EP4314775A1 - Vorrichtung, einrichtung und verfahren zur bestrahlung einer insbesondere biologischen probe mit einem holografisch-optischen bauelement - Google Patents

Vorrichtung, einrichtung und verfahren zur bestrahlung einer insbesondere biologischen probe mit einem holografisch-optischen bauelement

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EP4314775A1
EP4314775A1 EP22716224.5A EP22716224A EP4314775A1 EP 4314775 A1 EP4314775 A1 EP 4314775A1 EP 22716224 A EP22716224 A EP 22716224A EP 4314775 A1 EP4314775 A1 EP 4314775A1
Authority
EP
European Patent Office
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light
light source
holographic
optical component
hoe
Prior art date
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Pending
Application number
EP22716224.5A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Reinhold Fiess
Eugen BAUMGART
Ingo Ramsteiner
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Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
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Filing date
Publication date
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    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging

Definitions

  • Device for irradiating a sample, in particular a biological one, with a holographic-optical component
  • fluorescence measurements are also widely used in medical technology, for example in flow cytometry, in quantitative real-time PCR, in antibody tests or in histopathology.
  • the light source is of particular importance, because every fluorescence measurement requires excitation of the sample with a selected wavelength band.
  • the task of the light source is to deliver light of high spectral density in the range of the absorption band of the respective fluorophore.
  • the light must be limited to a precisely defined wavelength interval in order not to outshine the fluorescence wavelengths, which are usually not far away spectrally. These requirements are exacerbated when several dyes that have different, usually overlapping, excitation and fluorescence bands are to be addressed separately.
  • the light source must then be able to switch between different excitation bands, which are spectrally characterized by precisely defined wavelength bands with steep slopes.
  • such light sources are realized by either providing a very broadband light source (e.g. white light-emitting diode, incandescent lamp or gas discharge lamp) with exchangeable dielectric band-pass filters, which are arranged, for example, on a slider or wheel, or uses multiple light sources that either have intrinsically limited spectral ranges (laser, SLD) and/or are broader (e.g. colored LEDs), but are spectrally defined by a fixed bandpass filter. If several light sources are used, the beam paths are usually brought into line with dichroic mirrors before the light hits the sample.
  • a very broadband light source e.g. white light-emitting diode, incandescent lamp or gas discharge lamp
  • exchangeable dielectric band-pass filters which are arranged, for example, on a slider or wheel, or uses multiple light sources that either have intrinsically limited spectral ranges (laser, SLD) and/or are broader (e.g. colored LEDs), but are spectrally defined by a fixed band
  • the invention relates to a device for irradiating a sample.
  • the device comprises a first light source, a second light source and at least one holographic-optical component.
  • the first light source, the second light source and the holographic-optical component are arranged relative to one another such that first light from the first light source and second light from the second light source are directed via the holographic-optical component onto a common sample area for irradiating the sample.
  • the sample preferably comprises a material which can be excited to fluoresce with suitable optical excitation, in particular due to fluorophores contained in the sample or added to the sample.
  • the sample can in particular be a biological sample.
  • the sample can include parts of a body fluid from an animal or a human, for example components from blood, urine, sputum or a swab or from a tissue sample.
  • the sample can contain nucleic acids or segments of nucleic acids, preferably amplified parts of nucleic acids from an isothermal or polymerase chain reaction (“PCR”)-based amplification of nucleic acid segments.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the sample can include a product from a detection method for detecting pathogens, in particular a product from an isothermal or PCR-based DNA amplification, with the detection of the presence of certain pathogens in particular via a fluorescence-based selection of DNA samples marked with fluorophores should take place.
  • the invention is fundamentally suitable for any application and for any device used for this purpose, in which fluorescent examination objects have to be illuminated with several wavelength bands, in particular in the field of life science, forensics and also in protecting and verifying the authenticity of products, in particular documents against product piracy.
  • the light sources can be, for example, light-emitting diodes (“LED”), superluminescent or laser diodes, incandescent lamps, gas discharge lamps or also lighting means excited by primary sources such as, for example, phosphorus-converted sources.
  • the first light source preferably has a first emission spectrum which differs from a second emission spectrum of the second light source.
  • the wavelength spectrum of the first light can preferably differ from that of the second light.
  • the first or second light source comprises beam-shaping elements (e.g. concave mirrors, Fresnel or refractive lenses) and/or spectrally filtering elements (e.g. dielectric filters or colored glasses).
