EP4448795A1 - Procédé de détection d'une présence d'une espèce biologique d'intérêt par séquençage temps réel itératif - Google Patents

Procédé de détection d'une présence d'une espèce biologique d'intérêt par séquençage temps réel itératif

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EP4448795A1
EP4448795A1 EP22847254.4A EP22847254A EP4448795A1 EP 4448795 A1 EP4448795 A1 EP 4448795A1 EP 22847254 A EP22847254 A EP 22847254A EP 4448795 A1 EP4448795 A1 EP 4448795A1
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EP
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species
interest
sequences
control
sample
Prior art date
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Pending
Application number
EP22847254.4A
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German (de)
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Inventor
Sébastien HAUSER
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Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
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    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
    • G16B50/30—Data warehousing; Computing architectures

Definitions

  • the technical field of the invention is the identification of a biological species of interest by metagenomic analysis, by implementing a real-time sequencing method.
  • DNA sequencing by nanopores is based on the passage of a molecule, comprising a strand of oligonucleotides, through a nanopore, the latter forming a channel.
  • a potential difference can be measured, on either side of the channel, which depends on the nature of each base forming the strand.
  • the potential difference allows a distinction between the five standard bases of DNA or RNA (G, C, T or U).
  • G, C, T or U the strand of oligonucleotides induces a temporal sequence of potential differences, from which the sequence of bases forming the strand is determined.
  • Document WO2021/013900 describes a method for detecting a species of interest, in particular a bacterium, in a sample.
  • a control species was previously added to the sample, according to a known quantity. After sequencing, the number of sequences corresponding to the control species is used to quantify a concentration of species of interest or to determine a minimum detectable concentration of the species of interest in the sample.
  • the use of the control species makes it possible to ensure that the extraction process and the possible amplification of the nucleotide sequences is carried out correctly. Since the quantity of control species introduced into the sample is known, it can be used to quantify a concentration or a minimum detectable concentration of the species of interest.
  • the inventor has adapted the method described above to the use of real-time sequencers delivering their digital nucleotide sequences (also called “reads” and corresponding to DNA or RNA sequences) as the nucleotide fragments in the sample are read. Indeed, the latter make it possible to obtain an analysis result more quickly, for example a few hours, or even a few tens of minutes.
  • a first object of the invention is a method for detecting a biological species of interest potentially present in a sample, the biological species of interest having a known or partially known genome, the sample comprising a mixture of different species biological, the method comprising the steps:
  • control species in the sample, the control species having a known genome, the control species being added according to a known concentration in the sample;
  • step b) sequencing of part of the nucleic acid sequences extracted during step b) using a real-time sequencer for a predetermined period or until a number of sequencings is obtained predetermined;
  • step c) following step c), assignment of sequences resulting from step c) to the species of interest as well as to the control species;
  • step e • during a first iteration of step e), the quantities of sequences assigned to the control species and to the species of interest during step d) added to the quantities of initial sequences;
  • step e • during each repetition of step e), the quantities of sequences (ng 0I , n s l pc ) assigned to the control species and to the species of interest during step d) added to the quantities sequences associated with the control species and with the species of interest resulting from the previous iteration;
  • step f the biological species of interest in the sample, or going to step h;
  • step d) of each iteration is performed for a predetermined duration or until the sequencing of a predetermined number of sequences.
  • the process can be such as:
  • step f) of an iteration when the quantity of sequences associated with the species of interest is greater than the threshold of the number of sequences;
  • step g) comprises an estimation of a concentration of the species of interest as a function of: the quantity of sequences associated with the species of interest during the last update (that is to say during the last step e); the quantity of sequences associated with the control species at the last update; the added concentration of the control species.
  • the process can be such as:
  • step f) of an iteration when the quantity of sequences associated with the species of interest is greater than the threshold of the number of sequences;
  • step g the concentration of the species of interest is considered to be greater than the concentration of the control species.
  • the process can be such as:
  • step f) of an iteration when the quantity of sequences associated with the species of interest is lower than the threshold of the number of sequences;
  • step f) when the quantity of sequences associated with the control species is greater than the control threshold; during step g), if the quantity of sequences associated with the species of interest is zero, the concentration of the species of interest is considered to be zero.
  • the process can be such as:
  • step f) of an iteration when the quantity of sequences associated with the species of interest is lower than the threshold of the number of sequences;
  • step g) comprises an estimation of a concentration of the species of interest as a function of: the quantity of sequences associated with the species of interest; the amount of sequences associated with the control species; the added concentration of the control species.
  • the concentration of the species of interest can be estimated from a ratio: Or :
  • L SPC and L so / are respectively the genome lengths of the control species and of the species of interest;
  • ⁇ soi and gp C are respectively the quantities of sequences respectively associated with the species of interest and with the control species resulting from the last update;
  • C spc is the concentration of the control species added to the sample.
  • the method can be such that, following the achievement of the criterion for stopping the iterations,
  • the method generates information that neither the presence nor the absence of the species of interest can be confirmed.
  • the method comprises taking into account a decision threshold, the method aiming to compare a concentration of the species of interest to the decision threshold, the method being such that during step a), the concentration of the control species, is between 0.01 times and 100 times the decision threshold.
  • step h) the criterion for stopping the iterations is reached when: - the quantity of sequences associated with the species of interest exceeds the threshold of the number of sequences;
  • control threshold - and/or the quantity of sequences associated with the control species exceeds the control threshold
  • the method comprises the steps: i) sequencing of part of the nucleotide sequences extracted during step b ) using the real-time sequencer for a predetermined duration or until a predetermined number of sequences is obtained; j) following step i), assignment of sequences resulting from step i) to the detected species of interest; k) updating the quantities of sequences associated with the species of interest, such that the quantities of sequences associated with the species of interest are:
  • step k • during a first iteration of step k), the quantity of sequences assigned to the species of interest detected during step j) added to the quantity of sequences resulting from the last iteration of steps c) to g);
  • step k • during each reiteration of step k), the quantity of sequences assigned to the species of interest during step j) added to the quantity of sequences resulting from the previous iteration of step k); l) reiteration of steps i) to k) until an iteration stopping criterion is reached.
  • Steps i) to k) can be repeated until a predetermined number of iterations is reached.
  • the method comprises a determination of a sequencing depth of the biological species of interest, the corresponding sequencing depth to a ratio between the cumulative length of the sequences associated with the species and the length of the genome of the species; - Steps i) to k) are repeated until a predetermined sequencing depth is reached.
  • a type sequence of the genome of the species of interest comprising an antibiotic resistance marker or a marker virulence of the species of interest.
  • the sequencer is configured to carry out successive sequencing of different nucleic acid sequences, one after the other, the sequencing of each sequence being considered as carried out in real time.
  • processing unit comprising a bioinformatics module, programmed to assign sequences resulting from the sequencer to a species, and a control module, programmed to implement steps c) to h) of a method according to first object of the invention.
  • Figures 1 and 2 schematize the main steps of a method according to the invention.
  • Figure 1 relates to a detection phase of a species of interest.
  • FIG. 3 schematizes a device configured to implement the invention.
  • the objective of the method is to be able to detect the presence of a biological species of interest SOI in a sample.
  • SOI stands for "Species of Interest”.
  • the method can allow an absolute quantification of the species of interest SOI, so as to allow a comparison with a decision threshold SD.
  • biological species is meant a microorganism, for example a bacterium, or a virus, a fungus, an archaeobacterium, an amoeba, a protist, a microalgae.
  • a biological species can also be a cell or any other material or entity comprising a sequenceable nucleic acid.
  • the species of interest has a known or partially known genome.
  • the genome, or its known portion is made up of sequences, called sequences of interest.
  • the method can simultaneously address several species of interest. Also, the term a kind of interest is to be interpreted as meaning at least a kind of interest.
  • the decision threshold can correspond to a compliance value, such that beyond the decision threshold, the sample is considered non-compliant, and below decision threshold, the sample is considered compliant.
  • the concentration of the biological species of interest is greater than or equal to the decision threshold, it is defined as being critical.
  • a concentration of biological species of interest can be considered critical if it is lower than a decision threshold, the latter corresponding to a minimum admissible concentration of the biological species.
  • the sample is generally a sample taken from the environment, or from an organism, dead or alive, or even from an agri-food or manufactured product. The sample may also have been taken from an industrial facility for process control purposes.
  • the sample includes different biological species, not having the same genome.
  • the sample results from a sample taken from an organism, for example a human or animal organism
  • the sample comprises a significant, or even majority, quantity of cells from the organism from which the sample was taken.
  • the genomes of human or animal organisms are 1,000 to 100,000 times larger in size than the genomes of prokaryotic organisms.
  • the sample generally includes biological species naturally present in the sample, and not likely to cause a pathology or a critical contamination.
  • the sample is a broncho-alveolar sample, it comprises a bacterial flora naturally present in the lungs.
  • the sample is a stool sample, it includes bacterial flora naturally present in the digestive tract.
  • the biological species of interest is a bacterium or a virus
  • the nucleic acids originating from the biological species of interest can be in the minority in the sample.
  • the sample contains so-called “matrix” species, endogenous in the sample, and capable of masking the metagenomic information relating to the biological species of interest.
  • matrix species representative of these media.
  • the matrix comprises the cells making up the organism.
  • An important aspect of the invention is that the presence of the species of interest in the sample is detected by implementing a real-time sequencer mentioned in the prior art.
  • a sequencer makes it possible to obtain exploitable data, relating to the sequences present in the sample, more quickly than previous sequencers.
  • the real-time sequencer is configured to successively collect signals representative of successive detections of bases of the same sequence.
  • a real-time sequencer is configured to generate a sequence in real time, as it is decoded. Sequencing of different sequences present in the sample is carried out successively, each sequence being sequenced one after the other. This does not exclude the fact that certain sequences can be the subject of simultaneous, parallel sequencing. For example, when the sequencer is a nanopore sequencer, each nanopore “reads” several sequences different in parallel. Each nanopore can read several different sequences successively.
  • sequencer can be of the nanopore type, as described in the prior art. More generally, the invention relates to the use of a sequencer configured to generate sequences in real time, the latter being identified following their sequencing. Thus, the sequencer is configured to sequentially generate a list of identified sequences, the latter being designated by the term “reads”. The lists of reads are generated at regular intervals, for example every n minutes, n being for example equal to 10. It is also possible to configure the quantity of sequences read in each list. The quantity of sequences (or reads) in each list can for example be equal to 4000.
  • one of the objectives of the invention is to evaluate to what extent a metagenomic analysis is exploitable. In particular, it is a question of evaluating the conformity of all the steps from the preparation of the sample, sampling excluded, to the bioinformatics analysis of the sequencing data.
  • SPC an acronym for Sample Processing Control
  • One function of the control species is to allow a control of the correct progress of the nucleic acid extraction and sequencing steps, described below.
  • the SPC control species can be a known biological species, the genome of which is also known, preferably in full.
  • the SPC control species may be a natural biological species.
  • the SPC control species is not initially present in the sample taken, or in a negligible amount.
  • the content of SPC control species initially present in the sample that is to say present before the addition, and preferably at least 10 times lower, or preferably at least 100 or 1000 times lower to the added SPC concentration of the SPC control species in the sample.
  • the SPC control species may for example be a bacterium. It is important that the SPC concentration of the added SPC control species is controlled.
  • control species can be chosen taking into account the aspects listed below:
  • the control species should preferably be distinguished from the organisms naturally present in the sample, or endogenous organisms, as well as from the species of interest sought: thus, the bioinformatics tool can accurately identify the sequences from the SPC sequencing.
  • control species is preferably detectable by high-throughput sequencing, while not being preponderant in the sample.
  • control species it is preferable for the control species to present at least one of the following characteristics: o
  • the size of its genome is preferably similar, or at least comparable, to the size of the genome of the biological species of interest.
  • the size of the genome of the control species is between 0.1 times and 10 times the size of the genome of the biological species of interest.
  • the C S PC concentration of the control species can be determined based on the decision threshold.
  • the concentration C S PC of the control species SPC added may for example be between 0.001 times and 1000 times, and preferably between 0.01 and 100 times the decision threshold.
  • Nucleic acids from the SPC control species undergo similar processing to nucleic acids from the species of interest during the sample preparation, extraction, and sequencing steps, and preferably
  • the percentage of GC bases is preferably close to the percentage of GC bases of the biological species of interest; By close to is meant between 75% and 125%, and preferably between 80% and 120%.
  • control biological species preferably comprises, when the biological species of interest is a bacterium, a membrane or an integrated cell wall or, when the biological species of interest is a virus, a protein envelope. This condition also allows a monitoring of the lysis steps or the extraction of nucleic acids from the biological species of interest.
  • the nucleotide sequences of the control species preferably do not contain genomic markers, such as for example antibiotic resistance markers, virulence markers, so as not to distort the results of a possible test for sensitivity to antibiotics by the presence of such markers in the genome of the biological species of interest.
  • the nucleotide sequences of the control species do not contain any other gene of clinical or industrial interest and whose presence is likely to be controlled.
  • control species is preferably easy to handle, in particular: o by being harmless to humans or the environment; o and/or by being resistant to heat treatments such as freeze-drying or freezing, which facilitates storage.
  • control species should not form spores, or only marginally.
  • control species must have a sensitivity to lysis close to that of the biological species of interest.
  • control species can be present in the form of beads, each bead comprising a calibrated concentration of control biological species in freeze-dried form.
  • SPC control may be used, or that several species of control, of different types, may be used.
