EP4440545A1 - Nanoparticules pour la liberation d'acides nucleiques - Google Patents

Nanoparticules pour la liberation d'acides nucleiques

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Publication number
EP4440545A1
EP4440545A1 EP22830156.0A EP22830156A EP4440545A1 EP 4440545 A1 EP4440545 A1 EP 4440545A1 EP 22830156 A EP22830156 A EP 22830156A EP 4440545 A1 EP4440545 A1 EP 4440545A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lipid
group
nanoparticle according
mrna
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22830156.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Giovanna LOLLO
Valentina ANDRETTO
David KRYZA
Eyad AL MOUAZEN
Mathieu REPELLIN
Stéphanie BRIANCON
Laurent Schaeffer
Arnaud JACQUIER
Laurent Coudert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
Universita degli Studi di Verona
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
Universita degli Studi di Verona
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Hospices Civils de Lyon HCL, Universite Claude Bernard Lyon 1, Universita degli Studi di Verona filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4440545A1 publication Critical patent/EP4440545A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to new vectors for the intracellular delivery of nucleic acids, in in vitro or ex vivo models, or for in vivo therapeutic applications.
  • Single- and double-stranded nucleic acids typically require a delivery system to reach their targets intact and efficiently, which can be physical (electroporation, assisted delivery by ultrasound) or by means of vectors of nanometric size.
  • the commonly used and most effective vectors for penetrating nucleic acids into the cytoplasm of a cell are cationic chemical molecules, of the lipid or polymer type, which associate by their charge with the nucleic acid and allow it to enter the cell.
  • nucleic acids DNA or RNA, small or large
  • Very effective in cultured cells they are less so in the body due to phenomena of trapping by the proteins and cells contained in the blood.
  • the prior patent EP 2389158 describes a composition based on an anionic macromolecule, which may for example be an alginic acid, and a cationic lipid.
  • This composition which also includes cholesterol, allows the release of a nucleic acid with a size of less than 200 nucleotides.
  • the inventors now propose novel nanoparticles which are both stable and allow targeted, intracellular release of the nucleic acid.
  • the nanoparticles of the invention include
  • each type of lipid (a), (b) and (c) can consist of a single or a mixture of several lipids of the same type (a), (b) and (c), respectively.
  • the nanoparticle is loaded with a nucleic acid.
  • a nanoparticle is useful for the intracellular delivery of said nucleic acid.
  • the nanoparticle of the invention is coated with at least one anionic polysaccharide, preferably hyaluronic acid.
  • the nanoparticle of the invention is typically free of cholesterol, or even of any steroid.
  • FIG. 1 is a schematic representation of uncoated lipoplex (LRC) and hyaluronic acid-coated (HLRC) complexes.
  • LRC uncoated lipoplex
  • HLRC hyaluronic acid-coated
  • Figure 2 shows cryo-TEM images of liposomes.
  • Figure 2A the classic morphology of unilamellar liposomes is shown without mRNA.
  • the interactions of liposomes with mRNA and mRNA/HA are reported in Figures 2B and 2C, respectively.
  • Figure 3 reports the results in terms of transfection efficiency, cell viability and internalization of THP-1 cells after transfection with liposomes (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; production by hydration of the lipid film) complexed with eGFP- mRNA at different N/P ratios.
  • LRC lipid nanoparticles
  • HLRC HA-coated nanoparticles
  • LRC D) and HLRC E) by THP-1 cells was measured at time points shown by flow cytometry using rhodamine fluorescent nanoparticles and with phase contrast and fluorescence microscopy 24 h post-transfection. All values are means ⁇ standard deviation of the mean and statistical analyzes were calculated using the one-way ANOVA test.
  • FIG. 4 represents the electrophoresis study of mRNA formulations complexed with DOPE/DOTAP/Coatsome SS-M liposomes at different N/P ratios (1, 5, 10 and 50) in the presence or absence of heparin for demonstrate the complexation and the presence of the nucleic acid in the lipoplexes.
  • Figure 5 reports the results in terms of transfection efficiency and cell viability of THP-1 cells after transfection with LRCs and HLRCs complexed (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; microfluidic manufacturing) with eGFP-mRNA at different ratios N/P.
  • Figure 6 reports the transfection efficiency of different lipid formulations loaded with mRNA at N/P ratios of 1.5 and 3 on C2C12 myoblasts to induce GFP expression.
  • Figure 7 reports the results in terms of transfection efficiency of C2C12 myoblasts after transfection with LRCs and HLRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; microfluidic fabrication) complexed with mRNA at an N/P ratio of 1.5 to induce GFP expression.
  • Figure 8 shows the distribution of HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; manufactured by microfluidics) labeled with PE-cyanine5 and associated with mRNA coding for the fluorescent protein mCherry after intramuscular administration in the anterior tibialis in the healthy Balb/C mouse.
  • HLRC DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; manufactured by microfluidics
  • Figure 9 shows the physico-chemical properties of HLRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; manufactured by microfluidics) loaded with pDNA.
  • Electrophoretic analysis of pDNA-loaded HLRCs for investigate DNA association efficiency in HLRCs C.
  • Cryo-TEM image of HLRCs loaded with pDNA at an N/P ratio of 1.5 D).
  • Figure 10 shows the rate of internalization of HLRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; fabrication by microfluidics) loaded with pDNA on C2C12 myoblasts.
  • Figure 11 shows the transfection efficiency of HLRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; microfluidic fabrication) loaded with pDNA at different N/P ratios on C2C12 myoblasts to induce GFP expression.
  • Figure 12 reports the transfection efficiency of different lipid formulations loaded with pDNA at N/P ratios of 1.5 and 3 on C2C12 myoblasts to induce GFP expression.
  • FIG. 13 shows the result of cell viability tests on C2C12 myoblasts transfected with HLRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; fabrication by microfluidics) loaded with pDNA at different N/P ratios. Values represent means ⁇ S.D (standard deviation).
  • Figure 14 shows the result of transfection efficiency of siRNA-HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; fabrication by microfluidics) at different doses on C2C12 myoblasts to inhibit the expression of the GFP protein.
  • Figure 15 reports transfection efficiency on C2C12 myoblasts from LRC and HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M; microfluidic manufacturing) complexed with at an N/P ratio of 1.5 and 3 with pDNA (encoding mScarlet protein) and mRNA (coding for GFP protein) at a mass ratio of 2:1. Transfection efficiency is assessed on the ability of the system to induce the expression of GFP, the mScarlet and simultaneously both at the same time.
  • lipoplex is meant a complex which vectorizes a nucleic acid, in particular a complex between (i) a nucleic acid and (ii) a nanoparticle as defined in the present description.
  • cationic lipid is meant a lipid possessing an overall positive charge.
  • a cationic lipid comprises a cationic polar head and one or more hydrophobic chain(s).
  • neutral lipid is meant a lipid whose overall charge is neutral, more particularly a zwitterionic lipid.
  • micelle is meant a spheroidal aggregate of amphiphilic molecules possessing a hydrophilic polar head and a hydrophobic chain.
  • liposome is understood to mean an artificial vesicle formed by concentric lipid bilayers, trapping aqueous compartments between them.
  • the "zeta potential” represents the electrical charge that a particle acquires thanks to the cloud of ions which surround it when it is in suspension or in solution. Indeed, when it is in motion in a liquid, it surrounds itself with ions organized in a “double electric layer”:
  • the “shear plane” delimits these two layers. It is the potential difference between the dispersion medium and the potential at the shear plane that defines the Zeta potential. This potential represents the measure of the intensity of repulsion or electrostatic attraction between particles.
  • the positive ⁇ (zeta) potential is crucial to ensure the efficiency of nucleic acid complexation, also having an impact on the colloidal stability of the particles due to the electrostatic repulsion between them.
  • the nanoparticles of the invention comprise at least one cationic lipid (a).
  • the cationic lipid is chosen from: lipopolyamines, such as 2- ⁇ 3-[Bis-(3-amino-propyl)-amino]-propylamino ⁇ -N-ditetradecyl carbamoyl methyl-acetamide (compound RPR209120), 2- ⁇ 3-[3-(3-Amino-propylamino)-propylamino]-propylamino ⁇ -N,N-dioctadecyl-acetamide (RPR120535) (Byk et al, J. Med.
  • lipopolyamines such as 2- ⁇ 3-[Bis-(3-amino-propyl)-amino]-propylamino ⁇ -N-ditetradecyl carbamoyl methyl-acetamide (compound RPR209120), 2- ⁇ 3-[3-(3-Amino-propylamino)-propylamino]-propylamino ⁇ -
  • SAINT-2 4(dioleyl)methylpyridinium chloride
  • SAINT-2 stearylamine
  • DiC14-amidine N-t-butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidine
  • DiC14-amidine 0,0'-dimyristyl N-lysylaspartate
  • DMKE O,O'-dimyristyl-N- lysyl glutamate
  • lipids comprising cationic heads of the guanidine (BGTC) or imidazole (DOTIM) type, alone or as a mixture.
  • BGTC guanidine
  • DOTIM imidazole
  • the cationic lipid is chosen from quaternary ammoniums as mentioned above.
  • the cationic lipid is DOTAP.
  • the cationic lipid is present in the nanoparticle in an amount comprised between 3 mM and 15 mM, preferably between 5 and 10 mM, more preferably 5 mM, and/or the molar ratio of cationic lipid relative to the other lipids is between 1:1 and 2:1.
  • the cationic lipid (a) is DOTAP, and the molar ratio of DOTAP to all of the other lipids (b) and (c) is between 1:1 and 2:1, preferably about 1:1.
  • the DOTAP is present in an amount between 3 mM and 15 mM, preferably between 5 and 10 mM, more preferably 5 mM.
  • the nanoparticles of the invention further comprise at least one neutral lipid (b).
  • neutral lipid examples include l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC ) and N'-(rac-1-[11-(F-octyl)undec-10-enyl]-2-(hexadecyl)glycero-3-phosphoethanoyl)-sperminecarboxamide), which can be used alone or in a mixture .
  • the neutral lipid is DOPE.
  • a preferred nanoparticle comprises a mixture of DOTAP and DOPE.
  • the mixture of DOTAP and DOPE and preferably in the form of liposome or lipid nanoparticle.
  • the nanoparticle of the invention is devoid of cholesterol, or even of any steroid.
  • the neutral lipid is present in the nanoparticle in an amount comprised between 1 mM and 10 mM, more preferably between 1 and 5 mM, preferably approximately 2.5 mM.
  • the nanoparticles of the invention also comprise at least one pH-sensitive lipid (c), different from the cationic lipid (a). These lipids are protonated at low pH, which charges them positively, but remain neutral at physiological pH.
  • pH-sensitive lipid ionizable lipids, in particular lipids which react according to variations in the pH of the surrounding medium which are cleavable via acid hydrolysis, or which comprise reducible groups, such as disulphide bridges.
  • these lipids are likely to be cleaved by a reducing cellular agent such as glutathione.
  • the lipid typically contains two hydrophobic moieties and is functionalized with two responsive motifs that can respond to the intracellular environment.
  • the first is a tertiary amine, a unit that acquires a positive charge in response to an acidic compartment (such as the endosome or lysosome) for membrane destabilization;
  • the second is a disulfide bond, a unit that can be cleaved in response to a reducing environment (as in the cytoplasm) for spontaneous collapse.
  • a preferred example of a pH-sensitive lipid is thus known as ssPalm (for “SS-cleavable and pH-activated lipid-like material”).
  • Coatsome® products marketed by NOF America corporation are such preferred pH sensitive lipids. They are in particular described in the articles Tanaka et al, Biomaterials, 2014, 35(5): 755-1761 and Hidetaka Akita, Biol. Pharma. Bull. 2020, 43 (11): 1617-1625, as well as in patent applications EP 3 315 125 of Silence Therapeutics, WO 2020/142725 of Oncorus; WO 2021/123332 from Curevac.
  • the pH-sensitive lipid is a lipid of the following formula (I): RCOO ⁇ C-CHCHa-S iCOO- CHaCHî-S in which :
  • RCOO is a group chosen from the myristoyl group, the ⁇ -D-tocopherolsuccinoyl group, the linoleyl group and the oleoyl group;
  • X is chosen from the following groups of structures (II), (III) or (IV):
  • the pH-sensitive lipid is a lipid of formula (I) as defined above in which:
  • - RCOO is a myristoyl group and X is a group of formula
  • - RCOO is an a-D-tocopherolsuccinoyl group and X is a group of formula
  • - RCOO is a linoleyl or oleoyl group and X is a group of formula
  • - RCOO is an oleoyl group and X is a group of formula
  • the pH-sensitive lipid is a lipid of formula (I) as defined above in which —RCOO is a myristoyl group and X is a group of formula (II).
  • This product is known as Coatsome® SS-M.
  • the pH-sensitive lipid can be chosen from the following lipids: - A lipid which includes a tertiary amine group such as l,2-dilinoleyloxy-n,n-dimethyl-3-aminopropane (DLinDMA), O-(Z,Z,Z,Z-heptatriaconta-6,9,26, 29-tetraen-19-yl)-4-(N,N-dimethylamino) (DLin-MC3-DMA), or 2-[2,2-bis[(9Z,12Z)- octadeca-9,12-dienyl ]-l,3-dioxolan-4-yl]-N,N-dimethylethanamine (DLin-KC2-DMA)
  • DLinDMA l,2-dilinoleyloxy-n,n-dimethyl-3-aminopropane
  • DLin-MC3-DMA O-(Z,Z,Z,Z-hept
  • pH-sensitive lipids mentioned above can be used alone or in admixture with other pH-sensitive lipids.
  • the pH-sensitive lipid is present in the nanoparticle in an amount comprised between 1 and 10 mM, preferably between 1 and 5 mM, more preferably around 2.5 mM.
  • the amount of pH sensitive lipid is substantially the same as the amount of neutral lipid.
  • the pH-sensitive lipid is a lipid of formula (I) as defined above in which -RCOO is a myristoyl group and X is a group of formula (II), in an amount between 1 and 10 mM, preferably between 1 and 5 mM, more preferably about 2.5 mM.
  • a preferred nanoparticle comprises a mixture of a) DOTAP as a cationic lipid, b) DOPE as a neutral lipid, and c) a lipid of formula I, as defined above, as a pH-sensitive lipid, preferably a lipid of formula (I) in which -RCOO is a myristoyl group and X is a group of formula (II).
  • a particularly preferred nanoparticle comprises a mixture of DOTAP (in an amount of 5 mM), DOPE (in an amount of 2.5 mM) and a lipid of formula (I) as defined above in which -RCOO is a myristoyl group and X is a group of formula (II), in an amount of 2.5 mM.
  • the nanoparticle comprises
  • the nanoparticle of the invention is prepared in the form of a liposome or a lipid nanoparticle comprising a) a cationic lipid, b) a neutral lipid, and c) a pH-sensitive lipid, different from the lipid cationic (a), in a molar ratio of 2:1:1 to 4:1:1.
  • the nanoparticle according to the invention is prepared in the form of a liposome comprising:
  • the nanoparticle according to the invention is prepared in the form of a liposome or a lipid nanoparticle comprising:
  • RCOO is a group chosen from the myristoyl group, the ⁇ -D-tocopherolsuccinoyl group, the linoleyl group and the oleoyl group;
  • X is chosen from the groups of structures (II), (III) or (IV) as defined above.
  • the nanoparticle according to the invention is prepared in the form of a liposome or a lipid nanoparticle comprising:
  • - RCOO is a myristoyl group and X is a group of formula (II);
  • - RCOO is an a-D-tocopherolsuccinoyl group and X is a group of formula (II) or (III);
  • - RCOO is a linoleyl or oleoyl group and X is a group of formula (III); Or
  • - RCOO is an oleoyl group and X is a group of formula (IV).
  • Liposomes or lipid nanoparticles can be obtained according to techniques known to those skilled in the art, in particular by a method of hydration of the lipid film and extrusion (typically through one or more membranes, for example polycarbonate membranes) or by a process microfluidics. These two methods are described in detail in the examples below.
  • the nanoparticle is loaded with a nucleic acid, in particular to form lipoplexes.
  • Lipoplexes are in particular formed by complexation of lipids with a nucleic acid.
  • the lipids and the nucleic acid are associated in a non-covalent way.
  • the charged nanoparticle, or lipoplex can in particular be obtained by a process comprising: i) obtaining a mixture of lipids a), b) and c) as defined above (which makes it possible to obtain liposomes), and ii) bringing said mixture into contact with a nucleic acid, to obtain complexes or lipoplexes.
  • Step i) of this process is preferably carried out according to the method described above to form the lipid nanoparticle.
  • Step ii) is preferably carried out by diluting the liposomes obtained in step i) in a buffer or an aqueous solvent, in particular in RNase-free water, then by adding a solution of nucleic acids in the same buffer or the same aqueous solvent, in particular in water devoid of RNase.
  • the nanoparticle can be loaded with the nucleic acid, so as to obtain an N/P ratio ranging from 1 to 100, preferably 1 to 60, preferably 1 to 50, preferably 1 to 40, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, preferably 1 to 10, preferably 1 to 8, more preferably 1.5 to 8, preferably 1 to 5, more preferably 1.5 to 5 or 1.5 to 4.
  • the N/P charge ratio corresponds to the ratio of the number of amine functions of the lipids of the nanoparticle (positive charges) to the number of phosphate molecules of the nucleic acid (negative charges).
  • the charged nanoparticle, or lipoplex when the charged nanoparticle is formed by a process of hydration of the lipid film and extrusion, typically has an N/P ratio greater than or equal to 3, preferably 3 to 8, preferably 3 to 5.
  • the charged nanoparticle, or lipoplex when the charged nanoparticle is formed by a microfluidic process, typically has an N/P ratio greater than or equal to 1.5 or 2, preferably 1.5 to 10, preferably 1.5 to 5 or 2 to 5.
  • the nucleic acid can be a deoxyribonucleic acid (DNA), a single or double stranded ribonucleic acid (RNA), for example an mRNA or an interfering RNA, or a mixture, still or hybrid DNA/RNA sequences. These may be sequences of natural or artificial origin. They can also be obtained by a chemical modification at the level of their sugar parts, their nucleobase parts or their internucleotide skeleton.
  • nucleobases it is possible to use modified bases, such as in particular 5-bromo-uridine, 5-iodo-uridine, N ⁇ 3>-methyl-uridine, a 2,6-diaminopurine (DAP) , 5-methyl-2'-deoxyCytidine, 5-(1-propynyl)-2'-deoxy-Uridine (pdU), 5-(1-propynyl)-2'-deoxyCytidine (pdC), or bases combined with cholesterol.
  • modified bases such as in particular 5-bromo-uridine, 5-iodo-uridine, N ⁇ 3>-methyl-uridine, a 2,6-diaminopurine (DAP) , 5-methyl-2'-deoxyCytidine, 5-(1-propynyl)-2'-deoxy-Uridine (pdU), 5-(1-propynyl)-2'-deoxyCytidine (pdC), or bases combined with cholesterol.
  • DAP 2,6-
  • advantageous modifications of the internucleotide skeleton include the replacement of phosphodiester groups of this skeleton by phosphorothioate, methylphosphonate, phosphorodiamidate groups, or the use of a skeleton composed of N-(2-aminoethyl)-glycine units linked by peptide bonds (PNA, Peptide Nucleic Acid).
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • base, sugar, skeleton can of course be combined to give modified nucleic acids of the morpholino type (bases attached to a morpholine ring and linked by phosphorodiamidate groups) or PNA (bases attached to N-( 2-aminoethyl)-glycine bound by peptide bonds).
  • the nucleic acids can be of small size (for example less than 200 nucleotides), such as antisense oligonucleotides, interfering RNAs (miRNA, siRNA, etc.), or aptamers for example. They can also advantageously be of large size (for example greater than 200, 300 or 400 nucleotides).
