CN117881965A - 基于挥发性有机化合物的探针及其用于病理状况的诊断和预后的用途 - Google Patents
基于挥发性有机化合物的探针及其用于病理状况的诊断和预后的用途 Download PDFInfo
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：‑至少乙基‑β‑D‑葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基‑β‑D‑葡糖苷酸探针)，和至少乙基‑β‑D‑吡喃半乳糖苷(或乙基‑β‑D‑吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；‑或至少乙基‑α‑吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基‑β‑D‑葡糖苷酸探针)；其用作诊断剂和/或预后剂。
Description
本发明涉及基于挥发性有机化合物的探针、包含这些探针的组合物以及它们用于病理状况的诊断和预后的用途。本发明还涉及一种用于通过使用所述探针来诊断这些病理状况的方法。
早期、精确、可靠的诊断是确保患者康复的关键因素之一，而不管他们的病理状况如何。迄今为止，对患者的诊断来自当个体具有特定症状时对个体的临床检查，或者来自参与国家筛查计划。该患者随后进入涉及影像分析的医疗方案，这些医疗方案在1)它们的低可及性、2)它们的特异性、3)它们的高成本和4)它们的灵敏度方面仍然是可改进的。
“挥发物组学(volatolomics)”，一种研究由生物系统产生的挥发性有机化合物(VOC)的学科，是新兴的科学领域，其使得探索实时代谢过程成为可能。存在于个体的呼吸、汗液、尿液或粪便中的许多内源性VOC可能是各种疾病的潜在标志物，从而允许在定制疗法的背景下对患者进行诊断和分类。然而，由于体液或生物气体中VOC的采样和分析存在个体间高度可变性和实验室间差异，“挥发物组学”的临床用途仍然受到限制。
最近，已经开发了用于医学或生物学目的的生物传感器，这些生物传感器基于通过荧光、电化学或发光进行的检测。然而，这些生物传感器具有含有放射性元素的缺点。
因此，需要基于源自生物分子且不含任何放射性元素的探针的简单且灵敏的诊断手段。
本发明的目的是提供一种包含酶敏感型探针的组合物，这些酶敏感型探针被编程为对一种(多种)病理状况的特异性酶作图，从而在将这些探针施用于待诊断的受试者之后，早期且确定地诊断疾病。
本发明还旨在提供一种用于受试者的诊断的组合物，使得可以在受试者的疗法进程中非常规律地跟踪受试者，并且因此帮助医务人员做出关于选择最有效的方案的决定。
本发明的另一个目的是提供一种简单、实惠、非常灵敏、无痛的诊断方法，该方法可大众化，以便能够改善恶性病理状况的治疗。
本发明的目的是提供一种用于诊断的组合物，使得可以显著降低在跟踪内源性标志物时遇到的个体间可变性。
因此，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)；
-至少乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-N-乙酰葡糖酰胺探针)；以及
-至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
其用作诊断剂和/或预后剂。
因此，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；其用作诊断剂和/或预后剂。
本发明还涉及一种组合物(C1)，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和
-至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素，
其用作诊断剂和/或预后剂。
本发明还涉及一种组合物(C2)，所述组合物包含：至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)，
其用作诊断剂和/或预后剂。
根据本发明的组合物或混合物
因此，前述组合物包含几种化合物或探针，旨在用作病理状况的诊断或预后的药剂。该组合物随后也用术语“混合物”或“探针混合物”表示。该组合物因此用于诊断或预测病理状况，如下文所解释的。因此，作为根据本发明的组合物，可以提及例如上述组合物C1或C2。
如上所述，根据本发明使用的组合物包含例如至少两种探针，特别是至少三种探针，即乙基-β-D-葡糖苷酸探针、乙基-N-乙酰葡糖酰胺和乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，这些探针(或化合物)中的每一者在乙基部分中包含至少一种非放射性同位素。
如上所述，根据本发明使用的组合物C1，也称为“混合物1”，包含至少两种探针，即乙基-β-D-葡糖苷酸和乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针，这些探针(或化合物)中的每一者在乙基部分中包含至少一种非放射性同位素。根据一个实施方案，该组合物包含例如乙基-N-乙酰葡糖酰胺探针。
根据本发明使用的另一种组合物，即组合物C2，也称为“混合物2”，至少包含乙基-α-吡喃甘露糖苷探针，其优选地与至少一种其他探针(诸如例如乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷探针或乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷探针)组合。
乙基-β-D-葡糖苷酸对应于下式：
并且靶向β-葡萄糖醛酸酶。
乙基-N-乙酰葡糖酰胺对应于下式：
并且靶向酶N-乙酰基氨基葡糖苷酶。
乙基-β-D-吡喃半乳糖苷对应于下式：
并且靶向β-半乳糖苷酶。
如上文所解释的，根据本发明的组合物的探针在它们的乙基部分中包含至少一种非放射性同位素。作为非放射性同位素，可以提及例如氘(2D)、碳-13(13C)或氧18(18O)。因此，这些探针是源自对应于上述式的化合物的化合物，其中它们的乙基部分的至少一个氢和/或碳和/或氧原子被同位素替代。因此，根据本发明使用的探针的乙基部分在一个或多个位置上被一种或多种非放射性同位素标记(2D、13C或18O)。
根据一个实施方案，乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种存在于根据本发明的组合物中的非放射性同位素，是探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸，其对应于下式(1)：
该探针靶向酶β-葡萄糖醛酸酶。
根据一个实施方案，乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种存在于根据本发明的组合物中的非放射性同位素，是探针13C-D5-乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其对应于下式(2)：
该探针靶向酶N-乙酰基-氨基葡糖苷酶。
根据一个实施方案，乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种存在于根据本发明的组合物中的非放射性同位素，是探针D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其对应于下式(3)：
该探针靶向酶β-半乳糖苷酶。
乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷对应于下式：
并且靶向酶α-L-岩藻糖苷酶。
乙基-N-吡喃葡萄糖苷对应于下式：
并且靶向酶α-或β-葡糖苷酶。
乙基-吡喃甘露糖苷对应于下式：
并且靶向酶α-或β-甘露糖苷酶。
乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷对应于下式：
并且靶向酶α-葡糖苷酶。
乙基-α-吡喃甘露糖苷对应于下式：
并且靶向酶α-甘露糖苷酶。
根据一个实施方案，乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷，其乙基部分包含至少一种存在于根据本发明的组合物中的非放射性同位素，是探针D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷，其对应于下式(4)：
该探针靶向酶α-L-岩藻糖苷酶。
根据一个实施方案，乙基-吡喃葡萄糖苷，其乙基部分包含至少一种存在于根据本发明的组合物中的非放射性同位素，是探针D4-乙基-吡喃葡萄糖苷，其对应于下式(5)：
根据一个实施方案，乙基-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种存在于根据本发明的组合物中的非放射性同位素，是探针D5-乙基-吡喃甘露糖苷，其对应于下式(6)：
所有探针可用乙醇同位素随机合成，这些乙醇同位素为：乙醇-D2、乙醇-D3、乙醇-D4、乙醇-D5、乙醇-13C-D5、乙醇-13C2-D5、乙醇-13C或乙醇-13C2。
因此，与常规内源性VOC的研究不同，本发明基于多模式探针的离体使用，在其结构中包括用一种或多种稳定同位素标记的VOC。这些相互作用的探针在受损组织中通过特异于这些介质的酶的活性被选择性地水解。由此释放的VOC进而成为受损组织代谢的外源性标志物特征，并根据既定的和详细的方案在生物样品中进行离体检测，如下文所解释的。
靶向β-葡萄糖醛酸酶(一种肿瘤酶标志物)的首个概念验证表明了使用氘标记的乙醇探针检测体内各种类型的实体瘤并监测这些实体瘤在化学疗法期间的演变的相关性。然而，在临床研究的背景下，靶向单一酶可能导致大量假阳性和假阴性。
因此，本发明基于相互作用探针混合物的使用，每种探针靶向特异于一种或多种病理状况的酶促标志物，以降低错误诊断的风险并预测相关疗法的功效。根据所激活的探针，该策略提供关于病理状况(例如实体瘤、炎性综合征、细菌感染、病毒感染)的性质、其位置、其侵袭性、其发展阶段以及其对治疗的反应等信息。
因此，在本发明的背景下，使用靶向糖苷酶的具有VOC的探针。这些酶在受损组织(例如肿瘤或感染性微环境)中表达，但不被健康细胞表达/分泌，或很少被健康细胞表达/分泌。
水解后，这些探针释放经标记的乙醇分子。
此外，根据本发明的基于VOC的探针提供迄今无可比拟的灵敏度。例如，用靶向β-葡萄糖醛酸酶的探针获得的第一结果表明，这种酶在低于5×10-13M的浓度下可以在血浆中检测到。最近开发的荧光生物传感器对于该相同的酶具有5×10-9M的LOD。
根据一个实施方案，前述组合物，特别是组合物C1或“混合物1”，还包含至少一种其他的经标记化合物，该至少一种其他的经标记化合物选自：乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；以及它们的混合物。