  • the method first comprises a detection phase of a species of interest, the steps of which are now linked to Figure 1.
  • Step 10 taking the sample.
  • the sample is taken from a living human organism, for diagnostic aid purposes.
  • the invention is not limited to an application in the field of life.
  • the sample can be taken in a natural, industrial or hospital environment, so as to verify compliance with respect to a decision threshold.
  • Step 20 Addition of the control species.
  • the added concentration C S PC of the control species SPC is preferably known with precision, for example with the same precision as that desired for the quantification of the species of interest. Indeed, it can allow, provided that certain conditions are met, to quantify the concentration of biological species of interest in the sample, the control species then forming a calibrator.
  • the term added concentration refers to the concentration of the control species in the sample due to the addition of the control species.
  • control species fulfills the function of quality control of the steps of the metagenomic analysis, as well as the function of calibrator, allowing possible quantification of the concentration of the biological species of interest.
  • an added CSPC concentration of the control species in the sample is available.
  • the added concentration Cspc of the control species is expressed, preferably, in GEq/mL (genome equivalent per mL).
  • the clinical detection thresholds in bacteriology are generally expressed in CFU/mL (colony-forming unit), however the proposed quantification method makes it possible to quantify nucleic acids without genomic equivalence information. It is therefore recommended to determine, for the SPC, the correlation between the number of units forming a colony by culturing, for example on an agar medium, and the equivalence in number of genomes, for example by quantitative PCR. For example, it has been established that in a bioball® B. subtilis strain ATCC 19659 BioBall® MultiShot 10E8 (bioMérieux, Catalog #416721) one colony-forming unit is equivalent to one genome.
  • the added concentration can be defined according to the SD decision threshold.
  • the added CSPC concentration of the control species is equal to the SD decision threshold, or close to the SD decision threshold, for example to within ⁇ 50%.
  • 0.1 SD ⁇ C S pc ⁇ 10 SD The impact of the added CSPC concentration of the control species is described next.
  • Step 30 lysis and extraction of nucleic acids.
  • lysis can be configured to preferentially target the biological species of interest.
  • the control species must have the same sensitivity to lysis as the biological species of interest, or a sensitivity to lysis considered to be equivalent.
  • the lysis can include a first lysis, intended to essentially lyse cells other than the species of interest.
  • a first lysis can for example be envisaged when the biological species of interest is a very small minority compared to the cells of a matrix making up the sample.
  • the released nucleic acids are evacuated, then a second lysis is carried out, targeting the biological species of interest.
  • the control species is preferably resistant to the first lysis, and not resistant to the second lysis.
  • the DNA is extracted from the sample, for example according to the extraction method described in WO2014/114896.
  • the DNA extracted from the sample undergoes sequencing using a sequencer allowing real-time access to the sequences read, for example to nanopores.
  • a sequencer may for example be a sequencer of MinION® type from Oxford Nanopore Technologies.
  • the sequencer is connected to a dedicated fluidic chamber, comprising the nanopores.
  • the sample is introduced into the fluidic chamber.
  • the sequencer is connected to a processing unit allowing the analysis of the identified sequences.
  • the processing unit comprises a microprocessor, configured to execute instructions from bioinformatics software, to identify the analyzed sequences.
  • the processing unit is for example a computer of the MinIT type, comprising the computer environment dedicated to sequencing.
  • the invention applies particularly to so-called "real-time" sequencers having the following characteristics: an ability to read all of the sequences present in the sample, unlike sequencers based on immobilization of the sequences on a support for their reading, these sequencers therefore sequencing a predefined maximum number of sequences corresponding to the number of elements for fixing the nucleotide sequences. This implies in particular that the number of sequences produced is proportional to the duration of sequencing. an ability to output raw data (e.g. reads or raw signals such as electrical potentials) as they are collected, or to output raw data in batches at a defined rate per batch of sequences of given size or regularly at a fixed frequency (for example one batch of raw data per minute or per ten minutes).
  • raw data e.g. reads or raw signals such as electrical potentials
  • a special feature of “real-time” sequencing is that the results of reading DNA or RNA sequences are available in real time at the output of the sequencer, or in near real time.
  • quasi-real time we mean that the reads (or the raw signals measured such as the electrical potentials) are produced at the output of the sequencer in batches after a period much shorter than the total time necessary for the sequencing of the acids present. in the sample or much less than the total consumption time of the reagents required for sequencing. Each batch can thus be produced in a few minutes or a few tens of minutes.
  • the real-time sequencer has the ability to produce sequences (reads) in real time. However, it is generally expected that a certain number of sequences have been decoded, in a file generated at regular intervals.
  • the MinlON sequencer from oxford nanopore generates, by default, in near real time ".fast5" type files in batches of 4,000 sequences of potential differences which can be converted in near real time by a computer as a .fastq file in batches of 4,000 reads.
  • the .fast5 extension denotes raw data files.
  • the .fastq extension denotes files storing footage, along with associated quality scores. This allows an interactive implementation of the method, so as to be able to stop or continue the sequencing according to the results obtained.
  • the sequencing can in particular be carried out iteratively, each iteration corresponding to a sequencing of a predetermined number of sequences (or batch) or to a sequencing carried out during a predetermined duration.
  • sequences are potentially assigned to the control species SPC or to the biological species of interest SOI, or to each biological species of interest or to other species present in the 'sample.
  • Each iteration corresponds to a rank i. i is an integer between 1 and I, I corresponding to the maximum number of iterations described in connection with step 70, or to a maximum number of sequences (reads) obtained.
  • the sequencing assigns sequence numbers n S l 0I and n s l pc respectively to the species of interest SOI and to the control species SPC.
  • Step 50 Update number of sequences.
  • the numbers of sequences respectively assigned, during step 40, to each biological species of interest and to the control species are respectively the number of sequences N ⁇ , respectively associated with the biological species of interest SOI and with the control species SPC during the previous iteration.
  • This step corresponds to a bet update of the number of sequences respectively associated with the species of interest SOI and with the control species SPC, according to the expressions: where n S l 0I and n s l pc are the numbers of sequences respectively assigned to the species of interest and to the control species during step 40 of iteration i.
  • the notation n l corresponds to a number of sequences assigned to a species during iteration i, while the notation N 1 corresponds to a total number of sequences associated with a species for all the iterations up to the iteration i.
  • the sequence numbers N 0I or N PC can be normalized by a reference quantity.
  • the reference quantity can for example be a total quantity N 1 of sequences produced during the sequencing, up to the current iteration i.
  • Step 60 Comparisons to thresholds
  • the number Ng 0I of sequences associated with each SOI species of interest is compared to a threshold of the number of sequences S self , which corresponds to the minimum number of reads associated with the SOI species of interest necessary for stop the sequencing and start the quantitative interpretation relating to the presence of the species of interest in the sample.
  • the threshold of the number of sequences corresponds to a threshold of the number of sequences, or threshold of the number of reads, associated with the species of interest.
  • the number N ⁇ PC of sequences associated with the control species SPC is compared to a control threshold S spc . which corresponds to the minimum number of reads associated with the SPC to stop the sequencing when the number of reads associated with each of the SOIs does not reach the threshold of the number of Ssoi sequences.
  • step 64 When N ⁇ OI ⁇ S self and N PC > S spc cf. step 64 The determination of the sequence number threshold and the control threshold are described below.
  • Step 62 During this step, it is possible to conclude that the species of interest SOI is present in the sample and to quantify its concentration, for example by the expression: Or :
  • L SPC and L so / are respectively the genome lengths of the control species and of the biological species of interest.
  • a is a correction factor determined empirically, on the basis of learning samples whose concentration in the biological species of interest is known.
  • the concentration of the biological species of interest is also expressed in the same unit.
  • the species of interest is present in the sample, at a concentration greater than the concentration of the control species, but it is not possible to determine its absolute concentration.
  • Step 70 Steps 40 to 60 are repeated, until a criterion for stopping the iterations is reached.
  • each iteration i corresponds to a predetermined sequencing duration, and preferably identical for each iteration, or to a predetermined number of sequences read (number of reads).
  • the iteration stopping criterion is considered to have been reached when the conditions leading to steps 62 or 63 or 64 are reached.
  • the criterion for stopping the iterations can also be a number of iterations equal to a maximum number of iterations I, the latter having been predetermined.
  • the criterion for stopping the iterations is considered to have been reached when the sequencing duration is greater than or equal to a predetermined duration, for example 12 hours, or when the total number of sequences from the sequencer is greater than a predetermined maximum number .
  • Step 80 is carried out if N P0I ⁇ S self and N PPC ⁇ S spc , that is to say following the last iteration of rank I, the numbers of sequences respectively associated with the species of interest and the control are below the sequence count threshold and the control threshold, respectively. In this case, an alert signal is emitted, indicating that the presence or absence of the species of interest in the sample cannot be confirmed.
  • step 70 or a possible step 80, the method can be stopped.
  • steps 62, 63 and 64 are analyzed simultaneously.
  • the sequencing can be stopped and each species of interest is interpreted according to these criteria.
  • steps 62 or 63 or 64 it is possible to have additional genomic information as to the species of interest identified. It may in particular be the presence of a specific marker in the genome, for example an antibiotic resistance marker or a virulence marker. Antibiotic resistance or virulence markers are known.
  • steps 100 to 130 can be implemented to confirm the presence of the specific marker in the genome of the identified species of interest. If i' designates the rank of the iteration during which the iteration stopping criterion of step 70 has been reached, steps 100 to 130 are implemented for i r ⁇ i ⁇ 1 .1 corresponds to the rank of the last iteration.
  • step 40 is similar to step 40. Only the sequences corresponding to each SOI species of interest detected following the iterations of steps 40 to 80 are counted.
  • Step 120 reiteration of steps 100 to 110, unless an iteration stopping criterion is reached.
  • the criterion for stopping the iterations can be the achievement of a maximum number of iterations I. It is recalled that the latter can correspond to a maximum sequencing duration or to a maximum number of identified sequences.
  • a sequencing depth of the species of interest SOI is determined during each iteration.
  • the sequencing depth corresponds to a ratio between the cumulative length of the sequences associated with the species of interest and the length of the genome of the species of interest.
  • the criterion for stopping the iterations is reached. The iterations are stopped.
  • sequences corresponding to the desired marker are identified and counted.
  • the implementation of the method previously described assumes a prior determination: of the threshold of the number of sequences S self , with which the number of sequences of the species of interest Ng OI is compared during each step 60; and the control threshold S spc , to which the number of control sequences N ⁇ PC is compared during each step 60.
  • the sequencing times required to produce numbers of reads corresponding to the SOI species of interest were estimated to be respectively equal to 1, 10, 100, 1,000 and 10,000, and this by taking into account different concentrations C S0I of l SOI species of interest in the sample.
  • the duration of TTR (Time to Result) sequencing is estimated according to the expression:
  • S self is the threshold of the number of sequences
  • C DNAtot is the total concentration of DNA in the sample: this includes the concentrations of the species of interest, the control species and the DNA of no interest (human DNA and commensal flora);
  • Tfastq is an average sequencing time to obtain a .fastq file with a quantity of reads equal to Rfastq;
  • Nsampie is the number of samples sequenced simultaneously. N sampie corresponds to a proportion of sequenced DNA that can be attributed to the sample. N sampie is different from 1 when different samples are sequenced simultaneously. In this case, N samp ie designates the total quantity of DNA sequenced divided by the quantity of DNA in the sample considered.
  • a value that is too low limits the possibility of detecting other species of interest potentially present at lower concentrations.
  • the use of a threshold for the number of sequences S itself equal to 100 allows the detection from a single read of another species of interest SOI′ present at a concentration 100 times lower.
  • a high threshold of the number of sequences S itself can be particularly interesting if a majority SOI is present at a concentration greater than 100 times the SD: this allows the detection of other minority SOIs, denoted SOI', at a concentration up to 100 times lower than SOI but higher than the decision threshold SD.
  • the threshold of the number of sequences S itself is preferably between 5 and 500 or between 50 and 500.
  • a short duration of analysis chooses a relatively low threshold for the number of sequences S itself , close to 50, or even lower, knowing that a threshold for the number of sequences that is too low is conducive to false positives.
  • a higher threshold for the number of sequences S is chosen, close to or greater than 500, to the detriment of the analysis time.
  • DNA can have various origins, for example DNA from the patient's cells and commensal flora. DNA can also result from an atypical infection: the concentration of genomic DNA from a microorganism other than SOI can therefore reach quantities much higher than the SD decision threshold.
  • Table 2 gives, for different concentrations of DNA C DNA , expressed relative to the decision threshold SD, the sequencing time making it possible to obtain a number of sequences corresponding to the control species greater than the control threshold S spc . It was assumed that the concentration of species of interest C SOI corresponds to the decision threshold SD. The objective is to determine the effect of the variation of the control threshold S spc on the duration of sequencing of a sample in which the SOI is not detected.
  • control species SPC was present at a concentration C spc equal to the decision threshold SD.
  • the inventor has evaluated the effect of a variation in the added concentration C spc of the control species.
  • a concentration C spc equal to the decision threshold increases the detection limit compared to a concentration C spc ⁇ 0.01 SD. However, this allows a quantification of the concentration of the species of interest according to a greater dynamic: between 0.01SD and 1000SD.
  • We then considered a high concentration C spc equal to 100 times the decision threshold SD.
  • the high quantity of SPC allows a very rapid result rendering because in the range of SOI concentrations evaluated the result is rendered only 3 minutes after the start of the sequencing.
