KR20230110606A - 감염원을 식별하는 방법 - Google Patents

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크리스토프 로드리게즈
쟝-미셸 파우롯스키
바네싸 드몽땅
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인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
위니베르씨떼 빠리-에스뜨 끄레떼이으 발 드 마른느
아시스땅스 퍼블리끄-오삐또 드 빠리
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Abstract

본 발명은 감염원을 검출, 식별, 분류, 정량화 및/또는 특성 규명하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 감염원을 검출, 식별, 분류, 정량화 및/또는 특성 규명하는 방법에 관한 것으로,
핵산 서열의 샘플을 제공하는 단계;
상기 핵산 서열의 샘플로부터 고품질 핵산 서열을 분리하는 단계;
상기 고품질 핵산 서열로부터 적어도 하나의 비동물성 고품질 핵산 서열을 분리하는 단계;
복수의 알려진 서열 중에서 가장 가까운 알려진 서열을 식별하는 단계로서, 상기 가장 가까운 알려진 서열은 상기 복수의 알려진 서열 중에서 상기 적어도 하나의 비동물성 고품질 핵산 서열과 가장 많은 유사도를 공유하고, 상기 복수의 알려진 서열은 감염원의 서열을 포함하는, 상기 가장 가까운 알려진 서열을 식별하는 단계;를 포함한다.

Description

감염원을 식별하는 방법
본 발명은 의학 분야, 특히 미생물학 및 전염병 분야에 관한 것이다.
감염원(infectious agent)의 직접 검출, 식별, 분류, 정량화 및 특성 규명은 전통적으로, 배양, 항원 검출/정량화, 표적 증폭 방법(qPCR, qTMA, LAMP, 등)에 의한 게놈 검출/정량화, 및/또는 표적 시퀀싱(Sanger 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱[NGS] 포함)에 의한 DNA 또는 RNA 서열 분석에 기반한 방법에 의해 수행된다. 그러나 이러한 접근 방법 모두에는 하기 표 1에 나열된 제한이 있다.
일상적인 실험실 테스트에서 감염원(병원체)의 직접 검출을 위해 사용되는 미생물학 기술의 감염원(병원체) 식별 능력의 비교
병원체 배양 항원 검출/정량화 표적 증폭에 의한 DNA 또는 RNA 검출/정량화 Sanger-기반 표적 메타게노믹스 NGS-기반 표적 메타게노믹스 샷건(Shotgun) 메타게노믹스
MetaMIC
세균 부분적(배양 가능) 표적 표적(targeted) 16S 16S 있음
진균 부분적(배양 가능) 표적 표적 ITS ITS 있음
바이러스 더 이상 사용되지 않음 표적 표적 없음 없음 있음
기생충 부분적(배양 가능) 표적 표적 18S/28S 18S/28S 있음
플루리마이크로바이얼(Plurimicrobial) 부분적(배양 가능) 없음 표적 없음 있음 있음
새로운 병원체 제한됨 없음 없음 제한됨 제한됨 있음
내성 있음(표현형) 표적 표적 없음 없음 있음(유전자형)
ITS: 내부 전사 스페이서; 배양 가능은 배양시 성장할 수 있는 살아있는 감염원만이 검출될 수 있음을 의미한다.
감염성 증후군의 증상은 일반적으로 바이러스, 진균, 세균 또는 기생충 병인에 대해 특이적이지 않다. 그러나 의료 미생물학은, 주로 이러한 감염원을 진단하는 기법들이 서로 다르기 때문에 병원체의 각 패밀리에 해당하는 여러 하위 전문 분야로 인위적으로 분할되었다.
최첨단 미생물학 기술의 주요 한계는 검출되는 감염원의 범위가 제한적이라는 것이다. 실제로, 선험(a priori)없이 성장하는 박테리아/진균 배양을 제외하고, 이러한 방법은 매우 제한된 수의 미리 정의된 감염원(예를 들어, 현재의 신드롬 qPCR 패널의 경우 세균, 바이러스, 진균 및/또는 기생충을 포함하는 1개에서 20개 미만의 병원체)만을 검출할 수 있다. 검출 및 특성규명될 수 있는 미리 정의된 병원체의 목록은 역학 연구에서 설명된 바와 같이 해당 감염 증후군의 원인 병원체로서 이러한 병원체의 빈도를 기반으로 한다. 그러나, 이러한 감염의 원인이 될 수 있는 많은 감염 인자는 무시되는 반면, 그의 빈도는 지속적으로 달라지며 기후 변화, 대규모 이주, 전염병, 새로운 의료 행위(예: 이식, 면역 억제, 항감염 요법 등) 등의 상황에서 극적으로 증가할 수 있다. 이러한 변화는, 지속적으로 업데이트되고 증가되어야 하는 미리 정의된 병원체의 제한된 패널을 검색하는 현재의 진단 분석법에 의해서는 반영될 수 없으므로, 고객 실험실에서 개발 및 인증을 위한 높은 비용을 발생시킨다.
이러한 상황은 인간 또는 동물 감염의 원인이 되는 임의의 병원체(들)을 선험없이 검출, 식별, 분류, 정량화 및 특성 규명할 수 있는 기술의 필요성을 강조한다. 또한, 역학적(epidemiological) 및 병태생리학적 지식 격차를 메우기 위해, 일상적인 실시에서 지금까지 알려지지 않은 새로운 감염성 병원체를 발견할 수 있는 능력을 갖춘 기술이 필요하다.
또한, 분석된 샘플에 존재하는 임의의 병원체의 양에 대한 정보를 제공할 수 있는 기술이 필요하다. 특정 상황에서, 이러한 정보는 질병의 중증도를 측정하고, 증상에서 병원체의 역할을 확인하고, 감염의 예후를 확립하고, 치료적 결정을 하고/하거나 항감염 치료의 효능을 추적하는데 필요하다. 현재, 정량화는 표적 증폭 방법을 이용하여 단일 병원체 분석 기준(예: HIV, CMV, HCV, HBV)에서 미리 정의된 소수의 병원체에 대해서만 가능하다. 다른 감염원의 경우, 일상적인 진단 실험실로 이전할 수 없는 회사내(in-house) 단일 병원체 분석법만이 개발되었으며, 그 시장은 향후 표준화된 상용 분석법의 개발을 보장하기에는 너무 작다.
표준 배양은 세균 또는 진균 감염을 진단할 수 있지만, 이는 시간이 많이 걸리고 배양의 성능, 병원균이 살아 있어야 하는 필요성, 배양에서 잘 자라지 않거나 특정 조건을 필요로 하는 병원체의 특성, 및/또는 항생제의 투여로 인해 식별에 결함이 있을 수 있다. 최근의 표적 메타게노믹스(targeted metagenomics) 도구는 배양에 대한 대안을 제공했다. 그러나, 그의 성능은 고전적인 배양에 비해 열등한 것으로 판명되었다.
따라서, 선험없이 병원체를 식별하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 새로운 방법이 절실히 필요하다.
본 발명은 감염원을 검출, 식별, 분류, 정량화 및/또는 유전적으로 특성을 규명하는 방법을 제공한다. 본 발명은 위에서 확인된 필요성을 충족시킨다. 특히 본 발명은 청구항들에 의해 한정된다.
본 발명은 감염원을 식별하는 방법으로서,
a. 핵산 서열의 샘플을 제공하는 단계;
b. 핵산 서열의 샘플로부터 고품질 핵산 서열을 분리하는 단계;
c. 고품질 핵산 서열로부터 적어도 하나의 비동물성 고품질 핵산 서열을 분리하는 단계;
d. 복수의 알려진 서열 중에서 가장 가까운 알려진 서열을 식별하는 단계를 포함하고, 가장 가까운 알려진 서열은 복수의 알려진 서열 중에서 적어도 하나의 비동물성 고품질 핵산 서열과 가장 많은 양의 정보를 공유하고, 복수의 알려진 서열은 감염원, 바람직하게는 적어도 하나의 관심 있는 진균 판별 유전자(fungal discriminant gene)의 서열을 포함하고, 상기 식별은 감염원을 나타내는, 방법에 관한 것이다.
이 방법은 감염원을 검출, 식별, 분류, 정량화 및/또는 유전적으로 특성을 규명하는 것을 가능하게 한다.
본원에서 사용되는 용어 "감염원"은 동물에서 감염을 일으키는 미생물을 의미한다. 일반적으로 유기체는 바이러스, 세균, 기생충, 원생동물 및/또는 진균이다.
본원에서 사용되는 용어 "동물"은 인간을 포함하는 모든 포유류 동물을 의미한다. 또한 이는 배아 및 태아 단계를 포함하여 모든 발달 단계에 있는 개개의 동물을 포함한다. 이 용어는 농장 동물(돼지, 염소, 양, 소, 말, 토끼 등), 설치류(예: 마우스) 및 애완동물(예: 고양이 및 개)을 포함한다. 본 발명의 방법은 특히 인간에서 감염원을 식별하는데 적합하다.
다른 공지된 기법과 달리, 감염원의 식별은 감염 및 이의 원인 감염원(들)의 진단에 적용될 수 있을 만큼 충분히 정확하게 수행될 수 있다. 구체적으로, 이 방법은 관심 감염원을 오염 물질과 구별할 수 있다. 이를 위해, 방법은 임의의 관심 핵산 서열이 없는 샘플로부터 고품질 핵산 서열을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 식별된 모든 서열은 오염물로 간주되며 핵산 서열의 샘플에서 발견되는 경우 무시된다.
또한, 방법은 적어도 하나의 알려진 서열을 포함하는 핵산 서열의 샘플에 대해 단계 a) 내지 d)를 반복하는 것으로 구성되는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 방법의 사용 조건을 확인하고 임의의 이상(anomaly)을 검출하는 것을 가능하게 한다. 또한, 정확하게 식별된 하나의 감염원에 속하는 서열의 수는 샘플이 감염원의 존재에 대해 음성 또는 양성으로 간주되어야 하는지 여부를 결정하기 위해 컷오프(cut-off)를 사용하여 해석될 수 있다. 감염원의 존재(양성 검출)는 미생물학 실험실에서 의학적 해석에 사용할 수 있는 보고서에 나열될 수 있다.
또한, 방법은 다음 단계들 중 임의의 단계를 포함할 수 있다: 병원체의 부하량을 정량화하는 단계, 감염원의 게놈을 재구성하는 단계, 및 기준 서열(reference sequence)과 비교하여 뉴클레오티드 또는 아미노산 차이를 식별하기 위해 변이를 호출(calling)하는 단계.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 서열"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. "분리된 핵산 서열"은 그것이 분리된 자연 환경에서 더 이상 존재하지 않는 핵산 서열, 예를 들어, 세포 내의 핵산 서열을 의미한다.