根据一个实施方案，前述组合物，特别是组合物C1或“混合物1”，还包含乙基-N-乙酰葡糖酰胺。
根据一个实施方案，本发明的组合物至少包含前述探针(1)、(2)和(3)，其与如上所定义的探针(4)、(5)和/或(6)中的至少一者组合。
根据一个实施方案，本发明的组合物C1至少包含前述探针(1)和(3)，其与如上所定义的探针(2)、(4)、(5)和/或(6)中的至少一者组合。
根据一个实施方案，本发明的组合物C2至少包含前述探针(6)，其与如上所定义的探针(4)和/或(5)中的至少一者组合。
根据一个实施方案，组合物C1至少包含：乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；和乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素。
因此，根据本发明的混合物C1-1优选地包含靶向β-葡萄糖醛酸酶的乙基-β-d-葡糖苷酸、靶向N-乙酰基氨基葡糖苷酶的乙基-N-乙酰葡糖酰胺、靶向β-半乳糖苷酶的乙基-β-D-吡喃半乳糖苷和靶向α-L-岩藻糖苷酶的乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷，这些探针中的每一个探针通过在它们的乙基部分中存在至少一种非放射性同位素而如上所解释地被修饰。
根据一个实施方案，组合物C1至少包含：乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；和乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素。
因此，根据本发明的混合物C1-2优选地包含靶向β-葡萄糖醛酸酶的乙基-β-d-葡糖苷酸、靶向β-半乳糖苷酶的乙基-β-D-吡喃半乳糖苷和靶向α-葡糖苷酶的乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，这些探针中的每一个探针通过在它们的乙基部分中存在至少一种非放射性同位素而如上所解释地被修饰。
根据一个实施方案，组合物C2至少包含：乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；和乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素。
因此，根据本发明的混合物C2-1优选地包含靶向α-葡糖苷酶的乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷和靶向α-甘露糖苷酶的乙基-α-吡喃甘露糖苷，这些探针中的每一个探针通过在它们的乙基部分中存在至少一种非放射性同位素而如上所解释地被修饰。
根据一个实施方案，组合物C2至少包含：乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；和乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素。
因此，根据本发明的混合物C2-2优选地包含靶向α-L-岩藻糖苷酶的乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷和靶向α-甘露糖苷酶的乙基-α-吡喃甘露糖苷，这些探针中的每一个探针通过在它们的乙基部分中存在至少一种非放射性同位素而如上所解释地被修饰。
根据一个实施方案，该组合物至少包含：乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；乙基-吡喃葡萄糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素，和乙基-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素。
因此，根据本发明的混合物优选地包含靶向β-葡萄糖醛酸酶的乙基-β-d-葡糖苷酸、靶向N-乙酰基氨基葡糖苷酶的乙基-N-乙酰葡糖酰胺、靶向β-半乳糖苷酶的乙基-β-D-吡喃半乳糖苷、靶向α-L-岩藻糖苷酶的乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷、靶向α-葡糖苷酶或β-葡糖苷酶的乙基-吡喃葡萄糖苷和靶向α-甘露糖苷酶或β-甘露糖苷酶的乙基-吡喃甘露糖苷，这些探针中的每一个探针通过在它们的乙基部分中存在至少一种非放射性同位素而如上所解释地被修饰。
根据一个实施方案，根据本发明的组合物包含上述对应于式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)的探针。
根据本发明的组合物或混合物的用途
本发明还涉及如上所定义的组合物的用途，即包含以下各项的组合物：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；以及
-至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
其作为用于病理状况的离体诊断和/或预后的药剂，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组。
本发明还涉及如上所定义的组合物的用途，即包含以下各项的组合物：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷)；
其作为用于病理状况的离体诊断和/或预后的药剂，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组。
本发明还涉及如上所定义的组合物(即组合物C1或C2)作为用于病理状况的离体诊断和/或预后的药剂的用途，该病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组。
如下文所解释的，根据本发明的并且如上所定义的组合物，特别是组合物C1或C2，并且包含上述探针，被用于受试者(人或动物)的离体诊断和/或预后。这些组合物可特别用于根据病理状况的进展、严重程度和演变对受试者或患者进行分类，也可用于例如在给定受试者或患者群体的筛查活动的背景下诊断(可能是早期诊断)病理状况。
根据一个实施方案，用作用于上述病理状况的离体诊断和/或预后的药剂的组合物如上所定义，并且特别包含探针(1)、(2)和(3)。
根据一个实施方案，用作用于上述病理状况的离体诊断和/或预后的药剂的组合物是组合物C1或C2。
根据一个实施方案，用作用于上述病理状况的离体诊断和/或预后的药剂的组合物包含前述探针(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)。
病理状况
如上所述，可通过根据本发明的探针混合物诊断和/或预测的病理状况是涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染。在这些病理状况中，可以特别提及炎症性疾病、细菌感染或甚至自身免疫性疾病。
术语“涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况”特别是指癌症、肺ARDS和纤维化或帕金森病。
术语“慢性炎症性疾病”特别是指克罗恩氏病、湿疹以及自身免疫性疾病诸如1型糖尿病、白癜风、多发性硬化症或类风湿性关节炎。
术语“急性感染”特别是指病毒感染(呼吸道合胞病毒、SARS-COV、HIV、单纯疱疹病毒和所有新出现的病毒)和细菌感染(大肠杆菌、葡萄球菌、假单胞菌、痤疮丙酸杆菌)。
炎症性疾病，也称为炎性疾病，可以是由免疫系统的异常反应引起的任何疾病。
炎症性疾病可以是自身炎症性疾病、自身免疫性疾病或不确定来源的炎症性病症。
炎性疾病定义为由于免疫系统功能障碍引起的组织攻击。因此，其中可以提及动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、肺部炎症、慢性炎症性肠病、败血症、严重败血症、败血症性休克或癌症。
因此，炎症性疾病优选地选自由以下组成的组：动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、肺部炎症、慢性炎症性肠病、败血症、严重败血症、败血症性休克、癌症以及它们的组合。
动脉粥样硬化(也称为动脉硬化)是一种影响动脉的疾病，并且其特征在于动脉内壁上出现动脉粥样化斑块。
类风湿性关节炎(或RA)是一种结缔组织全身性疾病，其特征在于偶尔出现的慢性关节炎症。
肺部炎症特别包括炎症性肺部疾病和/或肺部过敏。
炎症性肺部疾病特别包括急性肺损伤(ALI，也称为“中度ARDS”)、急性呼吸窘迫综合征(或ARDS)和输血相关急性肺损伤(或TRALI)。
肺部过敏，也称为呼吸道过敏，是一种急性期(也称为哮喘)和慢性期交替的疾病。
慢性炎症性肠病(或IBD)可选自克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
响应于感染的过度炎症反应引起败血症及其最严重的形式，即严重败血症和败血症性休克。
癌细胞将引起炎症并侵入邻近细胞，为邻近细胞的生长创造有利环境。癌症肿瘤因此一点一点地生长。具体地，癌细胞利用炎症来进展。
根据一个实施方案，前述病理状况选自由以下组成的组：癌症、细菌和病毒感染、医院内感染、自身免疫性疾病、呼吸道炎症、慢性炎症、神经退行性疾病和慢性年龄相关性病症。
根据本发明，在癌症中，可以提及例如实体癌肿瘤，诸如例如肺部癌症(肺癌、支气管癌和鼻咽癌)、妇科癌症(乳腺癌、卵巢癌、子宫癌)和胃肠癌(肝癌、肠癌、结肠癌、胰腺癌)。
优选地，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、鼻咽癌、肠癌、结肠癌、膀胱癌和脑癌。
作为细菌和病毒感染，可以提及例如由于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、衣原体(Chlamydia)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、SARS-COV、HIV、合胞病毒、单纯疱疹病毒和所有新出现的病毒引起的感染。
作为医院内感染，可以提及例如由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和痤疮丙酸杆菌引起的感染。
作为自身免疫性疾病，可以提及例如1型糖尿病、白癜风、多发性硬化症或类风湿性关节炎。
作为呼吸道炎症，可以提及例如肺纤维化，特别是急性低氧性呼吸功能衰竭或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
作为慢性炎症，可以提及例如克罗恩氏病。
作为神经退行性疾病，可以提及例如阿尔茨海默病或帕金森病。