  • the various analysis parameters such as: the concentration C spc of the control species added to the sample; the threshold of the number of sequences S itself ; the S spc control threshold;
  • the parameterization makes it possible to adapt the performance of the method described above in terms of sequencing speed, quantification dynamics and the required sensitivity.
  • the SPC at a concentration close to the clinical decision threshold C spc “SD (for example C spc between 0.1SD and 10 SD or even between 0.01 SD and 100SD) with a threshold for the number of sequences S self between 5 and 500 and a control threshold S spc between 5 and 125.
  • C spc “SD” for example C spc between 0.1SD and 10 SD or even between 0.01 SD and 100SD
  • Bacillus subtilis was used as a control species for the metagenomic sequencing of samples resulting from bronchoalveolar lavages (BAL) carried out on human patients. We know that this type of sample is likely to contain a large amount of human DNA from the patient. 38 samples were sequenced. The maximum sequencing time was set at 12 hours. Each iteration gathered 4000 reads.
  • BAL bronchoalveolar lavages
  • Control species was added at a concentration of 1.7E4 CFU/mL, where CFU stands for Colony-Forming Unit. This threshold is considered to be slightly above a clinical threshold separating a normal presence of bacteria from a presence of bacteria representative of an infection.
  • the analysis protocol includes an elimination of the patient's DNA during a first lysis.
  • the sample was treated with a lysing agent specifically targeting the patient's cells.
  • a lysing agent specifically targeting the patient's cells.
  • the released DNA was then removed by enzymatic action and washing.
  • the sample then underwent a second mechanical and chemical lysis in order to extract the bacterial DNA.
  • the mechanical lysis was carried out with the aid of stirring, lasting 20 minutes, using glass beads with a diameter of 1 mm as well as Zr/Si microbeads with a diameter of 0.1 mm. DNA was extracted from the lysate using the easyMAG platform (Biomérieux).
  • the resulting volume of elution was 25 ⁇ L.
  • DNA extracts were stored at -20°C.
  • the preparation of the sequencing libraries and the barcoding of the DNA fragments were carried out using the “Rapid PCR Barcoding kit” (Oxford Nanopore Technologies). 4 samples were processed in parallel.
  • the sequencing was carried out with the MinlON sequencer (Oxford Nanopore Technologies), connected to a MinIT computer (Oxford Nanopore Technologies).
  • the sequencing data was processed by the WIMP software (What is in my Pot?) of the EPI2ME suite (Oxford Nanopore Technologies).
  • This software allows separation of the sequences of each sample using barcodes (bar coding by molecular marker, each sample being assigned a label allowing it to be identified), identification of the bacterial or viral or fungal species corresponding to each sequence read “read”, as well as a count of the number of reads associated with each of the identified species.
  • Steps 40 to 70 were repeated in series of 4000 reads.
  • the detection thresholds respectively associated with the species of interest and with the control species were 100 reads and 25 reads.
  • concentrations of each species of interest were quantified, the concentrations were compared to a metagenomic threshold of 5.53 GEq/mL. This is a decision threshold, making it possible to conclude on the pathological presence of a species of interest in a sample resulting from BAL.
  • PPV Positive Predictive Value
  • NPV Negative Predictive Value
  • the method has equivalent performances, or even better than those obtained with a 12h sequencing. It enabled the detection of all infections with a median time saving of over 11 hours and 30 minutes. Moreover, in the absence of infection by all the species of interest, the detection of the SPC makes it possible to confirm the proper functioning of the process in a median duration of 2 hours and 13 minutes and to produce a negative detection result.
  • the method allows an improvement in the performance of the test, by lowering the number of false positives, which improves the specificity and the positive predictive value. This is due to the timely termination of sequencing when enough relevant information is available, i.e. when Ng 0I > S self or when N ⁇ PC > S spc . As soon as one of these thresholds is crossed, the iterations cease and a quantification of the concentration (or of the minimum concentration) of the species of interest can be carried out. It is observed that it is not useful, nor even desirable, to continue the iterations up to the maximum number of iterations initially fixed, which corresponded to a total duration of 12 hours. Indeed, obtaining too many sequences of the species of interest can induce false positives.
  • the iterative steps 100 to 120 were implemented on the samples, so as to identify the presence of any antibiotic resistance markers in the genome. Iterative steps 100 to 120 were performed until a total sequencing time of 12 hours was obtained.
  • the first column (ref) corresponds to the reference of each sample; the second column (SOI) corresponds to each species of interest detected; the third column (method) corresponds to the detection method: culture or implementation of the invention; the fourth column (Csoi) corresponds to the measured or estimated concentration of each bacterial species detected, the fifth column (depth) corresponds to the depth of sequencing, as previously described.
  • the sixth column (TTR ID) corresponds to the duration, according to the “hour:minute” format of steps 40 to 80, for the confirmation of the presence of the species of interest in the sample. It is observed that the duration is between 3 minutes (sample Cl-026) and 8 hours 37 (sample Cl-060). 6 samples were considered positive in less than 30 minutes.
  • the following columns correspond to the presence of an antibiotic resistance marker with regard to 21 antibiotic agents.
  • the letter R indicates a resistance observed to the antibiotic by the culture or predicted by the presence of a marker while the letter S indicates a sensitivity observed by the culture. It is not possible to comment on sensitivity to an antibiotic based on the absence of markers of resistance to it. This is the reason why there is no letter S in the lines corresponding to the implementation of the invention.
  • a shaded letter R indicates the presence of an antibiotic resistance marker revealed by sequencing, but not confirmed by bacterial culture (shaded letter S): it is therefore a false positive resulting from sequencing.
  • a white letter R on a black background indicates the presence of an antibiotic resistance marker revealed by bacterial culture, but not detected by sequencing: this is a false negative resulting from sequencing. There are 9 false negatives.
  • a notable advantage of the invention resides in the possibility of obtaining, as the iterations progress, increasingly precise information as to the constitution of the sample.
  • the invention makes it possible to optimize the duration of analysis, by stopping the iterations as soon as a biological species of interest is detected in a sufficiently reliable manner. The analysis time is thus shortened, without loss of sensitivity.
  • Example 1 following detection of a species of interest, additional iterations can be performed, so as to obtain more precise information as to the genome of each species of interest detected.
  • the invention can be implemented using other types of sequencers allowing the reading and real-time analysis of the DNA fragments present in a sequencing library or directly in the sample.
  • a method has been described whose steps following the sequencing are implemented by a processing unit connected to the sequencer, in particular a unit based on processor(s) or microprocessor(s) and computer memory storing in the form of instructions executable by computer all of the steps 40 to 130 and configured to store the results of the method and the values, parameters and intermediate results.
  • This unit is advantageously connected to a screen for displaying the results of the method according to the invention for the attention of the user, this screen possibly consisting of a screen of a mobile device (e.g. smartphone) connected to the processing unit to receive and display the results.
  • a mobile device e.g. smartphone
  • These steps can be implemented remotely, for example on a remote server connected to the sequencers, either directly or through a laboratory computer system.
  • These steps can also be implemented on a mobile device (e.g.
  • the smartphone, tablet connected to the sequencer, for example a MinlON, the assembly consisting of the MinlON and the mobile device being easily transportable.
  • steps can also be implemented by different processing units. For example, one unit, connected to the sequencer, implements the bioinformatics steps (signal readings, translation into nucleotide bases, assemblies, quality control, etc.) and another processing unit, connected to the first, implements the rest of the process.

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Abstract

L'invention concerne une analyse métagénomique d'un échantillon en vue d'une détection d'une présence d'une espèce d'intérêt dans l'échantillon. L'analyse est effectué de façon itérative. Au cours de chaque itération, on identifie et on dénombre des séquences correspondant à chaque espèce d'intérêt. Les itérations cessent lorsque la présence d'une espèce d'intérêt est confirmée ou lorsqu'un nombre maximal d'itérations sont effectuées. La détection d'une espèce d'intérêt peut être suivie d'une caractérisation plus précise du génome de ladite espèce d'intérêt. La caractérisation met en œuvre des itérations complémentaires.

Description

Description
Titre : Procédé de détection d'une présence d'une espèce biologique d'intérêt par séquençage temps réel itératif.
DOMAINE TECHNIQUE
Le domaine technique de l'invention est l'identification d'une espèce biologique d'intérêt par analyse métagénomique, en mettant en oeuvre une méthode de séquençage en temps réel.
ART ANTERIEUR
Récemment, des techniques de séquençage dites « en temps réel »ont émergées. Ces plates- formes permettent un accès immédiat ou légèrement décalé, aux séquences au fur et à mesure de leur lecture. De plus la quantité de séquences lues n'est plus limitée par la nécessité d'une mobilisation des acides nucléiques sur un support, ce qui permet potentiellement d'avoir accès à l'ensemble des séquences d'acides nucléiques présent dans l'échantillon analysé. Un exemple de méthode est le séquençage de l'ADN par nanopores, telle que mise en oeuvre par les plateformes de séquençage MinlON et GridION de la société Oxford Nanopore Technologies.
Le séquençage de l'ADN par nanopores est basé sur le passage d'une molécule, comportant un brin d'oligonucléotides, à travers un nanopore, ce dernier formant un canal. Lorsque la molécule traverse le canal, une différence de potentiel peut être mesuré, de part et d'autre du canal, qui dépend de la nature de chaque base formant le brin. La différence de potentiel permet une distinction entre les cinq bases standard de l'ADN ou de l'ARN (G, C, T ou U). Ainsi, au cours du passage à travers le nanopore, le brin d'oligonucléotides induit une séquence temporelle de différences de potentiel, à partir de laquelle on détermine la suite des bases formant le brin.
Le document W02021/013900 décrit un procédé de détection d'une espèce d'intérêt, en particulier une bactérie, dans un échantillon. Une espèce de contrôle a été préalablement ajoutée à l'échantillon, selon une quantité connue. Après séquençage, le nombre de séquences correspondant à l'espèce de contrôle est utilisé pour quantifier une concentration d'espèce d'intérêt ou pour déterminer une concentration minimale détectable de l'espèce d'intérêt dans l'échantillon. L'utilisation de l'espèce de contrôle permet de s'assurer que le procédé d'extraction et l'éventuelle amplification des séquences de nucléotides est effectué correctement. La quantité d'espèce de contrôle introduite dans l'échantillon étant connue, elle peut être utilisée pour quantifier une concentration ou une concentration minimale détectable de l'espèce d'intérêt. L'inventeur a adapté le procédé précédemment décrit à l'utilisation de séquenceurs en temps réel délivrant leurs séquences nucléotidiques numériques (également appelés « reads » et correspondant à des séquences d'ADN ou d'ARN) à mesure que les fragments nucléotidiques dans l'échantillon sont lus. En effet, ces derniers permettent d'obtenir un résultat d'analyse plus rapidement, par exemple quelques heures, voire quelques dizaines de minutes.
EXPOSE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est un Procédé de détection d'une espèce biologique d'intérêt potentiellement présente dans un échantillon, l'espèce biologique d'intérêt présentant un génome connu ou partiellement connu, l'échantillon comportant un mélange de différentes espèces biologiques, le procédé comportant les étapes :
- a) ajout d'une espèce de contrôle dans l'échantillon, l'espèce de contrôle présentant un génome connu, l'espèce de contrôle étant ajoutée selon une concentration connue dans l'échantillon ;
- b) extraction des acides nucléiques de l'échantillon ;
- c) séquençage d'une partie des séquences d'acides nucléiques extraites lors de l'étape b) à l'aide d'un séquenceur à temps réel durant une durée prédéterminée ou jusqu'à l'obtention d'un nombre de séquençages prédéterminé ;
- d) suite à l'étape c), assignation de séquences résultant de l'étape c) à l'espèce d'intérêt ainsi qu'à l'espèce de contrôle ;
- e) mise à jour des quantités de séquences respectivement associées à l'espèce d'intérêt et à l'espèce de contrôle, de telle sorte que les quantités de séquences associées à l'espèce de contrôle et à l'espèce d'intérêt sont :
• lors d'une première itération de l'étape e), les quantités de séquences assignées à l'espèce de contrôle et à l'espèce d'intérêt lors de l'étape d) ajoutées à des quantités de séquences initiales ;
• lors de chaque réitération de l'étape e), les quantités de séquences (ng0I, ns l pc) assignées à l'espèce de contrôle et à l'espèce d'intérêt lors de l'étape d) ajoutées aux quantités de séquences associées à l'espèce de contrôle et à l'espèce d'intérêt résultant de l'itération précédente ;
- ^comparaison de la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt mise à jour dans l'étape e) avec un seuil du nombre de séquences ; et/ou comparaison de la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle mise à jour dans l'étape e) avec un seuil de contrôle ;
- g) en fonction d'au moins une comparaison effectuée lors de l'étape f), détection de la présence de l'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon, ou passage à l'étape h) ;
- h) réitération des étapes c) à g) jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt d'itérations.
Selon un mode de réalisation, l'étape d) de chaque itération est effectuée durant une durée prédéterminée ou jusqu'au séquençage d'un nombre prédéterminé de séquences.
Le procédé peut être tel que :
- lors de l'étape f) d'une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt est supérieure au seuil du nombre de séquences;
- lors de l'étape e) de l'itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle est strictement supérieure à zéro ; l'étape g) comporte une estimation d'une concentration de l'espèce d'intérêt en fonction : de la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt lors de la dernière mise à jour (c'est-à-dire lors de la dernière étape e); de la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle lors de la dernière mise à jour ; de la concentration ajoutée de l'espèce de contrôle.