  • the first or the second light source can include a bandpass filter for defined limitation of the emitted light.
  • bandpass filters can advantageously limit the spectral range of the light sources to a narrower band and steeper edges than is possible solely through the intrinsic spectral width of the holographic optical component.
  • scattered light with undesired wavelengths can be reduced.
  • beam-shaping and/or spectrally filtering elements can be arranged at other points of the device, in particular between the holographic-optical component and the sample area or the sample.
  • the holographic optical component (also referred to as "HOE" for short) is in particular an element whose holographic properties can be used for the optics of devices, for example to replace conventional lenses, mirrors and prisms.
  • the HOE preferably comprises a substrate for mechanical stabilization (eg glass or plastic) and at least one or more optically active layers in which one or more holograms are inscribed.
  • the HOE is designed to direct light from the first and second light sources at least partially onto the sample area.
  • the intrinsic wavelength selectivity of the holograms can preferably be used as a desired filter function in order to avoid a specific wavelength band to illuminate the sample area and the sample.
  • the holographic-optical component can comprise a reflection hologram or a transmission hologram, which is designed as a surface hologram or preferably as a volume hologram.
  • the holographic-optical component is thus preferably designed, with a predetermined placement relative to the HOE of the first light source with the first emission spectrum and the second light source with the second emission spectrum, at least some of the light from the first light source and some of the light from the second light source to steer a given sample area.
  • the (common) sample area means a specific spatial area relative to the HOE and preferably relative to the two light sources, in particular a specific solid angle area in which a sample can be placed for illumination according to the invention.
  • the invention thus advantageously provides excitation optics for fluorescence spectroscopy, wherein excitation light from different excitation channels can be directed onto the sample to be examined via the holographic-optical component.
  • the holographic-optical component can advantageously fulfill a number of functions, in particular due to holographic structures designed for this purpose in one or more holographic layers of the HOE.
  • the HOE is preferably designed to geometrically combine several beam paths and thus to deflect light beams incident on the HOE from different directions into a common area, in particular a common direction, in particular via reflection or transmission caused by the HOE.
  • the HOE can be designed to direct only light beams of specific wavelengths in a specific direction, preferably onto the sample.
  • the HOE can be designed to shape an intrinsic radiation distribution of one or more of the light sources, in particular to filter, diffract, focus/bundle, collimate and/or expand without the usual filters, diffraction gratings, lenses or curved mirrors to need.
  • the HOE can be set up Bending light of predetermined wavelengths, in particular at the short and/or long-wave edge of a predetermined wavelength band.
  • the HOE can preferably be designed to fulfill one or more of these functions at the same time.
  • the HOE can have a beam-shaping effect for light of predetermined wavelengths and/or from predetermined directions.
  • the HOE can preferably be permeable to light of other wavelengths and/or from other predetermined directions, ie only slightly, if at all, influence such light.
  • the invention thus advantageously enables the sample to be illuminated with spectrally different light from the same direction via the HOE.
  • the invention enables a wavelength-sensitive, deterministic deflection of light, as described above. This is particularly advantageous when different fluorophores in the sample are to be excited with different excitation spectra under the same geometric illumination conditions, ie when the sample is to be exposed to the same illumination situation regardless of the spectral distribution of the light.
  • the same illumination made possible by the device according to the invention has the particular advantage that inhomogeneities in the sample are illuminated in the same way by different excitation light and different fluorescence signals do not affect different ones.
  • the device according to the invention has the advantage that no moving parts and an associated mechanism that is susceptible to errors and wear and tear are required. Furthermore, it is avoided that a large part of the light generated by the broadband light source remains unused, possibly being shielded by further measures, and the associated waste heat having to be dissipated.
  • the invention also has particular advantages over the solutions with a plurality of light sources explained at the outset.
  • the solution according to the invention can be implemented much more cost-effectively than using a plurality of light sources. Because for light sources with intrinsically limited spectral ranges are often Laser or superluminescent diodes and for broadband light sources comparatively expensive dielectric bandpass filters are required.
  • the device according to the invention does not require any additional optical components such as, for example, dichroic mirrors for combining the beam paths of the various light sources.
  • the invention thus provides resource-saving, compact and comparatively inexpensive excitation optics which are particularly suitable for use in low-cost molecular diagnostics, in particular for use in lab-on-a-chip platforms, preferably with quantitative real-time PCR with multiplex functionality, for example in point-of-care solutions.