作为慢性年龄相关性病症，可以提及例如2型糖尿病、骨关节炎和骨质疏松症。
本发明还涉及前述组合物，特别是包含探针(1)、(2)和(3)的组合物，或组合物C1或C2，其用作用于癌症的诊断和/或预后的药剂。
本发明还涉及包含探针(1)、(2)、(3)和(4)的如上所定义的组合物，其用作用于癌症的诊断和/或预后的药剂。
本发明还涉及包含探针(1)、(2)、(3)、(4)和(6)的如上所定义的组合物，其用作用于癌症的诊断和/或预后的药剂。
本发明还涉及如上所定义的组合物C1或C2，其用作用于癌症的诊断和/或预后的药剂。
本发明还涉及包含探针(1)、(2)、(3)和(5)的如上所定义的组合物，其用作用于病毒和细菌感染以及慢性炎症性疾病(诸如骨关节炎或糖尿病)的诊断和/或预后的药剂。
本发明还涉及如上所定义的组合物C1或C2，其用作用于病毒和细菌感染以及慢性炎症性疾病(诸如骨关节炎或糖尿病)的诊断和/或预后的药剂。
用于诊断病理状况的方法
本发明还涉及一种用于诊断受试者的病理状况的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；以及
-至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值进行比较，以及
d)由此推断所述受试者是否受所述病理状况影响。
前述诊断方法优选为离体方法。
本发明还涉及一种用于诊断受试者的病理状况的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值进行比较，以及
d)由此推断所述受试者是否受所述病理状况影响。
本发明还涉及一种用于诊断受试者的病理状况的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在所述受试者的生物样品中添加如上所定义的组合物C1或C2；
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值进行比较，以及
d)由此推断所述受试者是否受所述病理状况影响。
根据一个实施方案，可以对同一受试者的两个相同样品平行地进行步骤a)至d)，其中一侧是组合物C1并且另一侧是组合物C2。
根据一个实施方案，前述诊断方法包括实施用于癌症诊断的前述组合物，特别是包含探针(1)、(2)和(3)的组合物。
根据一个实施方案，前述诊断方法包括实施用于癌症诊断的包含探针(1)、(2)、(3)和(4)的前述组合物。
根据一个实施方案，前述诊断方法包括实施用于癌症诊断的包含探针(1)、(2)、(3)、(4)和(6)的前述组合物。
根据一个实施方案，前述诊断方法包括实施用于诊断癌症的前述组合物C1或C2。
根据一个实施方案，前述诊断方法包括实施用于诊断病毒和细菌感染以及慢性炎症性疾病(诸如骨关节炎或糖尿病)的包含探针(1)、(2)、(3)和(5)的前述组合物。
根据一个实施方案，前述诊断方法包括实施用于诊断病毒和细菌感染以及慢性炎症性疾病(诸如骨关节炎或糖尿病)的前述组合物C1或C2。
受试者
根据一个实施方案，受试者是人或动物。
受试者优选是哺乳动物，例如人类受试者或非人哺乳动物，诸如猫、狗、猴、兔、小鼠或大鼠。
人类受试者可以是任何年龄的男性或女性，诸如婴儿、儿童、青少年、成人或老年人。
受试者优选是患有如上所定义的病理状况(特别是炎症性疾病)或处于患如上所定义的病理状况的风险中的受试者。
处于患炎症性疾病的风险中的受试者是例如具有炎症性疾病家族史、已经患过至少一种炎症性疾病、具有遗传风险因子、代谢和/或生活方式因子和/或具有可成为炎症性疾病前兆的至少一种症状的受试者。
生物样品
生物样品优选地从如上所定义的受试者获得。生物样品优选地选自由以下组成的组：所述受试者的血浆、血液、组织、唾液、尿液、脑脊液样品和活检物。
步骤a)包括将从受试者获得的生物样品与根据本发明的组合物，特别是如上所定义的探针混合物接触放置。通过本领域技术人员熟知的任何手段将本发明的组合物(或探针混合物)添加到所述生物样品中，进行这种接触。
例如，将组合物添加到含有所述样品(例如血浆或血液样品)的容器中。
将本发明的组合物添加到生物样品中可以直接在生物样品中进行或在处理生物样品之后进行。
根据一个实施方案，在添加所述组合物之后，将生物样品(优选体积为1mL的流体和几百克的组织)维持在-20℃，直至对应于前述方法的测量步骤b)的分析。分析前不应将其解冻。
根据一个实施方案，还将从受试者获得的生物样品添加到缓冲溶液，诸如例如乙酸盐缓冲液(特别是pH 5.5、0.1mol/L，含有乙酸钠和乙酸的混合物)中，用于检测生物样品中的实体瘤的标志物酶。
根据一个实施方案，还将从受试者获得的生物样品添加到蛋白酶抑制剂(例如，完整的、不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物，Roche)中。例如，为了检测生物样品中的实体瘤标志物酶，使用浓度为7X的UP水制备的蛋白酶抑制剂的终浓度为1X。
因此，该步骤a)之前可以是处理生物样品的步骤。
“处理生物样品”在此意指至少一个处理步骤，例如选自由以下组成的组：离心、冷冻和解冻循环以及悬浮在缓冲液中。
根据一个实施方案，本发明的组合物通过将上述探针添加到缓冲溶液中而制备，特别是如上所定义的探针，优选浓度介于10-3mol/L与10-7mol/L之间。优选地，以介于10μL与200μL之间的体积添加探针，以获得介于25μL与300μL之间的总样品体积(总体积包括10μL至250μL缓冲液、10μL至250μL生物流体或5mg至5000mg组织和1μL至35μL 1X蛋白酶抑制剂)。
根据一个实施方案，将样品整体(即包括生物样品、探针以及任选的缓冲溶液和蛋白酶抑制剂)插入气密密封的惰性材料的小瓶中，诸如例如具有带插入件的密封塞的2μL小瓶。
例如，为了从血浆样品中诊断肿瘤，预先在前述缓冲液中以5×10-5mol/L的浓度制备探针(1-4)，并添加10μL体积，以获得100μL的总样品体积(总体积包括62μL缓冲液、25μL生物流体和3μL蛋白酶抑制剂)。例如，将样品整体插入具有带插入件的密封塞的2μL小瓶中。
步骤b)包括测量在气相中释放的经标记乙醇的量。经标记乙醇是从上述探针释放的乙醇，并因此含有如上所定义的经标记的乙基部分。
根据一个实施方案，该测量步骤在对应于添加本发明的组合物的步骤a)之后的0小时与8小时之间的至少三个动力学点上进行。动力学点对应于在时刻t对在相同条件下制备的相同样品进行的测量。为了获得三个动力学点，如上文所解释的制备三个相同的生物样品，在相同条件下向其中添加如上所定义的根据本发明的探针混合物，然后在随时间间隔开的三个不同时刻t1、t2和t3进行根据本发明的测量步骤b)。
因此，例如，在步骤a)之后2小时进行测量，在步骤a)之后4小时进行另一次测量，并且在步骤a)之后7小时进行最后一次测量。这些动力学点是通过在含有相同生物样品和根据本发明的相同组合物的3个单独的烧瓶中进行测量而获得的。这些动力学点至少一式两份地产生，然后使得有可能获得对于涉及诊断的结论步骤有用的酶促曲线，如下文所解释的。
在生物样品中存在包含至少一种非放射性同位素的乙基部分的情况下放置探针后，如果该生物样品含有至少一种由所述探针靶向的酶，则探针将被酶通过水解切割，这将从所述探针释放-O-Et部分，如上文所解释的，并且因此将导致包含至少一种非放射性同位素的乙醇气体的释放。
例如，前述探针(1)允许经标记的乙醇以CD3-CD2-OH形式释放，前述探针(2)允许经标记的乙醇以CD3-13CD2-OH形式释放，前述探针(3)允许经标记的乙醇以CH3-CD2-OH形式释放，前述探针(4)允许经标记的乙醇以CD3-CHD-OH形式释放，前述探针(5)允许经标记的乙醇以CD3-CD2-OH形式释放，并且前述探针(6)允许经标记的乙醇以13CD3-13CD2-OH形式释放。
如上文所解释的，本发明的组合物的探针在受损组织中通过特异于这些介质的酶的活性被选择性地水解。由此释放的经标记的乙醇成为受损组织代谢的外源性标志物特征，并在生物样品中进行离体检测。如果生物样品是健康受试者的样品，该样品不含靶向酶，组合物的探针因此将不被水解，因此将不获得经标记的乙醇的释放，并且因此无法测量。
根据一个实施方案，生物样品在容器诸如小瓶或烧瓶中，并且在步骤a)的背景下，将组合物添加到所述容器中，然后将所述容器气密密封。
根据一个实施方案，在实施步骤b)测量在气相中释放的乙醇的量之前，例如在涡流下搅拌容器。
在步骤b)期间在气相中释放的乙醇的量的测量可以通过任何测量方法或本领域技术人员熟知的测量气相中标记的乙醇的量或浓度的方法来进行，诸如例如，固相微萃取(SPME)。根据一个实施方案，步骤b)包括与装备有EI源的三重四极杆耦联的气相色谱(GC)测量(GC-TQMS)，或与高分辨率质谱仪耦联的气相色谱(GC-QTOFMS)，或人工鼻。
在步骤b)测量所释放的经标记乙醇的量之后，将由此获得的值与对应的标准对照值进行比较。
在步骤c)中，将步骤b)中获得的结果与对应的标准对照值进行比较。
在步骤b)中获得的结果是在将本发明的组合物添加到生物样品中之后，在气相中释放的经标记乙醇的量、浓度和/或比例。
表述“对应的标准对照值”中的术语“对应的”意指将生物样品中测量的经标记乙醇的量、浓度和/或比例与乙醇的量、浓度和/或比例的标准对照值进行比较。
如果它是在生物样品中测量的乙醇的量，则标准对照值是量。
如果它是在生物样品中测量的乙醇的浓度，则标准对照值是浓度。
如果它是在生物样品中测量的乙醇的比例，则标准对照值是比例。
标准对照值(也称为参考值)可以例如是在来自健康受试者的样品中测量的乙醇的量、浓度或比例的平均值、最大阈值和/或最小阈值(在实施上述步骤a)和b)之后)，或在空白样品(即其中添加了本发明的组合物但不含靶标酶的样品)中测量的乙醇的量、浓度或比例的平均值、最大阈值和/或最小阈值。
在健康受试者的样品中或在空白样品中测量的值使用与用于生物样品的测量方法类似的测量方法进行。
如果在同一样品上实施时两种测量方法给出相同或相似的结果，则它们是相似的。在这方面，变异系数(CV)的计算是该方法的可靠性的重要量度，如果CV<20％，则其是可接受的。
最小阈值和最大阈值定义了参考区间。参考区间通常被定义为包括在参考群体中获得的值的95％。
健康受试者或个体意指具有良好的一般健康状况的受试者或个体，特别是不患有如上所定义的病理状况的受试者或个体。
乙醇的标准对照值可以是在来自健康个体的样品中测量的乙醇的量、浓度或比例的平均值、最大阈值和/或最小阈值，这些样品已被添加到根据本发明的探针组合物或混合物中。
标准对照值可以例如对应于在来自10个健康受试者的样品中获得的值的平均值。
当如上解释的测量的乙醇值将被包括在如上解释的相对于健康受试者在所有动力学点上的值的平均值的标准偏差中时，受试者将被认为是健康的。
在步骤d)中，推断受试者是否患有上述病理状况。