Le procédé peut être tel que :
- lors de l'étape f) d'une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt est supérieure au seuil du nombre de séquences ;
- lors de l'étape e) de l'itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle est nulle ; au cours de l'étape g), la concentration de l'espèce d'intérêt est considérée comme supérieure à la concentration de l'espèce de contrôle.
Le procédé peut être tel que :
- lors de l'étape f) d'une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt est inférieure au seuil du nombre de séquences;
- lors de l'étape f) de l'itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle est supérieure au seuil de contrôle; au cours de l'étape g), si la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt est nulle, la concentration de l'espèce d'intérêt est considérée comme nulle. Le procédé peut être tel que :
- lors de l'étape f) d'une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt est inférieure au seuil du nombre de séquences ;
- lors de l'étape f) de l'itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle est supérieure au seuil de contrôle ; au cours de l'étape g), si la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt est non nulle, l'étape g) comporte une estimation d'une concentration de l'espèce d'intérêt en fonction : de la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt ; de la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle; de la concentration ajoutée de l'espèce de contrôle.
La concentration de l'espèce d'intérêt peut être estimée à partir d'un ratio : où :
LSPC et Lso/sont respectivement les longueurs de génome de l'espèce de contrôle et de l'espèce d'intérêt ;
^soi et gpC sont respectivement les quantités de séquences respectivement associées à l'espèce d'intérêt et à l'espèce de contrôle résultant la dernière mise à jour;
Cspc est la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée dans l'échantillon.
Le procédé peut être tel que, suite à l'atteinte du critère d'arrêt des itérations,
- si la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt est inférieure au seuil du nombre de séquences ;
- et si la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle est inférieure au seuil de contrôle;
- le procédé génère une information selon laquelle ni la présence ni l'absence de l'espèce d'intérêt ne peuvent être confirmées.
Selon une possibilité, le procédé comporte une prise en compte d'un seuil de décision, le procédé visant à comparer une concentration de l'espèce d'intérêt au seuil de décision le procédé étant tel que lors de l'étape a), la concentration de l'espèce de contrôle, est comprise entre 0.01 fois et 100 fois le seuil de décision.
Selon une possibilité, dans l'étape h), le critère d'arrêt des itérations est atteint lorsque : - la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt dépasse le seuil du nombre de séquences;
- et/ou la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle dépasse le seuil de contrôle;
- et/ou la durée cumulée des étapes c) atteint une durée maximale prédéterminée ;
- et/ou le nombre de séquençages cumulés lors des étapes c) atteint un nombre maximal prédéterminé ;
- et/ou le nombre d'itérations atteint un nombre maximal d'itérations prédéterminé.
Selon un mode de réalisation, suite à une détection d'une présence de l'espèce d'intérêt dans l'échantillon, le procédé comporte les étapes : i) séquençage d'une partie des séquences de nucléotides extraites lors de l'étape b) à l'aide du séquenceur temps réel durant une durée prédéterminée ou jusqu'à l'obtention d'un nombre de séquençages prédéterminé ; j) suite à l'étape i), assignation de séquences résultant de l'étape i) à l'espèce d'intérêt détectée; k) mise à jour des quantités de séquences associées à l'espèce d'intérêt, de telle sorte que les quantités de séquences associées à l'espèce d'intérêt sont :
• lors d'une première itération de l'étape k), la quantité de séquences assignées à l'espèce d'intérêt détectée lors de l'étape j) ajoutées à la quantité de séquences résultant de la dernière itération des étapes c) à g) ;
• lors de chaque réitération de l'étape k), la quantité de séquences assignées à l'espèce d'intérêt lors de l'étape j) ajoutées à la quantité de séquences résultant de l'itération précédente de l'étape k) ; l) réitération des étapes i) à k) jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt d'itérations.
Les étapes i) à k) peuvent être réitérées jusqu'à l'atteinte d'un nombre d'itérations prédéterminé.
Selon une possibilité : au cours de chaque itération des étapes i) à k), suite à l'étape k), le procédé comporte une détermination d'une profondeur de séquençage de l'espèce biologique d'intérêt, la profondeur de séquençage correspondant à un ratio entre la longueur cumulée des séquences associées à l'espèce et la longueur du génome de l'espèce ; - les étapes i) à k) sont réitérées jusqu'à l'atteinte d'une profondeur de séquençage prédéterminée.
Selon un mode de réalisation, suite à l'arrêt des itérations des étapes i) à k), une détection d'une séquence type du génome de l'espèce d'intérêt, la séquence type comportant un marqueur d'antibiorésistance ou un marqueur de virulence de l'espèce d'intérêt.
De préférence, le séquenceur est configurer pour effectuer des séquençages successifs de différentes séquences d'acides nucléiques, les unes après les autres, le séquençage de chaque séquence étant considéré comme effectué en temps réel.
Un deuxième objet de l'invention est un dispositif d'analyse métagénomique d'un échantillon, comportant :
- une chambre fluidique, destinée à recevoir l'échantillon ;
- un séquenceur configuré pour effectuer un séquençage temps réel de l'échantillon ;
- une unité de traitement, comportant un module de bio-informatique, programmé pour assigner des séquences résultant du séquenceur à une espèce, et un module de pilotage, programmé pour mettre en oeuvre les étapes c) à h) d'un procédé selon le premier objet de l'invention.
Un troisième objet de l'invention est un support d'enregistrement, lisible par ordinateur, ou téléchargeable, comportant les instructions pour la mise en oeuvre des étapes c) à h) d'un procédé selon le premier objet de l'invention.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous.
FIGURES
Les figures 1 et 2 schématisent les principales étapes d'un procédé selon l'invention.
La figure 1 concerne une phase de détection d'une espèce d'intérêt.
La figure 2 concerne une phase de caractérisation de chaque espèce d'intérêt détectée lors de la phase de détection.
La figure 3 schématise un dispositif configuré pour mettre en oeuvre l'invention.
EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
L'objectif du procédé est de pouvoir détecter la présence d'une espèce biologique d'intérêt SOI dans un échantillon. L'acronyme SOI signifie "Species of Interest". En cas de détection, le procédé peut permettre une quantification absolue de l'espèce d'intérêt SOI, de façon à permettre une comparaison avec un seuil de décision SD. Par espèce biologique, il est entendu un microorganisme, par exemple une bactérie, ou un virus, un champignon, une archéobactérie, une amibe, un protiste, une microalgue. Une espèce biologique peut également être une cellule ou tout autre matériel ou entité comportant un acide nucléique séquençable.
Lorsque l'échantillon est issu d'un organisme humain ou animal, l'espèce biologique d'intérêt peut être une espèce pathogène ou une espèce identifiée comme ayant un impact sur la santé ou le fonctionnement du corps humain ou animal, comme par exemple les espèces bactériennes intestinales, ou les bactéries impactant l'efficacité d'un traitement anti-cancéreux. Lorsque l'échantillon est issu d'un prélèvement dans un procédé industriel ou dans l'environnement, l'espèce biologique d'intérêt peut être une espèce considérée comme contaminante, ou une espèce d'intérêt ayant une importance dans un processus industriel ou dans l'environnement, et dont on souhaite contrôler la présence ou la concentration.
L'espèce d'intérêt présente un génome connu, ou partiellement connu. Le génome, ou sa portion connue, est constitué de séquences, dites séquences d'intérêt.
Le procédé peut adresser simultanément plusieurs espèces d'intérêt. Aussi, le terme une espèce d'intérêt est à interpréter comme signifiant au moins une espèce d'intérêt.
Le seuil de décision SD est un seuil permettant de caractériser une charge de l'espèce biologique d'intérêt, par exemple d'un microorganisme, en fonction de l'application visée. Il est par exemple établi à partir d'une limite réglementaire, ou sanitaire ou industrielle. Par exemple, lorsque l'application est utilisée dans l'aide au diagnostic clinique, l'espèce biologique d'intérêt étant une bactérie, le seuil de décision peut être une concentration en deçà de laquelle la présence de la bactérie correspond à une présence normale, c'est-à-dire un développement non pathologique, et au-delà duquel la présence de la bactérie est considérée comme pathologique, correspondant par exemple à une infection. Lorsque l'invention est appliquée dans un procédé industriel, le seuil de décision peut correspondre à une valeur de conformité, de telle sorte qu'au-delà du seuil de décision, l'échantillon est considéré comme non conforme, et qu'en deçà du seuil de décision, l'échantillon est considéré comme conforme. Quelle que soit l'application, lorsque la concentration de l'espèce biologique d'intérêt est supérieure ou égale au seuil de décision, elle est définie comme étant critique. Dans certaines applications, par exemple dans la fabrication de produits subissant une fermentation, une concentration d'espèce biologique d'intérêt peut être considérée comme critique si elle est inférieure à un seuil de décision, ce dernier correspondant à une concentration minimale admissible de l'espèce biologique. L'échantillon est généralement un échantillon prélevé dans l'environnement, ou dans un organisme, mort ou vivant, ou encore dans un produit agroalimentaire ou manufacturé. L'échantillon peut également avoir été prélevé dans une installation industrielle à des fins de contrôle de procédé. Aussi, l'échantillon comporte différentes espèces biologiques, ne présentant pas le même génome. En particulier, lorsque l'échantillon résulte d'un prélèvement sur un organisme, par exemple un organisme humain ou animal, l'échantillon comporte une quantité significative, voire majoritaire, de cellules provenant de l'organisme sur lequel a été prélevé l'échantillon. Les génomes des organismes humains ou animaux ont une taille 1 000 à 100 000 fois plus importante que les génomes des organismes procaryotes. De plus, l'échantillon comporte généralement des espèces biologiques naturellement présentes dans l'échantillon, et non susceptibles d'entraîner une pathologie ou une contamination critique. Par exemple, lorsque l'échantillon est un prélèvement broncho-alvéolaire, il comporte une flore bactérienne naturellement présente dans les poumons. Lorsque l'échantillon est un prélèvement de selles, il comporte une flore bactérienne naturellement présente dans le tube digestif. En cela, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est une bactérie ou un virus, les acides nucléiques provenant de l'espèce biologique d'intérêt peuvent être minoritaires dans l'échantillon.
L'échantillon comporte des espèces dites "de matrice", endogènes dans l'échantillon, et susceptibles de masquer l'information métagénomique relative à l'espèce biologique d'intérêt. Par exemple, lorsque l'échantillon est prélevé dans un yaourt, dans une viande ou dans un vaccin, il comporte des espèces de matrice représentatives de ces milieux. Dans le cas d'un prélèvement sur un organisme, la matrice comporte les cellules composant l'organisme.
Un aspect important de l'invention est que la présence de l'espèce d'intérêt dans l'échantillon est détectée en mettant en oeuvre un séquenceur temps réel évoqué dans l'art antérieur. Un tel séquenceur permet d'obtenir des données exploitables, relatives aux séquences présentes dans l'échantillon, plus rapidement que les séquenceurs antérieurs. Le séquenceur temps réel est configuré pour collecter successivement des signaux, représentatifs de détections successives de bases d'une même séquence. Ainsi, un séquenceur temps réel est configuré pour générer une séquence en temps réel, au fur et à mesure de son décodage. Des séquençages de différentes séquences présentes dans l'échantillon sont effectués successivement, chaque séquence étant séquencée l'une après l'autre. Cela n'exclut pas le fait que certaines séquences peuvent faire l'objet de séquençages simultanés, en parallèle. Par exemple, lorsque le séquenceur est un séquenceur par nanopores, chaque nanopore « lit » plusieurs séquences différentes en parallèle. Chaque nanopore peut lire plusieurs séquences différentes successivement.
Un autre avantage d'un tel séquenceur est la possibilité d'effectuer une analyse en temps réel des séquences et la quantité de séquences lue est relative à la durée du séquençage. En fonction des résultats de séquençage disponibles, on peut poursuivre ou arrêter le séquençage, ce qui confère un gain de temps et une grande souplesse d'utilisation. Le séquenceur peut être de type à nanopores, comme décrit dans l'art antérieur. D'une façon plus générale, l'invention concerne le recours à un séquenceur configuré pour générer, en temps réel, des séquences, ces dernières étant identifiées suite à leur séquençage. Ainsi, le séquenceur est configuré pour générer séquentiellement une liste de séquences identifiées, ces dernières étant désignées par le terme « reads ». Les listes de reads sont générées à intervalles réguliers, par exemple tous les n minutes, n étant par exemple égal à 10. On peut également paramétrer la quantité de séquences lues dans chaque liste. La quantité de séquences (ou reads) dans chaque liste peut par exemple être égale à 4000.
De même que dans la demande W02021/013900, un des objectifs de l'invention est d'évaluer dans quelle mesure une analyse métagénomique est exploitable. Il s'agit en particulier d'évaluer une conformité de l'ensemble des étapes depuis la préparation de l'échantillon, prélèvement exclu, jusqu'à l'analyse bio-informatique des données de séquençage. A cette fin, une espèce de contrôle, notée SPC, acronyme de Sample Processing Control, est ajoutée dans l'échantillon. Une fonction de l'espèce de contrôle est de permettre un contrôle du bon déroulement des étapes d'extraction d'acides nucléiques et de séquençage, décrites par la suite. L'espèce de contrôle SPC peut être une espèce biologique connue, dont le génome est également connu, de préférence en totalité. L'espèce de contrôle SPC peut être une espèce biologique naturelle. Il peut également s'agir d'une espèce artificielle, par exemple un ARN (acide ribonucléique) encapsidé. De préférence, l'espèce de contrôle SPC n'est pas initialement présente dans l'échantillon prélevé, ou selon une quantité négligeable. De préférence, la teneur en espèce de contrôle SPC initialement présente dans l'échantillon, c'est-à-dire présente avant l'ajout, et de préférence au moins 10 fois inférieure, ou de préférence au moins 100 ou 1 000 fois inférieure à la concentration ajoutée CSPC de l'espèce de contrôle SPC dans l'échantillon. L'espèce de contrôle SPC peut par exemple être une bactérie. Il est important que la concentration CSPC de l'espèce de contrôle SPC ajoutée soit maîtrisée.
