EP4340887A1 - Composés bifonctionnels de type protac ciblant pxr, leur procédé de préparation et leur utilisation en thérapeutique - Google Patents

Composés bifonctionnels de type protac ciblant pxr, leur procédé de préparation et leur utilisation en thérapeutique

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Publication number
EP4340887A1
EP4340887A1 EP22733859.7A EP22733859A EP4340887A1 EP 4340887 A1 EP4340887 A1 EP 4340887A1 EP 22733859 A EP22733859 A EP 22733859A EP 4340887 A1 EP4340887 A1 EP 4340887A1
Authority
EP
European Patent Office
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pxr
compound
ligase
formula
linker
Prior art date
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Pending
Application number
EP22733859.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Marc Pascussi
Julie Pannequin
Muriel AMBLARD-CAUSSIL
Guillaume Laconde
Sabine GERBAL-CHALOIN
Alain Chavanieu
William BOURGUET
Vanessa DELFOSSE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM, Universite de Montpellier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4340887A1 publication Critical patent/EP4340887A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
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    • C07D235/06—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C07D235/14—Radicals substituted by nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings

Definitions

  • TITLE BIFUNCTIONAL COMPOUNDS OF THE PROTAC TYPE TARGETING PXR, THEIR PREPARATION METHOD AND THEIR USE
  • the present invention relates to the treatment of cancer and more particularly cancers overexpressing the PXR nuclear receptor, such as colorectal cancer.
  • Colorectal cancer is the third most common cancer and is the third leading cause of cancer death.
  • Current treatments include surgery, radiation therapy, and chemotherapy, sometimes in combination with targeted therapies that demonstrate minor improvement.
  • the efficacy of these treatments is seriously compromised by the frequent appearance of resistance which leads to relapse in patients after stopping treatment (50% of patients).
  • cancer cell subpopulations, cancer stem cells (CSCs) have been shown to be involved in tumor initiation, metastatic development and drug resistance, thus leading to tumor recurrence. .
  • NR112 nuclear receptor PXR
  • shRNA RNA
  • Inhibition of the PXR nuclear receptor (NR112) therefore makes it possible to sensitize cancer stem cells to current treatments.
  • PXR antagonists identified to date are, however, either non-specific and/or toxic at the concentrations necessary for PXR inactivation, or not yet validated for clinical use.
  • PROTACs (“Proteolysis Targeting Chimera”) are bifunctional molecules that simultaneously bind a target protein and an E3-ubiquitin ligase. This causes poly-ubiquitination of the target protein which is thus degraded into small peptides and amino acids by the proteasome complex.
  • the PROTAC approach is therefore a chemical protein knock-down strategy
  • the present invention relates to the bifunctional compounds corresponding to the general formula (I):
  • L(PXR) is a ligand capable of binding to the PXR nuclear receptor
  • L(E3 ligase) represents a ligand of the E3 ubiquitin ligase
  • Linker represents a group that makes it possible to covalently bind L(PXR) to
  • the ubiquitin-proteasome (UPP) pathway is an essential cellular pathway that regulates key regulatory proteins and degrades misfolded or abnormal proteins. UPP is central to several cellular processes. If it is faulty or unbalanced, it leads to the pathogenesis of various diseases.
  • the covalent attachment of ubiquitin to specific protein substrates is achieved by the action of ubiquitin ligases E3. These ligases include more than 500 different proteins and are classified into several classes defined by the structural element of their functional activity E3.
  • the E3 ligase ligand which is a functional modality of the present compounds, binds to an E3 ubiquitin ligase.
  • the ligase catalyzes the covalent attachment of ubiquitin to the target protein, which in turn induces the degradation of the target protein by native proteasomes.
  • the compounds of the present invention are designed in a manner that exploits native cellular degradative processes but where the degradative action is directed to undesirable target proteins that are implicated in disease etiology.
  • the PROTACs according to the invention act as degradation enzymes with a super-stoichiometric action capacity.
  • L(PXR) which is a functional modality of the present compounds which binds to PXR.
  • the targeting ligand is an analog of the ligands of
  • L(PXR) can be chosen from the groups of formula
  • the compounds according to the invention can correspond to the following formula (1-1): where Linker, L(E3 ligase) are as defined above or below, or a pharmaceutically acceptable salt.
  • the E3 ligase ligand binds to cereblon.
  • L(E3 ligase) can in particular be chosen from: - the groups of formula (NIA): and
  • X is NH
  • X' is -C(O)- or -CH 2 -;
  • Y represents H or a C1-C6 alkyl group; represents the group's attachment to Linker.
  • the compounds according to the invention may in particular correspond to the formula (I-) or (1-3): where Linker, L(PXR), L(E3 ligase), X, X′, Y are as defined above or below; or a pharmaceutically acceptable salt.
  • Linker provides covalent attachment of the targeting ligand with the E3 ligase ligand.
  • Linker represents a C1 -C20 alkylene group, optionally interrupted or optionally ending at one and/or the other of the two ends, by one of the groups -0-, -S-, -N (R') -, -C(O)-, -C(0)0-, - OC(O) -, -0C(0)0 -, - C(NOR')-, -C(0 )N(R')-, -C(0)N(R')C(0)-, -C(0)N(R')C(0)N(R')-, -N(R' )C(0)-, -N(R' )C(0)-, -N(R' )C(0)-, -N(R' )C(0)-, -N(R' )C(0)-, -N(R' )C(0)-, -N(R' )C(0)
  • Linker can be chosen from C4-C20 alkylene groups, optionally interrupted by and/or ending with one or more groups chosen from -NH-, -O-, -C(O) -; piperidinyl, piperazinylene.
  • Linker can be represented among the groups of formula
  • Li and L 2 identical or different, independently represent an alkylene group of 1 to 12 carbon atoms optionally interrupted or ending in a heterocyclene of 3 to 12 members and comprising 1, 2 or 3 heteroatoms chosen from N,
  • Li is bound is linked to L(E3 ligase);
  • Z represents H or a C1-C6 alkyl group.
  • Li is a C7-alkylene group
  • L 2 is a (C2 to C8)-alkylene group optionally interrupted by a piperidinyl group.
  • the compounds according to the invention may correspond to the following formula (V): in which L 2 represents a linear C2-C8 alkylene group optionally interrupted by a piperidinyl group, and L(E3 ligase) is as defined above or below.
  • Alkyl means an aliphatic hydrocarbon group which may be linear or branched having about 1 to about 20 carbon atoms in the chain. Preferred alkyl groups have 1 to about 12 carbon atoms in the chain, especially 1 to 6 carbon atoms. Branched means that one or more lower alkyl groups, such as methyl, ethyl or propyl, are attached to a straight alkyl chain. “Lower alkyl” means from about 1 to about 4 carbon atoms in the chain which may be straight or branched.
  • the alkyl may be substituted with one or more "alkyl group substituents", which may be the same or different and include halo, cycloalkyl, hydroxy, alkoxy, amino, acylamino, aroylamino, carboxy, alkoxycarbonyl, aralkoxycarbonyl, heteroaralkoxycarbonyl or Y 1 Y 2 NCO-, wherein Y 1 and Y 2 are, independently, hydrogen, optionally substituted alkyl, optionally substituted aryl, optionally substituted aralkyl or optionally substituted heteroaralkyl, or Y 1 and Y 2 , taken together in conjunction with N through which Y 1 and Y 2 are linked, form a 4 to 7 membered heterocyclyl.
  • alkyl group substituents may be the same or different and include halo, cycloalkyl, hydroxy, alkoxy, amino, acylamino, aroylamino, carboxy, alkoxycarbonyl,
  • alkyl groups include methyl, trifluoromethyl, cyclopropylmethyl, cyclopentylmethyl, ethyl, n-propyl, 17-propyl, n-butyl, t-butyl, n-pentyl, 3- pentyl, methoxyethyl, carboxymethyl, methoxycarbonylethyl, benzyloxycarbonylmethyl, pyridylmethyloxycarbonylmethyl.
  • Alkylene designates a bivalent alkyl group as defined above.
  • Preferred alkylene groups are lower alkylene groups having 1 to about 6 carbon atoms.
  • Typical examples of alkylene groups include methylene and ethylene.
  • Cycloalkyl means a mono- or multi-cyclic non-aromatic ring system of about 3 to about 10 carbon atoms, preferably about 5 to about 10 carbon atoms. Preferred ring sizes of the rings of the ring system include about 5 to about 6 ring atoms, optionally substituted with one or more substituents.
  • Exemplary monocyclic cycloalkyls include cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, and the like.
  • Exemplary multicyclic cycloalkyls include 1-decalin, norbornyl, adamant-(1 or 2-)yl, and the like.
  • Cycloalkylene means a saturated, divalent cycloalkyl group as defined above, such as in particular cyclohexylene.
  • Heterocyclyl means a non-aromatic saturated monocyclic or multicyclic ring system of about 3 to about 10 carbon atoms, preferably about 5 to about 10 carbon atoms, wherein one or more of the carbon atoms in the system ring is/are hetero element(s) different from carbon, for example nitrogen, oxygen or sulphur.
  • Preferred ring sizes of the rings of the ring system include about 5 to about 6 ring atoms.
  • the designation of aza, oxa or thia as a prefix before heterocyclyl defines that at least one nitrogen, oxygen or sulfur atom is present, respectively, as a ring atom.
  • the heterocyclyl may be optionally substituted with one or more substituents, which may be the same or different, and are as defined herein.
  • the nitrogen atom of a heterocyclyl may be a basic nitrogen atom.
  • the nitrogen or sulfur atom of the heterocyclyl can also be optionally oxidized to the corresponding N-oxide, S-oxide or S,S-dioxide.
  • Exemplary monocyclic heterocyclyl rings include piperidyl, pyrrolidinyl, piperazinyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, thiazolidinyl, 1,3-dioxolanyl, 1,4-dioxanyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydrothiophenyl, tetrahydrothiopyranyl, and the like.
  • heterocyclene denotes a bivalent heterocyclyl radical as defined above.
  • Heteroaryl means an aromatic monocyclic or multicyclic ring system of about 5 to about 14 carbon atoms, preferably about 5 to about 10 carbon atoms, wherein one or more of the carbon atoms in the ring system is/are heteroelement(s) other than carbon, for example nitrogen, oxygen or sulphur. Preferred ring sizes of the rings of the ring system include about 5 to about 6 ring atoms. "Heteroaryl” can also be substituted with one or more substituents. The designation of aza, oxa or thia as a prefix before heteroaryl defines that at least one nitrogen, oxygen or sulfur atom is present respectively as a ring atom.
  • a nitrogen atom of a heteroaryl can be a basic nitrogen atom and can also be optionally oxidized to the corresponding N-oxide.
  • exemplary heteroaryl and substituted heteroaryl groups include pyrazinyl, thienyl, isothiazolyl, oxazolyl, pyrazolyl, furazanyl, pyrrolyl, 1,2,4-thiadiazolyl, pyridazinyl, quinoxalinyl, phthalazinyl, l imidazo[1,2-a]pyridine, imidazo[2,1-b]thiazolyl, benzofurazanyl, azaindolyl, benzimidazolyl, benzothienyl, thienopyridyl, thienopyrimidinyl, pyrrolopyridyl, imidazopyridyl, benzoazaindole, 1,2,4-triazinyl, benzthiazolyl, furanyl
  • Heteroarylene denotes a bivalent heteroaryl radical as defined above. “Substituents” denotes one or more identical or different groups chosen from halogen, cyano, cycloalkyl, hydroxy, alkoxy, amino, alkylamino, dialkylamino, aroylamino, carboxy, alkoxycarbonyl, aralkoxycarbonyl, heteroaralkoxycarbonyl.
  • the compounds of the present invention may be in the form of a free acid or a free base, or a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salts refers to the relatively non-toxic, inorganic and organic acid addition salts, and base addition salts, of the compounds of the present invention. These salts can be prepared in situ during the final isolation and purification of the compounds. In particular, acid addition salts can be prepared by separately reacting the purified compound in its purified form with an organic or inorganic acid and isolating the salt thus formed.
  • acid addition salts include hydrobromide, hydrochloride, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acetate, oxalate, valerate, oleate, palmitate, stearate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate salts.
  • Acid addition salts can also be prepared by separately reacting the purified compound in its acid form with an organic or inorganic base and isolating the salt thus formed.
  • Acid addition salts include amine and metal salts. Suitable metal salts include sodium, potassium, calcium, barium, zinc, magnesium and aluminum salts. Sodium and potassium salts are preferred.
  • Suitable basic inorganic addition salts are prepared from metallic bases which include sodium hydride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, aluminum hydroxide, lithium hydroxide, magnesium hydroxide, zinc hydroxide .
  • Suitable basic amine addition salts are prepared from amines which have sufficient alkalinity to form a stable salt, and preferably include amines which are often used in medicinal chemistry due to their low toxicity and acceptability.
  • ammonia ethylenediamine, N-methyl-glucamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N,N'-dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, diethanolamine, procaine, N-benzylphenethylamine, diethylamine, piperazine, tris(hydroxymethyl)- aminomethane, tetramethylammonium hydroxide, triethylamine, dibenzylamine, ephenamine, dehydroabietylamine, N-ethylpiperidine, benzylamine, tetramethylammonium, tetraethylammonium, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, ethylamine, basic amino
  • stereoisomer may have at least one chiral center and therefore may be in the form of a stereoisomer, which as used herein encompasses all isomers of individual compounds which differ only in orientation. of their atoms in space.
  • stereoisomer includes mirror image isomers (enantiomers that include the (R-) or (S-) configurations of compounds), mixtures of mirror image isomers (physical mixtures of enantiomers and racemates or racemic mixtures ) of geometric compounds (cis/trans or E/Z, R/S isomers) of compounds and isomers of compounds with more than one chiral center that are not mirror images of each other (diastereoi somers).