特别地，如果测量的经标记乙醇的测量数量的数量、浓度和/或比例大于对应的标准对照值(特别是大于最大阈值或大于设定值)，则由此推断出存在由如上所定义的探针靶向的至少一种酶，并且因此该受试者患有如上所定义的病理状况。
在至少一个动力学点(如上文所解释的)上，患病受试者的值的标准偏差不应与健康受试者的值的标准偏差叠加，以便将靶向酶视为病理状况的标志物。
然后，当受试者的测量的乙醇值被包括在相对于患病受试者在至少一个动力学点上的测量值的平均值的标准偏差中时，受试者被认为是患病的。该值应当是在至少一个动力学点上对健康受试者测量的值的平均值的至少1.3倍。
根据一个实施方案，当在步骤d)结束时推断出受试者患有前述病理状况时，可以实施额外步骤，该额外步骤包括治疗所述受试者的步骤，例如通过向所述受试者施用药学上可接受量的旨在治疗所述病理状况的化合物或组合物。
本发明还涉及一种用于诊断受试者的病理状况的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在所述受试者的血液样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值进行比较，以及
d)由此推断所述受试者是否受所述病理状况影响。
根据一个实施方案，步骤a)包括向受试者的血液样品中添加组合物C1-2或C2-2。
根据一个实施方案，步骤a)在于向受试者的第一个血液样品中添加组合物C1-2，并且在同一受试者的第二个血液样品中添加组合物C2-2。
用于监测病理状况的治愈性或预防性治疗的功效的方法
本发明还涉及一种用于跟踪受试者中病理状况的治愈性或预防性治疗的功效的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；以及
-至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
所述添加在所述治疗期间的时刻t在所述受试者的生物样品中进行，
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值和/或与在所述治疗开始之前或在所述治疗期间在所述时刻t之前的时刻t'获得的对应值进行比较，
d)由此推断所述治疗是否有效，以及
e)任选地，重复步骤a)至d)。
本发明还涉及一种用于跟踪受试者中病理状况的治愈性或预防性治疗的功效的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
所述添加在所述治疗期间的时刻t在所述受试者的生物样品中进行，
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值和/或与在所述治疗开始之前或在所述治疗期间在所述时刻t之前的时刻t'获得的对应值进行比较，
d)由此推断所述治疗是否有效，以及
e)任选地，重复步骤a)至d)。
病理状况具体如上文在“病理状况”部分中所定义。优选地，病理状况是炎症性疾病，并且优选癌症。
生物样品是来自受试者的样品，特别是如上文在“生物样品”部分中所定义的。优选地，生物样品是血液、血浆或活检样品。
受试者具体如上文在“受试者”部分中所定义。
治愈性或预防性治疗可包括上述病理状况的治愈性或预防性治疗和/或如上所定义的炎症的治愈性或预防性治疗。
涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病或急性感染的治愈性或预防性治疗是例如本领域技术人员熟知的用于这些病理状况的治愈性或预防性治疗。
病理状况的治愈性或预防性治疗可以例如包括手术切除恶性组织、施用化学疗法、免疫调节剂、三联疗法、合适的抗生素治疗或呼吸辅助。
步骤a)和b)的特征通常如“诊断方法”部分中所定义的步骤a)和b)所定义。
在用于监测如上所定义的治疗的效率的方法中，步骤b)包括在治疗期间的时刻t测量所述受试者的生物样品中的经标记乙醇的量、浓度和/或比例。
换句话说，在来自于在时刻t进行的采样的生物样品中进行测量。
在步骤c)中，将步骤b)中获得的结果与对应的标准对照值和/或与在所述治疗开始之前或在治疗期间在时刻t之前的时刻t'获得的对应值进行比较。
术语“在所述治疗开始之前获得的对应值”应理解为是指在所述受试者的生物样品中测量的经标记乙醇的量、浓度和/或比例，所述样品在治疗开始前采集。
术语“在治疗期间在时刻t之前的时刻获得的对应值”应理解为是指所述受试者的生物样品中对应的经标记乙醇的数量、浓度和/或比例，所述样品是在治疗开始之后但在时刻t之前采集的。
在步骤d)中，由此推断治疗是否有效。
例如，如果测量的经标记乙醇的量减少或消失，则该治疗是有效的。
例如，如果在时刻t测量的经标记乙醇的数量、浓度和/或比例小于在所述治疗开始之前或在治疗期间在时刻t之前的时刻t'获得的对应值，则该治疗是有效的。
例如，如果在时刻t测量的经标记乙醇的数量、浓度和/或比例大于在所述治疗开始之前或在治疗期间在时刻t之前的时刻t'获得的对应值，则该治疗是无效的。
如果治疗无效，则该方法可以包括施用新的治疗或补充治疗。
该方法可包括步骤e)，其中重复步骤a)至d)，特别是无论治疗是否有效。
步骤a)至d)可以重复一次、两次、三次或至少三次。
例如，可以重复步骤a)至d)，直到受试者已经康复或病理状况已经稳定。
两次重复之间的时期可以是例如至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、六个月或至少六个月，例如一年。
用于监测治愈性或预防性治疗的功效的方法可以在每次开始新的治疗或补充治疗时进行。
当根据步骤b)测量的乙醇值被包括在相对于健康受试者在所有动力学点的平均值的标准偏差中时，受试者被认为已经康复(如以上在关于诊断方法的段落中所解释的)。
用于监测病理状况的演变的方法
本发明还涉及一种用于跟踪受试者的病理状况的进程的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在时刻t1向所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；以及
-至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
b)在时刻t1测量所述样品在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)在时间上与时刻t1分开的时刻t2处，向所述受试者的生物样品中添加如步骤a)中所定义的组合物，
d)在时刻t2测量所述样品在气相中释放的经标记乙醇的量，
e)比较分别在时刻t1和t2在步骤b)和d)中获得的值，
f)由此推断所述病理状况是否有利地改变，以及
g)任选地，重复步骤a)至f)。
本发明还涉及一种用于跟踪受试者的病理状况的进程的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在时刻t1向所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
b)在时刻t1测量所述样品在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)在时间上与时刻t1分开的时刻t2处，向所述受试者的生物样品中添加如步骤a)中所定义的组合物，
d)在时刻t2测量所述样品在气相中释放的经标记乙醇的量，
e)比较分别在时刻t1和t2在步骤b)和d)中获得的值，
f)由此推断所述病理状况是否有利地改变，以及
g)任选地，重复步骤a)至f)。
病理状况具体如上文在“病理状况”部分中所定义。优选地，病理状况是炎症性疾病，并且优选癌症。
生物样品是来自受试者的样品，特别是如上文在“生物样品”部分中所定义的。优选地，生物样品是血液、血浆或活检样品。
受试者具体如上文在“受试者”部分中所定义。
步骤a)至d)的特征通常如“诊断方法”部分中所定义的步骤a)和b)所定义。
在用于监测如上所定义的病理状况的进程的方法中，步骤b)和d)包括在时间上分开的两个时刻t1和t2测量受试者的生物样品中的经标记乙醇的量、浓度和/或比例。
换句话说，在来自于在时刻t1进行的采样的生物样品中以及在来自于在时刻t2采集的样品的生物样品中进行测量，时刻t1先于时刻t2。
t1与t2之间的时间间隔是例如至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、六个月或至少六个月，例如一年。
在步骤e)中，将步骤a)中在时刻t1和时刻t2获得的结果相互比较。
在步骤f)中，由此推断病理状况是否有利地进展。
例如，如果释放的乙醇的量在时刻t1与t2之间降低，则病理状况有利地演变。
例如，如果释放的乙醇的量在时刻t1与t2之间相等或增加，则病理状况进展不利。
当对样品测量的乙醇值被包括在相对于健康受试者在所有动力学点上的值的平均值的标准偏差中时，疾病的进展被认为是高度有利的(如以上在关于诊断方法的段落中所解释的)。
当对样品测量的乙醇值被包括在相对于患病受试者在所有动力学点上的值的平均值的标准偏差中或大于该标准偏差时，疾病的进展被认为是高度不利的(如以上在关于诊断方法的段落中所解释的)。该值是在至少一个动力学点上对健康受试者测量的值的平均值的至少1.3倍。
该方法可包括步骤g)，其中重复步骤a)至f)，特别是无论病理状况是否有利地进展。
步骤a)至f)可以重复一次、两次、三次或至少三次。
例如，可以重复步骤a)至f)，直到受试者已经康复或病理状况已经稳定。
步骤a)至d)可以以规则或不规则的时间间隔重复。
两次重复之间的时期可以是例如至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、六个月或至少六个月，例如一年。
对患有病理状况或处于患病理状况的风险中的受试者进行分类的方法
本发明还涉及一种用于将患有病理状况的受试者分类为类别C-1(在一个严重性程度下患有所述病理状况的受试者)或类别C-2(在另一个严重性程度下患有所述病理状况的受试者)的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；以及
-至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值进行比较，以及
d)由此推断受试者在类别C-1中还是在类别C-2中。
本发明还涉及一种用于将患有病理状况的受试者分类为类别C-1(在一个严重性程度下患有所述病理状况的受试者)或类别C-2(在另一个严重性程度下患有所述病理状况的受试者)的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值进行比较，以及
d)由此推断受试者在类别C-1中还是在类别C-2中。
病理状况具体如上文在“病理状况”部分中所定义。优选地，病理状况是炎症性疾病，并且优选癌症。
生物样品是来自受试者的样品，特别是如上文在“生物样品”部分中所定义的。优选地，生物样品是血液、血浆或活检样品。
