EP4359799A1 - Sondes à base de composés organiques volatils et leurs utilisations pour le diagnostic et le pronostic de pathologies - Google Patents

Sondes à base de composés organiques volatils et leurs utilisations pour le diagnostic et le pronostic de pathologies

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Publication number
EP4359799A1
EP4359799A1 EP22735872.8A EP22735872A EP4359799A1 EP 4359799 A1 EP4359799 A1 EP 4359799A1 EP 22735872 A EP22735872 A EP 22735872A EP 4359799 A1 EP4359799 A1 EP 4359799A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ethyl
probe
radioactive isotope
pathology
glucuronide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22735872.8A
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German (de)
English (en)
Inventor
Pauline Poinot
Sébastien PAPOT
Justin Lange
Fabiola DJAGO
Estelle BLOCHOUSE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Poitiers
Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Poitiers
Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Poitiers, Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4359799A1 publication Critical patent/EP4359799A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57585—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds identifiable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/94—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase

Definitions

  • the subject of the present invention is probes based on volatile organic compounds, compositions comprising these probes and their uses for the diagnosis and prognosis of pathologies.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing these pathologies by the use of said probes.
  • VOCs volatile organic compounds
  • biosensors for medical or biological purposes have been developed, these being based on detection by fluorescence, electrochemical or luminescence.
  • these biosensors have the disadvantage of containing radioactive elements.
  • the aim of the present invention is to provide a composition comprising enzymo-sensitive probes, programmed to map the specific enzymes of one (several) pathology(ies), to diagnose diseases early and with certainty, after administration of the probes in the subjects to be diagnosed.
  • the present invention also aims to provide a composition for the diagnosis of subjects, making it possible to follow the subjects very regularly during their therapy and thus to help the medical personnel in their decision-making as to the choice of the most effective protocol. .
  • the present invention also aims to provide a diagnostic method that is simple, inexpensive, very sensitive, painless and accessible to a large number of people, in order to be able to improve the treatment of malignant pathologies.
  • the aim of the present invention is to provide a composition for diagnosis which makes it possible to considerably reduce the inter-individual variability encountered with the monitoring of endogenous markers.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising:
  • ethyl ⁇ -D-galactopyranoside or ethyl- ⁇ -O-galactopyranoside probe, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope; for its use as a diagnostic and/or prognostic agent.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising:
  • ethyl ⁇ -D-glucuronide whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl ⁇ -D-glucuronide probe) and at least ethyl ⁇ -D-galactopyranoside (or ethyl probe ⁇ -D-galactopyranoside) whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope;
  • composition (C1) comprising:
  • ethyl ⁇ -D-galactopyranoside or ethyl- ⁇ -O-galactopyranoside probe, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, for its use as a diagnostic and/or prognostic agent.
  • the present invention also relates to a composition (C2) comprising at least ethyl- ⁇ -mannopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl- ⁇ -mannopyranoside probe), for its use as a diagnostic agent and /or prognosis.
  • a composition comprising at least ethyl- ⁇ -mannopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl- ⁇ -mannopyranoside probe), for its use as a diagnostic agent and /or prognosis.
  • compositions or cocktail according to the invention are Composition or cocktail according to the invention.
  • compositions therefore comprises several compounds or probes, intended for use as an agent for the diagnosis or prognosis of a pathology.
  • This composition is also designated below by the term “cocktail” or “cocktail of probes”. This composition is therefore used to diagnose or prognosticate a pathology, as explained below.
  • compositions according to the invention mention may therefore be made, for example, of the aforementioned compositions C1 or C2.
  • the composition used according to the invention comprises, for example, at least two probes, in particular at least three probes, namely the ethyl- ⁇ -D-glucuronide, ethyl-/ ⁇ -acetylglucosamide and ethyl- ⁇ -O-galactopyranoside probes. , each of these probes (or compounds) comprising at least one non-radioactive isotope in the ethyl part.
  • composition C1 used according to the invention, also called “cocktail 1"
  • a composition C1 comprises at least two probes, namely the ethyl ⁇ -D-glucuronide and ethyl ⁇ -D-galactopyranoside probes, each of these probes (or compounds) comprising at least one non-radioactive isotope in the ethyl part.
  • this composition comprises for example the ethyl-/N-acetylglucosamide probe.
  • composition C2 also called “cocktail 2”
  • composition C2 comprises at least the ethyl- ⁇ -mannopyranoside probe, preferably in combination with at least one other probe such as for example the ethyl- ⁇ -D-glucopyranoside probe or the ethyl-1- ⁇ -L-fucopyranoside probe.
  • Ethyl ⁇ -D-glucuronide has the following formula: and targets the enzyme b-glucuronidase.
  • Ethyl-/V-acetylglucosamide has the following formula: and targets the enzyme /V-acetylglucosaminidase.
  • Ethyl ⁇ -D-galactopyranoside has the following formula: and targets the enzyme b-galactosidase.
  • the probes of the composition according to the invention comprise, in their ethyl part, at least one non-radioactive isotope.
  • a non-radioactive isotope mention may be made, for example, of deuterium ( 2 D), carbon-13 ( 13 C) or oxygen-18 ( 18 0).
  • These probes are therefore compounds derived from compounds corresponding to the aforementioned formulas, in which at least one hydrogen and/or carbon and/or oxygen atom of their ethyl parts are replaced by an isotope.
  • the ethyl part of the probes used according to the invention is therefore marked with one or more non-radioactive isotopes on one or more positions ( 2 D, 13 C or 18 0).
  • the ethyl-D-glucuronide is the probe with the following formula (1): this probe targeting the enzyme b-glucuronidase.
  • the ethyl-/V-acetylglucosamide whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope present in the composition according to the invention is the probe 13 CD 5 -ethyl-/V-acetylglucosamide, corresponding to the following formula (2): this probe targeting the enzyme N-acetyl-glucosaminidase.
  • the ethyl ⁇ -D-galactopyranoside whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope present in the composition according to the invention is the D2-ethyl ⁇ -D-galactopyranoside probe, corresponding to the formula ( 3) next: this probe targeting the enzyme b-galactosidase.
  • Ethyl-1-aL-fucopyranoside has the following formula: and targets the enzyme aL-fucosidase.
  • Ethyl-glucopyranoside has the following formula: and targets the enzyme a- or b-glucosidase.
  • Ethyl-mannopyranoside has the following formula: and targets the enzyme a- or b-mannosidase.
  • Ethyl-aD-glucopyranoside has the following formula: and targets the enzyme a-glucosidase.
  • Ethyl-a-mannopyranoside has the following formula: and targets the enzyme a-mannosidase.
  • the ethyl-1-aL-fucopyranoside whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope present in the composition according to the invention is the probe D 4 -ethyl-1-aL-fucopyranoside, corresponding to the following formula (4): this probe targeting the enzyme aL-fucosidase.
  • the ethyl-glucopyranoside whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope present in the composition according to the invention is the D4-ethyl-glucopyranoside probe, corresponding to the following formula (5):
  • the ethyl-mannopyranoside whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope present in the composition according to the invention is the probe D 5 -ethyl-mannopyranoside, corresponding to the following formula (6):
  • All probes can be randomly synthesized with ethanol isotopes: ethanol-D2, ethanol-D3, ethanol-D4, ethanol-D5, ethanol-13C-D5, ethanol-13C2-D5, ethanol-13C or ethanol-13C2.
  • the present invention breaking with the conventional search for endogenous COVs, is based on the ex vivo use of multimodal probes, including in their structure a COV labeled with one (or more) stable isotope(s). These crossed probes are selectively hydrolyzed in damaged tissues via the activity of enzymes specific to these media. The COVs thus released in turn become exogenous markers characteristic of the metabolism of the injured tissue and are detected ex vivo in a biological sample according to an established and detailed protocol, as explained below.
  • a first proof of concept targeting b-glucuronidase, an enzymatic tumor marker showed the relevance of using a deuterium-labeled ethanol probe to detect different types of solid tumors in vivo and monitor their evolution over a period of time. chemotherapy. Nevertheless, in a clinical research context, targeting a single enzyme can lead to a large number of false positives and false negatives.
  • the present invention is therefore based on the use of a cocktail of crossed probes, each targeting a specific enzymatic marker of one or more pathologies, in order to reduce the risk of erroneous diagnosis and to predict the effectiveness of associated therapies.
  • this strategy provides information on the nature of the pathology (eg solid tumor, inflammatory syndrome, bacterial infection, viral infection), its location, its aggressiveness, its stage of development and its response to treatment.
  • COV probes targeting enzymes of the glycosidase type are therefore used. These enzymes are over-expressed in damaged tissues (eg tumor or infectious microenvironment), but are not, or very little, expressed/secreted by healthy cells.
  • these probes release a molecule of labeled ethanol.
  • VOC-based probes according to the invention offer a sensitivity hitherto never achieved.
  • the first results obtained with the probe targeting b-glucuronidase show that this enzyme can be detected in plasma at concentrations below 5.10 13 M.
  • a recently developed fluorescence biosensor presented an LOD of 5.10 9 M for this same enzyme.
  • the aforementioned composition in particular composition C1 or “cocktail 1”, further comprises at least one other labeled compound chosen from the group consisting of: ethyl-1- ⁇ -L-fucopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, ethyl-D-glucopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, ethyl-mannopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, and mixtures thereof.
  • the aforementioned composition, in particular composition C1 or “cocktail 1” also comprises ethyl-N-acetylglucosamide.
  • the composition of the invention comprises at least the aforementioned probes (1), (2) and (3), in combination with at least one of the probes (4), (5) and/or (6 ) as defined above.
  • the composition of the invention C1 comprises at least the aforementioned probes (1) and (3), in combination with at least one of the probes (2), (4), (5) and/or ( 6) as defined above.
  • the composition of the invention C2 comprises at least the aforementioned probe (6), in combination with at least one of the probes (4) and/or (5) as defined above.
  • composition C1 comprises at least ethyl-b-D-glucuronide, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, ethyl-/V-acetylglucosamide, the ethyl part of which comprises at least one isotope non-radioactive, ethyl ⁇ -D-galactopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope and ethyl-1- ⁇ -L-fucopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope.
  • This cocktail according to the invention C1-1 thus preferably comprises ethyl-D-glucuronide targeting b-glucuronidase, ethyl-N-acetylglucosamide targeting N-acetyl-glucosaminidase, ethyl b-D- galactopyranoside targeting b-galactosidase and ethyl-1-a-L-fucopyranoside targeting a-L-fucosidase, each of these probes being modified as explained above, by the presence of at least one non-radioactive isotope in their ethyl parts.
  • composition C1 comprises at least ethyl-b-D-glucuronide, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, ethyl-D-galactopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one isotope non-radioactive and ethyl-a-D-glucopyranoside whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope
  • This cocktail according to the invention C1-2 thus preferably comprises ethyl ⁇ -D-glucuronide targeting b-glucuronidase, ethyl bD-galactopyranoside targeting b-galactosidase and ethyl ⁇ -D-glucopyranoside targeting ⁇ -glucosidase, each of these probes being modified as explained above, by the presence of at least one non-radioactive isotope in their ethyl parts.
  • composition C2 comprises at least ethyl- ⁇ -D-glucopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope and ethyl- ⁇ -mannopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope. radioactive.
  • This cocktail according to the invention C2-1 thus preferably comprises ethyl- ⁇ -D-glucopyranoside targeting ⁇ -glucosidase and ethyl- ⁇ -mannopyranoside targeting ⁇ -mannosidase, each of these probes being modified as explained above high, by the presence of at least one non-radioactive isotope in their ethyl parts.
  • composition C2 comprises at least ethyl-1-a-L-fucopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope and ethyl-a-mannopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope.
  • This cocktail according to the invention C2-2 thus preferably comprises ethyl-1-a-L-fucopyranoside targeting a-L-fucosidase and ethyl-a-mannopyranoside targeting a-mannosidase, each of these probes being modified as explained above, by the presence of at least one non-radioactive isotope in their ethyl parts.
  • the composition comprises at least ethyl-b-D-glucuronide, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, ethyl-/V-acetylglucosamide, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, ethyl-1-D-galactopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, ethyl-1- ⁇ -L-fucopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope, ethyl-glucopyranoside whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope and ethyl-mannopyranoside whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope.
  • the cocktail according to the invention thus preferably comprises ethyl-D-glucuronide targeting b-glucuronidase, ethyl-N-acetylglucosamide targeting N-acetyl-glucosaminidase, ethyl bD-galactopyranoside targeting b-galactosidase, ethyl-1-aL-fucopyranoside targeting a-L-fucosidase, ethyl-glucopyranoside targeting a-glucosidase or b-glucosidase and ethyl-mannopyranoside targeting a-mannosidase or b-mannosidase, each of these probes being modified as explained above, by the presence of at least one non-radioactive isotope in their ethyl parts.
  • the composition according to the invention comprises the aforementioned probes corresponding to formulas (1), (2), (3), (4), (5)
  • compositions or cocktail according to the invention also relates to the use of the composition as defined above, namely a composition comprising:
  • a pathology chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections.
  • the present invention also relates to the use of the composition as defined above, namely a composition comprising:
  • ethyl ⁇ -D-glucuronide whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl ⁇ -D-glucuronide probe) and at least ethyl ⁇ -D-galactopyranoside (or ethyl probe ⁇ -D-galactopyranoside) whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope;
  • a pathology chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections.
  • the present invention also relates to the use of the composition as defined above, namely a composition C1 or C2, as an ex vivo diagnostic and/or prognostic agent for a pathology chosen from the group consisting of pathologies involving a reaction inflammation in response to injury or infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections.
  • a composition C1 or C2 as an ex vivo diagnostic and/or prognostic agent for a pathology chosen from the group consisting of pathologies involving a reaction inflammation in response to injury or infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections.
  • the compositions according to the invention and as defined above, in particular the compositions C1 or C2, and comprising the aforementioned probes, are used for the diagnosis and/or the prognosis ex vivo of subjects (humans or animals ).
  • compositions can be intended in particular for the stratification of subjects or patients, according to the progress, the severity and the evolution of the pathology, but also for the diagnosis, possibly early, of a pathology, for example within the framework of a screening campaign for a given population of subjects or patients.
  • the composition used as ex vivo diagnostic and/or prognostic agent for the aforementioned pathology is as defined above, and comprises in particular the probes (1), (2) and (3).
  • composition used as ex vivo diagnostic and/or prognostic agent for the aforementioned pathology is composition C1 or C2.
  • the composition used as ex vivo diagnostic and/or prognostic agent for the aforementioned pathology comprises the aforementioned probes (1), (2), (3), (4), (5) and (6) .
  • the pathologies which can be diagnosed and/or predicted by the cocktail of probes according to the invention are pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the organism, chronic inflammatory diseases and acute infections.
  • pathologies mention may be made in particular of inflammatory diseases, bacterial infections or even autoimmune diseases.
  • pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or infection of the body refers in particular to cancers, ARDS and pulmonary fibrosis, or even Parkinson's disease.
  • chronic inflammatory diseases refers in particular to Crohn's disease, eczema, as well as autoimmune diseases such as type 1 diabetes, vitiligo, multiple sclerosis or rheumatoid arthritis.
  • acute infections refers in particular to viral infections (respiratory syncytial virus, SARS-COV, HIV, herpes simplex virus and all emerging viruses) and bacteria (Escherichia Coli, Staphylococcus, Pseudomonas, Propionibacterium acnes).
  • Inflammatory disease also called inflammatory disease, can be any disease resulting from an abnormal reaction of the immune system.
  • the inflammatory disease can be an autoinflammatory disease, an autoimmune disease or an inflammatory condition of undetermined origin.
  • Inflammatory pathologies are defined by tissue aggression due to a dysregulation of the immune system. Also, among the latter, we can mention atherosclerosis, rheumatoid arthritis, lung inflammation, chronic inflammatory bowel disease, sepsis, severe sepsis, septic shock or cancer.
  • the inflammatory disease is thus preferably selected from the group consisting of atherosclerosis, rheumatoid arthritis, lung inflammation, inflammatory bowel disease, sepsis, severe sepsis, septic shock, cancer and combinations thereof.
  • Atherosclerosis also called arteriosclerosis
  • arteriosclerosis is a disease affecting the arteries and characterized by the appearance of atherosclerotic plaques on the inner wall of the arteries.
  • Rheumatoid arthritis is a systemic connective tissue disease characterized by chronic joint inflammation that progresses in flare-ups.
  • Lung inflammation includes but is not limited to inflammatory lung disease and/or lung allergy.
  • Inflammatory lung disease includes, but is not limited to, Acute Lung Ingury or ALI, also known as moderate ARDS, Acute Respiratory Distress Syndrome or ARDS, acute lung injury resulting a transfusion (“Transfusion Related Acute Lung Injury” or TRALI).
  • Acute Lung Ingury or ALI also known as moderate ARDS, Acute Respiratory Distress Syndrome or ARDS, acute lung injury resulting a transfusion
  • TRALI Transfusion Related Acute Lung Injury
  • Lung allergy also called respiratory allergy
  • respiratory allergy is a disease alternating between an acute phase (also called an asthma attack) and a chronic phase.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • An excessive inflammatory reaction in response to an infection, causes sepsis and its most severe forms, severe sepsis and septic shock.
  • the cancerous cell will cause inflammation and invade neighboring cells to create an environment conducive to the growth of nearby cells. This is how, little by little, the cancerous tumor is born. Concretely, the cancer cell uses inflammation to progress.
  • the aforementioned pathology is selected from the group consisting of cancers, bacterial and viral infections, nosocomial infections, autoimmune diseases, respiratory inflammations, chronic inflammations, neurodegenerative diseases and chronic disorders related at the age.
  • solid cancerous tumors such as for example lung cancers (lungs, bronchi and nasopharynx), gynecological (breast, ovary, uterus) and gastrointestinal (liver, intestine , colon, pancreas).
  • the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, uterine cancer, nasopharyngeal cancer, bowel cancer, colon cancer, bladder and brain cancer.
  • infections due for example to Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Listeria monocytogenes, Chlamydia, Treponema pallidum, SARS-COV, HIV, syncytial virus, herpes simplex virus and all emerging viruses.
  • nosocomial infections include infections due to Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Propionibacterium acnes.
  • autoimmune diseases include type 1 diabetes, vitiligo, multiple sclerosis or rheumatoid arthritis.
  • respiratory inflammation examples include pulmonary fibrosis, and in particular acute hypoxemic respiratory failure or acute respiratory distress syndrome (ARDS or ARDS).
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • Chronic inflammation examples include Crohn's disease.
  • neurodegenerative diseases mention may be made, for example, of Alzheimer's disease or Parkinson's disease.
  • Examples of chronic age-related disorders include type 2 diabetes, osteoarthritis and osteoporosis.
  • the present invention also relates to the aforementioned composition, in particular comprising the probes (1), (2) and (3), or the composition C1 or C2, for its use as a diagnostic and/or prognostic agent for cancers.
  • the present invention also relates to a composition as defined above comprising the probes (1), (2), (3) and (4), for its use as a diagnostic and/or prognostic agent for cancers.
  • the present invention also relates to a composition as defined above comprising the probes (1), (2), (3), (4) and (6), for its use as a diagnostic and/or prognostic agent for cancers .
  • the present invention also relates to a composition C1 or C2 as defined above, for its use as a diagnostic and/or prognostic agent for cancers.
  • the present invention also relates to a composition as defined above comprising the probes (1), (2), (3) and (5), for its use as a diagnostic and/or prognostic agent for viral and bacterial infections. and chronic inflammatory diseases such as osteoarthritis or diabetes.
  • the present invention also relates to a composition C1 or C2 as defined above, for its use as an agent for the diagnosis and/or prognosis of viral and bacterial infections and of chronic inflammatory diseases such as osteoarthritis or diabetes.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing a pathology in a subject, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding, to a biological sample of said subject, a composition comprising:
  • step b) at least ethyl ⁇ -D-galactopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope; b) measuring the quantity of labeled ethanol, released in the gaseous phase, c) comparing the values obtained in step b) with a corresponding standard control value, and d) deducing therefrom whether the subject is suffering from said pathology.
  • the aforementioned diagnostic method is preferably an ex vivo method.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing a pathology in a subject, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding, to a biological sample of said subject, a composition comprising:
  • ethyl ⁇ -D-glucuronide whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl ⁇ -D-glucuronide probe) and at least ethyl ⁇ -D-galactopyranoside (or ethyl probe -b-O-galactopyranoside) whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope;
  • step b) either at least ethyl-a-mannopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl-a-mannopyranoside probe); b) measuring the quantity of labeled ethanol, released in the gaseous phase, c) comparing the values obtained in step b) with a corresponding standard control value, and d) deducing therefrom whether the subject is suffering from said pathology.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing a pathology in a subject, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding, to a biological sample from said subject, a composition C1 or C2 as defined above; b) measuring the quantity of labeled ethanol released in the gaseous phase, c) comparing the values obtained in step b) with a corresponding standard control value, and d) deducing therefrom whether the subject is suffering from said pathology.