  • the chiral centers of compounds can undergo epimerization in vivo; thus, for these compounds, administration of the compound in its (R ⁇ ) form is considered equivalent to administration of the compound in its (S-) form. Accordingly, the compounds of the present invention can be made and used as individual isomers and substantially free of other isomers, or as a mixture of various isomers, eg, racemic mixtures of stereoisomers.
  • the following compounds are suitable for binding Cereblon and PXR:
  • the compounds according to the invention can be chosen from the compounds corresponding to one of the following formulas:
  • the present invention also relates to the process for the preparation of a compound according to the invention.
  • the compounds of general formula (I) can be prepared by applying or adapting any method known per se to and/or within the reach of those skilled in the art, in particular those described by Larock in Comprehensive Organic Transformations, VCH Pub., 1989 , or by application or adaptation of the methods described in the examples which follow.
  • said method comprises the coupling of a compound of formula (B) and a compound of formula (C):
  • the term "complementary reactive functions" designates two functions capable of reacting together to form a function providing a covalent bond between T and T'.
  • T and T' are such that T has a terminal function of the amine type and T' has a terminal function of the carboxylic acid type.
  • T represents a group of formula (T-B):
  • T' represents a group
  • TC in which Li and L 2 are as defined above.
  • Said coupling can advantageously be carried out in the presence of a peptide coupling agent such as BOP (benzotriazol-l -yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, typically in the presence of an organic base such as Hünig base (N, /V- diisopropylethylamine (DIPEA or DIEA).
  • BOP benzotriazol-l -yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate
  • organic base such as Hünig base (N, /V- diisopropylethylamine (DIPEA or DIEA).
  • compound (B) corresponds to formula (A):
  • the compound (C) corresponds to the formula (C-1): ligase)
  • said method may also comprise the step consisting in isolating the product of formula (I) obtained.
  • the product can, if desired, be further purified by various techniques, such as recrystallization, reprecipitation or the various chromatography techniques, including column chromatography or preparative thin layer chromatography.
  • compounds useful according to the present invention may contain asymmetric centers. These asymmetric centers may be independently in the R or S configuration. It will be apparent to those skilled in the art that certain compounds which are useful according to the invention may also exhibit geometric isomerism. It is to be understood that the present invention includes individual geometric isomers and stereoisomers and mixtures thereof, including racemic mixtures, of compounds of formula (I) above.
  • This type of isomers can be separated from their mixtures, by the application or adaptation of known methods, for example chromatography techniques or recrystallization techniques, or they are prepared separately from the appropriate isomers of their intermediates.
  • the basic products or reagents used are commercially available and/or can be prepared by the application or adaptation of known methods, for example methods as described in the Reference Examples or their obvious chemical equivalents.
  • the process according to the invention can implement the intermediate of formula (A) which is new.
  • the present invention therefore also relates to the compound of formula (A):
  • the compound of formula (A) can be prepared by coupling the following compounds:
  • This coupling can typically be achieved by applying or adapting the procedure described in example 1.
  • the compounds of formula (I) are capable of inducing the targeted proteolysis of PXR.
  • the compounds of formula (I) are therefore useful in the treatment and/or prevention of cancers, in particular cancers overexpressing PXR.
  • a subject of the present invention is therefore also pharmaceutical compositions comprising a compound according to the invention with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • said composition contains an effective amount of the compound according to the invention.
  • the present invention also relates to a compound of general formula (I) for the treatment and/or prevention of cancers, in particular cancers overexpressing PXR.
  • Cancers overexpressing PXR include colorectal cancer, and cancers of the pancreas, liver and breast.
  • the compounds according to the invention can be used in combination with an anti-cancer agent.
  • anticancer agents can be chosen in particular from 5-Fluorouracil (5-FU), Irinotecan (CPT11), Oxaliplatin, Cisplatin, Tamoxifen, Paclitaxel, Doxorubicin, Vonblastine, Cyclophosphamide (CPA), Isophosphamide (IFO).
  • said composition is administered to a patient in need thereof.
  • Said patient is in particular a patient resistant to the aforementioned anti-cancer agents.
  • the type of formulation of the pharmaceutical compositions of the invention depends on the mode of administration, which may include enteral (e.g. oral), parenteral (e.g. subcutaneous (sc), intravenous (iv), intramuscular (im) injection. and intrasternal, or infusion techniques, intravenous or intravenous), arterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, interdermal, rectal, intravaginal, intraperitoneal, topical mucosa, nasal, buccal, sublingual, intratracheal instillation, bronchial instillation and/or inhalation .
  • enteral e.g. oral
  • parenteral e.g. subcutaneous (sc), intravenous (iv), intramuscular (im) injection. and intrasternal, or infusion techniques, intravenous or intravenous
  • compositions are formulated for oral or intravenous administration (eg, systemic intravenous injection).
  • pharmaceutically acceptable carrier means a pharmaceutically acceptable material, composition or vehicle suitable for administering compounds of the present invention to mammals.
  • Suitable carriers can include, for example, liquids (both aqueous and non-aqueous and combinations thereof), solids, encapsulating materials, gases and combinations thereof (e.g. semi-solids) , which function to carry or transport the compound from one organ or body part to another organ or body part.
  • a carrier is "acceptable” in the sense that it is physiologically inert and compatible with the other components of the formulation and is non-toxic to the subject or patient. Depending on the type of formulation,
  • the compounds of formula I can be formulated into solid compositions (eg powders, tablets, dispersible granules, capsules, cachets and suppositories), liquid compositions (eg solutions in which the compound is dissolved, suspensions in which the particles of the compound are dispersed, emulsions and solutions containing liposomes, micelles or nanoparticles, syrups and elixirs); semi-solid compositions (for example, gels, suspensions and creams); and gases (eg propellants for aerosol compositions).
  • solid compositions eg powders, tablets, dispersible granules, capsules, cachets and suppositories
  • liquid compositions eg solutions in which the compound is dissolved, suspensions in which the particles of the compound are dispersed, emulsions and solutions containing liposomes, micelles or nanoparticles, syrups and elixirs
  • semi-solid compositions for example, gels, suspensions and creams
  • excipients which are suitable for solid administration are derivatives of cellulose or microcrystalline cellulose, alkaline-earth carbonates, magnesium phosphate, starches, modified starches, lactose for the forms solid.
  • water, aqueous solutions, saline, isotonic solutions are the most conveniently used vehicles.
  • the dosage may vary within significant limits depending on the therapeutic indication and the route of administration, as well as the age and weight of the subject.
  • Figure 1 depicts the PXR affinity of pre-PROTAC JMV6944 measured by RT-FRET.
  • FIG 2 illustrates the activation of PXR by the pre-PROTAC JMV6944 and the resulting PROTACs measured using a luciferase reporter gene placed under the control of the CYP3A4 promoter, the target gene of PXR.
  • Figures 3A and 3B represent the induction of a PXR target gene (i.e. CYP3A4) by pre-PROTAC JMV6944 and subsequent PROTACs measured by RT-qPCR.
  • Figures 4A and 4B illustrate and represent the effect of PROTACs JMV7048 and JMV7965 on the induction of CYP34 by Western blot.
  • FIGs 5A and 5B illustrate the effects of PROTACs on cell viability in different cell lines (LS174T, FIT29) and primary culture (CRC1) from colon cancer.
  • Figures 6A-E represent the effects of PROTACs on the degradation of the PXR protein in LS174T cells, measured by Western blot.
  • FIG 7 Figures 7A and 7B respectively represent the effects of PROTACs on the degradation of the PXR protein in FIEPG2 (7A) and ASPC1 (7B) cells, measured by Western blot.
  • FIGs 8A-B illustrate the importance of the proteasome pathway in the effects of PROTACs on PXR protein degradation measured by Western blot.
  • Figures 9A-C represent the effect of JMV7048 on the degradation of the PXR protein in vivo, on xenografts of LS174T cells in SCID mice, respectively.
  • Figures 10A-D represent respectively the effects of PROTACs on the cancer stem cell population: inhibition of ALDFI activity (10A), inhibition of their self-renewal capacity (10B) and sensitization to chemotherapy (10C and 10D)
  • FIG 11 Figure 11 illustrates the mode of interaction of JMV6944 with the LBD of hPXR.
  • 11 A Whole structure of the complex. The F112 activating helix is indicated. The arrow symbolizes the extension of the PROTACs synthesized thereafter.
  • 11 B Zoom on the JMV6944 exit pathway and superposition with the structure of the hPXR-LBD/SR12813 complex. The end of the H2' helix, residues 206 to 209, rearranges in the presence of the ligand.
  • 11C Interactions of JMV6944 with hPXR binding pocket residues and representation of ligand electron density (omit type difference map).
  • the following examples illustrate the invention, without however limiting it.
  • the starting products used are known products or products prepared according to known procedures.
  • Step 3 (9FI-fluoren-9-yl)methyl N-[7-(5-amino-1-benzyl-1H-1,3-benzodiazol-2-yl)heptyllcarbamate
  • Step 4 N-[2-(7-aminoheptyl)-1-benzyl-1H-1.3-benzodiazol-5-yl1-2.4.6-trimethylbenzene-1-sulfonamide
  • a solution containing (9H-fluoren-9-yl)methyl N-[7-(5-amino-1-benzyl-1H-1,3-benzodiazol-2-yl)heptyl]carbamate 0.386 g, 0.69 mmol
  • a pyridine / DCM (1/1) mixture 5 ml / 5 ml
  • 2-mesitylenesulfonyl chloride (0.166 g, 0.75 mmol
  • the reaction medium containing 4-Fluorophthalic anhydride (2.43 g, 14.63 mmol) and 3-aminopiperidine-2,6-dione (2.38 g, 14.63 mmol) and sodium acetate (2.4 g, 29.26 mmol) in the acetic acid (50 ml) is heated at 100° C. for 24 hours. After cooling to room temperature add water (150ml) to the reaction mixture, drain the mixture and wash with ether several times.
  • the 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-fluoroisoindoline-1,3-dione compound (500 mg, 1.81 mmol) is dissolved in NMP (7 ml) at ambient temperature.
  • DIEA (0.89 ml, 5.43 mmol)
  • t-butyl 1 -piperazinecarboxylate (370.9 mg, 1.99 mmol) are added and the mixture is stirred at 140° C. for 24 hours.
  • the solution is diluted in water (100 ml). Extract with ethyl acetate twice and the organic phase is washed with saturated NaCl and dried over magnesium sulphate.
  • Step 3 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1-yl)isoindoline-1,3-dione
  • 6-Bromohexanoic acid 152 mg, 0.73 mmol
  • DIEA 0.193 ml, 1.16 mmol
  • the solution is concentrated under reduced pressure.
  • the oil obtained is purified by preparative HPLC. After lyophilization, a yellow powder is obtained with a mass of 90 mg (65% yield).
  • Step 1 7- ⁇ 4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-yl]piperazin-1-yljheptanoic acid
  • Step 1 8- ⁇ 4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-yl]piperazin-1-yljoctanoic acid
  • Step 1 tert-butyl 4-( ⁇ 4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl),3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-yl]piperazin-1- yl ⁇ methyl)piperidine-1-carboxylate
  • Step 2 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5- ⁇ 4-[(piperidin-4-yl)methyl]piperazin-1-yl ⁇ -2,3-dihydro-1H-isoindole- 1,3-dione
  • the tert-butyl compound 4-( ⁇ 4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-yl]piperazin-1 -yl ⁇ methyl)piperidine-1-carboxylate (100 mg, 0.19 mmol) is dissolved in DCM (50ml). TFA (5ml) is added drop by drop to the reaction medium and stirred at room temperature for 5 hours. The solution is concentrated under reduced pressure. The oil obtained (75mg, yield 92%) is used as is in step 3.
  • Step 3 tert-butyl 2-[4-( ⁇ 4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-yl ]piperazin-1 -yl ⁇ methyl)piperidin-1 -yljacetate
  • Step 4 2-[4-( ⁇ 4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-yl]piperazin acid -1 -yl ⁇ methyl)piperidin-1 -yljacetic
  • Step 1 tert-butyl 4- ⁇ 4-[(2,6-dioxopiperidin-3-yl)carbamoyl]phenyl ⁇ piperazine-1-carboxylate To a solution containing 4-[4-(tert-butoxycarbonyl)piperazino]benzoic acid
  • Step 3 7-(4- ⁇ 4-[(2,6-dioxopiperidin-3-yl)carbamoyl]phenyl ⁇ piperazin-1 - yl)heptanoic acid
  • N-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-(piperazin-1-yl)benzamide compound 50 mg, 0.15 mmol
  • DMF 5 ml
  • 7-bromoheptanoic acid 66 mg, 0.31 mmol
  • DIEA 0.078 ml, 0.47 mmol
  • the solution is concentrated under reduced pressure.
  • the oil obtained is purified by preparative HPLC. After freeze-drying, a yellow powder is obtained with a mass of 38 mg (55% yield).
  • the 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-fluoroisoindoline-1,3-dione compound (250mg, 0.90 mmol) is dissolved in anhydrous DMF (5ml) and the reaction medium is stirred and brought to 0. °C. Add the NaH in portions and leave to stir for 20 minutes. Add the iodomethane and stir for 2 hours. Stop the reaction with a solution of NH4Cl. Extract with ethyl acetate and wash twice with NaCl sat the organic phase. Dry over MgS04, filter and concentrate under reduced pressure.
  • Step 2 tert-butyl 4-[2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol-5-yl]piperazine- 1-carboxylate
  • Step 3 2 (1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1-yl)-2,3-dihydro-1H-isoindole-
  • Step 4 6- ⁇ 4-[2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-5-yl]piperazin acid -1-yl ⁇ hexanoic
  • the human PXR receptor ligand-binding domain (hPXR-LBD, residues 130-434), was produced as a recombinant protein in E. coli BL21-DE3 bacteria.