L'espèce de contrôle peut être choisie en tenant compte des aspects listés ci-dessous : L'espèce de contrôle doit de préférence se distinguer des organismes naturellement présents dans l'échantillon, ou organismes endogènes, ainsi que de l'espèce d'intérêt recherchée : ainsi, l'outil bio-informatique peut identifier avec précision les séquences issues du séquençage du SPC.
La quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle, au cours du séquençage, doit être suffisante pour pouvoir être détectée de façon correcte, sans pour autant masquer l'information utile, correspondant aux séquences de l'espèce biologique d'intérêt. En d'autres termes, l'espèce de contrôle est de préférence détectable par le séquençage haut débit, tout n'étant pas prépondérante dans l'échantillon. En particulier, lorsqu'on souhaite déterminer une positivité (concentration de l'espèce supérieure au seuil de décision) ou une négativité (concentration de l'espèce inférieure au seuil de décision), il est préférable que l'espèce de contrôle présente au moins une des caractéristiques suivantes: o La taille de son génome est de préférence similaire, ou au moins comparable, à la taille du génome de l'espèce biologique d'intérêt. Plus particulièrement, la taille du génome de l'espèce de contrôle est comprise entre 0.1 fois à 10 fois la taille du génome de l'espèce biologique d'intérêt. o La concentration CSPC de l'espèce de contrôle peut être déterminée en fonction du seuil de décision. La concentration CSPC de l'espèce de contrôle SPC ajoutée peut être par exemple comprise entre 0,001 fois et 1 000 fois, et de préférence entre 0.01 et 100 fois le seuil de décision. o Les acides nucléiques de l'espèce de contrôle SPC subissent un traitement similaire aux acides nucléiques de l'espèce d'intérêt lors des étapes de préparation de l'échantillon, de l'extraction et de séquençage, et de préférence
■ le pourcentage de bases GC (Guanine, Cytosine) est de préférence proche du pourcentage de bases GC de l'espèce biologique d'intérêt ; Par proche de, on entend compris entre 75% et 125%, et de préférence entre 80% et 120 %.
■ l'espèce biologique de contrôle comporte de préférence, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est une bactérie, une membrane ou une paroi cellulaire intègre ou, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est un virus, une enveloppe protéique. Cette condition permet en outre un suivi des étapes de lyse ou de l'extraction des acides nucléiques de l'espèce biologique d'intérêt.
Les séquences de nucléotides de l'espèce de contrôle ne contiennent pas, de préférence, de marqueurs génomiques, comme par exemple des marqueurs de résistance aux antibiotiques, des marqueurs de virulence, de façon à ne pas fausser des résultats d'un éventuel test de sensibilité aux antibiotiques par la présence de tels marqueurs dans le génome de l'espèce biologique d'intérêt. De préférence, les séquences de nucléotides de l'espèce de contrôle ne contiennent pas tout autre gène présentant un intérêt clinique ou industriel et dont la présence est susceptible d'être contrôlée.
L'espèce de contrôle est de préférence aisément manipulable, en particulier : o en étant inoffensive pour l'homme ou l'environnement ; o et/ou en étant résistante à des traitements thermiques de type lyophilisation ou congélation, ce qui facilite le stockage.
L'espèce de contrôle ne doit pas former des spores, ou de façon marginale.
L'espèce de contrôle doit présenter une sensibilité à la lyse proche de celle de l'espèce biologique d'intérêt.
L'espèce de contrôle peut être présente sous la forme de billes, chaque bille comportant une concentration calibrée d'espèce biologique de contrôle sous forme lyophilisée.
Il est précisé qu'une unique espèce de contrôle SPC peut être utilisée, ou que plusieurs espèces de contrôle, de différents types, peuvent être utilisées.
Le procédé comporte tout d'abord une phase de détection d'une espèce d'intérêt, dont les étapes sont à présent, en lien avec la figure 1.
Etape 10 : prélèvement de l'échantillon.
Dans cet exemple, l'échantillon est prélevé dans un organisme humain vivant, à des fins d'aide au diagnostic. Cependant, l'invention ne se limite pas à une application dans le domaine du vivant. L'échantillon peut être prélevé dans un environnement naturel, industriel ou hospitalier, de façon à vérifier une conformité à l'égard d'un seuil de décision.
Etape 20 : ajout de l'espèce de contrôle.
La concentration ajoutée CSPC de l'espèce de contrôle SPC est de préférence connue avec précision, par exemple avec la même précision que celle souhaitée pour la quantification de la ou des espèces d'intérêt. En effet, elle peut permettre, sous réserve que certaines conditions soient remplies, de quantifier la concentration d'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon, l'espèce de contrôle formant alors un calibrateur. Le terme concentration ajoutée désigne la concentration de l'espèce de contrôle dans l'échantillon due à l'ajout de l'espèce de contrôle.
Dans la description des étapes 30 à 60, on se base, à titre d'exemple avantageux, sur l'ajout d'un seul type d'espèce de contrôle dans l'échantillon. L'espèce de contrôle remplit alors la fonction de contrôle qualité des étapes de l'analyse métagénomique, ainsi que la fonction de calibrateur, permettant une quantification éventuelle de la concentration de l'espèce biologique d'intérêt.
A l'issue de l'étape 20, on dispose d'une concentration ajoutée CSPC de l'espèce de contrôle dans l'échantillon. La concentration ajoutée Cspcde l'espèce de contrôle est exprimée, de préférence, en GEq/mL (génome équivalent par mL).
On note que les seuils de détection clinique en bactériologie (e.g. le seuil au-delà duquel une infection est diagnostiquée) sont généralement exprimés en UFC/mL (unité formant une colonie), cependant la méthode de quantification proposé permet de quantifier des acides nucléiques sans informations sur l'équivalence en génome. Il est donc recommandé de déterminer, pour le SPC, la corrélation entre le nombre d'unité formant une colonie par mise en culture par exemple sur un milieu gélosé et l'équivalence en nombre de génomes par exemple par PCR quantitative. Il a par exemple été établi que dans un bioball® B. subtilis strain ATCC 19659 BioBall® MultiShot 10E8 (bioMérieux, Catalog #416721) une unité formant colonie était équivalent à un génome.
La concentration ajoutée peut être définie en fonction du seuil de décision SD. De préférence, la concentration ajoutée CSPC de l'espèce de contrôle est égale au seuil de décision SD, ou proche du seuil de décision SD, par exemple à + 50% près. Ainsi, 0.1 SD < CSpc < 10 SD. L'impact de la concentration ajoutée CSPC de l'espèce de contrôle est décrit par la suite.
Etape 30 : lyse et extraction des acides nucléiques.
Au cours de cette étape, les cellules de l'échantillon, et notamment les cellules de l'espèce biologique d'intérêt et de l'espèce de contrôle, subissent une lyse, pour permettre une extraction de leur ADN. Différentes stratégies peuvent être envisagées : la lyse peut être paramétrée pour cibler préférentiellement l'espèce biologique d'intérêt. Selon un tel scénario, l'espèce de contrôle doit présenter une même sensibilité à la lyse que l'espèce biologique d'intérêt, ou une sensibilité à la lyse considérée comme équivalente. la lyse peut inclure une première lyse, destinée à lyser essentiellement des cellules autres que l'espèce d'intérêt. Une telle première lyse peut par exemple être envisagée lorsque l'espèce biologique d'intérêt est très minoritaire par rapport aux cellules d'une matrice composant l'échantillon. A la suite de la première lyse, les acides nucléiques libérés sont évacués, puis une deuxième lyse est réalisée, visant l'espèce biologique d'intérêt. Selon un tel scénario, l'espèce de contrôle est de préférence résistante à la première lyse, et non résistante à la deuxième lyse.
Suite à la lyse, l'ADN est extrait de l'échantillon par exemple selon le procédé d'extraction décrit dans WO2014/114896.
Etape 40 : séquençage
L'ADN extrait de l'échantillon subit un séquençage à l'aide d'un séquenceur permettant l'accès en temps réel aux séquences lues, par exemple à nanopores. Il peut par exemple s'agir d'un séquenceur de type MinlON ® de Oxford Nanopore Technologies. Le séquenceur est relié à une chambre fluidique dédiée, comportant les nanopores. L'échantillon est introduit dans la chambre fluidique. Le séquenceur est connecté à une unité de traitement permettant l'analyse des séquences identifiées. L'unité de traitement comporte un microprocesseur, configuré pour exécuter des instructions d'un logiciel de bio-informatique, pour identifier les séquences analysées. L'unité de traitement est par exemple un ordinateur de type MinIT, comportant l'environnement informatique dédié au séquençage.
L'invention s'applique particulièrement à des séquenceurs dits « temps réel » présentant les caractéristiques suivantes : une capacité à lire l'ensemble des séquences présentes dans l'échantillon à la différence des séquenceurs se fondant sur une immobilisation des séquences sur un support pour leur lecture, ces séquenceurs séquençant donc un nombre maximal prédéfini de séquences correspondant au nombre d'éléments de fixation des séquences nucléotidiques. Ceci implique notamment que le nombre de séquences produites est proportionnel à la durée de séquençage. une capacité à produire en sortie des données brutes (e.g. des reads ou des signaux bruts comme des potentiels électriques) au fur et à mesure de leur collecte, ou à produire en sortie des données brutes par lots à une fréquence définie par lot de séquences de taille donnée ou régulièrement à une fréquence fixe (par exemple un lot de données brutes par minute ou par dizaine de minutes).
Une particularité du séquençage « temps réel » est que les résultats de lecture des séquences d'ADN ou d'ARN sont disponibles en temps réel en sortie du séquenceur, ou en quasi temps réel. Par quasi temps-réel, on entend que les reads (ou les signaux bruts mesurés comme les potentiels électriques) sont produits en sortie du séquenceur par lots à l'issue d'une durée très inférieure à la durée totale nécessaire au séquençage des acides présents dans l'échantillon ou très inférieure à la durée totale de consommation des réactifs nécessaires au séquençage. Chaque lot peut ainsi être produit en quelques minutes ou quelques dizaines de minutes. Le séquenceur temps réel a la capacité de produire des séquences (reads) en temps réel. Cependant, on attend généralement qu'un certain nombre de séquences aient été décodées, dans un fichier généré à intervalles réguliers. A titre d'exemple, le séquenceur MinlON d'oxford nanopore génère, par défaut, en quasi-temps réel des fichiers de type « ,fast5 » par lots de 4 000 séquences de différences de potentiel qui peuvent être convertis en quasi-temps réel en par un ordinateur en fichier .fastq par lots de 4 000 reads. L'extension ,fast5 désigne des fichiers de données brutes. L'extension .fastq désigne des fichiers stockant des séquences, ainsi que des scores de qualité associés. Cela permet une mise en oeuvre interactive du procédé, de façon à pouvoir arrêter où poursuivre le séquençage en fonction des résultats obtenus.
Le séquençage peut notamment être effectué de façon itérative, chaque itération correspondant à un séquençage d'un nombre de séquences prédéterminé (ou batch) ou à un séquençage effectué durant une durée prédéterminée. Au cours de chaque itération, suite au séquençage, des séquences sont potentiellement assignées à l'espèce de contrôle SPC ou à l'espèce biologique d'intérêt SOI, ou à chaque espèce biologique d'intérêt ou à d'autres espèces présentes dans l'échantillon.
A chaque itération correspond un rang i. i est un entier compris entre 1 et I, I correspondant au nombre maximal d'itérations décrit en lien avec l'étape 70, ou à un nombre maximal de séquences (reads) obtenus. Au cours de chaque itération, le séquençage assigne des nombres de séquences nS l 0I et ns l pc respectivement à l'espèce d'intérêt SOI et à l'espèce de contrôle SPC.
Les étapes suivantes sont décrites en lien avec une espèce d'intérêt SOI. Elles peuvent être mises en oeuvre avec plusieurs espèces d'intérêt différentes.
Etape 50 : Mise à jour du nombre de séquences.
Au cours de cette étape, les nombres de séquences respectivement assignées, lors de l'étape 40, à chaque espèce biologique d'intérêt et à l'espèce de contrôle sont respectivement au nombre de séquences N^, respectivement associées à l'espèce biologique d'intérêt SOI et à l'espèce de contrôle SPC lors de l'itération précédente. Cette étape correspond à une mise à jour du nombre de séquences respectivement associées à l'espèce d'intérêt SOI et à l'espèce de contrôle SPC, selon les expressions : où nS l 0I et ns l pc sont les nombres de séquences respectivement assignées à l'espèce d'intérêt et à l'espèce de contrôle lors de l'étape 40 de l'itération i. La notation nl correspond à un nombre de séquences assigné à une espèce lors de l'itération i, tandis que la notation N1 correspond à un nombre total de séquences associé à une espèce pour l'ensemble des itérations jusqu'à l'itération i.