  • the nucleic acid is a DNA plasmid (pDNA).
  • nucleic acid sizes that can be loaded into the lipoplexes of the invention are shown in Table 1 below.
  • the nucleic acid is mRNA.
  • the nucleic acid is DNA.
  • the nucleic acid is an RNA other than mRNA, for example an interfering RNA (eg siRNA or miRNA).
  • RNA other than mRNA for example an interfering RNA (eg siRNA or miRNA).
  • the nanoparticle comprises a DOPE/DOTAP and SS-Palm mixture, loaded with RNA (such as mRNA or interfering RNA) or DNA, preferably pDNA.
  • RNA such as mRNA or interfering RNA
  • DNA preferably pDNA
  • the nanoparticle comprises a DOPE/DOTAP and SS-Palm mixture, loaded with a mixture of RNA and DNA, preferably a mixture of mRNA and pDNA, for example in a ratio RNA:DNA ranging from 1:1 to 1:10, preferably 1:1 to 1:5, preferably 1:1 to 1:3, more preferably 1:2.
  • the nanoparticle can be coated with molecules of one or more anionic polysaccharides.
  • a "polysaccharide” is formed by sequences of saccharides connected together by glycosidic bonds, and an “anionic polysaccharide” is a polysaccharide having an overall negative charge.
  • glycosaminoglycans such as hyaluronic acid or one of its salts, alginic acid or one of its salts
  • carrageenans sulphated polysaccharides from red algae
  • fucans sulphated polysaccharides from brown algae
  • Carboxy Methyl Dextran Benzylamide Sulfonates or CMDBS synthetic polysaccharides prepared from dextran by statistical substitution of hydroxyl functions by carboxymethyl, benzylamide, sulphonate and sulphate chemical functions
  • heparan sulphates complex polysaccharides, belonging to the family of glycosaminoglycans.
  • the anionic polysaccharide is hyaluronic acid or one of its salts, such as the sodium salt.
  • the anionic polysaccharide can be alginic acid or one of its salts, such as the sodium salt.
  • the nanoparticle comprises a DOPE/DOTAP mixture and an SS palm lipid of formula I, is loaded with an RNA (of the type for example mRNA, or siRNA) or a DNA, preferably a pDNA, and is coated with molecules of hyaluronic acid, or one of the salts such as sodium hyaluronate (HA).
  • RNA of the type for example mRNA, or siRNA
  • DNA preferably a pDNA
  • HA sodium hyaluronate
  • the coating with the anionic polysaccharide is done by bringing the nanoparticle/liposomes/lipoplexes obtained previously into contact with the anionic polysaccharide such as hyaluronic acid in an aqueous solvent, for example in water devoid of RNase.
  • anionic polysaccharide such as hyaluronic acid
  • the lipoplexes are coated with anionic polysaccharide, such as HA, in a cationic lipid:anionic polysaccharide weight ratio of 1:2.
  • anionic polysaccharide such as HA
  • Lipoplexes with anionic polysaccharides has the particular advantage of increasing the accumulation of lipoplexes at tumor sites, or at the level of cells, such as for example macrophages, myoblasts or myotubes, where cellular receptors for these polysaccharides (such as CD44 ) are overexpressed.
  • the nanoparticles or lipoplexes of the invention can be used for the transfer of nucleic acids into cells in vivo, in vitro or ex vivo.
  • the compositions according to the invention can be used to very efficiently transfer nucleic acids into numerous cell types.
  • the nanoparticle according to the present invention is present in a medium containing cells to be transfected, under conditions such that there is passage from the lipoplex to from the medium into the cytoplasm of the cells, then release of the nucleic acid into the cytosol and/or the nucleus of the cells.
  • the nanoparticle may also comprise a targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid, such as an intracellular (nucleus, etc.) and/or extracellular (targeting of certain cell/tissue types).
  • a targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid, such as an intracellular (nucleus, etc.) and/or extracellular (targeting of certain cell/tissue types).
  • a subject of the present invention is also a pharmaceutical composition comprising a nanoparticle or lipoplex as defined here and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention targets the use of a nanoparticle as described here as a pharmaceutically acceptable vector of a nucleic acid.
  • the doses of nucleic acid used as well as the number of administrations can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the nucleic acid to be administered, or even the desired duration of treatment.
  • the nanoparticles of the invention are useful in gene therapy applications.
  • the nucleic acid can then preferably be a DNA coding for a functional protein, in particular a protein which is not produced functionally in the patient.
  • the nucleic acid can be an mRNA, coding for a protein which is not functionally produced in the patient, or for a protein of therapeutic or vaccine interest.
  • the selected nucleic acid can inhibit the expression of a protein expressed by the subject, and thus be an antisense RNAi or oligonucleotide per copy, which is complementary to the sequence of the mRNA that he targets. It can thus modify the mRNA, in particular by skipping or incorporating exon(s) by intervening at the splicing stage.
  • the nanoparticles of the invention are useful in ex vivo applications, for example for modifying cells with a view to cell therapy in particular.
  • a particular therapeutic application relates to the treatment of muscular diseases or musculoskeletal diseases.
  • Also described herein is a method for delivering a nucleic acid into the muscle of a subject, preferably a human patient suffering from a muscular or musculoskeletal disease, by intramuscular administration of a nanoparticle as described herein, loaded with a nucleic acid, for example an mRNA coding for a protein of therapeutic interest.
  • a nucleic acid for example an mRNA coding for a protein of therapeutic interest.
  • Example 1 Production of liposomes (lipoplexes) as vehicles for the intracellular delivery of mRNA
  • Liposomes were generated by the thin film hydration method, followed by extrusion. Lipids were dissolved in chloroform to generate solutions at the desired final concentration and then added to a 10 mL round bottom flask for a final lipid concentration of 10 mM after hydration, observing the molar ratio shown in Table 2 The organic solvent was removed under reduced pressure at 40°C using a rotary evaporator. To completely remove the chloroform, the round bottom flasks were left overnight in a dryer. The lipid film was rehydrated with 0.1 M HEPES buffer, pH 5.5.
  • the multi-lamellar vesicles were extruded through a large polycarbonate membrane (400 nm), using an Avanti mini-extruder (Avanti Polar Lipids), followed by a second extrusion with a 100 nm membrane. to obtain unilamellar vesicles.
  • Fluorescent liposomes were prepared with rhodamine-labeled DOPE (Rho-PE) embedded in the liposome membrane. Rho-PE was added at a ratio of 2% w/w to the lipid solution before the drying process.
  • DTPA liposomes were prepared with DSPE-DTPA (PE-DTPA) for radiolabeling purposes. 0.5% mole/mole of PE-DTPA was added to the lipid solution before the drying process.
  • Lipoplexes were prepared by diluting liposomes to 50 ⁇ L with RNase-free water to a final concentration of 1.8 mM, and subsequent addition of 50 ⁇ L of different mRNA concentrations (0.03-0 .15 mg/mL) in RNase-free water to obtain complexes in the range of N/P ratios of 1 to 5 as shown in Table .
  • Hyaluronic acid-coated lipoplexes were prepared by adding 50 ⁇ L of a 0.6 mg/mL solution of HA in RNase-free water to the already formulated lipoplexes. Intended for in vivo purposes, the lipoplexes were diluted with a 10% glucose solution, or coated with HA dissolved in 10% glucose, to obtain the same final concentration and good osmolality.
  • Particle size distribution and surface electrical charge were measured using the Malvern Zetasizer® Nano ZS (Malvern Instruments S.A, Worcestershire, UK).
  • the hydrodynamic diameter and the polydispersity index (PDI) were measured by dynamic light scattering (DLS) using the cumulation method and performed at 25°C at a detection angle of 173°.
  • Zeta (Q) potential was determined by the electrophoresis technique. All samples were diluted in 1 mM NaCl and analyzes were performed in triplicate.
  • mRNA association was determined using Sybr Green® agarose gel electrophoresis. Samples were diluted in HEPES at pH 5.5 until a final RNA amount of 0.125 ⁇ g. After addition of mRNA gel loading dye, samples were run on 1% (w/v) agarose gel for 30 min at 80 V. mRNA bands were visualized and imaged using the Gel DocTM EZ Imaging Device (Bio-Rad).
  • the morphology of the lipid nanoparticles was evaluated by cryogenic transmission electron microscopy. Briefly, 3.5 ⁇ L of formulation was added to a CF-2/1-3Cu-50 copper grid and immersion frozen using a Vitrobot (Thermoscientific) to generate vitreous ice. Samples were stored in liquid nitrogen and imaged with a JEM-1400Flash electron microscope operating at 120 kV. Cellular studies on THP1
  • a Viromer Red solution containing eGFP mRNA was used as a positive control for transfection, for the negative control, 3 ⁇ g of e-GFP mRNA was placed in plates. The cells were then incubated for 24 h at 37°C. The cell medium was modified after 4 h of transfection. After transfection, cells were washed and stained with Fixable Live/Dead Violet before acquisition with a BD LSR 2 flow cytometer. Data were analyzed using FlowJo software and statistical analysis was determined with the GraphPad Prism v8.1 software.
  • THP-1 cells and lipoplexes were plated as described above.
  • the lipoplexes were freshly prepared and added to each well in the amount necessary to have 3 ⁇ g of eGFP mRNA.
  • Treatment with 50 ⁇ M cis-platinum was used as a positive control for cell death.
  • the cells were then incubated for 4h, 24h, and 48h at 37°C, 5% CO2.
  • Cell medium was replaced after 4 h of transfection.
  • Cells were then washed and stained with Annexin V Pacific BlueTM and a 1:50 dilution of propidium iodide before acquisition with a BD LSR 2 flow cytometer. Data were analyzed using FlowJo software and statistical analysis was performed with GraphPad Prism v8.1 software.
  • Radiolabeling efficiency was assessed by flash thin layer chromatography on silica gel strips (iTLC-SG, Biodex Medical Systems, Shirley, USA) using 100 mM citrate buffer pH 5 as mobile phase. The activities of free and labeled U 1 ln were assessed in an ionization chamber (Capintec, Florham Park, USA).
  • Lipoplexes were prepared at an N/P ratio of 3. Briefly, 1.25 pmol (150 pL) of radiolabeled liposomes (0.63 pmol of DOTAP) were incubated at room temperature 0.2 nmol of mRNA respectively (equivalent to 0.244 pmol of phosphate), for 30 minutes.
  • mRNA solutions were prepared and quantified with a NanoDropTM (Ozyme, Saint-Cyr-l'ijk, FRANCE). Then a 10% glucose solution or 0.025 pmol of hyaluronic acid dissolved in 10% glucose was added to the lipoplexes also to adjust the osmolality.
  • Ex vivo quantification of organ radioactivity was performed with a Wizard 3” gamma ray counter (Perkin Elmer, Waltham USA). For each formulation, a mouse from the 48 h group was imaged in the supine position at 6 h, 24 h and 48 h. All live animal acquisitions were performed with a NanoSPECT/CTTM in vivo animal imaging device (Bioscan Inc., Washington DC, USA). During acquisition, animals were anesthetized with 1.5% Isofhirane and respiration was monitored with a small Model 1025T monitoring and feeding system (SA Instruments Inc, Stony Brook, USA). Each acquisition was performed with preclinical SPECT/CT multiplexing with multiple pinhole multiplexing apertures.
  • the SPECT device acquired 24 of the 256 x 256 pixels every 15 degrees.
  • the scanning time was 100 seconds per projection.
  • the reconstruction was performed with the manufacturer's software, HiSPECT, using an Ordered Subset Expectation Maximization (OSEM) algorithm with 9 iterations and 4 subsets with an image voxel size of 0.6 mm.
  • OEM Ordered Subset Expectation Maximization
  • PDI has a significant impact on the stability and bioavailability of liposomes.
  • the liposome preparation must be homogeneous.
  • An acceptable formulation of liposomes for drug delivery should have a PDI value of less than 0.3.
  • the surface charge of all prepared liposome formulations was positive in the range of +40-55 mV (Table ).
  • the N/P ratio between 1.5 and 2.5 showed the strongest instability in terms of complex formation, as can be observed in terms of size mean and polydispersity values reported in Table and Table .
  • the sizes fell below 300 nm, with a good PDI around 0.2, which is important for the stability and the bioavailability of the system.
  • the surface charges were positive for all N/P ratios in the case of LRC, except for the N/P ratio of 1, the presence of an excess of mRNA compared to the amount of lipids leading to negatively charged particles.
  • LRC with an N/P ratio of 1 was found to be stable after preparation with an initially negative potential ⁇ , shifting to positive values after 24 h, probably due to the formation of aggregates due to to system instability.
  • surface charges were similar to liposomes alone, with a reduction following the addition of mRNA. This could be a result of the electrostatic interaction between the cationic lipid and the negatively charged backbone of the nucleic acid.
  • the zeta potential of the HLRCs was negative for all the N/P ratios tested due to the presence of hyaluronic acid: in fact, at neutral pH, the pK a of the carboxylic groups of the polymer is approximately 3-4. With this coating, we obtained lipoplexes with negative charges in order to observe their different behavior in vitro and in vivo.
  • Cryo-MET is a single-particle detection method that is used to characterize the morphology of liposomes.
  • Figure 2A the typical morphology of unilamellar liposomes is shown. They are spherical vesicles with an internal aqueous compartment bounded by a single bilayer membrane. The interactions of liposomes with mRNA and mRNA/HA are reported in Figures 2B and 2C, respectively.
  • liposomes labeled with U 1 ln were injected intravenously into BALB/c_Rj mice after complexation with mRNA at the chosen N/P ratio of 3.
  • SPECT/ CT was performed at 6 h, 24 h, and 48 h after injection.
  • Results are expressed as a percentage of the total dose of administered LRC or HLRC accumulated per gram of tissue.
  • the biodistribution of nanoparticles was not different between LRC and HLRC. After 6 h, both systems were found mainly in liver and spleen. In the lungs, the % detected was less than 10%.
  • the radioactive dose in the spleen increased, reaching approximately 60% of the injected dose, while in the liver the percentage decreased to approximately 30%.
  • Example 2 Liposomes Fabricated by Microfluidics as Vehicles for Intracellular Delivery of mRNA
  • Example 2 The same materials as in Example 1 were used here.
  • the mRNA-GFP used for the in vitro studies on THP-1 and in vivo after intravenous administration was provided by Biontech, whereas that used for the studies in vitro on C2C12 or iPSC and in vivo after intramuscular administration was purchased from from Tebubio (Le Perray-en-Yvelines, France).
  • DOTAP cationic lipid
  • DOPE neutral lipid
  • Coatsome® SS-M or DLin-MC3-DMA pH-sensitive lipid
  • Liposomes were formed by mixing the lipid solution with HEPES at pH 5.5 using an IgniteTM microfluidic platform (Precision NanoSystems Inc, Vancouver, Canada), at a flow rate ratio of 3:1 (v/v) and a total flow of 15 mL.min' 1 .
  • the systems were then dialyzed using a 5 kDa dialysis membrane to remove residual ethanol from the formulation.
  • the fluorescent lipid nanoparticles were obtained by adding PE-Rhodamine to the lipid mixture.
  • Lipoplexes were prepared by diluting liposomes to 50 ⁇ L with RNase-free water to a final concentration of 1.8 mM, and subsequent addition of 50 ⁇ L of different mRNA concentrations (0.06- 0.3 mg/mL) in RNase-free water to obtain complexes in the range of N/P ratios of 1 to 50.
  • Hyaluronic acid-coated lipoplexes were prepared by the addition of 50 ⁇ L of a 0.6 mg/mL solution in RNase-free water to already formulated lipoplexes. Intended for in vivo purposes, the lipoplexes were diluted with a 10% glucose solution, or coated with HA dissolved in 10% glucose, to obtain the same final concentration and good osmolality.
  • formulations composed of a neutral lipid as well as only a cationic lipid or an ionizable lipid were tested.
  • formulations of DOTAP/DOPE or DOPE/Coatsome SS-M were produced under the same conditions as previously described.
  • C2C12 myoblasts (an immortalized murine muscle cell line purchased from ATCC® CRL-1772) were cultured in a humid atmosphere with 5% CO2 at 37°C, in Dulbecco's GlutaMax modified Eagle medium, supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 0.5% (v/v) and 100 units/mL penicillin-streptomycin (Gibco).
  • Dulbecco's GlutaMax modified Eagle medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 0.5% (v/v) and 100 units/mL penicillin-streptomycin (Gibco).
  • FBS fetal bovine serum
  • Gibco penicillin-streptomycin
  • the myoblasts were seeded on 12 mm glass coverslips in 24 multi-well plates at a density of 10,000 cells/well while to obtain myotubes, the myoblasts were seeded on a chamber of Labtek 4-compartment culture at a density of 40,000 cells/well and induced for differentiation for 6 days.
  • Myoblasts and myotubes were treated with 1 ⁇ g of 5-cyanine-labeled mRNA and complexed with HLRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) labeled with PE-Rhodamine at an N/P ratio of 1.5 for 30 min, 2 h and 24 h.
  • HLRCs DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M
  • CSPi cells were cultured under a humid atmosphere with 5% CO2 at 37° C., in StemMACSTM PSC-Brew XF culture medium (Miltenyi biotec).
  • StemMACSTM PSC-Brew XF culture medium StemMACSTM PSC-Brew XF culture medium (Miltenyi biotec).
  • the iPSCs were seeded in 24-well plates at a density of 50,000 cells per well.
  • the iPSCs were then treated with 3 ⁇ g of mRNA-LRC or mRNA-HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) at N/P ratios of 1.5.
  • Lipofectamine 2000 transfection reagent invitrogen® was used as a transfection control for the RNA experiments and used according to the manufacturer's instructions. After 2 hours, a change of medium was made.
  • the cells were enzymatically detached with Tryple (Gibco) and the cells were subsequently labeled with a Live/Dead Violet solution to assess the proportion of dead cells and then fixed with a 4% PFA solution. for 10 min at room temperature.
  • Tryple Gibco
  • a Live/Dead Violet solution to assess the proportion of dead cells and then fixed with a 4% PFA solution. for 10 min at room temperature.
  • flow cytometry analysis data were acquired with a BD LSR 2 flow cytometer and data were analyzed using FlowJo software. Statistical analyzes were determined with GraphPad Prism v8.1 software.
  • Intravenous administration The same analyzes as in Example 1 were used here.
  • mRNA-HLRC DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M
  • N/P ratio of 1.5 5 ⁇ g mRNA-HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) at an N/P ratio of 1.5 was injected into the tibialis anterior muscle of mice.
  • BALB/c BALB/c.
  • the HLRCs were labeled with PE-cy5 and the mRNA sequence was selected to express the fluorescent protein mCherry. After 2 h, the mice were then sacrificed and the tibialis anterior muscle was explanted and frozen in isopentane and transverse sections of these muscles were collected in a cryostat.
  • Muscle fiber membranes were stained with anti-Laminin 488 immunofluorescent staining and cell nuclei were counterstained with DAPI.
  • the samples were finally mounted in Fluoromount mounting medium (Invitrogen) and observation was performed by a Zeiss LSM800 confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) using a 40X objective.
  • N/P nitrogen/phosphate
  • mRNA complexation was assessed by electrophoretic measurement ( Figure 4). mRNA is efficiently complexed with all systems for all N/P ratios tested. The higher the N/P ratio tested, the more strongly the mRNA is complexed, as demonstrated by the decrease in mRNA signal. In order to demonstrate that the weak signal of mRNA with a high N/P ratio is due to the strong complexation of the mRNA and not to its degradation, the formulations were incubated with heparin, a large anionic molecule, in order to to decomplex the mRNA. When incubated with heparin, all the different formulations demonstrated that mRNA was indeed present.
  • THP-1 designates a spontaneously immortalized monocyte-like cell line derived from the peripheral blood of a pediatric case of acute monocytic leukemia.