  • steps a) to d) can be carried out for two identical samples of the same subject in parallel with a composition C1 on one side and a composition C2 on the other.
  • the aforementioned diagnostic method comprises the implementation of the aforementioned composition, in particular comprising the probes (1), (2) and (3), for the diagnosis of cancers.
  • the aforementioned diagnostic method comprises the implementation of the aforementioned composition comprising the probes (1), (2), (3) and (4), for the diagnosis of cancers.
  • the aforementioned diagnostic method comprises the implementation of the aforementioned composition comprising the probes (1), (2), (3), (4) and (6), for the diagnosis of cancers.
  • the aforementioned diagnostic method comprises the implementation of the aforementioned composition C1 or C2, for the diagnosis of cancers.
  • the aforementioned diagnostic method comprises the implementation of the aforementioned composition comprising the probes (1), (2), (3) and (5), for the diagnosis of viral and bacterial infections and of chronic inflammatory diseases such as osteoarthritis or diabetes.
  • the aforementioned diagnostic method comprises the implementation of the aforementioned composition C1 or C2, for the diagnosis of viral and bacterial infections and of chronic inflammatory diseases such as osteoarthritis or diabetes.
  • the subject is a human or an animal.
  • the subject is preferably a mammal, for example a human subject or a non-human mammal, such as a cat, dog, monkey, rabbit, mouse or rat.
  • the human subject can be male or female of any age, such as an infant, child, adolescent, adult, or elderly person.
  • the subject is preferably a subject suffering or at risk of suffering from a pathology as defined above, in particular from an inflammatory disease.
  • a subject at risk of suffering from an inflammatory disease is for example a subject having a family history of inflammatory disease, having already suffered from at least one inflammatory disease, having genetic, metabolic and/or risk factors linked to the mode of life and/or presenting at least one symptom that may be a precursor to an inflammatory disease.
  • the biological sample is preferably obtained from a subject as defined above.
  • the biological sample is preferably chosen from the group consisting of samples of plasma, blood, tissues, saliva, urine, cerebrospinal fluid and biopsies of said subject.
  • Step a) consists in bringing together a biological sample obtained from a subject with the composition according to the invention, in particular the cocktail of probes as defined above. This bringing together is carried out by adding the composition of the invention (or cocktail of probes) to said biological sample, by any means well known to those skilled in the art.
  • the composition is added to a container containing said sample, for example plasma or blood sample.
  • composition of the invention to a biological sample can be carried out directly in the biological sample or after treatment of the biological sample.
  • the biological sample preferably with a volume of 1 mL for fluids and several hundred grams for tissues, is maintained, after the addition of said composition, at -20° C. until to the analysis corresponding to measurement step b) of the aforementioned method. It should not be thawed before analysis.
  • the biological sample obtained from the subject is also supplemented with a buffer solution such as for example an acetate buffer (in particular pH 5.5, 0.1 mol/L, containing a mixture of sodium acetate and acid acetic acid), used to detect solid tumor marker enzymes in biological samples.
  • a buffer solution such as for example an acetate buffer (in particular pH 5.5, 0.1 mol/L, containing a mixture of sodium acetate and acid acetic acid), used to detect solid tumor marker enzymes in biological samples.
  • the biological sample obtained from the subject is also supplemented with a protease inhibitor (for example Completed mini EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roche).
  • a protease inhibitor for example Completed mini EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roche.
  • protease inhibitor prepared with UP water at 7X concentration, is used at 1X final concentration.
  • this step a) can be preceded by a step for processing the biological sample.
  • treatment of the biological sample is meant here at least one treatment step, for example selected from the group consisting of centrifugation, a cycle of freezing then thawing and suspension in a buffer.
  • the composition of the invention comprises is prepared by adding the aforementioned probes to a buffer solution, in particular as defined above, preferably at a concentration of between 10 -3 mol/L and 10 -7 mol /L.
  • the probes are added with a volume between 10 pL and 200 mI_ to obtain a total volume of sample between 25 mI_ and 300 mI_ (total volume including from 10 pL to 250 pL of buffer, from 10 pL to 250 pL of biological fluid or 5 mg to 5000 mg of tissue, and 1 pL to 35 pL of 1X protease inhibitor).
  • the sample as a whole (that is to say including the biological sample, the probes and possibly the buffer solution and the protease inhibitor) is inserted into a hermetically sealed vial made of inert material , such as a 2 ml_ vial with hermetic cap with insert.
  • a hermetically sealed vial made of inert material such as a 2 ml_ vial with hermetic cap with insert.
  • the probes (1 -4) are prepared beforehand in the aforementioned buffer at a concentration of 5.10 5 mol/L, and added with a volume of 10 pL to obtain a total volume of sample of 100 pL (total volume including 62 pL of buffer, 25 pL of biological fluid and 3 pL of protease inhibitor).
  • the sample as a whole is for example inserted into a 2 mL vial with a hermetic stopper with insert.
  • Step b) consists in measuring the quantity of labeled ethanol released in the gaseous phase.
  • the labeled ethanol is the ethanol released from the aforementioned probes and therefore containing the labeled ethyl moiety as defined above.
  • this measurement step is carried out on at least three kinetic points between 0 and 8 hours after step a) corresponding to the addition of the composition of the invention.
  • a kinetic point corresponds to a measurement carried out at a time t for the same sample prepared under identical conditions.
  • three identical biological samples are prepared as explained above, to which is added, under identical conditions, the cocktail of probes according to the invention as defined above, and the step of measurement b) according to the invention at three distinct instants, t1, t2 and t3 spaced out in time.
  • a measurement is taken 2 hours after step a), another measurement is taken 4 hours after step a) and a final measurement is taken 7 hours after step a).
  • These kinetic points are obtained by carrying out the measurements in 3 separate bottles containing the same biological sample and the same composition according to the invention. These kinetic points, carried out at least in duplicate, then make it possible to obtain an enzymatic curve useful for the conclusion stage concerning the diagnosis, as explained below.
  • the probes After bringing together the probes whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope with the biological sample, if this biological sample contains at least one of the enzymes targeted by said probes, the probes will then be cut by the enzymes by hydrolysis, this which will release the -O-Et part of said probes as explained above and therefore will lead to the release in the gas phase of ethanol comprising at least one non-radioactive isotope.
  • the aforementioned probe (1) allows the release of labeled ethanol in the CD3-CD2-OH form
  • the aforementioned probe (2) allows the release of labeled ethanol in the CD 3 - 13 CD 2 -OH form
  • the aforementioned probe (3) allows the release of labeled ethanol in the CH3-CD2-OH form
  • the aforementioned probe (4) allows the release of labeled ethanol in the CD3-CHD-OH form
  • the aforementioned probe (5) allows the release of labeled ethanol in the CD3-CD2-OH form
  • the aforementioned probe (6) allows the release of labeled ethanol in the 13 CD3-13 CD2-OH form.
  • the probes of the composition of the invention are selectively hydrolyzed in the damaged tissues via the activity of enzymes specific to these media.
  • the labeled ethanol thus released becomes an exogenous marker characteristic of the metabolism of the damaged tissue and is detected ex vivo in the biological sample. If the biological sample is that of a healthy subject, this sample not containing the targeted enzymes, the probes of the composition will therefore not be hydrolyzed and therefore no release of labeled ethanol will be obtained and therefore cannot be measured.
  • the biological sample is in a container or container such as a bottle or vial, and, as part of step a), the composition is added to said container or container, then said container or container is hermetically sealed.
  • the container or receptacle is agitated, for example with a vortex, before the implementation of step b) for measuring the quantity of ethanol released in the gaseous phase.
  • step b) comprises a measurement by gas chromatography (GC) coupled to a triple quadrupole equipped with an El source (GC-TQMS), or gas chromatography coupled to a mass spectrometer high resolution (GC-QTOFMS), or an artificial nose.
  • GC gas chromatography
  • GC-TQMS gas chromatography coupled to a triple quadrupole equipped with an El source
  • GC-QTOFMS mass spectrometer high resolution
  • step b) of measuring the quantity of labeled ethanol released the values thus obtained are compared with a corresponding standard control value.
  • step c) the results obtained in step b) are compared with a corresponding standard control value.
  • step b) are the quantity, concentration and/or proportion of labeled ethanol released into the gaseous phase, after addition of the composition of the invention to the biological sample.
  • corresponding in the expression "corresponding standard control value” means that the quantity, concentration and/or proportion measured in the biological sample for the labeled ethanol is compared with a standard control value of the quantity, concentration and/or proportion of ethanol.
  • the standard control value is a quantity.
  • the standard control value is a concentration.
  • the standard control value is a proportion.
  • a standard control value can for example be the average, the maximum threshold value and/or the minimum threshold value of the quantity, concentration or proportion of ethanol measured in a sample originating from a healthy subject. (after implementing steps a) and b) above), or even the average, the maximum threshold value and/or the minimum threshold value of the quantity, concentration or proportion of ethanol measured in a blank sample, it is ie in a sample in which the composition of the invention has been added but which does not contain the target enzymes.
  • the values measured in samples from healthy subjects or in blank samples are carried out using a measurement method similar to that used for the biological sample.
  • CV coefficient of variation
  • the minimum threshold value and the maximum threshold value define a reference interval.
  • the reference interval is usually defined to include 95% of the values obtained in the reference population.
  • healthy subjects or individuals we mean subjects or individuals having a good general state of health, in particular not suffering from the pathologies as defined above.
  • the standard ethanol control value may be the average, the maximum threshold value and/or the minimum threshold value of the quantity, concentration or proportion of ethanol measured in the samples originating from healthy individuals, the samples having been supplemented with the composition or cocktail of probes according to the invention.
  • a standard control value can for example correspond to the average of the values obtained in the samples originating from 10 healthy subjects. A subject will then be considered healthy when the ethanol value measured as explained above is within the standard deviation from the mean of the values for healthy subjects over all the kinetic points as explained below. above.
  • step d it is deduced whether or not the subject has the aforementioned pathology.
  • the quantity, concentration and/or proportion of the quantity of labeled ethanol measured is greater than a corresponding standard control value (in particular the maximum threshold value or a fixed value), the presence of at least one enzyme targeted by the probes defined above, and therefore that the subject is suffering from a pathology as defined above.
  • a corresponding standard control value in particular the maximum threshold value or a fixed value
  • the standard deviation of the values for the sick subjects must not overlap with the standard deviation of the values for the healthy subjects on at least one of the kinetic points (as explained above) to consider the targeted enzyme as a marker of pathology.
  • a subject is then considered to be sick when his measured ethanol value is within the standard deviation from the mean of the values measured for the sick subjects on at least one of the kinetic points. This value must be at least 1.3 times higher than the mean of the values measured for healthy subjects on at least one of the kinetic points.
  • an additional step can be implemented consisting of a step of treating said subject, by for example by the administration to said subject of a pharmaceutically acceptable quantity of a compound or of a composition intended for the treatment of said pathology.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing a pathology in a subject, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding, to a blood sample of said subject, a composition comprising: - or at least ethyl ⁇ -D-glucuronide whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl ⁇ -D-glucuronide probe) and at least ethyl ⁇ -D-galactopyranoside (or ethyl probe -bO- galactopyranoside) whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope;
  • step b) either at least ethyl-a-mannopyranoside, the ethyl part of which comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl-a-mannopyranoside probe); b) measuring the quantity of labeled ethanol, released in the gaseous phase, c) comparing the values obtained in step b) with a corresponding standard control value, and d) deducing therefrom whether the subject is suffering from said pathology.
  • step a) consists in adding, to a blood sample from the subject, a composition C1-2 or C2-2.
  • step a) consists in adding, in a first blood sample from the subject, a composition C1-2 and, in a second blood sample from the same subject, a composition C2-2.
  • the present invention also relates to a method for monitoring the effectiveness of a curative or preventive treatment of a pathology in a subject, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection. body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding a composition comprising:
  • step b) measuring the quantity of labeled ethanol, released in the gaseous phase, c) comparing the values obtained in step b) with a corresponding standard control value and/or with a corresponding value obtained before the start of the processing or at a time t' during the processing which is prior to the time t, d) deducing therefrom whether the treatment is effective, and e) optionally, repeating steps a) to d).
  • the present invention also relates to a method for monitoring the effectiveness of a curative or preventive treatment of a pathology in a subject, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection. body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding a composition comprising:
  • ethyl ⁇ -D-glucuronide whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl ⁇ -D-glucuronide probe) and at least ethyl ⁇ -D-galactopyranoside (or ethyl probe -b-O-galactopyranoside) whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope;
  • the pathology is in particular as defined above in the “pathologies” section.
  • the pathology is an inflammatory disease, and preferably a cancer.
  • the biological sample is a sample originating from a subject, in particular as defined above in the “biological sample” section.
  • the biological sample is a blood, plasma or biopsy sample.
  • the subject is in particular as defined above in the "subject” section.
  • the curative or preventive treatment may comprise a curative or preventive treatment of the aforementioned pathology and/or a curative or preventive treatment of an inflammation as defined above.
  • the curative or preventive treatment of a pathology involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the organism, of a chronic inflammatory disease or of an acute infection is for example a curative or preventive treatment well known to the patient. skilled in the art for these pathologies.
  • the curative or preventive treatment of the pathology may, for example, include the surgical removal of the malignant tissue, the administration of chemotherapy, an immunomodulator, a triple therapy, an appropriate antibiotic treatment, or even assistance respiratory.
  • steps a) and b) are generally as defined for steps a) and b) defined in the “diagnostic method” section.
  • step b) comprises measuring the quantity, concentration and/or proportion of labeled ethanol in a biological sample of said subject at a time t during of the treatment.
  • the measurement is performed in a biological sample taken from a sample taken at time t.
  • step c) the results obtained in step b) are compared with a corresponding standard control value and/or with a corresponding value obtained before the start of said processing or at a time during processing t' which is prior at time t.
  • Corresponding value obtained before the start of said treatment means the quantity, concentration and/or proportion of corresponding labeled ethanol measured in a biological sample from said subject, said sample having been taken before the start of treatment.
  • corresponding value obtained at a time during the treatment which is prior to time t is meant the corresponding quantity, concentration and/or proportion of labeled ethanol measured in a biological sample of said subject, said sample having been taken after the start of treatment, but before time t.
  • step d) it is deduced therefrom whether the treatment is effective.
  • the treatment is for example effective if the quantity of labeled ethanol measured decreases or disappears.
  • the treatment is effective if its quantity, concentration and/or proportion measured at time t is lower than a corresponding value obtained before the start of said treatment or at time t' during the treatment which is prior to the moment t.
  • the treatment is not effective if the quantity, concentration and/or proportion of labeled ethanol measured at time t is greater than a corresponding value obtained before the start of said treatment or at time t' during the processing which is prior to time t.
  • the method may include giving a new or complementary treatment.
  • the method may comprise a step e) in which steps a) to d) are repeated, in particular whether the treatment is effective or not.
  • Steps a) to d) can be repeated once, twice, three times or at least three times.
  • Steps a) to d) can for example be repeated until the subject recovers or the pathology stabilizes.
  • the period between two repetitions can for example be at least one week, at least two weeks, at least three weeks, at least four weeks, at least two months, at least three months, at least four months, at least five months , six months or at least six months, for example one year.
  • the method for monitoring the effectiveness of a curative or preventive treatment can be implemented each time a new treatment or an additional treatment is initiated.
  • a subject is considered to be cured when the ethanol value measured according to step b) is within the standard deviation relative to the mean of healthy subjects over all the kinetic points (as explained above in the paragraph concerning the method of diagnosis).
  • the present invention also relates to a method for monitoring the development of a pathology in a subject, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding, to a biological sample of said subject, at a time t1, a composition comprising:
  • step b) measuring the quantity of labeled ethanol, released in the gaseous phase, for the sample at time t1, c) adding, in a biological sample of said subject, at a time t2 separated in time with respect to time t1, the composition as defined in step a), d) measuring the quantity of labeled ethanol, released in the gas phase, for the sample at time t2, e) comparing the values obtained in steps b) and d) at times t1 and t2 respectively, f) deducing whether the pathology is progressing favourably, and g) optionally, repeating steps a) to f).
  • the present invention also relates to a method for monitoring the development of a pathology in a subject, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, diseases chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding, to a biological sample from said subject, at a time t1, a composition comprising:
  • the pathology is in particular as defined above in the “pathologies” section.
  • the pathology is an inflammatory disease, and preferably a cancer.
  • the biological sample is a sample from a subject, in particular as defined above in the “biological sample” section.
  • the biological sample is a blood, plasma or biopsy sample.
  • the subject is in particular as defined above in the "subject" section.
  • steps a) to d) are generally as defined for steps a) and b) defined in the “diagnostic method” section.
  • steps b) and d) consist in measuring the quantity, concentration and/or proportion of labeled ethanol in a biological sample from the subject at two times t1 and t2 separated in time.
  • the measurement is performed in a biological sample from a sample taken at time t1, as well as in a biological sample from a sample taken at time t2, time t1 being earlier at time t2.
  • the time interval between t1 and t2 is for example at least one week, at least two weeks, at least three weeks, at least four weeks, at least two months, at least three months, at least four months, at least least five months, six months or at least six months, for example one year.
  • step e) the results obtained at step a), at time t1 and at time t2 are compared with each other.
  • step f it is deduced whether the pathology is progressing favorably.
  • the pathology evolves favorably, for example if the quantity of ethanol released decreases between time t1 and t2.
  • the pathology does not evolve favorably, for example if the quantity of ethanol released is equal or increases between time t1 and t2.
  • the evolution of the disease is considered to be very favorable when the ethanol value measured for the sample is within the standard deviation compared to the mean of the values for the healthy subjects on all the kinetic points (as explained above in the paragraph concerning the diagnostic method).
  • the evolution of the disease is considered to be very unfavorable when the ethanol value measured for the sample is within the standard deviation or greater than the standard deviation in relation to the mean of the values of the sick subjects over at least one of the kinetic points (as explained above in the paragraph concerning the diagnostic method). This value is at least 1.3 times higher than the average for healthy subjects on at least one of the kinetic points.
  • the method may comprise a step g) in which steps a) to f are repeated, in particular whether the pathology progresses favorably or not.
  • Steps a) to f) can be repeated once, twice, three times or at least three times.
  • Steps a) to f) can for example be repeated until the subject recovers or the pathology stabilizes.
  • Steps a) to d) can be repeated at regular time intervals or not.
  • the period between two repetitions can for example be at least one week, at least two weeks, at least three weeks, at least four weeks, at least two months, at least three months, at least four months, at least five months , six months or at least six months, for example one year.
  • the present invention also relates to a method for stratifying a subject suffering from a pathology into a category C-1 of subjects suffering from said pathology at a degree of severity or into a category C-2 of subjects suffering from said pathology at a another degree of severity, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding, in a biological sample of said subject, a composition comprising:
  • the present invention also relates to a method for stratifying a subject suffering from a pathology into a category C-1 of subjects suffering from said pathology at a degree of severity or into a category C-2 of subjects suffering from said pathology at a another degree of severity, said pathology being chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said method comprising the following steps: a) adding, to a biological sample of said subject, a composition comprising:
  • ethyl ⁇ -D-glucuronide whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl ⁇ -D-glucuronide probe) and at least ethyl ⁇ -D-galactopyranoside (or ethyl probe -b-O-galactopyranoside) whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope;
  • the pathology is in particular as defined above in the “pathologies” section.
  • the pathology is an inflammatory disease, and preferably a cancer.
  • the biological sample is a sample from a subject, in particular as defined above in the “biological sample” section.
  • the biological sample is a blood, plasma or biopsy sample.
  • the subject is in particular as defined above in the "subject" section.
  • steps a) to c) are generally as defined for steps a) and b) defined in the “diagnostic method” section.
  • the present invention also relates to a kit for the diagnosis of a pathology chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said kit comprising a composition comprising:
  • the present invention also relates to a kit for the diagnosis of a pathology chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said kit comprising a composition comprising:
  • ethyl ⁇ -D-glucuronide whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope (or ethyl ⁇ -D-glucuronide probe) and at least ethyl ⁇ -D-galactopyranoside (or ethyl probe -bO- galactopyranoside) whose ethyl part comprises at least one non-radioactive isotope;
  • the present invention also relates to a kit for the diagnosis of a pathology chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections, said kit comprising a composition C1 or C2 as defined above.
  • the present invention also relates to the use of the aforementioned kit for the diagnosis of a pathology chosen from the group consisting of pathologies involving an inflammatory reaction in response to a lesion or an infection of the body, chronic inflammatory diseases and acute infections. .
  • FIG. 1 represents the calibration line for the detection of b-glucuronidase in the presence of the D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide probe and performances of the analytical method GC-MSMS (LOD, LOQ and R 2 ).
  • FIG. 2 represents the calibration line for the detection of b-glucuronidase in the presence of para-nitrophenol glucuronide and performances of the UV detection method (LOD, LOQ and R 2 ).