따라서, 핵산 서열의 샘플은 대량의 DNA 및 RNA 서열로 구성될 수 있지만, RNA 서열은 본 발명의 방법의 목적을 달성하기에 충분할 수 있다. 샘플은 어떤 방법으로든 얻을 수 있다. 환자 또는 동물로부터 채취할 수 있는 샘플의 성질은 매우 다양하다. 실제로, 그 기법은 조직(다양한 장기 유래의 냉동 및 파라핀 포매 생검) 및 체액(뇌척수액, 기관지폐포 세척액, 가래, 전혈, 혈장, 혈청, 고름, 소변, 방수, 골수, 복수 등)에 대해 검증되었다.
바람직하게는, 관리 도구(management tool)는 복수의 환자 또는 동물 유래의 복수의 샘플을 모니터링할 수 있고 관심 샘플을 익명으로 추적하는 것을 가능하게 한다.
몇몇 구현예에서, 단계 a)는 핵산 서열을 추출하는 것으로 구성된 하위 단계를 포함하고, 상기 하위 단계는 적어도 추출의 진행 및 샘플의 출처를 포함하는 정보를 생성하도록 모니터링된다.
핵산 서열의 샘플을 제공하기 위해, 샘플의 기계적, 효소적 및 화학적 용해의 조합으로 구성되는 사전 추출과 막, 지질, 단백질 및 임의의 다른 세포 또는 세포외 성분을 제거하여 고품질 핵산을 제공함으로써 핵산을 정제하는 것으로 구성되는 추출이 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 오직 RNA 서열로부터 감염원을 식별하는데 특히 효율적이다. 환경 대조군(음성 대조군) 및 양성 대조군(8 종의 세균, 2종의 진균 및 4 종의 바이러스를 포함)이 ISO 15189 규범의 권장 사항에 따라 포함될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 추출물의 핵산 서열의 라이브러리가 준비되고 상기 핵산 서열의 시퀀싱이 수행된다.
본원에서 사용되는 용어 "시퀀싱"은 핵산에서 뉴클레오티드들의 순서를 결정하는 과정을 의미한다. 핵산을 시퀀싱하기 위한 다양한 방법이 당업계에 잘 알려져 있고 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 차세대 시퀀싱이 수행된다. 본원에서 사용되는 용어 "차세대 시퀀싱"은 당업계에서 그의 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어 한 번에 수십만 또는 수백만 개의 상대적으로 짧은 시퀀스 리드(sequence read)를 생성할 수 있는 능력을 갖는 전통적인 Sanger-기반 및 모세관 전기영동-기반 접근법과 비교하여 증가된 처리량을 갖는 시퀀싱 기술을 의미한다. 차세대 시퀀서는 당업계에 잘 알려져 있으며 Illumina(Solexa) 시퀀싱, Roche 454 시퀀싱, Ion torrent 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱, PacBio 시퀀싱 등과 같은 다양한 기술에 기반한 다수의 다양한 시퀀서를 포함할 수 있다. 본 방법에서 사용할 수 있는 시퀀싱 기술의 일 예는 Illumina 플랫폼이다. Illumina 플랫폼은 폴드백(fold-back) PCR 및 고정된 프라이머(예: 캡처 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 고체 표면(예: 유동 셀)에서 DNA 증폭(RNA에 대한 역전사 후)하는 것을 기반으로 한다. Illumina 플랫폼을 사용한 시퀀싱의 경우, DNA가 단편화되고 어댑터가 단편의 양쪽 말단에 추가된다(이전 단계 참조). DNA 단편은 이 단편의 어댑터 말단에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포획함으로써 유동 셀 채널의 표면에 부착된다. 그런 다음, DNA 단편은 신장되고 브리지 증폭된다. 여러 주기의 고상 증폭 이후의 변성 후, 수백만 개의 공간적으로 고정화된 핵산 클러스터의 어레이 또는 단일 가닥 핵산의 콜로니가 생성된다. 각각의 클러스터는 동일한 주형의 단일 가닥 DNA 분자의 대략 수백 개 내지 수천 개 복제를 포함할 수 있다. Illumina 플랫폼은 검출 가능한 표지(예: 형광단)를 포함하는 시퀀싱 뉴클레오티드가 유리 3' 히드록시 기에 연속적으로 추가되는 합성에 의한 시퀀싱 방법을 사용한다. 뉴클레오티드 혼입 후, 표지된 뉴클레오티드에 특이적인 파장의 레이저 광을 사용하여 표지(label)를 여기시킬 수 있다. 이미지가 캡처되고 뉴클레오티드 염기의 정체(identity)가 기록된다. 이러한 단계를 반복하여 나머지 염기를 시퀀싱할 수 있다. 이러한 기술에 따른 시퀀싱은 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 출원 2011/0009278호, 2007/0014362호, 2006/0024681호, 2006/0292611호, 및 미국 특허 7,960,120호, 7,835,871호, 7,232,656호, 및 7,115,200호에 기술되어 있다.
본 발명에 따르면 다수의 리드가 얻어질 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "리드(read)"는 핵산 샘플의 일부로부터 판독된 서열을 의미한다. 일반적으로, 리드는 샘플에서 인접한 염기쌍들의 짧은 서열을 나타낸다. 리드는 염기의 정확성에 대한 확률적 추정치(품질 점수)와 함께 샘플 부분의 A, T, C 및 G로 염기쌍 서열에 의해 상징적으로 표현될 수 있다.
본 발명에 따르면, 생성된 서열의 품질을 판단하여 품질이 낮은 핵산 서열을 제거할 수 있다. 단계 b)에서 분리된 고품질 핵산 서열은 바람직하게는 미리 결정된 임계값 이상의 품질 점수, 바람직하게는 20보다 높은 Phred 점수를 갖는 서열이다. 본원에서 사용되는 용어 "Phred 점수"는 당업계에서 그의 일반적인 의미를 가지며 자동 시퀀싱에 의해 생성된 핵염기(nucleobase)의 식별 품질을 나타낸다. Phred 점수가 높을수록 품질이 높다. 예를 들어, 10의 Phred 점수는 90%의 기본 호출 정확도를 나타내고 20의 Phred 점수는 99%의 기본 호출 정확도와 상관관계가 있다. 또한, 의미 있는 양의 정보를 포함하는 서열만을 유지하기 위해 추가적인 필터링을 위해 핵산 서열의 유익한 점수를 계산할 수 있다. 예를 들어, 단일 중합체 서열은 많은 상이한 게놈에 해당할 수 있기 때문에 식별 정보를 거의 포함하지 않는다.
그런 다음 숙주 세포 핵산 서열은 얻어진 고품질/유익한 서열로부터 감해서(subtract) 비-동물 핵산 서열만을 얻을 수 있다. 적어도 하나의 비-동물 고품질 핵산 서열을 분리하기 위한 임의의 다른 수단이 구현될 수 있다.
후속 고갈(depletion) 라운드는 다른 유형의 핵산 서열, 예를 들어 포유동물, 곤충, 식물 서열 등을 제거하고 관심 서열, 예를 들어 기생충, 진균, 세균 또는 바이러스 서열 만을 유지하도록 유리하게 수행될 수 있다. 이들 서열은 식별될 감염원에 해당하며, 다음에 그 서열은 복수의 알려진 감염원 서열 중에서 가장 가까운 알려진 서열을 식별하기 위해 복수의 알려진 감염원 서열과 비교된다.
단계 d)의 복수의 알려진 핵산 서열은 예를 들어 데이터베이스로 구성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 데이터베이스는 세균, 바이러스, 진균 및/또는 기생충 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이러한 데이터베이스는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에서 유래될 수 있다. 일반적으로, 이는 처음에 제공되는 핵산 서열 샘플의 기원을 고려할 때 가능한 한 관련되는 복수의 알려진 서열을 제공하도록 알려진 관심 서열이 추가되어진 NCBI 데이터베이스로 구성된 풍부한(enriched) NCBI 데이터베이스를 포함한다. NCBI 데이터베이스는 데이터베이스에서 사용된 이름과 관계없이, 분류군(taxon)이 여러 이름을 가지고 있더라도 분류군을 식별할 수 있도록 모든 계통발생학적 분기점(phylogenetic nod)에 번호를 매기는 분류학적 분류를 유리하게 사용한다.
식별할 서열과 가장 많은 양의 유사성을 공유하는 핵산 서열을 결정하기 위해, 여러 접근법을 사용할 수 있다. 바람직한 접근법은 결정될 서열을 복수의 알려진 서열과 반복적으로 비교하는 것으로 구성된다. 공통 부분의 길이, 공통 부분의 양 등과 같은 다양한 매개변수를 고려할 수 있다. 또한, 서열의 비정보성(non-informative) 부분은 알려진 수단으로 식별할 수 있으며 분석에서 언제든지 계산에서 더 낮은 가중치를 부여할 수 있다. 또한, 이를 위해, 핵산 서열 사이의 계통발생학적 거리를 계산하기 위한 알려진 수단이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 가장 가까운 알려진 서열과 적어도 하나의 비인간 고품질 핵산 서열 사이의 유사도가 소정의 임계값 이상인지를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계가 없으면, 본 발명에 따른 방법은 항상 가장 가까운 식별된 서열에 해당하는 결과를 반환할 것이다. 그러나, 서열이 충분히 유사하지 않은 경우, 임의의 결과, 즉, 식별할 서열과 출력되는 가장 가까운 서열 간의 유사성을 특성 규명하기 위한 사전 결정된 임계값을 반환하지 않는 것이 더 나을 수 있다.
임계값은 신중하게 선택해야 하며 식별할 감염원에 따라 달라진다. 실제로, 어떤 경우에는 다소 먼 서열로도 감염원을 식별하기에 충분할 수 있는 반면, 다른 감염원을 확실하게 식별하기 위해서는 높은 유사성이 필요할 수 있다. 예를 들어, 빠르게 변이하는 바이러스에는 진균과 동일한 임계값이 지정되지 않는다.
몇몇 구현예에서, 올바르게 식별된 서열의 수 및 인간 서열에 대한 이들의 상대적인 양(비)이 계산되고, 환경(음성) 대조군의 것과 비교되고, 감염성 질병의 병인에 대한 경험에 따라 해석 또는 RNA 발현을 위해 샘플에 존재하는 감염원(들)의 양을 측정하여 감염병의 원인이 될 수 있는 감염원의 존재를 그 비율에 따라 보고하기 위해 사용된다.