  • THP-1 cells including their genetically engineered derivatives, represent valuable tools for studying monocyte structure and function in both healthy and diseased subjects and are widely used in translational testing.
  • the transfection protocol was optimized and GFP expression was quantified using a flow cytometer together with cell viability.
  • GFP transfection is achieved with all systems.
  • N/P ratio of 2 we achieved transfection efficiency comparable to the commercial agent (approximately 70%) with no significant impact on cell viability.
  • Systems retained for further studies were those prepared to an N/P of 2 for both LRC and HLRC.
  • Transfection efficiency and mean fluorescence intensity (MFI) were significantly higher compared to N/P of 2.5, 3, 3.5 and 5. While N/P ratio of 1 n' was not retained because unstable.
  • Transfection efficiency was studied by flow cytometry to assess the percentage of myoblasts expressing GFP (Figure 6). Data showed that for DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M and DOTAP/DOPE/Dlin-MC3-DMA formulations at N/P ratio 1.5 and 3, approximately 90% of myoblasts expressed GFP, demonstrating similar transfection efficiency to that of the commercial transfection agent used. For the DOTMA/DOPE/Coatsome SS-M formulation, this rate was reduced to approximately 40%.
  • formulations composed of a neutral lipid and only a cationic lipid (DOTAP/DOPE) or of a pH-sensitive lipid (Coatsome SS-M/DOPE) only demonstrated a low transfection rate of about 20% under conditions similar to previous formulations.
  • DOTAP/DOPE a neutral lipid and only a cationic lipid
  • Coatsome SS-M/DOPE a pH-sensitive lipid
  • mRNA-HLRC accumulated in the cytosol of the perinuclear region without entering the nucleus.
  • HLRC appeared as larger fluorescent clusters with more diffuse signal, probably due to lipid exchange with the cells.
  • the intracellular release of mRNA was also studied by evaluating the colocalization between the HLRC signal and the mRNA. After only 30 min, mRNA was already found free in cytosol and complexed with HLRC whereas after 2 h, almost no mRNA was found complexed with HLRC in cytosol. After 24 h of incubation, no more mRNA was found in the intracellular medium.
  • Intramuscular administration The in vivo distribution of lipid nanoparticles as well as the protein expression of mRNA-HLRCs were evaluated after injection into the anterior tibialis of healthy mice ( Figure 8). After observation of cross-sections by confocal microscopy, the images demonstrated a main distribution of HLRC between muscle fibers and diffusing into adjacent fibers after 2 h of administration. Moreover, a slight expression of the protein encoded by the mRNA complexed in the HLRCs was already visible at the level of the localization of the HLRCs, after only 2 h of incubation, demonstrating the effectiveness of this formulation in transporting and delivering the mRNA in muscle fibers. No cellular or morphological damage was observed on the cross-sections collected.
  • Example 3 Liposomes Manufactured by Microfluidics as a Vehicle for Intracellular Delivery of Plasmid DNA
  • Example 1 Materials The same materials as in Example 1 and Example 2 were used here.
  • the pCAGIG DNA plasmid was obtained from Addgene (Plasmid #11159).
  • the same protocol as well as the same formulations described in example 2 were followed here.
  • the plasmid DNA (pCAGIG) encoding the expression of green fluorescent protein (GFP) was complexed by mixing the different liposomes with adequate amounts of DNA in order to obtain lipoplexes at an N/P ratio of 1, 5 and 3.
  • the lipoplexes were finally coated with HA (HLRC) in a DOTAP:HA weight ratio of 1:2.
  • DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M lipid nanoparticles were assessed by cryo transmission electron microscopy. Briefly, 3.5 ⁇ L of formulation was added to a CF-2/1-3Cu-50 copper grid and immersion frozen using a Vitrobot (Thermoscientific) to generate vitreous ice. The samples were stored in liquid nitrogen and observed with a JEM-1400Flash electron microscope operating at 120 kV.
  • C2C12 myoblasts were cultured as previously described in Example 2.
  • the internalization efficiency of pDNA-HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) in myoblasts was evaluated by flow cytometry and confocal microscopy.
  • flow cytometry analysis the cells were seeded in flat-bottomed 12-well plates at a density of 20,000 cells per well.
  • the myoblasts were then treated with 7.5 pg of pDNA loaded in the HLRCs labeled with PE-Rhodamine at N/P of 1.5 and 2.
  • the internalization efficiency was evaluated after 2 , 4, 24 and 48 h incubation. After 2 h post incubation, the medium containing the treatment was replaced with fresh medium.
  • myoblasts were then treated with 5, 7.5 and 10 pg pDNA loaded in HLRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) at N/P ratios of 1 5, 2 and 3. Jet-prime transfection reagent (Polyplus transfection®) was used as a transfection control according to the manufacturer's instructions. All treatments were left overnight and then replaced with fresh medium. After 48 h, cells were processed and analyzed as described above.
  • the myoblasts were then treated with 3 pg of pDNA complexed with the different nanosystems at N/P ratios of 1.5 and 3.
  • the commercial transfection reagent Jet-Prime (Polyplus®) was was used as a transfection control according to the manufacturer's instructions. All treatments were left for 2 h, then removed to fresh medium and internalization efficiency was assessed after 48 h of incubation. Next, cells were enzymatically detached with Trypsin-EDTA (0.5%, Gibco) and stained with Fixable Live/Dead Violet for assessment of cell viability. Data were acquired with a BD LSR 2 flow cytometer and data were analyzed using FlowJo software. Statistical analyzes were determined with GraphPad Prism v8.1 software.
  • pDNA-loaded HLRCs were obtained by complexation of pDNA with liposomes fabricated by microfluidics. All the lipoplexes showed an average diameter around 200 nm and a polydispersity index lower than 0.2 for the different N/P ratios tested, with a negative surface charge (around -20 mV) due to the phosphate groups and carboxylic acids of DNA and HA ( Figure 9, A and B).
  • pDNA complexation was assessed by electrophoretic measurement. pDNA was efficiently and fully complexed with all systems for all N/P ratios tested. As for Example 2, the higher the N/P ratio tested, the more strongly the pDNA is complexed, as demonstrated by the decrease in mRNA signal ( Figure 9, C for the DOTAP/DOPE/Coatsome SS formulation -M). Morphological analysis performed using TEM cryo-microscopy ( Figure 9, D for DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M formulation) showed that pDNA-loaded HLRCs formed vesicles with a multi-lamellar structure where the nucleic acid is enclosed between different lipid bilayers, thus ensuring its protection.
  • HLRCs The efficiency of HLRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) loaded with pDNA to be internalized in muscle cells was studied by flow cytometry (Figure 10).
  • Flow cytometry analysis showed for both N/P ratios rapid and efficient internalization of pDNA-loaded HLRCs with almost all cells positive for rhodamine signal after only 2 h of incubation.
  • the internalization rate was kept constant for up to 48 h, which means that the pDNA-loaded HLRCs were not completely expelled from the cells and that the nanoparticles were transmitted from cell to cell during cell proliferation. .
  • pDNA-loaded HLRCs The intracellular distribution of pDNA-loaded HLRCs in C2C12 myoblasts was studied by confocal microscopy.
  • myoblasts HLRCs labeled with PE-Rhodamine and loaded with pDNA were shown to rapidly enter the cells as a function of time.
  • pDNA-loaded HLRCs accumulate in the cytosol of the perinuclear region without penetrating into the nucleus.
  • the lipoplexes are observed as larger fluorescent clusters showing a more diffuse signal, probably due to some exchange of lipids with the cells.
  • Transfection efficiency was studied by flow cytometry to assess the percentage of myoblasts expressing GFP.
  • formulations composed of a neutral lipid and only a cationic lipid (DOTAP/DOPE) or of a pH-sensitive lipid (Coatsome SS-M/DOPE) only demonstrated a very low transfection rate of less than 10% under conditions similar to the preceding formulations.
  • Cells treated with only pDNA showed no signs of transfection, with a similar percentage to untreated cells.
  • Example 4 Liposomes Manufactured by Microfluidics as Vehicles for Intracellular Delivery of Antisense Oligonucleotides
  • the antisense oligonucleotide ASO-cyanine5 supplied by Eurogentec, has 14 nucleotides.
  • the antisense oligonucleotide tested is an ASO-cyanine 5 designed to target a special DNA sequence and induce its cleavage.
  • the ASO-cyanine5 sequence was complexed by mixing lipid nanoparticles (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) with adequate amounts of ASO to obtain lipoplexes at an N/P ratio of 2, 4, 8 and 10. Lipoplexes were finally coated with HA (HLRC) in a DOTAP:HA weight ratio of 1:2.
  • C2C12 myoblasts and myotubes were cultured as previously described in Example 2.
  • ASO-HLRC The intracellular distribution of ASO-HLRC was studied by confocal microscopy analysis.
  • the myoblasts were seeded on 12 mm glass coverslips in 24 multiwell plates at the density of 10,000 cells/well while to obtain myotubes, the myoblasts were seeded on a Labtek culture chamber at 4 compartments at a density of 40,000 cells/well and induced in differentiation for 6 days.
  • Myoblasts were treated with 1 ⁇ g of ASO-cyanin5-HLRC for 30 min, 2 and 24 h and myotubes were treated with 1 ⁇ g of ASO-cyanin5-HLRC at an N/P ratio of 10 for 2 and 48 hours. For long incubation times, cells were incubated for 2 h and then fed fresh medium.
  • ASO-cyanin5-HLRC lipoplexes were obtained by complexation of ASO-cyanin5 with liposomes manufactured by microfluidics.
  • the lipoplexes showed a mean diameter of about 150 nm and a polydispersity index of less than 0.2 for all N/P ratios.
  • the surface potential was negative (around -20 mV) due to the phosphate and carboxyl groups of the ASO sequence and HA.
  • ASO-cyanine5-HLRC The intracellular distribution of ASO-cyanine5-HLRC in C2C12 myoblasts and myotubes was studied by confocal microscopy.
  • myoblasts HLRCs labeled with a fluorescent lipid were shown to rapidly enter cells in a time-dependent manner.
  • the ASO-cyanin5-HLRCs After 2 h of incubation, the ASO-cyanin5-HLRCs are accumulated in the cytosol of the perinuclear region without penetrating into the nucleus. After 24 h of incubation, the ASO-cyanin5-HLRCs appear as larger fluorescent clusters with a more diffuse signal, probably due to lipid exchange with the cells.
  • the intracellular release of ASO was also studied by evaluating the colocalization between the HLRC signal and ASO. After 30 min of incubation, ASO was almost completely complexed with HLRCs whereas after 24 h of incubation, ASO was no longer complexed with
  • Example 5 Liposomes fabricated by microfluidics as vehicles for intracellular delivery of siRNA
  • Interfering RNA is a 21 nucleotide RNA, supplied by Eurogentec.
  • siRNA complexation The same protocol as that described in Example 2 was followed here.
  • the interfering RNA was complexed by mixing lipid nanoparticles (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) with adequate amounts of siRNA to obtain lipoplexes at an N/P ratio of 2, 4, 8 and 10.
  • the lipoplexes were finally coated with HA (HLRC) in a DOTAP:HA weight ratio of 1:2.
  • C2C12 myoblasts were cultured as previously described in Example 2.
  • Transfection efficiency study Transfection efficiency was studied by flow cytometry to assess the percentage of myoblasts expressing GFP.
  • Myoblasts were seeded in 12-well flat-bottomed plates at a density of 15,000 cells per well.
  • myoblasts were treated with 0.5, 1, and 2 ⁇ g siRNA-HLRC at N/P ratio 10, followed by pCAGIG (plasmid DNA encoding GFP expression) treatment using Jet-prime transfection reagent (Polyplus transfection®) according to the manufacturer's instructions. All treatments were left for 2 h and then removed for fresh medium. After 48 h, cell culture media were harvested and cells were enzymatically detached with Trypsin-EDTA (0.5%, Gibco). Data were acquired with a BD LSR 2 flow cytometer and data were analyzed using FlowJo software. Statistical analysis was determined with GraphPad Prism v8.1 software.
  • the HLRC-siRNAs were obtained by complexation of siRNAs with liposomes manufactured by microfluidics (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M).
  • the lipoplexes showed an average diameter of approximately 150 nm and a polydispersity index less than 0.2 for all N/P ratios.
  • the surface potential was negative (about -20 mV) due to the phosphate and carboxyl groups of RNA and HA.
  • a gel electrophoresis study was used to study siRNA complexation in HLRC nanosystems.
  • the siRNA was partially complexed with nanoparticles. This complexation was enhanced at an N/P ratio of 10 as demonstrated by the absence of a current RNA signal on the gel.
  • the transfection efficiency of HLRC showed a dose-dependent profile, with less than 30% of GFP+ cells treated with the highest dose of siRNA complexed with HLRC.
  • siRNA complexed with HLRC was found to halve the percentage of cells expressing GFP.
  • Example 6 Liposomes Fabricated by Microfluidics as Vehicles for Simultaneous Intracellular Delivery of mRNA and pDNA
  • the same materials as in the previous examples have been used here.
  • the mRNA-GFP used in this example was purchased from Tebubio (Le Perray-en-Yvelines, France) and the DNA plasmid mScarlet_pcDNA3.1 encoding the fluorescent protein mScarlet was obtained from Genscript.
  • Example 2 The same protocol as that described in Example 2 was followed here.
  • the two different nucleic acids were complexed to LRCs (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) by mixing the liposomes with adequate amounts of mRNA and pDNA, to obtain lipoplexes at an N/P ratio of 1.5 and 3 and with an nrDNAp mass ratio of 1:2.
  • LRCs DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M
  • C2C12 myoblasts were cultured as previously described in Example 2.
  • the transfection efficiency was studied by flow cytometry to evaluate the percentage of myoblasts simultaneously expressing the GFP and mScarlet protein.
  • Myoblasts were seeded in 12-well flat-bottomed plates at a density of 15,000 cells per well. Cells were treated with doses of mRNA-pDNA-LRC at an N/P ratio of 1.5 or 3 and corresponding to 3 pg of mRNA and 6 pg of pDNA per well.
  • mRNA-pDNA-LRC were obtained by complexation of mRNA and pDNA with liposomes made by microfluidics.
  • the lipoplexes showed an average diameter of approximately 150 nm and a polydispersity index less than 0.2 for all N/P ratios.
  • Gel electrophoresis also demonstrated that mRNA and pDNA were efficiently complexed in the same system at N/P of 1.5 and 3.

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Abstract

L'invention a trait à une nanoparticule comprenant au moins un lipide cationique, au moins un lipide neutre, et au moins un lipide sensible au pH, différent dudit lipide cationique, utile comme vecteur pour le transport et la libération d'acides nucléiques à l'intérieur de cellules.

Description

NANOPARTICULES POUR LA LIBERATION D’ACIDES NUCLEIQUES
La présente invention se rapporte à de nouveaux vecteurs pour l'administration intracellulaire d’acides nucléiques, dans des modèles in vitro ou ex vivo, ou pour des applications thérapeutiques in vivo.
Etat de la technique antérieure
Les acides nucléiques simple et double brin (oligonucléotides antisens, petits ARN interférents, ADN plasmidique et, plus récemment, ARNm) nécessitent typiquement un système de libération pour atteindre leurs cibles de manière intacte et efficace, système qui peut être physique (électroporation, délivrance assistée par ultrasons) ou au moyen de vecteurs de taille nanométrique. Les vecteurs couramment utilisés et les plus efficaces pour faire pénétrer des acides nucléiques dans le cytoplasme d'une cellule sont des molécules chimiques cationiques, de type lipide ou polymère, qui s'associent par leur charge à l'acide nucléique et lui permettent d'entrer dans la cellule. Ces molécules, qui sont chargées de manière permanente ou deviennent positives en réponse au pH de leur environnement, sont utilisées très couramment pour faire pénétrer des acides nucléiques (ADN ou ARN, de petite ou grande taille) dans des cellules en culture ou des cellules de l'organisme. Très efficaces dans les cellules en culture, elles le sont moins dans l'organisme du fait de phénomènes de piégeage par les protéines et les cellules contenues dans le sang.
Le brevet antérieur EP 2389158 décrit une composition à base d’une macromolécule anionique, qui peut être par exemple un acide alginique, et d’un lipide cationique. Cette composition, qui comprend en outre du cholestérol, permet la libération d’un acide nucléique d’une taille inférieure à 200 nucléotides.
Il est également connu de délivrer des acides nucléiques par des liposomes formés des combinaisons DOTAP et DOPE, et de cholestérol, comme dans la demande de brevet WO2013/143555 de BioNTech, liposomes qui sont éventuellement recouverts d’acide hyaluronique (HA). Voir Gasperini, Langmuir 31.11 (2015) : 3308-3317 ; Hattori, et al, Journal of drug targeting 21.7 (2013) : 639-647 ; Ruponen et al, Glycobiology and extracellular matrices, 276 (2001) : 33875-33880.
Résumé de l’invention
Les inventeurs proposent maintenant de nouvelles nanoparticules qui sont à la fois stables et permettent une libération ciblée, intracellulaire, de l’acide nucléique. Les nanoparticules de l’invention comprennent
(a) au moins un lipide cationique,
(b) au moins un lipide neutre, et
(c) au moins un lipide sensible au pH, différent du lipide cationique (a).
Il est entendu que chaque type de lipide (a), (b) et (c) peut consister en un seul ou en un mélange de plusieurs lipides de même type (a), (b) et (c), respectivement.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoparticule est chargée avec un acide nucléique. Une telle nanoparticule est utile pour la délivrance intracellulaire dudit acide nucléique.
De préférence, la nanoparticule de l’invention est recouverte par au moins un polysaccharide anionique, de préférence de l’acide hyaluronique.
De manière avantageuse, la nanoparticule de l’invention est typiquement dépourvue de cholestérol, voire d’un quelconque stéroïde.
Figures
La Figure 1 est une représentation schématique de complexes lipoplexes non revêtus (LRC) et revêtus d’acide hyaluronique (HLRC).
La Figure 2 représente des images de cryo-MET de liposomes. Dans la Figure 2A, la morphologie classique des liposomes uni-lamellaires est montrée sans ARNm. Les interactions des liposomes avec l’ARNm et l’ARNm/HA sont rapportées respectivement dans les Figures 2B et 2C.
La Figure 3 rapporte les résultats en termes d’efficacité de transfection, viabilité cellulaire et internalisation des cellules THP-1 après transfection avec des liposomes (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabrication par hydratation du film lipidique) complexées avec le eGFP-ARNm à différents rapports N/P. Analyse de cytométrie en flux de l’efficacité de transfection et de l’intensité de fluorescence des monocytes THP-1 avec A) des nanoparticules lipidiques (LRC) et avec B) des nanoparticules revêtues d’HA (HLRC) à différents rapports N/P (1, 3, 3,5, 5) au bout de 24 h. C) La viabilité cellulaire a été évaluée par coloration avec de l’iodure de propidium (PI) et de l’annexine V pour visualiser la nécrose et l’apoptose à des moments indiqués après la transfection avec soit LRC soit HLRC au rapport N/P de 3. L’internalisation des LRC D) et HLRC E) par des cellules THP-1 a été mesurée à des moments indiqués par cytométrie en flux en utilisant des nanoparticules fluorescentes à la rhodamine et avec contraste de phase et microscopie de fluorescence 24 h post-transfection. Toutes les valeurs sont des moyennes ± écart-type de la moyenne et les analyses statistiques ont été calculées en utilisant le test ANOVA à un facteur.
La Figure 4 représente l’étude d’électrophorèse des formulations ARNm complexé avec les liposomes DOPE/DOTAP/Coatsome SS-M à différents rapports N/P (1, 5, 10 et 50) en présence ou non avec de l’héparine pour démontrer la complexation et la présence de l’acide nucléique dans les lipoplexes.