  • FIG. 3 represents the kinetics of detection of ethanol-D 5 released into the headspace of the plasmas of patients after addition of the D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide probe.
  • FIG. 4 represents the kinetics of detection of ethanol-D 5 released into the headspace of plasmas of patients having tumors of different sizes after addition of the D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide probe.
  • FIG. 5 represents the detection of ethanol-D 5 in the headspace of murine tissue samples as a function of the concentration of Ds-ethyl-b-D-glucuronide probe added (10 ⁇ 9 M).
  • FIG. 8 represents the quantity of ethanol-D 5 and of ethanol- 13 CD 5 released when the two probes are placed in the presence of one or the other of the enzymes b-Glucuronidase (enzyme 1), D 5 - ethyl ⁇ -D-glucuronide (probe 1) and 13 CD 5 -ethyl-N- acetylglucosamine (probe 2).
  • b-Glucuronidase enzyme 1
  • D 5 - ethyl ⁇ -D-glucuronide probe 1
  • 13 CD 5 -ethyl-N- acetylglucosamine probe 2).
  • N-Acetyl-glucosaminidase enzyme 2
  • D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide probe 1
  • 13 CD 5 -ethyl-N-acetylglucosamine probe 2.
  • Figure 9b represents the quantity of ethanol-D4 released after hydrolysis of D 4 -ethyl-1-aL-fucopyranoside targeting Ga-
  • FIG. 10a represents the quantity of ethanol-D 5 exhaled by the animals after injection of 10 pg.kg -1 of D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide.
  • FIG. 10b represents the quantity of ethanol-D4 expired by the animals after injection of 100 pg.kg -1 of D4-ethyl-1- ⁇ -L-fucopyranoside.
  • FIG. 10c represents the quantity of ethanol- 13 CD 5 exhaled by the animals after injection of 10 pg.kg -1 of 13 CD 5 -ethyl-N-acetylglucosamine.
  • FIG. 10d represents the quantity of ethanol-D 2 expired by the animals after injection of 1 pg.kg -1 of D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside.
  • FIG. 11 represents the calibration lines showing the signal intensity of ethanol-D 5 as a function of the activity (UL 1 ) of ⁇ -mannosidase in the presence of the probe D 5 -ethyl- ⁇ -mannopyranoside ( 10 3 M) and the performance of the COV probe concept for the detection of this enzyme (LOD and R 2 ).
  • the straight lines were drawn for three different kinetic points (2, 4 and 7 h of reaction). Each point was performed in duplicate.
  • FIG. 11 a corresponds to the 2 o'clock kinetic point at 2:30 o'clock
  • FIG. 11 b corresponds to the 4 o'clock kinetic point at 4:30 o'clock
  • FIG. 11 c corresponds to the 7 o'clock kinetic point at 7:30 o'clock.
  • FIG. 12 represents the calibration lines showing the signal intensity of ethanol-D2 as a function of the activity (UL 1 ) of b-galactosidase in the presence of the probe D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside (10 4 M) and the performance of the concept of COV probe for the detection of this enzyme (LOD and R 2 ).
  • the straight lines were drawn for three different kinetic points (2, 4 and 7 h of reaction). Each point was performed in duplicate.
  • Figure 12a corresponds to the 2 o'clock kinetic point at 2:30 o'clock
  • Figure 12b corresponds to the 4 o'clock kinetic point at 4:30 o'clock
  • Figure 12c corresponds to the 7 o'clock kinetic point at 7:30 o'clock.
  • FIG. 13 represents the calibration lines showing the signal intensity of ethanol- 13 CD 5 as a function of the activity (UL 1 ) of /V-acetyl-glucosaminidase in the presence of the probe 13 CD 5 - ethyl-/V-acetylglucosamide (10 3 M) and the performance of the COV probe concept for the detection of this enzyme (LOD and R 2 ).
  • the straight lines were drawn for three different kinetic points (2, 4 and 7 h of reaction). Each point was performed in duplicate.
  • Figure 13a corresponds to the 2 o'clock kinetic point at 2:30 o'clock
  • Figure 13b corresponds to the 4 o'clock kinetic point at 4:30 o'clock
  • Figure 13c corresponds to the 7 o'clock kinetic point at 7:30 o'clock.
  • FIG. 14a represents the quantity of ethanol-D 5 detected above the biopsies in the presence of 10 -7 M of D 5 -ethyl-D-glucuronide.
  • FIG. 14b represents the quantity of ethanol-D detected above the biopsies in the presence of 10 -4 M of D 4 -ethyl-1-aL-fucopyranoside.
  • FIG. 14c represents the quantity of ethanol- 13CD5 detected above the biopsies in the presence of 10 ⁇ 8 M of 13CD5 -ethyl-N-acetylglucosamine.
  • FIG. 14d represents the quantity of ethanol-D 2 detected above the biopsies in the presence of 10 _6 M of D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside
  • FIG. 15a represents the quantity of ethanol-D 5 released after hydrolysis of D 5 -ethyl-D-glucuronide targeting b-glucuronidase.
  • FIG. 15b represents the quantity of ethanol-D released after hydrolysis of D 4 -ethyl-1- ⁇ -L-fucopyranoside targeting ⁇ -L-fucosidase.
  • FIG. 15c represents the quantity of ethanol- 13CD5 released after hydrolysis of 13CD5 -ethyl-N-acetylglucosamine targeting N-acetyl-glucosaminidase.
  • FIG. 15d represents the quantity of ethanol-D 2 released after hydrolysis of D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside targeting bD-galactosidase.
  • FIG. 15e represents the quantity of ethanol-D 5 released after hydrolysis of D 5 -ethyl- ⁇ -mannopyranoside targeting ⁇ -mannosidase.
  • the figure 15f represents the amount of ethanol-D4 released after hydrolysis of D4-ethyl- ⁇ -D-glucuronide targeting Ga-D-glucosidase.
  • FIG. 16a represents the quantity of ethanol-D 5 released after hydrolysis of D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide targeting b-glucuronidase.
  • FIG. 16b represents the quantity of ethanol-D released after hydrolysis of D 4 -ethyl-1- ⁇ -L-fucopyranoside targeting ⁇ -L-fucosidase.
  • FIG. 16a represents the quantity of ethanol-D 5 released after hydrolysis of D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide targeting b-glucuronidase.
  • FIG. 16b represents the quantity of ethanol-D released after hydrolysis of D 4 -ethyl-1- ⁇ -L-fucopyrano
  • FIG. 16c represents the quantity of ethanol- 13CD5 released after hydrolysis of 13CD5 -ethyl-N-acetylglucosamide targeting N-acetyl-glucosaminidase.
  • FIG. 16d represents the quantity of ethanol-D 2 released after hydrolysis of D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside targeting bD-galactosidase.
  • FIG. 16e represents the quantity of ethanol-D 5 released after hydrolysis of D 5 -ethyl- ⁇ -mannopyranoside targeting ⁇ -mannosidase.
  • Figure 16f shows the amount of ethanol-D4 released after hydrolysis of D4-ethyl- ⁇ -D-glucuronide targeting ⁇ -D-glucosidase.
  • FIG. 17a represents the quantity of ethanol-D 5 released after hydrolysis of D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide targeting b-glucuronidase.
  • FIG. 17b represents the quantity of ethanol-D4 released after hydrolysis of D 4 -ethyl-1- ⁇ -L-fucopyranoside targeting ⁇ -L-fucosidase.
  • FIG. 17a represents the quantity of ethanol-D 5 released after hydrolysis of D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide targeting b-glucuronidase.
  • FIG. 17b represents the quantity of ethanol-D4 released after hydrolysis of D 4 -ethyl-1- ⁇
  • FIG. 17c represents the quantity of ethanol- 13CD5 released after hydrolysis of 13CD5 -ethyl-N-acetylglucosamide targeting N-acetyl-glucosaminidase.
  • FIG. 17d represents the quantity of ethanol-D 2 released after hydrolysis of D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside targeting bD-galactosidase.
  • FIG. 17e represents the quantity of ethanol-D 5 released after hydrolysis of D 5 -ethyl- ⁇ -mannopyranoside targeting ⁇ -mannosidase.
  • Figure 17f shows the amount of ethanol-D4 released after hydrolysis of D4-ethyl- ⁇ -D-glucuronide targeting ⁇ -D-glucosidase.
  • FIG. 18 represents the calibration lines showing the signal intensity of ethanol-D4 as a function of the activity (UL 1 ) of ⁇ -L-fucosidase in the presence of the D -ethyl-1-aL-fucopyranoside probe (10 _3 M) and the performance of the COV probe concept for the detection of this enzyme (LOD and R 2 ).
  • the straight lines were drawn for three different kinetic points (2, 4 and 7 h of reaction). Each point was performed in duplicate.
  • Figure 18a corresponds to the 2 o'clock kinetic point at 2:30 o'clock
  • Figure 18b corresponds to the 4 o'clock kinetic point at 4:30 o'clock
  • Figure 18c corresponds to the 7 o'clock kinetic point at 7:30 o'clock.
  • Example 1 Optimization of the protocol for detecting tumor enzymatic markers in blood samples; validation with a cocktail probe
  • a sample of 4-5 ml_ of blood is taken from patients at the time of their first consultation with the oncologist in charge of the file.
  • the plasma (approximately 2 mL) is extracted therefrom and then stored at -20°C until analysis.
  • a 25 pL aliquot of plasma is taken and inserted into a 2 mL vial with insert.
  • This biological sample is supplemented with 50 ⁇ L acetate buffer solution (pH 5), protease inhibitor (1X) and 25 ⁇ L of probe D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide at 2.10 4 M.
  • an SPME sample SPME semi-polar phase type Car/PDMS, 1 cm long and 75 ⁇ m thick with a 24 ga needle; Supelco
  • the VOCs trapped on the SPME fiber are then analyzed by GC-TQMS.
  • GC-TQMS detection of ethanol isotopes is carried out with gas phase chromatography coupled to a triple quadrupole equipped with an El source (TSQ 9000, Thermo Fisher Scientific). The system is controlled by the TSQ 9000 software and the results are analyzed with the Xcalibur software (Thermo Fisher Scientific). The analysis conditions are summarized in Table 2.
  • LOD Limit of detection
  • a model enzyme b-glucuronidase from E. coli; 50% glycerol liquid solution, 140 U.mL -1 ; Sigma Aldrich
  • D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide probe was then determined.
  • a plasma sample for which the activity of endogenous b-glucuronidase was not detectable was supplemented with enzyme concentrations ranging from 1.10 11 to 1.10 13 mol.L -1 .
  • the amount of ethanol-D 5 released was monitored before addition of probe then after 2.5, 4.5 and 7.5 h of reaction at 30°C.
  • FIG. 1 represents the calibration line allowing the detection of b-glucuronidase after 7.5 h of reaction.
  • the detection limit of the enzyme with the probe is between 1.10 13 mol.L -1 (signal to noise of 9) and 5.10 13 mol.L -1 (signal to noise of 37) which leads to a minimum quantity of detectable enzyme equal to 1.10 -18 mol.
  • This LOD is 100 times lower than the threshold value obtained using the reference detection method for this same enzyme (Li et al., 2018, Biotechnology Letters, 40, 11 1-118; Xiao et al., 2020, RSC Advances, 10, 22966).
  • This method corresponds to the hydrolysis of para-nitrophenol glucuronide. It was carried out in acetate buffer (pH > 10), followed by UV detection at 400 nm of para-nitrophenol ( Figure 2).
  • the approach according to the present invention has proven to be 100 to 1000 times more sensitive than very recent strategies involving fluorescent probes such as para-nitrophenol glucuronide (Huo et al. 2018, Sensors and Actuators B: Chemical, 262, 508-515; Guo et al., 2019, Sensors and Actuators B: Chemical, 295, 1-6). It is also 10 times more sensitive than the most sensitive proteomics analyzes (Selevsek et al. 2011, Proteomics, 11, 1135-1147).
  • the blood samples were taken by the nursing staff associated with the oncology department, then collected and pre-treated by the CIC.
  • This study included plasma samples taken from 11 breast cancer patients and 11 lung cancer patients. These patients were diagnosed, but had not yet received treatment at the time of sampling. Their response was compared with that obtained from plasmas of 4 healthy patients. The results were compared to an experimental blank in which the probe was added, whereas the enzyme was not present therein (FIG. 3). After addition of probe, the quantity of ethanol-D 5 released above the samples from patients suffering from cancer was significantly higher compared to the blanks and to the plasma of the healthy patient. This test therefore makes it possible to discriminate between healthy patients and patients suffering from cancer.
  • Example 2 Optimization of the protocol for detecting tumor enzymatic markers on tissue samples (biopsies); validation with a cocktail probe
  • the objective here is to develop a protocol to detect target enzymes in the extracellular environment of tumor cells, whereas they should be absent, or have limited activity, in the environment of healthy cells.
  • This protocol was first developed to detect b-glucuronidase with the corresponding cocktail probe, D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide.
  • Probe solutions at 10 -7 , 10 -6 , 10 -4 and 10 -2 M were prepared in a PBS buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HP0 4 , 1.8 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4).
  • the biopsies were rinsed with 500 ⁇ L of PBS then placed in a vial with a 2 mL insert. A volume of 297 pL of PBS was added to the vial. The volatile molecules present in the headspace of the vial were trapped for 30 min in order to ensure the absence of detection of ethanol-D 5 . Then, 3 ⁇ L of probe at 10 7 , 10 6 , 10 4 or 10 2 M were added (final concentration of probe in the vial of 10 9 , 10 8 , 10 6 or 10 4 M). After sealing and vortexing the vial, the volatile compounds were preconcentrated on SPME fiber (Car/PDMS, Supelco) for 30 min and then analyzed by GC-TQMS (analysis conditions described in Table 2).
  • SPME fiber Car/PDMS, Supelco
  • Example 3 Preliminary tests with a cocktail of four COV-based probes according to the invention
  • a second probe, 13 CD 5 -ethyl-N-acetylglucosamine (probe (2) as defined above) targeting N-acetyl-glucosaminidase was studied.
  • a targeted analysis method by GC-MS/MS SRM mode
  • 13 CD 5 isotope transitions ethanol- 13 CD 5 transitions: 52>34 and 52>50.
  • the detection performances of this compound in the presence of ethanol and of ethanol-D 5 were then verified. It was then demonstrated that in the presence of ethanol and ethanol-D 5 , the specificity and sensitivity of detection of ethanol- 13 C-D 5 are in no way altered.
  • the detection ranges for ethanol-D 5 and ethanol- 13 CD 5 were then carried out under the SPME sampling conditions developed for the biological samples (30 min of sampling at 30° C.). The two isotopes were present in mixture in solution. The detection limits obtained are respectively 1.10 9 M and 5.10 9 M.
  • the SPME-GC-TQMS method therefore allows a clear differentiation of the two isotopes according to their mass fragmentation.
  • N-acetylglucosamine, D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside and D -ethyl-1-aL-fucopyranoside targets enzymes identified in different types of solid tumors or in the bloodstream of cancer patients.
  • this cocktail In order to verify the diagnostic efficacy of this cocktail, it was tested on plasma samples taken from 4 patients with breast cancer and 3 patients with lung cancer. These patients were diagnosed, but had not yet received the treatment adapted to their pathology at the time of sampling.
  • the D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside probe does not make it possible to differentiate healthy patients from cancer patients.
  • the enzyme targeted by this probe bD-galactosidase, does not appear to be active in the plasma of sick patients.
  • the underlying hypotheses would be that the enzyme is not present in the tumor microenvironment (absence of secretion by the tumor or immune cells), or if present, that it has been rendered inactive after denaturation.
  • This cocktail of 4 probes was then tested in vivo in order to demonstrate (1) its effectiveness in differentiating healthy animals from diseased animals, and the presence of one or more of the target enzymes in the tumor microenvironment, in real time.
  • the concentration of the 4 probes to be injected was determined beforehand according to a precise experimental plan aimed at determining the quantity of each probe inducing a minimal ethanol response for healthy animals (signal reaching a low or even zero basal level).
  • the healthy animals received increasing doses of the 4 probes (from 0.5 pg.kg -1 to 100 pg.kg -1 ).
  • the animals were then placed in an airtight cage for 1 h.
  • the quantity of each The ethanol isotope present in the breath of the animals was then measured for 30 min via an SPME sample, then an analysis on GC-TQMS.
  • the optimal injection doses were found to be different for each probe (ie, 1 pg.kg -1 of D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside, 10 pg.kg -1 of D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide and 13 CD 5 -ethyl-N-acetylglucosamine, and finally 100 pg.kg -1 of D -ethyl-1-al-fucopyranoside).
  • This result is representative of the variability of penetration/metabolism of each probe, or else of the variation in activity of the 4 targeted enzymes.
  • the cocktail was injected into healthy mice and into sick mice after 12 then 15 days of implantation of the xenograft.
  • the quantity of ethanol isotopes expired by the animals was measured 1 hour after injection of the cocktail (FIG. 10).
  • a negative control on two mice (healthy and sick) was carried out. This consisted of measuring the quantity of the 4 isotopes of ethanol in the air surrounding the mice when they had not received the cocktail. Ethanol-D 5 , ethanol-D4 and ethanol- 13 CD 5 were not detected.
  • specific ethanol-D2 transitions gave a strong signal, implying the presence of an interfering compound in the mouse environment. The quantity of ethanol-D2 exhaled by the healthy mice was therefore subtracted from this background noise.
  • sick animals were able to be discriminated from healthy animals from 12 days after tumor implantation (minimum duration for tumor implantation in animals) with this cocktail (the expired quantity of 3 out of 4 isotopes was significantly greater for the sick animals).
  • D2-ethyl ⁇ -D-galactopyranoside probe did not make it possible to differentiate healthy patients from patients with breast or lung cancer, it is here activated in the microenvironment of nasopharyngeal tumors . Thus, this probe makes it possible to discriminate tumors according to their location.
  • Example 4 Detection limit of three target enzymes
  • the detection limit (LOD) of a model b-glucuronidase (b-glucuronidase from E. coli; 50% glycerol liquid solution, 140 U.mL 1 ; Sigma Aldrich) was measured in plasma matrix in the presence of the probe D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide added at a concentration of 5.10 5 M. The results were presented in the initial submission.
  • the detection limit was determined for three additional enzymes: ⁇ -mannosidase, ⁇ -galactosidase, / ⁇ -acetyl-glucosaminidase.
  • ⁇ -mannosidase ⁇ -galactosidase
  • / ⁇ -acetyl-glucosaminidase ⁇ -mannosidase
  • an SPME sample (SPME in semi-polar phase of the Car/PDMS type, 1 cm long and 75 ⁇ m thick with a 24 ga needle; Supelco) of the gas phase at above the sample lasting 30 min will be produced after 2h, 4h and 7h of reaction. Each kinetic point required a reaction vial, and will be carried out in duplicate.
  • the VOCs trapped on the SPME fiber are then analyzed by GC-TQMS.
  • GC-TQMS detection of ethanol isotopes is performed with phase chromatography gaseous coupled to a triple quadrupole equipped with an El source (TSQ 9000, Thermo Fisher Scientific).
  • TSQ 9000 phase chromatography gaseous coupled to a triple quadrupole equipped with an El source (TSQ 9000, Thermo Fisher Scientific).
  • TSQ 9000 El source
  • Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific
  • the detection limit of each of the enzymes is between 1.47.10 ⁇ 3 and 0.345 LU 1 which brings us to a minimum quantity of detectable enzyme less than or equal to 10 13 mol for the commercial enzymes used here.
  • a first cocktail consisting of 4 probes (D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide, 13 CD 5 - ethyl-N-acetylglucosamine, D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside and D 4 -ethyl-1-aL-fucopyranoside) was was used to demonstrate in vivo its effectiveness in differentiating healthy animals from diseased animals, and the presence of one or more of the target enzymes in the tumor microenvironment, in real time.
  • Anticancer agents targeting these enzymatic activities could be of real interest for the treatment of this type of cancer.
  • tumor MDA-MB-231 human breast cancer cells
  • tumor and healthy biopsies were placed in the presence of the cocktail consisting of the 4 D 5 -ethyl ⁇ -D-glucuronide, 13 CD 5 -ethyl-N-acetylglucosamine, D 2 -ethyl ⁇ -D-galactopyranoside and D -ethyl-1 -aL-fucopyranoside probes in order to demonstrate the extracellular activity of 4 corresponding enzymes, respectively targeting b-glucuronidase, N-acetyl-glucosaminidase, bD-galactosidase and Ga-1-fucosidase.
  • the concentration of each probe to be added to the tissues was optimized in order to detect only the enzymes present in the extracellular environment ( nb . These 4 glycosidases are also present inside the lysosomes of the cells, whether they are cancerous or healthy). In addition, and as a control measure, the absence of ethanol isotopes was checked on all the tissues tested.
  • the healthy biopsies (healthy whole organs) were placed in the presence of increasing concentrations of each probe.