Lors de la première itération (i = 1), on considère des valeurs initiales N°0I et N°PC prédéterminées, en général nulles : N°0I = N°PC = 0.
Selon une possibilité, les nombres de séquences N 0I ou N PC peuvent être normalisées par une quantité de référence. La quantité de référence peut par exemple être une quantité totale N1 de séquences produites lors du séquençage, jusqu'à l'itération courante i.
Etape 60 : Comparaisons à des seuils
Au cours de cette étape, le nombre Ng0I de séquences associées à chaque espèce d'intérêt SOI est comparé à un seuil du nombre de séquences Ssoi, qui correspond au nombre minimum de reads associé à l'espèce d'intérêt SOI nécessaire pour arrêter le séquençage et débuter l'interprétation quantitative relative à la présence de l'espèce d'intérêt dans l'échantillon. Le seuil du nombre de séquences correspond à un seuil du nombre de séquences, ou seuil du nombre de reads, associés à l'espèce d'intérêt.
Le nombre N^PC de séquences associées à l'espèce de contrôle SPC est comparé à un seuil de contrôle Sspc. qui correspond au nombre minimum de reads associé au SPC pour arrêter le séquençage quand le nombre de reads associé à chacun des SOI n'atteint pas le seuil du nombre de séquences Ssoi.
- Lorsque N^OI < Ssoi et N PC < Sspc cf. étape 61 ;
Lorsque N 0I > Ssoi et N PC > 0 : cf. étape 62 ;
Lorsque Ng0I > Ssoi et N^PC = 0 : cf. étape 63 ;
- Lorsque N^OI < Ssoi et N PC > Sspc cf. étape 64 La détermination du seuil du nombre de séquences et du seuil de contrôle sont décrits par la suite.
Etape 61
Au cours de cette étape, on ne peut rien conclure quant à la présence de l'espèce d'intérêt SOI dans l'échantillon. Une nouvelle itération des étapes 40 à 60 est nécessaire, sauf si un critère d'arrêt des itérations est atteint, tel que décrit en lien avec l'étape70
Etape 62 : Au cours de cette étape, il est possible de conclure à la présence de l'espèce d'intérêt SOI dans l'échantillon et de quantifier sa concentration, par exemple par l'expression : où :
LSPC et Lso/sont respectivement les longueurs de génome de l'espèce de contrôle et de l'espèce biologique d'intérêt. a est un facteur de correction déterminé de façon empirique, sur la base d'échantillons d'apprentissage dont la concentration en espèce biologique d'intérêt est connue. Le facteur de correction a permet de prendre en compte des différences d'efficacité du processus de séquençage de l'espèce biologique d'intérêt et de l'espèce de contrôle. Par défaut, on peut considérer a = 1. Cette valeur unitaire permet d'obtenir une quantification absolue suffisante pour déterminer la positivité ou la négativité d'un échantillon par rapport au seuil de décision.
Lorsque la concentration ajoutée est exprimée en GEq/mL, la concentration de l'espèce biologique d'intérêt est également exprimée dans la même unité.
Etape 63
Au cours de cette étape, on considère que l'espèce d'intérêt est présente dans l'échantillon, à une concentration supérieure à la concentration de l'espèce de contrôle mais il n'est pas possible d'en déterminer la concentration absolue.
Csoi » CSPC (4)
Etape 64
Au cours de cette étape, si N 0I = 0, il est possible de conclure en l'absence de l'espèce d'intérêt SOI dans l'échantillon. Sinon il est possible de quantifier sa concentration, avec la formule décrite dans l'étape 62. Etape 70 : Les étapes 40 à 60 sont réitérées, jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt des itérations. De préférence, chaque itération i correspond à une durée de séquençage prédéterminée, et de préférence identique pour chaque itération, ou à un nombre prédéterminé de séquences lues (nombre de reads).
Le critère d'arrêt d'itérations est considéré comme atteint lorsque les conditions menant aux étapes 62 ou 63 ou 64 sont atteintes.
Le critère d'arrêt des itérations peut également être un nombre d'itérations égal à un nombre maximal d'itérations I, ce dernier ayant été prédéterminé. Par exemple, le critère d'arrêt des itérations est considéré comme atteint lorsque la durée de séquençage est supérieure ou égale à une durée prédéterminée, par exemple 12 heures, ou lorsque le nombre total de séquences issues du séquenceur est supérieur à un nombre maximal prédéterminé.
Etape 80 Alerte.
L'étape 80 est effectuée si NP0I < Ssoi et NPPC < Sspc, c'est-à-dire suite à la dernière itération de rang I, les nombres de séquences respectivement associées à l'espèce d'intérêt et au contrôle sont respectivement inférieurs au seuil du nombre de séquences et au seuil de contrôle. Dans ce cas, un signal d'alerte est émis, indiquant que la présence ou l'absence de l'espèce d'intérêt dans l'échantillon ne peut être confirmée.
Etape 90 Arrêt
Suite à l'étape 70 ou à une éventuelle étape 80, le procédé peut être arrêté.
Selon une possibilité, plusieurs espèces d'intérêt, différentes l'une de l'autre, sont analysées simultanément. Lorsqu'une des conditions indiquées dans les étapes 62, 63 et 64 est rencontrée, le séquençage peut être stoppé et chaque espèce d'intérêt est interprétée selon ces critères.
De façon optionnelle, après que la présence d'une espèce d'intérêt dans l'échantillon a été reportée, suite aux étapes 62 ou 63 ou 64, il est possible de disposer d'informations génomiques complémentaires quant à l'espèce d'intérêt identifiée. Il peut notamment s'agir de la présence d'un marqueur spécifique dans le génome, par exemple un marqueur d'antibiorésistance ou d'un marqueur de virulence. Les marqueurs d'antibiorésistance ou de virulence sont connus.
Les étapes itératives 100 à 130, décrites ci-après, en lien avec la figure 2, peuvent être mises en oeuvre pour confirmer la présence du marqueur spécifique dans le génome de l'espèce d'intérêt identifiée. Si i' désigne le rang de l'itération lors de laquelle le critère d'arrêt d'itérations de l'étape 70 a été atteint, les étapes 100 à 130 sont mises en œuvre pour ir < i < 1 .1 correspond au rang de la dernière itération.
Etape 100
Cette étape est similaire à l'étape 40. Seules les séquences correspondant à chaque espèce d'intérêt SOI détectée suite aux itérations des étapes 40 à 80 sont dénombrées.
Etape 110
Cette étape correspond à l'étape 50, si ce n'est qu'on procède à une mise à jour du nombre de séquences de chaque espèce d'intérêt selon l'expression : . oi = oi + nsoi (1)
Etape 120 : réitération des étapes 100 à 110, sauf si un critère d'arrêt d'itérations est atteint. Le critère d'arrêt des itérations peut être l'atteinte d'un nombre maximal d'itérations I. On rappelle que ce dernier peut correspondre à une durée de séquençage maximale ou à un nombre maximal de séquences identifiées.
Selon une possibilité, on détermine, au cours de chaque itération, une profondeur de séquençage de l'espèce d'intérêt SOI. La profondeur de séquençage correspond à un ratio entre la longueur cumulée des séquences associées à l'espèce d'intérêt et la longueur du génome de l'espèce d'intérêt. Lorsque la profondeur de séquençage atteint une profondeur seuil, le critère d'arrêt des itérations est atteint. Les itérations sont arrêtées.
Etape 130 : Caractérisation
Au cours de cette étape les séquences correspondant au marqueur recherché sont identifiées et dénombrées.
Détermination du seuil du nombre de séquences Ssoi et du seuil de contrôle SSPC
La mise en œuvre du procédé préalablement décrit suppose une détermination préalable : du seuil du nombre de séquences Ssoi, auquel le nombre de séquences de l'espèce d'intérêt Ng0I est comparé lors de chaque étape 60 ; et du seuil de contrôle Sspc, auquel le nombre de séquences de contrôle N^PC est comparé lors de chaque étape 60.
On a estimé les durées de séquençage nécessaires pour produire des nombres de reads correspondant à l'espèce d'intérêt SOI respectivement égales à 1, 10, 100, 1 000 et 10 000, et cela en prenant en compte différentes concentrations CS0I de l'espèce d'intérêt SOI dans l'échantillon. La durée de séquençage TTR (Time to Result) est estimées selon l'expression :
OÙ :
Ssoi est le seuil du nombre de séquences ;
CADNtot est la concentration totale d'ADN dans l'échantillon : cela inclut les concentrations de l'espèce d'intérêt, de l'espèce de contrôle et de l'ADN sans intérêt (ADN humain et flore commensale) ;
Rfastq est une quantité de reads obtenue lors de chaque itération c'est-à-dire dans chaque fichier .fastq généré. Par exemple, Rfastq = 4 000.
Tfastq est une durée moyenne de séquençage pour obtenir un fichier .fastq comportant une quantité de reads égale à Rfastq ;
Nsampie est Ie nombre d'échantillons séquencés simultanément. Nsampie correspond à une proportion d'ADN séquencée que l'on peut attribuer à l'échantillon. Nsampie est différent de 1 lorsque différents échantillons sont séquencés simultanément. Dans ce cas, Nsampie désigne la quantité totale d'ADN séquencée divisée par la quantité d'ADN dans l'échantillon considéré.
Le tableau 1 donne la durée de séquençage (en HH :M M) qui est calculée en fonction du seuil du nombre de séquences Ssoi, et de la concentration CS0I d'espèce d'intérêt SOI exprimée en fonction du seuil de décision SD. On a considéré que l'espèce de contrôle a été ajoutée selon une concentration CSPC=SD et que la somme de l'ADN humain et de la flore commensale équivalait à 100SD. La quantité d'ADN totale est alors égale à CADNtot = 101SD + CS0I. L'échantillon est considéré comme séquencé en même temps que trois autres échantillons (NSampie=4), chacun des échantillons étant séquencé avec une quantité équivalente d'ADN avec un séquenceur qui génère des fichiers de reads comportant Rfastq = 4 000 reads avec une fréquence d'environ Tfastq = 3 minutes.
Tableau 1
Dans le tableau 1, on observe que lorsque la concentration CS0I est égale au seuil de décision SD, la valeur du seuil du nombre de séquences Ssoi ne doit pas excéder 100 si on souhaite atteindre le seuil du nombre de séquences Ssoi en 30 minutes de séquençage. En effet, plus le seuil du nombre de séquences Ssoi est élevé, plus la durée d'analyse augmente. Logiquement, plus le seuil du nombre de séquences Ssoi est élevé, plus la durée pour l'atteindre l'est également. Une valeur Ssoi = 1 est atteinte rapidement, même pour des concentrations faibles d'espèce d'intérêt. Toutefois, le fait d'adopter une valeur trop faible de Ssoi augmente le risque de faux positif et nuit à la précision de la quantification.
De plus, une valeur trop faible limite la possibilité de détection d'autres espèces d'intérêt potentiellement présentes à des concentrations plus faibles. Par exemple l'utilisation d'un seuil du nombre de séquences Ssoi égal à 100 permet la détection à partir d'un seul read d'une autre espèce d'intérêt SOI' présent à une concentration 100 fois inférieure. Ainsi, un seuil du nombre de séquences Ssoi élevé peut être particulièrement intéressant si un SOI majoritaire est présent à une concentration supérieure à 100 fois le SD : cela permet la détection d'autres SOI minoritaires, notés SOI', à une concentration jusqu'à 100 fois inférieure à SOI mais supérieure au seuil de décision SD.
En se basant sur les résultats présentés dans le tableau 1 , on conclut que le seuil du nombre de séquences Ssoi est de préférence compris entre 5 et 500 ou entre 50 et 500. Lorsque l'on privilégie une courte durée d'analyse, on choisit un seuil du nombre de séquences Ssoi relativement faible, proche de 50, voire inférieure, sachant qu'un seuil du nombre de séquences trop faible est propice à des faux positifs. Lorsque l'on privilégie la dynamique de mesure, et la possibilité de détecter simultanément différentes espèces d'intérêt, présentes dans différentes concentrations, on choisit un seuil du nombre de séquences Ssoi plus élevé, proche ou supérieure à 500, au détriment de la durée d'analyse.
On a étudié l'influence du seuil de contrôle Sspc sur la mise en oeuvre du procédé. En l'absence de l'espèce d'intérêt, d'importantes quantités d'ADN peuvent-être présentes dans l'échantillon. Dans un échantillon clinique, l'ADN peut avoir diverses origines, par exemple l'ADN provenant des cellules du patient et de la flore commensale. L'ADN peut aussi résulter d'une infection atypique : la concentration d'ADN génomique d'un microorganisme autre que les SOI peut donc atteindre des quantités très supérieures au seuil de décision SD. Le tableau 2 donne, pour différentes concentrations d'ADN CADN, exprimées relativement au seuil de décision SD, la durée de séquençage permettant d'obtenir un nombre de séquences correspondant à l'espèce de contrôle supérieur au seuil de contrôle Sspc. On a supposé que la concentration d'espèce d'intérêt CS0I correspond au seuil de décision SD. L'objectif est de déterminer l'effet de la variation du seuil de contrôle Sspc sur la durée de séquençage d'un échantillon dans lequel le SOI n'est pas détecté.
Tableau 2
On observe qu'un seuil de contrôle Sspc compris entre 5 et 3125 est atteint en moins de 30 minutes de séquençage lorsque la concentration d'ADN est équivalente à SD (CADN = SD). Il est donc possible de conclure pour ces échantillons en l'absence de SOI en moins de 30 minutes de séquençage.