受试者具体如上文在“受试者”部分中所定义。
步骤a)至c)的特征通常如“诊断方法”部分中所定义的步骤a)和b)所定义。
用于诊断的试剂盒和用途
本发明还涉及一种用于诊断病理状况的试剂盒，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述试剂盒包含组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-N-乙酰葡糖酰胺，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；以及
-至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素。
本发明还涉及一种用于诊断病理状况的试剂盒，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述试剂盒包含组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)。
本发明还涉及一种用于诊断病理状况的试剂盒，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述试剂盒包含如上所定义的组合物C1或C2。
本发明还涉及前述试剂盒用于诊断病理状况的用途，该病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组。
附图说明
图1示出了用于在探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸存在下检测β-葡萄糖醛酸酶和执行分析方法GC-MSMS的校准直线(LOD、LOQ和R2)。
图2示出了用于在对硝基苯酚葡糖苷酸存在下检测β-葡萄糖醛酸酶和执行UV检测方法的校准直线(LOD、LOQ和R2)。
图3示出了在添加探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸后释放到患者的血浆顶部空间中的乙醇-D5检测的动力学。
图4示出了在添加探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸后释放到具有不同大小肿瘤的患者的血浆顶部空间中的乙醇-D5检测的动力学。
图5示出了作为所添加的探针Ds-乙基-β-D-葡糖苷酸的浓度(10-9M)的函数的小鼠组织样品的顶部空间中乙醇-D5的检测。
图6示出了每种探针在它们的靶标酶存在下水解后释放的乙醇-D5和乙醇-13C-D5的量。β-葡萄糖醛酸酶(酶1)和D5-乙基-β-D-葡糖苷酸(探针1)。N-乙酰基-氨基葡糖苷酶(酶2)和13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺(探针2)。
图7示出了每种探针在它们的伴侣酶存在下水解后释放的乙醇-D5和乙醇-13C-D5的量。N-乙酰基-氨基葡糖苷酶(酶2)和D5-乙基-β-D-葡糖苷酸(探针1)。β-葡萄糖醛酸酶(酶1)和13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺(探针2)。
图8示出了当在存在以下酶中的一者或另一者的情况下放置两种探针时释放的乙醇-D5和乙醇-13C-D5的量：β-葡萄糖醛酸酶(酶1)、D5-乙基-β-D-葡糖苷酸(探针1)和13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺(探针2)。N-乙酰基-氨基葡糖苷酶(酶2)和D5-乙基-β-D-葡糖苷酸(探针1)和13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺(探针2)。
图9a示出了靶向β-葡萄糖醛酸酶的D5-乙基-β-D-葡糖苷酸水解后释放的乙醇-D5的量(n＝4名健康患者，n＝3名乳腺癌患者，n＝3名肺癌患者)。图9b示出了靶向α-L-岩藻糖苷酶的D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷水解后释放的乙醇-D4的量(n＝2名健康患者，n＝1名乳腺癌患者，n＝1名肺癌患者)。图9c示出了在靶向N-乙酰基-氨基葡糖苷酶的13CD5-乙基-N-乙酰基葡糖胺水解后释放的乙醇-13CD5的量(n＝4名健康患者，n＝3名乳腺癌患者，n＝3名肺癌患者)。图9d示出了靶向β-D-半乳糖苷酶的D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷水解后释放的乙醇-D2的量(n＝4名健康患者，n＝3名乳腺癌患者，n＝3名肺癌患者)。
图10a示出了注射10pg.kg-1D5-乙基-β-D-葡糖苷酸后动物呼出的乙醇-D5的量。图10b示出了注射100pg.kg-1D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷后动物呼出的乙醇-D4的量。图10c示出了注射10pg.kg-1 13CD5-乙基-N-乙酰基葡糖胺后动物呼出的乙醇-13CD5的量。图10d示出了注射1pg.kg-1D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷后动物呼出的乙醇-D2的量。
图11示出了校准直线，其具有在探针D5-乙基-α-吡喃甘露糖苷(10-3M)的存在下取决于α-甘露糖苷酶活性(U.L-1)的乙醇-D5的信号强度和用于检测该酶的VOC探针概念的性能(LOD和R2)。对三个不同的动力学点(反应2小时、4小时和7小时)绘制直线。每个点一式两份地进行。图11a对应于动力学点2小时至2小时30分钟，图11b对应于动力学点4小时至4小时30分钟，并且图11c对应于动力学点7小时至7小时30分钟。
图12示出了校准直线，其具有在探针D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(104M)的存在下取决于β-半乳糖苷酶活性(U.L-1)的乙醇-D2的信号强度和用于检测该酶的VOC探针概念的性能(LOD和R2)。对三个不同的动力学点(反应2小时、4小时和7小时)绘制直线。每个点一式两份地进行。图12a对应于动力学点2小时至2小时30分钟，图12b对应于动力学点4小时至4小时30分钟，并且图12c对应于动力学点7小时至7小时30分钟。
图13示出了校准直线，其具有在探针13C-D5-乙基-N-乙酰葡糖酰胺(10-3M)的存在下取决于N-乙酰基-氨基葡糖苷酶活性(U.L-1)的乙醇-13CD5的信号强度和用于检测该酶的VOC探针概念的性能(LOD和R2)。对三个不同的动力学点(反应2小时、4小时和7小时)绘制直线。每个点一式两份地进行。图13a对应于动力学点2小时至2小时30分钟，图13b对应于动力学点4小时至4小时30分钟，并且图13c对应于动力学点7小时至7小时30分钟。
图14a示出了在10-7M的D5-乙基-β-D-葡糖苷酸存在下，在活检物之上检测到的乙醇-D5的量。图14b示出了在10-4M的D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷存在下，在活检物之上检测到的乙醇-D的量。图14c示出了在10-8M的13CD5-乙基-N-乙酰基葡糖胺存在下，在活检物之上检测到的乙醇-13CD5的量。图14d示出了在10-6M的D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷存在下，在活检物之上检测到的乙醇-D2的量。
图15涉及基于VOC的探针的水解动力学(n＝7名健康患者；实线＝空白；虚线＝在处理之前在室温下保留30分钟的血液样品的响应的平均值：健康-T0；虚线＝在处理之前在4℃下保留5小时的血液样品的响应的平均值：健康-T2)。图15a示出了靶向β-葡萄糖醛酸酶的D5-乙基-β-D-葡糖苷酸水解后释放的乙醇-D5的量。图15b示出了靶向α-L-岩藻糖苷酶的D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷水解后释放的乙醇-D的量。图15c示出了靶向N-乙酰基氨基葡糖苷酶的13CD5-乙基-N-乙酰基葡糖胺水解后释放的乙醇-13CD5的量。图15d示出了靶向β-D-半乳糖苷酶的D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷水解后释放的乙醇-D2的量。图15e示出了靶向α-甘露糖苷酶的D5-乙基-α-吡喃甘露糖苷水解后释放的乙醇-D5的量。图15f示出了靶向α-D-葡糖苷酶的D4-乙基-α-D-葡糖苷酸水解后释放的乙醇-D4的量。
图16涉及在SARS-COV-2感染期间基于VOC的探针的预后效率(n＝10名轻微症状性患者：A组，n＝10名强症状性患者：B组，n＝10名进入重症监护的强症状性患者：C组)。图16a示出了靶向β-葡萄糖醛酸酶的D5-乙基-β-D-葡糖苷酸水解后释放的乙醇-D5的量。图16b示出了靶向α-L-岩藻糖苷酶的D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷水解后释放的乙醇-D的量。图16c示出了靶向N-乙酰基氨基葡糖苷酶的13CD5-乙基-N-乙酰基葡糖胺水解后释放的乙醇-13CD5的量。图16d示出了靶向β-D-半乳糖苷酶的D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷水解后释放的乙醇-D2的量。图16e示出了靶向α-甘露糖苷酶的D5-乙基-α-吡喃甘露糖苷水解后释放的乙醇-D5的量。图16f示出了靶向α-D-葡糖苷酶的D4-乙基-α-D-葡糖苷酸水解后释放的乙醇-D4的量。
图17涉及在SARS-COV-2感染期间通过基于VOC的探针检测到的酶促标志物的活性的进展(n＝10名轻微症状性患者：A组，n＝10名强症状性患者：B组，n＝10名进入重症监护的强症状性患者：C组)。图17a示出了靶向β-葡萄糖醛酸酶的D5-乙基-β-D-葡糖苷酸水解后释放的乙醇-D5的量。图17b示出了靶向α-L-岩藻糖苷酶的D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷水解后释放的乙醇-D4的量。图17c示出了靶向N-乙酰基氨基葡糖苷酶的13CD5-乙基-N-乙酰基葡糖胺水解后释放的乙醇-13CD5的量。图17d示出了靶向β-D-半乳糖苷酶的D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷水解后释放的乙醇-D2的量。图17e示出了靶向α-甘露糖苷酶的D5-乙基-α-吡喃甘露糖苷水解后释放的乙醇-D5的量。图17f示出了靶向α-D-葡糖苷酶的D4-乙基-α-D-葡糖苷酸水解后释放的乙醇-D4的量。
