施8小时～1夜左右的培养，使细菌增殖到能检测到因细菌的呼吸或发酵等而生成的气体成分等的水平。已知血液培养呈阳性的培养瓶中包含10⁶～10¹⁰CFU/mL的细菌。血液培养阳性时的细菌的浓度还根据患者血液的状态和菌种、血液培养试验装置等而不同，所以取这样的大范围。血液培养瓶中的细菌以外的主要成分除了血球成分和培养基以外，还包括吸附抗生素的树脂、珠粒、活性碳等。这些成分中，存在于血液中的红血球和白血球的浓度高，分别为10⁹个/mL、10⁷个/mL左右，与细菌的浓度相同或在其之上。

在分离培养中，将血液培养阳性的试样涂在琼脂培养基上而使菌落发育。通过根据菌落的性状等来预测细菌的种类而更可靠地鉴别细菌种类并利用菌落来制备菌液，能够获得没有细菌以外的杂质、具有敏感性检查所需的细菌浓度(通常为10⁵～10⁶CFU/mL)的试样。

在敏感性检查中，通常是向包含细菌的菌液中导入一定浓度的抗菌药并判定与抗菌药的浓度相应的细菌的增殖程度。敏感性检查的结果会发生变动，因此以菌液中的细菌浓度达到一定值的方式事先调整好就比较重要。关于敏感性检查，目前在进行加快到检查结束为止的时间的研究。目前的黄金准则方式是根据浊度的变化来测定细菌的增殖程度，检查需要1昼夜。目前，使用激光来更迅速地判定浊度变化的方法、利用显微镜来迅速地判定各细菌的增殖程度的方法、借助ATP(Adenosine triphosphate)发光来迅速地对细菌的增殖程度进行定量的方法等不断被开发出来，敏感性检查所需的时间有可能被缩短到几小时左右。另一方面，用于制备菌液的预处理工序依然在使用实施1天分离培养而将菌落稀释到液体中的方法。

对此，若能在短时间内完成以下操作，则敏感性检查所需的时间将再缩短1天：不实施分离培养，从血液培养阳性试样中去除细菌以外的成分(例如血球成分、培养基中包含的杂质等)，制作出有10⁵～10⁶CFU/mL的一定浓度的菌液。

针对这样的课题，专利文献1揭示了一种方法，即，通过使用两种不同界面活性剂而在不影响细菌的生长的情况下仅选择性地破坏血球成分。专利文献2揭示了一种方法，即，对血球细胞进行基于蛋白酶的分解、基于低渗溶液的膨胀处理，以及使用界面活性剂而仅选择性地破坏血球成分。

专利文献3揭示了一种方法，即，对膜滤件上捕捉的细菌作荧光标记来检测细菌的个数和浓度。根据该方法，即便在包含细菌以外的夹杂物的情况下也能测量细菌的浓度。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2014-235076号公报

专利文献2：WO2019/097752

专利文献3：日本专利特开2007-006709号公报

发明内容

发明要解决的问题

然而，专利文献1～2没有揭示将细菌的浓度调整为一定值的方法。例如，通常在利用菌落来制作菌液时，可以根据浊度的值来调整菌液的浓度。但红血球、白血球、血小板等血球成分或者大量包含于血球中的血红蛋白等的吸收波长与细菌的散射光测量中使用的波段相同，所以基于浊度的调整比较困难。

在专利文献3中，须利用荧光标记用的染色试剂对细菌进行处理，在处理时暴露在试剂中会导致细菌的性状发生变化，有可能影响到敏感性检查的结果。因而，这样的需要染色工序的方法难以运用于敏感性检查。此外，还存在试剂成本高、需要使用荧光激发的专用的昂贵的光学系统等问题。

本发明是鉴于这样的状况而成，提供一种从混存有细菌和血球之类的杂质的试样推断试样中的细菌浓度并将试样调整为期望的细菌浓度的技术。

解决问题的技术手段

本发明的自动分析装置对混存有细菌和杂质的试样导入破坏所述杂质的物质，并将被破坏后的所述杂质与所述细菌分离，之后利用滤件取出所述细菌，按照留在所述滤件上的所述杂质的量与所述试样内的所述细菌的浓度之间的对应关系数据来推断所述试样内的所述细菌的浓度。