  • the biopsies were rinsed twice with 500 ml of acetate buffer (pH 5) then placed in a vial with a 2 ml insert.
  • a volume of 270 ml of acetate buffer was added to each vial, then the cocktail was added so as to obtain a concentration of each of the probes ranging from 10 4 to 10 9 M.
  • One concentration per probe was selected (figure 14) . It therefore corresponds to the concentration for which the signal of the corresponding ethanol isotope is weak or even absent on healthy tissues (whole or cut; figure 14).
  • the cancerous tissues (whole or cut) were then tested under these conditions.
  • Example 6 Cocktail for the diagnosis and prognosis of diseases: study of SARS-COV-2 infection
  • COV-based probes could make it possible to diagnose, predict and monitor the evolution of pathologies such as, for example, inflammation (cancer type) and infections (SARS-COV-type viral infection). 2).
  • inflammation cancer type
  • SARS-COV-type viral infection SARS-COV-type viral infection. 2
  • an ex vivo study aimed at demonstrating the relevance of COV probes as prognostic tracers of SARS-COV-2 infection was conducted. For this, blood samples from 30 patients infected with SARS-COV-2 were tested using six COV-based probes, each targeting a different glycolytic activity.
  • an SPME sample (SPME in semi-polar phase of the Car/PDMS type, 1 cm long and 75 ⁇ m thick with a 24 ga needle; Supelco) of the gas phase at above the sample lasting 30 min will be produced after 2h, 4h and 7h of reaction. Each kinetic point requires a reaction vial, and was carried out in duplicate.
  • the VOCs trapped on the SPME fiber are then analyzed by GC-TQMS according to the parameters defined in Tables 4 and 5. Cocktail blanks (cocktails in acetate buffer without plasma) and plasma blanks (plasmas in acetate buffer without cocktail) were performed on each analysis day.
  • the responses of the probes in the plasma samples were compared with their responses in so-called “blank” samples and corresponding to the probes added in the acetate buffer alone.
  • COVID N-acetylglucosaminidase and Ga-mannosidase have higher activity in highly symptomatic patients admitted to intensive care.
  • These two enzymes seem to be unfavorable prognostic markers of SARS-COV-2 infection detectable as early as 8 days after infection. Their concentration decreases significantly the following days, but nevertheless remains high in patients who have developed severe symptoms, which makes them markers of SARS-COV-2 infection.
  • two other enzyme markers, b-glucuronidase and ⁇ -glucosidase seem to be in place several weeks after infection in patients admitted to intensive care. Their respective activities become discriminating 6 months after infection. These two markers would therefore be markers of chronic post-infection inflammation (ARDS) as developed by patients admitted to intensive care. Monitoring these markers over the longer term would make it possible to verify a regression of inflammation.
  • ARDS chronic post-infection inflammation
  • b-D-galactosidase and Ga-I-fucosidase cannot differentiate infected patients. Nevertheless, since these two enzymes are markers of solid tumors, they should allow us to discriminate patients with cancer from those with infection.

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Abstract

La présente invention a pour objet une composition comprenant : - soit au moins de l'éthyl-β-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-β-D-glucuronide) et au moins de l'éthyl-β- D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-β-D-galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif; - soit au moins de l'éthyl-α-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-β-D-glucuronide); pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic.

Description

SONDES À BASE DE COMPOSÉS ORGANIQUES VOLATILS ET LEURS UTILISATIONS POUR LE DIAGNOSTIC ET LE PRONOSTIC DE PATHOLOGIES
La présente invention a pour objet des sondes à base de composés organiques volatils, des compositions comprenant ces sondes et leurs utilisations pour le diagnostic et le pronostic de pathologies. La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic de ces pathologies par l’utilisation desdites sondes.
Un diagnostic précoce, précis et fiable, est un des éléments clés assurant la guérison des patients, et ce, quelle que soit leur pathologie. Jusqu’à présent, le diagnostic d’un patient résulte soit de l’examen clinique de l’individu lorsque celui-ci présente des symptômes bien particuliers, soit d’une participation à un programme de dépistage national. Il entre alors dans des protocoles médicaux impliquant une analyse par imagerie, qui restent discutables en raison de 1 ) leur faible accessibilité, 2) leur spécificité, 3) leur coût élevé, et 4) leur sensibilité.
La « volatolomique », discipline qui étudie les composés organiques volatils (COVs) produits par les systèmes biologiques, est un domaine scientifique émergent qui permet d’explorer les processus métaboliques en temps réel. De nombreux COVs endogènes, présents dans l’haleine, la transpiration, l’urine ou les selles des individus seraient des marqueurs potentiels de diverses maladies, permettant leur diagnostic comme la stratification des patients dans le cadre de thérapies personnalisées. Cependant, l’utilisation clinique de la « volatolomique » reste limitée en raison d’une grande variabilité inter-individuelle et d’une disparité inter-laboratoire pour ce qui est du prélèvement et de l’analyse des COVs dans les fluides ou gaz biologiques.
Récemment, des biocapteurs à visée médicale ou biologique ont été développés, ceux-ci étant basés sur une détection par fluorescence, électrochimique ou luminescence. Toutefois, ces biocapteurs présentent l’inconvénient de contenir des éléments radioactifs.
Il existe donc à ce jour un besoin de moyens simples et sensibles pour le diagnostic, basés sur des sondes dérivées de molécules biologiques et ne contenant pas d’élément radioactif.
La présente invention a pour but de fournir une composition comprenant des sondes enzymo-sensibles, programmées pour cartographier les enzymes spécifiques d’une (plusieurs) pathologie(s), pour diagnostiquer les maladies de façon précoce et certaine, après administration des sondes chez les sujets à diagnostiquer.
La présente invention a également pour but de fournir une composition pour le diagnostic de sujets, permettant de suivre les sujets très régulièrement au cours de leur thérapie et ainsi d’aider le personnel médical dans sa prise de décision quant au choix du protocole le plus efficace.
La présente invention a également pour but de fournir une méthode de diagnostic simple, peu coûteuse, très sensible, indolore et accessible à un grand nombre, afin de pouvoir améliorer le traitement des pathologies malines.
La présente invention a pour but de fournir une composition pour le diagnostic permettant de réduire considérablement la variabilité inter-individuelle rencontrée avec le suivi de marqueurs endogènes.
Ainsi, la présente invention concerne une composition comprenant :
- au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) ;
- au moins de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-/V-acétylglucosamide) ; et
- au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic.
La présente invention concerne une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl^-D-galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a-mannopyranoside) ; pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic. La présente invention concerne également une composition (C1) comprenant :
- au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et
- au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic.
La présente invention concerne également une composition (C2) comprenant au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a-mannopyranoside), pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic.
Composition ou cocktail selon l’invention
La composition susmentionnée comprend donc plusieurs composés ou sondes, destinés à une utilisation comme agent pour le diagnostic ou le pronostic d’une pathologie. Cette composition est également désignée par la suite par le terme « cocktail » ou « cocktail de sondes ». Cette composition est donc utilisée pour diagnostiquer ou pronostiquer une pathologie, comme expliqué plus loin. A titre de compositions selon l’invention, on peut donc mentionner par exemple les compositions C1 ou C2 susmentionnées.
Comme mentionné ci-dessus, la composition utilisée selon l’invention comprend par exemple au moins deux sondes, notamment au moins trois sondes, à savoir les sondes éthyl^-D-glucuronide, éthyl-/V-acétylglucosamide et éthyl-b-O- galactopyranoside, chacune de ces sondes (ou composés) comprenant au moins un isotope non radioactif dans la partie éthyle.
Comme mentionné ci-dessus, une composition C1 , utilisée selon l’invention, également nommée « cocktail 1 », comprend au moins deux sondes, à savoir les sondes éthyl^-D-glucuronide et éthyl^-D-galactopyranoside, chacune de ces sondes (ou composés) comprenant au moins un isotope non radioactif dans la partie éthyle. Selon un mode de réalisation, cette composition comprend par exemple la sonde éthyl-/V-acétylglucosamide.
Une autre composition utilisée selon l’invention, à savoir la composition C2, également nommée « cocktail 2 », comprend au moins la sonde éthyl-a- mannopyranoside, de préférence en association avec au moins une autre sonde comme par exemple la sonde éthyl-a-D-glucopyranoside ou la sonde éthyl-1 -a-L- fucopyranoside.
L’éthyl^-D-glucuronide répond à la formule suivante : et cible l’enzyme b-glucuronidase. L’éthyl-/V-acétylglucosamide répond à la formule suivante : et cible l’enzyme /V-acétylglucosaminidase.
L’éthyl^-D-galactopyranoside répond à la formule suivante : et cible l’enzyme b-galactosidase.
Comme expliqué plus haut, les sondes de la composition selon l’invention comprennent, dans leur partie éthyle, au moins un isotope non radioactif. A titre d’isotope non radioactif, on peut citer par exemple le deutérium (2D), le carbone-13 (13C) ou l’oxygène-18 (180). Ces sondes sont donc des composés dérivés des composés répondant aux formules susmentionnées, dans lesquelles au moins un atome d’hydrogène et/ou de carbone et/ou d’oxygène de leurs parties éthyle sont remplacé(s) par un isotope. La partie éthyle des sondes utilisées selon l’invention est donc marquée avec un ou plusieurs isotopes non radioactifs sur une ou plusieurs positions (2D, 13C ou 180).
Selon un mode de réalisation, l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif présent dans la composition selon l’invention est la sonde à la formule (1 ) suivante : cette sonde ciblant l’enzyme b-glucuronidase.
Selon un mode de réalisation, l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif présent dans la composition selon l’invention est la sonde 13C-D5-éthyl-/V-acétylglucosamide, répondant à la formule (2) suivante : cette sonde ciblant l’enzyme N-acétyl-glucosaminidase.
Selon un mode de réalisation, l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif présent dans la composition selon l’invention est la sonde D2-éthyl^-D-galactopyranoside, répondant à la formule (3) suivante : cette sonde ciblant l’enzyme b-galactosidase. L’éthyl-1-a-L-fucopyranoside répond à la formule suivante : et cible l’enzyme a-L-fucosidase.
L’éthyl-glucopyranoside répond à la formule suivante : et cible l’enzyme a- ou b-glucosidase.
L’éthyl-mannopyranoside répond à la formule suivante : et cible l’enzyme a- ou b-mannosidase.
L’éthyl-a-D-glucopyranoside répond à la formule suivante : et cible l’enzyme a-glucosidase.
L’éthyl-a-mannopyranoside répond à la formule suivante : et cible l’enzyme a-mannosidase. Selon un mode de réalisation, l’éthyl-1-a-L-fucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif présent dans la composition selon l’invention est la sonde D4-éthyl-1-a-L-fucopyranoside, répondant à la formule (4) suivante : cette sonde ciblant l’enzyme a-L-fucosidase.
Selon un mode de réalisation, l’éthyl-glucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif présent dans la composition selon l’invention est la sonde D4-éthyl-glucopyranoside, répondant à la formule (5) suivante :
Selon un mode de réalisation, l’éthyl-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif présent dans la composition selon l’invention est la sonde D5-éthyl-mannopyranoside, répondant à la formule (6) suivante :
Toutes les sondes peuvent être synthétisées aléatoirement avec les isotopes de l’éthanol que sont : l’éthanol-D2, éthanol-D3, éthanol-D4, éthanol-D5, éthanol- 13C-D5, éthanol-13C2-D5, éthanol-13C ou éthanol-13C2.
Ainsi, la présente invention, en rupture avec la recherche classique de COVs endogènes, repose sur l’utilisation ex vivo de sondes multimodales, incluant dans leur structure un COV marqué avec un (ou des) isotope(s) stable(s). Ces sondes croisées sont hydrolysées sélectivement dans les tissus lésés via l’activité d’enzymes spécifiques de ces milieux. Les COVs ainsi libérés deviennent à leur tour des marqueurs exogènes caractéristiques du métabolisme du tissu lésé et sont détectés ex vivo dans un prélèvement biologique suivant un protocole établi et détaillé, comme expliqué plus loin.
Une première preuve de concept ciblant la b-glucuronidase, marqueur enzymatique tumoral, a montré la pertinence de l’utilisation d’une sonde à éthanol marqué au deutérium pour détecter in vivo différents types de tumeurs solides et suivre leur évolution au cours d’une chimiothérapie. Néanmoins, dans un contexte de recherche clinique, le ciblage d’une seule et unique enzyme peut conduire à un nombre important de faux-positifs et faux-négatifs.
La présente invention est donc basée sur l’utilisation d’un cocktail de sondes croisées, ciblant chacune un marqueur enzymatique spécifique d’une ou plusieurs pathologies, afin de réduire le risque de diagnostic erroné et de prédire l’efficacité des thérapies associées. Suivant les sondes activées, cette stratégie renseigne sur la nature de la pathologie (ex. tumeur solide, syndrome inflammatoire, infection bactérienne, infection virale), sa localisation, son agressivité, son stade de développement et sa réponse aux traitements.
Dans le cadre de la présente invention, des sondes à COVs ciblant des enzymes de type glycosidases sont donc utilisées. Ces enzymes sont sur-exprimées dans les tissus lésés (ex. micro-environnement tumoral ou infectieux), mais ne sont pas, ou très peu, exprimées/sécrétées par les cellules saines.
Après hydrolyse, ces sondes libèrent une molécule d’éthanol marqué.
Par ailleurs, les sondes à base de COV selon l’invention offrent une sensibilité jusque-là jamais atteinte. A titre d’exemple, les premiers résultats obtenus avec la sonde ciblant la b-glucuronidase montrent que cette enzyme peut être détectée dans le plasma à des concentrations inférieures à 5.1013 M. Un biocapteur à fluorescence développé récemment présentait une LOD de 5.109M pour cette même enzyme.
Selon un mode de réalisation, la composition susmentionnée, notamment la composition C1 ou « cocktail 1 », comprend en outre au moins un autre composé marqué choisi dans le groupe constitué de : l’éthyl-1 -a-L-fucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, l’éthyl^-D-glucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, l’éthyl- mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, et de leurs mélanges. Selon un mode de réalisation, la composition susmentionnée, notamment la composition C1 ou « cocktail 1 », comprend en outre de l’éthyl-N-acétylglucosamide.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention comprend au moins les sondes (1 ), (2) et (3) susmentionnées, en association avec au moins une des sondes (4), (5) et/ou (6) telles que définies ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention C1 comprend au moins les sondes (1) et (3) susmentionnées, en association avec au moins une des sondes (2), (4), (5) et/ou (6) telles que définies ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention C2 comprend au moins la sonde (6) susmentionnée, en association avec au moins une des sondes (4) et/ou (5) telles que définies ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la composition C1 comprend au moins de l’éthyl- b-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif et de l’éthyl-1 -a-L-fucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif.
Ce cocktail selon l’invention C1-1 comprend ainsi de préférence de l’éthyl^-D- glucuronide ciblant la b-glucuronidase, de l’éthyl-N-acetylglucosamide ciblant la N- acetyl-glucosaminidase, de l’éthyl b-D-galactopyranoside ciblant la b-galactosidase et de l’éthyl-1 -a-L-fucopyranoside ciblant l’a-L-fucosidase, chacune de ces sondes étant modifiées comme expliqué plus haut, par la présence d’au moins un isotope non radioactif dans leurs parties éthyles.
Selon un mode de réalisation, la composition C1 comprend au moins de l’éthyl- b-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif et de l’éthyl-a-D-glucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif
Ce cocktail selon l’invention C1-2 comprend ainsi de préférence de l’éthyl^-D- glucuronide ciblant la b-glucuronidase, de l’éthyl b-D-galactopyranoside ciblant la b- galactosidase et de l’éthyl-a-D-glucopyranoside ciblant l’a-glucosidase, chacune de ces sondes étant modifiées comme expliqué plus haut, par la présence d’au moins un isotope non radioactif dans leurs parties éthyles. Selon un mode de réalisation, la composition C2 comprend au moins de l’éthyl- a-D-glucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif et de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif.
Ce cocktail selon l’invention C2-1 comprend ainsi de préférence de l’éthyl-a-D- glucopyranoside ciblant la a-glucosidase et de l’éthyl-a-mannopyranoside ciblant la a-mannosidase, chacune de ces sondes étant modifiées comme expliqué plus haut, par la présence d’au moins un isotope non radioactif dans leurs parties éthyles.
Selon un mode de réalisation, la composition C2 comprend au moins de l’éthyl- 1-a-L-fucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif et de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif.
Ce cocktail selon l’invention C2-2 comprend ainsi de préférence de l’éthyl-1-a- L-fucopyranoside ciblant la a-L-fucosidase et de l’éthyl-a-mannopyranoside ciblant la a-mannosidase, chacune de ces sondes étant modifiées comme expliqué plus haut, par la présence d’au moins un isotope non radioactif dans leurs parties éthyles.
Selon un mode de réalisation, la composition comprend au moins de l’éthyl-b- D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, de l’éthyl-1-a-L-fucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif, de l’éthyl-glucopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif et de l’éthyl- mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif.
Le cocktail selon l’invention comprend ainsi de préférence de l’éthyl^-D- glucuronide ciblant la b-glucuronidase, de l’éthyl-N-acetylglucosamide ciblant la N- acetyl-glucosaminidase, de l’éthyl b-D-galactopyranoside ciblant la b-galactosidase, de l’éthyl-1-a-L-fucopyranoside ciblant l’a-L-fucosidase, de l’éthyl-glucopyranoside ciblant la a-glucosidase ou b-glucosidase et de l’éthyl-mannopyranoside ciblant la a- mannosidase ou b-mannosidase, chacune de ces sondes étant modifiées comme expliqué plus haut, par la présence d’au moins un isotope non radioactif dans leurs parties éthyles. Selon un mode de réalisation, la composition selon l’invention comprend les sondes susmentionnées répondant aux formules (1), (2), (3), (4), (5) et (6).
Utilisation de la composition ou cocktail selon l’invention La présente invention concerne également l’utilisation de la composition telle que définie ci-dessus, à savoir une composition comprenant :
- au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- au moins de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; et
- au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; comme agent de diagnostic et/ou pronostic ex vivo d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües.
La présente invention concerne également l’utilisation de la composition telle que définie ci-dessus, à savoir une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl^-D-galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a-mannopyranoside) ; comme agent de diagnostic et/ou pronostic ex vivo d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües.
La présente invention concerne également l’utilisation de la composition telle que définie ci-dessus, à savoir une composition C1 ou C2, comme agent de diagnostic et/ou pronostic ex vivo d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües. Comme expliqué plus loin, les compositions selon l’invention, et telles que définies plus haut, notamment les compositions C1 ou C2, et comprenant les sondes susmentionnées, sont utilisées pour le diagnostic et/ou le pronostic ex vivo de sujets (humains ou animaux). Ces compositions peuvent être destinées notamment à la stratification de sujets ou patients, selon l’avancement, la sévérité et l’évolution de la pathologie, mais également au diagnostic, éventuellement précoce, d’une pathologie, par exemple dans le cadre d’une campagne de screening d’une population donnée de sujets ou patients.
Selon un mode de réalisation, la composition utilisée comme agent de diagnostic et/ou pronostic ex vivo de la pathologie susmentionnée est telle que définie plus haut, et comprend notamment les sondes (1), (2) et (3).
Selon un mode de réalisation, la composition utilisée comme agent de diagnostic et/ou pronostic ex vivo de la pathologie susmentionnée est la composition C1 ou C2.
Selon un mode de réalisation, la composition utilisée comme agent de diagnostic et/ou pronostic ex vivo de la pathologie susmentionnée comprend les sondes (1), (2), (3), (4), (5) et (6) susmentionnées.
Pathologies
Comme indiqué ci-dessus, les pathologies pouvant être diagnostiquées et/ou pronostiquées par le cocktail de sondes selon l’invention sont des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l’organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües. Parmi ces pathologies, on peut citer notamment les maladies inflammatoires, les infections bactériennes ou encore les maladies auto-immunes.
Le terme « pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l’organisme » désigne notamment les cancers, le SDRA et fibrose pulmonaire, ou encore la maladie de Parkinson.
Le terme « maladies inflammatoires chroniques » désigne notamment la maladie de Crohn, l’eczéma, ainsi que les maladies auto-immunes telles que le diabète de type 1 , le vitiligo, la sclérose en plaques ou encore la polyarthrite rhumatoïde.
Le terme « infections aigües » désigne notamment les infections virales (virus respiratoires syncytial, SARS-COV, VIH, virus de l’herpès simplex et l’ensemble des virus émergents) et bactériennes (Escherichia Coli, Staphylocoque, Pseudomonas, Propionibacterium acnés).
La maladie inflammatoire, appelée également pathologie inflammatoire, peut être toute maladie résultant d’une réaction anormale du système immunitaire.
La maladie inflammatoire peut être une maladie auto-inflammatoire, une maladie auto-immune ou une affection inflammatoire d’origine indéterminée.