La Figure 5 rapporte les résultats en termes d’efficacité de transfection et viabilité cellulaire des cellules THP-1 après transfection avec des LRC et HLRC complexés (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabrication par microfluidique) avec eGFP-mARN à différents rapports N/P. Analyse de cytométrie en flux de l’efficacité de transfection et de l’intensité de fluorescence des monocytes THP-1 avec A) LRC et B) HLRC à différents rapports N/P (1, 2, 2,5, 3, 3,5, 5) au bout de 24 h. C) Viabilité cellulaire évaluée par coloration à l’iodure de propidium (PI) et à l’annexine V pour visualiser la nécrose et l’apoptose à des moments indiqués après transfection avec soit des LRC soit des HLRC au rapport N/P de 2. Toutes les valeurs sont des moyennes ± écart-type de la moyenne et des analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le test ANOVA à un facteur.
La Figure 6 rapporte l’efficacité de transfection de différentes formulations lipidiques chargés en ARNm à des rapports N/P de 1,5 et 3 sur des myoblastes C2C12 pour induire l’expression de la GFP.
La Figure 7 rapporte les résultats en termes d’efficacité de transfection des myoblastes C2C12 après transfection avec des LRC et HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabrication par microfluidique) complexés avec de l’ARNm à un rapport N/P de 1,5 pour induire l’expression de la GFP.
La Figure 8 montre la distribution de HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabriqués par microfluidique) marqués avec de la PE-cyanine5 et associés avec de l’ARNm codant pour la protéine fluorescentes mCherry après administration intramusculaire dans le tibialis anterieur chez la souris saine Balb/C.
La Figure 9 montre les propriétés physico-chimiques des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabriqués par microfluidique) chargés en ADNp. Diamètre moyen et indice de polydispersité (A) et valeurs de potentiel zêta (B) des HLRC chargés en ADNp à différents rapports N/P (1,5, 2, 3, ou 4). Analyse électrophorétique des HLRC chargés en ADNp pour rechercher l’efficacité d’association d’ADN dans des HLRC (C). Image cryo-MET des HLRC chargés en ADNp à un rapport N/P de 1,5 (D).
La Figure 10 montre le taux d’internalisation des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabrication par microfluidique) chargés en ADNp sur des myoblastes C2C12.
La Figure 11 montre l’efficacité de transfection des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabrication par microfluidique) chargés en ADNp à différents rapports N/P sur des myoblastes C2C12 pour induire l’expression de la GFP.
La Figure 12 rapporte l’efficacité de transfection de différentes formulations lipidiques chargés en ADNp à des rapports N/P de 1,5 et 3 sur des myoblastes C2C12 pour induire l’expression de la GFP.
La Figure 13 montre le résultat des tests de viabilité cellulaire sur des myoblastes C2C12 transfectés par des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabrication par microfluidique) chargés en ADNp à différents rapports N/P. Les valeurs représentent des moyennes ± S.D (deviation standard).
La Figure 14 montre le résultat d’efficacité de transfection des ARNsi-HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabrication par microfluidique) à différentes doses sur myoblastes C2C12 pour inhiber l’expression de la protéine GFP.
La Figure 15 rapporte l’efficacité de transfection sur des myoblastes C2C12 des LRC et HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ; fabrication par microfluidique) complexés avec à un rapport N/P de 1,5 et 3 avec de l’ADNp (codant pour la protéine mScarlet) et de l’ARNm (codant pour la protéine GFP) à un rapport massique de 2: 1. L’efficacité de transfection est évaluée sur la capacité du système à induire l’expression de la GFP, de la mScarlet et simultanément les deux en même temps.
Description détaillée de l’invention
Définitions
Par « lipoplexe », on entend un complexe qui vectorise un acide nucléique, en particulier un complexe entre (i) un acide nucléique et (ii) une nanoparticule telle que définie dans la présente description.
Par « lipide cationique » on entend un lipide possédant une charge globale positive. Un lipide cationique comprend une tête polaire cationique et une ou plusieurs chaine(s) hydrophobe(s). Par « lipide neutre » on entend un lipide dont la charge globale est neutre, plus particulièrement un lipide zwitterionique. Par « micelle » on entend un agrégat sphéroïdal de molécules amphiphiles possédant une tête polaire hydrophile et une chaine hydrophobe.
On entend par « liposome » une vésicule artificielle formée par des bicouches lipidiques concentriques, emprisonnant entre elles des compartiments aqueux.
Le « potentiel zêta » représente la charge électrique qu'une particule acquiert grâce au nuage d’ions qui l’entourent quand elle est en suspension ou en solution. En effet, lorsque celle-ci est en mouvement dans un liquide, elle s’entoure d’ions organisés en une « double couche électrique » :
- une partie des ions s’accroche à la particule formant ainsi une couche d’ions adhérents dite couche dense
- l’autre partie des ions forme une couche non liée dite diffuse.
Le « plan de cisaillement » délimite ces deux couches. C’est la différence de potentiel entre le milieu de dispersion et le potentiel au plan de cisaillement qui définit le potentiel Zêta. Ce potentiel représente la mesure de l’intensité de répulsion ou d’attraction électrostatique entre particules. Le potentiel Ç (zêta) positif est crucial pour s’assurer de l’efficacité de la complexation de l’acide nucléique, ayant également un impact sur la stabilité colloïdale des particules du fait de la répulsion électrostatique entre elles.
Lipides cationiques
Les nanoparticules de l’invention comprennent au moins un lipide cationique (a).
De préférence, le lipide cationique est choisi parmi : les lipopolyamines, telles que la 2-{3-[Bis-(3-amino-propyl)-amino]-propylamino}-N- ditetradecyl carbamoyl methyl-acetamide (composé RPR209120), la 2-{3-[3-(3- Amino-propylamino)-propylamino]-propylamino}-N,N-dioctadecyl-acetamide (RPR120535) ( Byk et al, J. Med. Chem., 41, 224-235, 1998) ou le 2,3-dioleoyloxy- N- [2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propane-aminium-trifluoracetate (DOSPA), le dioctadécylamine-glycine-spermine (DOGS), la dipalmitylphosphatidylethanolamine 5-carboxyspermylamide (DPPES) ; les ammoniums quartenaires tels que le bromure de l,2-dimyristoyloxypropyl-3- diméthyl-hydroxy éthyl ammonium bromide (DMRIE) N-(2,3-dioleyloxypropyl]- N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), le l,2-dioleoyloxypropyl-N,N,N- trimethylammonium chloride (DOTAP), la dimethyldioctadecylammonium bromide (DD AB), ou la l,2-dioleyloxypropyl-3- dimethylhydroxy ethylammonium bromide (DORIE), la N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-l-aminium (DOBAQ), la l,2-dioleoyl-sn-glycero-3 -ethylphosphocholine (sel de chlorure) (DOEPC), N-N-dioleoyl-N,N-dimethylammonium chloride (DODAC), l,2-dioleoyl-3- dimethylammonium-propane (DODAP), N-methyl-
4(dioleyl)methylpyridinium chloride (SAINT-2) ; la stearylamine (SA), la N-t-butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidine (DiC14-amidine), la 0,0 '-dimyristyl N-lysylaspartate (DMKD), ou la O,O'-dimyristyl- N-lysyl glutamate (DMKE) ; et les lipides comportant des têtes cationiques de type guanidine (BGTC) ou imidazole (DOTIM), seuls ou en mélange.
Dans un mode de réalisation préféré, le lipide cationique est choisi parmi les ammoniums quaternaires tels que cités ci-dessus.
Dans un mode de réalisation préféré, le lipide cationique est du DOTAP.
Avantageusement, le lipide cationique est présent dans la nanoparticule en une quantité comprise entre 3 mM et 15 mM, de préférence entre 5 et 10 mM, de préférence encore 5 mM, et/ou le ratio molaire de lipide cationique par rapport aux autres lipides est compris entre 1 : 1 et 2:1.
Dans un mode de réalisation préféré, le lipide cationique (a) est du DOTAP, et le ratio molaire de DOTAP par rapport à l’ensemble des autres lipides (b) et (c) est compris entre 1 : 1 et 2: 1, de préférence environ 1 : 1. De préférence le DOTAP est présent une quantité comprise entre 3 mM et 15 mM, de préférence entre 5 et 10 mM, de préférence encore 5 mM.
Lipides neutres
Les nanoparticules de l’invention comprennent en outre au moins un lipide neutre (b).
Des exemples de lipide neutre incluent le l,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (DOPE), le dioleoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine (DOPC), le dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DPPC) et le N'-(rac-l-[l 1-(F- octyl)undec- 10-enyl]-2-(hexadecyl)glycero-3- phosphoethanoyl)-sperminecarboxamide), qui peuvent être utilisés seuls ou en mélange. De préférence le lipide neutre est DOPE. Une nanoparticule préférée comprend un mélange de DOTAP et de DOPE. Le mélange de DOTAP et de DOPE et de préférence sous la forme de liposome ou de nanoparticule lipidique.
De manière avantageuse, la nanoparticule de l’invention est dépourvue de cholestérol, voire d’un quelconque stéroïde.
Avantageusement, le lipide neutre est présent dans la nanoparticule en une quantité comprise entre 1 mM et 10 mM, de préférence encore entre 1 et 5 mM, de préférence environ 2,5 mM.
Lipides sensibles au pH
Les nanoparticules de l’invention comprennent en outre au moins un lipide (c) sensible au pH, différent du lipide cationique (a). Ces lipides sont protonés à un pH faible, ce qui les charge positivement, mais restent neutres à pH physiologique.
Par « lipide sensible au pH », on entend des lipides ionisables, notamment des lipides qui réagissent en fonction des variations du pH du milieu environnant clivables via hydrolyse acide, ou comprenant des groupements réductibles, comme des ponts disulfures.
Notamment ces lipides sont susceptibles d’être clivés par un agent cellulaire réducteur comme le glutathion.
Typiquement le lipide contient deux fractions hydrophobes et il est fonctionnalisé avec deux motifs sensibles qui peuvent répondre à l’environnement intracellulaire. Le premier est une amine tertiaire, une unité qui acquiert une charge positive en réponse à un compartiment acide (comme l’endosome ou le lysosome) pour la déstabilisation de la membrane ; le second est une liaison disulfure, une unité qui peut être clivée en réponse à un environnement réducteur (comme dans le cytoplasme) pour l’effondrement spontané.
Un exemple préféré de lipide sensible au pH est ainsi connu sous l’appellation de ssPalm (pour « SS-cleavable and pH-activated lipid-like material »).
Les produits Coatsome® mis sur le marché par NOF America corporation sont des tels lipides sensibles au pH préférés. Ils sont notamment décrits dans les articles Tanaka et al, Biomaterials, 2014, 35(5) : 755-1761 et Hidetaka Akita, Biol. Pharm. Bull. 2020, 43 (11) : 1617-1625, ainsi que dans les demandes de brevets EP 3 315 125 de Silence Therapeutics, WO 2020/142725 d’Oncorus; WO 2021/123332 de Curevac.
Dans un mode de réalisation préféré, le lipide sensible au pH est un lipide de formule (I) suivante : RCOO^C-CHCHa-S iCOO- CHaCHî-S dans laquelle :
RCOO est un groupement choisi parmi le groupement myristoyle, le groupement a-D- tocophérolsuccinoyle, le groupement linoléyle et le groupement oléoyle ; et
X est choisi parmi les groupements de structures (II), (III) ou (IV) suivantes :
En particulier, le lipide sensible au pH est un lipide de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle :
- RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule
(II) (correspondant au produit Coatsome® SS-M [SS-14/3AP-01]) ;
- RCOO est un groupement a-D-tocophérolsuccinoyle et X est un groupement de formule
(II) ou (III) (correspondant respectivement au produit Coatsome® SS-E [SS-33/3AP- 05] ou Coatsome® SS-EC [SS-33/4PE-15]) ;
- RCOO est un groupement linoléyle ou oléoyle et X est un groupement de formule
(III) (correspondant respectivement au produit Coatsome® SS-LC [SS-18/4PE-13] ou Coatsome® SS-OC [SS-18/4PE-16]) ; ou
- RCOO est un groupement oléoyle et X est un groupement de formule
(IV) (correspondant au produit Coatsome® SS-OP).
Avantageusement, le lipide sensible au pH est un lipide de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle -RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II). Ce produit est connu comme du Coatsome® SS-M.
Dans un autre mode de réalisation, le lipide sensible au pH peut être choisi parmi les lipides suivants : - Un lipide qui comprend un groupement amine tertiaire comme la l,2-dilinoleyloxy-n,n- dimethyl-3 -aminopropane (DLinDMA), la O-(Z,Z,Z,Z-heptatriaconta-6,9,26,29- tetraen-19-yl)-4-(N,N-dimethylamino) (DLin-MC3-DMA), ou la 2-[2,2-bis[(9Z,12Z)- octadeca-9,12-dienyl]-l,3-dioxolan-4-yl]-N,N-dimethylethanamine (DLin-KC2- DMA)
Ou
Les lipides sensibles au pH mentionnés ci-dessus peuvent être utilisés seuls ou en mélange avec d’autres lipides sensibles au pH.
Avantageusement, le lipide sensible au pH est présent dans la nanoparticule en une quantité comprise entre 1 et 10 mM, de préférence entre 1 et 5 mM, de préférence encore environ 2,5 mM. Dans un mode de réalisation préféré, la quantité de lipide sensible au pH est pratiquement identique à la quantité de lipide neutre.
Avantageusement, le lipide sensible au pH est un lipide de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle -RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II), en une quantité comprise entre 1 et 10 mM, de préférence entre 1 et 5 mM, de préférence encore environ 2,5 mM.
Une nanoparticule préférée comprend un mélange de a) DOTAP en tant que lipide cationique, b) DOPE en tant que lipide neutre, et c) un lipide de formule I, telle que définie plus haut, en tant que lipide sensible au pH, de préférence un lipide de formule (I) dans laquelle -RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II).
Une nanoparticule particulièrement préférée comprend un mélange de DOTAP (en une quantité de 5 mM), DOPE (en une quantité de 2,5 mM) et d’un lipide de formule (I) telle que définie ci- dessus dans laquelle -RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II), en une quantité de 2,5 mM.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la nanoparticule comprend
(a) du DOTAP en tant que lipide cationique,
(b) du DOPE en tant que lipide neutre, et
(c) du DLin-MC3-DMA en tant que lipide sensible au pH.
Méthode de préparation de la nanoparticule
De manière préférée, la nanoparticule de l’invention est préparée sous la forme d’un liposome ou d’une nanoparticule lipidique comprenant a) un lipide cationique, b) un lipide neutre, et c) un lipide sensible au pH, différent du lipide cationique (a), dans un rapport molaire de 2 : 1 : 1 à 4 :1 :1.
De manière avantageuse, la nanoparticule selon l’invention est préparée sous la forme de liposome comprenant :
(a) environ 50 % d’un lipide cationique, (b) environ 25 % d’un lipide neutre, et
(c) environ 25 % d’un lipide sensible au pH, différent du lipide cationique (a).
Selon un aspect préféré de l’invention, la nanoparticule selon l’invention est préparée sous la forme de liposome ou d’une nanoparticule lipidique comprenant :
(a) environ 50 % de DOTAP en tant que lipide cationique,
(b) environ 25 % de DOPE en tant que lipide neutre, et
(c) environ 25 % d’un lipide sensible au pH choisi parmi les lipides de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle :
RCOO est un groupement choisi parmi le groupement myristoyle, le groupement a-D- tocophérolsuccinoyle, le groupement linoléyle et le groupement oléoyle ; et
X est choisi parmi les groupements de structures (II), (III) ou (IV) telles que définies ci-dessus.
Selon un aspect préféré de l’invention, la nanoparticule selon l’invention est préparée sous la forme de liposome ou d’une nanoparticule lipidique comprenant :
(a) environ 50% de DOTAP en tant que lipide cationique,
(b) environ 25% de DOPE en tant que lipide neutre, et
(c) environ 25% d’un lipide sensible au pH choisi parmi les lipides de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle :
- RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II) ;
- RCOO est un groupement a-D-tocophérolsuccinoyle et X est un groupement de formule (II) ou (III) ;
- RCOO est un groupement linoléyle ou oléoyle et X est un groupement de formule (III) ; ou
- RCOO est un groupement oléoyle et X est un groupement de formule (IV).
Les liposomes ou nanoparticule lipidique peuvent être obtenus selon des techniques connues de l’homme du métier, notamment par une méthode d’hydratation du film lipidique et extrusion (typiquement à travers une ou plusieurs membranes, par exemple des membranes polycarbonate) ou par un procédé microfluidique. Ces deux méthodes sont décrites en détail dans les exemples ci-dessous. Complexation avec l’acide nucléique
Selon un aspect particulier de l’invention, la nanoparticule est chargée avec un acide nucléique, notamment pour former des lipoplexes. Les lipoplexes sont en particulier formés par complexation des lipides avec un acide nucléique. Dans le complexe obtenu, les lipides et l’acide nucléique sont associés de manière non covalente.
La nanoparticule chargée, ou lipoplexe, peut être notamment obtenue par un procédé comprenant : i) l’obtention d’un mélange des lipides a), b) et c) tels que définis plus haut (qui permet l’obtention de liposomes), et ii) la mise en contact dudit mélange avec un acide nucléique, pour obtenir des complexes ou lipoplexes.
L’étape i) de ce procédé est de préférence effectuée selon la méthode décrite ci-dessus pour former la nanoparticule lipidique.
L’étape ii) est de préférence effectuée par dilution des liposomes obtenus à l’étape i) dans un tampon ou un solvant aqueux, notamment dans de l’eau dépourvue de RNase, puis par addition d’une solution d’acides nucléiques dans un même tampon ou un même solvant aqueux, notamment dans de l’eau dépourvue de RNase.
Selon un aspect particulier de l’invention, la nanoparticule peut être chargée avec l’acide nucléique, de manière à obtenir un ratio N/P allant de 1 à 100, de préférence 1 à 60, de préférence 1 à 50, de préférence de 1 à 40, de préférence de 1 à 30, de préférence encore 1 à 20, de préférence de 1 à 10, de préférence de 1 à 8, de préférence encore 1,5 à 8, de préférence 1 à 5, de préférence encore I,5 à 5 ou l,5 à 4.
Le rapport des charges N/P correspond au rapport du nombre de fonctions amine des lipides de la nanoparticule (charges positives) sur le nombre de molécules de phosphate de l’acide nucléique (charges négatives).
Selon un aspect spécifique de l’invention, lorsque la nanoparticule chargée est formée par un procédé d’hydratation du film lipidique et extrusion, la nanoparticule chargée, ou lipoplexe, présente typiquement un ratio N/P supérieur ou égal à 3, de préférence 3 à 8, de préférence 3 à 5. Selon un autre aspect, lorsque la nanoparticule chargée est formée par un procédé microfluidique, la nanoparticule chargée, ou lipoplexe, présente typiquement un ratio N/P supérieur ou égal à 1,5 ou 2, de préférence 1,5 à 10, de préférence 1,5 à 5 ou 2 à 5.