몇몇 구현예에서, 양성 대조군의 해석은 전체 과정을 검증하기 위해 추가로 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 모든 대조(control) 결과 및 다수의 유효성 지표를 포함하는 특정 보고서가 제공된다. 본 발명에 따른 방법은 분석 보고서, 바람직하게는 관심 포맷의 분석 보고서를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 관심 포맷은 바람직하게는 txt, html 또는 pdf 문서와 같은 대부분의 장치에서 읽을 수 있는 포맷이다.
일반적으로, 샘플에서 최종 보고서까지의 전체 과정은 ISO EN NF 15189 표준(의료 실험실용 진단)을 준수한다.
본 발명에 따른 방법은 그의 게놈 DNA 및 게놈/발현 RNA를 기반으로 세균, 바이러스, 진균 및 기생충을 식별하는데 매우 유용하며; 그의 게놈(RNA 바이러스) 및/또는 발현된 RNA 서열(유전체가 DNA인 병원체 포함)에만 기반하여 이러한 모든 병원체를 식별하는데 특히 효율적이다.
이 방법은 알려진 식별 방법이 다른 감염원과 마찬가지로 진균의 경우에 성공적이지 않기 때문에 진균을 식별하는데 특히 중요하다.
따라서, 단계 a의 핵산 서열의 제공된 샘플은 유리하게는 진균 RNA 서열을 함유하는 샘플일 수 있다.
대부분의 진균은 그의 게놈의 중요한 부분을 공통적으로 공유한다. 따라서 대부분의 진균에 공통적인 게놈의 이 부분은 유익하지 않다. 따라서 진균을 식별하기 위해 DNA 서열보다는 RNA 서열을 사용하는 것이 좋다.
주어진 진균에 대해 매우 특이적이므로 판별 진균 유전자를 구성하는 유전자가 있다. 예시적인 판별 진균 유전자로는 하기의 것들이 있다: i) 핵 리보솜 RNA 유전자 대형 서브유닛(26/28S의 D1-D2 도메인); ii) 완전한 내부 전사 스페이서 영역(ITS1/2); iii) 부분적 β-튜불린 II(TUB2); iv) γ-액틴(ACT); v) 번역 신장 인자 1-α(TEF1α) 및 번역 신장 인자 3(TEF3); vi) RNA 중합효소 II의 두 번째로 큰 서브유닛(부분적 RPB2, 섹션 5-6); vii) t-RNA 도킹에 필요한 작은 리보솜 단백질; viii) 60S L10(L1) RP; ix) DNA 토포이소머라제 I(TOPI); x) 포스포글리세르산 키나제(PGK); xi) 단백질 LNS2(Stielow JB 등; Persoonia 2015에 기술됨).
본 명세서에서, 관심 있는 다양한 유전자 각각의 명칭은, 특히 인터넷 주소www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/index.html에서 이용 가능한 HUGO Gene Nomenclature Committee의 데이터베이스를 비롯하여, 국제적으로 인정된 유전자 서열 및 단백질 서열 데이터베이스에서 발견되는 해당 유전자의 국제적으로 인정된 명칭을 의미한다. 이러한 국제적으로 인정된 서열 데이터베이스를 통해, 본원에 기재된 각각의 관심 마커에 상응하는 핵산 및 아미노산 서열은 당업자에 의해 검색될 수 있다.
본 발명에 따르면, 단계 d)의 복수의 알려진 서열은 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 관심 판별 진균 유전자를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 실시예 2에 기재된 바와 같이 여러 모듈을 포함하는 컴퓨터 프로그램에 의해 수행된다. 간단히 말해서, 컴퓨터 프로그램은 hg19 데이터베이스를 사용하여 불량한 품질 서열(Phred 점수 <20), 무정보성(non-informative) 단일 중합체 서열 및 인간 서열을 제거하기 위해 사용되는 제1 모듈을 포함할 수 있다. 제2 모듈은 정리된 데이터베이스를 사용하여 감염원의 식별을 수행할 수 있다. 이 식별 단계 후, 각 샘플(환자/동물 샘플, 환경 대조 및 블랭크 샘플) 유래의 각 감염원 서열에 식별 태그를 붙인다. 환자 샘플 유래의 서열은 환경 대조군에서 공통적으로 발견되는 서열을 사용하여 세척(clean)된다. 다음으로 세균, 바이러스 및 기생충의 경우 종 수준에서, 진균의 경우 속 수준에서 나머지 각 미생물에 대한 비율(미생물 서열의 수/인간 또는 동물 서열의 수)을 결정한다. 일정 양을 초과하는 모든 식별은 양성으로 해석된다. 특히 진균의 경우, 전용 모듈을 이용하여 종 수준에서 식별의 신뢰성을 확인할 수 있다. 상기 모듈은 동일한 식별된 속(genus)에 속하는 서열로부터 식별된 종의 분포로부터 계산된 Simpson 지수에 기반한다. 분포 지수가 높은 경우는 서열이 모두 하나의 종에 속한다는 것을 나타내며 이는 정보가 신뢰될 수 있다는 생각을 뒷받침한다. 이 경우, 종을 식별한다. 지수가 낮은 경우, 진균 종 식별의 히트맵이 계산된다. 이는 선별된 진균 유전자(즉, 판별 진균 유전자)의 데이터베이스를 통해 식별되는 것으로 알려진 유전자에 속하는 진균 서열만을 사용하는 것으로 구성된다. 이 단계의 종료 시, 동일한 종 유래의 적어도 3개의 서로 다른 식별 유전자가 존재하는 경우, "종" 정보가 검증된다. 그렇지 않으면 속만이 반환된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은, 프로세서 또는 전자 제어 유닛에 의해 실행되는 경우 본 발명에 따른 방법을 수행하도록 구성된 코드를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 컴퓨터 프로그램은 잘 알려진 컴퓨터 프로세서, 메모리 유닛, 저장 장치, 컴퓨터 소프트웨어 및 기타 구성 요소를 사용하여 컴퓨터에서 구현된다. 일반적으로, 컴퓨터에는 컴퓨터의 전체 작업을 정의하는 컴퓨터 프로그램 명령을 실행함으로써 그 전체 작업을 제어하는 프로세서가 포함되어 있다. 컴퓨터 프로그램 명령은 저장 장치(예: 자기 디스크)에 저장되고 컴퓨터 프로그램 명령의 실행이 필요할 때 메모리에 로드될 수 있다. 또한 컴퓨터는 사용자가 컴퓨터와 상호 작용할 수 있도록 하는 기타 입력/출력 장치(예: 디스플레이, 키보드, 마우스, 스피커, 버튼 등)를 포함한다. 당업자는 실제 컴퓨터의 구현이 다른 구성 요소도 포함할 수 있음을 인식할 것이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 컴퓨터 프로그램은 클라이언트-서버 관계로 동작하는 컴퓨터를 사용하여 구현된다. 일반적으로, 이러한 시스템에서 클라이언트 컴퓨터는 서버 컴퓨터에서 멀리 떨어져 있으며 네트워크를 통해 상호 작용한다. 클라이언트-서버 관계는 각 클라이언트 및 서버 컴퓨터에서 실행되는 컴퓨터 프로그램에 의해 정의되고 제어될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 결과는 LED 또는 LCD와 같은 표시 시스템에 표시될 수 있다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 알고리즘은 백엔드 구성요소, 예를 들어 데이터 서버를 포함하거나, 미들웨어 구성요소, 예를 들어 애플리케이션 서버를 포함하거나, 프런트엔드(front-end) 구성요소, 예를 들어 사용자가 실시(implementation)와 상호 작용할 수 있도록 하는 그래픽 사용자 인터페이스 또는 웹 브라우저가 있는 클라이언트 컴퓨터를 포함하거나, 하나 이상의 백엔드, 미들웨어 또는 프런트엔드 구성 요소의 임의의 조합을 포함하는 컴퓨팅 시스템에서 구현될 수 있다. 시스템의 구성 요소는 예를 들어 통신 네트워크와 같은 디지털 데이터 통신의 임의의 형태 또는 매체에 의해 상호 연결될 수 있다. 통신 네트워크의 예로는 근거리 통신망("LAN") 및 광역 통신망("WAN"), 예를 들어 인터넷이 있다. 컴퓨팅 시스템은 클라이언트 및 서버를 포함할 수 있다. 클라이언트 및 서버는 일반적으로 서로 멀리 떨어져 있으며 일반적으로 통신 네트워크를 통해 상호 작용한다. 클라이언트와 서버의 관계는, 각 컴퓨터에서 실행되고 서로 클라이언트-서버 관계를 갖는 컴퓨터 프로그램에 의해 발생한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 컴퓨터 프로그램은 네트워크 기반 클라우드 컴퓨팅 시스템 내에서 구현된다. 이러한 네트워크 기반 클라우드 컴퓨팅 시스템에서, 네트워크에 연결된 서버 또는 다른 프로세서는 네트워크를 통해 하나 이상의 클라이언트 컴퓨터와 통신한다. 클라이언트 컴퓨터(예를 들어, 전화기, 태블릿 또는 랩톱 컴퓨터와 같은 모바일 장치)는 예를 들어 클라이언트 컴퓨터에 상주하고 작동하는 네트워크 브라우저 애플리케이션을 통해 서버와 통신할 수 있다. 클라이언트 컴퓨터는 서버에 데이터를 저장하고 네트워크를 통해 데이터에 액세스할 수 있다. 클라이언트 컴퓨터는 데이터 요청 또는 온라인 서비스 요청을 네트워크를 통해 서버로 전송할 수 있다. 서버는 요청된 서비스를 수행하고 클라이언트 컴퓨터(들)에 데이터를 제공할 수 있다. 또한, 서버는 클라이언트 컴퓨터가 지정된 기능을 수행(예: 계산 수행하는 것, 화면에 지정된 데이터 표시하는 것 등)하도록 적응된 데이터를 전송할 수 있다. 예를 들어, 의사는 매개변수(즉, 입력 데이터)를 등록할 수 있으며, 그런 다음 인터넷을 통해 광역 통신망(WAN)과 같은 장거리 통신 링크를 통해 데이터를 데이터 분석 모듈이 있는 서버로 전송할 수 있다. 데이터 분석 모듈은 알고리즘을 구현하고 최종적으로 모바일 장치에 출력(예: 점수)을 반송한다. 몇몇 구현예에서, 출력 결과는 임상 결정 지원(CDS) 시스템에 통합될 수 있다. 이러한 출력 결과는 전자 의료 기록(EMR) 시스템에 통합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음을 포함하는 감염원을 검출 및 식별하기 위한 키트이다:
핵산 서열의 샘플을 제공받도록 구성된 샘플 제공자(sample provider),
본 발명에 따른 방법을 구현하기 위한 수단, 및
가장 가까운 알려진 서열을 기반으로 결과를 표시하기 위한 수단.