Les pathologies inflammatoires se définissent par une agression tissulaire en raison d'un dérèglement du système immunitaire. Aussi, parmi ces dernières, on peut citer l’athérosclérose, polyarthrite rhumatoïde, inflammation pulmonaire, maladie inflammatoire chronique de l’intestin, sepsis, sepsis sévère, choc septique ou cancer.
La maladie inflammatoire est ainsi de préférence sélectionnée dans le groupe consistant en l’athérosclérose, polyarthrite rhumatoïde, inflammation pulmonaire, maladie inflammatoire chronique de l’intestin, sepsis, sepsis sévère, choc septique, cancer et leurs combinaisons.
L’athérosclérose (appelée également artériosclérose) est une maladie touchant les artères et caractérisée par l'apparition de plaques d'athérome sur la paroi interne des artères.
La polyarthrite rhumatoïde (ou PR) est une maladie systémique du tissu conjonctif caractérisée par une inflammation articulaire chronique évoluant par poussées.
L’inflammation pulmonaire comprend notamment la maladie pulmonaire inflammatoire et/ou l’allergie pulmonaire.
La maladie pulmonaire inflammatoire comprend notamment l’atteinte pulmonaire aiguë (« Acute Lung Ingury » ou ALI, également appelé « ARDS modéré »), le syndrome de détresse respiratoire aiguë (« Acute Respiratory Distress Syndrome ou ARDS), l’atteinte pulmonaire aiguë résultant d’une transfusion (« Transfusion Related Acute Lung Injury » ou TRALI).
L’allergie pulmonaire, appelée également allergie respiratoire, est une maladie alternant une phases aiguë (appelée également crise d’asthme) et une phase chronique.
La maladie inflammatoire chronique de l’intestin (ou MICI) peut être sélectionnée parmi la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique.
Une réaction inflammatoire excessive, en réponse à une infection, provoque le sepsis et ses formes les plus graves, le sepsis sévère et le choc septique. La cellule cancéreuse va provoquer une inflammation et envahir les cellules voisines pour créer un climat propice à la croissance de cellules de proximité. C’est ainsi que, petit à petit, naît la tumeur cancéreuse. Concrètement, la cellule cancéreuse utilise l’inflammation pour progresser.
Selon un mode de réalisation, la pathologie susmentionnée est choisie dans le groupe constitué des cancers, des infections bactériennes et virales, des infections nosocomiales, des maladies auto-immunes, des inflammations respiratoires, des inflammations chroniques, des maladies neurodégénératives et des troubles chroniques liés à l’âge.
Selon l’invention, parmi les cancers, on peut citer par exemple les tumeurs cancéreuses solides, comme par exemple les cancers pulmonaires (poumons, bronches et naso-pharynx), gynécologiques (sein, ovaire, utérus) et gastro intestinaux (foie, intestin, côlon, pancréas).
De préférence, le cancer est choisi dans le groupe constitué du cancer du sein, cancer du poumon, cancer du pancréas, cancer des ovaires, cancer de l’utérus, cancer nasopharyngé, cancer de l’intestin, cancer du côlon, cancer de la vessie et cancer du cerveau.
A titre d’infections bactériennes et virales, on peut citer les infections dues par exemple à Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii et Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Listeria monocytogenes, Chlamydia, Treponema pallidum, SARS-COV, VIH, virus syncytial, virus de l’herpès simplex et l’ensemble des virus émergents.
A titre d’infections nosocomiales, on peut citer par exemple les infections dues à Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Propionibacterium acnés.
A titre de maladies auto-immunes, on peut citer par exemple le diabète de type 1 , le vitiligo, la sclérose en plaques ou encore la polyarthrite rhumatoïde.
A titre d’inflammations respiratoires, on peut citer par exemple la fibrose pulmonaire, et en particulier l’insuffisance respiratoire hypoxémique aiguë ou syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA ou ARDS).
A titre d’inflammations chroniques, on peut citer par exemple la maladie de Crohn.
A titre de maladies neurodégénératives, on peut citer par exemple la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. A titre de troubles chroniques liés à l’âge, on peut citer par exemple le diabète de type 2, l’arthrose et l’ostéoporose.
La présente invention concerne également la composition susmentionnée, notamment comprenant les sondes (1), (2) et (3), ou la composition C1 ou C2, pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic des cancers.
La présente invention concerne également une composition telle que définie ci- dessus comprenant les sondes (1), (2), (3) et (4), pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic des cancers.
La présente invention concerne également une composition telle que définie ci- dessus comprenant les sondes (1), (2), (3), (4) et (6), pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic des cancers.
La présente invention concerne également une composition C1 ou C2 telle que définie ci-dessus, pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic des cancers.
La présente invention concerne également une composition telle que définie ci- dessus comprenant les sondes (1), (2), (3) et (5), pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic d’infections virales et bactériennes et de maladies inflammatoires chroniques comme l’arthrose ou le diabète.
La présente invention concerne également une composition C1 ou C2 telle que définie ci-dessus, pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic d’infections virales et bactériennes et de maladies inflammatoires chroniques comme l’arthrose ou le diabète.
Méthode de diagnostic d’une pathologie
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, une composition comprenant :
- au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; - au moins de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; et
- au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante, et d) en déduire si le sujet est atteint de ladite pathologie.
La méthode de diagnostic susmentionnée est de préférence une méthode ex vivo.
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside) ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante, et d) en déduire si le sujet est atteint de ladite pathologie.
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, une composition C1 ou C2 telle que définie ci-dessus ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante, et d) en déduire si le sujet est atteint de ladite pathologie.
Selon un mode de réalisation, les étapes a) à d) peuvent être effectuées pour deux échantillons identiques du même sujet en parallèle avec d’un côté une composition C1 et de l’autre une composition C2.
Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic susmentionnée comprend la mise en œuvre de la composition susmentionnée, notamment comprenant les sondes (1), (2) et (3), pour le diagnostic des cancers.
Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic susmentionnée comprend la mise en œuvre de la composition susmentionnée comprenant les sondes (1), (2), (3) et (4), pour le diagnostic des cancers.
Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic susmentionnée comprend la mise en œuvre de la composition susmentionnée comprenant les sondes (1), (2), (3), (4) et (6), pour le diagnostic des cancers.
Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic susmentionnée comprend la mise en œuvre de la composition C1 ou C2 susmentionnée, pour le diagnostic des cancers.
Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic susmentionnée comprend la mise en œuvre de la composition susmentionnée comprenant les sondes (1), (2), (3) et (5), pour le diagnostic d’infections virales et bactériennes et de maladies inflammatoires chroniques comme l’arthrose ou le diabète.
Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic susmentionnée comprend la mise en œuvre de la composition C1 ou C2 susmentionnée, pour le diagnostic d’infections virales et bactériennes et de maladies inflammatoires chroniques comme l’arthrose ou le diabète.
Sujet
Selon un mode de réalisation, le sujet est un humain ou un animal. Le sujet est de préférence un mammifère, par exemple un sujet humain ou un mammifère non humain, tel qu’un chat, chien, singe, lapin, souris ou rat. Le sujet humain peut être un homme ou une femme de tout âge, tel qu’un nourrisson, un enfant, un adolescent, un adulte ou une personne âgée.
Le sujet est de préférence un sujet souffrant ou à risque de souffrir d’une pathologie telle que définie ci-dessus, notamment d’une maladie inflammatoire.
Un sujet à risque de souffrir d’une maladie inflammatoire est par exemple un sujet présentant des antécédents familiaux de maladie inflammatoire, ayant déjà souffert d’au moins une maladie inflammatoire, présentant des facteurs de risques génétiques, métaboliques et/ou liés au mode de vie et/ou présentant au moins un symptôme pouvant être précurseur d’une maladie inflammatoire.
Echantillon biologique
L’échantillon biologique est de préférence obtenu d’un sujet tel que défini ci- dessus. L’échantillon biologique est de préférence choisi dans le groupe constitué des échantillons de plasma, de sang, de tissus, de salive, d’urine, de liquide céphalorachidien et de biopsies dudit sujet.
L’étape a) consiste à mettre en présence un échantillon biologique obtenu d’un sujet avec la composition selon l’invention, notamment le cocktail de sondes tel que défini plus haut. Cette mise en présence est effectuée en ajoutant la composition de l’invention (ou cocktail de sondes) dans ledit échantillon biologique, par tout moyen bien connu de l’homme du métier.
Par exemple, la composition est ajoutée dans un récipient contenant ledit échantillon, par exemple échantillon de plasma ou de sang.
L’addition de la composition de l’invention dans un échantillon biologique peut être effectuée directement dans l’échantillon biologique ou après traitement de l’échantillon biologique.
Selon un mode de réalisation, l’échantillon biologique, de préférence d’un volume de 1 mL pour les fluides et de plusieurs centaines de grammes pour les tissus, est maintenu, après l’addition de ladite composition, à -20°C jusqu’à l’analyse correspondant à l’étape de mesure b) de la méthode susmentionnée. Il ne devra pas être décongelé avant analyse.
Selon un mode de réalisation, l’échantillon biologique obtenu du sujet est additionné également d’une solution tampon comme par exemple un tampon acétate (notamment pH 5,5, 0,1 mol/L, contenant un mélange d’acétate de sodium et d’acide acétique), utilisé pour détecter les enzymes marqueurs des tumeurs solides dans les échantillons biologiques.
Selon un mode de réalisation, l’échantillon biologique obtenu du sujet est additionné également d’un inhibiteur de protéases (par exemple Complété mini EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roche). A titre d’exemple, pour détecter les enzymes marqueurs des tumeurs solides dans les échantillons biologiques, l’inhibiteur de protéase, préparé avec de l’eau UP à une concentration de 7 X, est utilisé à une concentration finale 1 X.
Ainsi, cette étape a) peut être précédée d’une étape de traitement de l’échantillon biologique.
Par « traitement de l’échantillon biologique », on désigne ici au moins une étape de traitement, par exemple sélectionnée dans le groupe consistant en une centrifugation, un cycle de congélation puis décongélation et une mise en suspension dans un tampon.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention comprend est préparée en ajoutant les sondes susmentionnées dans une solution tampon, notamment telle que définie plus haut, de préférence à une concentration comprise entre 10-3 mol/L et 10-7 mol/L. De préférence, les sondes sont ajoutées avec un volume compris entre 10 pL et 200 mI_ pour obtenir un volume total d’échantillon compris entre 25 mI_ et 300 mI_ (volume total incluant de 10 pL à 250 pL de tampon, de 10 pL à 250 pL de fluide biologique ou de 5 mg à 5 000 mg de tissu, et de 1 pL à 35 pL d’inhibiteur 1X de protéases).
Selon un mode de réalisation, l’échantillon dans sa globalité (c’est-à-dire incluant l’échantillon biologique, les sondes et éventuellement la solution tampon et l’inhibiteur de protéases) est inséré dans un vial en matériau inerte fermé hermétiquement, comme par exemple un vial de 2 ml_ avec bouchon hermétique avec insert.
Par exemple, pour le diagnostic de tumeurs à partir d’échantillons de plasma, les sondes (1 -4) sont au préalable préparées dans le tampon susmentionné à une concentration de 5.105 mol/L, et ajoutées avec un volume de 10 pL pour obtenir un volume total d’échantillon de 100 pL (volume total incluant 62 pL de tampon, 25 pL de fluide biologique et 3 pL d’inhibiteur de protéases). L’échantillon dans sa globalité est par exemple inséré dans un vial de 2 mL avec bouchon hermétique avec insert. L’étape b) consiste à mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse. L’éthanol marqué est l’éthanol libéré provenant des sondes susmentionnées et contenant donc la partie éthyle marquée telle que définie ci- dessus.
Selon un mode de réalisation, cette étape de mesure est effectuée sur au moins trois points de cinétique compris entre 0 et 8h après l’étape a) correspondant à l’addition de la composition de l’invention. Un point de cinétique correspond à une mesure effectuée à un instant t pour un même échantillon préparé dans des conditions identiques. Pour obtenir trois points de cinétique, on prépare trois échantillons biologiques identiques comme expliqué plus haut, dans lesquels on ajoute, dans des conditions identiques, le cocktail de sondes selon l’invention tel que défini plus haut, et on effectue ensuite l’étape de mesure b) selon l’invention à trois instants distincts, t1 , t2 et t3 espacés dans le temps.
Ainsi, par exemple, une mesure est effectuée 2h après l’étape a), une autre mesure est effectuée 4h après l’étape a) et une dernière mesure est effectuée 7h après l’étape a). Ces points de cinétique sont obtenus en effectuant les mesures dans 3 flacons distincts contenant le même échantillon biologique et la même composition selon l’invention. Ces points de cinétique, réalisés au moins en duplicata, permettent ensuite d’obtenir une courbe enzymatique utile pour l’étape de conclusion concernant le diagnostic, comme expliqué plus loin.
Après mise en présence des sondes dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif avec l’échantillon biologique, si cet échantillon biologique contient au moins une des enzymes ciblées par lesdites sondes, les sondes seront alors coupées par les enzymes par hydrolyse, ce qui libérera la partie -O-Et desdites sondes comme expliqué plus haut et donc aboutira à la libération en phase gazeuse d’éthanol comprenant au moins un isotope non radioactif.
Par exemple, la sonde (1 ) susmentionnée permet la libération d’éthanol marqué sous la forme CD3-CD2-OH, la sonde (2) susmentionnée permet la libération d’éthanol marqué sous la forme CD3-13CD2-OH, la sonde (3) susmentionnée permet la libération d’éthanol marqué sous la forme CH3-CD2-OH, la sonde (4) susmentionnée permet la libération d’éthanol marqué sous la forme CD3-CHD-OH, la sonde (5) susmentionnée permet la libération d’éthanol marqué sous la forme CD3-CD2-OH et la sonde (6) susmentionnée permet la libération d’éthanol marqué sous la forme 13CD3-13CD2-OH. Comme expliqué plus haut, les sondes de la composition de l’invention sont hydrolysées sélectivement dans les tissus lésés via l’activité d’enzymes spécifiques de ces milieux. L’éthanol marqué ainsi libéré devient un marqueur exogène caractéristique du métabolisme du tissu lésé et est détecté ex vivo dans l’échantillon biologique. Si l’échantillon biologique est celui d’un sujet sain, cet échantillon ne contenant pas les enzymes ciblées, les sondes de la composition ne seront donc pas hydrolysées et donc aucune libération d’éthanol marqué ne sera obtenue et ne pourra donc être mesurée.
Selon un mode de réalisation, l’échantillon biologique est dans un contenant ou récipient comme un flacon ou vial, et, dans le cadre de l’étape a), la composition est ajoutée dans ledit contenant ou récipient, puis ledit contenant ou récipient est fermé hermétiquement.
Selon un mode de réalisation, le contenant ou récipient est agité par exemple au vortex avant la mise en œuvre de l’étape b) de mesure de la quantité d’éthanol libéré en phase gazeuse.
La mesure de la quantité d’éthanol libéré en phase gazeuse lors de l’étape b) peut être effectuée par tout moyen ou toute méthode de mesure bien connu(e) de l’homme du métier pour mesurer la quantité ou concentration d’éthanol marqué dans une phase gazeuse comme par exemple la microextraction de la phase solide (SPME). Selon un mode de réalisation, l’étape b) comprend une mesure par chromatographie en phase gazeuse (GC) couplée à un triple quadripôle équipé d’une source El (GC-TQMS), ou chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse haute résolution (GC-QTOFMS), ou un nez artificiel.
Après l’étape b) de mesure de la quantité d’éthanol marqué libéré, on compare les valeurs ainsi obtenues avec une valeur contrôle standard correspondante.
Dans l’étape c), les résultats obtenus à l’étape b) sont comparés avec une valeur contrôle standard correspondante.
Les résultats obtenus à l’étape b) sont la quantité, concentration et/ou proportion d’éthanol marqué libéré dans la phase gazeuse, après addition de la composition de l’invention dans l’échantillon biologique.
Le terme « correspondante » dans l’expression « valeur contrôle standard correspondante » signifie que la quantité, concentration et/ou proportion mesurée dans l’échantillon biologique pour l’éthanol marqué est comparée à une valeur contrôle standard de la quantité, concentration et/ou proportion d’éthanol.
Si c’est la quantité d’éthanol qui est mesurée dans l’échantillon biologique, la valeur contrôle standard est une quantité.
Si c’est la concentration d’éthanol qui est mesurée dans l’échantillon biologique, la valeur contrôle standard est une concentration.
Si c’est la proportion d’éthanol qui est mesurée dans l’échantillon biologique, la valeur contrôle standard est une proportion.
Une valeur de contrôle standard, appelée également valeur de référence, peut par exemple être la moyenne, la valeur seuil maximale et/ou la valeur seuil minimale de la quantité, concentration ou proportion d’éthanol mesurée dans un échantillon provenant d’un sujet sain (après mise en œuvre des étapes a) et b) susmentionnées), ou encore la moyenne, la valeur seuil maximale et/ou la valeur seuil minimale de la quantité, concentration ou proportion d’éthanol mesurée dans un échantillon blanc, c’est-à-dire dans un échantillon dans lequel la composition de l’invention a été ajoutée mais ne contenant pas les enzymes cibles.
Les valeurs mesurées dans les échantillons de sujets sains ou dans les échantillons blancs sont effectuées en utilisant une méthode de mesure similaire à celle utilisée pour l’échantillon biologique.
Deux méthodes de mesure sont similaires si, mises en œuvre sur un même échantillon, elles donnent un résultat identique ou similaire. A cet égard, le calcul du coefficient de variation (C V) est une mesure importante de la fiabilité de la méthode qui est acceptable si CV £ 20%.
La valeur seuil minimale et la valeur seuil maximale définissent un intervalle de référence. L’intervalle de référence est généralement défini de manière à comprendre 95% des valeurs obtenues dans la population de référence.
Par sujets ou individus sains, on désigne des sujets ou individus présentant un bon état de santé général, notamment n’étant pas atteints des pathologies telles que définies plus haut.
La valeur contrôle standard d’éthanol peut être la moyenne, la valeur seuil maximale et/ou la valeur seuil minimale de la quantité, concentration ou proportion d’éthanol mesurée dans les échantillons provenant d’individus sains, les échantillons ayant été additionnés de la composition ou cocktail de sondes selon l’invention.
Une valeur contrôle standard peut par exemple correspondre à la moyenne des valeurs obtenues dans les échantillons provenant de 10 sujets sains. Un sujet sera alors considéré comme sain lorsque la valeur en éthanol mesurée comme expliqué plus haut sera comprise dans l’écart-type par rapport à la moyenne des valeurs pour les sujets sains sur l’ensemble des points de cinétique tel qu’expliqué ci-dessus.
Dans l’étape d), il est déduit si le sujet est atteint ou non de la pathologie susmentionnée.
En particulier, si la quantité, concentration et/ou proportion de la quantité d’éthanol marqué mesuré est supérieure à une valeur contrôle standard correspondante (en particulier à la valeur seuil maximale ou à une valeur fixée), il en est déduit la présence d’au moins une enzyme ciblée par les sondes définies ci- dessus, et donc que le sujet est atteint d’une pathologie telle que définie ci-dessus.
L’écart-type des valeurs pour les sujets malades ne devra pas se superposer avec l’écart-type des valeurs pour les sujets sains sur au moins un des points de cinétique (comme expliqué plus haut) pour considérer l’enzyme ciblée comme marqueur de la pathologie.
Un sujet est alors considéré comme malade lorsque sa valeur mesurée en éthanol est comprise dans l’écart-type par rapport à la moyenne des valeurs mesurées pour les sujets malades sur au moins un des points de cinétique. Cette valeur devra être supérieure d’au moins 1 ,3 fois par rapport à la moyenne des valeurs mesurées pour les sujets sains sur au moins un des points de cinétique.
Selon un mode de réalisation, lorsqu’à l’issue de l’étape d), il est conclu que le sujet est atteint de la pathologie susmentionnée, une étape supplémentaire peut être mise en œuvre consistant en une étape de traitement dudit sujet, par exemple par l’administration audit sujet d’une quantité pharmaceutiquement acceptable d’un composé ou d’une composition destinée au traitement de ladite pathologie.
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon sanguin dudit sujet, une composition comprenant : - soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside) ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante, et d) en déduire si le sujet est atteint de ladite pathologie.
Selon un mode de réalisation, l’étape a) consiste à ajouter, dans un échantillon sanguin du sujet, une composition C1-2 ou C2-2.
Selon un mode de réalisation, l’étape a) consiste à ajouter, dans un premier échantillon sanguin du sujet, une composition C1-2 et, dans un deuxième échantillon sanguin du même sujet, une composition C2-2.
Méthode de suivi de l’efficacité d’un traitement curatif ou préventif d’une pathologie
La présente invention concerne également une méthode de suivi de l’efficacité d’un traitement curatif ou préventif d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter une composition comprenant :
- au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- au moins de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; et
- au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; dans un échantillon biologique dudit sujet à un instant t au cours dudit traitement, b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante et/ou avec une valeur correspondante obtenue avant le début du traitement ou à un instant t’ au cours du traitement qui est antérieur à l’instant t, d) en déduire si le traitement est efficace, et e) optionnellement, répéter les étapes a) à d).