图18示出了校准直线，其具有在探针D-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷(10-3M)的存在下取决于α-岩藻糖苷酶活性(U.L-1)的乙醇-D4的信号强度和用于检测该酶的VOC探针概念的性能(LOD和R2)。对三个不同的动力学点(反应2小时、4小时和7小时)绘制直线。每个点一式两份地进行。图18a对应于动力学点2小时至2小时30分钟，图18b对应于动力学点4小时至4小时30分钟，并且图18c对应于动力学点7小时至7小时30分钟。
实施例
实施例1：对用于检测血液样品中的肿瘤酶标志物的方案的优化；用混合物的探针
验证
进行了旨在证明本发明的探针从简单的患者血液样品中诊断最广泛的实体癌的相关性的离体研究。
该初步研究用混合物的探针之一，即探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸(如上所定义的探针(1))进行，该探针靶向β-葡萄糖醛酸酶并且在水解后释放经标记的VOC，即乙醇-D5。
为了检测血浆样品中的酶，研究了该基质内β-葡萄糖醛酸酶水解的最佳条件。使用取自健康患者的血浆样品来优化所有条件。使用大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶作为酶促模型。测试了不同的参数，诸如所使用的缓冲液(实验1)、反应体积(实验2)、待添加到样品中的最佳探针浓度(实验3)、血浆的冷冻/解冻对酶活性的影响(实验4)，以及最终地，血浆蛋白酶对酶活性的影响(实验5)。所有这些实验总结于表1中。
表1.优化血浆中β-葡萄糖醛酸酶水解的最佳条件。
根据该实验计划，确定最佳的血浆探针水解条件，如下文所解释的：
因此，在患者第一次与主治肿瘤学家会诊时，从患者采集4mL至5mL血液样品。
提取血浆(约2μL)并储存在-20℃下直至分析。采集25μL血浆的等分试样，并将其插入带插入件的2μL小瓶中。将该生物样品添加到50μL的乙酸盐缓冲溶液(pH 5)、蛋白酶抑制剂(1X)和25μL探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸中，浓度为2×10-4M。将小瓶气密封闭并搅拌至涡流后，在反应2小时、4小时和7小时后，对样品上方的气相进行30分钟的SPME(Car/PDMS的半极性相中的SPME，1cm长且75μm厚类型，带24号针头；Supelco)。每个动力学点需要一个小瓶反应，并且一式两份地进行。然后通过GC-TQMS分析捕获在SPME纤维上的VOC。用与装备有E1源的三重四极杆偶联的气相色谱(TSQ 9000，Thermo Fisher Scientific)进行乙醇同位素的GC-TMS检测(因此包括乙醇-D5)。系统由软件TSQ 9000控制，并将结果用Xcalibur软件(Thermo Fisher Scientific)分析。分析条件总结于表2中。
表2.该方法的设定GC和TQ使得能够分析VOC。
对于每个对照测量，必须用VOC探针在用于每次研究的所有小瓶中证实不存在乙醇的同位素。因此，在实验开始之前对VOC进行10分钟的SPME采样，然后通过GC-TQMS分析。所有所谓的“跟踪外源性VOC污染的”小瓶均未使用。
对于SRM模式(选择反应监测)的检测，必须预先对每个经标记的VOC的转变进行优化。乙醇-D5之后是转变51>33和51>49，其不同于可能干扰分析的未标记乙醇的转变(转变46>31和46>45)。
然后确定血浆基质中的模型酶(大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶；液体溶液50％甘油，140U.mL-1；Sigma Aldrich)在探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸存在下的检测限(LOD)。为此，将无法检测到内源性β-葡萄糖醛酸酶活性的血浆样品添加至1×10-11mol.L-1至1×10- 13mol.L-1范围内的酶浓度。在添加探针之前以及然后在30℃下反应2.5小时、4.5小时和7.5小时之后，监测释放的乙醇-D5的量。图1示出了允许在反应7.5小时后检测β-葡萄糖醛酸酶的校准直线。
用探针检测酶的极限在1×10-13mol.L-1(信噪比9)与5×10-13mol.L-1(信噪比37)之间，这导致可检测酶的最小数量等于1×10-18mol。该LOD是根据该相同酶的参考检测方法获得的阈值的1/100(Li等人，2018,Biotechnology Letters,40,11 1-118；Xiao等人，2020,RSC Advances,10,22966)。该方法对应于对硝基苯酚葡糖苷酸的水解。其在乙酸盐缓冲液(pH>10)中进行，随后在400nm处对硝基苯酚进行UV检测(图2)。
最后，与文献相比，根据本发明的方法的灵敏度已被证明是最近的涉及荧光探针(如对硝基苯酚葡糖苷酸)的策略的100至1000倍(Huo等人2018,Sensors and ActuatorsB:Chemical,262,508-515；Guo等人2019,Sensors and Actuators B:Chemical,295,1-6)。其灵敏度也是最灵敏的蛋白质组学分析的10倍(Selevsek等人2011,Proteomics,11,1135-1147)。
在优化用于检测β-葡萄糖醛酸酶的策略并评价与分析方法相结合的VOC探针的性能后，对血浆样品进行临床研究。相关临床方案由CIC(PU/PH R.Robert，INSERM 1402，CHUPoitiers)制定，并然后由CHU Poitiers医院伦理委员会进行评价。
血液样品由与肿瘤服务相关联的护理者采集，然后收集并用CIC预处理。该研究包括取自11名乳腺癌患者和11名肺癌患者的血浆样品。这些患者均已确诊，但在采样时尚未接受治疗。将它们的响应与从4名健康患者的血浆中获得的响应进行比较。将结果与其中添加了探针但不存在酶的实验空白进行比较(图3)。
在添加探针后，在癌症患者样品上方释放的乙醇-D5的量与空白样品和健康患者的血浆相比显著更高。因此，该测试使得能够将健康患者与癌症患者区分开。
存在于患者血浆中的酶的量似乎与肿瘤的大小不是正相关的(图4)。因此，为了确认这些生理病理学参数与血浆酶活性之间的相关关系，可以研究癌症的侵袭性或其演变阶段等其他因素。
此外，根据患者的临床和生物学数据，已经证明，我们的策略使得能够检测亚厘米大小的肿瘤，诸如在患者身上意外发现的肿瘤(带菱形的曲线，图4)。这一结果证明了VOC探针检测肿瘤的灵敏度，尽管成像无法证实这一诊断。
实施例2：对用于检测组织样品(活检物)中的肿瘤酶标志物的方案的优化；用混合
物的探针验证
在此，目标是开发一种方案，使得能够在肿瘤细胞的细胞外环境中检测靶标酶，而这些酶在健康细胞的环境中应当不存在或具有有限的活性。
首先开发该方案以便用的混合物的对应探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸检测β-葡萄糖醛酸酶。
首先需要确定待添加到组织中的探针浓度，以仅检测存在于细胞外培养基中的酶。
因此，进行在存在浓度渐低的D5-乙基-β-D-葡糖苷酸的情况下放置肿瘤和健康活检物的测试。所保留的探针浓度对应于未获得健康组织响应的浓度，而在癌症组织上观察到酶促响应。
在这项工作的背景下，研究了在小鼠模型上取得的两个肿瘤活检物(MDA-MB-231：人乳腺癌细胞；KB：人鼻咽癌细胞)。
使用两个小鼠肝活检物作为健康组织。在PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCI、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4，pH 7.4)中制备10-7M、10-6M、10-4M和10-2M的探针溶液。
将活检物用500μL的PBS冲洗，然后置于带插入件的2mL小瓶中。将297μL的PBS添加到小瓶中。将小瓶顶部空间中存在的挥发性分子捕获30分钟，以确保检测不到乙醇-D5。然后添加3μL的10-7M、10-6M、10-4M或10-2M的探针(小瓶中最终探针浓度为10-9M、10-8M、10-6M或10-4M)。在气密封闭和涡流搅拌后，将挥发性化合物在SPME纤维(Car/PDMS，Supelco)上预浓缩30分钟，然后通过GC-TQMS分析(分析条件描述于表2中)。
对于每个对照测量，必须在用于研究的所有小瓶中证实不存在乙醇的同位素。因此，在实验开始之前对VOC进行10分钟的SPME采样，然后通过GC-TQMS分析。所有所谓的“跟踪外源性VOC污染的”小瓶均未使用。
尽管肿瘤活检物有显著的标准偏差，但显然的是，小于10-4M的探针浓度使得能够区分健康组织与癌组织(图5)。实际上，对于等于10-9M、10-8M和10-6M的探针浓度，在健康组织上并未检测到乙醇-D5中的响应，而在这些浓度下，对于癌症组织检测到该同位素的释放。这一结果表明，在这些浓度下，探针不会被动地穿透细胞，因此不会被肿瘤细胞和健康细胞的溶酶体β-葡萄糖醛酸酶水解。另一方面，探针确实被癌症组织的细胞外基质中存在的β-葡萄糖醛酸酶水解。因此，在针对属于混合物的每种探针优化添加到培养基中的剂量后，可以将靶标酶的活性直接映射到组织活检物中。
实施例3：使用根据本发明的四种基于VOC的探针的混合物进行初步测试
研究了靶向N-乙酰基-氨基葡糖苷酶的第二种探针，13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺(如上所定义的探针(2))。为了区分该探针水解后释放的乙醇与D5-乙基-β-D-葡糖苷酸水解后释放的乙醇，开发了使用GC-MS/MS的靶向分析方法(SRM模式)，并优化了同位素13C-D5的转变(乙醇-13C-D5的转变：52>34和52>50)。
然后验证该化合物在乙醇和乙醇-D5的存在下的检测性能。然后证明，在乙醇和乙醇-D5的存在下，检测乙醇-13C-D5的特异性和灵敏度没有任何改变。然后在为生物样品开发的SPME采样条件下进行乙醇-D5和乙醇-13C-D5的检测范围(在30℃下采样30分钟)。这两种同位素以混合物的形式存在于溶液中。获得的检测限分别为1×109M和5×109M。因此，SPME-GC-TQMS方法允许根据这两种同位素的质量碎片对它们进行明显区分。
然后进行实验研究以评价D5-乙基-β-D-葡糖苷酸和13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺对它们各自的酶(β-葡萄糖醛酸酶和N-乙酰基氨基葡糖苷酶)的亲和力。为此，在它们各自的探针的存在下(图6)，然后在其配偶体的底物探针的存在下(图7)，研究这些酶中每一种酶的水解功效。在第一种情况下，每种酶水解其自身的探针，从而产生经标记的乙醇信号(图6)。在另一种情况下，没有检测到乙醇信号，这表明β-葡萄糖醛酸酶不水解13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺，并且相反，N-乙酰基氨基葡糖苷酶不水解D5-乙基-β-D-葡糖苷酸(图7)。在存在两种底物的情况下，每种酶仅对特异于其的探针给出信号(图8)。