发明的效果

根据本发明的自动分析装置，可以从混存有细菌和杂质的试样推断试样中的细菌浓度并将试样调整为期望的细菌浓度。结果，能够准确地实施敏感性检查。上述以外的课题、构成以及效果将通过以下实施方式的说明来加以明确。

附图说明

图1为表示从包含细菌的血液试样中破坏血球而去除杂质的一般次序的流程图。

图2为在不染色的情况下拍摄过滤滤件得到的图像的例子。

图3为表示通过对滤件图像进行处理而算出的滤件的颜色信息与通过了滤件的试样中的红血球数之间的关系的图表。

图4为表示通过对滤件图像进行处理而算出的滤件的颜色信息与实际的血中细菌浓度之间的关系的图表。

图5为说明使用根据滤件图像推断出的血中细菌浓度来进行细菌浓度调整的次序的流程图。

图6为实施方式2的自动分析装置100的构成图。

图7表示通过浊度测量从血液培养阳性试样进行调整后的细菌浓度相关的结果。

图8表示使用图5所示的方法从血液培养阳性试样进行调整后的细菌浓度相关的结果。

图9表示血液培养阳性试样以及利用菌落制作的试样的增殖度。

图10表示血液培养阳性试样以及利用菌落制作的试样的增殖度。

图11表示实施药剂敏感性检查的结果。

具体实施方式

图1为表示从包含细菌的血液试样中破坏血球来去除杂质的一般次序的流程图。在本发明的实施方式之前，按照图1对从血球试样中去除杂质的一般次序进行说明。其后，对本发明的实施方式的详情进行说明。

在步骤S10中，向血液试样中加入界面活性剂来破坏血球。处理的血液量越多，最终获得的细菌数也越是增加，所以优选对更多的试样进行预处理，但废液也会增加，因此优选每1样本作几mL～10mL左右的预处理。界面活性剂优选(a)具有亲水性及疏水性部分且疏水性部分为链状烃的阴离子性界面活性剂、或者(b)具有亲水性及疏水性部分且疏水性部分具有环状烃的界面活性剂、或者(a)(b)的组合。具体而言，前者可列举十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂以及N-月桂酰肌氨酸钠，后者可列举皂苷、胆酸钠、脱氧胆酸钠、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-1丙磺酸盐、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-2羟基-1丙磺酸盐。加入界面活性剂后，可立即实施下一步骤S11，但也可静置5～15分钟左右而等待反应完成。

在步骤S11中，实施离心分离，以去除被界面活性剂破坏而流出的血球内的成分，例如血红蛋白等，其后，实施上清液的去除和洗净。在本步骤中，例如优选在2000G下实施5～10分钟左右的离心分离，但离心速度、离心时间并不限于此，只要能将未被界面活性剂破坏的细菌和血球成分与流出的血红蛋白等加以分离即可。洗净是使用纯水、生理盐水等来实施，可仅为1次洗净，也可为多次洗净。

在步骤S12中，利用滤件来过滤试样，以进一步去除未能被界面活性剂破坏的血球成分和培养基中的杂质。通过使用比细菌大的孔径作为滤件的过滤孔径(网眼间隔)，使得细菌通过并利用滤件来捕捉细菌以外的杂质。例如，优选使用孔径1～40μm的滤件。在杂质的量多的情况下，也可进行在利用过滤孔径大的滤件进行过滤后利用过滤孔径小的滤件进行过滤等多次过滤。为了抑制细菌被滤件捕捉，优选使用以疏水性材料制成的滤件。通过以上步骤S10～S12，可以从血液试样中去除细菌以外的杂质而提取出细菌。

〈实施方式1〉

在本发明的实施方式1中，展示从含有细菌的血液试样获得具有被调整为期望的值的细菌浓度的试样的方法。再者，本实施方式只是一例，并不限定于该构成。使用包含大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的血液试样来实施S10～S12的预处理。血液试样是按照以下次序来制作。向装有药剂吸附珠粒的血液培养瓶导入来源于健康志愿者的血液10mL以及事先利用菌落制作的已将浓度调整为约150CFU/mL的菌液0.1mL，制作出与实际的败血症患者同等的血液。其后，将试样导入血液培养装置进行培养，在血液培养呈阳性后取出，用于实验。此外，还制作在不导入菌液的情况下培养出的血中细菌浓度为0CFU/mL的相当于阴性对照的试样，并通过适当加以稀释来改变细菌浓度。