본 발명의 방법, 키트 및 컴퓨터 프로그램은, 많은 샘플이 식물군(flora) 또는 배경 집락 유기체를 포함하기 때문에 식별하기 어려울 수 있는 감염원을 정확하게 검출하고 식별하는데 특히 적합하다. 따라서 본 발명의 방법, 키트 및 컴퓨터 프로그램은 감염원을 분류, 정량화 및/또는 특성 규명하는데 적합할 수 있다. 특히, 이 방법은 감염원의 신속하고 효율적이며 유용한 식별을 보장하므로 감염의 진단을 위한 임상 실시 및 공중 보건 감시에서 많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은, 환자가 전염병을 앓는 것으로 의심되고 임상의가 환자로부터 하나 이상의 샘플을 채취하여 어떤 감염원(들)이 상기 감염의 원인이 되는 지를 결정하는 경우에 사용될 수 있다. 임상의는 다양한 수준에서 결과를 살펴보고 가능한 경우 잠재적인 치료 옵션을 제공하기 위하여, 실제로 환자가 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 기생충 감염 등을 가지고 있는지 여부를 알고 싶어 할 수 있다. 특히, 일단 감염원(들)이 식별되면, 추가의 이용 가능한 임상 및 실험실 데이터는 검출된 감염원이 숙주 유기체(예: 인간 또는 동물)에서 병원성(즉, 질병 유발)인지 여부를 결정하는데 도움이 될 수 있다. 임상 샘플에서 잠재적인 감염원의 존재가 검출되었다고 해서 이것이 반드시 질병을 유발한다는 의미는 아니다. 예를 들어, 잠재적인 병원체는 이주종(colonizer)일 수도 있고 방관자(bystander)일 수도 있으며 숙주 유기체의 질병과는 아무런 관련이 없다. 식별된 감염원이 임상 및 유성(oilier) 기준에 의해 병원성인 것으로 간주되는 경우, 검출을 사용하여 다음을 포함할 수 있는 임상 개입을 안내할 수 있다: (1) 항균 약물 요법(예: 표적 항균제를 처방 또는 투여), (2) 항균 약물 중단(예: 확정 진단이 없는 경우 경험적으로 투여된 약물을 중단), (3) 백신이 있고 감염(예: 광견병) 후 효과가 있는 경우 백신 접종, 및 (4) 의료 절차(예: 항진균 요법만으로는 효과가 없는 진균성 심내막염의 경우 판막 교체). 또한, 감염원 검출 실패는 질병의 원인으로서 감염의 존재를 배제하는데 임상적으로 유용할 수 있으며, 이는 임상의가 비감염성 원인을 치료하도록 안내할 수 있다(예: 자가면역 질환 등의 치료에 적합한 정맥 면역글로불린 및 코르티코스테로이드를 투여). 또한, 본 발명의 방법, 키트 및 컴퓨터 프로그램은 감염원의 존재를 신속하고 효율적으로 식별함으로써 도움을 받을 수 있는 혈액 은행 검사, 식품 및 수질 검사, 환경 검사, 동물 검사, 동물 건강, 또는 임의의 다른 분야에서 사용될 수 있다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
도 1: 실시예 1 연구의 흐름도.
도 2(a): 괴사성 연조직 감염(NSTI) 환자 34명의 괴사 샘플에서 배양, 표적 메타게노믹스(TM) 및 샷건(Shotgun) 메타게노믹스(SM)에 의해 검출된 음성, 단일균(monomicrobial) 및 복합균(polymicrobial) 샘플의 비율. 도 2(b): 배양, TM 및 SM에 의해 NSTI 환자 34명에서 확인된 미생물의 수. GP, 그람 양성; GNB, 그람 음성 간균. 도 2(c): 세 가지 방법의 결합된 결과를 기반으로, 장내세균(대장균 포함), 비발효(NF) GNB, 그람 양성 구균(GPC), 혐기성 세균 및 모든 미생물의 검출을 위한 각각의 방법의 민감도. 도 2(d): 세 가지 방법의 결과의 조합을 기반으로, 각각의 방법이 최상의 가능한 병원체 식별을 제공한 샘플의 수를 보여주는 벤(Venn) 다이어그램.
도 3(a): 배양에 의해 추정된 반정량적 세균 부하에 대한 세균 대 인간 서열의 정량적 샷건 메타게노믹(SM) 비율의 비교(+, ++, +++, ++++). 도 3(b): 건강한 부위 및 괴사 부위로부터 채취한 샘플에서 SM 비율로부터 계산한 세균 부하의 비교.
실시예 1
실시예 1의 결과는 참조로 포함되는 문헌[Br J Dermatol. 2020 Jul;183(1):105-113]에 게재되었다.
요약
배경 괴사성 연조직 감염(NSTI)은 생명을 위협하므로 광범위한 항생제를 필요로 한다. 이들의 병인학적 진단은 배양의 불충분한 성능 및 수술 전 항생제의 투여로 인해 제한될 수 있다.
목적 본 발명자들은 (i) 16S-표적 메타게노믹스(TM) 및 편향되지 않은 반정량적 범미생물 DNA- 및 RNA-기반 샷건 메타게노믹스(SM)를 배양과 비교하고, (ii) 메타게노믹스 접근법으로부터 가장 이익을 얻을 수 있는 환자를 식별하고, (iii) SM 기반 방법을 통해 주변의 비-괴사성 '건강한' 조직에서 미생물 병원체를 검출하고자 하였다.
방법 NSTI 환자 34명의 조직에 대한 표준 배양, TM 및 SM의 분석 성능을 평가하기 위해 전향적 관찰 연구를 수행했다. 이 세 가지 방법으로 얻은 병원체 식별을 비교했다.
결과 34명의 환자로부터 34개의 괴사조직 및 10개의 건강한 조직을 수집하였다. TM의 성능은 다른 방법보다 낮았고(P < 0.05), SM은 결과가 통계적으로 유의하지 않았지만(P = 0.08) 표준 배양보다 더 우수했다. SM은 모든 세균의 검출에 대해 TM보다 유의하게 더 민감했고(P = 0.02), 혐기성 세균의 검출에 대해 표준 배양보다 더 민감했다(P < 0.01). 배양에서 세균의 반정량적 풍부도(abundance)와 SM에서 세균 대 인간 서열 비율 사이에는 강한 상관관계(r = 0.71, Spearman 상관 계수)가 있었다. 건강한 조직에서 적은 양의 세균 DNA가 발견되었고, 이는 거시적으로 '건강한' 조직과 괴사 조직 사이에 세균 연속체(bacterial continuum)가 있음을 시사한다.
결론 SM은 TM보다 더 넓은 범위의 병원체를 검출하고 표준 배양보다 엄격한 혐기성 세균을 식별하는데 훨씬 더 나은 능력을 보여주었다. NSTI가 있는 당뇨병 환자는 SM으로부터 가장 많은 혜택을 받는 것으로 나타났다. 마지막으로, 본 발명의 결과는 거시적으로 '건강한' 비-괴사 부위와 괴사 조직 사이의 세균 연속체를 시사한다.
표준 세균학적 절차
모든 생검은 확립된 지침에 따라 표준화된 세균학적 절차를 사용하여 검사하였다[1]. 생검은 50 내지 60Hz에서 210초 동안 3mL 등장액 및 강철 비드가 포함된 멸균 일회용 튜브에서 분쇄하였다(IKA® Ultra-Turrax® Tube Drive, 독일 Staufen). 분쇄된 물질의 일부(약 10 내지 100 mg)를 Tempus Blood RNA 튜브(ThermoFisher Scientific사, 미국 메사추세츠주 월샘)로 옮기고 메타게노믹스 연구를 위해 -80℃에서 동결했다. 나머지 부분은 유럽임상미생물감염학회(ESCMID)에서 권장하는 바와 같이 하기의 배지를 파종하는데 사용하였다: Polyvitex(5일, 5% CO2), 콜리스틴 날리딕스산 혈액 플레이트, 트립티카제-대두 한천 및 Drigalski 플레이트(48시간, 호기성), 혈액 한천 플레이트(5일, 혐기성), 및 티오글리콜산 액체 브로쓰(5일)[1].
세균 콜로니는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF, Beckman-Coulter사, 미국 캘리포니아주 새크라멘토)을 사용하여 확인하였고 내부 차트에 따라 반정량적으로 계수했다(+: 1 내지 10개 단위 형성 콜로니(UFC), ++: 11 내지 100개 UFC, +++: 101 내지 1000개 UFC, 및 ++++: > 1001개 UFC). 양성 혈액 배양은 ESCMID에서 권장하는 대로 관리하였다[1]. 항균제 감수성 검사는 디스크확산법을 이용하여 수행하였으며, 프랑스 미생물학회(the Antibiogram Committee of the French Society for Microbiology)의 2014년 항균위원회 권고에 따라 해석하였다[2].
메타게노믹스 절차
추출 및 대조군
편향되지 않은 DNA-RNA 추출 절차는 표적 메타게노믹스(TM) 또는 샷건 메타게노믹스(SM)를 수행하기 전에 모든 생검에 적용하였다. 간단히 말해서, 화학적 세포 파괴와 결합된 비드 균질화에 의한 사전 추출에 이어 QiaSymphony(Qiagen사, 독일 Hilden)를 사용한 추출을 수행하였다.
각각의 TM 또는 SM 실행에서 음성 대조군을 검사했다. 세균, 바이러스 및 진균의 검출을 위한 메타게노믹스 기법의 성능을 평가하기 위해 양성 대조군을 사용했다. 하기의 미생물을 혼합하여 10mL 양성 대조군 로트를 생산했다: (i) 그람-양성 및 그람-음성 호기성 및 혐기성 종을 포함하는 세균; (ii) 외피 및 비외피 RNA 및 DNA 바이러스를 포함한 바이러스; 및 (iii) 사상(filamentous) 및 비-사상 병원체를 포함한 진균.