Dans les cas où la concentration d'ADN excède SD, la durée de séquençage augmente significativement, il est donc nécessaire de choisir un seuil de contrôle qui ne soit pas trop élevé pour pouvoir rendre un résultat négatif pour la détection de l'espèce d'intérêt SOI. Par exemple dans le cas d'un échantillon clinique ayant une infection atypique avec une concentration du pathogène équivalente à 10005D, un seuil de contrôle SSPC= Z5 ne permet pas de rendre un résultat négatif pour la détection de l'espèce d'intérêt SOI avant au moins 6h de séquençage. Il est cependant recommandé de ne pas choisir un seuil du nombre de séquences Ssoi trop faible pour permettre au séquenceur de produire suffisamment de reads pour permettre la détection des SOI et d'identifier une autre espèce, différente de l'espèce d'intérêt, mais dont il peut être intéressant de rapporter la présence à une concentration supérieure à SD. Cette situation peut survenir dans le cadre d'une infection atypique.
Détermination de la concentration ajoutée d'espèce de contrôle CSPC
Dans les paragraphes précédents, l'espèce de contrôle SPC était présente selon une concentration Cspc égale au seuil de décision SD. L'inventeur a évalué l'effet d'une variation de la concentration ajoutée Cspc de l'espèce de contrôle.
Le tableau 3 indique pour différentes concentrations de SPC ajouté dans l'échantillon (Cspc= 0,0151) ; CSPC=SD et Cspc= 1005Z)) la durée ( H H : M M ) nécessaire pour le rendu de résultat ainsi que le résultat de détection pour différentes concentrations CS0I de SOI comprises entre 0,000150 et 10000 SD.
Dans la colonne «Résultats » :
La présence de concentrations exprimées par rapport au seuil de décision SD dans les colonnes « Résultats » indique que la détection de reads du SOI (Ng0I > 0) et du SPC (Ngpc > 0) a permis le calcul de cette concentration. Cela correspond à l'étape 62 ou à l'étape 64 avec N 0I > 0.
La mention « NEG » indique qu'aucun read n'a été associé au SOI (Ng0I = 0) mais que le nombre de reads associé au SPC excède le seuil de contrôle fixé à 25 (NgPC > 25). Cela correspond à l'étape 64 avec Ng0I = 0.
La mention « >SPC » indique qu'aucun read n'a été associé au SPC (NgPC = 0) mais que le nombre de reads associé au SOI (Ng0I > 100) excède le seuil du nombre de séquences Ssoi fixé à 100. Dans ces conditions il n'est pas possible de calculer la concentration CS0I de l'espèce d'intérêt, mais cette dernière peut être considérée comme étant supérieure à la concentration de l'espèce de contrôle Cspc. Cela correspond à l'étape 63. On a tout d'abord pris en compte une faible concentration Cspc, égale à 0,0151). Lorsque CS0I > O,1SD, on retrouve sensiblement les mêmes durées que dans le tableau 1. Ainsi, la quantité ajoutée de SPC n'influe pas sur la durée pour atteindre le seuil du nombre de séquences Ssoi. Cependant l'absence de reads du SPC ne permet pas le calcul de la concentration du SOI, et la mention « >SPC » n'est pas suffisante pour permettre la comparaison de cette concentration par rapport à SD. Lorsque la concentration CS0I < 0,015Z), il est necessaire de sequencer plus de 12 heures pour pouvoir rendre un résultat CS0I < SD. Dans ce contexte si la durée totale de séquençage est limitée à 12h, il n'est pas possible de rendre des résultats négatifs pour ces échantillons.
Tableau 3
Une concentration Cspc égale au seuil de décision augmente la limite de détection par rapport à une concentration Cspc < 0.01 SD. Cependant, cela permet une quantification de la concentration de l'espèce d'intérêt selon une plus grande dynamique : entre 0.01SD et 1000SD. On a ensuite considéré une concentration Cspc élevée, égale à 100 fois le seuil de décision SD. La forte quantité de SPC permet un rendu de résultat très rapide car dans la gamme de concentrations de SOI évaluée le résultat est rendu seulement 3 minutes après le début du séquençage. Cependant on observe une augmentation de la limite de détection d'au moins 10 fois par rapport aux essais réalisé avec une concentration ÇPC=SD. Cela peut se comprendre par le faite que la forte présence de SPC réduit d'autant le nombre de reads associés au SOI. Ainsi, la sensibilité est diminuée.
L'ajout d'une grande quantité de SPC permet également de rendre un résultat quantitatif sur une plus large gamme que pour les plus faibles concentrations.
Il est donc possible de sélectionner les différents paramètres d'analyse, tels que : la concentration Cspc de l'espèce de contrôle ajoutée dans l'échantillon ; le seuil du nombre de séquences Ssoi; le seuil de contrôle du Sspc ;
Le paramétrage permet d'adapter les performances du procédé précédemment décrit en termes de rapidité de séquençage, de dynamique de quantification et de la sensibilité requise.
Par exemple dans le cadre d'un diagnostic clinique nécessitant une détection rapide avec une forte sensibilité de détection ainsi qu'une précision de la quantification des SOI détectées autour du seuil de décision clinique il est avantageux d'ajouter le SPC à une concentration proche du seuil de décision clinique Cspc « SD (par exemple Cspc compris entre 0.1SD et 10 SD voire entre 0.01 SD et 100SD) avec un seuil du nombre de séquences Ssoi compris entre 5 et 500 et un seuil de contrôle Sspc compris entre 5 et 125.
Exemple 1
Au cours d'un premier exemple, on a utilisé Bacillus subtilis en tant qu'espèce de contrôle pour le séquençage métagénomique d'échantillons résultant de lavages broncho-alvéolaire (BAL) pratiqués sur patients humains. On sait que ce type d'échantillon est susceptible de comporter une quantité importante d'ADN humain provenant du patient. 38 échantillons ont été séquencés. La durée maximale de séquençage était fixée à 12 heures. Chaque itération regroupait 4000 reads.
Le volume de chaque échantillon était de 600 pL. L'espèce de contrôle a été ajoutée selon une concentration de 1.7E4 CFU/mL, CFU signifiant Colony-Forming Unit (Unité formant colonies). Ce seuil est considéré comme légèrement au-dessus d'un seuil clinique séparant une présence normale de bactéries d'une présence de bactéries représentative d'une infection.
Afin d'éliminer l'ADN du patient, le protocole d'analyse comporte une élimination de l'ADN du patient au cours d'une première lyse. Lors de la première lyse, l'échantillon a été traité avec un agent lysant ciblant spécifiquement les cellules du patient. Un tel agent lysant est par exemple décrit dans WO2014/114896. L'ADN libéré a ensuite été éliminé par action enzymatique et lavage. L'échantillon a ensuite fait l'objet d'une deuxième lyse, mécanique et chimique de manière à extraire l'ADN bactérien. La lyse mécanique a été effectuée à l'aide d'une agitation, de durée 20 minutes, en utilisant des billes de verre de diamètre 1 mm ainsi que des microbilles de Zr/Si de diamètre 0.1 mm. L'ADN a été extrait du lysat en utilisant la plateforme easyMAG (Biomérieux). Le volume résultant de l'élution était de 25 pL. Les extraits d'ADN ont été stockés à -20 °C. La préparation des librairies de séquençage et le barcoding des fragments d'ADN ont été effectués en utilisant le kit « Rapid PCR Barcoding kit » (Oxford Nanopore Technologies). 4 échantillons ont été traités en parallèle. Le séquençage a été effectué avec le séquenceur MinlON (Oxford Nanopore Technologies), relié à un ordinateur MinIT (Oxford Nanopore Technologies). Les données de séquençage ont été traitées par le logiciel WIMP (What is in my Pot ?) de la suite EPI2ME (Oxford Nanopore Technologies). Ce logiciel permet une séparation des séquences de chaque échantillon à l'aide des barcodes (codage à barre par marqueur moléculaire, chaque échantillon étant assigné d'un label permettant de l'identifier), une identification des espèces bactériennes ou virales ou fongiques correspondant à chaque séquence lue « read », ainsi qu'un comptage du nombre de read associé à chacune des espèces identifiées .
Les étapes 40 à 70 ont été réitérées par séries de 4 000 reads. Les seuils de détection respectivement associés à l'espèce d'intérêt et à l'espèce de contrôle étaient de 100 reads et de 25 reads. On a pris en compte 20 espèces d'intérêt différentes : Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Hafnia alvei , Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Morganella morganii, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Legionella pneumophila, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae.
Lorsque les concentrations de chaque espèce d'intérêt ont été quantifiées, les concentrations ont été comparées à un seuil métagénomique de 5.53 GEq/mL. Il s'agit d'un seuil de décision, permettant de conclure à la présence pathologique d'une espèce d'intérêt dans un échantillon résultant de BAL.
Les 38 échantillons ont été analysés. Lorsqu'au moins une espèce d'intérêt SOI était détectée, la durée médiane de séquençage était 28,5 minutes par échantillon. Cela correspond à la durée de séquençage nécessaire à l'obtention de la condition Ng0I > 100 pour au moins une des espèces d'intérêt.
En l'absence de détection d'au moins une des espèces d'intérêt, (Ng0I < 100 et N PC > 25), la durée médiane de séquençage était de 2 heures et 13 minutes. La condition N PC > Sspc permet de s'assurer que le séquençage s'est convenablement effectué. Cela permet de s'assurer qu'un échantillon négatif soit bien un vrai négatif. On a comparé les résultats du séquençage selon le procédé précédemment décrit avec un séquençage de même type, effectué durant une durée fixe de 12 heures. Le tableau 4 résume les principaux résultats obtenus. Les performances de chaque méthode ont été comparées en analysant chaque échantillon par la méthode de référence : la culture microbienne.
Tableau 4.
Les sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive (usuellement désignée PPV : Positive Predictive Value), valeur prédictive négative (usuellement désignée NPV : Negative Predictive Value) résultent du nombre des quantités de vrais positifs, faux positifs, vrais négatifs, faux négatifs.
On observe que le procédé a des performances équivalentes, voir meilleures que celles obtenues avec un séquençage de 12h. Il a permis la détection de l'ensemble des infections avec un gain de temps médian supérieur à 11 heures et 30 minutes. De plus en l'absence d'infection par la totalité des espèces d'intérêt, la détection du SPC permet de confirmer le bon fonctionnement du procédé en une durée médiane de 2 heures et 13 minutes et de produire un résultat de détection négative.
On observe 4 faux négatifs, cependant ces échecs de détection ne sont pas à attribuer au procédé décrit. 2 des 4 faux négatifs n'ont pas été détectés par PCR, il semble donc qu'il s'agisse de faux positifs de culture ou d'erreur d'identification de l'espèces par la méthode de référence. Les 2 autres faux négatifs correspondent à l'espèce S. marcescens qui ont produit un nombre de read inférieure à 100 et qui ont été quantifiés à des concentrations inférieures au seuil de décision clinique. Ces 2 discordance entre le procédé et la méthode de référence ont été confirmées par la PCR. L'augmentation de la durée de séquençage à 12 heures ne permet pas d'améliorer la détection de ces 2 infections par S. marcescens et laisse supposer à une erreur induite par le logiciel WIMP utilisé pour l'assignation des séquences
On observe que le procédé permet une amélioration des performances du test, en abaissant le nombre de faux positifs, ce qui améliore la spécificité et la valeur prédictive positive. Cela est dû à l'arrêt opportun du séquençage lorsqu'on dispose de suffisamment d'informations pertinentes, c'est-à-dire au moment où Ng0I > Ssoi ou lorsque N^PC > Sspc. Dès qu'un de ces seuils est franchi, les itérations cessent et une quantification de la concentration (ou de la concentration minimale) de l'espèce d'intérêt peut être effectuée. On observe qu'il n'est pas utile, ni même souhaitable, de poursuivre les itérations jusqu'au nombre d'itérations maximal initialement fixé, qui correspondait à une durée totale de 12 heures. En effet, l'obtention d'un trop grand nombre de séquences de l'espèce d'intérêt peut induire des faux positifs.
Exemple 2
Dans un deuxième exemple, on a utilisé le même protocole que décrit en lien avec le premier mode de réalisation. On a analysé 11 échantillons de BAL, préparés comme précédemment décrit. Les 11 échantillons avaient été préalablement analysés par culture bactérienne et s'étaient avérés positifs à au moins une espèce d'intérêt, avec une concentration supérieure à 1E4 CFU/mL. Les 11 échantillons ont été analysés de façon à identifier au moins une des 20 espèces d'intérêt précédemment listées. On a mis en oeuvre les étapes itératives 40 à 80. Sur les 11 échantillons, 6 ont été considérés comme positifs pour au moins une espèce d'intérêt en moins de 30 minutes de séquençage.
Cependant, une quantité de 100 séquences pour chaque espèce d'intérêt détectée est trop faible pour parvenir à une caractérisation fine de leur génome. Les étapes itératives 100 à 120 ont été mises en oeuvre sur les échantillons, de façon à identifier la présence d'éventuels marqueurs d'antibiorésistance dans le génome. Les étapes itératives 100 à 120 ont été effectuées jusqu'à obtenir une durée totale de séquençage de 12 heures.