图2为在不染色的情况下拍摄过滤滤件得到的图像的例子。此处展示对以血液试样中的大肠杆菌的浓度变为10⁶～10⁹CFU/mL的方式预先制作的血液试样进行处理的结果。被虚线围住的过滤区域20是应关注的区域。在实际的血中细菌浓度为3.9×10⁶CFU/mL的情况下，表现出与过滤外区域21相同色感的不存在杂质的区域22占大部分。在实际的血中细菌浓度为1×10⁹CFU/mL的情况下，红度强的存在杂质的区域23占大部分，随着实际的血中细菌浓度上升，红度进一步增强。

图3是使用血中细菌浓度为0CFU/mL的阴性对照的血液试样与界面活性剂的混合溶液进行过滤的结果，对用于过滤的试样中的红血球量与滤件图像的红度进行了比较。再者，红血球量是利用血球计数器来算出。为了对红度进行定量评价，使用通过以下处理算出的彩度值。滤件图像为彩色图像，通常以RGB颜色空间来表现。为了降低拍摄时的周围亮度等的影响，从RGB转换成HSV(色调、彩度、明度)。并且更具体而言，算出过滤区域20内部的各像素的彩度值的平均值，作为滤件图像的红度。根据图3的结果得知，通过了滤件的试样中的红血球量与滤件图像的彩度值存在正相关关系。阴性对照的血液试样中除了红血球以外还包含附着有血红蛋白的血小板、血纤蛋白、培养基中的杂质，所以认为这样的杂质增强了滤件的红度。即，可以利用滤件图像的彩度值来检测红血球和其他杂质量。

由于滤件的红度根据试样中包含的红血球等的杂质量而变强，因此，对于得到图2的结果的原因作以下推断。不论实际的血中细菌浓度如何都是以某一固定浓度来加入界面活性剂，在实际的血中细菌浓度低的情况下，试样中的大部分血球都被界面活性剂破坏，所以在步骤S11中大部分血球被去除，杂质不留在滤件上。另一方面，当实际的血中细菌浓度升高时，细菌与红血球的浓度变为相同程度，界面活性剂对血球的破坏作用被细菌自身所阻碍。由此，步骤S11中未被完全破坏的红血球量增加，在步骤S12的过滤工序中被捕捉到。此外，还考虑细菌与血红蛋白、血纤蛋白、血小板凝集而使得表示红度的杂质在步骤S12的过滤工序中被捕捉这一情况。随着实际的血中细菌浓度上升，过滤后的过滤区域20的红度进一步增强。因而，例如可以通过利用滤件的图像来算出过滤后留在滤件上的杂质例如红血球的量而知晓通过了滤件的细菌的浓度。

图4为表示通过对滤件图像进行处理而算出的滤件的颜色信息与实际的血中细菌浓度之间的关系的图表。为了将滤件的颜色信息定量化，将以RGB颜色空间表示的滤件图像转换为HSV(色调、彩度、明度)而使用彩度的值。具体而言，使用过滤区域20内部的各像素的彩度值的平均值。图3一并展示利用大肠杆菌反复进行实验得到的结果以及金黄色葡萄球菌的结果。在实际的血中细菌浓度10⁶～10⁹CFU/mL的范围内，血中细菌浓度与滤件图像的彩度值之间可见正相关关系。只要利用该血中细菌浓度和滤件图像的彩度值来获取校准曲线，便能根据过滤后的滤件图像的彩度值的信息来推断菌数。该血中细菌浓度的范围与平常血液培养中呈阳性的试样中的细菌浓度大致相同，所以能运用于各种菌种及菌株。

关于处理中使用的界面活性剂的具体浓度，能以如下范围加以规定。通常，血液中的红血球的浓度为10⁹个/mL的数量级，如果是对1mL的试样进行预处理的情况下，试样中的红血球数为10⁹个。此处，图3所示的可以根据滤件的色感来推断的杂质例如红血球量的范围为10⁶～10⁸个。即，要做到可以根据滤件的色感来推断实际的细菌浓度，只要将红血球破坏到变为1/1000～1/10为止即可。即，需要能够破坏包含细菌的血液中的90～99.9％的红血球的浓度的界面活性剂。