L’acide nucléique peut être un acide désoxyribonucléique (ADN), un acide ribonucléique (ARN) simple ou double brin, par exemple un ARNm ou un ARN interfèrent, ou un mélange, encore ou des séquences hybrides ADN/ARN. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle. Ils peuvent également être obtenus par une modification chimique au niveau de leurs parties sucres, de leurs parties nucléobases ou de leur squelette internucléotidique. Parmi les modifications avantageuses dans les parties sucres, on peut notamment citer les modifications intervenant en position 2' du ribose, telles que les modifications 2'-deoxy, 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-thio, ou 2'-O-alkyl, en particulier 2'-O-méthyle, au lieu du groupement 2'-OH normal sur les ribonucléotides, ou encore la présence d'un pont méthylène entre les positions 2' et 4' du ribose (LNA). Concernant les nucléobases, il est possible d'utiliser des bases modifiées, telles que notamment la 5-bromo-uridine, la 5-iodo-uridine, la N<3>-méthyl-uridine, une 2,6- diaminopurine (DAP), la 5-méthyl-2'-deoxyCytidine, la 5-(l-propynyl)-2'-deoxy -Uridine (pdU), la 5-(l-propynyl)-2'-deoxyCytidine (pdC), ou des bases conjuguées avec du cholestérol. Enfin, des modifications avantageuses du squelette internucléotidique comprennent le remplacement de groupements phosphodiesters de ce squelette par des groupements phosphorothioate, méthylphosphonate, phosphorodiamidate, ou l'utilisation d'un squelette composé d'unités de N-(2-aminoethyl)-glycine liées par des liaisons peptidiques (PNA, Peptide Nucleic Acid). Les différentes modifications (base, sucre, squelette) peuvent bien entendu être combinées pour donner des acides nucléiques modifiés de type morpholino (bases fixées sur un cycle morpholine et liées par des groupes phosphorodiamidate) ou PNA (bases fixées sur des unités de N-(2-aminoethyl)-glycine liées par des liaisons peptidiques).
Les acides nucléiques peuvent être de petite taille (par exemple inférieure à 200 nucléotides), tels que des oligonucléotides antisens, des ARN interférents (ARNmi, ARNsi, ...), ou des aptamères par exemple. Ils peuvent être aussi avantageusement de grande taille (par exemple supérieure à 200, 300 ou 400 nucléotides). Dans un exemple particulier de réalisation, l’acide nucléique est un plasmide d’ADN (ADNp).
Des exemples de tailles d’acides nucléiques qui peuvent être chargés dans les lipoplexes de l’invention sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Dans un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique est un ARNm.
Dans un autre mode de réalisation, l’acide nucléique est un ADN.
Dans un autre mode de réalisation, l’acide nucléique est un ARN autre que de l’ARNm, par exemple un ARN interfèrent (par exemple siARN ou miARN).
Dans un mode de réalisation préféré, la nanoparticule comprend un mélange DOPE/DOTAP et SS-Palm, chargée avec un ARN (tel qu’un ARNm ou un ARN interfèrent) ou un ADN, de préférence un ADNp.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la nanoparticule comprend un mélange DOPE/DOTAP et SS-Palm, chargée avec un mélange d’ARN et d’ADN, de préférence un mélange d’ARNm et d’ADNp, par exemple dans un ratio ARN:ADN allant de 1 : 1 à 1 : 10, de préférence 1 : 1 à 1 :5, de préférence de 1 : 1 à 1 :3, de préférence encore 1 :2.
Polysaccharide anionique
La nanoparticule peut être revêtue de molécules d’un ou plusieurs polysaccharides anioniques. Un « polysaccharide » est formé par des séquences de saccharides connectées entre elles par des liaisons glycosidiques, et un « polysaccharide anionique » est un polysaccharide présentant une charge globale négative.
Parmi les polysaccharides anioniques, on peut citer les glycosaminoglycanes (comme l’acide hyaluronique ou l’un de ses sels, l’acide alginique ou l’un de ses sels), les carraghénanes (polysaccharides sulfatés des algues rouges), les fucanes (polysaccharides sulfatés des algues brunes), les Carboxy Méthyl Dextrane Benzylamide Sulfonates ou CMDBS (polysaccharides synthétiques préparés à partir de dextrane par substitution statistique de fonctions hydroxyles par des fonctions chimiques carboxyméthyles, benzylamides, sulfonates et sulfates), et les héparanes sulfates (polysaccharides complexes, appartenant à la famille des glycosaminoglycanes).
Dans un mode de réalisation préféré, le polysaccharide anionique est de l’acide hyaluronique ou l’un de ses sels, tels que le sel de sodium.
Alternativement, le polysaccharide anionique peut être l'acide alginique ou l'un de ses sels, tels que le sel de sodium.
Dans un mode de réalisation préféré, la nanoparticule comprend un mélange DOPE/DOTAP et un lipide SS palm de formule I, est chargée avec un ARN (de type par exemple ARNm, ou ARNsi) ou un ADN, de préférence un ADNp, et est revêtue de molécules d’acide hyaluronique, ou d’un des sels comme le hyaluronate de sodium (HA).
De préférence, le revêtement avec le polysaccharide anionique se fait par mise en contact de la nanoparticule / des liposomes / des lipoplexes obtenus précédemment avec le polysaccharide anionique tel que l’acide hyaluronique dans un solvant aqueux, par exemple dans de l’eau dépourvue de RNase.
De préférence, les lipoplexes sont revêtus de polysaccharide anionique, tel que de l’HA, dans un rapport pondéral lipide cationique : polysaccharide anionique de 1 :2.
Recouvrir les lipoplexes de polysaccharides anioniques présente notamment l’avantage d’augmenter l’accumulation des lipoplexes à des sites tumoraux, ou au niveau de cellules, comme par exemple des macrophages, myoblastes ou myotubes, où des récepteurs cellulaires à ces polysaccharides (comme CD44) sont surexprimés.
Transfert d’acides nucléiques
Les nanoparticules ou lipoplexes de l’invention peuvent être utilisés pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vivo, in vitro ou ex vivo. En particulier les compositions selon l'invention peuvent être utilisées pour transférer de manière très efficace des acides nucléiques dans de nombreux types cellulaires.
De préférence, la nanoparticule selon la présente invention est présente dans un milieu contenant des cellules à transfecter, dans des conditions telles qu'il y a passage du lipoplexe à partir du milieu dans le cytoplasme des cellules, puis relargage de l'acide nucléique dans le cytosol et/ou le noyau des cellules.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoparticule peut comprendre en outre un élément de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique, tel qu'un élément de ciblage intracellulaire (noyau, etc.) et/ou extracellulaire (ciblage de certains types cellulaires/tissus).
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une nanoparticule ou lipoplexe tel que défini ici et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement l’invention vise l’utilisation d’une nanoparticule telle que décrite ici en tant que vecteur pharmaceutiquement acceptable d’un acide nucléique.
Les doses d'acide nucléique utilisées ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, de l'acide nucléique à administrer, ou encore de la durée du traitement recherchée.
Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules de l’invention sont utiles dans des applications en thérapie génique. L’acide nucléique peut être alors de préférence un ADN codant pour une protéine fonctionnelle, notamment une protéine qui n’est pas produite de manière fonctionnelle chez le patient.
Dans plusieurs modes de réalisation, l’acide nucléique peut être un ARNm, codant pour une protéine qui n’est pas produite de manière fonctionnelle chez le patient, ou pour une protéine d’intérêt thérapeutique ou vaccinal.
Selon un autre aspect, l’acide nucléique choisi peut inhiber l’expression d’une protéine exprimée par le sujet, et donc être un ARNi ou un oligonucleotide anti-sens par exemplaire, qui est complémentaire de la séquence de l'ARNm qu'il cible. Il peut ainsi modifier l’ARNm, notamment par saut ou incorporation d’exon(s) en intervenant à l'étape de l’épissage.
Dans d’autres modes de réalisation, les nanoparticules de l’invention sont utiles dans des applications ex vivo, par exemple pour modifier des cellules dans une perspective de thérapie cellulaire notamment.
Une application thérapeutique particulière concerne le traitement des maladies musculaires ou des maladies musculo-squelettiques.
Est également décrit ici une méthode pour libérer un acide nucléique dans le muscle d’un sujet, de préférence un patient humain atteint d’une maladie musculaire ou musculo-squelettique, par administration intramusculaire d’une nanoparticule telle que décrite ici, chargée avec un acide nucléique, par exemple un ARNm codant pour une protéine d’intérêt thérapeutique. Les exemples et figures illustrent l’invention sans en limiter la portée.
Exemple 1 : Production de liposomes (lipoplexes) comme véhicules pour l’administration intracellulaire d’ARNm
Matériels et méthodes
Matériels
Le lipide cationique l,2-dioléoyl-3-triméthylammonium -propane (DOTAP) et le lipide auxiliaire l,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE) ont été achetés chez Avanti Polar Lipids. Coatsome® SS-M a été obtenu auprès de NOF America Corporation. L’ARNm codant pour GFP et Viromer a été fourni par BioNTech. Le hyaluronate de sodium (HA, masse molaire moyenne en poids, Mw=20 000 g mol-1) a été acheté auprès de Lifecore Biomedical (Minnesota, USA). Le fixable Live/dead® a été fourni par Sigma-Aldrich (Saint-Quentin- Fallavier, France).
Formulation de liposomes et de lipoplexes
Formulation de liposomes. Les liposomes ont été générés par la méthode d’hydratation de film mince, suivie d’une extrusion. Les lipides ont été dissous dans du chloroforme pour générer des solutions à la concentration finale désirée et ensuite ajoutés dans un ballon à fond circulaire de 10 mL pour une concentration lipidique finale de 10 mM après hydratation, en respectant le rapport molaire indiqué dans le Tableau 2. Le solvant organique a été éliminé sous pression réduite à 40°C en utilisant un évaporateur rotatif. Pour éliminer complètement le chloroforme, les ballons à fond circulaire ont été laissés toute la nuit dans un séchoir. Le film de lipides a été réhydraté avec le tampon HEPES à 0,1 M, pH 5,5. Après 5 minutes de vortexage, les vésicules multi-lamellaires ont été extradées à travers une grande membrane en polycarbonate (400 nm), en utilisant une mini-extrudeuse Avanti (Avanti Polar Lipids), puis par une seconde extrusion avec une membrane de 100 nm pour obtenir des vésicules unilamellaires. Des liposomes fluorescents ont été préparés avec du DOPE marquée à la rhodamine (Rho-PE) intégrée dans la membrane de liposome. Rho-PE a été ajoutée à un rapport de 2 % p/p à la solution de lipide avant le processus de séchage. Des liposomes DTPA ont été préparés avec du DSPE-DTPA (PE-DTPA) à des fins de radio-marquage. 0,5 % mole/mole de PE-DTPA a été ajouté à la solution de lipide avant le processus de séchage.
Tableau 2: Composition lipidique
Conc. finale en Conc. en DOTAP Conc. en DOPE Conc. en Coatsome® lipides (mM) (mM) (mM) (mM)
Liposome 10 5 2,5 2,5
Formulation de lipoplexes. Les lipoplexes ont été préparés en diluant les liposomes à 50 pL avec de l’eau dépourvue de RNase à une concentration finale de 1,8 mM, et par l’addition suivante de 50 pL de différentes concentrations en ARNm (0,03-0,15 mg/mL) dans de l’eau dépourvue de RNase pour obtenir des complexes dans la plage de rapports N/P de 1 à 5 tels que le montre le Tableau . Des lipoplexes revêtus d’acide hyaluronique ont été préparés par l’addition de 50 pL d’une solution d’HA à 0,6 mg/mL dans de l’eau dépourvue de RNase aux lipoplexes déjà formulés. Destinés à des fins in vivo, les lipoplexes ont été dilués avec une solution de glucose à 10 %, ou enrobés avec de l’HA dissous dans du glucose à 10%, pour obtenir la même concentration finale et une bonne osmolalité.
Tableau 3: Rapports molaires
Masse Masse
Rapport N/P N+ (mol) P- (mol) lipidique (g) d’ARNm (g)
1,0 6,43E-05 l,53E-05 4,50E-08 4,51E-08
1,5 6,43E-05 l,02E-05 4,50E-08 3,00E-08
2,0 6,43E-05 0,77E-05 4,50E-08 2,25E-08
2,5 6,43E-05 0,61E-05 4,50E-08 l,80E-08
3,0 6,43E-05 0,51E-05 4,50E-08 l,50E-08
3,5 6,43E-05 0,44E-05 4,50E-08 l,28E-08
5 6,43E-05 0,31E-05 4,50E-08 0,90E-08
Analyse physicochimique des lipoplexes
La distribution de tailles particulaires et la charge électrique de surface ont été mesurées en utilisant le Nano ZS de Malvern Zetasizer® (Malvern Instruments S. A, Worcestershire, UK). Le diamètre hydrodynamique et l’indice de polydispersité (PDI) ont été mesurés par diffusion dynamique de la lumière (DLS) en utilisant la méthode des cumuls et réalisée à 25 °C à un angle de détection de 173°. Le potentiel Zêta (Q a été déterminé par la technique d’électrophorèse. Tous les échantillons ont été dilués dans 1 mM de NaCl et les analyses ont été réalisées en triple exemplaire.
L’efficacité de l’association de l’ARNm a été déterminée en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose de Sybr Green®. Des échantillons ont été dilués dans de l’HEPES à pH 5,5 jusqu’à une quantité d’ARN finale de 0,125 pg. Après addition du colorant de chargement de gel d’ARNm, les échantillons ont été testés sur du gel d’agarose à 1 % (p/v) pendant 30 min à 80 V. Les bandes d’ARNm ont été visualisées et représentées en image en utilisant le dispositif d’imagerie EZ de Gel Doc™ (Bio-Rad).
Analyse par cryo-microscopie électronique en transmission (Cryo-MET) des liposomes chargés d ARNm
La morphologie des nanoparticules lipidiques a été évaluée par microscopie cryogénique électronique en transmission. En résumé, 3,5 pL de formulation ont été ajoutés sur une grille en cuivre CF-2/l-3Cu-50 et congelés par immersion en utilisant un Vitrobot (Thermoscientific) afin de générer une glace vitreuse. Les échantillons ont été stockés dans de l’azote liquide et représentés en image avec un microscope électronique JEM-1400Flash fonctionnant à 120 kV. Etudes cellulaires sur THP1
Etude de transfection. Une méthode de transfection inverse a été utilisée pour amplifier et prolonger l’expression génique. Des lipoplexes fraîchement préparés à un rapport N/P de 1, 3, 3,5 et 5 ont été placés dans des plaques à 24 puits. Des cellules THP-1 ont été ajoutées aux lipoplexes à une densité de 150000 cellules dans un total de 600 pL de milieu RPMI complet, supplémenté avec 15 % de FBS, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 % de tampon HEPES, 1 % de L-glutamine, et 1 % de pénicilline/streptomycine. Les volumes de lipoplexes ont été adaptés afin de transfecter des cellules avec 3 pg d’ARNm eGFP pour chaque condition. Une solution de Viromer Red contenant de l’ARNm eGFP a été utilisée en tant que témoin positif pour la transfection, pour le témoin négatif, 3 pg d’ARNm e-GFP ont été placées dans des plaques. Les cellules ont été ensuite incubées pendant 24 h à 37°C. Le milieu cellulaire a été modifié après 4 h de transfection. Après transfection, les cellules ont été lavées et colorées avec une solution de Fixable Live/Dead Violet avant acquisition avec un cytomètre en flux BD LSR 2. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel FlowJo et l’analyse statistique a été déterminée avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Etudes de viabilité. Des cellules THP-1 et les lipoplexes ont été mises en plaque comme décrit ci-dessus. Les lipoplexes ont été fraîchement préparés et ajoutés à chaque puits en la quantité nécessaire pour avoir 3 pg d’ARNm eGFP. Un traitement avec 50 pM de cis-platine a été utilisé comme témoin positif de la mort cellulaire. Les cellules ont été ensuite incubées pendant 4h, 24h, et 48h à 37°C, 5 % de CO2. Le milieu de cellules a été remplacé après 4 h de transfection. Les cellules ont été ensuite lavées et colorées avec de l’annexine V Pacific Blue™ et une dilution à 1 : 50 d’iodure de propidium avant acquisition avec un cytomètre en flux BD LSR 2. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel FlowJo et l’analyse statistique a été réalisée avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Etude d’internalisation Des lipoplexes fraîchement préparés de liposomes associés à PE-Rho à un rapport N/P de 3 ont été étalées dans des plaques 24 puits. Les cellules THP-1 ont ensuite été ajoutées à une densité de 150 000 cellules dans un total de 600 pL de milieu RPMI complet. Les volumes des lipoplexes ont été adaptés afin de transfecter les cellules avec 3 pg d'eGFP- ARNm pour chaque condition. Les cellules ont été incubées pendant 2, 4, 24 et 48h à 37 °C. Le milieu cellulaire a été changé après 4h de transfection. Après transfection, les cellules ont été lavées et colorées avec une solution Fixable Live/Dead Violet avant l'acquisition avec un cytomètre en flux BD™ LSR II. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo et l'analyse statistique a été déterminée avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Étude de biodistribution in vivo
Biodistribution in vivo des li radio-i Le radio-marquage de surface des liposomes a été réalisé par l’incubation de 4,17 pmol (500 pL) de liposome (DOTAP-DOPE- Coatsome-SS-M) avec 85,8 MBq (100 pL) de 11 lin à 60°C pendant 30 minutes. Cela a conduit à une quantité de radioactivité de 20,58 GBq/mmol. Le rapport molaire/activité a été de
0,24 nmol de PE-DTPA/MBq. L’efficacité du radio-marquage a été évaluée par la chromatographie en couches minces instantanée sur des bandes de gel de silice (iTLC-SG, Biodex Medical Systems, Shirley, USA) à l’aide du tampon citrate à 100 mM pH 5 comme phase mobile. Les activités de U 1ln libre et marqué ont été appréciées dans une chambre d’ionisation (Capintec, Florham Park, USA). Des lipoplexes ont été préparés à un rapport N/P 3. En bref, 1,25 pmol (150 pL) de liposomes radio-marqués (0,63 pmol de DOTAP) ont été incubés à température ambiante 0,2 nmol d’ARNm respectivement (équivalent à 0,244 pmol de phosphate), pendant 30 minutes. Des solutions d’ARNm ont été préparées et quantifiées avec un NanoDropTM (Ozyme, Saint-Cyr-l’Ecole, FRANCE). Ensuite, une solution de glucose à 10 % ou 0,025 pmol d’acide hyaluronique dissous dans du glucose à 10 % a été ajoutée aux lipoplexes également pour régler l’osmolalité.
Des formulations ont été injectées en intraveineuse à des souris BALB/c_Rj sous anesthésie avec 3 % d’Isoflurane. Les souris ont reçu une injection de 2,07±0,82 MBq i nIn chélatée à des lipoplexes de DTP A, soit en tant que lipoplexes LRC chargés positivement soit lipoplexes HLRC chargés négativement (activité spécifique de 20,58 et 25,77 Gbq/mmol de lipide total ; 50 nmol de lipide total/souris dans 100 pL, n=18). Pour chaque formulation, des groupes de 3 souris ont été euthanasiés 6 h, 24 h et 48 h post-injection par dislocation cervicale. Par la suite, les souris ont été disséquées et les organes ont été prélevés pour réaliser une analyse quantitative de l’activité accumulée. Une quantification ex vivo de la radioactivité de l’organe a été réalisée avec un compteur de rayons gamma Wizard 3” (Perkin Elmer, Waltham USA). Pour chaque formulation, une souris du groupe 48 h a été représentée en image en position couchée à 6 h, 24 h et 48 h. Toutes les acquisitions de l’animal vivant ont été réalisées avec un dispositif d’imagerie d’animal in vivo NanoSPECT/CTTM (Bioscan Inc., Washington D.C, USA). Au cours de l’acquisition, les animaux ont été anesthésiés avec 1,5 % d’Isofhirane et la respiration a été suivie avec un petit système de surveillance et d’alimentation modèle 1025T (SA Instruments Inc, Stony Brook, USA). Chaque acquisition a été réalisée avec un multiplexage préclinique SPECT/CT avec des ouvertures de multiplexage à trous d’épingle multiple. Le dispositif SPECT a acquis 24 des 256 x 256 pixels tous les 15 degrés. La durée du balayage a été de 100 secondes par projection. La reconstruction a été réalisée avec le logiciel du fabricant, HiSPECT, en utilisant un algorithme de maximisation d’attente de sous-ensembles ordonnés (OSEM) avec 9 itérations et 4 sous-ensembles avec une taille de voxel d’image de 0,6 mm.