  • the protein was purified on an affinity column then by size exclusion chromatography. After concentration, hPXR-LBD was crystallized in the presence of the JMV6944 ligand.
  • the structure of the hPXR-LBD/JMV6944 complex was determined by X-ray crystallography by the molecular replacement method, then reconstructed and refined on the basis of the electron density (diffraction data collected at the ESRF synchrotron, Grenoble). The structure is shown in Figure 11 .
  • the entire structure of the complex shows the binding mode of JMV6944.
  • the originality of JMV6944 lies in the position of the extension added to the parent molecule JMV6845 and its way out of the protein domain.
  • the extension grafted onto the agonist JMV6845 does not extend towards the H12 helix but points in the opposite direction between the helices H2', H6, H7 and the S1 strand to finally reach the outer surface of the LBD.
  • JMV6944 also establishes hydrogen bonds with I ⁇ 407 and S247, as well as hydrophobic interactions with L411 and F428 on the one hand, and the residues of the “p-trap” region. on the other hand (F288, W299, Y306).
  • the binding affinity between the JMV6944 molecule (prePROTAC) and the ligand binding domain (LBD) of PXR was quantified by FRET using the LanthaScreen TR-FRET PXR Competitive binding assay Kit (Invitrogen). The molecules were incubated for 1 hour 30 minutes at ambient temperature with the LBD of PXR in the presence of a fluorescent reference ligand. The displacement of the fluorescent ligand caused by the prePROTAC or the PXR ligand SR12813 was measured by reading the emissions at 520nm and 495nM after excitation at 337 nM on a PHERA-Star device (BMG LABTECH). The results are illustrated in Figure 1 which shows that the JMV6944 molecule is a PXR ligand with an affinity of 18.38 nM.
  • LS174T cells stably transfected with an expression vector encoding the PXR protein, a Luciferase reporter gene placed under the control of the CYP3A4 promoter (target gene of PXR) and an expression cassette encoding the GFP protein placed under CMV promoter control for signal normalization.
  • the cells were treated for 48 h with 5 mM of the molecules JMV6944 (prePROTACs), the PROTACs JMV7048 and JMV7605, as well as rifampicin (5 mM, PXR ligand).
  • the transcriptional activity of PXR is measured by the ratio of the luciferase/GFP signals measured on a PHERA-Star device (BMG LABTECH).
  • Figure 2 shows that only prePROTAC JMV6944 and rifampicin are able to activate PXR transcriptional activity.
  • the LS174T cells were treated for 48 hours with 5 mM of the molecules JMV6944 (prePROTACs), JMV7048, JMV7505, or JMV5159 (inactive equivalent of JMV7048 following the addition of a methyl group to the CNBR ubiquitin ligase ligand) in the presence or in the absence of rifampicin (ligand of PXR) at 5 mM final.
  • JMV6944 prePROTACs
  • JMV7048 JMV7505, or JMV5159
  • rifampicin ligand of PXR
  • FIG. 5A illustrates the absence of toxicity of PROTACs JMV7048, JMV7505 and JMV7605 on the LS174T line.
  • FIG. 5B it is seen that PROTAC JMV7048 does not affect the viability of HT29 cells or CRC1 protoculture (from a patient with colon cancer.
  • the effect of PROTACs on the level of expression of the PXR protein was studied by Western-blot.
  • the LS174T cells were transfected in the absence or presence of 50 nM of an siRNA targeting PXR (siPXR: NR112 Silencer, Thermofischer) or treated with PROTACs. After lysis of the cells (RIPA+antiproteases), the proteins were purified and assayed before being deposited (9C ⁇ g) on a 10% SDS-PAGE gel.
  • Figures 6D and 6E illustrate the effect of JMV7048 on the level of expression of PXR according to the treatment time (maximum effect reached after 3 hours of treatment) and the concentration used (decrease dependent on the dose, with a maximum effect observed from 500 nM).
  • FIGS. 7A and 7B illustrate the effect of PROTACs JMV7048 and JMV7965 on the level of expression of PXR in hepatic (7A) or pancreatic (7B) cancer cells
  • LS174T cells were treated for 24 hours with JMV7048 in the presence or absence of CNBR ubiquitin ligase (MLN4924) or proteasome inhibitor (Bortezomib).
  • Figures 8A and 8B confirm the importance of the proteasome pathway on the decrease in the level of expression of the PXR protein induced by PROTAC JMV7048: the decrease in the level of expression of PXR induced by JMV7048 is reversed by inhibitors ubiquitin ligase CRBN (MLN4924, Figure 8A) or by a 26S proteasome inhibitor (Bortezomib, Bz; Figure 8B), whereas the JMV7048 mutant (i.e. JMV7159, not allowing CNBR recruitment) does not cause any decrease in PXR expression level.
  • the JMV7048 mutant i.e. JMV7159, not allowing CNBR recruitment
  • PROTACs The effects of PROTACs on the survival and self-renewal of colon cancer stem cells were studied in vitro on the HT29 line or cancer cells isolated from patients (CRC1).
  • the cells were treated with or without 5mM PROTACs for 48 hours before being analyzed: Aldefluor labeling, enzymatic activity preferentially present in cancer stem cells (Figure 10A); formation of tumorspheres under aseric and non-adherent conditions, (FIG. 10B), and finally resistance to chemotherapies (FIG. 10C and 10D).
  • FIG. 10A shows that the PROTACs JMV7048, JMV 7505, JMV7506 and JMV7965 significantly reduce the percentage of ALDH-positive cells after dissociation of CRC1 cells and labeling with AldefluorTM (STEMCELL Technologies) compared to untreated cells.
  • FIG. 10B shows that the JMV7048 and JMV7965 molecules significantly reduce the number of HT29 cells capable of surviving anoikis () and of inducing the formation of T umorphers (Sphere Forming Cells). Tumorphers of more than 50 mM in diameter were counted 10 days after treatment and culturing 200 cells per well (previously treated with poly2Hema in order to prevent any cell adhesion) in 100 m ⁇ medium devoid of calf serum.
  • FIGS. 10A-D show that a treatment at 5 mM for 2 days with the PROTACs JMV7048 and JMV7965 significantly decreases the survival and the chemoresistance of stem cells in colon cancer cell lines.

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Abstract

La présente demande concerne de nouveaux composés bifonctionnels de type PROTAC liant simultanément la protéine cible PXR et l'E3-ubiquitine ligase, leur procédé de préparation et leurs utilisations pour traiter les cancers surexprimant PXR.

Description

DESCRIPTION
TITRE : COMPOSÉS BIFONCTIONNELS DE TYPE PROTAC CIBLANT PXR, LEUR PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET LEUR UTILISATION
EN THÉRAPEUTIQUE
La présente invention concerne le traitement du cancer et plus particulièrement les cancers surexprimant le récepteur nucléaire PXR, tels que le cancer colorectal.
Le cancer colorectal (CRC) se situe au troisième rang des cancers les plus fréquents et est la troisième cause de décès par cancer. Les traitements actuels comprennent la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, parfois en association avec des thérapies ciblées qui démontrent une amélioration mineure. Cependant, l'efficacité de ces traitements est gravement compromise par l'apparition fréquente de résistance qui conduit à la rechute des patients après l’arrêt des traitements (50% des patients). Au cours des dernières années, il a été montré que des sous-populations de cellules cancéreuses, les cellules souches cancéreuses (CSCs), étaient impliquées dans l'initiation tumorale, le développement métastatique et la résistance aux médicaments, conduisant ainsi à la récidive tumorale.
Les inventeurs ont désormais démontré que le récepteur nucléaire PXR (NR112) est préférentiellement activé dans les cellules souches cancéreuses et que l’extinction de son expression par interférence à l’ARN (shRNA) sensibilise cette population cellulaire, normalement résistante à la chimiothérapie, et retarde significativement la récidive tumorale chez la souris. L’inhibition du récepteur nucléaire PXR (NR112) permet donc de sensibiliser les cellules souches cancéreuses aux traitements actuels.
Les antagonistes de PXR identifiés à ce jour (L-sulforaphane, kétoconazole et SAP-70) sont cependant soit non spécifiques et/ou toxiques aux concentrations nécessaires à l’inactivation de PXR, soit pas encore validés pour une utilisation en clinique.
Les PROTACs (« Proteolysis Targeting Chimera ») sont des molécules bi fonctionnelles qui lient simultanément une protéine cible et une E3-ubiquitine ligase. Cela provoque la poly-ubiquitination de la protéine cible qui est ainsi dégradée en petits peptides et acides aminés par le complexe du protéasome. L’approche PROTAC est donc une stratégie de knock-down chimique de protéine
Il est donc désirable de mettre à disposition ligands chimériques bi-fonctionnels capables d’induire la protéolyse ciblée de PXR selon la stratégie PROTAC. Selon un premier objet, la présente invention concerne les composés bifonctionnels répondant à la formule générale (I) :
L(PXR)-Linker-L(E3 ligase)
(l) dans laquelle :
L(PXR) est un ligand capable de se lier au récepteur nucléaire PXR,
L(E3 ligase) représente un ligand de l’ubiquitine ligase E3, et
Linker représente un groupe qui permet de lier de façon covalente L(PXR) à
L(E3 ligase).
La voie de l'ubiquitine-protéasome (UPP) est une voie cellulaire essentielle qui régule les protéines régulatrices clés et dégrade les protéines mal repliées ou anormales. UPP est au cœur de plusieurs processus cellulaires. Si elle est défectueuse ou déséquilibrée, elle conduit à la pathogenèse de diverses maladies. L'attachement covalent de l'ubiquitine à des substrats protéiques spécifiques est obtenu par l'action d'ubiquitine ligases E3. Ces ligases comprennent plus de 500 protéines différentes et sont classées en plusieurs classes définies par l'élément structurel de leur activité fonctionnelle E3.
Le ligand de la ligase E3, qui constitue une modalité fonctionnelle des présents composés, se lie à une ubiquitine ligase E3. La ligase catalyse la fixation covalente de l'ubiquitine à la protéine cible, ce qui induit à son tour la dégradation de la protéine cible par les protéasomes natifs. Ainsi, les composés de la présente invention sont conçus d'une manière qui exploite les processus de dégradation cellulaires natifs mais où l'action de dégradation est dirigée vers des protéines cibles indésirables qui sont impliquées dans l'étiologie de la maladie.
Contrairement aux inhibiteurs chimiques conventionnels, les PROTACs selon l’invention agissent comme des enzymes de dégradation avec une capacité d’action super- stœchiométrique.
Les avantages des composés selon l’invention sont donc multiples :
1 ) ils sont actifs à des concentrations inférieures à celles de l’inhibiteur seul qui nécessite des niveaux élevés d'exposition systémique afin obtenir une saturation de la cible,
2) ils peuvent réaliser de multiples cycles de dégradation conduisant à la dégradation de la protéine ciblée,
3) comparée aux cinétiques rapides de dissociation des inhibiteurs sur leur cible, la restauration de la fonction protéique après une dégradation induite par PROTAC nécessite la synthèse de novo de la protéine par la cellule, ce qui prend beaucoup plus de temps et augmente ainsi la durée des effets des PROTACs. L(PXR) qui est une modalité fonctionnelle des présents composés qui se lie à PXR. Dans certains modes de réalisation, le ligand de ciblage est un analogue des ligands de
Selon un mode de réalisation, L(PXR) peut être choisi parmi les groupes de formule
(II) : où I représente l’attachement du groupe à Linker ; ou un sel pharmaceutiquement acceptable.
Ainsi, les composés selon l’invention peuvent répondre à la formule (1-1) suivante : où Linker, L(E3 ligase) sont tels que définis ci -avant ou ci-après, ou un sel pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation, le ligand de la ligase E3 se lie au céréblon. L(E3 ligase) peut notamment être choisi parmi : - les groupes de formule (NIA) : et
- les groupes de formule (INB) : ou un sel pharmaceutiquement acceptable, dans lesquelles formules (NIA) et (INB) :
X est NH ;
X’ est -C(O)- ou -CH2- ;
Y représente H ou un groupe Alkyle en C1 -C6 ; représente l’attachement du groupe à Linker .
Ainsi, les composés selon l’invention peuvent notamment répondre à la formule (I-) ou (1-3) : où Linker, L(PXR), L(E3 ligase), X, X’, Y sont tels que définis ci-avant ou ci-après ; ou un sel pharmaceutiquement acceptable.
Plus particulièrement, les composés selon l’invention peuvent répondre à l’une des formules suivantes
(1-5) dans lesquelles L(PXR), Linker sont définis ci-avant ou ci-après; ou un sel pharmaceutiquement acceptable.
Linker fournit une fixation covalente du ligand de ciblage avec le ligand de la ligase E3. Selon un mode de réalisation, Linker représente un groupe alkylène en C1 -C20, éventuellement interrompu ou se terminant éventuellement à l’une et/ou l’autre des deux extrémités, par l’un des groupes -0-, -S-, -N (R') -, -C(O)-, -C(0)0-, - OC(O) -, -0C(0)0 -, - C(NOR')-, -C(0)N(R')-, -C(0)N(R')C(0)-, -C(0)N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -
N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, -C(NR')-, -N(R')C(NR')-, -C(NR')N(R') -, - N(R')C(NR')N(R')-, -S(0)2-, -OS(O)-, -S(0)0-, -S(O)-, -0S(0)2-, -N(R')S(0)2-, -S(0)2N(R')-, -N(R')S-, -S(0)N(R')-, -N(R')S(0) 2 N(R') -, -N(R')S(0)N(R')-, cycloalkylène en C3 à C12, hétérocyclène de 3 à 12 chaînons et comprenant 1 , 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N, O, S, hétéroarylène de 5 à 12 chaînons et comprenant 1 , 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N, O, S, ou toute combinaison de ceux-ci, et dans lesquels R' identiques ou différents représentent H ou un groupe alkyle en C1-C6. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, Linker peut être choisi parmi les groupes alkylène en C4-C20, éventuellement interrompu par et/ou se terminant par un ou plusieurs groupes choisi parmi -NH-, -O-, -C(O)- ; pipéridinyle, piperazinylène.