再者，作为一例，此处展示的界面活性剂浓度的范围是对1mL的试样进行预处理的情况，在处理的容量增加的情况下，优选以红血球的破坏率相应地升高的方式增加界面活性剂的浓度。例如，在对10mL的试样进行预处理的情况下，需要能破坏99～99.99％的红血球的浓度的界面活性剂，可根据试样的处理量进行变化。

具体而言，关于能破坏包含细菌的血液中的99～99.99％的红血球的界面活性剂的浓度，若列举作为具有亲水性及疏水性部分且疏水性部分为链状烃的阴离子性界面活性剂的十二烷基硫酸钠为例，则浓度为0.05重量％至0.5重量％的范围。就其他界面活性剂例如十二烷基硫酸锂、N-月桂酰肌氨酸钠而言，也优选为能破坏期望的红血球的界面活性剂的浓度。

此外，作为其他界面活性剂，就作为具有亲水性及疏水性部分且疏水性部分具有环状烃的界面活性剂的例如皂苷、胆酸钠、脱氧胆酸钠、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-1丙磺酸盐、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-2羟基-1丙磺酸盐而言，也可混合界面活性剂的种类。

在实施方式1中，使用能破坏包含细菌的血液中的99～99.99％的红血球的终浓度为0.05重量％至0.5重量％的范围的十二烷基硫酸钠等界面活性剂，对2.7mL的血液试样进行处理。

图5为说明使用根据滤件图像推断出的血中细菌浓度来进行细菌浓度调整的次序的流程图。步骤S10～S12与图1所示的工序相同。

在步骤S50中，拍摄滤件，获取留在滤件上的杂质的颜色。在本流程图中，由于根据留在滤件上的红血球的颜色来推断杂质量，所以无须对试样和杂质进行染色。

在步骤S51中，读出记述有留在滤件上的杂质的颜色与实际的血中细菌浓度之间的对应关系的对应关系数据，使用从滤件图像获取到的颜色来参考该对应关系数据，由此算出所推断的血中细菌浓度。具体而言，针对留在滤件上的杂质的颜色和实际的血中细菌浓度而获取例如以单对数表示的校准曲线，根据校准曲线的数据来算出所推断的血中细菌浓度。对应关系数据为图4中例示的数据，预先制作并存放在存储装置中。再者，不论菌种和界面活性剂的种类如何，只要有至少1个对应关系数据，便能运用本发明的方法。在更准确地求所推断的血中细菌浓度的情况下，也可根据每一菌种或耐药株例如甲氧西林耐药葡萄球菌等的信息和界面活性剂的种类来保有对应关系数据。

在步骤S52中，以S51中推断出的血中细菌浓度为基准来稀释试样，以获得期望的细菌浓度。例如，在S51中推断出的血中细菌浓度为5×10⁸CFU/mL时，若期望的细菌浓度为5×10⁵CFU/mL，则稀释1000倍。在S51中推断出的血中细菌浓度未达到期望的细菌浓度的情况下，优选前进至步骤S53而判定为不良标本。在判定为不良标本的情况下，难以制作出适于敏感性检查的标本，所以在血液培养瓶中进一步进行培养而使得细菌增殖之后返回至步骤S10。或者，也可使用通过实施分离培养得到的菌落来实施鉴别检查和敏感性检查。

在步骤S54中，使用制作出的菌液来实施鉴别检查和敏感性检查。作为检查方法，可使用任何方法。例如可列举使用自动装置的鉴别检查、基因检查、微量液体稀释法下的敏感性检查、纸片法下的敏感性检查、基于显微镜图像或激光散射光测量等的迅速敏感性检查等。

〈实施方式1：总结〉

在本实施方式1中，利用过滤滤件对血球被破坏后的试样进行过滤，通过参考留在滤件上的杂质的图像的颜色分量与实际的血中细菌浓度之间的对应关系数据，来算出所推断的血中细菌浓度。由此，无须实施分离培养即可制作具有期望的细菌浓度的试样。因而，可以将通常需要1昼夜左右的分离培养工序缩短至例如30分钟左右。

〈实施方式2〉

在实施方式2中，展示用于从含有细菌的血液试样获得具有被调整为期望的值的细菌浓度的试样的自动分析装置。再者，本实施方式只是一例，并不限定于该构成。

图6为本发明的实施方式2的自动分析装置100的构成图。自动分析装置100是自动实施图5中说明过的预处理次序的装置。通常，血液培养瓶为防止污染等而使用有橡胶塞，瓶内部为真空。作业人员使用注射针从血液培养瓶中取出血液试样，将该血液试样分注到装有界面活性剂的容器中。由此来实施S10。也能以自动分析装置100的一部分的形式配备对试样自动导入界面活性剂的导入装置101来代替由作业人员导入界面活性剂。