  • the HOE and the two light sources are arranged relative to one another in such a way that first light from the first light source and second light from the second light source are directed via the HOE onto a common light path or beam path for irradiating the sample, preferably via a reflection the HOE, for which the HOE includes a reflection hologram.
  • the common light path or common beam path can be realized in particular by at least partially, preferably completely, overlapping beam paths or beam profiles.
  • the device according to the invention enables an at least partially, preferably completely congruent wavefront of the light beams deflected by the HOE.
  • the device can also comprise more than two light sources as described above, with the further light sources also being able to have beam-shaping and/or spectrally filtering elements as explained above.
  • the device comprises in particular between two and six, preferably between two and four light sources, in particular light sources suitable for molecular diagnostic applications.
  • the sample area can advantageously be illuminated in the same way with many different light spectra.
  • the device comprises at least one third light source and the holographic-optical component is designed to be transparent to light of predetermined wavelengths from the third light source.
  • the HOE is located between the third light source and the two other light sources and the sample.
  • the HOE is designed to deflect light from the first and second light sources onto the sample and to let light from the third light source pass through, so that preferably light from all three light sources hits the sample area and in particular the sample from the same direction .
  • the HOE thus preferably has no significant effect on light of predetermined wavelengths from the third light source, with the exception of effects due to interface and material properties that cannot be completely avoided (Fresnel reflection and slight scattering and absorption).
  • further light sources can be placed on the same side of the HOE as the first and second light sources or on the same side as the third light source, so that selected light from these light sources is also deflected via the HOE or guided through the HOE.
  • the HOE can be set up to allow light of predetermined wavelengths to pass through the HOE from a predetermined direction and to change the direction in the process, so that an effect similar to the diffraction of light occurs.
  • the device comprises one or more additional optical elements, in particular diaphragms, lenses and/or shutters or other beam-shaping and/or spectrally filtering elements as described above.
  • additional optical elements in particular diaphragms, lenses and/or shutters or other beam-shaping and/or spectrally filtering elements as described above.
  • These further optical elements can be arranged with respect to the holographic-optical component in such a way that light from the light sources deflected by the HOE is modified, in particular bundled, focused and/or deflected. This has the advantage that the light deflected by the holographic-optical component can be further adjusted before impinging on a sample.
  • the first light source and the second light source are on a shell of a cone or a Truncated cone, in particular on a circle, arranged around the exit axis of the holographic-optical component.
  • the exit axis is to be understood in particular as the direction in which the HOE, due to its design, emits or deflects light as intended.
  • the holographic-optical component can preferably be arranged at or in the tip of the cone or the truncated cone.
  • the jacket can only be understood to mean the imaginary geometric shape of the geometric object of a cone or a truncated cone.
  • the first and/or the second light source can actually be arranged on or in a casing of a preferably at least partially conical, pyramidal, truncated cone-shaped or truncated pyramid-shaped component.
  • This has the advantage that rotationally symmetrical molded parts can be produced cost-effectively and precisely, and that the adjustment effort is significantly reduced due to the utilization of the geometry of the molded part.
  • the first light source and the second light source are arranged on a circle around the exit axis of the holographic optical component.
  • this component can also be a hollow body.
  • the light sources and/or the HOE can be attached inside, in particular on or in an inner wall, of the hollow body.
  • the device has one or more mirrors.
  • the mirrors are arranged with respect to the light sources and the holographic-optical component in such a way that light emitted by the light sources is directed via the mirrors onto the holographic-optical component.
  • the mirrors can preferably be arranged on or on the jacket of the component described above. If the device has a hollow body as described above, one or more mirrors can be attached to an inside of the hollow body, in particular to an inside of the casing of the hollow body. A part of the casing can also be designed as a mirror, for example due to a reflecting area of a surface of the casing, for example a reflecting metallic surface.
  • the one or more mirrors may be part of a tapered cladding, in particular part of a cladding of a preferably designed as a hollow cone, truncated cone, pyramid or truncated pyramid.
  • the device has a transparent body which is arranged in such a way that light from at least one light source can be guided through the transparent body, preferably using total reflection within the body.
  • the transparent body can be arranged between at least one light source, preferably between both light sources, and the HOE.
  • the transparent body can consist at least partially of glass or transparent plastic.