La présente invention concerne également une méthode de suivi de l’efficacité d’un traitement curatif ou préventif d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside) ; dans un échantillon biologique dudit sujet à un instant t au cours dudit traitement, b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante et/ou avec une valeur correspondante obtenue avant le début du traitement ou à un instant t’ au cours du traitement qui est antérieur à l’instant t, d) en déduire si le traitement est efficace, et e) optionnellement, répéter les étapes a) à d).
La pathologie est en particulier telle que définie ci-dessus dans la section « pathologies ». De préférence, la pathologie est une maladie inflammatoire, et préférentiellement un cancer.
L’échantillon biologique est un échantillon provenant d’un sujet, notamment tel que défini ci-dessus dans la section « échantillon biologique ». De préférence, l’échantillon biologique est un échantillon sanguin, de plasma ou de biopsies. Le sujet est en particulier tel que défini ci-dessus dans la section « sujet ».
Le traitement curatif ou préventif peut comprendre un traitement curatif ou préventif de la pathologie susmentionnée et/ou un traitement curatif ou préventif d’une inflammation telle que définie plus haut.
Le traitement curatif ou préventif d’une pathologie impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, d’une maladie inflammatoire chronique ou d’une infection aigüe est par exemple un traitement curatif ou préventif bien connu de l’homme du métier pour ces pathologies.
Le traitement curatif ou préventif de la pathologie peut par exemple comprendre le retrait chirurgical du tissu malin, l’administration d’une chimiothérapie, d’un immunomodulateur, d’une trithérapie, d’un traitement antibiotique adapté, ou encore d’une assistance respiratoire.
Les caractéristiques des étapes a) et b) sont de manière générale telles que définies pour les étapes a) et b) définies dans la section « méthode de diagnostic ».
Dans la méthode de suivi de l’efficacité d’un traitement définie ci-dessus, l’étape b) comprend de mesurer la quantité, concentration et/ou proportion d’éthanol marqué dans un échantillon biologique dudit sujet à un instant t au cours du traitement.
En d’autres termes, la mesure est effectuée dans un échantillon biologique provenant d’un prélèvement effectué à l’instant t.
Dans l’étape c), les résultats obtenus à l’étape b) sont comparés avec une valeur contrôle standard correspondante et/ou avec une valeur correspondante obtenue avant le début dudit traitement ou à un instant au cours du traitement t’ qui est antérieur à l’instant t.
Par « valeur correspondante obtenue avant le début dudit traitement », on entend la quantité, concentration et/ou proportion d’éthanol marqué correspondant mesurée dans un échantillon biologique dudit sujet, ledit échantillon ayant été prélevé avant le début du traitement.
Par « valeur correspondante obtenue à un instant au cours du traitement qui est antérieur à l’instant t », on entend la quantité, concentration et/ou proportion d’éthanol marqué correspondante mesurée dans un échantillon biologique dudit sujet, ledit échantillon ayant été prélevé après le début du traitement, mais avant l’instant t.
Dans l’étape d), il en est déduit si le traitement est efficace. Le traitement est par exemple efficace si la quantité d’éthanol marqué mesurée diminue ou disparaît.
Par exemple, le traitement est efficace si sa quantité, concentration et/ou proportion mesurée à l’instant t est inférieure à une valeur correspondante obtenue avant le début dudit traitement ou à un instant t’ au cours du traitement qui est antérieur à l’instant t.
Par exemple, le traitement n’est pas efficace si la quantité, concentration et/ou proportion d’éthanol marqué mesurée à l’instant t est supérieure à une valeur correspondante obtenue avant le début dudit traitement ou à un instant t’ au cours du traitement qui est antérieur à l’instant t.
Si le traitement n’est pas efficace, la méthode peut comprendre l’administration d’un nouveau traitement ou d’un traitement complémentaire.
La méthode peut comprendre une étape e) dans laquelle sont répétées les étapes a) à d), en particulier que le traitement soit efficace ou non.
Les étapes a) à d) peuvent être répétées une fois, deux fois, trois fois ou au moins trois fois.
Les étapes a) à d) peuvent par exemple être répétées jusqu’à la guérison du sujet ou la stabilisation de la pathologie.
La période entre deux répétitions peut par exemple être d’au moins une semaine, au moins deux semaines, au moins trois semaines, au moins quatre semaines, au moins deux mois, au moins trois mois, au moins quatre mois, au moins cinq mois, six mois ou au moins six mois, par exemple un an.
La méthode de suivi de l’efficacité d’un traitement curatif ou préventif peut est mise en œuvre à chaque initiation d’un nouveau traitement ou d’un traitement complémentaire.
Un sujet est considéré comme guéri lorsque la valeur en éthanol mesurée selon l’étape b) est comprise dans l’écart-type par rapport à la moyenne des sujets sains sur l’ensemble des points de cinétique (comme expliqué plus haut dans le paragraphe concernant la méthode de diagnostic).
Méthode de suivi de l’évolution d’une pathologie
La présente invention concerne également une méthode de suivi de l’évolution d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, à un instant t1 , une composition comprenant :
- au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- au moins de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; et
- au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, pour l’échantillon à l’instant t1, c) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, à un instant t2 séparé dans le temps par rapport à l’instant t1, la composition telle que définie à l’étape a), d) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, pour l’échantillon à l’instant t2, e) comparer les valeurs obtenues aux étapes b) et d) aux instants t1 et t2 respectivement, f) en déduire si la pathologie évolue favorablement, et g) optionnellement, répéter les étapes a) à f).
La présente invention concerne également une méthode de suivi de l’évolution d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, à un instant t1 , une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; - soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside) ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, pour l’échantillon à l’instant t1 , c) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, à un instant t2 séparé dans le temps par rapport à l’instant t1, la composition telle que définie à l’étape a), d) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, pour l’échantillon à l’instant t2, e) comparer les valeurs obtenues aux étapes b) et d) aux instants t1 et t2 respectivement, f) en déduire si la pathologie évolue favorablement, et g) optionnellement, répéter les étapes a) à f).
La pathologie est en particulier telle que définie ci-dessus dans la section « pathologies ». De préférence, la pathologie est une maladie inflammatoire, et préférentiellement un cancer.
L’échantillon biologique est un échantillon provenant d’un sujet, notamment tel que défini ci-dessus dans la section « échantillon biologique ». De préférence, l’échantillon biologique est un échantillon sanguin, de plasma ou de biopsies.
Le sujet est en particulier tel que défini ci-dessus dans la section « sujet ».
Les caractéristiques des étapes a) à d) sont de manière générale telles que définies pour les étapes a) et b) définies dans la section « méthode de diagnostic ».
Dans la méthode de suivi de l’évolution d’une pathologie définie ci-dessus, les étapes b) et d) consistent à mesurer la quantité, concentration et/ou proportion d’éthanol marqué dans un échantillon biologique du sujet à deux instants t1 et t2 séparés dans le temps.
En d’autres termes, la mesure est effectuée dans un échantillon biologique provenant d’un prélèvement effectué à l’instant t1 , ainsi que dans un échantillon biologique provenant d’un prélèvement effectué à l’instant t2, l’instant t1 étant antérieur à l’instant t2.
L’intervalle de temps entre t1 et t2 est par exemple d’au moins une semaine, au moins deux semaines, au moins trois semaines, au moins quatre semaines, au moins deux mois, au moins trois mois, au moins quatre mois, au moins cinq mois, six mois ou au moins six mois, par exemple un an. Dans l’étape e), les résultats obtenus à l’étape a), à l’instant t1 et à l’instant t2 sont comparés entre eux.
Dans l’étape f), il en est déduit si la pathologie évolue favorablement.
La pathologie évolue favorablement, par exemple si la quantité d’éthanol libéré diminue entre l’instant t1 et t2.
La pathologie n’évolue pas favorablement, par exemple si la quantité d’éthanol libéré est égale ou augmente entre l’instant t1 et t2.
L’évolution de la maladie est considérée comme très favorable lorsque la valeur en éthanol mesurée pour l’échantillon est comprise dans l’écart-type par rapport à la moyenne des valeurs pour les sujets sains sur l’ensemble des points de cinétique (comme expliqué plus haut dans le paragraphe concernant la méthode de diagnostic).
L’évolution de la maladie est considérée comme très défavorable lorsque la valeur en éthanol mesurée pour l’échantillon est comprise à l’écart-type ou supérieure à l’écart-type par rapport à la moyenne des valeurs des sujets malades sur au moins un des points de cinétique (comme expliqué plus haut dans le paragraphe concernant la méthode de diagnostic). Cette valeur est supérieure d’au moins 1 ,3 fois par rapport à la moyenne des sujets sains sur au moins un des points de cinétique.
La méthode peut comprendre un étape g) dans laquelle sont répétées les étapes a) à f), en particulier que la pathologie évolue favorablement ou non.
Les étapes a) à f) peuvent être répétées une fois, deux fois, trois fois ou au moins trois fois.
Les étapes a) à f) peuvent par exemple être répétées jusqu’à la guérison du sujet ou la stabilisation de la pathologie.
Les étapes a) à d) peuvent être répétées à intervalle de temps régulier ou non.
La période entre deux répétitions peut par exemple être d’au moins une semaine, au moins deux semaines, au moins trois semaines, au moins quatre semaines, au moins deux mois, au moins trois mois, au moins quatre mois, au moins cinq mois, six mois ou au moins six mois, par exemple un an.
Méthode de stratification d’un sujet souffrant ou à risque de souffrir d’une pathologie
La présente invention concerne également une méthode de stratification d’un sujet souffrant d’une pathologie dans une catégorie C-1 de sujets atteints de ladite pathologie à un degré de sévérité ou dans une catégorie C-2 de sujets atteints de ladite pathologie à un autre degré de sévérité, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, une composition comprenant :
- au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- au moins de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; et
- au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante, et d) en déduire si le sujet est dans la catégorie C-1 ou dans la catégorie C-2.
La présente invention concerne également une méthode de stratification d’un sujet souffrant d’une pathologie dans une catégorie C-1 de sujets atteints de ladite pathologie à un degré de sévérité ou dans une catégorie C-2 de sujets atteints de ladite pathologie à un autre degré de sévérité, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside) ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante, et d) en déduire si le sujet est dans la catégorie C-1 ou dans la catégorie C-2.
La pathologie est en particulier telle que définie ci-dessus dans la section « pathologies ». De préférence, la pathologie est une maladie inflammatoire, et préférentiellement un cancer.
L’échantillon biologique est un échantillon provenant d’un sujet, notamment tel que défini ci-dessus dans la section « échantillon biologique ». De préférence, l’échantillon biologique est un échantillon sanguin, de plasma ou de biopsies.
Le sujet est en particulier tel que défini ci-dessus dans la section « sujet ».
Les caractéristiques des étapes a) à c) sont de manière générale telles que définies pour les étapes a) et b) définies dans la section « méthode de diagnostic ».
Kit et utilisation pour le diagnostic
La présente invention concerne également un kit pour le diagnostic d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ledit kit comprenant une composition comprenant :
- au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- au moins de l’éthyl-/V-acétylglucosamide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ; et
- au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif.
La présente invention concerne également un kit pour le diagnostic d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ledit kit comprenant une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside).
La présente invention concerne également un kit pour le diagnostic d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ledit kit comprenant une composition C1 ou C2 telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également l’utilisation du kit susmentionné pour le diagnostic d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües.
FIGURES
La Figure 1 représente la droite d’étalonnage de la détection de la b- glucuronidase en présence de la sonde D5-éthyl^-D-glucuronide et performances de la méthode analytique GC-MSMS (LOD, LOQ et R2).
La Figure 2 représente la droite d’étalonnage de la détection de la b- glucuronidase en présence du glucuronide de para-nitrophénol et performances de la méthode de détection UV (LOD, LOQ et R2).
La Figure 3 représente la cinétique de détection d’éthanol-D5 libéré dans l’headspace des plasmas de patients après ajout de la sonde D5-éthyl^-D- glucuronide.
La Figure 4 représente la cinétique de détection d’éthanol-D5 libéré dans l’headspace de plasmas de patientes ayant des tumeurs de taille différentes après ajout de la sonde D5-éthyl^-D-glucuronide.
La Figure 5 représente la détection d’éthanol-D5 dans l’headspace de prélèvements tissulaires murins en fonction de la concentration de sonde Ds-éthyl-b- D-glucuronide ajoutée (10-9 M).
La Figure 6 représente la quantité d’éthanol-D5 et d’éthanol-13C-D5 libérée après hydrolyse de chaque sonde en présence de leur enzyme cible. b-Glucuronidase (enzyme 1 ) et D5-éthyl^-D-glucuronide (sonde 1 ). N-Acétyl-glucosaminidase (enzyme 2) et 13C-D5-éthyl-N-acetylglucosamine (sonde 2).
La Figure 7 représente la quantité d’éthanol-D5 et d’éthanol-13C-D5 libérée après hydrolyse de chaque sonde en présence de leur enzyme partenaire. N-Acétyl- glucosaminidase (enzyme 2) et D5-éthyl^-D-glucuronide (sonde 1). b-Glucuronidase (enzyme 1) et 13C-D5-éthyl-N-acetylglucosamine (sonde 2).
La figure 8 représente la quantité d’éthanol-D5 et d’éthanol-13C-D5 libérée lorsque les deux sondes sont mises en présence de l’une ou l’autre des enzymes b- Glucuronidase (enzyme 1 ), D5-éthyl^-D-glucuronide (sonde 1) et 13C-D5-éthyl-N- acetylglucosamine (sonde 2). N-Acétyl-glucosaminidase (enzyme 2), D5-éthyl^-D- glucuronide (sonde 1 ) et 13C-D5-éthyl-N-acetylglucosamine (sonde 2).
La figure 9a représente la quantité d’éthanol-D5 libérée après hydrolyse du D5- éthyl^-D-glucuronide ciblant la b-glucuronidase (n=4 patients sains, n=3 patients atteints d’un cancer du sein, n=3 patients atteints d’un cancer du poumon). La figure 9b représente la quantité d’éthanol-D4 libérée après hydrolyse du D4-éthyl-1-a-L- fucopyranoside ciblant Ga-L-fucosidase (n=2 patients sains, n=1 patient atteint d’un cancer du sein, n=1 patient atteint d’un cancer du poumon). La figure 9c représente la quantité d’éthanol-13CD5 libérée après hydrolyse du 13CD5-éthyl-N- acetylglucosamine ciblant la N-acétyl-glucosaminidase (n=4 patients sains, n=3 patients atteints d’un cancer du sein, n=3 patients atteints d’un cancer du poumon). La figure 9d représente la quantité d’éthanol-D2 libérée après hydrolyse du D2-éthyl- b-D-galactopyranoside ciblant la b-D-galactosidase (n=4 patients sains, n=3 patients atteints d’un cancer du sein, n=3 patients atteints d’un cancer du poumon).
La figure 10a représente la quantité d’éthanol-D5 expirée par les animaux après injection de 10 pg.kg-1 de D5-éthyl^-D-glucuronide. La figure 10b représente la quantité d’éthanol-D4 expirée par les animaux après injection de 100 pg.kg-1 de D4- éthyl-1-a-L-fucopyranoside. La figure 10c représente la quantité d’éthanol-13CD5 expirée par les animaux après injection de 10 pg.kg-1 de 13CD5-éthyl-N- acetylglucosamine. La figure 10d représente la quantité d’éthanol-D2 expirée par les animaux après injection de 1 pg.kg-1 de D2-éthyl^-D-galactopyranoside.
La figure 11 représente les droites d’étalonnage présentant l’intensité de signal de l’éthanol-D5 en fonction de l’activité (U.L 1) de Ga-mannosidase en présence de la sonde D5-éthyl-a-mannopyranoside (103M) et les performances du concept de sonde à COV pour la détection de cette enzyme (LOD et R2). Les droites ont été tracées pour trois points de cinétique différents (2, 4 et 7h de réaction). Chaque point a été réalisé en duplicat. La figure 11 a correspond au point de cinétique 2h à 2h30, la figure 11 b correspond au point de cinétique 4h à 4h30 et la figure 11c correspond au point de cinétique 7h à 7h30.
La figure 12 représente les droites d’étalonnage présentant l’intensité de signal de l’éthanol-D2 en fonction de l’activité (U.L 1) de la b-galactosidase en présence de la sonde D2-éthyl^-D-galactopyranoside (104M) et les performances du concept de sonde à COV pour la détection de cette enzyme (LOD et R2). Les droites ont été tracées pour trois points de cinétique différents (2, 4 et 7h de réaction). Chaque point a été réalisé en duplicat. La figure 12a correspond au point de cinétique 2h à 2h30, la figure 12b correspond au point de cinétique 4h à 4h30 et la figure 12c correspond au point de cinétique 7h à 7h30.
La figure 13 représente les droites d’étalonnage présentant l’intensité de signal de l’éthanol-13CD5 en fonction de l’activité (U.L 1) de la /V-acétyl-glucosaminidase en présence de la sonde 13C-D5-éthyl-/V-acétylglucosamide (103M) et les performances du concept de sonde à COV pour la détection de cette enzyme (LOD et R2). Les droites ont été tracées pour trois points de cinétique différents (2, 4 et 7h de réaction). Chaque point a été réalisé en duplicat. La figure 13a correspond au point de cinétique 2h à 2h30, la figure 13b correspond au point de cinétique 4h à 4h30 et la figure 13c correspond au point de cinétique 7h à 7h30.
La figure 14a représente la quantité d’éthanol-D5 détectée au-dessus des biopsies en présence de 10-7 M de D5-éthyl^-D-glucuronide. La figure 14b représente la quantité d’éthanol-D détectée au-dessus des biopsies en présence de 10-4 M de D4-éthyl-1 -a-L-fucopyranoside. La figure 14c représente la quantité d’éthanol-13CD5 détectée au-dessus des biopsies en présence de 10-8 M de 13CD5-éthyl-N- acetylglucosamine. La figure 14d représente la quantité d’éthanol-D2 détectée au- dessus des biopsies en présence de 10_6 M de D2-éthyl^-D-galactopyranoside
La figure 15 concerne la cinétique d’hydrolyse des sondes à base de COVs (n=7 patients sains ; ligne pleine = blanc; ligne pointillée = moyenne des réponses des prélèvements sanguins réservés 30 min à température ambiante avant traitement : sain-TO ; ligne tiret = moyenne des réponses des prélèvements sanguins réservés 5h à 4°C avant traitement : sain-T2). La figure 15a représente la quantité d’éthanol-D5 libérée après hydrolyse du D5-éthyl^-D-glucuronide ciblant la b- glucuronidase. La figure 15b représente la quantité d’éthanol-D libérée après hydrolyse du D4-éthyl-1-a-L-fucopyranoside ciblant l’a-L-fucosidase. La figure 15c représente la quantité d’éthanol-13CD5 libérée après hydrolyse du 13CD5-éthyl-N- acetylglucosamine ciblant la N-acétyl-glucosaminidase. La figure 15d représente la quantité d’éthanol-D2 libérée après hydrolyse du D2-éthyl^-D-galactopyranoside ciblant la b-D-galactosidase. La figure 15e représente la quantité d’éthanol-D5 libérée après hydrolyse du D5-éthyl-a- mannopyranoside ciblant l’a-mannosidase. La figure 15f représente la quantité d’éthanol-D4 libérée après hydrolyse du D4-éthyl-a-D- glucuronide ciblant Ga-D-glucosidase.
La figure 16 concerne l’efficacité pronostique des sondes à base de COVs lors d’une infection au SARS-COV-2 (n=10 patients légèrement symptomatiques : groupe A, n=10 patients fortement symptomatiques : groupe B, n=10 patients fortement symptomatiques admis en réanimation : groupe C). La figure 16a représente la quantité d’éthanol-D5 libérée après hydrolyse du D5-éthyl^-D-glucuronide ciblant la b-glucuronidase. La figure 16b représente la quantité d’éthanol-D libérée après hydrolyse du D4-éthyl-1-a-L-fucopyranoside ciblant l’a-L-fucosidase. La figure 16c représente la quantité d’éthanol-13CD5 libérée après hydrolyse du 13CD5-éthyl-N- acetylglucosamide ciblant la N-acétyl-glucosaminidase. La figure 16d représente la quantité d’éthanol-D2 libérée après hydrolyse du D2-éthyl^-D-galactopyranoside ciblant la b-D-galactosidase. La figure 16e représente la quantité d’éthanol-D5 libérée après hydrolyse du D5-éthyl-a-mannopyranoside ciblant l’a-mannosidase. La figure 16f représente la quantité d’éthanol-D4 libérée après hydrolyse du D4-éthyl-a-D- glucuronide ciblant l’a-D-glucosidase.