已导入有界面活性剂的试样被导入至离心分离器102。试样内的血球因界面活性剂而受到了破坏。离心分离器102将溶出的血红蛋白等与细菌以及未能被破坏的血球等分离。由此来实施S11中的分离工序。

离心分离结束后的试样被导入至洗净部103。洗净部103将试样的上清液去除，并利用例如1mL左右的生理盐水或纯水、培养基等的洗净液来洗净试样。洗净用移液管104抽吸上清液。可将从试样容器的底部起到某一基准的高度为止作为上清液处理。由此来实施S11中的剩余部分。更严格而言，优选设置液位传感器等来检测细菌和血球凝固而变成颗粒状的部分与液体部分之间的界面，将到界面位置附近为止作为上清液处理。

洗净结束后的试样被导入至过滤滤件部105。过滤滤件部105例如由处理用的过滤滤件以及用于将杂质捕捉到滤件上的注射器等构成。由过滤滤件部105实施S12。某些情况下，也可使用离心分离器102来过滤试样。

相机106(相当于检测杂质的量的传感器)对留在过滤滤件部105上的杂质进行拍摄。存储部107存放有图4中说明过的对应关系数据。电脑110(运算部)将相机106所拍摄到的RGB图像转换为HSV颜色空间图像，之后检测杂质区域的颜色分量(例如彩度值)(S50)，使用该颜色来参考对应关系数据，由此算出所推断的血中细菌浓度(S51)。

过滤后的试样被导入至稀释部108。稀释部108根据电脑110推测出的血中细菌浓度，以变为期望的细菌浓度的方式调整稀释倍率。稀释用移液管109按照该稀释倍率来导入稀释液。由此来实施S52。

电脑110通过对自动分析装置100所配备的各部进行控制来自动实施以上工序。优选电脑110具备输入输出装置，作业人员能对电脑110指示细菌种类和期望的细菌浓度等。电脑110也可以根据输入的细菌种类来改变要参考的对应关系数据，并根据期望的细菌浓度来变更稀释部108的稀释倍率。电脑110推测出的血中细菌浓度值例如输出至显示器等输出装置，在期望的细菌浓度以下的情况下，也可显示是不良标本的标记(S53)。

自动分析装置100除了上述构成以外也可配备敏感性检查装置111。电脑110通过控制敏感性检查装置111来自动实施敏感性检查。由此，能自动实施S10到S54的全部工序。作为敏感性检查的内容，除了实施方式1中说明过的内容以外，还可以测定后文叙述的实施例中进行说明的最小发育阻止浓度等。

〈实施方式3〉

认为实施方式1～2中说明过的对血液试样内的血中细菌浓度进行调整的方法会因原血液中包含的红血球的量而受到一定程度的影响。人的红血球的浓度还根据性别、健康状态而不同，为3×10⁹～6×10⁹个/mL左右，与细菌的浓度范围10⁶～10¹⁰个/mL相比，其变动极小。因而认为对所推断的血中细菌浓度的结果的影响不大。但是，在事先通过另外的血球分析等而像红血球浓度、血细胞比容值等那样求出了杂质量的另外检测结果的情况下，也可以使用该值对步骤S51的结果进行修正。由此，能更准确地算出所推断的血中细菌浓度。作为修正次序，例如考虑如下次序。

(修正次序1)在通过由作业人员或电脑110实施图5的次序而推断出的血中细菌浓度为异常值(脱离了预先定下的容许范围)的情况下，使用另外检测结果来代替使用滤件图像加以推断的杂质量。即，使用另外检测结果来参考对应关系数据，由此推断血中细菌浓度。

(修正次序2)通过由作业人员或电脑110实施图5的次序而对滤件上的杂质量作1次以上的推断，并且也获取另外检测结果。将这多个杂质量当中去掉了异常值的杂质量加以平均，由此求出最终的杂质量。使用该杂质量来参考对应关系数据，由此算出所推断的血中细菌浓度。