표적 메타게노믹스
TM에는 하기의 4개 앰플리콘 라이브러리에 대한 연구가 포함되었다: 세균 16S rRNA 유전자의 도메인 V1-V2(16S-V1V2)[3] 및 V3-V4(16S-V3V4)[4]와 2개의 리보솜 진균 내부 전사 스페이서(ITS) 영역 ITS1 및 ITS2 [5]. 제조사(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에서 제공한 "16S 메타케놈 시퀸싱 라이브러리 준비 프로토콜"에 따라 5mL 추출물로부터 각 앰플리콘을 제조했다. 각 라이브러리에 대해, TapeStation(Agilent사, 미국 캘리포니아주 산타클라라)에서 D1000 ScreenTape를 사용하여 품질을 평가하고 Mithras LB 940(Berthold Technologies사, 독일 Bad Wildbad)에서 Quant-it dsDNA Assay 키트(ThermoFischer사, 미국 메사추세츠주 월샘)를 사용하여 수량을 평가했다. 모든 라이브러리는 MiSeq 장치(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에서 페어-엔드(pair-end) 시퀀싱(v3, 2 x 300 bp) 전에 4 nM으로 정규화하고, 풀링하고, 변성시켰다. 표적 세균 및 진균 영역은 제조사의 지침에 따라 시퀀싱하고[6], 그 서열을 본 출원인 회사내 소프트웨어 PyroMIC®을 사용하여 전용 데이터베이스의 것과 비교하였다[5]. 간단히 말해서, 페어-엔드 서열을 병합한 후, 50bp 미만의 리드 및 20 미만의 Phred 품질 점수를 제거하였다. 키메라 서열은 센스 및 안티센스 리드 모두에 의해 제공된 식별을 비교함으로써 검출하였다. 식별이 일치하지 않은 경우, 서열을 키메라로 간주하여 제거하였다. 나머지 서열은 16S rDNA에 대한 RefSeq 데이터베이스(릴리즈 85, 2017년 11월)[7] 및 정제된 NCBI 데이터베이스(2017년 11월)[8]를 기반으로 하는 회사내 진균 데이터베이스를 이용하여 블라스트(blast)했다. 세균은 10-150 미만의 e-값 및 97% 초과의 동일성인 300 bp 초과 길이의 서열을 사용하여 확인하였고 진균은 10-180 미만의 e-값 및 99% 초과의 동일성인 300 bp 초과 길이의 서열을 사용하여 확인하였다. 최소 100개의 속성(attributed) 서열 및 서열의 총 수의 1% 이상을 나타내는 식별만이 고려되었다.
샷건 메타게노믹스
SM DNA 라이브러리는 제조사의 프로토콜16에 따라 0.2ng/mL의 5mL 추출물과 Nextera XT DNA(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 준비했다. RNA 라이브러리는 10 ng/mL의 10 mL 추출물과 Human RiboZero TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 이미 보고된 바와 같이17 병렬로 준비하였다. 각 라이브러리의 품질 및 수량은 TM과 동일한 프로토콜을 사용하여 평가하였다. DNA 및 RNA 라이브러리는 DNA와 RNA를 분리하여 분석할 수 있도록 태그를 붙였다. 그런다음 DNA와 RNA는 NextSeq500 Illumina 장치(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에서 High Output Kit v2, 2x150bp를 사용한 풀링, 변성 및 페어-엔드 시퀀싱 전에 동일한 농도(1.8pM)로 정규화하였다[9].
시퀀싱 후, 비인간 RNA 및 DNA는 모듈 모자이크로 구성된 본 출원인의 회사내 MetaMIC® 소프트웨어(IDDN.FR.001.160012.000.S.C.2018.000.31230)를 사용하여 별도로 분석했다. R1 및 R2 파일로 구성된 페어-엔드 서열은 먼저 R1의 식별을 이용하여 분석하였다. R1이 참조로 식별된 경우, R2는 참조에서 R1의 식별 위치 주변의 1000bp의 창(window)에서 식별을 위해 테스트하였다. 식별된 미생물의 최종 계수를 위해 확인된 R1/R2 쌍만을 유지하였다. Phred 점수가 20 미만인 서열은 제거하였다. hg19 데이터베이스(전체 데이터 세트 GRCh37/hg19, 2009년 2월)를 사용하여 인간 서열을 제거했다. 비인간 서열의 식별 및 게놈 재구성은 알려진 모든 미생물을 포함하는 정리된 NCBI nt 및 nr(Genbank 릴리스 215, 2016년 10월) 데이터베이스, 및 특정의 회사내 세균, 진균 및 바이러스 데이터베이스를 사용하여 수행하였다. 식별된 각 종에 대해, 해당 서열의 수를 서열의 총 수로 정규화한 후 샘플의 서열에서 음성 대조군 서열을 감했다. 100개 이상의 식별 서열이 있는 경우, 해당 종은 샘플에 존재하고 샘플 양성인 것으로 간주하였다. 세균 서열/인간 서열 비율을 사용하여 세균에 대해 상대적인 정량화를 수행하였다.
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연구 모집단
NSTI의 임상적 의심에 대한 연구 기간 동안 입원한 모든 성인 환자가 포함되었다(도 1). 진단의 확인은 진피 및 피하 조직으로부터 더 깊은 근막 및 근육에 이르는 연조직 구획의 층들의 일부 또는 모두를 포함하는 괴사성 성분에 대한 수술 소견을 기반으로 했다. 샘플은 NSTI가 의심되는 환자 66명 중 34명에 대한 메타게노믹스 연구에 충분한 양으로 이용 가능했다. 이 34명의 환자가 연구 그룹을 구성한다. 연령, 성별, 동반 질환, 중환자실 입원, 직접 입원 또는 다른 시설로부터의 이송, 입원 후 수술 지연, 수술 전 투여된 항생제 및 임상 결과(사망 포함)를 포함한 매개 변수를 표준화된 파일에 기록하였다. 항생제는 치료 표준으로 간주되는 표준 배양 기반 접근법의 결과에 따라 조정되었다(아래 참조).
샘플
환자들은 피부, 피하 지방, 근막 및 근육을 포함한 모든 괴사 및 비혈관 조직의 광범위한 괴사 조직 제거술을 받았다. 필요한 경우, 깊은 근막절개를 수행했다. 절단된 사지는 샘플링하지 않았다. 안전한 조직과 괴사 조직('감염된 샘플') 사이의 경계면과, 34명의 환자 중 10명의 하위 그룹의 경우 감염의 초점을 둘러싸는 거시적으로 건강한 조직으로 정의된 비괴사 조직('건강한 샘플')으로부터 심부 생검을 무균 상태로 채취했다. 샘플은 실온에서 2시간 이내에 미생물학과(24시간 연중무휴)로 보냈다.
표준 미생물학 및 메타게노믹스 절차
모든 생검은 하기 방법에 의해 검사하였다: (i) 표준화된 미생물학적 절차, (ii) 박테리아 16S 리보솜 유전자의 V1-V2(16S-V1V2) 및 V3-V4(16S-V3V4) 도메인 및 2개의 리보솜 진균 내부 전사 스페이서(ITS) 영역 ITS1 및 ITS2의 TM, 및 (iii) 편향되지 않은 회사내 반정량적 범미생물 DNA 및 RNA 기반 SM 방법인 MetaMIC. 본 발명의 SM 방법은 추출 단계에서 DNase 또는 포획 농축(capture enrichment)이 사용되지 않았기 때문에 편향되지 않은 것으로 간주되었다. 확인된 모든 미생물은 감염 과정의 원인이 되는 것으로 간주되었다.
통계 분석
NSTI의 세균 병인을 식별하는 능력에 대해 세 가지 진단 방법을 비교했다. 최적 표준이 없는 경우, 단일 방법에 의해 제공된 결과와 세 가지 방법(배양, TM 및 SM)에 의해 생성된 정보의 합으로 얻은 결과를 비교하여 민감도를 평가했다. 세 가지 방법 사이의 상관 관계를 kappa 계수로 평가하였으며, 그의 강도는 다음과 같이 간주하였다: 0.01 내지 0.20: 미미, 0.21 내지 0.40: 좋음(fair), 0.41 내지 0.60: 보통, 0.61 내지 0.80: 강함, 0.81 내지 1.00: 거의 완벽.
정량적 데이터에 대한 t-검정 또는 Mann-Whitney 검정 및 범주형(categorical) 데이터에 대한 v2-검정 또는 Fisher의 정확 검정을 기반으로 한 조정되지 않은 비교를 수행하여 어떤 환자 특성이 TM 및/또는 SM의 긍정적인 기여와 관련이 있는지를 이해했다.
데이터는 분포 정규성에 따라 연속 데이터의 경우 평균 ± SD 또는 중앙값(사분위수 범위)으로, 범주형 데이터의 경우 비율(%)로 기재한다. 0.05 미만의 양측 P-값은 유의한 것으로 간주하였다. Stata 소프트웨어 버전 14ㆍ1(StataCorp LP사, 미국 텍사스주 칼리지 스테이션)를 사용하여 통계 분석을 수행했다.
결과
환자
66명의 환자가 자격이 있었다. 샘플은 연구에 포함된 34명의 메타게노믹스 연구에 충분한 양으로 제공되었다(도 1). 환자로부터 34개의 괴사 샘플과 10개의 '건강한' 샘플을 수집했다. 환자의 74%(34명 중 25명)가 동반질환을 가지고 있었으며, 가장 흔한 동반질환은 당뇨병(38%, 34명 중 13명), 면역억제(29%, 34명 중 10명), 및 비만(26%, 34명 중 9명)이었다. 항생제에의 이전 노출은 환자의 68%(34명 중 23명)에서 보고되었다. 모든 환자는 최소 1회 이상 괴사조직제거 수술을 받았고, 97%(34명 중 33명)는 국내 가이드라인에 따라 광범위 항생제로 경험적 치료를 받았다. 환자의 50%(34명 중 17명)가 중환자실에 입원했고 6%(34명 중 2명)가 입원 중 사망했다.