Plus particulièrement, Linker peut être représenté parmi les groupes de formule
(IV) : où Li et L2 identiques ou différents représentent indépendamment un groupe alkylène de 1 à 12 atomes de carbone éventuellement interrompu ou se terminant par un hétérocyclène de 3 à 12 chaînons et comprenant 1 , 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N,
O, S ;
Li est lié est lié à L(E3 ligase) ;
Z représente H ou un groupe alkyle en C1 -C6.
Selon un mode de réalisation plus particulier, Li est un groupe C7-alkylène
(-C7H14-) .
Selon un mode de réalisation plus particulier, L2 est un groupe (C2 à C8)-alkylène éventuellement interrompu par un groupe pipéridinyle.
Selon un mode de réalisation, les composés selon l’invention peuvent répondre à la formule (V) suivante : dans laquelle L2 représente un groupe alkylène linéaire en C2-C8 éventuellement interrompu par un groupe pipéridinyle, et L(E3 ligase) est tel que défini ci-avant ou ci-après.
Les formules (I), (II), (NIA), (INB), (IV), (V) représentées ici couvrent également les sels pharmaceutiquement acceptables de celles-ci, leurs dérivés isotopiques et leurs stéréoisomères.
Tel qu’utilisé ci-avant et ci-après et sauf mention spécifique : « Alkyle » désigne un groupe hydrocarboné aliphatique qui peut être linéaire ou ramifié ayant environ 1 à environ 20 atomes de carbone dans la chaîne. Des groupes alkyles préférés ont 1 à environ 12 atomes de carbone dans la chaîne, notamment de 1 à 6 atomes de carbone. Ramifié signifie qu'un ou plusieurs groupes alkyles inférieurs, tels que le méthyle, l'éthyle ou le propyle, sont liés à une chaîne alkyle linéaire. « Alkyle inférieur » signifie d'environ 1 à environ 4 atomes de carbone dans la chaîne qui peut être linéaire ou ramifiée. L’alkyle peut être substitué par un ou plusieurs « substituants de groupe alkyle », qui peuvent être identiques ou différents et comprennent halo, cycloalkyle, hydroxy, alcoxy, amino, acylamino, aroylamino, carboxy, alcoxycarbonyle, aralcoxycarbonyle, hétéroaralcoxycarbonyle ou Y1Y2NCO-, dans lequel Y1 et Y2 sont, indépendamment, un hydrogène, un alkyle éventuellement substitué, un aryle éventuellement substitué, un aralkyle éventuellement substitué ou un hétéroaralkyle éventuellement substitué, ou Y1 et Y2, considérés ensemble conjointement avec le N par l'intermédiaire duquel Y1 et Y2 sont liés, forment un hétérocyclyle à de 4 à 7 éléments. Des exemples types de groupes alkyle comprennent le méthyle, le trifluorométhyle, le cyclopropylméthyle, le cyclopentylméthyle, l'éthyle, le n-propyle, 17-propyle, le n-butyle, le t- butyle, le n-pentyle, le 3-pentyle, le méthoxyéthyle, le carboxyméthyle, le méthoxycarbonyléthyle, le benzyloxycarbonylméthyle, le pyridylméthyloxycarbonylméthyle.
« Alkylène » désigne un groupe alkyle tel que défini ci-avant bivalent. Les groupes alkylène préférés sont les groupes alkylène inférieurs ayant 1 à environ 6 atomes de carbone. Des exemples types de groupes alkylène comprennent le méthylène et l'éthylène.
"Cycloalkyle" signifie un système de cycle non aromatique mono- ou multicyclique d'environ 3 à environ 10 atomes de carbone, de préférence d'environ 5 à environ 10 atomes de carbone. Les tailles de cycle préférées des cycles du système de cycle comprennent environ 5 à environ 6 atomes de cycle, éventuellement substitué avec un ou plusieurs substituants. Les cycloalkyles monocycliques exemplaires comprennent le cyclopentyle, le cyclohexyle, le cycloheptyle, et similaires. Les cycloalkyles multicycliques exemplaires comprennent la 1 -décaline, le norbornyle, l'adamant-(1 ou 2-)yle, et similaires.
"Cycloalkylène" signifie un groupe cycloalkyle tel que défini ci-avant saturé, bivalent, tel que notamment le cyclohexylène.
"Hétérocyclyle" signifie un système de cycle monocyclique ou multicyclique saturé non aromatique d'environ 3 à environ 10 atomes de carbone, de préférence d'environ 5 à environ 10 atomes de carbone, dans lequel un ou plusieurs des atomes de carbone dans le système de cycle est/sont un(des) élément(s) hétéro différent(s) du carbone, par exemple l'azote, l'oxygène ou le soufre. Les tailles de cycle préférées des cycles du système de cycle comprennent environ 5 à environ 6 atomes de cycle. La désignation de aza, oxa ou thia comme préfixe avant hétérocyclyle définit qu'au moins un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre est présent, respectivement, comme atome de cycle. L'hétérocyclyle peut être éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants, qui peuvent être identiques ou différents, et sont tels que définis ici. L'atome d'azote d'un hétérocyclyle peut être un atome d'azote basique. L'atome d'azote ou de soufre de l'hétérocyclyle peut aussi être éventuellement oxydé en le N-oxyde, S-oxyde ou S, S-dioxyde correspondant. Les cycles hétérocyclyle monocycliques exemplaires comprennent le pipéridyle, le pyrrolidinyle, le pipérazinyle, le morpholinyle, le thiomorpholinyle, le thiazolidinyle, le 1 ,3-dioxolanyle, le 1 ,4- dioxanyle, le tétrahydrofuranyle, le tétrahydrothiophényle, le tétrahydrothiopyranyle, et similaires.
Le terme "hétérocyclène" désigne un radical hétérocyclyle tel que défini ci-avant bivalent.
"Hétéroaryle" signifie un système de cycle monocyclique ou multicyclique aromatique d'environ 5 à environ 14 atomes de carbone, de préférence d'environ 5 à environ 10 atomes de carbone, dans lequel un ou plusieurs des atomes de carbone dans le système de cycle est/sont un(des) hétéro élément(s) différents du carbone, par exemple l'azote, l'oxygène ou le soufre. Les tailles de cycle préférées des cycles du système de cycle comprennent environ 5 à environ 6 atomes de cycle. L'"hétéroaryle" peut aussi être substitués par un ou plusieurs substituants. La désignation de aza, oxa ou thia comme préfixe avant hétéroaryle définissent qu'au moins un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre est présent respectivement comme atome de cycle. Un atome d'azote d'un hétéroaryle peut être un atome d'azote basique et peut aussi être éventuellement oxydé en le N-oxyde correspondant. Les groupes hétéroaryle et hétéroaryle substitués exemplaires comprennent le pyrazinyle, le thiényle, l'isothiazolyle, l'oxazolyle, le pyrazolyle, le furazanyle, le pyrrolyle, le 1 ,2,4-thiadiazolyle, le pyridazinyle, le quinoxalinyle, le phtalazinyle, l'imidazo[1 ,2-a]pyridine, l'imidazo[2,1-b]thiazolyle, le benzofurazanyle, l'azaindolyle, le benzimidazolyle, le benzothiényle, le thiénopyridyle, le thiénopyrimidinyle, le pyrrolopyridyle, l'imidazopyridyle, le benzoazaindole, le 1 ,2,4-triazinyle, le benzthiazolyle, le furanyle, l'imidazolyle, l'indolyle, l'indolizinyle, l'isoxazolyle, l'isoquinolinyle, l'isothiazolyle, l'oxadiazolyle, le pyrazinyle, le pyridazinyle, le pyrazolyle, le pyridyle, le pyrimidinyle, le pyrrolyle, le quinazolinyle, le quinolinyle, le 1 ,3,4-thiadiazolyle, le thiazolyle, le thiényle et le triazolyle. Les groupes hétéroaryle préférés comprennent le pyrazinyle, le théinyle, le pyridyle, le pyrimidinyle, l'isoxazolyle et l'isothiazolyle.
« Hétéroarylène » désigne un radical hétéroaryle tel que défini ci-avant bivalent. « Substituants » désigne un ou plusieurs groupes identiques ou différents choisis parmi halogène, cyano, cycloalkyle, hydroxy, alcoxy, amino, alkylamino, dialkylamino, aroylamino, carboxy, alcoxycarbonyle, aralcoxycarbonyle, hétéroaralcoxycarbonyle.
Les composés de la présente invention peuvent se présenter sous la forme d'un acide libre ou d'une base libre, ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable.
L’expression « sels pharmaceutiquement acceptables » fait référence aux sels d’addition acide relativement non toxiques, inorganiques et organiques, et les sels d’addition de base, des composés de la présente invention. Ces sels peuvent être préparés in situ pendant l’isolement final et la purification des composés. En particulier, les sels d’addition acide peuvent être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme épurée avec un acide organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Parmi les exemples de sels d’addition acide on trouve les sels bromhydrate, chlorhydrate, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acétate, oxalate, valerate, oléate, palmitate, stéarate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maléate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mésylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamates, malonates, salicylates, propionates, méthylènebis-b-hydroxynaphtoates, acide gentisique, iséthionates, di-p-toluoyltartrates, methanesulfonates, éthanesulfonates, benzenesulfonates, p-toluenesulfonates, cyclohexyl sulfamates et quinateslaurylsulfonate, et analogues. (Voir par exemple S.M. Berge et al. « Pharmaceutical Salts » J. Pharm. Sci, 66 :p.1 -19 (1977) qui est incorporé ici en référence). Les sels d’addition acide peuvent également être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme acide avec une base organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Les sels d’addition acide comprennent les sels aminés et métalliques. Les sels métalliques adaptés comprennent les sels de sodium, potassium, calcium, baryum, zinc, magnésium et aluminium. Les sels de sodium et de potassium sont préférés. Les sels d’addition inorganiques de base adaptés sont préparés à partir de bases métalliques qui comprennent hydrure de sodium, hydroxyde de sodium, hydroxyde de potassium, hydroxyde de calcium, hydroxyde d’aluminium, hydroxyde de lithium, hydroxyde de magnésium, hydroxyde de zinc. Les sels d’addition aminés de base adaptés sont préparés à partir d’amines qui ont une alcalinité suffisante pour former un sel stable, et de préférence comprennent les amines qui sont souvent utilisées en chimie médicinale en raison de leur faible toxicité et de leur acceptabilité pour l’usage médical : ammoniac, éthylènediamine, N-méthyl-glucamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N,N’-dibenzylethylenediamine, chloroprocaïne, diéthanolamine, procaïne, N-benzylphénéthylamine, diéthylamine, pipérazine, tris(hydroxymethyl)-aminomethane, hydroxyde de tétraméthylammonium, triéthylamine, dibenzylamine, éphénamine, dehydroabietylamine, N-ethylpiperidine, benzylamine, tétraméthylammonium, tétraéthylammonium, méthylamine, diméthylamine, triméthylamine, éthylamine, acides aminés de base, par exemple lysine et arginine, et dicyclohexylamine, et analogues.
Les composés de la présente invention peuvent avoir au moins un centre chiral et peuvent donc être sous la forme d'un stéréo-isomère, qui, tel qu'utilisé ici, englobe tous les isomères de composés individuels qui ne diffèrent que par l'orientation de leurs atomes dans l'espace. Le terme stéréo-isomère inclut les isomères d’image miroir (énantiomères qui incluent les configurations (R-) ou (S-) des composés), les mélanges d’isomères d’image miroir (mélanges physiques des énantiomères et racémates ou mélanges racémiques) de composés géométriques (isomères cis / trans ou E / Z, R / S) de composés et isomères de composés à plus d’un centre chiral qui ne sont pas des images miroirs les uns des autres (diastereoi somers). Les centres chiraux des composés peuvent subir une épimérisation in vivo; ainsi, pour ces composés, l'administration du composé sous sa forme (R ~) est considérée comme équivalente à l'administration du composé sous sa forme (S- ). En conséquence, les composés de la présente invention peuvent être fabriqués et utilisés sous la forme d'isomères individuels et sensiblement exempts d'autres isomères, ou sous la forme d'un mélange de divers isomères, par exemple de mélanges racémiques de stéréoisomères.
Dans certains modes de réalisation, les composés suivants sont appropriés pour se lier au Céréblon et à PXR :
[Table 1]
Tout particulièrement, les composés selon l’invention peuvent être choisis parmi les composés répondant à l’une des formules suivantes : Selon un autre objet, la présente invention concerne également le procédé de préparation d’un composé selon l’invention.
Les composés de formule générale (I) peuvent être préparés par application ou adaptation de toute méthode connue en soi de et/ou à la portée de l’homme du métier, notamment celles décrites par Larock dans Comprehensive Organic Transformations, VCH Pub., 1989, ou par application ou adaptation des procédés décrits dans les exemples qui suivent.
Selon l’invention, ledit procédé comprend le couplage d’un composé de formula (B) et d’un composé de formule (C) :
L(PXR)-T T’-L(E3 ligase)
(B) (C) tels que L(PXR) et L(E3 ligase) sont tels que définis ci-avant, et T et T’ sont deux groupes précurseurs de Linker c’est-à-dire dont le couplage permet de conduire au groupe Linker, tels qu’ils possèdent chacun respectivement une fonction terminale réactive complémentaire.
On désigne ici par « fonctions réactives complémentaires » deux fonctions susceptibles de réagir ensemble pour former une fonction assurant une liaison covalente entre T et T’. Ainsi, typiquement, T et T’ sont tels que T possède une fonction terminale de type amine et T’ possède une fonction terminale de type acide carboxylique.