在上述修正次序中，会使用测量杂质量得到的另外检测结果来参考对应关系数据。因而，对应关系数据须记述好该杂质量与实际的血中细菌浓度之间的对应关系。例如，可以在对应关系数据内同时记述滤件图像的彩度值和与其相对应的杂质量，也可以预先定义好彩度值与杂质量之间的转换公式而使用该转换公式将另外检测结果转换为彩度值。即，对应关系数据只要记述以某种形式表示留在滤件上的杂质量的值与血液试样内的实际的血中细菌浓度之间的对应关系即可。

在实施方式1～2中，为检测留在滤件上的红血球而使用了滤件图像的彩度值。也可以使用对与红色相当的特定波长的吸收和反射进行检测的光传感器代替相机106。即，通过使用至少能检测留在滤件上的杂质的RGB分量中的最大分量的光学传感器，能够获得与相机106所拍摄到的图像的彩度值同样的信息。在该情况下，对应关系数据也须记述光学传感器所测量的数值来代替彩度值。或者，也可由人根据色板来目视测量杂质量，根据该测量结果来参考对应关系数据。进而，色板自身也可记述杂质的颜色与血中细菌浓度之间的对应关系。

〈实施例1〉

在本发明的实施例1中，针对本发明的预处理方法的优势而与比较例一起进行说明。在本实施例1中，通过使用浊度测量的浓度调整和本发明的浓度调整在敏感性检查的推荐细菌浓度范围内进行调整并进行比较。在浊度测量的情况下，使用波长600nm的吸光度测量。在本发明的浓度调整的情况下，使用图1所示的预处理方法。所使用的细菌、界面活性剂的种类以及浓度等与实施方式1相同。

图7展示利用通过图1所示的预处理方法得到的菌液而通过以往的细菌检查预处理中使用的浊度测量来调整细菌浓度的结果。影线区域是由美国临床检查标准化机构制定的、实施敏感性检查时的推荐细菌浓度范围。该影线的范围是5×10⁵CFU/mL(±60％)的区域，以变为该中央值即5×10⁵CFU/mL的方式尝试调整。具体而言，对通过麦氏比浊法将菌数浓度调整为相当于1.5×10⁸CFU/mL的麦氏浊度0.5的菌液作300倍稀释。

在血液试样内的细菌浓度为10⁸CFU/mL以上的情况下，能调整至期望的浓度范围附近，但在血液试样内的细菌浓度为10⁶～10⁷CFU/mL的情况下，调整后的菌数会降低1～2位。其原因在于，步骤S11及步骤S12中未能去除的血红蛋白和培养基中包含的微粒等有助于增加散射光，由此导致尽管细菌浓度低，浊度的值却升高。因而，对细菌浓度的预估会过量，因此难以通过使用浊度测量来调整细菌浓度。根据图7的标绘完全没有落在表示推荐细菌浓度范围的影线区域内这一情况，也明确了这一事实。

图8展示根据使用图5所示的方法加以推断的血中细菌浓度来进行浓度调整的结果。与图7相比，即便在血液试样内的实际的血中细菌细菌浓度为10⁶～10⁷CFU/mL的情况下，调整后的细菌浓度也不会降低，大致落在影线的范围内。此外，图8展示根据相同对应关系数据对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行预处理的结果。根据图8，表明即便是革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌等性状大为不同的细菌，也可以根据1个对应关系数据使调整后的细菌浓度落在一定范围内。在希望更准确地调整浓度的情况下，优选按每一细菌种类来保有对应关系数据而参考与细菌种类相对应的对应关系数据。

〈实施例2〉

在本发明的实施例2中，展示使用大肠杆菌、利用血液培养阳性试样而通过本发明的预处理法来进行细菌浓度调整的例子。作为比较例，使用通过1昼夜的分离培养而利用菌落来制作菌液的情况下的增殖度。关于血液培养阳性试样内的细菌浓度，使用10⁷～10⁹CFU/mL三种不同浓度，以最终细菌浓度变为5×10⁵CFU/mL的方式进行调整。在利用菌落来制作菌液的情况下，也以最终细菌浓度变为5×10⁵CFU/mL的方式使用浊度测量进行调整。将试样50μL分注至96孔板，还分注以2倍浓度调整后的米勒-欣顿培养基50μL。其后，将96孔板放入35～37℃的培养箱中，利用明视野显微镜来观察增殖情况。关于增殖度，使用显微镜图像中的判定为细菌的区域的面积作为增殖度的指标，算出增殖度的经时变化。