표준 배양과 비교한 표적 및 샷건 메타게노믹스의 진단적 가치의 평가
표준 배양의 결과
감염된 샘플은 고전적 배양 방법의 경우 환자의 74%(34명 중 25명)에 대해 양성이었다(도 2a). 배양 결과, 하기와 같이 사례의 41%(34개 중 14개 사례)에서 단 하나의 세균 종만이 확인되었다: 황색포도상구균(5개 사례), 화농성연쇄상구균(4개 사례), 녹농균(3개 사례), 헤모필러스 인플루엔자균(1개 사례), 및 응고효소-음성 포도상구균(1개 사례)(도 2b). 하기와 같이 사례의 32%(34개 중 11개)에서 복합미생물 배양(polymicrobial culture)이 관찰되었다: 황색포도상구균(4개 사례), 화농성연쇄상구균(3개 사례), 장내 세균(9개 사례), 비발효 그람 음성 간균(NF-GNB)(3개 사례), 장구균(4개 사례), 기타(3개 사례) 및 칸디다 알비칸스와 칸디다 트로피칼리스의 혼합(1개 사레)(도 2b). 혐기성 세균은 발견되지 않았다.
메타게노믹스 방법의 결과
TM은 16S V1-V2(샘플당 평균 74,890 ± 34,158개 서열)를 사용한 경우 괴사 조직의 44%(34개 중 15개) 및 16S V3-V4(샘플당 평균 282,681 ± 85,776개 서열)을 사용한 경우 74%(34개 중 25개)에 대하여 양성 결과(세균 및/또는 진균의 존재)를 나타냈다(도 2a). 2개의 16S 표적 간에 세균 식별에 대한 불일치가 없었고, V1-V2의 명백한 민감도 부족으로 인해 V3-V4 결과만이 기술의 비교에 사용되었다. SM은 DNA와 RNA(샘플당 평균 35,468,679 ± 11,964,012개 RNA 서열 및 샘플당 39,218,559 ± 4,969,662개 DNA 서열)를 사용한 경우 괴사 샘플의 79%(34개 중 27개)에 대해 양성 결과를 나타냈다. 서열의 품질(Q30)은 제조사에서 권장하는 것보다 높았다(> 90%). 양성 대조군의 모든 병원체가 적절하게 식별되었다(데이터 미도시). 서열은 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스(PRJNA553328)에서 입수할 수 있다.
TM에 의해 단일미생물 감염은 다음과 같이 사례의 53%(34개 중 18개 사례)에서 보고되었다: 황색포도상구균(2개 사례), 화농성연쇄상구균(7개 사례), 스트렙토코커스 디스갈락티애(1개 사례), 대장균(1개 사레), NF-GNB(5개 사례), 클로스트리디움 퍼프린젠스(1개 사레) 및 기타(1개 사레). SM에 의해 단일미생물 감염은 다음과 같이 사례의 38%(34개 중 13개 사례)에서 보고되었다: 황색포도상구균(3개 사례), 화농성연쇄상구균(4개 사례), 대장균(1개 사레), NF-GNB(3개 사레) 및 기타(2개 사레)(도 2b). 복합세균 종은 TM에 의해 다음과 같이 사례의 21%(34개 중 7개 사례)에서 식별되었다: 황색포도상구균(3개 사례), 화농성연쇄상구균(1개 사례), 스트렙토코커스 애갈락티에(1개 사례), 장내 세균(2개 사레), NF-GNB(2개 사레) 및 칸디다 알비칸스(1개 사례)(도 2b). SM은 다음과 같이 사례의 41%(34개 중 14개 사례)에서 복합균 감염(polymicrobial infection)을 나타냈다: 황색포도상구균(3개 사례), 화농성연쇄상구균(4개 사례), 장내 세균(7개 사례), NF-GNB(4개 사례), 혐기성 세균(7개 사례), 칸디다 알비칸스(1개 사례) 및 기타(4개 사례). 34명의 환자 모두에서 바이러스 DNA나 RNA가 확인되지 않았다.
괴사 샘플에서 미생물 식별을 위한 세 가지 방법의 비교
적어도 하나의 미생물 종의 존재로 정의되는 양성 결과는 배양에 의해 샘플의 74%(34개 중 25개), TM에 의해 74%(34개 중 25개), SM에 의해 79%(34개 중 27개)에서 얻어졌다.
종합하면, 그람 양성 구균, 장내세균, NF-GNB 및 혐기성 세균의 검출에 대한 민감도는 배양의 경우 각각 81%, 70%, 70% 및 0%, TM이 경우 각각 56%, 30%, 80% 및 50%, SM의 경우 67%, 70%, 90% 및 100% 였다. SM은 모든 세균의 검출에 대해 TM보다 훨씬 더 민감했고(P = 0.02), 혐기성 세균의 검출에 대해 표준 배양보다 더 민감했다(P <0.01). 표준 배양은 그람 양성 구균의 검출에 대해 TM보다 더 민감했다(P = 0.04)(도 2c).
샘플의 15%(34개 중 5개)만이 세 가지 테스트된 방법에서 음성 결과를 보였다. 세 가지 방법은 사례의 21%(34개 중 7개)에서 미생물의 전체 스펙트럼을 식별한 반면, 모든 미생물은 추가 사례의 18%(34개 중 6개)에서 배양 및 SM 모두에 의해 식별되었다. 나머지 16개 사례에서는 배양에 의해 5개 사례, SM에 의해 11개 사례에서 완전한 식별이 얻어졌다(도 2d). 본 발명자들은 TM이 NSTI에서 감염원의 완전한 식별을 제공하는데 있어서 다른 두 가지 방법보다 열등하다는 것을 확인한 반면(P = 0.02), 결과가 통계적으로 유의하지는 않았지만 SM에 의한 정확한 식별의 수는 배양에 의한 것보다 높았다(P = 0.08).
세 가지 방법 간의 상관관계
요약하면, kappa 계수는 배양과 TM 사이에 0.22(50% 일치, P = 0.03), 배양과 SM 사이에 0.41(61% 일치, P < 0.001), TM과 SM 사이에 0.47(65% 일치, P < 0.001)이었다. 배양에서 세균 반정량화와 SM에서 박테리아 대 인간 서열 비율 사이에는 강한 상관관계가 있었다(r = 0.71, P < 0.001; 도 3a).
샷견 메타게노믹스가 다른 방법보다 더 완전한 병원체 식별을 제공한 환자 분석
SM은 11명의 환자에 대해 다른 두 가지 방법보다 더 완전한 병원체 식별을 나타냈다. 이들 환자를 23명의 다른 환자들과 비교한 결과, 진성 당뇨병이 유일하게 유의미한 차별화 요인인 것으로 나타났다(교차비(odds ratio) 5.0, 95% 신뢰 구간 1.1-23.2; P = 0.04). 또한 본 발명자들은 결과가 통계적으로 유의하지는 않았지만 75세 이상의 환자에서 더 높은 비율을 관찰했다(교차비 4.0, 95% 신뢰 구간 0.8-16.7; P = 0.08). 다른 검사된 특성(성별, 중환자실 첫 입원, 비만, 면역억제, 입원 전 항생제 요법, 이전의 스테로이드 섭취, 이전의 수술 절차, 입원 일수 또는 NSTI 유형을 포함) 중 어느 것도 SM을 사용한 향상된 진단과 관련이 없었다.
비-괴사성 '건강한' 조직의 평가
10개의 건강한 샘플 중 6개(NSTI 환자의 비괴사 조직에서 채취한 샘플)는 배양에서 음성이었다. 본 발명자들은 두 개의 사례, 즉, 황색포도상구균(1개 사례) 및 녹농균(1개 사례)에서 단일 미생물 성장을 관찰한 반면, 다른 두 개의 사례에서 다음과 같이 복합 미생물 성장을 관찰했다: 대장균, 엔테로코쿠스 파시움 및 황색포도상구균(1개 사례) 및 프로비덴시아 스투아르테, 시트로박터 프룬디 및 응고효소-음성 포도상구균(1개 사례). 이들 4개 사례 중 3개 사례는 건강한 조직과 괴사 조직 사이에 완전한 일치를 보였다.
6개의 건강한 샘플은 음성이었고 4개는 TM에 의해 양성이었는데, 단일미생물 결과는 다음과 같았다: 황색포도상구균(1개 사례), 화농성연쇄상구균(1개 사례), 프로비덴시아 스투아르티(1개 사례) 및 슈도모나스 애루지노사(1개 사례). 이들 4개 사례 중 3개 사례는 건강한 샘플과 감염된 샘플 간에 완전한 일치를 보여주었다. 일치하지 않는 경우, 괴사 조직이 아니라 건강한 조직에서는 병원체가 발견되었다.
10개의 '건강한' 비괴사성 샘플 중 3개만이 SM에 의해 음성이었다. 5개의 샘플은 다음과 같이 단일균 감염이었다: 황색포도상구균(2개 사례), 화농성연쇄상구균(1개 사례) 및 슈도모나스 애루지노사(2개 사례). 2개 샘플은 다음과 같이 복합균 감염이었다: 프로비덴시아 스투아르테, 시트로박터 프룬디 및 모르가넬라 모르가니이(1개 사례), 및 대장균, 엔테로코쿠스 파시움 및 황색포도상구균(1개 사례). 이들 7개 사례 중 6개는 '건강한' 샘플과 괴사 샘플 간에 완전한 일치를 보였다. 세균 대 인간 서열의 정량적 비율은 두 부위에서 테스트된 10명의 환자의 경우 괴사 조직보다 건강한 조직에서 훨씬 더 작았다(P = 0.02, 도 3b).
결론
본 발명자들은 NSTI 환자로부터 전향적으로 수집된 조직에 대한 원래의 편향되지 않은 반정량적 범미생물 DNA- 및 RNA-기반 SM 방법의 성능을 평가하고자 하였다.
NSTI 환자를 평가하기 위해 두 가지 다른 메타게노믹스 접근법인 TM 및 편향되지 않은 SM을 표준 배양과 함께 병행하여 사용했다. 종합하면, SM은 광범위한 병원체를 검출하는데 있어서 TM보다 훨씬 더 우수했으며 엄격한 혐기성 미생물을 식별하는데는 배양보다 훨씬 더 우수했다. TM 및 SM은 엄격한 혐기성 미생물을 표준 배양보다 훨씬 더 잘 식별했고 더 많은 NF-GNB의 식별을 가능하게 했다.
결론적으로, SM은 피부 조직에서 다양한 미생물의 검출을 통해 병원체 식별에 아주 적합한 새로운 NGS 기반 방법이다. 일상적인 사용을 위해 설정하는 것은 여전히 복잡하지만, SM의 결과는 복합 미생물 및 혐기성 감염에 대한 더 나은 민감도와 함께 고전적인 배양 기반 접근법의 결과와 관련이 있다. SM 기반 진단을 사용하는 전략은 치료 의사가 환자의 완전한 미생물학적 프로파일링을 기반으로 개인적으로 맞춤화된 결정을 내릴 수 있게 함으로써 전염병의 양상을 바꿀 수 있다.