Ainsi, typiquement, T représente un groupe de formule (T-B) :
-LI-NH2 (T-B) et T’ représente un groupe
(T-C) dans lesquels Li et L2 sont tels que définis ci-avant. Ledit couplage peut être avantageusement réalisé en présence d’un agent de couplage peptidique tel que BOP (benzotriazol-l -yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, typiquement en présence d’une base organique telle que la base de Hünig (N, /V-diisopropyléthylamine (DIPEA ou DIEA).
Selon un mode de réalisation, le composé (B) répond à la formule (A) :
Selon un mode de réalisation, le composé (C) répond à la formule (C-1) : ligase)
(C-1 ) dans laquelle L2 et L(E3 ligase) sont tels que définis ci-avant.
Eventuellement ledit procédé peut également comprendre l’étape consistant à isoler le produit de formule (I) obtenu.
Dans les réactions décrites ci-après, il peut être nécessaire de protéger les groupes fonctionnels réactifs, par exemples les groupes hydroxy, amino, imino, thio, carboxy, lorsqu’ils sont souhaités dans le produit final, pour éviter leur participation indésirable dans les réactions. Les groupes de protection traditionnels peuvent être utilisés conformément à la pratique standard, pour des exemples voir T.W. Green et P.G.M. Wuts dans Protective Groups in Organic Chemistry , John Wiley and Sons, 1991 ; J.F.W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry, Plénum Press, 1973. Le composé ainsi préparé peut être récupéré à partir du mélange de la réaction par les moyens traditionnels. Par exemple, les composés peuvent être récupérés en distillant le solvant du mélange de la réaction ou si nécessaire après distillation du solvant du mélange de la solution, en versant le reste dans de l’eau suivi par une extraction avec un solvant organique immiscible dans l’eau, et en distillant le solvant de l’extrait. En outre, le produit peut, si on le souhaite, être encore purifié par diverses techniques, telles que la recristallisation, la reprécipitation ou les diverses techniques de chromatographie, notamment la chromatographie sur colonne ou la chromatographie en couche mince préparative. II sera apprécié que les composés utiles selon la présente invention peuvent contenir des centres asymétriques. Ces centres asymétriques peuvent être indépendamment en configuration R ou S. Il apparaîtra à l’homme du métier que certains composés utiles selon l’invention peuvent également présenter une isomérie géométrique. On doit comprendre que la présente invention comprend des isomères géométriques individuels et des stéréoisomères et des mélanges de ceux-ci, incluant des mélanges racémiques, de composés de formule (I) ci-dessus. Ce type d’isomères peuvent être séparés de leurs mélanges, par l’application ou l’adaptation de procédés connus, par exemple des techniques de chromatographie ou des techniques de recristallisation, ou ils sont préparés séparément à partir des isomères appropriés de leurs intermédiaires. Les produits de bases ou les réactifs utilisés sont disponibles commercialement et/ou peuvent être préparés par l’application ou l’adaptation de procédés connus, par exemple des procédés tels que décrits dans les Exemples de Référence ou leurs équivalents chimiques évidents. Le procédé selon l’invention peut mettre en œuvre l’intermédiaire de formule (A) qui est nouveau.
Selon un autre objet, la présente invention concerne donc également le composé de formule (A) : Le composé de formule (A) peut être préparé par couplage des composés suivants :
Ce couplage peut etre typiquement réalisé par application ou adaptation de la procédure décrite dans l’exemple 1.
Selon la présente invention, les composés de formule (I) sont capables d’induire la protéolyse ciblée de PXR. Les composés de formule (I) sont donc utiles dans le traitement et/ou la prévention des cancers, notamment des cancers surexprimant PXR. La présente invention a donc également pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant un composé selon l’invention avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, ladite composition contient une quantité efficace du composé selon l’invention.
Selon un autre objet la présente invention concerne également un composé de formule générale (I) pour le traitement et/ou la prévention des cancers, notamment les cancers surexprimant PXR.
Des cancers surexprimant PXR sont notamment le cancer colorectal, et les cancers du pancréas, du foie et du sein.
Typiquement, les composés selon l’invention peuvent être utilisés en combinaison avec un agent anti-cancéreux. De tels agents anticancéreux peuvent être notamment choisis parmi 5-Fluorouracile (5-FU), Irinotécan (CPT11), Oxaliplatine, Cisplatine, Tamoxifen, Paclitaxel, Doxorubicine, Vonblastine, Cyclophosphamide (CPA), Isophosphamide (IFO).
De préférence, ladite composition est administrée à un patient qui en a besoin. Ledit patient est notamment un patient résistant aux agents anti-cancéreux précités. Le type de formulation des compositions pharmaceutiques de l’invention dépend du mode d’administration, qui peut inclure une injection entérale (par exemple orale), parentérale (par exemple sous-cutanée (sc), intraveineuse (iv), intramusculaire (im) et intrasternale, ou des techniques de perfusion, intraveineuse ou intraveineuse), artériel, intramédullaire, intrathécal, intraventriculaire, transdermique, interdermale, rectale, intravaginale, intrapéritonéale, muqueuse topique, nasale, buccale, sublinguale, instillation intratrachéale, instillation bronchique et / ou inhalation. En général, la voie d'administration la plus appropriée dépend de divers facteurs, notamment la nature de l'agent (par exemple, sa stabilité dans l'environnement du tube digestif) et / ou l'état du sujet (par exemple, si le sujet est capable de tolérer une administration orale). Dans certains modes de réalisation, les compositions sont formulées pour une administration orale ou intraveineuse (par exemple, une injection intraveineuse systémique).
L'expression "véhicule pharmaceutiquement acceptable", telle que connue dans la technique, désigne un matériau, une composition ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, convenant à l'administration de composés de la présente invention à des mammifères. Les supports appropriés peuvent inclure, par exemple, des liquides (aussi bien aqueux que non aqueux et leurs combinaisons), des solides, des matériaux d’encapsulation, des gaz et des combinaisons de ceux-ci (par exemple, des semi-solides), qui fonctionnent pour transporter ou transporter le composé d’un organe ou une partie du corps à un autre organe ou une partie du corps. Un support est «acceptable» dans le sens où il est physiologiquement inerte et compatible avec les autres composants de la formulation et qui est non toxique pour le sujet ou le patient. En fonction du type de formulation,
Par conséquent, les composés de formule I peuvent être formulés en compositions solides (par exemple, poudres, comprimés, granulés dispersables, capsules, cachets et suppositoires), compositions liquides (par exemple, solutions dans lesquelles le composé est dissous, suspensions dans lesquelles les particules du composé sont dispersées, les émulsions et les solutions contenant des liposomes, des micelles ou des nanoparticules, des sirops et des élixirs); compositions semi-solides (par exemple, gels, suspensions et crèmes); et des gaz (p. ex. agents propulseurs pour compositions en aérosol). Les composés peuvent également être formulés pour une libération rapide, intermédiaire ou prolongée.
Les excipients qui conviennent pour des administrations solides sont les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalino-terreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides. Pour l’usage parentéral, l’eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques sont les véhicules les plus commodément utilisés.
La posologie peut varier dans les limites importantes en fonction de l’indication thérapeutique et de la voie d’administration, ainsi que de l’âge et du poids du sujet.
Figures
[Fig 1] La Figure 1 représente l’affinité PXR de pré-PROTAC JMV6944 mesurée par RT-FRET.
[Fig 2] La Figure 2 illustre l’activation de PXR par le pré-PROTAC JMV6944 et les PROTACs qui en découle mesurée grâce à un gène rapporteur luciférase placé sous le contrôle du promoteur du CYP3A4, gène cible de PXR.
[Fig 3] Les Figures 3A et 3B représentent l’induction d’un gène cible de PXR (i.e. le CYP3A4) par le pré-PROTAC JMV6944 et les PROTACs qui en découle mesurée par RT- qPCR.
[Fig 4] Les Figures 4A et 4B illustrent et représentent l'effet des PROTACs JMV7048 et JMV7965 sur l'induction du CYP34 par Western blot.
[Fig 5] Les Figures 5A et 5B illustrent les effets des PROTACs sur la viabilité cellulaire dans différentes lignées cellulaires (LS174T, FIT29) et primo-culture (CRC1) issues de cancer du côlon.
[Fig 6] Les Figures 6A-E représentent les effets des PROTACs sur la dégradation de la protéine PXR dans les cellules LS174T, mesurés par Western blot.
[Fig 7] Les Figures 7A et 7B représentent respectivement les effets des PROTACs sur la dégradation de la protéine PXR dans les cellules FIEPG2 (7A) et ASPC1 (7B), mesurés par Western blot.
[Fig 8] Les Figures 8A-B illustrent l’importance de la voie du protéasome dans les effets des PROTACs sur la dégradation de la protéine PXR mesurée par Western blot.
[Fig 9] Les Figures 9A-C représentent respectivement l’effet du JMV7048 sur la dégradation de la protéine PXR in vivo, sur des xénogreffes de cellules LS174T dans des souris SCID.
[Fig 10] Les Figures 10A-D représentent respectivement les effets des PROTACs sur la population des cellules souches cancéreuses : inhibition de l’activité ALDFI (10A), inhibition de leur capacité d’auto-renouvellement (10B) et sensibilisation à la chimiothérapie (10C et 10D)
[Fig 11] La Figure 11 illustre le mode d’interaction du JMV6944 avec le LBD de hPXR. (11 A) Structure entière du complexe. L’hélice activatrice Fl 12 est indiquée. La flèche symbolise l’extension des PROTACs synthétisés par la suite. (11 B) Zoom sur la voie de sortie du JMV6944 et superposition avec la structure du complexe hPXR-LBD/SR12813. L’extrémité de l’hélice H2’, résidus 206 à 209, se réarrange en présence du ligand. (11 C) Interactions du JMV6944 avec les résidus de la poche de liaison de hPXR et représentation de la densité électronique du ligand (carte différence de type omit).
Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois la limiter. Les produits de départs utilisés sont des produits connus ou préparés selon des modes opératoires connus.
Les composés de la présente invention seront mieux compris en liaison avec les schémas de synthèse décrits dans divers exemples de travail et qui illustrent des procédés non limitatifs par lesquels les composés de l'invention peuvent être préparés. Les pourcentages sont exprimés en poids, sauf mention contraire.
Exemple 1 : Synthèse du JMV6944
Etape 1 : N1-benzyl-4-nitrobenzene-1 .2-diamine
A une solution contenant la 2-fluoro-5-nitroaniline (5 g, 32.03 mmol) et la benzylamine (7.01 ml, 64.05 mmol) dans le DMF (50 ml) et ajouter du K2C03 (13.28 g, 96.08 mmol). Le milieu réactionnel est agité pendant 24h à 100°C. Le milieu réactionnel est dilué dans un mélange acétate d’éthyle / H20. La phase organique est lavée successivement avec de l’eau, du KHS04 1N, du NaCI saturé et séché sur sulfate de magnésium. Après évaporation, le produit est trituré dans l’éther diéthylique et essoré. Le composé 1 N1 - benzyl-4-nitrobenzene-1 ,2-diamine est obtenu sous forme de solide jaune avec une masse de 7.5 g (rendement 96%). ESI : M+H 244.1 .
Etape 2 : (9H-fluoren-9-yl)methyl N-f2-[4-(1-benzyl-5-nitro-1 H-1 ,3-benzodiazol-2- vDbutoxylethvDcarbamate
A une solution contenant la N1-benzyl-4-nitrobenzene-1 ,2-diamine (0.747 g, 3.07 mmol) et le (9H-fluoren-9-yl)methyl N-[8-(1 H-1 ,2,3-benzotriazol-1-yl)-8-oxooctyl]carbamate (1.63 g, 3.37 mmol) dans un mélange toluène / DMF (9/1) (45ml /5 ml) et ajouté du TFA (0.91 ml, 12.28 mmol). Le milieu réactionnel est agité pendant 6h à 60°C. Le milieu réactionnel est refroidi à température ambiante puis à 0°C. Le solide est essoré puis lavé deux fois avec de l’éther diéthylique. La poudre est mise en solution dans l’acide acétique et chauffée à 100° pendant 18h. Après évaporation le composé 2 (9FI-fluoren-9-yl)methyl N-{2-[4-(1 -benzyl-5-nitro-1 FI-1 ,3-benzodiazol-2-yl)butoxy]ethyl}carbamate est obtenu sous forme d’huile jaune 0.55 g (rendement 30%). ESI : M+FI 589.2.
Etape 3 : (9FI-fluoren-9-yl)methyl N-[7-(5-amino-1-benzyl-1 H-1 ,3-benzodiazol-2- yl)heptyllcarbamate
A une solution contenant le (9FI-fluoren-9-yl)methyl N-{2-[4-(1-benzyl-5-nitro-1 H- 1 ,3-benzodiazol-2-yl)butoxy]ethyl}carbamate (0.75 g, 1.27 mmol) dans l’éthanol (30 ml) et ajouté du SnCI2 (1.2 g, 6.34 mmol). Le milieu réactionnel est agité pendant 2h à 80°C. Le milieu réactionnel est dilué dans un mélange acétate d’éthyle / NaFIC03 sat et filtré sur célite. La phase organique est récupérée et sécher sur MgS04. Après évaporation le composé 3 (9FI-fluoren-9-yl)methyl N-[7-(5-amino-1-benzyl-1 H-1 ,3-benzodiazol-2- yl)heptyl]carbamate est obtenu sous forme de poudre jaune 0.55 g (rendement 77%). ESI : M+H 559.3. Etape 4 : N-[2-(7-aminoheptyl)-1 -benzyl-1 H-1 .3-benzodiazol-5-yl1-2.4.6- trimethylbenzene-1 -sulfonamide A une solution contenant le (9H-fluoren-9-yl)methyl N-[7-(5-amino-1-benzyl-1 H-1 ,3- benzodiazol-2-yl)heptyl]carbamate (0.386 g, 0.69 mmol) dans un mélange pyridine / DCM (1/1 ) (5 ml / 5 ml) à 0°C et ajouté le 2-mesitylenesulfonyl chloride (0.166 g, 0.75 mmol) par portion. Le milieu réactionnel est mis à température ambiante et agité 18 h. La diethylamine (2ml) est ajouté dans le milieu réactionnel et agité 2h. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue 0.201 g (rendement 56%). ESI : M+H 519.4. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : d 10.53 (s, 1 H), 7.77 (m, 3H), 7.64 (d, J = 8.92 Hz, 1 H), 7.33 (m, 4H), 7.20 (d, J= 6.81 Hz, 2H), 7.10 (dd, J = 1.79, 8.88 Hz, 1 H), 7.01 (s, 2H), 5.63 (s, 2H), 3.08 (m, 2H), 2.75 (m, 2H), 2.58 (s, 6H), 2.21 (s, 3H), 1 .66 (m, 2H), 1 .48 (m, 2H), 1 .26 (m, 6H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) d 155.3, 142.7, 139.2, 135.8, 135.4, 133.9, 132.3, 129.4,
129.3, 129.3, 128.5, 127.3, 117.7, 113.7, 47.7, 39.4, 39.2, 28.6, 28.4, 27.3, 26.5.