  • the HOE can be attached or arranged on or in the transparent body. This has the advantage that no separate substrate is required for the placement of the HOE.
  • At least one light source and the HOE adjoin the transparent body, which body can be shaped as a plate.
  • This has the advantage that light coupled into the body by the light source can be guided through the body to the HOE, preferably using total reflection.
  • the HOE can have, for example, a reflection hologram or a transmission hologram for coupling the light out of the body.
  • the light sources are arranged on a common circuit board. This has the advantage that only one component is required for a well-defined placement of the light sources.
  • the holographic-optical component is designed to collimate or focus incident radiation.
  • the incident radiation can be a plane wave, diverging radiation or converging radiation.
  • the diverging radiation can in particular be part of a radiation with a spherical wave front, such as is emitted by an approximately point light source, for example.
  • the invention also relates to a device for examining a sample, in particular a biological one, the device comprising a device according to the invention and a measuring device for detecting light emitted by a sample taken, in particular fluorescent light.
  • the invention also relates to a method for irradiating a sample, in particular a biological one, with the device according to the invention, i.e. a method in which first light from a first light source and second light from a second light source are directed via a holographic-optical component onto a common sample area, in particular onto a common light path, are directed to irradiate the sample.
  • the method according to the invention is particularly suitable for use in lab-on-a-chip platforms, preferably for fluorescence measurements in (quantitative) real-time PCR with multiplex functionality, for example in point-of-care solutions.
  • FIG. 7 shows a flow chart of an exemplary embodiment of the method according to the invention.
  • FIG. 1 shows a first exemplary embodiment of the device 100 according to the invention.
  • the device 100 comprises a holographic-optical component 150 ("HOE"), a first light source 110 and a second light source 120 in order to illuminate a sample 210 placed in a sample area 200.
  • the sample comprises, as described above, DNA sections amplified via the polymerase chain reaction, which are to be detected by exciting fluorescent probes in the sample.
  • FIG. 1 also shows an exemplary embodiment of the device 1000 according to the invention, comprising the exemplary embodiment of the device 100 according to the invention and a measuring device 300, the measuring device 300 being set up, for example as a camera, in order to capture fluorescent light emitted by the sample 210.
  • the HOE 150 includes one or more holograms, such as volume holograms, which may be embedded in one or more photopolymer layers.
  • the photopolymer layers can be applied to a suitable support, for example a glass plate, or embedded between two supports, for example in laminated form.
  • the hologram can be exposed into the layer(s) according to the desired arrangement of the light sources relative to the HOE and the sample area.
  • the hologram can be embossed into the layer, for example with the aid of an embossing template (also called “master”).
  • the first light source 110, the second light source 120 and the holographic-optical component 150 are arranged in relation to one another in such a way that first light 10 from the first light source 110 and second light 30 from the second light source 120 via the HOE 150 a common sample area 200 for the irradiation of the sample 210 can be directed can.
  • the HOE 100 is designed in such a way that it directs planar light waves, in particular collimated radiation, of a first wavelength from a first direction onto a common sample area 200 .
  • "light waves of a ... wavelength” means in particular light waves with wavelengths from a wavelength interval of finite width, ie in particular light waves with wavelengths from a specific wavelength spectrum of finite width.
  • the HOE 150 is specified in this example to redirect planar light waves (collimated rays) of a first wavelength from a first direction 10 to a second direction 20, preferably perpendicular to the surface of the HOE 150 as shown in FIG.
  • the HOE 150 is also designed in such a way that planar light waves of a second wavelength are also deflected from a third direction 30 into the second direction 20, ie both light paths are combined.
  • a reflection hologram is preferably used, as shown, because in practice it is usually possible to achieve better quality with regard to diffraction efficiency and light scattering.
  • the device 100 can also be configured with a transmission hologram.
  • the HOE 150 can in particular (additionally) be configured to carry out a wave selection depending on the direction of the light incident on the HOE 150 .
  • two light sources 110, 120 are mounted in such a way that they can illuminate the HOE 150, with the wavelength and direction of incidence having to correspond to the design of the HOE 150 hologram.
  • the first light source 110 may be an LED that emits light having a center wavelength of approximately 472 nanometers (nm) and a FWHM of 15 nm.
  • the second light source 120 could also be an LED, for example, which emits light with a central wavelength of approximately 530 nm and a full width at half maximum of 32 nm.