图9展示血液培养阳性试样以及利用菌落制作的试样的增殖度。在血液培养阳性_1与分离培养_1之间，细菌增殖度上升的时间存在约0.5小时的差异，但最终增殖度大致一致。血液培养阳性_2和血液培养阳性_3也一样。这表明，即便在对血液培养阳性试样进行了预处理的情况下，也能调整到与从菌落加以调整后的细菌浓度相同的程度，而且在敏感性检查时对细菌的发育无影响。

〈实施例3〉

在本发明的实施例3中，对将实施例2的大肠杆菌变更为金黄色葡萄球菌的情况下的结果进行说明。

图10展示血液培养阳性试样以及利用菌落制作的试样的增殖度。与实施例2一样，在血液培养阳性与分离培养之间，最终增殖度一致。因而表明，与实施例2一样，即便在对血液培养阳性试样进行了预处理的情况下，也能调整到与从菌落加以调整后的细菌浓度相同的程度，而且在敏感性检查时对细菌的发育无影响。

〈实施例4〉

在本发明的实施例4中，展示以血液培养阳性试样以及利用菌落制作的试样这两者来实施药剂敏感性检查的结果。在敏感性检查中，测定药剂对细菌表现出抗菌作用的浓度中的最低浓度(最小发育阻止浓度，Minimum Inhibitory Concentration：MIC)。此处，敏感性检查使用的是微量液体稀释法。将菌液以及不同浓度的药剂混合，对培养后的96孔板的各孔的18小时后的浊度进行目视判定，由此来判定MIC。

图11展示实施药剂敏感性检查的结果。图10中，作为1例，对大肠杆菌作用头孢吡肟(CFPM)、头孢噻肟(CTX)、庆大霉素(GM)、左氧氟沙星(LVFX)，对金黄色葡萄球菌作用红霉素(EM)、苯唑西林(MPIPC)、青霉素G(PCG)、万古霉素(VCM)。

在任何情况下，对血液培养试样进行预处理的情况下的MIC都落在利用菌落制作的试样的情况下的MIC的±1管(1倍或一半)的范围内，表明利用对血液培养试样进行预处理得到的试样也能正确地进行敏感性检查。

图11中展示了使用微量液体稀释法来判定MIC的例子，但也可通过像图8～图9中得到的那样使用显微镜图像的迅速敏感性检查来判定MIC，另外，也可实施利用激光的迅速敏感性检查。

〈关于本发明的变形例〉

在以上实施方式中，对使用过滤区域20的彩度值的平均值来参考对应关系数据这一情况进行了说明，但也可使用最大值或众数代替平均值。或者，也可利用以色调/明度/彩度中的至少2种来表示的特征量代替彩度值来表示留在滤件上的杂质量。

在以上实施方式中，对将血液试样中包含的血球作为杂质进行检测的例子进行了说明，而在其他细菌试样中也能使用本发明。即，只要是通过拍摄留在滤件上的杂质而获得的图像信息与试样内的细菌浓度之间存在对应关系的试样，便能使用本发明。关于为破坏杂质而加入的物质，根据杂质的种类酌情加以改变即可。

符号说明

100…自动分析装置

101…导入装置

102…离心分离器

103…洗净部

104…洗净用移液管

105…过滤滤件部

106…相机

107…存储部

108…稀释部

109…稀释用移液管

110…电脑。

Claims

1.一种自动分析方法，对包含细菌和杂质的试样进行分析，其特征在于，具有以下步骤：

对所述试样导入破坏所述杂质的物质；

将导入了所述物质的所述试样内的所述杂质与所述细菌相互分离；

使用从所述杂质与所述细菌分离后的所述试样取出所述细菌的滤件而从所述试样取出所述细菌；

从存放对应关系数据的存储部读取所述对应关系数据，所述对应关系数据记述有表示留在所述滤件上的所述杂质的量的数值与所述试样内的所述细菌的浓度之间的对应关系；以及

使用表示从所述试样取出所述细菌后留在所述滤件上的所述杂质的量的数值来参考所述对应关系数据，由此推断所述试样内的所述细菌的浓度。

2.根据权利要求1所述的自动分析方法，其特征在于，

所述试样含有血球作为所述杂质，

所述物质为界面活性剂，

所述界面活性剂包含：具有亲水性部分和疏水性部分且所述疏水性部分为链状烃的阴离子性界面活性剂，和具有亲水性部分和疏水性部分且所述疏水性部分具有环状烃的界面活性剂中的至少任一者。