Exemple 2 : Synthèse du JMV7048
Etape 1 : 2-(2.6-dioxopiperidin-3-yl)-5-fluoroisoindoline-1 ,3-dione
Le milieu réactionnel contenant le 4-Fluorophtalic anhydride (2.43 g, 14.63 mmol) et le 3- aminopiperidine-2,6-dione (2.38 g, 14.63 mmol) et l’acetate de sodium (2.4 g, 29.26 mmol) dans l’acide acétique (50 ml) est chauffé à 100°C pendant 24h. Après refroidissement à température ambiante ajouter de l’eau (150ml) dans le mélange réactionnel, essoré le mélange et laver avec de l’éther plusieurs fois. Mettre au dessiccateur une nuit à 50°C, le composé 1 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-fluoroisoindoline-1 ,3-dione est obtenu sous forme de solide rose avec une masse de 4 g (Rendement 99%) ESI : M+H 277.2. 1H NMR (600 MHz, DMSO-cfe) : d 11.15 (s, 1 H), 8.03-8.00 (dd, J = 4.59, 8.02 Hz, 1 H) , 7.87-7.85 (dd, J =
2.29, 8.02 Hz, 1 H), 7.75-7.71 (t, J= 2.29, 4.59, 8.02 Hz, 1 H), 5.19-5.16 (dd, J= 5.51 , 13.03, 1 H), 2.94-2.87 (m, 1 H), 2.64-2.59 (m, 1 H), 2.58-2.51 (m, 1 H), 2.10-2.05 (m,1 H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-cfe) d 173.2, 173.2, 170.2, 170.1 , 167.4, 166.6, 166.6, 166.3, 165.4, 134.7, 134.6, 127.9, 126.7, 126.7, 122.3, 122.1 , 112.0, 111.8, 49.6, 31.3, 22.4. Etape 2 : tert-butyl 4-(2-(2.6-dioxopiperidin-3-yl)-1 .3-dioxoisoindolin-5-yl)piperazine-1- carboxylate
Le composé 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-fluoroisoindoline-1 ,3-dione (500 mg, 1.81 mmol) est dissout dans la NMP (7 ml) à température ambiante. La DIEA (0.89 ml, 5.43 mmol) et le t-butyl 1 -piperazinecarboxylate (370.9 mg, 1.99 mmol) sont additionnés et le mélange est agité à 140°C pendant 24h. La solution est diluée dans l’eau (100 ml). Extraire avec de l’acétate d’éthyle deux fois et la phase organique est lavée avec du NaCI saturé et séché sur sulfate de magnésium. Après évaporation, l’huile obtenue est purifiée sur gel de silice avec un éluant éther de pétrole / Acétate d’éthyle (3/1). tert-butyl 4-(2-(2,6- dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxoisoindolin-5-yl)piperazine-1-carboxylate est obtenu sous forme de solide jaune avec une masse de 655 mg (rendement 82%). ESI : M+H 443.1 . 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : d 11.09 (s, 1H) , 7.70 (d, J= 8.56 Hz, 1H), 7.35 (d, J= 2.08 Hz, 1 H), 7.26-7.24 (dd, J= 2.08, 8.56 Hz, 1 H), 5.08 (m, 1 H), 3.47 (s, 8H), 2.93-2.86 (m, 1 H), 2.61-2.48 (m, 2H), 2.03 (m, 1 H), 1.43 (s, 9H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) d 173.2,
170.5, 167.9, 167.4, 155.4, 154.3, 134.3, 125.3, 119.0, 118.3, 108.5, 79.6, 49.2, 47.0, 31 .4,
28.5, 22.6.
Etape 3 : 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1 -yl)isoindoline-1 ,3-dione
Le composé tert-butyl 4-(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxoisoindolin-5- yl)piperazine-1-carboxylate (464 mg, 1.04 mmol) est dissout dans une solution d’HCI 4N dans le dioxane (4ml) et le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 2 heures puis concentré et trituré avec de l’éther. Le solide obtenu sous forme d’une poudre jaune avec une masse de 323 mg (rendement 90%). ESI : M+H 343.1 . 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : d 11.09 (s, 1H), 9.71 (m, 2H), 7.73 (d, J= 8.61 Hz, 1H), 7.44 (d, J= 2.08 Hz, 1 H), 7.32 (dd, J= 2.08, 8.61 Hz, 1 H), 5.09 (m, 1 H), 3.73 (m, 4H), 3.19 (m, 4H), 2.89 (m, 1 H), 2.61-2.48 (m, 2H), 2.03 (m, 1 H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) d 173.2, 170.4, 167.8, 167.3, 154.8, 134.2, 125.4, 120.0, 119.0, 109.2, 49.2, 44.5, 42.4, 31 .4, 22.6. Etape 4 : acide 6-(4-(2-(2.6-dioxopiperidin-3-yl)-1 .3-dioxoisoindolin-5-yl)piperazin-1 - vDhexanoiaue Le composé 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1 -yl)isoindoline-1 ,3-dione (100 g, 0.29 mmol) est dissout dans l’acétonitrile (5 ml). L’acide 6-bromohexanoique (152 mg, 0.73 mmol) et la DIEA (0.193 ml, 1.16 mmol) sont additionnés et le mélange est agité à 60°C pendant 24h. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 90 mg (rendement 65%). ESI : M+H 457.3. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : d 12.08 (m, 1 H), 11 .04 (s, 1 H), 9.73 (m, 1 H), 7.77 (d, J = 8.50 Hz), 7.50 (d, J= 1 .90 Hz), 7.37 (dd, J= 1 .90, 8.50 Hz), 5.10 (m, 1 H), 4.23 (m, 2H), 3.59 (m, 2H), 3.25 (m, 2H), 3.14 (m, 4H), 2.90 (m, 1 H), 2.59 (m, 2H), 2.25 (m, 2H), 2.04 (m, 1 H), 1 .69 (m, 2H), 1 .55 (m, 2H), 1 .33 (m, 2H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) d 174.7, 173.2, 170.4, 167.8, 167.3, 154.6, 134.2, 125.4, 120.4, 119.2, 109.4, 55.7, 50.7, 49.3, 44.8, 33.7, 31 .4, 25.9, 24.3, 23.4.
A une solution contenant le N-[2-(7-aminoheptyl)-1 -benzyl-1 H-1 ,3-benzodiazol-5- yl]-2,4,6-trimethylbenzene-1-sulfonamide (41 mg, 0.079 mmol) (exemple 1, JMV6944) , 6- (4-(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxoisoindolin-5-yl)piperazin-1-yl)hexanoic acid (34 mg, 0.079 mmol) et la DIEA (0.039 ml, 0.237 mmol) dans du DMF (5ml) est ajouté le BOP (52 mg, 0.12 mmol) . Le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 52 mg (rendement 66%). ESI : M+H 958.0. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : d 11.02 (s, 1 H),
10.42 (m, 1 H), 9.78 (m, 1 H), 7.69 (d, J= 8.49 Hz, 1 H), 7.65 (m, 1 H), 7.54 (d, J = 8.89 Hz, 1 H), 7.41 (d, J = 2.01 Hz, 1 H), 7.29-7.20 (m, 5H), 7.11 (m, 2H), 7.00 (dd, J= 2.01 , 8.89 Hz, 1 H), 6.93 (s, 2H), 5.02 (dd, J= 5.53, 13.14 Hz, 1 H)
Exemple 3 : Synthèse du JMV7505
Etape 1 : acide 7-{4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol-5- yl]piperazin-1 -yljheptanoique
Le composé 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1 -yl)isoindoline-1 ,3-dione (100 mg, 0.29 mmol) (exemple2, étape 3) est dissout dans l’acétonitrile (5 ml). L’acide 7- bromoheptanoique (155 mg, 0.73 mmol) et la DIEA (0.193 ml, 1.16 mmol) sont additionnés et le mélange est agité à 60°C pendant 24h. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 93 mg (rendement 65%). ESI : M+H 471 .3. Etape 2 :
A une solution contenant le N-[2-(7-aminoheptyl)-1 -benzyl-1 H-1 ,3-benzodiazol-5-yl]-2,4,6- trimethylbenzene-1-sulfonamide (41 mg, 0.079 mmol) (exemple 1, JMV6944), 6-(4-(2-(2,6- dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxoisoindolin-5-yl)piperazin-1 -yl)heptanoic acid (34 mg, 0.079 mmol) et la DIEA (0.039 ml, 0.237 mmol) dans du DMF (5ml) est ajouté le BOP (52 mg, 0.12 mmol) . Le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre blanche est obtenue avec une masse de 52 mg (rendement 68%). ESI : M+H 971.5. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : d 11.02 (s, 1 H), 10.42 (m, 1 H), 9.78 (m, 1 H), 7.69 (d, J= 8.49 Hz, 1 H), 7.65 (m, 1 H), 7.54 (d, J = 8.89 Hz, 1 H), 7.41 (d, J = 2.01 Hz, 1 H), 7.29-7.20 (m, 5H), 7.11 (m, 2H), 7.00 (dd, J= 2.01 , 8.89 Hz, 1 H), 6.93 (s, 2H), 5.53 (s, 2H), 5.02 (dd, J= 5.53, 13.14 Hz, 1 H) Exemple 4 : Synthèse du JMV7506
Etape 1 : acide 8-{4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol-5- yl]piperazin-1 -yljoctanoique
Le composé 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1 -yl)isoindoline-1 ,3-dione (100 mg, 0.29 mmol) (exemple2, étape 3) est dissout dans l’acétonitrile (5 ml). L’acide 8- bromooctanoique (160 mg, 0.73 mmol) et la DIEA (0.193 ml, 1.16 mmol) sont additionnés et le mélange est agité à 60°C pendant 24h. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 101 mg (rendement 67%). ESI : M+H 485.6.
Etape 2 :
A une solution contenant le N-[2-(7-aminoheptyl)-1 -benzyl-1 H-1 ,3-benzodiazol-5- yl]-2,4,6-trimethylbenzene-1-sulfonamide (41 mg, 0.079 mmol) (exemple 1, JMV6944), 6- (4-(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxoisoindolin-5-yl)piperazin-1 -yl)octanoique acid (36 mg, 0.079 mmol) et la DIEA (0.039 ml, 0.023 mmol) dans du DMF (5ml) est ajouté le BOP (52 mg, 0.12 mmol) . Le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre blanche est obtenue avec une masse de 45 mg (rendement 61%). ESI : M+H 985.5.
1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : d 11.02 (s, 1 H), 10.42 (m, 1 H), 9.78 (m, 1 H), 7.69 (d, J= 8.49 Hz, 1 H), 7.65 (m, 1 H), 7.54 (d, J = 8.89 Hz, 1 H), 7.41 (d, J = 2.01 Hz, 1 H), 7.29- 7.20 (m, 5H), 7.11 (m, 2H), 7.00 (dd, J= 2.01 , 8.89 Hz, 1 H), 6.93 (s, 2H), 5.54 (s, 4H), 5.02 (dd, J= 5.53, 13.14 Hz, 1 H) Exemple 5 : Synthèse du JMV7965
Etape 1 : tert-butyl 4-({4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl) ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol-5- yl]piperazin-1 -yl}methyl)piperidine-1 -carboxylate
A une solution contenant 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1 -yl)isoindoline-1 ,3-dione (100 mg, 0.29 mmol) (exemple2, étape 3) et le tert-butyl 4-formylpiperidine-1 -carboxylate (112 mg, 0.53 mmol) dans le DCE est ajouté 3 ml de MeOH. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 30mns. Ajouter par portion le sodium triacetoxyborohydride et agiter le milieu réactionnel à température ambiante pendant 18h. Concentrer le milieu réactionnel et réaliser une HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 85 mg (rendement 53%). ESI : M+H 540.2.
Etape 2 : 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-{4-[(piperidin-4-yl)methyl]piperazin-1-yl}-2,3- dihydro-1 H-isoindole-1 ,3-dione Le composé tert-butyl 4-({4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol- 5-yl]piperazin-1 -yl}methyl)piperidine-1 -carboxylate (100 mg, 0.19 mmol) est dissout dans le DCM (50ml). Le TFA (5ml) est additionné goutte à goutte dans le milieu réactionnel et agiter à température ambiante pendant 5h. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue (75mg, rendement 92%) est utilisée tel quel dans l’étape 3. ESI : M+FI
440.3.
Etape 3 : tert-butyl 2-[4-({4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol- 5-yl]piperazin-1 -yl}methyl)piperidin-1 -yljacetate
Le composé 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-{4-[(piperidin-4-yl)methyl]piperazin-1 -yl}-2,3- dihydro-1 H-isoindole-1 ,3-dione (128 mg, 0.29 mmol) est dissout dans le DCM en présence de DIEA (0.14ml, 0.88mmol). Ajouter goutte à goutte le tert-butyl bromoacetate (0.043 ml, 0.29 mmol) et agiter à température ambiante pendant 18h. Concentrer le milieu réactionnel et réaliser une HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 85 mg (rendement 53%). ESI : M+H 554.4.