  • the HOE 150 is designed to deflect light with a wavelength of 472 nm coming from the first light source 110 and light with a wavelength of 530 nm coming from the second light source 120 in a common direction 20 towards the sample region 200 .
  • the efficiency of the HOE 150 hologram typically follows one Lorentz distribution with a width of 15 nm, for example, around the respective central wavelength, which does not necessarily have to match the central wavelengths of the LEDs 110, 120 exactly.
  • the HOE 150 preferably restricts the deflected radiation to the range given by its own FWHM and keeps it dependent on operation, in particular dependent on temperature and current supply, and despite the central wavelengths of the LEDs that vary due to manufacturing tolerances.
  • the HOE 150 thus combines the two from different directions 10,
  • the exemplary embodiment shown in FIG. 1 for two light sources 110, 120 and two directions 10, 30 with two different wavelength spectra can be expanded to include additional light sources if required.
  • the symmetry of the light sources 110, 120 shown in FIG. 1 in relation to the HOE 150 is not mandatory.
  • the light sources 110, 120 can be arranged with respect to the HOE, in contrast to what is shown, in such a way that light emitted by them forms different angles of incidence to a surface normal of the HOE 150.
  • the HOE 150 can also be designed so that, at predetermined angles of incidence, the light incident from the light sources 110, 120 is not deflected along the normal to the surface of the HOE150, as shown, but at a different angle to the normal to the surface.
  • the device 100 can preferably have two to six light sources, particularly preferably four light sources.
  • the two or more light sources can be arranged on a circle around an axis perpendicular to the HOE, in particular around a surface normal of the HOE, which lies in the second direction 20 according to FIG. 1, as explained further below.
  • This has optical, structural and manufacturing advantages.
  • the maximum number of light sources is only limited for practical reasons, in particular due to limited installation space and a decreasing efficiency of the HOE 150 with an increasing degree of multiplexing.
  • optical collecting elements 111, 121 collimated or bundled depending on the optical design of the hologram of the HOE 150 and beam path.
  • Refractive or diffractive optical elements known from the prior art can be used here, for example simple lenses, parabolic converging lenses, Fresnel lenses, HOEs or combinations of these elements.
  • the device 100 can have bandpass filters 112, 122, as shown in FIG.
  • bandpass filters 112, 122 are placed after the collection elements 111, 121 where the rays emitted by the light sources 110, 120 have as narrow an angular distribution as possible.
  • the space of light source 110, 120 and collecting optics 111, 121 is optically separated from the space of HOE 150 with bandpass filters 112, 122 (e.g. by shielding surfaces or in a tube, as shown in Figure 1), so that no light components from light source 110, 120 to HOE 150 can pass bandpass filter 112, 122.
  • the optional bandpass filters 112, 122 have the advantageous effect of restricting the spectral range of the light sources 110, 120 in a narrower band and with steeper edges than is usually possible due to the intrinsic spectral width of the hologram of the HOE 150. Furthermore, scattered light with undesired wavelengths can be reduced in this way.
  • the device 100 can have a further collecting element 220, in particular a collecting lens, for focusing the beams 20 onto the sample 210.
  • the device 100 can include further optical elements such as diaphragms, lenses and shutters in order to further shape the combined beam path 20 after the HOE.
  • the exemplary embodiment shown in FIG. 1 is particularly suitable for deflecting plane waves or collimated beams. This is particularly advantageous if, in addition to cleaning up scattered light, interference filters 112, 122 (bandpass or edge filters) are to be used, for example in front of a single light source or also a multibandpass filter downstream of the HOE 150.
  • interference filters 112, 122 bandpass or edge filters
  • the device 100 also makes it possible not only to implement a wavelength-selective deflection with the HOE 150, but also to shape the wave front of the incident light.
  • FIG. 2a shows an exemplary embodiment in which the spherical wave 11, 31 emanating from the respective light source 110, 120 is deflected into a spherical wave 21 running towards the sample 210.
  • the divergent light of the light sources 110, 120 is collected by the HOE 150 over a large cross-sectional area and focused on the sample 210.
  • exemplary embodiments of the device 100 can also be realized in which the HOE 150 provides a comparatively plane wave either on the sample or light source side and enables the integration of a bandpass filter on this side, but has a collecting or focusing effect on the other side.
  • the symmetry of the light sources 110, 120 shown in FIG. 2a in relation to the HOE 150 is also not mandatory.