该研究证明了两种酶对它们各自探针的特异性。
研究了两种另外的探针，分别为靶向β-D-半乳糖苷酶和α-L-岩藻糖苷酶的D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(探针(3))和D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷(探针(4))，因此将混合物中探针的数量取为4。为了将4种同位素与这四种探针水解后释放的乙醇区分开，对每种同位素的MRM转变进行重新优化(表3)。当以等摩尔浓度单独或作为混合物研究时，通过测量每种同位素的信号强度来验证4种同位素之间不存在相互作用响应。
表3.乙醇的4种同位素的MRM转变。以粗体表示的转变用于定量每种VOC。
因此由4种探针(D5-乙基-β-D-葡糖苷酸、13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺、D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷和D-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷)组成的混合物靶向在不同类型的实体瘤中或在癌症患者的血液循环中鉴定的酶。
为了验证该混合物的诊断功效，对取自4名患有乳腺癌的患者和3名患有肺癌的患者的血浆样品进行测试。这些患者均已确诊，但在采样时尚未接受适合他们的病理状况的治疗。
在添加4种探针(根据上述方案)后，随时间推移测量在患者样品上方释放的乙醇的4种同位素的数量。将每种同位素的响应与当将混合物添加到4名健康患者的血浆中时获得的响应进行比较。每天还进行一次实验空白分析。这些空白对应于阴性对照，其中添加了混合物，而其中4种酶都不存在(图9)。
三种探针(D5-乙基-β-D-葡糖苷酸、D-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷、13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺)允许健康患者和癌症患者之间的清楚辨别。因此，这一结果表明，此处靶向的3种酶是在支气管肺和乳腺肿瘤处分泌的。因此，它们存在于患者的血液循环中，并且保持了一些活性(表明它们没有变性或变性程度不高)。
另一方面，探针D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷不能区分健康患者和癌症患者。该探针靶向的酶，β-D-半乳糖苷酶，在患病患者的血浆中似乎没有活性。基本假设是酶不存在于肿瘤微环境中(肿瘤细胞或免疫细胞不分泌这种酶)，或者如果存在，则在变性后使其失活。
最后，用靶向β-D-葡萄糖醛酸酶的参考方法(在对硝基苯酚的存在下进行UV检测；方案描述于第5页)测试这些相同的血浆样品。根据该方案，与使用葡糖醛酸化探针的方案相反，在任何样品中均未检测到该酶。这种信号的缺失证明了与当前标准相比基于VOC的探针的灵敏度。
然后对这4种探针的混合物进行体内测试，以实时证明(1)其区分健康动物和患病动物的功效，以及肿瘤微环境中一种或多种靶标酶的存在。
在本研究的背景下，在静脉注射混合物后，将携带肿瘤异种移植物(鼻咽KB的肿瘤细胞；n＝6)的小鼠模型呼出的4种同位素的数量与健康动物(n＝6)呼出的同位素的数量进行比较。
根据精确的实验计划预先确定待注射的4种探针的浓度，该实验计划的目标是确定每种探针在健康动物中诱导最小乙醇响应(信号达到低或甚至零基础水平)的量。在此背景下，健康动物接受递增剂量的4种探针(0.5μg.kg.kg-1至100μg.kg-1)。然后将动物置于密封笼中1小时。然后通过SPME采样测量存在于动物呼气中的每种乙醇同位素的量，持续30分钟，然后进行GC-TQMS分析。
证明每种探针的最佳注射剂量是不同的(即1μg.kg-1的D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷、10μg.kg-1的D5-乙基-β-D-葡糖苷酸和13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺，以及最终地，100μg.kg-1的D-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷)。这一结果代表了每种探针的穿透/代谢的可变性，或4种靶向酶的活性的变化。
一旦设定了i.v.剂量，在植入异种移植物12天和然后15天后将混合物注射到健康小鼠和患病小鼠中。在注射混合物后1小时测量动物呼出的乙醇同位素的量(图10)。对两只小鼠(健康的和患病的)进行阴性对照。该对照包括测量未接受混合物的小鼠周围空气中乙醇的4种同位素的数量。没有检测到乙醇-D5、乙醇-D4和乙醇-13CD5。另一方面，乙醇-D2的特异性转变产生了重要的信号，这意味着在小鼠周围环境中存在干扰化合物。因此从该背景噪声中减去由健康小鼠呼出的乙醇-D2的量。
值得注意的是，在用该混合物植入肿瘤后12天(动物中肿瘤植入的最小持续时间)，能够将患病动物与健康动物区分开(4种同位素中的3种同位素的呼出量对于患病动物而言显著更大)。
三天后，尽管肿瘤体积进一步增加，但4种探针在KB肿瘤的微环境中被显著激活，从而导致乙醇的4种同位素显著释放到动物呼出的空气中。因此，患病动物能够明确地与健康动物区分开。
应当注意的是，虽然D2-乙基-β-d-吡喃半乳糖苷探针无法将健康患者与乳腺癌或肺癌患者区分开来，但它在鼻咽肿瘤的微环境中被激活。因此，该探针使得能够通过肿瘤的位置来辨别肿瘤。
实施例4：三种靶标酶的检测限
在血浆基质中测量β-葡萄糖醛酸酶模型(大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶；液体溶液50％甘油，140U.mL-1；Sigma Aldrich)在添加浓度为5×10-5M的探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸存在下的检测限(LOD)。结果在最初提交中给出。
确定三种另外的酶的检测限：α-甘露糖苷酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰基氨基葡糖苷酶。因此，对这些酶中的每一种进行“VOC信号＝f(U.L-1活性)”类型的校准直线。
为此，使用商业酶(直生刀豆的α-甘露糖苷酶，在硫酸铵的液体溶液中，59.5U.mL-1，Sigma Aldrich；米曲霉的β-半乳糖苷酶，固体，13.4U.mg-1，Sigma Aldrich；牛肾N-乙酰基氨基葡糖苷酶，在硫酸铵液体溶液中，34.9U.mL-1，Sigma Aldrich；黄单胞菌α-L-岩藻糖苷酶，在TRIS-HCI的液体溶液中，0.1U.mL-1)，并通过试样中浓度为10-3M的D5-乙基-α-吡喃甘露糖苷探针、试样中浓度为10-4M的D2-乙基-β-d-吡喃半乳糖苷探针、试样中浓度为10-3M的13C-D5-乙基-N-乙酰葡糖酰胺探针和试样中浓度为10-3M的D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷探针测量它们各自的活性。
为了建立这三种酶中的每一种酶的校准直线，在乙酸盐缓冲液(pH 5)中制备浓度渐增的酶的溶液，然后将其插入带有插入件的2mL小瓶中(小瓶中的最终容积为100μL)。添加10μL体积的探针，以获得试样中所述浓度的D5-乙基-α-吡喃甘露糖苷、D2-乙基-β-d-吡喃半乳糖苷、13C-D5-乙基-N-乙酰葡糖酰胺或D-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷。
将小瓶气密封闭并搅拌至涡流后，将在反应2小时、4小时和7小时后，对样品上方的气相进行30分钟的SPME(Car/PDMS的半极性相中的SPME，1cm长且75μm厚类型，带24号针头；Supelco)。每个动力学点需要一个小瓶反应，并且将一式两份地进行。然后通过GC-TQMS分析捕获在SPME纤维上的VOC。用与装备有E1源的三重四极杆偶联的气相色谱(TSQ 9000，Thermo Fisher Scientific)进行乙醇同位素的GC-TMS检测(因此包括乙醇-D5、乙醇-D2、乙醇-13CD5和乙醇-D4)。系统由软件TSQ 9000控制，并将结果用Xcalibur软件(Thermo FisherScientific)分析。分析条件总结于表1和表2中。
表4.该方法的设定GC和TQ使得能够分析VOC。
表5.乙醇的4种同位素的MRM转变。以粗体表示的转变用于定量每种VOC。
反应2小时、4小时和7小时(采样30分钟)后的α-甘露糖苷酶、β-半乳糖苷酶和N-乙酰基-氨基葡糖苷酶的校准直线示于图11、图12、图13和图18中。
每种酶的检测限介于1.47×10-3与0.345U.L-1之间，这使得我们得到的可检测酶的最小数量小于或等于1013mol，就本文所用的商业酶而言。
这些LOD是用荧光探针获得的阈值的1/200至1/100,000(DOI:10.1021/acs.analchem.9b04806；10.1021/acs.analchem.9b03639；10.1039/c9tb00175a；10.1021/acscentsci.0c01189；10.1039/C8CC10311 A)。
实施例5：对癌症活检物的酶促活性研究
实时地使用由4种探针(D5-乙基-β-D-葡糖苷酸、13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺、D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷和D4-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷)组成的第一混合物，以在体内证明其区分健康动物和患病动物的功效，以及肿瘤微环境中一种或多种靶标酶的存在。获得的结果证明，4种探针在KB肿瘤(人颈部肿瘤)的微环境中被显著激活，从而导致在动物呼出的空气中乙醇的4种同位素的显著释放。因此，仅在植入肿瘤移植物后15天，才能够明确地将患病动物与健康动物区分开(参见上述实施例中的结果)。
靶向这些酶促活性的抗癌剂在治疗这种类型的癌症中可能是真正有益的。
根据该假设，用该相同的探针混合物研究了另一种实体瘤表型(肿瘤MDA-MB-231：人乳腺癌细胞)，目标是鉴定显著的酶促活性以合成对应的抗癌剂，从而靶向这些相同的活性，并最终验证其治疗功效。