La figure 17 concerne l’évolution de l’activité de marqueurs enzymatiques détectés via des sondes à base de COVs lors d’une infection au SARS-COV-2 (n=10 patients légèrement symptomatiques : groupe A, n=10 patients fortement symptomatiques : groupe B, n=10 patients fortement symptomatiques admis en réanimation : groupe C). La figure 17a représente la quantité d’éthanol-D5 libérée après hydrolyse du D5-éthyl^-D-glucuronide ciblant la b-glucuronidase. La figure 17b représente la quantité d’éthanol-D4 libérée après hydrolyse du D4-éthyl-1-a-L- fucopyranoside ciblant l’a-L-fucosidase. La figure 17c représente la quantité d’éthanol-13CD5 libérée après hydrolyse du 13CD5-éthyl-N-acetylglucosamide ciblant la N-acétyl-glucosaminidase. La figure 17d représente la quantité d’éthanol-D2 libérée après hydrolyse du D2-éthyl^-D-galactopyranoside ciblant la b-D-galactosidase. La figure 17e représente la quantité d’éthanol-D5 libérée après hydrolyse du D5-éthyl-a- mannopyranoside ciblant l’a-mannosidase. La figure 17f représente la quantité d’éthanol-D4 libérée après hydrolyse du D4-éthyl-a-D-glucuronide ciblant l’a-D- glucosidase.
La figure 18 représente les droites d’étalonnage présentant l’intensité de signal de l’éthanol-D4 en fonction de l’activité (U.L 1) de l’a-L-fucosidase en présence de la sonde D -éthyl-1-a-L-fucopyranoside (10_3M) et les performances du concept de sonde à COV pour la détection de cette enzyme (LOD et R2). Les droites ont été tracées pour trois points de cinétique différents (2, 4 et 7h de réaction). Chaque point a été réalisé en duplicat. La figure 18a correspond au point de cinétique 2h à 2h30, la figure 18b correspond au point de cinétique 4h à 4h30 et la figure 18c correspond au point de cinétique 7h à 7h30.
EXEMPLES
Exemple 1 : Optimisation du protocole de détection de marqueurs enzymatiques tumoraux dans des prélèvements sanguins ; validation avec une sonde du cocktail
Une étude ex vivo ayant pour objectif de démontrer la pertinence des sondes de l’invention pour diagnostiquer les cancers solides les plus répandus à partir d’un simple prélèvement sanguin de patients a été effectuée. Cette étude préliminaire a été réalisée avec une des sondes du cocktail, la sonde D5-éthyl^-D-glucuronide (sonde (1) définie ci-dessus), ciblant la b- glucuronidase et libérant après hydrolyse un COV marqué, l’éthanol-D5.
Afin de détecter l’enzyme dans des échantillons de plasma, les conditions optimales d’hydrolyse de la b-glucuronidase au sein même de cette matrice ont été étudiées. Un échantillon de plasma prélevé chez un patient sain a servi à l’optimisation de l’ensemble des conditions. La b-glucuronidase d ’E. coli a été utilisée comme modèle enzymatique. Différents paramètres ont été testés tels que le tampon utilisé (expérience 1), le volume réactionnel (expérience 2), la concentration optimale de sonde à ajouter dans le prélèvement (expérience 3), l’impact de la congélation / décongélation des plasmas sur l’activité de l’enzyme (expérience 4) et enfin l’impact des protéases du plasma sur l’activité de l’enzyme (expérience 5). L’ensemble de ces expériences est résumé dans le tableau 1.
Tableau 1. Optimisation des conditions optimales d’hydrolyse de la b- glucuronidase dans du plasma.
Suivant ce plan expérimental, les conditions optimales d’hydrolyse des sondes en plasma ont été déterminées, comme expliqué ci-après :
Ainsi, un prélèvement de 4-5 ml_ de sang est réalisé chez les patients au moment de leur première consultation avec l’oncologue en charge du dossier. Le plasma (environ 2 mL) en est extrait puis stocké à -20°C jusqu’à analyse. Un aliquot de 25 pL de plasma est prélevé et inséré dans un vial de 2 mL avec insert. Ce prélèvement biologique est additionné de 50 pL solution tampon acétate (pH 5), d’inhibiteur de protéases (1X) et de 25 pL de sonde D5-éthyl^-D-glucuronide à 2.104 M. Après fermeture hermétique et agitation au vortex du vial, un prélèvement SPME (SPME en phase semi-polaire de type Car/PDMS, 1 cm de long et 75 pm d’épaisseur avec une aiguille de 24 ga ; Supelco) de la phase gazeuse au-dessus de l’échantillon d’une durée de 30 min est réalisé après, 2h, 4h et 7h de réaction. Chaque point de cinétique nécessite un vial réactionnel, et est réalisé en duplicat. Les COVs piégés sur la fibre SPME sont ensuite analysé par GC-TQMS. La détection GC-TQMS des isotopes de l’éthanol (inclus donc, l’éthanol-D5) est réalisée avec une chromatographie en phase gazeuse couplée à un triple quadripôle équipé d’une source El (TSQ 9000, Thermo Fisher Scientific). Le système est contrôlé par le logiciel TSQ 9000 et les résultats sont analysés avec le logiciel Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Les conditions d’analyse sont résumées dans le tableau 2.
Tableau 2. Paramètres GC et TQ de la méthode permettant l’analyse des COVs.
Par mesure de contrôle, l’absence d’isotopes de l’éthanol doit être vérifiée dans l’ensemble des vials utilisés pour chaque étude avec sondes à COVs. Ainsi, un prélèvement SPME de 10 min des COVs est réalisé avant le début de l’expérimentation, puis analysé par GC-TQMS. Tous les vials dits « pollués en COVs exogènes tracés » ne sont pas utilisés.
Pour une détection en mode SRM (Selected Reaction Monitoring), les transitions de chaque COV marqué doivent être au préalable optimisées. L’éthanol- D5 est suivi avec les transitions 51 >33 et 51 >49, différentes de celles de l’éthanol non marqué pouvant interférer avec l’analyse (transitions 46>31 et 46>45).
La limite de détection (LOD) d’une enzyme modèle (b-glucuronidase d’E. coli ; solution liquide 50 % de glycérol, 140 U.mL-1 ; Sigma Aldrich) en matrice plasma en présence de la sonde D5-éthyl^-D-glucuronide a ensuite été déterminée. Pour cela, un échantillon plasmatique pour lequel l’activité de la b-glucuronidase endogène n’était pas détectable, a été additionné de concentrations d’enzyme allant de 1.1011 à 1 .10 13 mol.L-1. La quantité d’éthanol-D5 libérée a été suivie avant ajout de sonde puis après 2,5, 4,5 et 7,5 h de réaction à 30 °C. La Figure 1 représente la droite d’étalonnage permettant la détection de b-glucuronidase après 7,5 h de réaction.
La limite de détection de l’enzyme avec la sonde est comprise entre 1 .1013 mol.L-1 (signal sur bruit de 9) et 5.1013 mol.L-1 (signal sur bruit de 37) ce qui amène à une quantité minimale d’enzyme détectable égale à 1.10-18 mol. Cette LOD est 100 fois inférieure à la valeur seuil obtenue suivant la méthode de détection de référence de cette même enzyme (Li et al., 2018, Biotechnology Letters, 40, 11 1- 118 ; Xiao et al., 2020, RSC Advances, 10, 22966). Cette méthode correspond à l’hydrolyse du glucuronide de para-nitrophénol. Elle a été réalisée en tampon acétate (pH > 10), suivie d’une détection UV à 400 nm du para-nitrophénol (Figure 2).
Enfin, comparée à la littérature, l’approche selon la présente invention s’est avérée être 100 à 1 000 fois plus sensible que les stratégies très récentes impliquant des sondes fluorescentes à l’instar du glucuronide de para-nitrophénol (Huo et al. 2018, Sensors and Actuators B: Chemical, 262, 508-515; Guo et al. 2019, Sensors and Actuators B: Chemical, 295, 1 -6). Elle est également 10 fois plus sensible que les analyses protéomiques les plus sensibles (Selevsek et al. 2011 , Proteomics, 11 , 1135-1147).
Après avoir optimisé la stratégie de détection de la b-glucuronidase et évalué les performances de la sonde à COV couplée à la méthode analytique, une étude clinique sur des échantillons de plasma a été réalisée. Le protocole clinique associé a été établi par le CIC (PU/PH R. Robert, INSERM 1402, CHU Poitiers) puis soumis à l'évaluation du Comité de Protection des Personnes du CHU de Poitiers.
Les échantillons sanguins ont été prélevés par le personnel soignant associé au service oncologique, puis collectés et prétraités par le CIC. Cette étude a inclus des échantillons de plasma prélevés chez 11 patients atteints d’un cancer du sein et 11 patients atteints d’un cancer du poumon. Ces patients ont été diagnostiqués, mais n’avaient au moment du prélèvement pas encore reçu de traitement. Leur réponse a été comparée à celle obtenue à partir de plasmas de 4 patients sains. Les résultats ont été comparés à un blanc expérimental dans lequel la sonde a été ajoutée, alors que l’enzyme n’y était pas présente (Figure 3). Après ajout de sonde, la quantité d’éthanol-D5 libérée au-dessus des prélèvements des patients atteints d’un cancer était significativement plus élevée par rapport aux blancs et au plasma du patient sain. Ce test permet donc de discriminer des patients sains de patients atteints d’un cancer.
Il semble que de la quantité d’enzyme présente dans les plasmas des patients ne soit pas corrélée positivement à la taille de la tumeur (Figure 4). Cela étant, d’autres facteurs tels que l’agressivité du cancer ou son stade d’évolution peuvent être étudiés afin de confirmer une corrélation entre ces paramètres physiopathologiques et l’activité de l’enzyme plasmatique.
En outre, suivant les données cliniques et biologiques des patients, il a été démontré que notre stratégie permettait de détecter des tumeurs de taille infracentimétrique, telle que celle découverte fortuitement chez une patiente (courbe avec les losanges, figure 4). Un tel résultat démontre la sensibilité des sondes à COVs pour détecter une tumeur, alors même que l’imagerie n’avait pu confirmer ce diagnostic.
Exemple 2 : Optimisation du protocole de détection de marqueurs enzymatiques tumoraux sur prélèvements tissulaires (biopsies) ; validation avec une sonde du cocktail
L’objectif est ici de développer un protocole permettant de détecter les enzymes cibles dans l’environnement extracellulaire des cellules tumorales, alors qu’elles devraient être absentes, ou avoir une activité limitée, dans l’environnement des cellules saines.
Ce protocole a tout d’abord été mis au point afin de détecter la b-glucuronidase avec la sonde du cocktail correspondante, le D5-éthyl^-D-glucuronide.
Il faut au préalable déterminer la concentration de sonde à ajouter au tissu pour ne détecter que l’enzyme présente dans le milieu extracellulaire.
Ainsi, des essais au cours desquels les biopsies tumorales et saines ont été mises en présence de concentrations décroissantes de D5-éthyl^-D-glucuronide ont été réalisés. La concentration en sonde retenue correspondait à la concentration pour laquelle aucune réponse des tissus sains n’a été obtenue, alors qu’une réponse enzymatique a été observée sur les tissus cancéreux.
Dans le cadre de ce travail, deux biopsies tumorales, prélevées sur des modèles murins, ont été étudiées (MDA-MB-231 : cellules du cancer du sein humain ; KB : cellules du cancer du nasopharynx humain). Deux biopsies de foie murin ont été utilisées comme tissus sains. Des solutions de sonde à 10-7, 10-6, 10-4 et 10-2 M ont été préparées dans un tampon PBS (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HP04, 1 ,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
Les biopsies ont été rincées avec 500 pL de PBS puis placées dans un vial avec insert de 2 mL. Un volume de 297 pL de PBS a été ajouté dans le vial. Les molécules volatiles présentes dans l’headspace du vial ont été piégées pendant 30 min afin de s’assurer de l’absence de détection d’éthanol-D5. Puis, 3 pL de sonde à 107, 106, 104 ou 102 M ont été ajoutés (concentration finale de sonde dans le vial de 109, 108, 106 ou 104 M). Après fermeture hermétique et agitation au vortex du vial, les composés volatils ont été préconcentrés sur fibre SPME (Car/PDMS, Supelco) pendant 30 min puis analysés par GC-TQMS (conditions d’analyse décrites dans le tableau 2).
Par mesure de contrôle, l’absence d’isotopes de l’éthanol doit être vérifiée dans l’ensemble des vials utilisés pour l’étude. Ainsi, un prélèvement SPME de 10 min des COVs est réalisé avant le début de l’expérimentation, puis analysé par GC-TQMS. Tous les vials dits « pollués en COVs exogènes tracés » ne sont pas utilisés.
Malgré des écart-types importants pour les biopsies tumorales, il apparaît clairement qu’une concentration de sonde inférieure à 10_4 M permet de discriminer les tissus sains des tissus cancéreux (Figure 5). En effet, aucune réponse en éthanol- D5 n’a été détectée sur tissus sains pour des concentrations de sonde égales à 10-9, 108 et 106 M, alors qu’à ces concentrations, une libération de cet isotope a été détectée pour les tissus cancéreux. Un tel résultat suggère qu’à ces concentrations, la sonde ne pénétrait pas passivement dans les cellules, et n’était donc pas hydrolysée par la b-glucuronidase lysosomale des cellules tumorales et saines. En revanche, la sonde a bien été hydrolysée par la b-glucuronidase présente dans la matrice extracellulaire des tissus cancéreux. Ainsi, après optimisation de la dose à ajouter au milieu pour chaque sonde appartenant au cocktail, il est possible de cartographier les activités des enzymes cibles directement sur les biopsies tissulaires. Exemple 3 : Essais préliminaires avec un cocktail de quatre sondes à base de COVs selon l’invention
Une seconde sonde, la 13C-D5-éthyl-N-acetylglucosamine (sonde (2) telle que définie ci-dessus) ciblant la N-acétyl-glucosaminidase a été étudiée. Afin de différencier l’éthanol libéré après hydrolyse de cette sonde, de l’éthanol libéré après hydrolyse du D5-éthyl^-D-glucuronide, une méthode d’analyse ciblée par GC-MS/MS (mode SRM) a été développée et les transitions de l’isotope 13C-D5 optimisées (transitions de l’éthanol-13C-D5 : 52>34 et 52>50).
Les performances de détection de ce composé en présence d’éthanol et d’éthanol-D5 ont ensuite été vérifiées. Il a alors été démontré qu’en présence d’éthanol et d’éthanol-D5, la spécificité et la sensibilité de détection de l’éthanol-13C- D5 ne sont en rien altérées. Les gammes de détection de l’éthanol-D5et de l’éthanol- 13C-D5 ont alors été réalisées dans les conditions de prélèvement SPME développées pour les échantillons biologiques (30 min de prélèvement à 30°C). Les deux isotopes étaient présents en mélange en solution. Les limites de détection obtenues sont respectivement de 1.109M et 5.109M. La méthode SPME-GC-TQMS permet donc une différenciation nette des deux isotopes suivant leur fragmentation en masse.
Une étude expérimentale a ensuite été réalisée afin d’évaluer l’affinité du D5- éthyl^-D-glucuronide et de la 13C-D5-éthyl-N-acetylglucosamine pour leur enzyme respective (b-glucuronidase et N-acétyl-glucosaminidase). Pour cela, l’efficacité d'hydrolyse de chacune de ces enzymes a été étudiée en présence de leur sonde respective (Figure 6) puis en présence de la sonde substrat de sa partenaire (Figure 7). Dans le premier cas, chaque enzyme a hydrolysé sa propre sonde, générant ainsi un signal en éthanol marqué (Figure 6). Dans l’autre cas, aucun signal en éthanol n’a été détecté, démontrant que la b-glucuronidase n’hydrolyse pas la 13C-D5-éthyl-N- acetylglucosamine, et qu’inversement, la N-acétyl-glucosaminidase n’hydrolyse pas le D5-éthyl^-D-glucuronide (Figure 7). En présence des deux substrats, chaque enzyme ne donne un signal que pour la sonde qui lui est spécifique (Figure 8).
Cette étude démontre la spécificité des deux enzymes pour leur sonde respective.
Deux sondes supplémentaires, la D2-éthyl^-D-galactopyranoside (sonde (3)) et la D4-éthyl-1 -a-L-fucopyranoside (sonde (4)) ciblant respectivement la b-D- galactosidase et l’a-L-fucosidase ont été étudiées, portant ainsi le nombre de sondes dans le cocktail à 4. Afin de différencier les quatre isotopes de l’éthanol libérés après hydrolyse de ces 4 sondes, les transitions MRM de chaque isotope ont été ré optimisées (tableau 3). L’absence de réponses croisées entre les 4 isotopes a ensuite été vérifiée en mesurant l’intensité de signal de chaque isotope, lorsqu’étudié seul ou en mélange, et ce en concentrations équimolaires.
Tableau 3. Transitions MRM des 4 isotopes de l’éthanol. Les transitions indiquées en gras ont été utilisées pour quantifier chaque COV. Le cocktail, ainsi constitué de 4 sondes (D5-éthyl^-D-glucuronide, 13C-D5-éthyl-
N-acetylglucosamine, D2-éthyl^-D-galactopyranoside et D -éthyl-1-a-L- fucopyranoside) cible des enzymes identifiées dans différents types de tumeurs solides ou dans la circulation sanguine de patients cancéreux.
Afin de vérifier l’efficacité diagnostic de ce cocktail, il a été testé sur des échantillons de plasma prélevés chez 4 patients atteints d’un cancer du sein et 3 patients atteints d’un cancer du poumon. Ces patients ont été diagnostiqués, mais n’avaient, au moment du prélèvement pas encore reçu le traitement adapté à leur pathologie.
Après ajout des 4 sondes (suivant le protocole plus haut), la quantité des 4 isotopes de l’éthanol libérée au-dessus des prélèvements des patients a été mesurée au cours du temps. Les réponses de chaque isotope ont été comparées à celles obtenues lorsque le cocktail a été ajouté dans des plasmas de 4 patients sains. Un blanc expérimental a également été réalisé chaque jour d’analyse. Ces blancs correspondent à des contrôles négatifs dans lesquels le cocktail a été ajouté, alors qu’aucune des 4 enzymes n’y était présente (Figure 9). Trois sondes (D5-éthyl^-D-glucuronide, D -éthyl-1-a-l-fucopyranoside, 13C-D5- éthyl-N-acetylglucosamine) permettent une discrimination nette entre les patients sains et les patients atteints d’un cancer. Ce résultat suggère donc que les 3 enzymes ici ciblées sont sécrétées au niveau des tumeurs broncho-pulmonaires et mammaires. Elles se retrouvent ainsi dans la circulation sanguine des patients, et ont maintenu une certaine activité (suggérant donc qu’elles n’ont pas ou très peu été dénaturées).
En revanche, la sonde D2-éthyl^-D-galactopyranoside ne permet pas de différencier les patients sains des patients cancéreux. L’enzyme ciblée par cette sonde, la b-D-galactosidase, ne semble pas être active dans le plasma des patients malades. Les hypothèses sous-jacentes seraient que l’enzyme n’est pas présente au niveau du micro-environnement tumoral (absence de sécrétion par les cellules tumorales ou immunitaires), ou en cas de présence, qu’elle ait été rendue inactive après dénaturation.
Enfin, ces mêmes échantillons plasmatiques ont été testés avec la méthode de référence ciblant la b-D-glucuronidase (détection UV en présence du glucuronide de para-nitrophénol ; protocole décrit page 5). Suivant ce protocole, l’enzyme n’a été détectée dans aucun des prélèvements contrairement au protocole utilisant la sonde glucuronylée. Une telle absence de signal démontre la sensibilité des sondes à base de COVs comparée aux standards actuels.
Ce cocktail de 4 sondes a ensuite été testé in vivo afin de démontrer (1) son efficacité pour différencier des animaux sains d’animaux malades, et la présence d’une ou plusieurs des enzymes cibles dans le microenvironnement des tumeurs, et ce, en temps réel.
Dans le cadre de cette étude, la quantité des 4 isotopes expirés par des modèles murins porteurs d’une xénogreffe tumorale (cellules tumorales du nasopharynx KB ; n=6) a été comparée à celle expirée par des animaux sains (n=6) après injection i.v. du cocktail.
La concentration des 4 sondes à injecter a au préalable été déterminée suivant un plan expérimental précis ayant pour objectif de déterminer la quantité de chaque sonde induisant une réponse en éthanol minimale pour les animaux sains (signal atteignant un niveau basal faible voire nul). Dans ce cadre, les animaux sains ont reçu des doses croissantes des 4 sondes (de 0.5 pg.kg-1 à 100 pg.kg-1). Les animaux ont ensuite été placés dans une cage hermétique pendant 1 h. La quantité de chaque isotope d’éthanol présente dans l’haleine des animaux a ensuite été mesurée pendant 30 min via un prélèvement SPME, puis une analyse sur GC-TQMS.
Les doses d’injection optimales se sont révélées être différentes pour chaque sonde (i.e., 1 pg.kg-1 de D2-éthyl^-D-galactopyranoside, 10 pg.kg_1 de D5-éthyl^-D- glucuronide et 13C-D5-éthyl-N-acetylglucosamine, et enfin 100 pg.kg-1 de D -éthyl-1- a-l-fucopyranoside). Ce résultat est représentatif de la variabilité de pénétration/métabolisme de chaque sonde, ou encore de la variation d’activité des 4 enzymes ciblées.