실시예 2:
요약:
이식 수혜자의 심부 피부 진균증은 피부 및 피하 조직의 진균 침입에 의해 자주 발생하는 감염이며, 외상 접종 후 자주 발생한다. 이들 진균증은 종종 토양으로부터 유래하는 희귀하거나 새로운 기회 곰팡이(opportunistic fungal) 병원체를 포함하므로, 종 식별이 어렵다. 샷건 메타게노믹스(SMg)는 범병원체 검출, 특히 임상 샘플로부토 진균의 정확한 식별을 위한 포괄적인 방법이다. 그러나, 진균 감염은 불완전한 유전 지식과 식별을 위한 게놈 정보성의 낮은 가치 때문에 지금까지 이러한 기법에 의해서는 제대로 탐색되지 않았다. 본 연구에서 본 발명자들은 피하 진균 감염을 나타내는 신장 이식 수용자의 코호트에서 SMg 접근법을 검증하는 것을 제안한다.
기존의 진균학 기법(현미경 관찰, 배양, 질량 분석, 분자 생물학)에 의해 특성규명된 진균 피하 감염이 있는 13명의 신장 이식 환자의 생검을 SMg로 검사했다. 본 발명자들의 실험실에서 일상적으로 사용되는 ISO 15189-인증 범병원체 SMg 기법은 특정 범병원체 추출 및 DNA/RNA 라이브러리 준비 이후에 실행되었으며, NextSeq500(Ilumina사)을 이용한 시퀀싱 및 MetaMIC 소프트웨어를 이용한 분석이 수행되었다. 정보를 제공하는 진균 유전자를 포함하는 알고리즘이 정확한 종 식별을 가능하게 하기 위해 개발되었다.
DNA 서열을 기반으로, 13명 중 7명의 환자만이 양성으로 진단될 수 있었고, RNA 서열을 사용하는 경우 13명 중 13명의 환자가 속 수준에서 정확한 식별로 선별되었다. 유병기생충(etiological agent)은 피부사상균(n=6), 선균류(hyphomycetes)(n=3), 피부사상균(n=2), 및 조균목(mucorales)(n=2)를 포함하였다. 이들 13명의 환자 중 9명에서 높은 신뢰도로 종 수준에서 진균이 확인되었다. 진균 부하는 DNA 부하와 비교하여 RNA 부하의 중앙값이 1.93-log 더 높은 것으로 측정될 수 있었으며, 이는 두 마커 사이의 민감도 차이를 설명한다.
결론적으로, 편향되지 않은 RNA 시퀀싱을 사용하는 메타게노믹스는, 인간 유전 물질에 비해 포함된 진균 유전 물질의 양이 적기 때문에 어려운 매트릭스인 피부 생검에서도 진균 병원체를 식별하는 SMg 방법의 효율성을 향상시킨다. 본 발명자들은 극한 상황에서, SMg가 신뢰할 수 있는 진균 식별을 제공하여 범병원성 스펙트럼을 확인하는 능력이 있음을 보여줄 수 있었다. 또한, 이러한 ISO 15189-인증 방법은 희귀 병원체와 관련된 복잡한 감염 사례에 완벽하게 적합한 것으로 입증되었다.
방법:
추출. 이전에 기술된 바와 같이[Rodriguez 등; BJD 2019; Deschamps 등; BJD 2019], 생검(10 내지 50 mg)을 50-60 Hz에서 210초 동안 400 μL의 등장성 멸균 용액과 강철 비드가 들어 있는 멸균 일회용 튜브(IKA® Ultra-Turrax® Tube Drive, 독일 Staufen)에서 분쇄하고 2mL Sarsted 튜브에 옮겼다. 화학적 세포파쇄액 및 프로테이나제 K(Proteinase K)와 결합된 비드 비팅(bead beating)을 이용한 사전 추출 단계를 수행한 후, QiaSymphony(Qiagen사, 독일 Hilden)를 사용한 추출을 수행하였다. 환경 대조군(등장 멸균 용액) 및 양성 대조군(ZymoBIOMICSTM Microbial Community Standards, Ozyme)을 각각의 표적 또는 샷건 메타게노믹스 실행에서 테스트했다. 또한, 5개의 블랭크 샘플(등장 멸균 용액)을 별도의 실행에서 사용하여 특히 진균에 대한 검출 블랭크(BoD) 및 검출 한계(LoD)를 계산했다.
표적 메타게노믹스. 표적 메타게노믹스는 2개의 리보솜 진균 내부 전사 스페이서(ITS) 영역 ITS1 및 ITS2의 2개 앰플리콘 라이브러리에 대한 연구를 포함하였다(Sitterle 등, 프런트 2017). 각각의 앰플리콘은 제조사(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에서 제공한 "16S 메타게노믹 시퀀싱 라이브러리 준비 프로토콜"에 따라 5μL의 추출물로부터 제조하였다. 각 라이브러리에 대해, 품질과 양은 각각 TapeStation(Agilent사, 미국 캘리포니아주 산타클라라)에서 D1000 ScreenTape 및 Mithras LB 940(Berthold Technologies사, 독일 Bad Wildbad)에서 Quant-it dsDNA 분석 키트(ThermoFischer사, 미국 메사츄세츠주 월샘)에 의해 평가하였다. 모든 라이브러리는 MiSeq 장치(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에서 페어-엔드 시퀀싱(v3, 2 x 300 bp) 전에 4 nM에서 정규화하고 풀링 및 변성시켰다. 표적 세균 및 진균 부위는 제조사의 지침에 따라 시퀀싱하였으며 본 출원인의 회사내 소프트웨어 PyroMIC®(Sitterle 등, 2017)을 통해 전용 데이터베이스와 비교하였다. 간단히 말해서, 페어-엔드 서열들을 병합한 후, 50bp 미만의 리드값과 20 미만의 Phred 품질 점수를 가진 서열을 제거하였다. 키메라 서열은 센스 및 안티센스 리드 모두에 의해 제공된 식별을 비교함으로써 검출하였다. 식별이 일치하지 않은 경우, 서열은 키메라로 간주하여 제거하였다. 나머지 서열은 정리된 NCBI 데이터베이스(2017년 11월)를 기반으로 회사내 진균 데이터베이스를 이용하여 블라스트(blast)하였다(Pruitt KD; NAR, 2007). 적절한 식별을 위해 사용된 매개변수는 300bp보다 큰 서열 길이, 10-180 미만의 e-값 및 99% 초과의 동일성이었다. 최소 >100개의 속성(attributed) 서열 및 총 서열 수의 1% 이상을 나타내는 식별을 고려했다.
샷건 메타게노믹스 실험. 제조사의 프로토콜에 따라, 0.2 ng/μL 농도의 5 μL의 추출물을 사용을 사용하여 Nextera XT DNA(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 통해 DNA 샷건 메타게노믹스 라이브러리를 준비했다. RNA 라이브러리는 이미 보고된 바와 같이 10ng/μL 농도의 추출물 10μL와 RNA Human RiboZero TruSeq Stranded Total RNA Library Prep 키트(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 병렬로 준비하였다. 각 라이브러리에 대해, 표적 메타게노믹스의 경우와 동일한 프로토콜에 따라 품질과 양을 평가했다. DNA와 RNA 라이브러리는 DNA와 RNA를 분리하여 분석할 수 있도록 태그를 붙였다. DNA와 RNA는 NextSeq500 Illumina 장치(Illumina사, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에서 High Output Kit v2, 2x150bp를 사용하여 풀링, 변성 및 페어 엔드 시퀀싱하기 전에 동일한 농도(1.8pM)에서 정규화하였다.
샷건 메타게노믹스 데이터 분석. 시퀀싱 후, 생성된 RNA 및 DNA 서열은 모듈 모자이크로 구성된 본 출원인의 회사내 MetaMIC 소프트웨어를 이용하여 별도로 분석하였다. 첫 번째 모듈은 hg19 데이터베이스(전체 데이터 세트 GRCh37/hg19, 2009년 2월)를 사용하여 품질이 낮은 서열(Phred 점수 <20), 정보가 없는 단일 중합체 서열 및 인간 서열을 제거한다. 두 번째 모듈은 NCBI nt 및 nr(Genbank 릴리스 230, 2019년 2월) 정리 데이터베이스를 사용하여 미생물의 식별을 수행한다. 이러한 식별 단계 후, 각 샘플(환자 샘플, 환경 대조군 및 블랭크 샘플) 유래의 각 미생물 서열에 식별 태그를 붙였다.
5개의 블랭크 샘플을 사용하여 가양성 미생물 서열로부터 평균 블랭크(Mean Blank), 블랭크 한계[LoB= Mean Blank+1.65*Stdev Blank] 및 검출율 한계[LoD = Mean Blank+3.3*Stdev Blank]를 평가했으며, LoD는 환자 샘플에 대한 양성 컷오프로 사용하였다. [Little, "Method Validation Essentials, Limit of Blank, Limit of Detection, and Limit of Quantitation," BioPharm International 28 (4) 2015].
환자 샘플 유래의 서열은 환경 대조군에서 공통적으로 발견되는 서열을 사용하여 세척(clean)하였다. 다음으로 세균, 바이러스 및 기생충에 대해서는 종 수준에서, 진균에 대해서는 속 수준에서 각각의 나머지 미생물에 대한 비율(미생물 서열의 수/인간 서열의 수)을 결정하였다. LoD를 초과하는 모든 식별은 양성으로 해석하였다.
특히 진균의 경우, 전용 모듈을 이용하여 종 수준에서 동정의 신뢰도를 확인하였다. 후자는 특정 속(genus)에 속하는 서열의 종 식별 분포로부터 계산된 Simpson 지수를 기반으로 한다. 분포 지수가 높은 경우, 서열들은 모두 한 종에 속했고, 이는 정보가 신뢰할 수 있다는 사실을 뒷받침한다. 지수가 낮은 경우, 진균 종 식별의 히트맵을 계산하였다. 히트맵은 선택된 진균 유전자(ITS, LSU…)의 데이터베이스를 통해 식별되는 것으로 알려진 유전자에 속하는 진균 서열만을 사용하는 것으로 구성되었다. 이 단계의 종료 시, 동일한 종 유래의 적어도 3개의 서로 다른 식별 유전자가 양성인 경우, "종" 정보를 검증했다. 그렇지 않으면, 속만을 반환하였다.