由于如上所述的体内测试难以进行，我们直接在组织上进行了离体研究。
因此，根据上述活检物方案，在存在由4种探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸、13C-D5-乙基-N-乙酰基葡糖胺、D2-乙基-β-D-吡喃半乳糖苷和D-乙基-1-α-L-吡喃岩藻糖苷组成的混合物的情况下放置肿瘤和健康活检物(肾)，以证明分别靶向β-葡萄糖醛酸酶、N-乙酰基氨基葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶和α-1-岩藻糖苷酶的对应4种酶的细胞外活性。
在此之前，对待添加到组织中的每种探针的浓度进行优化，以便仅检测存在于细胞外培养基中的酶(注意：这4种糖苷酶也存在于细胞的溶酶体内，无论它们是癌性的还是健康的)。此外，通过测量，还验证了所有测试组织中都不存在乙醇的同位素。
因此，根据上述方案，在存在浓度渐增的每种探针的情况下放置健康的活检物(健康的整个器官)。为此，将活检物用500μL乙酸盐缓冲液(pH 5)冲洗两次，然后置于带插入件的2μL小瓶中。向每个小瓶中添加270μL体积的乙酸盐缓冲液，然后添加混合物，以获得10-4M至10-9M范围内的每种探针浓度。为每个探针选择一个浓度(图14)。因此，其对应于对应的乙醇同位素信号在健康组织(完整的或切割的；图14)中较小或甚至不存在时的浓度。
然后在这些条件下测试癌组织(完整的或切割的)。
结果证明，在乳腺肿瘤的环境中检测到前述4种酶(图14)。另一方面，在肿瘤的微环境中，N-乙酰基氨基葡糖苷酶似乎比其他酶具有更高的活性。然后合成靶向该酶的药剂，然后在小鼠模型上进行体内测试。所获得的结果证明了该抗癌剂的显著功效。
实施例6：用于疾病诊断和预后的混合物：SARS-COV-2感染的研究
根据最初提交的初步结果，基于VOC的探针能够诊断、预测和监测病理状况，诸如例如炎症(诸如癌症)和感染(诸如SARS-COV-2病毒感染)的演变。为了例证最初的应用，进行了旨在证明VOC探针作为SARS-COV-2感染的预后示踪剂的相关性的离体研究。为此，使用各自靶向不同糖酵解活性的基于VOC的六种探针测试来自感染有SARS-COV-2的30名患者的血液样品。
预先用不同探针的两种混合物对7名20岁至30岁健康志愿者的血液样品中存在的酶促活性进行研究(表6)。该研究的目标是(1)设定混合物的最终组成，(2)限定添加到血液样品中的探针的浓度以获得显著的同位素响应，已知该响应将不与对应探针的自发水解相关联，(3)限定最佳动力学点，(4)了解健康血浆样品中乙醇的同位素的响应范围。
此外，为每位患者采集两个样品，以研究将样品在室温下保存数小时(在医院条件下可能会发生)对酶促活性的潜在影响。因此，将第一样品转化为血浆，然后在血液采样后的一小时内冷冻。将第二样品在4℃下保存5小时，然后进行处理，然后冷冻。将样品全部储存在-20℃下直至分析。
表6.基于VOC的探针的两种混合物的组成
根据上述血浆方案，使用探针检测这些样品中的六种酶促活性。总之，将采集25μL血浆的等分试样，并将其插入带插入件的2mL小瓶中。该生物样品添加自61.4μL缓冲液(pH5)、3.6μL蛋白酶抑制剂(1X)和10μL的一种或另一种混合物。将小瓶气密封闭并搅拌至涡流后，将在反应2小时、4小时和7小时后，对样品上方的气相进行30分钟的SPME(Car/PDMS的半极性相中的SPME，1cm长且75μm厚类型，带24号针头；Supelco)。每个动力学点需要一个小瓶反应，并且一式两份地进行。然后根据表4和表5中限定的参数通过GC-TQMS分析捕获在SPME纤维上的VOC。每天进行空白混合物(在无血浆的乙酸盐缓冲液中的混合物)和血浆空白(具有无混合物的乙酸盐缓冲液的血浆)分析。
所获得的结果(图15)然后证明了这些酶中的每一种酶的非常不同的活性水平。例如，与β-D-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-甘露糖苷酶或α-葡糖苷酶相比，N-乙酰基氨基葡糖苷酶具有非常高水平的活性。同时，α-L-岩藻糖苷酶具有中间活性。因此，必须检查混合物的组成以限制乙醇的各种同位素之间的检测干扰。用于其余研究的混合物的组成示于表6中。
所获得的数据还使得可以证明，为了获得从背景噪声中出现的每种同位素的信号，7小时的动力学是必需的。经证明，超过7小时，样品内可变性增加，并且探针自发水解，这使得不可能维持反应超过7小时(已进行测试，数据未在此示出)。
最后，将血液样品保持在环境温度下对此处靶向的活性没有显著影响(图15)。
表7.基于VOC的探针的三种混合物的组成
然后用这三种探针混合物测试感染有SARS-COV-2的患者的血液样品，持续7小时的反应。进行完整的实验计划以便在每个样品中测试两种浓度的探针(浓度在上表6中限定)。这里的目标是确定每种探针的浓度，使得可以清楚地区分三组患者。
在本研究的背景下，研究了三组患者。第一组由10名年龄为39岁至74岁的弱症状性患者组成(组A)。第二组由10名年龄为46岁至70岁的住院高症状性患者组成(组B)。最后一组由10名年龄为50岁至72岁的重症监护住院的高症状性患者组成(组C)。所有这些患者在诊断后8天进行采样。
将血浆样品中探针的响应与它们在所谓的“空白”样品中的响应进行比较，该响应对应于单独添加到乙酸盐缓冲液中的探针。
结果证明，探针集合的最大浓度允许更好地区分这三组(包括探针D5-乙基-β-D-葡糖苷酸，当置于缓冲溶液中时，其仍然经历显著的自发水解；图16)。因此，在需要测试血浆样品时，探针将以这些浓度使用。
另外，结果证明，从阳性COVID测试后8天起，N-乙酰基氨基葡糖苷酶和α-甘露糖苷酶在症状严重并被送入重症监护的患者中具有更大的活性。这两种酶似乎是感染后8天开始可检测的SARS-COV-2感染的不利预后标志物。它们的浓度在接下来的几天显著降低，但是在已经发展出严重症状的患者中仍然是高的，这使得它们成为SARS-COV-2感染标志物。此外，两种其他的酶促标志物，β-葡萄糖醛酸酶和α-葡糖苷酶，似乎在感染后几周才在被送入重症监护的患者中开始发挥作用。它们各自的活性在感染后6个月变得明显。因此，这两种标志物将是被送入重症监护的患者所患有的慢性感染后炎症(ARDS)的标志物。长期跟踪这些标志物将使得验证炎症已经消退成为可能。
β-D-半乳糖苷酶和α-L-岩藻糖苷酶无法区分受感染的患者。然而，考虑到这两种酶是实体瘤标志物，它们应当允许我们区分患有癌症的患者与患有感染的患者。
Claims (10)
1.一种组合物，包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；其用作诊断剂和/或预后剂。
2.组合物的用途，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷)；其作为用于病理状况的离体诊断和/或预后的药剂，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物的用途，其中所述病理状况选自由以下组成的组：癌症、细菌和病毒感染、医院内感染、自身免疫性疾病、呼吸道炎症、慢性炎症、神经退行性疾病和慢性年龄相关性病症。
4.一种用于诊断受试者的病理状况的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值进行比较，以及
d)由此推断所述受试者是否受所述病理状况影响。
5.一种用于跟踪受试者中病理状况的治愈性或预防性治疗的功效的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
所述添加在所述治疗期间的时刻t在所述受试者的生物样品中进行，
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值和/或与在所述治疗开始之前或在所述治疗期间在所述时刻t之前的时刻t'获得的对应值进行比较，
d)由此推断所述治疗是否有效，以及
e)任选地，重复步骤a)至d)。
6.一种用于跟踪受试者的病理状况的进程的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在时刻t1向所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
b)在时刻t1测量所述样品在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)在时间上与时刻t1分开的时刻t2处，向所述受试者的生物样品中添加如步骤a)中所定义的组合物，
d)在时刻t2测量所述样品在气相中释放的经标记乙醇的量，
e)比较分别在时刻t1和t2在步骤b)和d)中获得的值，
f)由此推断所述病理状况是否有利地改变，以及
g)任选地，重复步骤a)至f)。
7.一种用于将患有病理状况的受试者分类为类别C-1，即在一个严重性程度下患有所述病理状况的受试者，或类别C-2，即在另一个严重性程度下患有所述病理状况的受试者的方法，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述方法包括以下步骤：
a)在所述受试者的生物样品中添加组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)；
b)测量在气相中释放的经标记乙醇的量，
c)将步骤b)中获得的值与对应的标准对照值进行比较，以及
d)由此推断受试者在所述类别C1中还是在所述类别C2中。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自由以下组成的组：血浆、血液、组织、唾液、尿液、脑脊液样品和活检物。
9.一种用于诊断病理状况的试剂盒，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组，
所述试剂盒包含组合物，所述组合物包含：
-至少乙基-β-D-葡糖苷酸，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-β-D-葡糖苷酸探针)，和至少乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(或乙基-β-D-吡喃半乳糖苷探针)，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素；
-或至少乙基-α-吡喃甘露糖苷，其乙基部分包含至少一种非放射性同位素(或乙基-α-吡喃甘露糖苷探针)。
10.根据权利要求9所述的试剂盒用于诊断病理状况的用途，所述病理状况选自由涉及响应于生物体的病变或感染的炎症反应的病理状况、慢性炎症性疾病和急性感染组成的组。
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