Résultats
Caractérisation des lipoplexes avec de l’ARNm IVT Des liposomes (LP) cationiques ont été préparés par une méthode d’hydratation de film lipidique suivie par une extrusion à travers une membrane MWCO de 100 nm. Le diamètre liposomal hydrodynamique mesuré par DLS était de 140,8±3,4 nm, avec un PDI inférieur à 0,2. La stabilité de la formulation appréciée sur une période de 4 mois a indiqué que la taille et le PDI restaient invariables pendant toute la durée de l’expérimentation. Des résultats similaires ont été obtenus avec des liposomes marqués par la rhodamine (Rho-LP) et des liposomes DTPA (DTPA-LP), dont la taille hydrodynamique a été respectivement de 151+2,3 et 139,1±2,9 nm, avec un PDI inférieur à 0,2 dans les deux cas. Le PDI a un impact significatif sur la stabilité et la biodisponibilité des liposomes. Pour être stable, sûre et efficace, la préparation de liposomes doit être homogène. Une formulation acceptable de liposomes pour l’administration de médicaments devrait avoir une valeur PDI inférieure à 0,3. La charge de surface de toutes les formulations de liposomes préparées était positive dans la plage de +40-55 mV (Tableau ).
Tableau 4: Caractérisation physico-chimique des LP
LP Rho-LP DTPA-LP
Moyenne Z 140,8+3,4 151+2,3 139,1+2,9
(nm) PDI 0,09+0,02 0,07+0,02 0,13+0,01
Potentiel Ç
+42,0+2,4 +49,5+1,4 +55,8+1,8
(mV)
La quantité de charge positive présente dans la formulation est d’une importance clé quand la complexation électrostatique se produit avec une quantité précise de charges négatives. Pour cette raison, une méthode de quantification des charges porteuses lipidiques a été développée en utilisant la RP-HPLC. Les formulations finales se sont montrées aux environs de 95 % de teneur en DOTAP et DOPE, alors que le rendement était plus faible dans le cas du SS-Palm (environ 60%). Cela peut être attribué au pH de la formulation, lequel peut provoquer une protonation partielle de l’amine tertiaire, conduisant à la précipitation d’une partie du lipide. Deux différents types de complexes ont été préparés (Figure 1). Pour obtenir des complexes d’ARN de liposomes (LRC), l’ARNm a été mélangé avec des liposomes à un rapport N/P allant de 1 à 5. Sept rapports N/P différents (1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, et 5) ont été testés en termes de caractéristiques physico-chimiques et capacité à retenir les acides nucléiques. Dans une tentative d’obtenir des systèmes ayant des caractéristiques similaires en termes de taille, mais opposés en termes de charges de surface, le même ensemble de lipoplexes a été revêtu d’un polymère anionique, l’acide hyaluronique (HA) pour former des complexes d’ARN de liposome hybride (H-LRC). Au pH physiologique et au pH utilisé pour la formulation de liposome (5,5), les groupes phosphate existent principalement sous leur forme anionique, permettant une bonne complexation avec la particule de lipide cationique. La quantité de charges positives dans les lipides a été déterminée en fonction des informations données par le fabricant. Sept rapports N/P différents dans la plage comprise entre 1 et 5 ont été testés en termes de caractéristiques physico-chimiques et capacité à retenir les acides nucléiques.
Tableau 5: Caractérisation des LRC
Rapport
1 1,5 2 2,5 3 3,5 5
N/P
Moyenne 213,0+ 2109,6+ 1287,24+ 605,35+ 257,04+ 241,33+ 207,8+
Z (nm) 90,54 1425,91 778,80 389,31 102,70 103,74 88,36
0,16+ 0,40+ 0,50+ 0,37+ 0,17+ 0,17+ 0,17+
PDI
0,06 0,40 0,26 0,11 0,09 0,04 0,03
Potentiel -24,8+ +25,3+ +32,11+ +34,0+ +34,83+ +33,29+ +39,6+
Ç (mV) 9,95 9,00 9,25 6,2 5,72 5,13 8,4 Tableau 6: Caractérisation des H-LRC
Rapport
1 1,5 2 2,5 3 3,5 5
N/P
Moyenne 209, 4± 1081, 65± 1930,11± 543, 63± 255, 29± 240, 08± 227, 63±
Z (nm) 36,41 254,36 635,71 237,44 21,46 14,72 8,66
0,18± 0,54± 0,37± 0,43± 0,17± 0,19± 0,17±
PDI
0,11 0,27 0,18 0,04 0,09 0,04 0,04
Potentiel -31,16± -28,87± -25,63± -27,13± -26,37± -25,25± -28,21±
Ç (mV) 13,21 8,77 7,29 5,92 3,89 4,22 2,04
Pour à la fois LRC et H-LRC, le rapport N/P compris entre 1,5 et 2,5 a montré l’instabilité la plus forte en termes de formation de complexes, telle qu’elle peut être observée en termes de taille moyenne et de valeurs de polydispersité rapportées dans les Tableau et Tableau . Au contraire, pour un rapport N/P égal à 1 et supérieur à 3, les tailles sont descendues en dessous de 300 nm, avec un bon PDI autour de 0,2, important pour la stabilité et la biodisponibilité du système. Les charges de surface ont été positives pour tous les rapports N/P dans le cas de LRC, à l’exception du rapport N/P de 1, la présence d’un excédent d’ ARNm par rapport à la quantité de lipides conduisant à des particules chargées négativement. De manière intéressante, LRC avec un rapport N/P de 1 s’est avéré stable après la préparation avec un potentiel Ç initialement négatif, se décalant vers des valeurs positives au bout de 24 h, probablement à cause de la formation d’agrégats due à l’instabilité du système. Pour tous les autres rapports N/P, les charges de surface ont été similaires à celles des liposomes seuls, avec une réduction à la suite de l’addition d’ARNm. Ceci pourrait être un résultat de l’interaction électrostatique entre le lipide cationique et le squelette chargé négativement de l’acide nucléique. D’autre part, le potentiel zêta des HLRC était négatif pour tous les rapports N/P testés du fait de la présence de l’acide hyaluronique : en fait, à pH neutre, le pKa des groupes carboxyliques du polymère est d’environ 3-4. Avec ce revêtement, nous avons obtenu des lipoplexes de charges négatives dans le but d’observer leur différent comportement in vitro et in vivo.
CRYO-MET. Les LRC et HLRC ne sont pas constitués par une phase d’acide nucléique ordonnée entourée d’une bicouche lipidique externe, ce sont plutôt des complexes d’acide nucléique partiellement condensés avec une sous-structure ordonnée et une morphologie irrégulière. La technologie cryo-MET est une méthode de détection de monoparticules qui sont utilisées pour caractériser la morphologie des liposomes. Dans la Figure 2A, la morphologie classique des liposomes uni-lamellaires est montrée. Ce sont des vésicules sphériques ayant un compartiment interne aqueux délimité par une membrane unique bicouche. Les interactions des liposomes avec l’ARNm et l’ARNm/HA sont rapportées respectivement dans les Figures 2B et 2C. La déformation et le réarrangement des membranes liposomales résultent de fortes interactions électrostatiques entre les groupes de tête de lipide cationique et les groupes de phosphate d’acide nucléique. Des liposomes s’absorbant les uns les autres pour former des membranes appariées grâce à la présence de l’ARNm agissant comme pont entre elles peuvent être régulièrement observés. En fait, le plan contact entre les bicouches avait un contraste supérieur à leurs arêtes externes, ce qui suggère des molécules d’acide nucléique denses au niveau électronique, prises en sandwich entre les membranes. Dans d’autres cas, comme cela a été déjà rapporté dans la littérature pour les liposomes cationiques et l’ADN, il y a formation de systèmes multi-lamellaires dans lesquels l’alternance entre les acides nucléiques et les liposomes ressemble à une structure de type sandwich. Cette modification structurelle est dite bénéfique pour la stabilité de l’acide nucléique : la garniture bicouche autour de ceux-ci favorise la protection des molécules d’ARNm de la dégradation mieux qu’une simple association de surface, dans laquelle ils seraient plus sujets à la dégradation par des nucléases sériques.
Etudes et stabilité de l’association ARNm-Liposomes. Pour évaluer la stabilité de la complexation des LRC et HLRC, l’essai électrophorétique a été réalisé à tous les rapports N/P étudiés. Les acides nucléiques migrent à travers une matrice de gel d’agarose sous l’action d’un champ électrique selon sa charge, sa taille et sa morphologie. Dans le cas des LRC, un signal léger peut être vu en correspondance de l’ARNm libre, ce qui signifie qu’une partie de l’acide nucléique n’est pas constamment lié à la particule cationique. D’autre part, la présence du revêtement d’acide hyaluronique gêne cette libération et aucune fluorescence ne peut être observée.
Etudes cellulaires in vitro sur THP1
Etudes de transfection. Pour déterminer si et dans quelle mesure les LRC et H-LRC ont été capables de transfecter des cellules, nous les avons incubés avec des cellules THP-1 après complexation avec de l’ARNm IVT capable d’induire l’expression d’eGFP. Une optimisation du protocole focalisée sur la stabilité des complexes, la quantité d’ARNm IVT, le nombre de cellules, et les volumes, a été réalisée par quantification de l’expression d’eGFP par cytométrie en flux, conjointement avec la viabilité cellulaire. En fait, l’entrée d’acides nucléiques dans les cellules conjointement avec l’utilisation d’agents de transfection comme nos systèmes lipidiques provoque souvent un stress substantiel qui pourrait en dernier lieu affecter la viabilité cellulaire. Un matériau commercial qui se compose d’un noyau polycationique de polyethylène-imine a été utilisé comme témoin positif.
Comme le montre la Figure 3 (A et B), la transfection d’eGFP a été obtenue avec tous les systèmes sans différence significative entre les systèmes nus et revêtus d’HA ayant le même rapport N/P. L’efficacité de transfection la plus élevée a été atteinte avec le rapport N/P de 3 pour à la fois le système LRC et HLRC. Ledit rapport N/P a été retenu pour d’autres études.
Études d’internalisation. Pour déterminer la capacité des nanoparticules à transfecter des cellules et des cinétiques d’internalisation, 2 % de lipides rhodamine-DOTAP ont été utilisés dans leur formulation. Les rhodamine-LRC et HLRC ont été complexés avec l’ARNm eGFP au rapport N/P de 3 pour suivre la libération et la traduction de l’ARN dans le cytoplasme des cellules THP-1, une lignée cellulaire de monocytes. Comme le montre la Figure 3 (D), les deux signaux fluorescents ont été observés avec une cytométrie en flux à 2 h, 4 h, 24 h et 48 h post- transfection. Au bout de 2 h, les rhodamine-LRC et HLRC étaient présents dans chaque cellule. Ce signal fluorescent à la rhodamine était toujours fortement présent à chaque moment avec une légère décrue pour les deux LRC et HLRC après 48 h, cela pourrait être interprété comme le commencement de l’externalisation des nanoparticules hors des cellules.
Études de viabilité. Le test d’annexine-PI a été choisi pour les études de viabilité des LRC et HLRC au rapport N/P de 3. Comme illustré sur la Figure 3 (C), les 4 h et 24 h d’incubation des nanoparticules n’ont pas affecté la viabilité cellulaire comme cela se produit pour le témoin Viromer. Alors que, au point temporel 48 h, les LRC et HLRC étaient moins toxiques par rapport au Viromer.
Etudes in vivo
Biodistribution in vivo. Pour rechercher les propriétés de ciblage in vivo des formulations liposomales, des liposomes marqués par U 1ln ont été injectés par intraveineuse à des souris BALB/c_Rj après complexation avec l’ARNm au rapport N/P choisi de 3. L’imagerie SPECT/CT a été réalisée à 6 h, 24 h, et 48 h après l’injection.
Les résultats sont exprimés en tant que pourcentage de la dose totale de LRC ou HLRC administrés accumulée par gramme de tissu. La biodistribution de nanoparticules n’était pas différente entre les LRC et HLRC. Au bout de 6 h, les deux systèmes ont été retrouvés principalement dans le foie et la rate. Dans les poumons, le % détecté a été inférieur à 10 %. Au point temporel 24 h, la dose radioactive dans la rate a augmenté, atteignant environ 60 % de la dose injectée alors que dans le foie le pourcentage est descendu à environ 30 %. Nous pouvons voir qu’il n’existe pas de différence significative dans l’accumulation entre les LRC et les HLRC, laquelle décroît dans le temps dans le foie tout en conservant des valeurs plus élevées dans la rate, avec un pic à 24 h. En fait, 29,5 % de la radioactivité a été détectée dans le foie au bout de 24 h, contre 58,9 % dans la rate pour les LRC. Des résultats similaires ont été obtenus pour les HLRC, à savoir 37,2 % dans le foie et 52,4 % dans la rate.
Exemple 2 : Liposomes fabriqués par microfluidique comme véhicules pour l’administration intracellulaire d’ARNm
Matériels et méthodes
Matériels
Les mêmes matériels que dans l’exemple 1 ont été utilisés ici. L’ARNm-GFP utilisé pour les études in vitro sur THP-1 et in vivo après administration intraveineuse a été fourni par Biontech, alors que celui utilisé pour les études in vitro sur C2C12 ou CSPi et in vivo après administration intramusculaire a été acheté auprès de Tebubio (Le Perray-en-Yvelines, France).
Formulation de nanoparticules lipidiques et de lipoplexes
En bref, le lipide cationique (DOTAP ou DOTMA), lipide neutre (DOPE) et lipide sensible au pH (Coatsome® SS-M ou DLin-MC3-DMA) ont été solubilisés dans de l’éthanol à un rapport molaire de 2: 1 : 1 à une concentration finale de 10 pmol de lipides totaux. Les liposomes ont été formés en mélangeant la solution de lipide avec HEPES à pH 5,5 en utilisant une plateforme microfluidique Ignite™ (Precision NanoSystems Inc, Vancouver, Canada), à un rapport de débit de 3: 1 (v/v) et un débit total de 15 mL.min'1. Les systèmes ont été ensuite dialysés en utilisant une membrane de dialyse de 5 kDa pour éliminer l’éthanol résiduel de la formulation. Les nanoparticules lipidiques fluorescentes ont été obtenues par addition de PE-Rhodamine au mélange de lipides.
Des lipoplexes ont été préparés en diluant les liposomes à 50 pL avec de l’eau dépourvue de RNase à une concentration finale de 1,8 mM, et par l’addition suivante de 50 pL de différentes concentrations d’ARNm (0,06-0,3 mg/mL) dans de l’eau dépourvue de RNase pour obtenir des complexes dans la plage de rapports N/P de 1 à 50. Des lipoplexes revêtus d’acide hyaluronique ont été préparés par l’addition de 50 pL d’une solution à 0,6 mg/mL dans de l’eau dépourvue de RNase aux lipoplexes déjà formulés. Destinés à des fins in vivo, les lipoplexes ont été dilués avec une solution de glucose à 10 %, ou enrobés avec de l’HA dissous dans du glucose à 10 %, pour obtenir la même concentration finale et une bonne osmolalité. A des fins comparatives, des formulations composées d’un lipide neutre ainsi que d’uniquement un lipide cationique ou un lipide ionisable ont été testées. Pour cela, des formulations de DOTAP/DOPE ou DOPE/Coatsome SS-M ont été réalisées dans les mêmes conditions que précédemment décrites.
Analyse physicochimique des lipoplexes
Les mêmes analyses que dans l’exemple 1 ont été utilisés ici.
Etudes de transfection in vitro sur THP1
Les mêmes analyses que dans l’exemple 1 ont été utilisés ici.
Etudes de transfection in vitro sur C2C12
Des myoblastes C2C12 (une lignée de cellules musculaires murines immortalisées achetées auprès d'ATCC® CRL-1772) ont été cultivés sous atmosphère humide avec 5 % de CO2 à 37 °C, dans le milieu Eagle modifié GlutaMax de Dulbecco, supplémenté avec 10 % (v/v) de sérum bovin foetal (FBS), 0,5 % (v/v) et 100 unités/mL de pénicilline-streptomycine (Gibco). Pour induire la différenciation en myotubes, les myoblastes ont été cultivés dans le milieu Eagle modifié GlutaMax de Dulbecco, complété avec 1 % (v/v) de sérum de cheval fœtal (FHS) et 100 unités/mL de pénicilline-streptomycine (Gibco) pendant 6 jours.
Etude de transfection et viabilité. Pour l'étude de l'efficacité de la transfection, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à fond plat à 12 puits à la densité de 15 000 cellules par puits. Les myoblastes ont ensuite été traités avec 3 pg d'ARNm complexés aux différents nanosystèmes aux rapports N/P de 1,5 et 3. Le réactif de transfection viromère (Lipocalyx®) a été utilisé comme contrôle de transfection selon les instructions du fabricant. Tous les traitements ont été laissés 2 h, puis retirés pour du milieu frais et l'efficacité d'internalisation a été évaluée après 24 h d'incubation. Ensuite, les cellules ont été détachées enzymatiquement avec de la Trypsine-EDTA (0,5 %, Gibco) et colorés avec une solution Fixable Live/Dead Violet pour l'évaluation de la viabilité cellulaire. Les données ont été acquises avec un cytomètre en flux BD LSR 2 et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo. Les analyses statistiques ont été déterminées avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Etude d’internalisation. Pour cette analyse confocale en microscopie, les myoblastes ont été ensemencés sur des lamelles de verre de 12 mm dans des plaques multi puits 24 à la densité de 10 000 cellules/puits tandis que pour obtenir des myotubes, les myoblastes ont été ensemencés sur une chambre de culture Labtek à 4 compartiments à la densité de 40 000 cellules/puits et induite pour la différenciation pendant 6 jours. Les myoblastes et myotubes ont été traités avec 1 pg d’ARNm marqué par de la cyanine 5 et complexé avec des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) marqués par de la PE-Rhodamine à un rapport N/P de 1,5 pendant 30 min, 2 h et 24 h. Pour les temps d'incubation longs, les cellules ont été incubées avec le traitement pendant 2 h et ont ensuite reçu du milieu frais. Après chaque point de temps, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (v/v) dans du PBS, pendant 15 min à température ambiante. Pour les myoblastes, le cytoplasme cellulaire a été coloré avec Phalloidin-Atto 488 (Sigma) dilué 1 :20 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante, tandis que les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec du DAPI (stock à 20 mM dilué 1 :2000) pendant 1 h à température ambiante. Pour les myotubes, seuls les noyaux cellulaires ont été coloré avec du DAPI dans les mêmes conditions. Les échantillons ont finalement été montés dans un milieu de montage Fluoromount (Invitrogen) et l'imagerie a été réalisée par un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM800 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne) en utilisant un objectif 63X.
Etudes de transfection in vitro sur cellules souches humaines pluripotentes induites
Des cellules CSPi ont été cultivées sous atmosphère humide avec 5 % de CO2 à 37 °C, dans le milieu de culture StemMACSTM PSC-Brew XF (Miltenyi biotec). Pour l'étude de l'efficacité de la transfection, les CSPi ont été ensemencées dans des plaques 24 puits à la densité de 50 000 cellules par puits. Les CSPi ont ensuite été traités avec 3 pg d'ARNm-LRC ou ARNm- HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) aux rapports N/P de 1,5. Le réactif de transfection Lipofectamine 2000 (invitrogene®) a été utilisé comme contrôle de transfection pour les expériences avec ARN et utilisé selon les instructions du fabricant. Après 2h, un changement de milieu a été opéré. A 24h post transfection, les cellules ont été détachées enzymatiquement avec du Tryple (Gibco) et les cellules ont été par la suite marquées avec une solution de Live/Dead Violet pour évaluer la proportion de cellules mortes puis fixé avec une solution de PFA 4% pendant 10 min à température ambiante. Pour l’analyse par cytométrie en flux, les données ont été acquises avec un cytomètre en flux BD LSR 2 et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo. Les analyses statistiques ont été déterminées avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Etudes in vivo
Administration par voie intraveineuse. Les mêmes analyses que dans l’exemple 1 ont été utilisées ici.