결과:
환자 생검은 권장된 바와 같이, Q30 품질 점수 >75%인 샘플당 40,276,258개[범위: 24,919,804개 내지 72,8725,50개] DNA 서열 및 25,049,534개[범위: 13,479,338개 내지 476,727,578개] RNA 서열의 중앙값으로 SMg에 의해 시퀀싱하였다.
블랭크 샘플을 기반으로 한 진균 LoB 및 LoD 비율은 1.00e-6으로 설정하였다. LoD는 환자 샘플에 대한 양성의 하한값으로 사용하였다. DNA 및 RNA 진균 비율(진균 서열의 수/인간 서열의 수)도 계산하여 보고했다. LoD 컷오프를 사용하여, RNA 정보를 사용하면 13명 중 13명의 환자가 진균 감염에 대해 양성인 반면, DNA 정보를 사용하면 13명 중 6명만이 양성이었다. 4개의 추가의 환자 샘플에는 검출된 진균 유래의 DNA 서열이 포함되어 있었지만 LoB 미만이었다. 즉, 배경 노이즈보다 양이 많지 않았다. DNA와 비율의 비교는 1.93 log의 차이를 보였고, 이는 RNA 양이 DNA 양보다 약 100배 더 많다는 것을 시사한다. 따라서, 진균의 유무를 검출하기 위해 RNA를 사용하는 것이 바람직했다.
환자 3, 4, 6, 8, 10 및 11에서 진균의 최종 식별은 높은 Simpson 지수에 의해 뒷받침되었고 그 결과는 추가 분석 없이 전달되었다. 대조적으로, 환자 1, 2, 5, 7, 9 및 12는 Heatmap 접근법을 통해 검사하였다. 이러한 추가 도구를 사용하여, 환자 1, 2 및 12는 최소 3개의 유전자에 대한 양성 임계값에 도달하지 않았으므로 알터나리아 종(Alternaria sp.)에 대해 양성으로 간주된 반면, 환자 5, 7 및 9는 종 수준에서 식별되었으며 각각 알터나리아 인펙토리아, 알터나리아 로새(Alternaria rosae) 및 스케도스포리움 아피오스페르뭄(Scedosporium apiospermum)에 감염된 것으로 확인되었다.
진균 식별 접근법의 비교
사용된 서로 다른 기술 간에는 거의 차이가 없었다. ITS는 그의 성 상태인 슈도알레쉐리아 보이디(Pseudallescheria boydii) 하에서 식별된 스케도스포리움 아피오스페르뭄(Scedosporium apiospermum)에 대해 다른 결과를 나타낸 반면, SMg는 속 수준에서 모든 식별을 나타냈다. 실제로 무코 서시넬로이드(Mucor circinelloides)는 리조무코 바리아빌리스(Rhizomucor variabilis)의 동의어로 간주되고[Mucormycosis Caused by Unusual Mucormycetes, Non-Rhizopus, -Mucor, and -Lichtheimia Species; Marisa Z. R. Gomes; Clin Microbiol Rev. 2011 Apr; 24(2): 411-445], 및 파에실로미세스 릴라시누스(Paecilomyces lilacinus)는 푸르푸레오실리움 릴라시눔(Purpurocillium lilacinum)의 동의어로 간주된다. 그럼에도 불구하고, SMg는 동일한 분석에서 동정된 바이러스 및 세균 외에도, 다른 기법으로 속(genus) 수준만이 동정된 4명의 환자에서 높은 신뢰도로 종(species) 수준에서 진균을 동정할 수 있었다.
고찰:
샷건 메타게노믹스는 특히 피부 생검에서 비정형 진균의 맥락에서 진균 감염 진단에 대해 지금까지 제대로 평가되지 않은 유망한 기법이다. 본 발명자들은 본원에서 배양에 의한 진균 진단 및 ITS를 이용한 분자 생물학에 의한 진균 진단의 일반적인 기법과 비교하여 범병원성 SMg 기법의 평가를 보고한다.
본 발명의 SMg 기법은 배경 노이즈를 평가하여 신뢰할 수 있는 검출 한계를 설정하는 것을 가능하게 한다. DNA 서열 대신 RNA 염기서열 사용에 추가된 이러한 계산 방법은 이 기법의 민감도를 최대화하여, 결국 정확한 진균 동정과 함께 양성으로 확인된 13개 중 13개 샘플의 점수를 얻는 것을 가능하게 했다. 진균 RNA는 과거에 무시되었지만 이의 사용에는 2가지 이점이 있다. 첫 번째 이점은 진균 DNA보다 100배 더 많은 이 핵산의 양과 관련이 있고, 두 번째 이점은 본 발명의 연구에서 식별 오류가 없다는 것에 의해 나타낸 바와 같이 분석의 특이성이다(이 점을 확인하기 위해서는 더 많은 환자가 검사될 필요가 있다).
이 기법은 관심 있는 기여 유전자를 선택함으로써 진균의 정확한 동정을 보장할 수 있기 때문에 다른 기법에 비해 부인할 수 없는 이점을 제공한다. 본 연구에서는, 모든 균류도 ITS로 식별할 수 있기 때문에 이점이 분명하지 않았지만, 이러한 이전 결과를 기반으로 부분적으로 선택되었다. 그럼에도 불구하고, ITS 영역이 항상 종 수준에서 식별을 제공할 수 있는 것은 아니며, 더욱이 이 영역에서의 증폭 민감도는 샘플에 존재하는 진균 핵산 복제 수에 밀접하게 의존한다는 것이 알려져 있다. 이 두 가지 중요한 제한은 SMg의 결과에 영향을 미치지 않는데, 왜냐하면 임의의 유전자가 기여할 수 있고 ITS 복제의 수는 전체 게놈 및 메타 전사체가 시퀀싱되기 때문에 영향을 미치지 않기 때문이다. 정보의 신뢰성을 평가하는 소프트웨어의 능력도 중요한 이점인데, 이는 종 구별 능력이 충분하지 않은 기법과 달리 SMg 결과는 과도하게 해석될 없기 때문이다. 본 연구에서 설명된 진균의 경우, 처리가 동일한 속의 모든 구성원에 대해 동일했기 때문에 종 정보는 처리 관리에 영향을 미치지 않았다.
환자에게 감염이 있을 때, 이 감염이 진균 기원인지를 예측하기 어려운 경우가 많다. 이것은 원인을 찾는데 필요한 미생물학적 조사의 수가 매우 많고 대량의 샘플이 필요함을 의미한다. 그러나, 본 발명자들의 연구에서와 같이, 생검이 필요한 심부 감염의 맥락에서, 생검의 이용가능한 부피는 기존의 접근법을 수행하기 위한 선택을 필요로 하게 한다. SMg는 선험 없이 필요한 모든 탐색을 수행하기 위해 합리적인 샘플 부피를 필요로 한다는 이점이 있다. 이전의 연구에서는 아직 알려지지 않은 새로운 병원체를 포함하여 세균 및 바이러스를 검출하고 식별하는 기법의 능력을 입증했다. 본 연구는 이러한 발견을 완성하고 SMg의 범병원체 검출 능력을 입증한다.
결론:
결론적으로, SMg는 임상 미생물학에서 일상적으로 사용되는 다른 기법의 민민감도와 동일한 민감도로 다른 미생물과 함께 복잡한 매트릭스에서 비정형 진균 감염을 검출하고 특성 규명하는 그의 능력을 입증했다. 선험적이지 않은 이러한 접근법은 물질의 양이 적고 의심되는 감염을 기존 기법을 통해 검출하고 특성 규명하기 어려운 경우에 특히 흥미로운 것이다.
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Claims (12)

  1. 감염원(infectious agent)을 식별하는 방법으로서,
    a. 핵산 서열의 샘플을 제공하는 단계;
    b. 상기 핵산 서열의 샘플로부터 고품질 핵산 서열을 분리하는 단계;
    c. 상기 고품질 핵산 서열로부터 적어도 하나의 비동물성 고품질 핵산 서열을 분리하는 단계;
    d. 복수의 알려진 서열 중에서 가장 가까운 알려진 서열을 식별하는 단계로서, 상기 가장 가까운 알려진 서열은 상기 복수의 알려진 서열 중에서 상기 적어도 하나의 비동물성 고품질 핵산 서열과 가장 많은 양의 정보를 공유하고, 상기 복수의 알려진 서열은 감염원, 바람직하게는 적어도 하나의 관심 있는 진균 판별 유전자의 서열을 포함하고, 상기 식별은 상기 감염원을 나타내는, 가장 가까운 알려진 서열을 식별하는 단계;를 포함하는, 감염원을 식별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 a는 핵산 서열을 추출하는 것으로 구성된 하위 단계를 포함하고, 상기 하위 단계는 추출의 진행 및 샘플의 출처의 적어도 하나를 포함하는 정보를 생성하도록 모니터링되는, 감염원을 식별하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단계 a에서 제공된 핵산 서열의 샘플은 RNA 서열의 샘플인, 감염원을 식별하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b에서 분리된 고품질 핵산 서열은 미리 결정된 임계값 이상의 품질을 갖는 서열인, 감염원을 식별하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 d의 복수의 알려진 서열은 데이터베이스인, 감염원을 식별하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 데이터베이스는 NCBI 데이터베이스, 바람직하게는 풍부한(enriched) NCBI 데이터베이스를 포함하는, 감염원을 식별하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    가장 가까운 알려진 서열과 적어도 하나의 비인간 고품질 핵산 서열 사이의 공유된 정보의 양이 미리 결정된 임계값 이상인지 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는, 감염원을 식별하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    분석 보고, 바람직하게는 관심 포맷의 분석 보고를 생성하는 단계를 더 포함하는, 감염원을 식별하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a의 핵산 서열의 제공된 샘플은 세균, 진균, 기생충, 또는 바이러스 RNA 서열의 샘플인, 감염원을 식별하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    관심 핵산 서열이 없는 샘플로부터 고품질 핵산 서열을 분리하는 것으로 구성된 단계를 더 포함하는, 감염원을 식별하는 방법.
  11. 감염원을 식별하기 위한 키트로서:
    핵산 서열의 샘플을 제공받도록 구성된 샘플 제공자,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법을 구현하기 위한 수단, 및
    가장 가까운 알려진 서열을 기반으로 결과를 표시하기 위한 수단
    을 포함하는, 키트.
  12. 프로세서 또는 전자 제어 유닛에 의해 실행될 때, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하도록 구성된 코드를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품.
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