3.根据权利要求1所述的自动分析方法，其特征在于，

所述滤件是通过过滤所述试样来分离所述杂质与所述细菌的过滤滤件，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，使用在不染色的情况下拍摄留在所述滤件上的所述杂质而获取到的图像，来检测留在所述滤件上的所述杂质的量，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，使用利用所述图像检测到的所述杂质的量来参考所述对应关系数据。

4.根据权利要求3所述的自动分析方法，其特征在于，

所述自动分析方法进一步具有拍摄RGB图像作为所述图像的步骤，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，将所述RGB图像转换为HSV颜色空间图像，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，使用留在所述滤件上的所述杂质的所述HSV颜色空间图像上的彩度值作为表示留在所述滤件上的所述杂质的量的数值。

5.根据权利要求3所述的自动分析方法，其特征在于，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，使用以留在所述滤件上的所述杂质的所述HSV颜色空间图像上的色调值、彩度值以及明度值来表示的特征量作为表示留在所述滤件上的所述杂质的量的数值。

6.根据权利要求1所述的自动分析方法，其特征在于，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，从至少检测所述杂质所具有的RGB颜色分量中的最大分量的光学传感器获取检测所述杂质得到的结果，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，使用所述光学传感器检测留在所述滤件上的所述杂质得到的结果作为表示留在所述滤件上的所述杂质的量的数值。

7.根据权利要求1所述的自动分析方法，其特征在于，

所述滤件是通过过滤所述试样来过滤所述杂质与所述细菌的过滤滤件，

所述自动分析方法进一步具有检测留在所述滤件上的所述杂质的量的步骤，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，区别于检测留在所述滤件上的所述杂质的量的步骤中检测到的所述杂质的量而另行获取检测所述试样内的所述杂质的量得到的另外检测结果，

在推断所述细菌的浓度的步骤中，使用所述另外检测结果对检测留在所述滤件上的所述杂质的量的步骤中检测到的所述杂质的量进行修正，使用该修正后的所述杂质的量来参考所述对应关系数据。

8.根据权利要求1所述的自动分析方法，其特征在于，

所述自动分析方法进一步具有实施所述细菌对药剂的药剂敏感性检查的步骤，

在实施所述药剂敏感性检查的步骤中，在推断出所述试样内的所述细菌的浓度后，在不培养所述试样内的所述细菌的情况下实施针对所述试样内的所述细菌的药剂敏感性检查。

9.根据权利要求8所述的自动分析方法，其特征在于，

所述自动分析方法进一步具有稀释所述试样的步骤，

在所述稀释步骤中，在推断出所述试样内的所述细菌的浓度后，通过稀释所述试样来制作具有实施所述药剂敏感性检查所需的所述细菌的浓度的检查试样，

在实施所述药剂敏感性检查的步骤中，对所述稀释步骤中制作出的所述检查试样实施所述药剂敏感性检查。

10.根据权利要求8所述的自动分析方法，其特征在于，

在实施所述药剂敏感性检查的步骤中，利用摄像装置对保持在35～37℃的培养箱内设置的试样的图像进行拍摄，

在实施所述药剂敏感性检查的步骤中，使用所述摄像装置拍摄到的所述试样的图像来测定所述细菌的增殖度，由此判定所述药剂的最小发育阻止浓度。

11.根据权利要求1所述的自动分析方法，其特征在于，

所述滤件的过滤孔径为1～40μm，所述滤件的材料为疏水性材料。

12.根据权利要求1所述的自动分析方法，其特征在于，

所述试样为血液试样，所述杂质至少包含血液内的红血球。

13.一种自动分析装置，其对包含细菌和杂质的试样进行分析，其特征在于，具备：

分离器，其将导入了破坏所述杂质的物质的所述试样内的所述杂质与所述细菌相互分离；

滤件，其从所述杂质与所述细菌分离后的所述试样取出所述细菌；

存储部，其存放对应关系数据，所述对应关系数据记述有表示留在所述滤件上的所述杂质的量的数值与所述试样内的所述细菌的浓度之间的对应关系；以及

运算部，其使用表示从所述试样取出所述细菌后留在所述滤件上的所述杂质的量的数值来参考所述对应关系数据，由此推断所述试样内的所述细菌的浓度。