Etape 4 : acide 2-[4-({4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol-5- yl]piperazin-1 -yl}methyl)piperidin-1 -yljacetique
Le composé tert-butyl 2-[4-({4-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H- isoindol-5-yl]piperazin-1 -yl}methyl)piperidin-1 -yljacetate (83 mg, 0.19 mmol) est dissout dans le DCM (25ml). Le TFA (5ml) est additionné goutte à goutte dans le milieu réactionnel et agiter à température ambiante pendant 18h. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue (70mg, rendement 93%) est utilisée tel quel dans l’étape 3. ESI : M+H 498.3. Etape 5 :
A une solution contenant le N-[2-(7-aminoheptyl)-1-benzyl-1 H-1 ,3-benzodiazol-5-yl]-2,4,6- trimethylbenzene-1-sulfonamide (21 mg, 0.0402 mmol) (exemple 1, JMV6944), 2-[4-({4-[2- (2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol-5-yl]piperazin-1 - yl}methyl)piperidin-1-yl]acetic acid (20 mg, 0.0402 mmol) et la DIEA (0.020 ml, 0.12 mmol) dans du DMF (5ml) est ajouté le BOP (27 mg, 0.0603 mmol) . Le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 25 mg (rendement 62%). ESI : M+H 998.3.
Exemple 6 : Synthèse du JMV7605
JMV7605
Etape 1 : tert-butvl 4-{4-[(2,6-dioxopiperidin-3-yl)carbamoyl]phenyl}piperazine-1- carboxylate A une solution contenant l’acide 4-[4-(tert-butoxycarbonyl)piperazino]benzoique
(0.775 g, 2.53 mmol), 3-Aminopiperidine-2,6-dione HCl (0.50 g, 3.03 mmol) et la DIEA (1.25 ml, 7.59 mmol) dans du DMF (50ml) est ajouté le BOP ( 1.11 g, 2.53 mmol) . Le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. Ajouter de l’eau dans le milieu réactionnel et extraire avec de l’acétate d’éthyle. Laver successivement la phase organique avec HCl 1N, NaHC03 sat et NaCI sat. Sécher la phase organique avec du MgS04, filtrer et concentrer sous pression réduite. Une poudre blanche est obtenue avec une masse de 0.4 g (rendement 38%). ESI : M+H 417.3.
Etape 2 : N-(2.6-dioxopiperidin-3-vl)-4-(piperazin-1 -vDbenzamide
Le composé tert-butyl 4-{4-[(2,6-dioxopiperidin-3-yl)carbamoyl]phenyl}piperazine-1 - carboxylate (0.4 g, 0.96 mmol) est dissout dans une solution d’HCI 4N dans le dioxane (6ml) et le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 2 heures puis concentré et trituré avec de l’éther. Le solide obtenu sous forme d’une poudre blanche avec une masse de 0.285 mg (rendement 94%).
Le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre blanche est obtenue avec une masse de 45 mg (rendement 52%). ESI : M+H 317.3.
Etape 3 : acide 7-(4-{4-[(2,6-dioxopiperidin-3-yl)carbamoyl]phenyl}piperazin-1 - yl)heptanoique
Le composé N-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-(piperazin-1-yl)benzamide (50 mg, 0.15 mmol) est dissout dans le DMF (5 ml). L’acide 7-bromoheptanoique (66 mg, 0.31 mmol) et la DIEA (0.078 ml, 0.47 mmol) sont additionnés et le mélange est agité à 100°C pendant 24h. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 38 mg (rendement 55%). ESI : M+H 445.1.
Etape 4 :
JMV7605
A une solution contenant le N-[2-(7-aminoheptyl)-1 -benzyl-1 H-1 ,3-benzodiazol-5- yl]-2,4,6-trimethylbenzene-1-sulfonamide (35 mg, 0.067 mmol) (exemple 1, JMV6944), 7- (4-{4-[(2,6-dioxopiperidin-3-yl)carbamoyl]phenyl}piperazin-1-yl)heptanoic acid (30 mg, 0.067 mmol) et la DIEA (0.033 ml, 0.20 mmol) dans le DMF (5ml) est ajouté le BOP (44 mg, 0.101 mmol) . Le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre blanche est obtenue avec une masse de 41 mg (rendement 65%). ESI : M+H 945.8.
Exemple 7 : Synthèse du JMV7159 (exemple comparatif) Etape 1 : 5-fluoro-2-(1-methvl-2.6-dioxopiperidin-3-vl)-2.3-dihvdro-1 H-isoindole-1 ,3-dione
Le composé 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-fluoroisoindoline-1 ,3-dione (250mg, 0.90 mmol) est dissout dans le DMF anhydre (5ml) et le milieu réactionnel est agiter et mis à 0°C. Ajouter par portion le NaH et laisser agiter pendant 20 minutes. Ajouter le iodomethane et agiter 2 heures. Stopper la réaction avec une solution de NH4CI. Extraire avec de l’acétate d’éthyle et laver deux fois avec du NaCI sat la phase organique. Sécher sur MgS04, filtrer et concentrer sous pression réduite. Le composé 5-fluoro-2-(1 -methyl-2,6- dioxopiperidin-3-yl)-2,3-dihydro-1 H-isoindole-1 ,3-dione est obtenu sous forme d’une poudre blanche avec une masse de 253 mg (rendement 96%). ESI : M+H 291 .1 .
Etape 2 : tert-butvl 4-[2-(1 -methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H- isoindol-5-yl]piperazine-1-carboxylate
Le composé 5-fluoro-2-(1 -methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-2,3-dihydro-1 H-isoindole- 1 ,3-dione (250 mg, 0.86 mmol) est dissout dans la NMP (4 ml) à température ambiante. La DIEA (0.42 ml, 2.58 mmol) et le t-butyl 1-piperazinecarboxylate (176 mg, 0.94 mmol) sont additionnés et le mélange est agité à 140°C pendant 24h. La solution est diluée dans l’eau (100 ml). Extraire avec de l’acétate d’éthyle deux fois et la phase organique est lavée avec du NaCI saturé et séché sur sulfate de magnésium. Après évaporation, l’huile obtenue est purifiée sur gel de silice avec un éluant éther de pétrole / Acétate d’éthyle (3/1). tert-butyl 4-[2-(1 -methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol-5-yl]piperazine-1 - carboxylate est obtenu sous forme de solide jaune avec une masse de 338 mg (rendement 86%). ESI : M+H 457.3.
Etape 3 : 2 (1 -methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1 -yl)-2,3-dihydro-1 H-isoindole-
1 ,3-dione Le composé tert-butyl 4-[2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro- 1 H-isoindol-5-yl]piperazine-1-carboxylate (250 mg, 0.54 mmol) est dissout dans une solution d’HCI 4N dans le dioxane (4ml) et le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 2 heures puis concentré et trituré avec de l’éther. Le solide obtenu sous forme d’une poudre jaune avec une masse de 175 mg (rendement 90%). ESI : M+H 357.3.
Etape 4 : acide 6-{4-[2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H- isoindol-5-yl]piperazin-1 -yl}hexanoique
Le composé 2-(1 -methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(piperazin-1 -yl)-2,3-dihydro-1 H- isoindole-1 ,3-dione (100 mg, 0.28 mmol) est dissout dans l’acétonitrile (5 ml). L’acide 6- bromohexanoique (136 mg, 0.70 mmol) et la DIEA (0.139 ml, 0.84 mmol) sont additionnés et le mélange est agité à 60°C pendant 24h. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre jaune est obtenue avec une masse de 85 mg (rendement 65%). ESI : M+H 471 .3.
A une solution contenant le N-[2-(7-aminoheptyl)-1 -benzyl-1 H-1 ,3-benzodiazol-5- yl]-2,4,6-trimethylbenzene-1-sulfonamide (28 mg, 0.055 mmol) (exemple 1, JMV6944), 6- {4-[2-(1 -methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1 ,3-dioxo-2,3-dihydro-1 H-isoindol-5-yl]piperazin-1 - yljhexanoic acid (26 mg, 0.055 mmol) et la DIEA (0.165 ml, 0.165 mmol) dans du DMF (5ml) est ajouté le BOP (36 mg, 0.082 mmol) . Le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. La solution est concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est purifiée par HPLC préparative. Après lyophilisation, une poudre blanche est obtenue avec une masse de 30 mg (rendement 56%). ESI : M+H 971 .6.
Exemple 8 : Biochimie et cristalloaraphie
Le domaine de liaison au ligand du récepteur PXR humain (hPXR-LBD, résidus 130-434), a été produit sous la forme d’une protéine recombinante dans les bactéries E. coli BL21 - DE3. La protéine a été purifiée sur colonne d’affinité puis par chromatographie d’exclusion de taille. Après concentration, hPXR-LBD a été cristallisé en présence du ligand JMV6944. La structure du complexe hPXR-LBD/JMV6944 a été déterminée par radiocristallographie par la méthode de remplacement moléculaire, puis reconstruite et affinée sur la base de la densité électronique (données de diffraction collectées au synchrotron ESRF, Grenoble). La structure est présentée en Figure 11 . En A, la structure entière du complexe montre le mode de liaison du JMV6944. L’originalité du JMV6944 réside dans la position de l’extension ajoutée à la molécule parente JMV6845 et sa voie de sortie du domaine protéique. Contrairement aux PROTACs connus pour les autres récepteurs nucléaires qui sont tous basés sur la modification d’un ligand antagoniste, l’extension greffée sur l’agoniste JMV6845 ne s’étend pas vers l’hélice H12 mais pointe dans la direction opposée entre les hélices H2’, H6, H7 et le brin S1 pour finalement atteindre la surface externe du LBD. La présence du bras alkyl/NH (entouré en B) induit un changement conformationnel de l’extrémité de H2’ qui permet à ce ligand de s’extraire de la poche de liaison et d’interagir spécifiquement avec un résidu de surface, la C207 (C). Au sein de la poche de liaison du ligand, le JMV6944 établit par ailleurs des liaisons hydrogènes avec IΉ407 et la S247, ainsi que des interactions hydrophobes avec la L411 et la F428 d’une part, et les résidus de la région « p-trap » d’autre part (F288, W299, Y306).
Exemple 9 : Résultats biologiques 9.1 Mesure de l’affinité préPROTAC/PXR
L’affinité de liaison entre la molécule JMV6944 (préPROTAC) et le domaine de liaison des ligands (LBD) de PXR a été quantifiée par FRET grâce au kit LanthaScreen TR-FRET PXR Compétitive binding assay Kit (Invitrogen). Les molécules ont été incubées 1 h30 à température ambiante avec le LBD de PXR en présence d’un ligand de référence fluorescent. Le déplacement du ligand fluorescent provoqué par le préPROTAC ou le ligand de PXR SR12813 a été mesuré par lecture des émissions à 520nm et 495nM après excitation à 337nM sur un appareil PHERA-Star (BMG LABTECH). Les résultats sont illustrés en Figure 1 qui montre que la molécule JMV6944 est un ligand de PXR avec une affinité de 18.38nM.
9.2 Mesure des effets des PROTAC sur l’activité transcriptionnelle de PXR (gène rapporteur)
Traitement de cellules LS174T stablement transfectées avec un vecteur d’expression codant la protéine PXR, un gène rapporteur Luciférase placé sous le contrôle du promoteur du CYP3A4 (gène cible de PXR) et d’une cassette d’expression codant pour la protéine GFP placée sous le contrôle du promoteur CMV pour la normalisation des signaux. Les cellules ont été traitées 48h avec 5mM des molécules JMV6944 (préPROTACs), les PROTACs JMV7048 et JMV7605, ainsi que la rifampicine (5mM, ligand de PXR). A l’issue des traitements, l’activité transcriptionnelle de PXR est mesurée par le ratio des signaux luciférase/GFP mesurés sur un appareil PHERA-Star (BMG LABTECH). La Figure 2 montre que seuls le préPROTAC JMV6944 et la rifampicine sont capables d’activer l’activité transcriptionnelle de PXR.
9.3 Mesure des effets des PROTAC sur l’activité transcriptionnelle de PXR (expression de l’ARNm du CYP3A4)
Les cellules LS174T ont été traitées 48h avec 5mM des molécules JMV6944 (préPROTACs), JMV7048, JMV7505, ou le JMV5159 (équivalent inactif du JMV7048 suite à l’ajout d’un groupement méthyle sur le ligand de l’ubiquitine ligase CNBR) en présence ou en absence de la rifampicine (ligand de PXR) à 5mM final. Apres lyse des cellules et purification des ARN totaux (Qiagen RNAeasy), les ADN complémentaires ont été préparés (SuperScript II en présence d’amorces aléatoire de 6 nucléotides, Invitrogen). L’expression des ARNm du CYP3A4 et des gènes de ménages RPLO et actine a été mesurée par RT- qPCR sur un appareil LC480 (Roche) en présence de SyberGreen (Millipore). Les niveaux d’expression relatifs ont été calculés selon la méthode RQ = Relative quantification = 2- AACt, les cellules non traitées servant de calibreur fixé à 1 . Les Figures 3A et 3B montrent que si le préPROTAC et le PROTAC inactivé (JMV7159) ont un effet additif sur l’expression de l’ARNm du CYP3A4, les PROTACs JMV7048 et JMV7965 diminuent significativement l’induction du CYP3A4 médiée par la rifampicine.