Sur le tableau 5 : la première colonne (ref) correspond à la référence de chaque échantillon ; la deuxième colonne (SOI) correspond à chaque espèce d'intérêt détectée ; la troisième colonne (méthode) correspond à la méthode de détection : culture ou mise en oeuvre de l'invention ; la quatrième colonne (Csoi) correspond à la concentration mesurée ou estimée de chaque espèce bactérienne détectée, la cinquième colonne (prof.) correspond à la profondeur de séquençage, telle que précédemment décrite. la sixième colonne (TTR ID) correspond à la durée, selon le format « heure :minute » des étapes 40 à 80, pour la confirmation de la présence de l'espèce d'intérêt dans l'échantillon. On observe que la durée est comprise entre 3 minutes (échantillon Cl- 026) et 8 heures 37 (échantillon Cl-060). 6 échantillons ont été considérés positifs en moins de 30 minutes. les colonnes suivantes correspondent à la présence d'un marqueur d'antibiorésistance à l'égard de 21 agents antibiotiques. La lettre R indique une résistance observée à l'antibiotique par la culture ou prédite par la présence d'un marqueur tandis que la lettre S indique une sensibilité observée par la culture. Il n'est pas possible de se prononcer sur la sensibilité à un antibiotique en se basant sur l'absence de marqueurs de résistance à celui-ci. C'est la raison pour laquelle il n'y a pas de lettre S dans les lignes correspondant à la mise en oeuvre de l'invention. Une lettre R grisée indique la présence d'un marqueur d'antibiorésistance révélée par le séquençage, mais non confirmée par la culture bactérienne (lettre S grisée) : il s'agit donc d'un faux positif résultant du séquençage. Une lettre R blanche sur fond noir indique une présence d'un marqueur d'antibiorésistance révélée par la culture bactérienne, mais non détectée par le séquençage : il s'agit d'un faux négatif résultant du séquençage. On dénombre 9 faux négatifs.
Sur les 9 faux négatifs (lettre R blanche sur fond noir), 8 résultent d'échantillons pour lesquels la profondeur de séquençage est faible, c'est-à-dire inférieure à 30. Il est donc probable que le taux de faux négatifs puisse être réduit en poursuivant le séquençage jusqu'à l'atteinte d'un seuil de profondeur de séquençage, ce dernier pouvant être égal à 30 dans cet exemple.
On comprend qu'un avantage notable de l'invention réside dans la possibilité d'obtenir, au fur à mesure des itérations, une information de plus en plus précise quant à la constitution de l'échantillon. Lorsqu'il s'agit de déterminer la présence d'espèces d'intérêt, l'invention permet d'optimiser la durée d'analyse, en stoppant les itérations dès qu'une espèce biologique d'intérêt est détectée de façon suffisamment fiable. La durée d'analyse ainsi est raccourcie, sans perte de sensibilité.
Comme montré dans l'exemple 1, suite à une détection d'une espèce d'intérêt, des itérations complémentaires peuvent être effectuées, de façon à obtenir une information plus précise quant au génome de chaque espèce d'intérêt détectée.
Bien que décrite avec un séquençage effectué à l'aide d'un séquenceur MinlON (Oxford Nanopore Technologies), l'invention peut être mise en oeuvre à l'aide d'autres types de séquenceurs permettant la lecture et l'analyse temps réel des fragments d'ADN présent dans une libraire de séquençage ou directement dans l'échantillon.
Il a été décrit un procédé dont les étapes suivant le séquençage sont mises en oeuvre par une unité de traitement connectée au séquenceur, notamment une unité à base de processeur(s) ou microprocesseur(s) et de mémoire informatique mémorisant sous forme d'instructions exécutables par ordinateur l'ensemble des étapes 40 à 130 et configurée pour mémoriser les résultats du procédé et les valeurs, paramètres et résultats intermédiaires. Cette unité est avantageusement connectée à un écran pour l'affichage des résultats du procédé selon l'invention à l'attention de l'utilisateur, cet écran pouvant être constitué d'un écran d'un appareil mobile (e.g. smartphone) connectée à l'unité de traitement pour recevoir et afficher les résultats. Ces étapes peuvent être mises de manière déportée, par exemple sur un serveur distant connecté aux séquenceurs, soit directement, soit au travers d'un système informatique de laboratoire. Ces étapes peuvent également être mises en oeuvre sur un appareil mobile (e.g. smartphone, tablette) connecté au séquenceur, par exemple un MinlON, l'ensemble constitué du MinlON et de l'appareil mobile étant aisément transportable. Ces étapes peuvent également être mises en oeuvre par différentes unités de traitement. Par exemple une unité, connectée au séquenceur, met en oeuvre les étapes de bioinformatiques (lectures des signaux, traduction en bases nucléotidiques, assemblages, contrôle qualité...) et une autre unité de traitement, connectée à la première, met en oeuvre le reste du procédé.

Claims

REVENDICATIONS Procédé de détection d'une espèce biologique d'intérêt (SOI) potentiellement présente dans un échantillon d'analyse, l'espèce biologique d'intérêt présentant un génome connu ou partiellement connu, l'échantillon comportant un mélange de différentes espèces biologiques, le procédé comportant les étapes :
- a) ajout d'une espèce de contrôle (SPC) dans l'échantillon, l'espèce de contrôle présentant un génome connu, l'espèce de contrôle étant ajoutée selon une concentration (CSPC) connue dans l'échantillon ;
- b) extraction des acides nucléiques de l'échantillon ;
- c) séquençage d'une partie des séquences d'acides nucléiques extraites lors de l'étape b) à l'aide d'un séquenceur à temps réel durant une durée prédéterminée ou jusqu'à l'obtention d'un nombre de séquençages prédéterminé ;
- d) suite à l'étape c), assignation de séquences (n 0/, nS l PC) résultant de l'étape c) à l'espèce d'intérêt ainsi qu'à l'espèce de contrôle ;
- e) mise à jour des quantités de séquences (Ns0I, NsPC) respectivement associées à l'espèce d'intérêt et à l'espèce de contrôle, de telle sorte que les quantités de séquences associées à l'espèce de contrôle et à l'espèce d'intérêt sont :
• lors d'une première itération de l'étape e), les quantités de séquences assignées à l'espèce de contrôle et à l'espèce d'intérêt lors de l'étape d) ajoutées à des quantités de séquences initiales (NP0I, NPPC) ;
• lors de chaque réitération de l'étape e), les quantités de séquences (nS l 0I, nS l PC) assignées à l'espèce de contrôle et à l'espèce d'intérêt lors de l'étape d) ajoutées aux quantités de séquence (NP0/ , NPpP ) associées à l'espèce de contrôle et à l'espèce d'intérêt résultant de l'itération précédente ;
- f)comparaison de la quantité de séquence associées à l'espèce d'intérêt (NP0I) mise à jour dans l'étape e) avec un seuil du nombre de séquences (Ssoi) et/ou comparaison de la quantité de séquence associées à l'espèce de contrôle (Nppc) mise à jour dans l'étape e) avec un seuil de contrôle (Sspc) ;
- g) en fonction d'au moins une comparaison effectuée lors de l'étape f), détection de la présence de l'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon ou passage à l'étape h) ;
- h) réitération des étapes c) à g) jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt d'itérations.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape d) de chaque itération est effectuée durant une durée prédéterminée ou jusqu'au séquençage d'un nombre prédéterminé de séquences.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
- lors de l'étape f) d'une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (NSoi) est supérieure au seuil du nombre de séquences (Ssoi) ;
- lors de l'étape e) de l'itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle (NSPC) est strictement supérieure à zéro ; l'étape g) comporte une estimation d'une concentration de l'espèce d'intérêt (Csoi) en fonction : de la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (Ng0I) lors de la dernière mise à jour; de la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle (NgPC) lors de la dernière mise à jour ; de la concentration ajoutée de l'espèce de contrôle (CSPC).
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
- lors de l'étape f) d'une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (Ng0I) est supérieure au seuil du nombre de séquences (Ssoi);
- lors de l'étape e) de l'itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle (NgPC) est nulle ; au cours de l'étape g), la concentration de l'espèce d'intérêt (CS0I) est considérée comme supérieure à la concentration de l'espèce de contrôle (Cspc).
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
- lors de l'étape f) d'une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (Ng0I) est inférieure au seuil du nombre de séquences (Ssoi);
- lors de l'étape f) de l'itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle (NgPC) est supérieure au seuil de contrôle (Sspc); au cours de l'étape g), si la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (Ng0I) est nulle, la concentration de l'espèce d'intérêt est considérée comme nulle.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
- lors de l'étape f) d'une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (Ng0I) est inférieure au seuil du nombre de séquences (Ssoi); - lors de l'étape f) de l'itération, lorsque la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle (N PC) est supérieure au seuil de contrôle (Sspc); au cours de l'étape g), si la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (N 0I) est non nulle, l'étape g) comporte une estimation d'une concentration de l'espèce d'intérêt (CSoi) en fonction : de la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (Ng0I) de la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle (NgPC) ; de la concentration ajoutée de l'espèce de contrôle (CSPC).
7. Procédé selon la revendication 3 ou la revendication 6, dans lequel la concentration de l'espèce d'intérêt est estimée à partir d'un ratio : où :
LSPC et Lso/sont respectivement les longueurs de génome de l'espèce de contrôle et de l'espèce d'intérêt ;
^soi et gpc sont respectivement les quantités de séquences respectivement associées à l'espèce d'intérêt et à l'espèce de contrôle résultant la dernière mise à jour;
Cspc est la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée dans l'échantillon.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel suite à l'atteinte du critère d'arrêt des itérations,
- si la quantité de séquences associées à l'espèce d'intérêt (Ng0I) est inférieure au seuil du nombre de séquences (Ssoi) ;
- et si la quantité de séquences associées à l'espèce de contrôle (NgPC) est inférieure au seuil de contrôle (Sspc) ;
- le procédé génère une information selon laquelle ni la présence ni l'absence de l'espèce d'intérêt ne peuvent être confirmées.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une prise en compte d'un seuil de décision (SD) , le procédé visant à comparer une concentration de l'espèce d'intérêt au seuil de décision le procédé étant tel que lors de l'étape a), la concentration de l'espèce de contrôle, est comprise entre 0.01 fois et 100 fois le seuil de décision.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel dans l'étape h), le critère d'arrêt des itérations est atteint lorsque :
- la quantité de séquences (Ng0I) associées à l'espèce d'intérêt dépasse le seuil du nombre de séquences (Ssoi);
- et/ou la quantité de séquences (NgPC) associées à l'espèce de contrôle dépasse le seuil de contrôle (Sspc)
- et/ou la durée cumulée des étapes c) atteint une durée maximale prédéterminée ;
- et/ou le nombre de séquençages cumulés lors des étapes c) atteint un nombre maximal prédéterminé ;
- et/ou le nombre d'itérations atteint un nombre maximal d'itérations prédéterminé.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel, suite à une détection d'une présence de l'espèce d'intérêt dans l'échantillon, le procédé comporte les étapes :
- i)séquençage d'une partie des séquences de nucléotides extraites lors de l'étape b) à l'aide du séquenceur temps réel durant une durée prédéterminée ou jusqu'à l'obtention d'un nombre de séquençages prédéterminé ;
- j) suite à l'étape i), assignation de séquences (n 0/) résultant de l'étape i) à l'espèce d'intérêt détectée; k) mise à jour des quantités de séquences associées à l'espèce d'intérêt (N 0I), de telle sorte que les quantités de séquences associées à l'espèce d'intérêt sont :
• lors d'une première itération de l'étape k), la quantité de séquences assignées à l'espèce d'intérêt détectée lors de l'étape j) ajoutées à la quantité de séquences (Ns0' I) résultant de la dernière itération des étapes c) à g) ;
• lors de chaque réitération de l'étape k), la quantité de séquences assignées à l'espèce d'intérêt (HÇ0/) lors de l'étape j) ajoutées à la quantité de séquences résultant de l'itération précédente de l'étape k) ;
- I) réitération des étapes i) à k) jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt d'itérations.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel les étapes i) à k) sont réitérées jusqu'à l'atteinte d'un nombre d'itérations prédéterminé.
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel : au cours de chaque itération des étapes i) à k), suite à l'étape k), le procédé comporte une détermination d'une profondeur de séquençage de l'espèce biologique d'intérêt, la profondeur de séquençage correspondant à un ratio entre la longueur cumulée des séquences associées à l'espèce et la longueur du génome de l'espèce ;
- les étapes i) à k) sont réitérées jusqu'à l'atteinte d'une profondeur de séquençage prédéterminée.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 comportant, suite à l'arrêt des itérations des étapes i) à k), une détection d'une séquence type du génome de l'espèce d'intérêt, la séquence type comportant un marqueur d'antibiorésistance ou un marqueur de virulence de l'espèce d'intérêt.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le séquenceur est configurer pour effectuer des séquençages successifs de différentes séquences d'acides nucléiques, les unes après les autres, le séquençage de chaque séquence étant considéré comme effectué en temps réel.
16. Dispositif (1) d'analyse métagénomique d'un échantillon, comportant :
- une chambre fluidique (2), destinée à recevoir l'échantillon ;
- un séquenceur (3) configuré pour effectuer un séquençage temps réel de l'échantillon ;
- une unité de traitement (4), comportant un module de bio-informatique (4.1), programmé pour assigner des séquences résultant du séquenceur à une espèce, et un module de pilotage (4.2), programmé pour mettre en oeuvre les étapes c) à h) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
17. Support d'enregistrement, lisible par ordinateur ou téléchargeable, comportant des instructions pour la mise en oeuvre des étapes c) à h) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
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