Administration par voie intramusculaire. Pour étudier l’efficacité des formulations liposomales a transfecté les fibres musculaires, 5 pg d’ARNm-HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) au rapport N/P de 1,5 ont été injectés dans le muscle tibialis antérieur de souris BALB/c. Afin de déterminer la distribution des nanoparticules lipidiques ainsi que l’expression protéique des ARNm-HLRC, les HLRC ont été marqués avec de la PE-cy5 et la séquence ARNm a été sélectionné pour exprimer la protéine fluorescente mCherry. Après 2 h, les souris ont ensuite été sacrifiées et le muscle tibialis antérieur a été explanté et congelé en isopentane et des coupes transversales de ces muscles ont été recueillies au cryostat. Les membranes des fibres musculaires ont été marquées avec un marquage immuno-fluorescent anti-Laminin 488 et les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec du DAPI. Les échantillons ont finalement été montés dans un milieu de montage Fluoromount (Invitrogen) et l'observation a été réalisée par un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM800 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne) en utilisant un objectif 40X.
Résultats
Caractérisation des LRC et HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ou DOTAP/DOPE/DLin- MC3-DMA ou DOTMA/DOPE/Coatsome SS-M) chargés d RNm
La complexation a été optimisée en fonction du rapport azote/phosphate (N/P), défini comme étant le rapport des groupes d’amine des lipides pouvant être chargés positivement sur des groupes de phosphate d’acide nucléique chargés négativement. Tous ont montré un diamètre hydrodynamique d’environ 200 nm avec une charge de surface positive pour les LRC et négative pour les HLRC due au revêtement d’acide hyaluronique.
La complexation de l’ARNm a été évaluée par une mesure électrophorétique (Figure 4). L’ARNm est efficacement complexé avec tous les systèmes pour tous les rapports N/P testés. Plus le N/P ratio testé est haut et plus l’ARNm est fortement complexé, comme démontré par la diminution du signal de l’ARNm. Afin de démontrer que le faible signal de l’ARNm à haut N/P ratio est due à la forte complexation de l’ARNm et non à sa dégradation, les formulations ont été incubées avec de l’héparine, une grande molécule anionique, afin de décomplexer l’ARNm. Une fois incubée avec l’héparine, toutes les différentes formulations ont démontré que l’ARNm était bien présent.
Internalisation et efficacité de transfection des nanosystèmes DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M marqués par fluorescence sur THP1
Nous avons mis au point un protocole utilisant des cellules THP-1 traitées avec des LRC-ARN codant pour GFP à différents rapports N/P par rapport à l’agent de transfection commercial. THP-1 désigne une lignée cellulaire de type monocytes spontanément immortalisée, dérivée du sang périphérique d’un cas pédiatrique de leucémie aiguë monocytaire. Les cellules THP-1, y compris leurs dérivés manipulés génétiquement, représentent des outils appréciables pour étudier la structure monocytaire et fonctionnent à la fois chez les sujets sains et malades et sont largement utilisées dans les essais de translation. Nous avons conçu des expériences destinées à explorer l’efficacité de transfection, l’absorption et l’internalisation des complexes transfectant la GFP. En premier lieu, le protocole de transfection a été optimisé et l’expression de GFP a été quantifiée en utilisant un cytomètre en flux conjointement avec la viabilité cellulaire. En fait, l’introduction exogène d’acides nucléiques dans des cellules, conjointement avec l’utilisation d’agents de transfection, provoque souvent un stress substantiel qui pourrait en dernier lieu affecter la viabilité cellulaire. Des paramètres cruciaux ont été étudiés : i) stabilité des LRC ii) agent de transfection et concentration en ARNm, iii) profil de toxicité des nanosystèmes et iv) durée d’incubation.
Comme le montre la Figure 5, la transfection de GFP est obtenue avec tous les systèmes. A un rapport N/P choisi de 2, nous avons atteint une efficacité de transfection comparable à l’agent commercial (environ 70%) avec aucun impact significatif sur la viabilité cellulaire. Les systèmes retenus pour d’autres études ont été ceux préparés à un N/P de 2 pour à la fois les LRC et HLRC. L’efficacité de transfection et l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) ont été nettement plus élevées par rapport aux N/P de 2,5, 3, 3,5 et 5. Tandis que le rapport N/P de 1 n’a pas été retenu car instable.
Nous avons émis l’hypothèse que l’expression accrue d’ARNm par ces lipides mixtes pouvait être due à une absorption accrue d’ARNm du fait de la complexation aux LRC. Cette hypothèse a été étudiée via les cinétiques d’internalisation des LRC en utilisant des systèmes marqués par fluorescence. Ces systèmes ont été complexés avec de l’ARN GFP à un rapport N/P de 2 qui était le rapport ayant suscité l’efficacité de transfection la plus élevée. Les deux signaux fluorescents, l’un des lipides et le signal de GFP, ont été observés par cytométrie en flux à 2 h, 4 h, 24 h et 48 h post-transfection. Au bout de 2 h, la fluorescence des lipides a été quantifiée dans toutes les cellules. Le signal a été maintenu jusqu’à 24 h et c’est seulement 48 h après qu’une légère décroissance a été observée.
Internalisation et efficacité de transfection des différents nanosystèmes sur C2C12
Etude de transfection. L'efficacité de la transfection a été étudiée par cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage de myoblastes exprimant la GFP (Figure 6). Les données ont montré que pour les formulations DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M et DOTAP/DOPE/Dlin-MC3-DMA au rapport N/P 1.5 et 3, environ 90 % des myoblastes exprimés la GFP, démontrant une efficacité de transfection similaire à celle de l’agent de transfection commercial utilisé. Pour ce qui est de la formulation DOTMA/DOPE/Coatsome SS-M, ce taux était réduit à environ 40 %. A l’inverse, les formulations composées d’un lipide neutre et d’uniquement un lipide cationique (DOTAP/DOPE) ou d’un lipide sensible au pH (Coatsome SS-M/DOPE) n’ont démontré qu’un faible taux de transfection d’environ 20 % dans les conditions similaires aux formulations précédentes.
Les cellules traitées avec l'ARNm uniquement n'ont montré aucun signe de transfection, avec un pourcentage similaire aux cellules non traitées.
Etude de viabilité. Pour étudier la cytotoxicité induite par les complexes aux différents rapports N/P, un test de viabilité vivant/mort a été réalisé. Nos résultats ont montré que les cellules incubées avec des lipoplexes ne présentaient qu'une légère diminution de la viabilité cellulaire par rapport à celle du contrôle avec jusqu'à 90 % de cellules vivantes pour toutes les conditions, alors que le produit commercial induit une diminution de la viabilité cellulaire d'environ 80 %. Etude d’internalisation. La distribution intracellulaire de l’ARNm complexé avec des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) dans les myoblastes C2C12 et les myotubes a été étudiée en microscopie confocale. Pour les myoblastes, le HLRC marqué par fluorescence a montré qu'il pénétrait rapidement dans les cellules d'une manière dépendante du temps. Après 2 h d'incubation, l'ARNm-HLRC s'est accumulée dans le cytosol de la région périnucléaire sans pénétrer dans le noyau. Après 24 h d’incubation, le HLRC est apparu sous la forme d'amas fluorescents plus gros présentant un signal plus diffus, probablement en raison d'un échange de lipides avec les cellules. La libération intracellulaire de l’ARNm a également été étudiée par l'évaluation de la colocalisation entre le signal HLRC et l’ARNm. Après seulement 30 min, l'ARNm était déjà trouvé libre dans le cytosol et complexé avec HLRC alors qu'après 2 h, presque aucun ARNm n'était trouvé complexé avec HLRC dans le cytosol. Après 24 h d'incubation, plus d’ARNm n'a été trouvé dans le milieu intracellulaire. Pour les myotubes, seuls quelques HLRC ont été trouvés dans le cytosol après 24 h d'incubation même si les myotubes ont été efficacement transfectés, comme le démontre leur expression de GFP. Plus intéressant encore, l'expression de la GFP était plus exprimée dans les myotubes que dans les myoblastes, montrant leur efficacité prometteuse pour traiter les muscles squelettiques.
Efficacité de transfection des différents nanosystèmes sur CSPi
L'efficacité de la transfection a été étudiée par cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage de CSPi exprimant la GFP (Figure 7). Les résultats obtenus ont démontré une forte efficacité des LRC et HLRC de composition DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M a transfecté les CSPi, avec environ 80 % de cellules exprimant la GFP, similairement à l’agent de transfection in vitro commercial Lipofectamine. De plus, aucune diminution de la viabilité cellulaire n’a été observé.
Etude in vivo des nanoparticules radio-marquées chez des souris en bonne santé Administration par voie intraveineuse. Des systèmes à circulation prolongée sont nécessaires pour maximiser le ciblage des monocytes qui sont principalement localisés dans le compartiment sanguin, la moelle osseuse et la rate. En utilisant une approche de radiomarquage, nous avons déterminé quantitativement la biodistribution des nanoparticules à la suite de l’administration systémique chez des souris en bonne santé. Les liposomes marqués par i nIn ont été injectés en IV chez des souris BALB/c_Rj après complexation avec l’ARNm au rapport N/P choisi de 2. L’imagerie SPECT/CT a été réalisée au bout de 6 h, 24 h, et 48 h après l’injection. Les doses d’agent radioactif injecté pour les LRC étaient de 3,30 MBq alors que pour HLRC elles étaient de 3,59 MBq. Dans les deux cas, une accumulation nette de particules dans le foie et la rate a été observée, sans aucune différence entre les systèmes.
La quantité de radioactivité de chaque organe animal a été quantifiée avec un compteur gamma et les résultats ont été normalisés et présentés sous forme de % Dl/g (dose injectée/g de tissu). Nous pouvons observer qu’entre les LRC et les HLRC, il n’y a eu aucune différence significative dans l’accumulation, qui diminue au cours du temps dans le foie tout en conservant des valeurs plus élevées dans la rate, avec un pic à 24 h post- injection IV. En fait, 34 % de la Dl/g ont été détectés dans le foie au bout de 24 h, contre 60 % dans la rate pour les LRC. Des résultats similaires ont été obtenus pour les HLRC, qui sont de 39.1 % dans le foie et 51.7 % dans la rate.
Administration par voie intramusculaire. La distribution in vivo des nanoparticules lipidiques ainsi que l’expression protéique des ARNm-HLRC ont été évaluées après injection dans le tibialis antérieur de souris saines (Figure 8). Après observation de coupes transversales en microscopie confocal, les images ont démontré une distribution principale des HLRC entre les fibres musculaires et diffusant dans les fibres adjacentes après 2 h d’administration. De plus, une légère expression de la protéine codée par l’ARNm complexé dans les HLRC était déjà visible au niveau de la localisation des HLRC, après seulement 2 h d’incubation, démontrant l’efficacité de cette formulation pour acheminer et délivrer l’ARNm dans les fibres musculaires. Aucun dommage cellulaire ni morphologiques n’a été observé sur les coupes transversales recueillies.
Exemple 3 : Liposomes fabriqués par microfluidique comme véhicule pour l’administration intracellulaire d’ADN plasmide
Matériels et méthodes
Matériels Les mêmes matériels qu’à l’exemple 1 et à l’exemple 2 ont été utilisés ici. Le plasmide d’ADN pCAGIG a été obtenu auprès de Addgene (Plasmid #11159).
Complexation de l ’ADNp dans des liposomes
Le même protocole ainsi que les mêmes formulations décrites dans l’exemple 2 ont été suivi ici. L’ADN plasmidique (pCAGIG) codant pour l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) a été complexé en mélangeant les différents liposomes avec des quantités adéquates d’ADN afin d’obtenir des lipoplexes à un rapport N/P de 1,5 et 3. Les lipoplexes ont été finalement revêtus avec de l’HA (HLRC) dans un rapport en poids DOTAP:HA de 1 :2.
Analyse physico-chimique des liposomes chargés en ADNp
Les mêmes analyses que dans l’exemple 1 ont été utilisées ici.
Analyse par cryo-microscopie électronique en transmission (Cryo-MET) des liposomes chargés dADNp
La morphologie des nanoparticules lipidiques DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M a été évaluée par cryomicroscopie électronique en transmission. En résumé, 3,5 pL de formulation ont été ajoutés sur une grille en cuivre CF-2/l-3Cu-50 et congelés par immersion en utilisant un Vitrobot (Thermoscientific) afin de générer une glace vitreuse. Les échantillons ont été stockés dans de l’azote liquide et observés avec un microscope électronique JEM-1400Flash fonctionnant à 120 kV.
Etudes de transfection in vitro
Les myoblastes C2C12 ont été cultivés comme précédemment décrit dans l’exemple 2.
Etude d’internalisation. L’efficacité d’internalisation des ADNp-HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) dans les myoblastes a été évalué en cytométrie en flux et en microscopie confocale. Pour l’analyse en cytométrie en flux, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits à fond plat à la densité de 20 000 cellules par puits. Les myoblastes ont été ensuite traités avec 7,5 pg d’ADNp chargé dans les HLRC marquées avec de la PE- Rhodamine à des N/P de 1,5 et 2. L’efficacité d’internalisation a été évaluée au bout de 2, 4, 24 et 48 h d’incubation. Après 2 h post incubation, le milieu contenant le traitement a été remplacé par du milieu frais. Après chaque temps d’incubation, les cellules ont été lavées, détachées enzymatiquement avec de la trypsine-EDTA (0,5 %, Gibco) et colorées avec une solution Fixable Live/Dead Violet pour étudier la viabilité cellulaire. Les données ont été acquises avec un cytomètre en flux BD LSR 2 et les données ont été analysées en utilisant le logiciel FlowJo. L’analyse statistique a été déterminée avec le logiciel GraphPad Prism v8.1. Pour les analyses en microscopie confocale, les mêmes conditions que dans l’exemple 2 ont été utilisées. Etude de transfection et viabilité. L'efficacité de la transfection a été étudiée par cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage de myoblastes exprimant la GFP. Pour cela, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits à fond plat à la densité de 15 000 cellules par puits. Pour la première étude approfondie de notre formulation principale, les myoblastes ont été ensuite traités avec 5, 7,5 et 10 pg d’ADNp chargé dans des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) à des rapports N/P de 1,5, 2 et 3. Le réactif de transfection Jet-prime (Polyplus transfection®) a été utilisé comme témoin de transfection conformément aux instructions du fabricant. Tous les traitements ont été laissés toute la nuit et puis remplacés par du milieu frais. Après 48 h, les cellules ont été traitées et analysées comme décrit ci-dessus.
Pour la seconde étude comparative des différentes formulations, les myoblastes ont ensuite été traités avec 3 pg d'ADNp complexés aux différents nanosystèmes aux rapports N/P de 1,5 et 3. Le réactif de transfection commercial Jet-Prime (Polyplus®) a été utilisé comme contrôle de transfection selon les instructions du fabricant. Tous les traitements ont été laissés 2 h, puis retirés pour du milieu frais et l'efficacité d'internalisation a été évaluée après 48 h d'incubation. Ensuite, les cellules ont été détachées enzymatiquement avec de la Trypsine-EDTA (0,5 %, Gibco) et colorés avec une solution Fixable Live/Dead Violet pour l'évaluation de la viabilité cellulaire. Les données ont été acquises avec un cytomètre en flux BD LSR 2 et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo. Les analyses statistiques ont été déterminées avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Résultats
Caractérisation des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M ou DOTAP/DOPE/DLin-MC3- DMA ou DOTMA/DOPE/Coatsome SS-M) chargés en ADNp
Les HLRC chargés en ADNp ont été obtenus par complexation de l’ADNp avec des liposomes fabriqués par microfluidique. Toutes les lipoplexes ont montré un diamètre moyen autour de 200 nm et un indice de polydispersité inférieur à 0,2 pour les différents rapports N/P testés, avec une charge de surface négative (autour de -20 mV) du fait des groupes phosphates et carboxyliques de l’ADN et de l’HA (Figure 9, A et B).
La complexation de l’ADNp a été évaluée par une mesure électrophorétique. L’ADNp a été efficacement et totalement complexé avec tous les systèmes pour tous les rapports N/P testés. Comme pour l’exemple 2, plus le N/P ratio testé est haut et plus l’ADNp est fortement complexé, comme démontré par la diminution du signal de l’ARNm (Figure 9, C pour la formulation DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M). L’analyse morphologique réalisée en utilisant la cryo-microscopie MET (Figure 9, D pour la formulation DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) a montré que les HLRC chargés en ADNp ont formé des vésicules avec une structure multi-lamellaires où l’acide nucléique est enfermé entre différentes bicouches lipidiques, assurant ainsi sa protection.
Efficacité d’internalisation
L’efficacité des HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) chargés en ADNp à être internalisé dans les cellules musculaires a été étudiée par cytométrie en flux (Figure 10). Le pourcentage de cellules marquées par les HLRC marqués avec de la PE-Rhodamine et chargés en ADNp a été analysé afin d’étudier quantitativement l’efficacité d’internalisation (Figure 10). L’analyse de cytométrie en flux a montré pour les deux rapports N/P une rapide et efficace internalisation des HLRC chargés en ADNp avec presque toutes les cellules positives au signal de la rhodamine après seulement 2 h d’incubation. Le taux d’internalisation a été maintenu constant jusqu’à 48 h, ce qui signifie que les HLRC chargés en ADNp n’ont pas été totalement expulsés des cellules et que les nanoparticules ont été transmises de cellules en cellules au cours de la prolifération cellulaire.
La distribution intracellulaire des HLRC chargés en ADNp dans les myoblastes C2C12 a été étudiée en microscopie confocale. Pour les myoblastes, les HLRC marqués par de la PE- Rhodamine et chargés en ADNp ont montré qu'ils pénétraient rapidement dans les cellules en fonction du temps. Après 2 h d'incubation, les HLRC chargés en ADNp s'accumulent dans le cytosol de la région périnucléaire sans pénétrer dans le noyau. Après 24 h d'incubation, les lipoplexes sont observés sous la forme d'amas fluorescents plus gros présentant un signal plus diffus, probablement en raison d'un certain échange de lipides avec les cellules.
Efficacité de transfection cellulaire
L’efficacité de transfection a été étudiée par cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage des myoblastes exprimant la GFP.
Pour la première étude approfondie de notre formulation principale DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M (Figure 11), les données ont démontré une efficacité de transfection dépendante du N/P ratio, avec un pourcentage de transfection cellulaire accru au N/P ratio les plus faibles. De plus, ces données ont montré l’efficacité de ce système pour acheminer et délivrer F ADNp au sein des myoblastes avec plus de 60 % de cellules exprimant la GFP pour les HLRC chargés en ADNp à un rapport N/P de 1.5, similairement à l’agent de transfection commercial in vitro utilisé. De manière intéressante, la quantité différente de traitement n’a augmenté que légèrement l’efficacité de transfection. Les cellules traitées avec de l’ADNp seul n’ont pas montré de signe quelconque de transfection, avec un pourcentage de transfection similaire aux cellules non traitées.
Pour la seconde étude comparative des différentes formulations (Figure 12), les données ont montré que pour les formulations DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M et DOTMA/DOPE/Coatsome SS-M au rapport N/P 1.5 et 3, environ 30 % des myoblastes exprimés la GFP, démontrant une efficacité de transfection similaire à celle de l’agent de transfection in vitro commercial utilisé. Pour ce qui est de la formulation DOTAP/DOPE/DLin- MC3-DMA, ce taux était même augmenté jusqu’à environ 60 % démontrant ainsi une efficacité supérieure à l’agent de transfection in vitro commercial utilisé. A l’inverse, les formulations composées d’un lipide neutre et d’uniquement un lipide cationique (DOTAP/DOPE) ou d’un lipide sensible au pH (Coatsome SS-M/DOPE) n’ont démontré qu’un très faible taux de transfection inférieur à 10 % dans les conditions similaires aux formulations précédentes. Les cellules traitées avec uniquement l'ADNp n'ont montré aucun signe de transfection, avec un pourcentage similaire aux cellules non traitées.