9.4 Mesure des effets des PROTAC sur l’activité transcriptionnelle de PXR (expression du CYP3A4) Les cellules LS174T ont été traitées 48h avec 5mM JMV7048 en présence ou en absence de la rifampicine (ligand de PXR) à 5mM final. Après la lyse des cellules (RIPA + antiprotéases), les protéines ont été purifiées et dosées avant d’être déposées (QOmV) sur gel SDS-PAGE 10%. Après la migration sur gel, elles ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (GE Healthcare) avant d’être révélées avec des anticorps dirigés contre CYP3A4 (sc-53850, Santa Cruz) et béta-actine (A5441 , Sigma ou Ab-253283, AbCAm) puis des anticorps secondaires couplées à la péroxidase (anti-mouse HRP, Santa Cruz). Les intensités des signaux ont été mesurés par une caméra (BioRad MP Touch). Les figures 4A et 4B montrent que les PROTACs JMV7048 et JMV7965 diminuent l’induction de l’enzyme CYP3A4 médiée par la rifampicine.
9.5 Mesure des effets des PROTACs sur la viabilité cellulaire
L’effet des PROTACs sur la viabilité cellulaire a été testée sur différentes lignées CRC1, HT29 et LS174T. Les cellules ont été incubées en présence de concentrations croissantes de molécules pendant 72h avant d’être fixées et marquées par le Sulforhodamine B (Sigma). Après lavages et lyse des cellules, le colorant incorporé libéré par les cellules est directement proportionnel à la biomasse cellulaire. Il est mesuré à 565nM par un spectrophotomètre pour plaques de 96 puits (Técan). Le signal obtenu pour les cellules non traité est fixé à 100%. La Figure 5A illustre l’absence de toxicité des PROTACs JMV7048, JMV7505 et JMV7605 sur la lignée LS174T. Sur la Figure 5B, on voit que le PROTAC JMV7048 n’affecte pas la viabilité des cellules HT29 ou de la protoculture CRC1 (issues d’un patient atteint d’un cancer du côlon.
9.6 Mesure des effets des PROTACs sur la dégradation PXR dans les cellules LS174T par western-blot in vitro
L’effet des PROTACs sur le niveau d’expression de la protéine PXR ont été étudiés par Western-blot. Les cellules LS174T ont été transféctées en absence ou présence de 50nM d’un siRNA ciblant PXR (siPXR : NR112 Silencer, Thermofischer) ou traitées par les PROTACs. Après la lyse des cellules (RIPA + antiprotéases), les protéines ont été purifiées et dosées avant d’être déposées (9C^g) sur gel SDS-PAGE 10%. Après la migration sur gel, elles ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (GE Healthcare) avant d’être révélées avec des anticorps dirigés contre PXR (sc-48340, Santa Cruz), GAPDH (sc- 32233, Santa Cruz) et béta-actine (A5441 , Sigma ou Ab-253283, AbCAm) puis des anticorps secondaires couplées à la péroxidase (anti-mouse HRP, Santa Cruz). Les intensités des signaux ont été mesurés par une caméra (BioRad MP Touch). Les Figures 6A-C montrent qu’après 24h de traitement à 5mM, les PROTACs JMV7048, JMV7505, JMV7506, JMV7605 et JMV7965 diminuent significativement le niveau d’expression de la protéine PXR, contrairement à un mutant inactif du JMV7048 (i.e. JMV7159). Les Figures 6D et 6E illustrent l’effet du JMV7048 sur le niveau d’expression de PXR en fonction du temps de traitement (effet maximal atteint après 3h de traitement) et de la concentration utilisée (diminution dépendante de la dose, avec un effet maximal observé dès 500nM).
9.7 Mesure des effets des PROTACs sur la dégradation PXR dans les cellules HEPG2 et ASPC1 par western-blot in vitro
L’effet des PROTACs (5mM, 24h de traitement) sur le niveau d’expression de la protéine PXR dans des cellules HepG2 (Hepatocellular Carcinoma, ATCC #HB-8065™) ou ASPC1 (Human Pancreatic Cancer Cell Line, ATCC #CRL-1682) ont été étudiés par Western-blot. Après la lyse des cellules (RIPA + antiprotéases), les protéines ont été purifiées et dosées avant d’être déposées (9C^g) sur gel SDS-PAGE 10%. Après la migration sur gel, elles ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (GE Healthcare) avant d’être révélées avec des anticorps dirigés contre PXR (sc-48340, Santa Cruz), GAPDH (sc-32233, Santa Cruz) et béta-actine (A5441 , Sigma ou Ab-253283, AbCAm) puis des anticorps secondaires couplées à la péroxidase (anti-mouse HRP, Santa Cruz). Les Figures 7A et 7B illustrent l’effet des PROTACs JMV7048 et JMV7965 sur le niveau d’expression de PXR dans des cellules cancéreuses hépatiques (7A) ou pancréatiques (7B)
9.8 Importance de la voie du protéasome sur les effet des PROTACs sur la dégradation PXR.
L’implication de la voie du protéasome sur les effets des PROTACs sur le niveau d’expression de la protéine PXR ont été étudiés par Western-blot. Les cellules LS174T ont été traitées pendant 24 heures avec le JMV7048 en présence ou absence de l’ubiquitine Ligase CNBR (MLN4924) ou de l’inhibiteur du protéasome (Bortezomib). Les figures 8A et 8B confirment l’importance de la voie du protéasome sur la diminution du niveau d’expression de la protéine PXR induite par le PROTAC JMV7048 : la diminution du niveau d’expression de PXR induite par le JMV7048 est reversée par des inhibiteurs de l’ubiquitine ligase CRBN (MLN4924, Figure 8A) ou par un inhibiteur du protéasome 26S (Bortezomib, Bz ; Figure 8B), alors que le mutant du JMV7048 (i.e. JMV7159, ne permettant pas le recrutement du CNBR) ne provoque pas de diminution du niveau d’expression de PXR.
9.9 Mesure des effets des PROTACs sur la dégradation PXR western-blot in vivo
L’effet des PROTACs sur le niveau d’expression de la protéine PXR ont été étudiés in vivo par Western-blot après xénogreffes de cellules LS174T dans des souris SCID. Lorsque les tumeurs ont atteint 100mm3, 10 souris ont été traitées par I.V. avec du solvant 5% EtOH, 20 % solutol in D5W ou du PROTACS (25mg/kg) toutes les 24h pendant 4 jours. Les souris ont été pesées tous les jours. Quatre heures après le dernier traitement, les tumeurs ont été réséquées avant d’être lysées dans un tampon RIPA grâce à des billes de céramiques (Lysing matrix D, MP-Bio) avec un appareil Fast-Prep 24 (MP-Bio). Les protéines ont été purifiées et dosées avant d’être déposées (£^g) sur gel SDS-PAGE 10%. Après la migration sur gel, elles ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (GE Healthcare) avant d’être révélées avec des anticorps dirigés contre PXR (sc-48340, Santa Cruz), GAPDH (sc-32233, Santa Cruz) et béta-actine (A5441 , Sigma ou Ab-253283, AbCAm) puis des anticorps secondaires couplées à la péroxidase (anti-mouse HRP, Santa Cruz). Les intensités des signaux ont été mesurés par une caméra (Biorad MP Touch). On voit sur la Figure 9A qu’un traitement à 25mk/kb pendant 4 jours ne modifie pas significativement le poids des souris. Les figures 9B et 9C confirment que ce traitement est capable d’induire une baisse significative du niveau d’expression de la protéine PXR au sein des tumeurs.
9.10 Mesure des effets des PROTACs sur l’auto-renouvellement et la chimiorésistance des cellules souches cancéreuses coliques
Les effets des PROTACs sur la survie et l’auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses coliques ont été étudiés in vitro sur la lignée HT29 ou des cellules cancéreuses isolées de patients (CRC1). Les cellules ont été traitées avec ou sans 5mM PROTACs pendant 48h avant d’être analysées : marquage Aldefluor, activité enzymatique préférentiellement présence dans les cellules souches cancéreuse (Figure 10A) ; formation de tumorsphères dans des conditions asériques et non adhérentes, (Figure 10B), et enfin résistance aux chimiothérapies ( Figure 10C et 10D).
La figure 10A montre que les PROTACs JMV7048, JMV 7505, JMV7506 et JMV7965 diminuent significativement le pourcentage de cellules ALDH-positive après dissociation des cellules CRC1 et marquage par Aldefluor™ (STEMCELL Technologies) comparé aux cellules non traitées. La figure 10B montre que les molécules JMV7048 et JMV7965 diminuent significativement le nombre de cellules HT29 capables de survivre à l’anoïkis () et d’induire la formation de T umorphères (Sphere Forming Cells). Les tumorphères de plus de 50 mM de diamètre ont été comptées 10 jours après traitement et mise en culture de 200 cellules par puits (préalablement traités avec du poly2Hema afin d’empêcher toute adhérence cellulaire) dans 100mί milieu dépourvu en sérum de veau. Ces conditions de culture permettent uniquement la survie des cellules souches cancéreuses. Les figures 10C et 10D montrent les effets des PROTACs JMV7048 et JMV7965 sur la survie (10C) et la capacité de formation de tumorphères (10D) des cellules HT29 maintenues en présence de différentes concentrations de 5-FU et SN38 (Folfiri 1X= dqmV 5-FU + 500nM SN38) et cultivées dans 100mI_ de milieu dépourvu en sérum de veau dans des boites préalablement traitées avec du poly2Flema afin d’empêcher toute adhérence cellulaire. Les tumorphères de plus de 50mM de diamètre ont été comptées 10 jours après ensemencement de 200 cellules/puits. Ainsi, les figures 10A-D montrent qu’un traitement à 5mM pendant 2 jours avec les PROTACs JMV7048 et JMV7965 diminue significativement la survie et la chimiorésistance des cellules souches dans des lignées de cellules de cancers du côlon.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Composé bifonctionnel répondant à la formule générale (I) :
L(PXR)-Linker-L(E3 ligase) (I) dans laquelle :
L(PXR) est un ligand capable de se lier au récepteur nucléaire PXR,
L(E3 ligase) représente un ligand de l’ubiquitine ligase E3, et Linker représente un groupe qui permet de lier de façon covalente L(PXR) à L(E3 ligase).
2. Composé bifonctionnel selon la revendication 1 telle que L(PXR) est un groupe de formule (II): où représente l’attachement du groupe à Linker ; ou un sel pharmaceutiquement acceptable .
3. Composé selon la revendication 1 ou 2 tel que L(E3 ligase) est choisi parmi : - les groupes de formule (NIA) : et
- les groupes de formule (INB) : ou un sel pharmaceutiquement acceptable, dans lesquelles : X est NH;
X’ est -C(O)- ou -CH2- ;
Y représente H ou un groupe Alkyle en C1 -C6 ; représente l’attachement du groupe à Linker .
4. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, tel que
Linker représente un groupe alkylène en C1 -C20, éventuellement interrompu ou se terminant éventuellement à l’une et/ou l’autre des deux extrémités, par l’un des groupes - 0-, -S-, -N (R') -, -C(O)-, -C(0)0-, - OC(O) -, -0C(0)0 -, -C(NOR')-, -C(0)N(R')-, - C(0)N(R’)C(0)-, -C(0)N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R’)C(0)N(R')-, -N(R')C(0)0-, - 0C(0)N(R')-, -C(NR')-, -N(R')C(NR')-, -C(NR')N(R') -, -N(R')C(NR,)N(R')-, -S(0)2-, -OS(O)-
, -S(0)0-, -S(O)-, -0S(0)2-, -N(R’)S(0)2-, -S(0)2N(R’)-, -N(R’)S-, -S(0)N(R , - N(R')S(0) 2 N(R') -, -N(R')S(0)N(R')-, carbocyclène en C3 à C12, hétérocyclène de 3 à 12 chaînons et comprenant 1 , 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N, O, S, hétéroarylène de 5 à 12 chaînons et comprenant 1 , 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N, O, S, ou toute combinaison de ceux-ci, et dans lesquels R' identiques ou différents représentent H ou un groupe alkyle en C1 -C6.
5. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, tel que Linker représente un groupe d où Li et L-2 identiques ou différents représentent indépendamment un groupe alkylène de 1 à 12 atomes de carbone éventuellement interrompu ou se terminant par un hétérocyclène de 3 à 12 chaînons et comprenant 1 , 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N, O, S ;
Li est lié est lié à L(E3 ligase) ;
Z représente H ou un groupe alkyle en C1-C6.
6. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, tel qu’il répond à l’une des formules suivantes (I-4) et (I-5):
(I-4)
L(PXR)-Linker
(I-5) dans lesquelles L(PXR), Linker sont définis selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ; ou un sel pharmaceutiquement acceptable.
7. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, tel qu’il répond à la formule (V) suivante : dans laquelle l_2 représente un groupe alkylène linéaire en C2-C8 éventuellement interrompu par un groupe pipéridinyle, et L(E3 ligase) est tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 6.
8. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, tel qu’il répond à l’une des formules suivantes :
9. Procédé de préparation d’un composé selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant le couplage d’un composé de formula (B) et d’un composé de formule (C) :
L(PXR)-T T’-L(E3 ligase)
(B) (C) tels que L(PXR) et L(E3 ligase) sont tels que définis selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, et T et T’ sont deux groupes précurseurs de Linker, tels qu’ils possèdent chacun respectivement une fonction terminale réactive complémentaire.
10. Procédé selon la revendication 9 tel que le composé (B) répond à la formule (A) : et le composé (C) répond à la formule (C-1 ) : ligase) dans laquelle L2 et L(E3 ligase) sont tels que définis selon l’une quelconque des revendications 1 à 7.
11. Composé de formule (A) :
12. Composition pharmaceutique comprenant un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
13. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 pour son utilisation pour le traitement et/ou la prévention de cancer surexprimant le récepteur nucléaire PXR.
14. Composé pour utilisation selon la revendication 13 en combinaison avec un agent anti-cancéreux.
15. Composé pour utilisation selon l’une quelconque des revendications 13 ou
14 pour administration chez des patients résistants à l’agent anti-cancéreux.
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