Une fois les doses i.v. fixées, le cocktail a été injecté aux souris saines et aux souris malades après 12 puis 15 jours d’implantation de la xénogreffe. La quantité des isotopes de l’éthanol expirée par les animaux a été mesurée 1 h après injection du cocktail (Figure 10). Un contrôle négatif sur deux souris (saine et malade) a été réalisé. Celui-ci consistait à mesurer la quantité des 4 isotopes de l’éthanol dans l’air environnant les souris alors qu’elles n’avaient pas reçu le cocktail. L’éthanol-D5, l’éthanol-D4 et l’éthanol-13CD5 n’ont pas été détectés. En revanche, les transitions spécifiques de l’éthanol-D2 donnaient un signal important, ce qui implique la présence d’un composé interférant dans l’environnement des souris. La quantité d’éthanol-D2 expirée par les souris saines a donc été soustraite à ce bruit de fond.
De façon remarquable, les animaux malades ont pu être discriminés des animaux sains dès 12 jours après implantation des tumeurs (durée minimale pour avoir une implantation tumorale chez les animaux) avec ce cocktail (la quantité expirée de 3 isotopes sur 4 était significativement supérieure pour les animaux malades).
Trois jours plus tard, alors que le volume des tumeurs avait encore augmenté, les 4 sondes ont été activées de manière significative dans le microenvironnement des tumeurs KB, conduisant à une libération importante des 4 isotopes de l’éthanol dans l’air expiré par les animaux. Ainsi, les animaux malades ont pu être différenciés sans ambiguïté des animaux sains.
Il est à noter qu’alors que la sonde D2-éthyl^-D-galactopyranoside ne permettait pas de différencier les patients sains des patients atteints d’un cancer du sein ou du poumon, elle est ici activée dans le microenvironnement des tumeurs du nasopharynx. Ainsi cette sonde permet de discriminer les tumeurs suivant leur localisation. Exemple 4 : Limite de détection de trois enzymes cibles
La limite de détection (LOD) d’une b-glucuronidase modèle (b-glucuronidase d’E. coli ; solution liquide 50 % de glycérol, 140 U.mL1 ; Sigma Aldrich) a été mesurée en matrice plasma en présence de la sonde D5-éthyl^-D-glucuronide ajouté à une concentration de 5. 105M. Les résultats ont été présentés dans le dépôt initial.
La limite de détection a été déterminée pour trois enzymes supplémentaires : a-mannosidase, b-galactosidase, /V-acetyl-glucosaminidase. Ainsi, des droites de calibration de type « signal du COV = f(activité en U.L 1) » sont été réalisées pour chacune de ces enzymes.
Pour cela, des enzymes commerciales modèles ont été utilisées (a- mannosidase de Canavalia ensiformis en solution liquide de sulfate d’ammonium, 59,5 U. mL-1 Sigma Aldrich ; b-galactosidase de Aspargillus oryzae, solide, 13,4 U. mg- 1, Sigma Aldrich ; /V-acetyl-glucosaminidase de rein bovin en solution liquide de sulfate d’ammonium, 34,9 U.mL 1 Sigma Aldrich ; l’a-l-fucosidase de Xanthomon en solution liquide de TRIS-HCI, 0,1 U.mL 1), et leurs activités respectives mesurées au moyen des sondes D5-éthyl-a-mannopyranoside à une concentration de 103M dans la prise d’essai, D2-éthyl^-D-galactopyranoside à une concentration de 104M dans la prise d’essai, 13C-D5-éthyl-/V-acetylglucosamide à une concentration de 103M dans la prise d’essai, et D4-éthyl-1-a-L-fucopyranoside à une concentration de 103M dans la prise d’essai.
Afin d’établir les droites d’étalonnage de chacune de ces trois enzymes, des solutions de concentrations croissantes en enzyme ont été préparées en tampon acétate (pH 5) puis insérées dans un vial de 2 mL avec insert (volume final de 100 pL dans le vial). Un volume de 10 pL de sonde a été ajouté afin d’obtenir ladite concentration de D5-éthyl-a-mannopyranoside, D2-éthyl^-D-galactopyranoside, 13C- D5-éthyl-/V-acetylglucosamide ou de D -éthyl-1 -a-L-fucopyranoside dans la prise d’essai.
Après fermeture hermétique et agitation au vortex du vial, un prélèvement SPME (SPME en phase semi-polaire de type Car/PDMS, 1 cm de long et 75 pm d’épaisseur avec une aiguille de 24 ga ; Supelco) de la phase gazeuse au-dessus de l’échantillon d’une durée de 30 min sera réalisé après, 2h, 4h et 7h de réaction. Chaque point de cinétique a nécessité un vial réactionnel, et sera réalisé en duplicat. Les COVs piégés sur la fibre SPME sont ensuite analysés par GC-TQMS. La détection GC-TQMS des isotopes de l’éthanol (inclus donc, l’éthanol-D5, l’éthanol-D2, l’éthanol-13CD5 et l’éthanol-D4) est réalisée avec une chromatographie en phase gazeuse couplée à un triple quadripôle équipé d’une source El (TSQ 9000, Thermo Fisher Scientific). Le système est contrôlé par le logiciel TSQ 9000 et les résultats ont été analysés avec le logiciel Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Les conditions d’analyse sont résumées dans les tableaux 1 et 2.
Tableau 4. Paramètres GC et TQ de la méthode permettant l’analyse des
COVs.
Tableau 5. Transitions MRM des 4 isotopes de l’éthanol. Les transitions indiquées en gras ont été utilisées pour quantifier chaque COV. Les droites d’étalonnage de Ga-mannosidase, la b-galactosidase et la /V-acetyl- glucosaminidase après 2, 4 et 7 h de réaction (prélèvement de 30 min) sont présentées par les figures 11 , 12,13 et 18.
La limite de détection de chacune des enzymes est comprise entre 1 ,47.10-3 et 0,345 U.L 1 ce qui nous amène à une quantité minimale d’enzyme détectable inférieure ou égale à 1013mol pour les enzymes commerciales ici utilisées.
Ces LODs sont 200 à 100000 fois inférieures aux valeurs seuil obtenues avec des sondes fluorescentes (DOI : 10.1021/acs.analchem.9b04806 ;
10.1021 /acs.analchem.9b03639 ; 10.1039/c9tb00175a ;
10.1021/acscentsci.0c01189 ; 10.1039/C8CC10311 A).
Exemple 5 : Etude des activités enzymatiques sur biopsies cancéreuses
Un premier cocktail constitué de 4 sondes (D5-éthyl^-D-glucuronide, 13C-D5- éthyl-N-acetylglucosamine, D2-éthyl^-D-galactopyranoside et D4-éthyl-1-a-L- fucopyranoside) a été utilisé afin de démontrer in vivo son efficacité pour différencier des animaux sains d’animaux malades, et la présence d’une ou plusieurs des enzymes cibles dans le microenvironnement des tumeurs, et ce, en temps réel. Les résultats obtenus ont mis en évidence que les 4 sondes étaient activées de façon significative dans le microenvironnement des tumeurs KB (tumeur humaine du col de l’utérus), conduisant à une libération importante des 4 isotopes de l’éthanol dans l’air expiré par les animaux. Ainsi, les animaux malades ont pu être différenciés sans ambiguïté des animaux sains, seulement 15 jours après implantation de la greffe tumorale (cf. résultats dans les exemples ci-dessus).
Des agents anticancéreux ciblant ces activités enzymatiques pourraient présenter un réel intérêt pour le traitement de ce type de cancer.
Suivant cette hypothèse, un autre phénotype de tumeurs solides (tumeur MDA- MB-231 : cellules du cancer du sein humain) a été étudié avec ce même cocktail de sondes, l’objectif étant d’identifier des activités enzymatiques significatives afin de synthétiser les agents anticancéreux correspondant, ciblant ces mêmes activités, et enfin d’en vérifier l’efficacité thérapeutique.
Les essais in vivo, tels que mentionnés ci-dessus, étant difficiles à mettre en place, nous avons réalisé une étude ex-vivo directement sur tissu.
Ainsi, et suivant le protocole sur biopsies décrit ci-dessus, des biopsies tumorales et saines (reins) ont été mises en présence du cocktail constitué des 4 sondes D5-éthyl^-D-glucuronide, 13C-D5-éthyl-N-acetylglucosamine, D2-éthyl^-D- galactopyranoside et D -éthyl-1 -a-L-fucopyranoside afin de mettre en évidence l’activité extracellulaire des 4 enzymes correspondantes, ciblant respectivement la b- glucuronidase, la N-acétyl-glucosaminidase, la b-D-galactosidase et Ga-1-fucosidase.
Au préalable, la concentration de chaque sonde à ajouter aux tissus a été optimisée afin de ne détecter que les enzymes présentes dans le milieu extracellulaire ( nb . Ces 4 glycosidases sont également présentes à l’intérieur des lysosomes des cellules, qu’elles soient cancéreuses ou saines). En outre, et par mesure de contrôle, l’absence d’isotopes de l’éthanol a été vérifiée sur l’ensemble des tissus testés.
Ainsi, et suivant le protocole décrit précédemment, les biopsies saines (organes entiers sains) ont été mises en présence de concentrations croissantes de chaque sonde. Pour cela, les biopsies ont été rincées deux fois avec 500 mI_ de tampon acétate (pH 5) puis placées dans un vial avec insert de 2 ml_. Un volume de 270 mI_ de tampon acétate a été ajouté dans chaque vial, puis le cocktail ajouté de telle sorte à obtenir une concentration de chacune des sondes allant de 104 à 109 M. Une concentration par sonde a été sélectionnée (figure 14). Elle correspond donc à la concentration pour laquelle le signal de l’isotope d’éthanol correspondant est faible voire absent sur les tissus sains (entiers ou coupés ; figure 14).
Les tissus cancéreux (entiers ou coupés) ont alors été testés dans ces conditions.
Les résultats mettent en évidence que les 4 enzymes suscitées ont été détectées dans l’environnement des tumeurs mammaires (figure 14). En revanche, la N-acétyl-glucosaminidase semble avoir une activité supérieure aux trois autres dans le microenvironnement des tumeurs. Un agent ciblant cette enzyme a alors été synthétisé puis testé in vivo sur modèle murins. Les résultats obtenus ont mis en évidence une efficacité remarquable de cet agent anticancéreux.
Exemple 6 : Cocktail pour le diagnostic et pronostic de maladies : étude de l’infection au SARS-COV-2
Suivant les résultats préliminaires présentés dans le dépôt initial, les sondes à base de COVs pourraient permettre de diagnostiquer, pronostiquer et suivre l’évolution de pathologies telles que par exemple les inflammations (type cancer) et infections (type infection virale au SARS-COV-2). Afin d’exemplifier la demande initiale, une étude ex vivo ayant pour objectif de démontrer la pertinence des sondes à COVs comme traceurs pronostic de l’infection au SARS-COV-2 a été menée. Pour cela, des prélèvements sanguins de 30 patients infectés au SARS-COV-2 ont été testés au moyen de six sondes à base de COVs ciblant chacune une activité glycolytique différente.
Au préalable, les activités enzymatiques présentes dans les échantillons sanguins de 7 volontaires sains âgés de 20 à 30 ans ont été étudiées au moyen de deux cocktails de sondes distincts (tableau 6). Cette étude avait pour objectif (1) de fixer la composition finale des cocktails, (2) de définir les concentrations des sondes à ajouter aux prélèvements sanguins pour obtenir une réponse en isotopes significative sachant que celle-ci ne devait pas être liée à une hydrolyse spontanée des sondes correspondantes, (3) de définir le point de cinétique optimal, (4) d’avoir une idée de la gamme de réponse des isotopes de l’éthanol dans des échantillons plasmatiques sains.
En outre, deux prélèvements par patient ont été réalisés afin d’étudier l’impact potentiel sur les activités enzymatiques ici ciblées d’un maintien des prélèvements à température ambiante pendant plusieurs heures (action qui peut avoir lieu en conditions à l’hôpital). Ainsi, le premier prélèvement a été transformé en plasma puis congelé dans l’heure suivant la prise de sang. Le second a été réservé 5h à 4°C, avant traitement puis congélation. Les prélèvements ont tous été stockés à -20°C jusqu’à analyse.
Tableau 6. Composition des deux cocktails de sondes à base de COVs Suivant le protocole sur plasma décrit plus haut, les sondes ont été utilisées pour détecter les six activités enzymatiques dans ces échantillons. En résumé, un aliquot de 25 mI_ de plasma sera prélevé et inséré dans un vial de 2 ml_ avec insert. Ce prélèvement biologique a été additionné de 61 ,4 mI_ solution tampon acétate (pH 5), de 3,6 mI_ d’inhibiteur de protéases (1X) et de 10 mI_ de l’un ou l’autre des cocktails. Après fermeture hermétique et agitation au vortex du vial, un prélèvement SPME (SPME en phase semi-polaire de type Car/PDMS, 1 cm de long et 75 pm d’épaisseur avec une aiguille de 24 ga ; Supelco) de la phase gazeuse au-dessus de l’échantillon d’une durée de 30 min sera réalisé après, 2h, 4h et 7h de réaction. Chaque point de cinétique nécessite un vial réactionnel, et a été réalisé en duplicat. Les COVs piégés sur la fibre SPME sont ensuite analysés par GC-TQMS suivant les paramètres définis dans les tableaux 4 et 5. Des blancs cocktails (cocktails en tampon acétate sans plasma) et des blancs plasmas (plasmas en tampon acétate sans cocktail) ont été réalisés chaque jour d’analyse.
Les résultats obtenus (figure 15) ont alors démontré des niveaux d’activité très distincts pour chacune de ces enzymes. A titre d’exemple la N-acétylglucosaminidase a un niveau d’activité très élevée comparée à la b-D-galactosidase, la b- glucuronidase, Ga-mannosidase ou encore Ga-glucosidase. L’a-l-fucosidase a quant à elle une activité intermédiaire. Ainsi, la composition des cocktails a dû être revue afin de limiter les interférences de détection entre les différents isotopes de l’éthanol. La composition des cocktails utilisés pour la suite de l’étude est présentée dans le tableau 6.
Les données obtenues ont également permis de mettre en évidence que 7h de cinétique étaient nécessaires afin d’obtenir des signaux pour chacun des isotopes qui sortaient du bruit de fond. Au-delà de 7h, une augmentation de la variabilité intra- échantillon et une hydrolyse spontanée des sondes ont été mises en évidence, ce qui n’a pas permis de maintenir la réaction au-delà de 7h (essais réalisés, données non illustrées ici).
Enfin, le maintien à température ambiante des prélèvements sanguins n’a eu aucun impact significatif sur les activités ici ciblées (figure 15).
Tableau 7. Composition des trois cocktails de sondes à base de COVs
Les échantillons sanguins de patients infectés au SARS-COV-2 ont alors été testés avec ces trois cocktails de sondes pendant 7h de réaction. Un plan expérimental complet a été réalisé de telle sorte à tester deux concentrations de sondes dans chaque prélèvement (concentrations définies dans le tableau 6 ci- dessus). L’objectif était ici de déterminer pour chacune des sondes, la concentration permettant d’obtenir une discrimination nette entre les trois groupes de patients. Dans le cadre de cette étude, trois groupes de patients ont été étudiés. Le premier groupe était constitué de 10 patients faiblement symptomatiques, âgés de 39 à 74 ans (groupe A). Le second groupe était constitué de 10 patients fortement symptomatiques hospitalisés, âgés de 46 à 70 ans (groupe B). Le dernier groupe était constitué de 10 patients fortement symptomatiques hospitalisés en réanimation, âgés de 50 à 72 ans (groupe C). Tous ces patients ont été prélevés 8 jours après diagnostic.
Les réponses des sondes dans les échantillons plasmatiques ont été comparées à leurs réponses dans des échantillons dits « blancs » et correspondant aux sondes ajoutées dans le tampon acétate seul.
Les résultats démontrent que les concentrations maximales de l’ensemble des sondes permettent une meilleure discrimination entre les trois groupes (incluse la sonde D5-éthyl^-D-glucuronide qui subit néanmoins une hydrolyse spontanée importante lorsque mise en solution tampon ; figure 16). Les sondes seront donc utilisées dorénavant à ces concentrations lorsqu’il s’agira de tester des échantillons plasmatiques. En outre, les résultats démontrent que dès 8 jours après le test positif à la
COVID, la N-acétylglucosaminidase et Ga-mannosidase ont une activité supérieure chez les patients fortement symptomatiques et admis en réanimation. Ces deux enzymes semblent être des marqueurs pronostiques défavorables de l’infection au SARS-COV-2 détectables dès 8 jours après l’infection. Leur concentration diminue significativement les jours suivants, mais reste néanmoins élevée chez les patients ayant développé des symptômes sévères, ce qui en fait des marqueurs d’infection au SARS-COV-2. En outre, deux autres marqueurs enzymatiques, la b-glucuronidase et Ga-glucosidase, semblent se mettre en place plusieurs semaines après l’infection chez les patients admis en réanimation. Leurs activités respectives deviennent discriminantes 6 mois après l’infection. Ces deux marqueurs seraient donc des marqueurs de l’inflammation chronique post-infection (SDRA) telle que l’ont développée les patients admis en réanimation. Le suivi de ces marqueurs à plus long terme permettrait de vérifier une régression de l’inflammation.
La b-D-galactosidase et Ga-I-fucosidase ne permettent pas de différencier les patients infectés. Néanmoins, étant donné que ces deux enzymes sont des marqueurs des tumeurs solides, elles devraient nous permettre de discriminer les patients atteints d’un cancer de ceux atteints d’une infection.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl^-D-galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a-mannopyranoside) ; pour son utilisation comme agent de diagnostic et/ou de pronostic.
2. Utilisation d’une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl^-D-galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a-mannopyranoside) ; comme agent de diagnostic et/ou pronostic ex vivo d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües.
3. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle la pathologie est choisie dans le groupe constitué des cancers, des infections bactériennes et virales, des infections nosocomiales, des maladies auto-immunes, des inflammations respiratoires, des inflammations chroniques, des maladies neurodégénératives et des troubles chroniques liés à l’âge.
4. Méthode de diagnostic d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl^-D-galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a-mannopyranoside) ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante, et d) en déduire si le sujet est atteint de ladite pathologie.
5. Méthode de suivi de l’efficacité d’un traitement curatif ou préventif d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside) ; dans un échantillon biologique dudit sujet à un instant t au cours dudit traitement, b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante et/ou avec une valeur correspondante obtenue avant le début du traitement ou à un instant t’ au cours du traitement qui est antérieur à l’instant t, d) en déduire si le traitement est efficace, et e) optionnellement, répéter les étapes a) à d).
6. Méthode de suivi de l’évolution d’une pathologie chez un sujet, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, à un instant t1 , une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside) ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, pour l’échantillon à l’instant t1 , c) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, à un instant t2 séparé dans le temps par rapport à l’instant t1, la composition telle que définie à l’étape a), d) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, pour l’échantillon à l’instant t2, e) comparer les valeurs obtenues aux étapes b) et d) aux instants t1 et t2 respectivement, f) en déduire si la pathologie évolue favorablement, et g) optionnellement, répéter les étapes a) à f).
7. Méthode de stratification d’un sujet souffrant d’une pathologie dans une catégorie C-1 de sujets atteints de ladite pathologie à un degré de sévérité ou dans une catégorie C-2 de sujets atteints de ladite pathologie à un autre degré de sévérité, ladite pathologie étant choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) ajouter, dans un échantillon biologique dudit sujet, une composition comprenant : - soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl-b-O- galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a- mannopyranoside) ; b) mesurer la quantité d’éthanol marqué, libéré en phase gazeuse, c) comparer les valeurs obtenues à l’étape b) avec une valeur contrôle standard correspondante, et d) en déduire si le sujet est dans la catégorie C1 ou dans la catégorie C2.
8. Méthode selon l’une quelconque des revendications 4 à 7, dans laquelle l’échantillon biologique est choisi dans le groupe constitué des échantillons de plasma, de sang, de tissus, de salive, d’urine, de liquide céphalorachidien et de biopsies.
9. Kit pour le diagnostic d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües, ledit kit comprenant une composition comprenant :
- soit au moins de l’éthyl^-D-glucuronide dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl^-D-glucuronide) et au moins de l’éthyl^-D-galactopyranoside (ou sonde éthyl^-D-galactopyranoside) dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif ;
- soit au moins de l’éthyl-a-mannopyranoside dont la partie éthyle comprend au moins un isotope non radioactif (ou sonde éthyl-a-mannopyranoside).
10. Utilisation du kit selon la revendication 9 pour le diagnostic d’une pathologie choisie dans le groupe constitué des pathologies impliquant une réaction inflammatoire en réponse à une lésion ou une infection de l'organisme, des maladies inflammatoires chroniques et des infections aigües.
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