Test de viabilité cellulaire
Pour étudier la cytotoxicité induite par les complexes ADNp-HLRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) aux différents rapports N/P testés dans la première étude de transfection, un test de viabilité (Live/Dead) a été réalisé (Figure 13). Nos résultats ont montré que les cellules incubées avec les lipoplexes présentaient une diminution de la viabilité cellulaire (50 à 75 %) par rapport à celle du contrôle. L'agent de transfection commercial Jet-prime a montré la même tendance, avec une viabilité cellulaire d'environ 65%. Cette diminution de la viabilité cellulaire est corrélée à la durée des traitements pendant la nuit et une durée d'incubation plus courte peut améliorer la viabilité cellulaire sans altérer l'efficacité de la transfection. Lors de la deuxième étude de transfection, nos résultats ont montré que les cellules incubées pendant 2 h avec les lipoplexes ne présentaient qu'une légère diminution de la viabilité cellulaire avec jusqu'à 90 % de cellules vivantes pour toutes les conditions.
Exemple 4 : Liposomes fabriqués par microfluidique comme véhicules pour l’administration intracellulaire d’oligonucléotides antisens
Matériels et méthodes
Matériels
Les mêmes matériels qu’aux exemples précédents ont été utilisés ici. L’oligonucléotide antisens ASO-cyanine5, fourni par Eurogentec, présente 14 nucléotides. Complexation de l ’oligonucléotide antisens (ASO)
Le même protocole que celui décrit à l’exemple 2 a été suivi ici. L'oligonucléotide antisens testé est un ASO-cyanine 5 conçu pour cibler une séquence d'ADN spéciale et induire son clivage. La séquence ASO-cyanine5 a été complexée en mélangeant des nanoparticules lipidiques (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) avec des quantités adéquates d’ASO pour obtenir des lipoplexes à un rapport N/P de 2, 4, 8 et 10. Les lipoplexes ont finalement été revêtus de HA (HLRC) dans un rapport pondéral DOTAP:HA de 1 :2.
Analyse physico-chimique des ASO-liposome
Les mêmes analyses que dans l’exemple 1 ont été utilisées ici.
Culture cellulaire
Les myoblastes et myotubes C2C12 ont été cultivés comme précédemment décrit dans l’exemple 2.
Absorption et distribution intracellulaire de IASO-HLRC
La distribution intracellulaire de l’ASO-HLRC a été étudiée par analyse confocale en microscopie. Pour cela, les myoblastes ont été ensemencés sur des lamelles de verre de 12 mm dans des plaques multipuits 24 à la densité de 10 000 cellules/puits tandis que pour obtenir des myotubes, les myoblastes ont été ensemencés sur une chambre de culture Labtek à 4 compartiments à la densité de 40 000 cellules/puits et induite en différenciation pendant 6 jours. Les myoblastes ont été traités avec 1 pg d'ASO-cyanine5-HLRC pendant 30 min, 2 et 24 h et les myotubes ont été traités avec 1 pg d'ASO-cyanine5-HLRC à un rapport N/P de 10 pendant 2 et 48 h. Pour les temps d'incubation longs, les cellules ont été incubées pendant 2 h et ont ensuite reçu du milieu frais. Après chaque point de temps, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (v/v) dans du PB S, pendant 15 min à température ambiante. Le cytoplasme cellulaire a été coloré avec Phalloidin-Atto 488 (Sigma) dilué 1 :20 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante, tandis que les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec du DAPI (stock à 20 mM dilué 1 :2000) pendant 1 h à température ambiante. Les échantillons ont finalement été montés dans un support de montage Fluoromount (Invitrogen) et l'imagerie a été réalisée par un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM800 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne) en utilisant un objectif 63X.
Résultats
Caractérisation de ï ASO -cyanine 5 -HLRC
Les lipoplexes ASO-cyanine5-HLRC ont été obtenus par complexation d'ASO-cyanine5 avec des liposomes fabriqués par microfluidique. Les lipoplexes ont montré un diamètre moyen d'environ 150 nm et un indice de polydispersité inférieur à 0,2 pour tous les rapports N/P. Le potentiel de surface était négatif (autour de -20 mV) en raison des groupements phosphate et carboxylique de la séquence ASO et de l’HA.
L’électrophorèse sur gel a été utilisé pour étudier la complexation de l'ASO avec les nanosystèmes HLRC. Pour un rapport N/P de 2 à 8, l'ASO était partiellement complexée avec les liposomes. Cette complexation a été renforcée à un rapport N/P de 10.
Internalisation et distribution intracellulaire de l'ASO -cyanine 5 -HLRC
La distribution intracellulaire des ASO-cyanine5-HLRC dans les myoblastes C2C12 et les myotubes a été étudiée en microscopie confocale. Pour les myoblastes, les HLRC marqués avec un lipide fluorescent ont montré qu'ils pénétraient rapidement dans les cellules d'une manière dépendante du temps. Après 2 h d'incubation, les ASO-cyanine5-HLRC sont accumulés dans le cytosol de la région périnucléaire sans pénétrer dans le noyau. Après 24 h d'incubation, les ASO-cyanine5-HLRC apparaissent sous la forme d'amas fluorescents plus gros présentant un signal plus diffus, probablement en raison d'un échange de lipides avec les cellules. La libération intracellulaire d'ASO a également été étudiée par l'évaluation de la colocalisation entre le signal HLRC et ASO. Après 30 min d'incubation, l'ASO était presque entièrement complexé avec les HLRC alors qu'après 24 h d’incubation, l’ASO n’était plus complexé avec les HLRC dans le cytosol.
Pour les myotubes, la même tendance globale a été observée. Après 2 h d'incubation, on a trouvé de l'ASO-cyanine5-HLRC entrant dans les myotubes dont l'ASO est complètement complexée avec la HLRC. Après 24 h d’incubation, les HLRC se sont retrouvées libres dans le cytosol et l'ASO n'était plus complexée avec les HLRC, démontrant l'efficacité des nanoparticules HLRC pour délivrer des séquences ASO dans les myotubes, ouvrant la voie à des applications de traitement du muscle squelettique.
Exemple 5 : Liposomes fabriqués par microfluidique comme véhicules pour l’administration intracellulaire de ARNsi
Matériels et méthodes
Matériels
Les mêmes matériels qu’aux exemples précédents ont été utilisés ici. L’ARN interfèrent est un ARN de 21 nucléotides, fourni par Eurogentec.
Complexation du ARNsi Le même protocole que celui décrit à l’exemple 2 a été suivi ici. L’ARN interfèrent a été complexé en mélangeant des nanoparticules lipidiques (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) avec des quantités adéquates d’ARNsi pour obtenir des lipoplexes à un rapport N/P de 2, 4, 8 et 10. Les lipoplexes ont finalement été revêtus de HA (HLRC) dans un rapport pondéral DOTAP:HA de 1 :2.
Analyse physico-chimique des ARNsi-liposome
Le même protocole que celui décrit à l’exemple 1 a été suivi ici.
Etudes de transfection in vitro
Les myoblastes C2C12 ont été cultivés comme précédemment décrit dans l’exemple 2.
Etude d’efficacité de transfection. L'efficacité de la transfection a été étudiée par cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage de myoblastes exprimant la GFP. Des myoblastes ont été ensemencées dans des plaques à fond plat à 12 puits à la densité de 15 000 cellules par puits. Tout d'abord, les myoblastes ont été traités avec 0,5, 1 et 2 pg de ARNsi-HLRC au rapport N/P 10, suivis d'un traitement pCAGIG (ADN plasmidique codant pour l'expression de la GFP) en utilisant le réactif de transfection Jet-prime (Polyplus transfection®) selon les instructions du fabricant. Tous les traitements ont été laissés 2 h puis retirés pour du milieu frais. Après 48 h, les milieux de culture cellulaire ont été recueillis et les cellules ont été détachées enzymatiquement avec de la Trypsine-EDTA (0,5 %, Gibco). Les données ont été acquises avec un cytomètre en flux BD LSR 2 et les données ont été analysées en utilisant le logiciel FlowJo. L’analyse statistique a été déterminée avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Etude de viabilité. Après 48 h d’incubations, les cellules ont été marquées avec une solution Fixable Live/Dead Violet pour évaluer la viabilité cellulaire. Les données ont été acquises avec un cytomètre en flux BD LSR 2 et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo. Les analyses statistiques ont été déterminées avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Résultats
Caractérisation des ARNsi-HLRC
Les ARNsi-HLRC ont été obtenus par complexation de ARNsi avec des liposomes fabriqués par microfluidique (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M). Les lipoplexes ont montré un diamètre moyen d'environ 150 nm et un indice de polydispersité inférieur à 0,2 pour tous les rapports N/P. Le potentiel de surface était négatif (environ -20 mV) en raison des groupements phosphate et carboxylique de l'ARN et de l'HA.
Une étude d’électrophorèse sur gel a été utilisé pour étudier la complexation des ARNsi dans les nanosystèmes HLRC. Pour un rapport N/P de 2 à 8, l'ARNsi a été partiellement complexé avec les nanoparticules. Cette complexation a été renforcée à un rapport N/P de 10 comme démontré par l'absence de signal d'ARN courant sur le gel.
Efficacité de la transfection cellulaire
L'efficacité de la transfection a été étudiée par cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage de myoblastes exprimant la GFP (Figure 14). Des myoblastes ont été transfectés avec l’ADNp pCAGIG en utilisant un agent commercial pour induire l'expression de la GFP afin d'étudier l'effet inhibiteur de la séquence ARNsi complexée avec HLRC sur l'expression de la GFP. Les données ont montré que les cellules transfectées avec pCAGIG exprimaient environ 70 % des cellules GFP+. Le pourcentage de cellules exprimant la GFP était plus faible pour les cellules traitées avec ARNsi-HLRC que pour les cellules transfectées avec ARNsi en utilisant l’agent de transfection commercial Jet-prime, démontrant une plus grande efficacité de la formulation HLRC pour délivrer des ARNsi que l’agent commercial. L'efficacité de transfection de HLRC a montré un profil dose-dépendant, avec moins de 30 % de cellules GFP+ traitées avec la dose la plus élevée de ARNsi complexé avec HLRC. Ainsi, le ARNsi complexé avec HLRC s'est avéré de réduire de moitié le pourcentage de cellules exprimant la GFP.
Viabilité cellulaire
Pour étudier la cytotoxicité induite par les complexes aux différents rapports N/P, un test de viabilité (Live/Dead) a été réalisé. Nos résultats démontrent que les cellules incubées avec toutes les différentes doses de ARNsi-HLRC n'ont montré aucune diminution de la viabilité cellulaire.
Exemple 6 : Liposomes fabriqués par microfluidique comme véhicules pour l’administration intracellulaire simultanée de ARNm et ADNp
Matériels et méthodes
Matériels
Les mêmes matériels qu’aux exemples précédents ont été utilisés ici. L’ARNm-GFP utilisé dans cet exemple a été acheté auprès de Tebubio (Le Perray-en-Yvelines, France) et le plasmide d’ADN mScarlet_pcDNA3.1 codant pour la protéine fluorescentes mScarlet a été obtenu auprès de Genscript.
Complexation de l ’ARNm et de l ’ADNp
Le même protocole que celui décrit à l’exemple 2 a été suivi ici. Les deux différents acides nucléiques ont été complexés à des LRC (DOTAP/DOPE/Coatsome SS-M) en mélangeant les liposomes avec des quantités adéquates d’ARNm et d'ADNp, pour obtenir des lipoplexes à un rapport N/P de 1,5 et 3 et avec un rapport massique ARNnrADNp de 1 :2.
Etudes de transfection in vitro
Les myoblastes C2C12 ont été cultivés comme précédemment décrit dans l’exemple 2.
L'efficacité de transfection a été étudiée par cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage de myoblastes exprimant simultanément la protéine GFP et mScarlet. Des myoblastes ont été ensemencées dans des plaques à fond plat à 12 puits à la densité de 15 000 cellules par puits. Les cellules ont été traités avec des doses de ARNm-ADNp-LRC à un rapport N/P de 1,5 ou 3 et correspondant à 3 pg d’ARNm et 6 pg d’ADNp par puits.
Tous les traitements ont été laissés 2 h puis retirés pour du milieu frais. Après 48 h, les cellules ont été détachées enzymatiquement avec de la Trypsine-EDTA (0,5 %, Gibco) et marquées avec une solution Fixable Live/Dead Violet pour l'évaluation de la viabilité cellulaire. Les données ont été acquises avec un cytomètre en flux BD LSR 2 et les données ont été analysées en utilisant le logiciel FlowJo. L’analyse statistique a été déterminée avec le logiciel GraphPad Prism v8.1.
Résultats
Caractérisation des ARNm-ADNp-LRC
Les ARNm-ADNp-LRC ont été obtenus par complexation de l’ARNm et ADNp avec des liposomes fabriqués par microfluidique. Les lipoplexes ont montré un diamètre moyen d'environ 150 nm et un indice de polydispersité inférieur à 0,2 pour tous les rapports N/P. L’électrophorèse sur gel a également démontré que l’ARNm et l’ADNp étaient efficacement complexés dans le même système au N/P de 1,5 et 3.
Efficacité de la transfection cellulaire
L'efficacité de la transfection a été étudiée par cytométrie en flux pour évaluer le pourcentage total de myoblastes exprimant la GFP, la mScarlet ou les deux protéines fluorescentes simultanément (Figure 15). Les cellules ont montré que bien que les LRC ont été chargés avec deux acides nucléiques, environ 80 % des myoblastes exprimés la GFP induites par l’ARNm tel que dans l’exemple 2. Pour ce qui de l’expression de la mScarlet induite par F ADNp, environ 30 % des myoblastes étaient positifs à la protéine. Plus intéressant encore, environ 30 % des myoblastes exprimés à la fois la GFP et la mScarlet, démontrant l’efficacité de cette formulation pour délivrer différents acides nucléiques simultanément, ouvrant la voie à des applications d’édition génomique telle que CRISPR/Cas9.

Claims

Revendications
1. Nanoparticule comprenant :
(a) au moins un lipide cationique,
(b) au moins un lipide neutre, et
(c) au moins un lipide sensible au pH, différent du lipide cationique (a).
2. Nanoparticule selon la revendication 1, chargée avec un acide nucléique.
3. Nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, recouverte par au moins un polysaccharide anionique, de préférence de l’acide hyaluronique.
4. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 3, dépourvue de cholestérol, voire d’un quelconque stéroïde.
5. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 4, dans laquelle le rapport molaire de lipide cationique par rapport aux autres lipides va de 1 : 1 à 2 : 1.
6. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 5, dans laquelle le lipide cationique est choisi parmi les ammoniums quartenaires tels que le chlorure de 1,2-dioleoyloxypropyl- N,N,N-triméthylammonium (DOTAP), le bromure de l,2-dimyristoyloxypropyl-3- diméthyl-hydroxy éthyl ammonium bromide (DMRIE), le chlorure de N-(2,3- dioleoyloxypropyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA), la diméthyldioctadécylammonium bromide (DD AB), le bromure de l,2-dioleyloxypropyl-3- diméthylhydroxyéthylammonium (DORIE), la N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3- bis(oleoyloxy)propan-l-aminium (DOBAQ), la l,2-dioleoyl-sn-glycero-3- ethylphosphocholine (sel de chlorure) (DOEPC), le chlorure de N-N-dioleoyl-N,N- diméthylammonium (DOD AC), l,2-dioleoyl-3-diméthylammonium-propane (DOD AP), le chlorure de N-methyl-4(dioleyl)methylpyridinium (SAINT-2), seuls ou en mélange; de préférence le lipide cationique étant du DOTAP. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 6, dans laquelle le lipide neutre est choisi parmi le l,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethano lamine (DOPE), le dioleoyl-sn-glycero- 3 -phosphocholine (DOPC), le dipalmitoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine (DPPC) et le N'- (rac-l-[l 1-(F- octyl)undec- 10-enyl]-2-(hexadecyl)glycero-3-phosphoethanoyl)- sperminecarboxamide), seuls ou en mélange ; le lipide neutre étant de préférence du DOPE. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 7, dans laquelle le lipide sensible au pH est au moins un lipide de formule (I) suivante :
RCOO-X-CH H2-S
RCOO-X-CH2CH2-S (i) dans laquelle :
RCOO est un groupement choisi parmi le groupement myristoyle, le groupement a-D- tocophérolsuccinoyle, le groupement linoléyle et le groupement oléoyle ; et
X est choisi parmi les groupements de structures (II), (III) ou (IV) suivantes : Nanoparticule selon la revendication 8, dans laquelle le lipide sensible au pH est au moins un lipide de formule (I), dans laquelle :
RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II) ;
RCOO est un groupement a-D-tocophérolsuccinoyle et X est un groupement de formule (II) ou (III) ;
RCOO est un groupement linoléyle ou oléoyle et X est un groupement de formule (III) ; ou RCOO est un groupement oléoyle et X est un groupement de formule (IV).
10. Nanoparticule selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle le lipide sensible au pH est au moins un lipide de formule (I), dans laquelle RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II) (II).
11. Nanoparticule selon la revendication 10, comprenant
(a) au moins du DOTAP en tant que lipide cationique,
(b) au moins du DOPE en tant que lipide neutre, et
(c) au moins un lipide de formule (I) en tant que lipide sensible au pH, dans laquelle RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II)
(II).
12. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 7, dans laquelle le lipide sensible au pH comprend un groupement amine tertiaire.
13. Nanoparticule selon la revendications 12, dans laquelle le lipide sensible au pH est la l,2-dilinoleyloxy-n,n-dimethyl-3 -aminopropane (DLinDMA), la O-(Z,Z,Z,Z- heptatriaconta-6,9,26,29-tetraen-19-yl)-4-(N,N-dimethylamino) (DLin-MC3-DMA), ou la 2-[2,2-bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienyl]-l,3-dioxolan-4-yl]-N,N- dimethylethanamine (DLin-KC2-DMA), seuls ou en mélange.
14. Nanoparticule selon la revendication 13, comprenant
(a) au moins du DOTAP en tant que lipide cationique,
(b) au moins du DOPE en tant que lipide neutre, et
(c) au moins du DLin-MC3-DMA en tant que lipide sensible au pH.
15. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 14, chargée avec un acide nucléique qui est de l’ARN.
16. Nanoparticule selon la revendication 15, chargée avec un acide nucléique qui est de l’ARNm.
17. Nanoparticule selon la revendication 15, chargée avec un acide nucléique qui est de
TARN interfèrent.
18. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 14, chargée avec un acide nucléique qui est de l’ADN.
19. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 14, chargée avec un mélange d’ARN et d’ADN, de préférence dans un ratio massique ARN:ADN allant de 1 : 1 à 1 : 10, de préférence 1 : 1 à 1 :5, de préférence de 1 : 1 à 1 :3, de préférence encore 1 :2.
20. Nanoparticule selon la revendication 19, chargée avec un mélange d’ADN plasmidique (ADNp) et d’ARNm.
21. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 20, dans laquelle la nanoparticule est chargée avec de l’acide nucléique, de manière à obtenir un ratio N/P allant de 1 à 100, de préférence 1 à 60, de préférence 1 à 50, de préférence de 1 à 30, de préférence encore 1 à 20, de préférence de 1 à 10, de préférence de 1 à 8, de préférence encore 1,5 à 8, de préférence 1 à 5, de préférence encore 1,5 à 4.
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