  • FIG. 2b shows a development of the exemplary embodiment from FIG. 2a, which has an additional third light source 130 in addition to the first two light sources 110, 120, light from the third light source 130 preferably irradiating the sample without being influenced by the HOE.
  • the third light source 130 can be arranged on the side of the HOE 150 facing away from the first two light sources 110 , 120 .
  • the HOE 150 can preferably be designed to be transparent to light 40 of a predetermined wavelength range from the third light source 130 .
  • the HOE 150 can be implemented in such a way that it redirects light of certain wavelengths from certain directions to a desired target direction while allowing light of certain other wavelengths and/or from certain other directions to pass in the same target direction substantially unhindered.
  • the light sources 110, 120, 130 could have peak wavelengths of 470 nm, 530 nm, 590 nm, 630 nm, 405 nm or 385 nm. If the holographic material is not suitable for one of the wavelengths desired for the application, for example for 385 nm, it is possible to provide the source 130 with that wavelength according to FIG. 2b.
  • the device 100 can have further lenses 131, 132 and/or bandpass filters 133 arranged in front of the third light source 130 in order to collect/scatter or filter light from the third light source as required.
  • the HOE 150 can be designed to shape, in particular to filter, bundle, light of predetermined wavelengths from the third light source 130 and in special configurations, as already explained above, also light of predetermined wavelengths from the first and/or second light source 110, 120. scatter and/or bend.
  • Figure 2c illustrates a beam shaping of light emitted by the third light source 130 by the HOE 150.
  • the HOE 150 is designed to diffract a predetermined wavelength spectrum 300 at the short-wave edge 310 and/or at the long-wave edge 320 (and thereby effectively cropping the spectrum 300) and/or condensing light 330 passing through the HOE 150 analogously to a converging lens.
  • An intrinsic spectrum of the light source 130 can thus be effectively tailored to a narrower, preferably steeper shape, which advantageously leads to a spectrum incident on the sample 210 which is more robust to fluctuations in the temperature, operating current or component tolerance of the light source 130 .
  • the HOE can also be designed to convert the light components 310, 320 that are bent away into one internal mode and from there preferably to be converted into an absorber material or a beam trap in order to avoid scattered light.
  • a plurality of light sources 110, 120 are arranged on the jacket 161 of a truncated cone 160 in such a way that their optical axes point to the center of the HOE 150 without further adjustment.
  • the light sources 110, 120 are arranged along a circle 162 about the exit axis 20 of the HOE 150.
  • the truncated cone 160 is preferably arranged rotationally symmetrically about the exit axis 20 of the HOE 150 , the exit axis being perpendicular to the planar HOE 150 , ie congruent with a surface normal of the HOE 150 .
  • the first light source 110 and the second light source 120 are arranged on a common circuit board 170, which is advantageous in terms of manufacturing technology.
  • the printed circuit board 170 can in particular be a substrate that is customary for optical components, for example a circuit board that is customary in electronics.
  • the circuit board can have a core made of a material with good thermal conductivity for dissipating the waste heat, for example comprising aluminum.
  • the collimated beams 10, 30 can then be directed onto the HOE 150, as shown, via an at least partially mirrored surface on the inside of a truncated pyramid 160 or truncated cone 160, or alternatively via mirrors 163 attached to the inside.
  • a mirroring of the inner surface of the stump 160 can be realized, for example, by means of reflective metal surfaces, in particular by means of vapor-deposited aluminum or silver.
  • the reflective surfaces could also be curved and thus also fulfill an optical function.
  • the HOE 150 can likewise be arranged on or in the stump 160 .
  • the device 100 can also have a solid, transparent body 180 in which the beam deflection via total internal reflection.
  • the body 180 can have glass or transparent plastic.
  • Figure 5a shows a further exemplary embodiment of the device 100 according to the invention, comprising a plurality of light sources, in particular light-emitting diodes, in this example four light sources, 110, 120, 130, 140.
  • the LEDs 110, 120, 130, 140 are arranged on a circuit board 171, for example in a two-by-two grid arrangement, as shown in the plan view of circuit board 171 in Figure 5b.
  • the device 100 can also have more or fewer light sources, which are arranged in particular at a minimal distance from one another, as described below.
  • the HOE 150 is arranged opposite a surface of the circuit board 171, which is preferably designed to direct perpendicularly incident light 10, which in this example is approximately spherical, due to the approximately point-shaped light sources 110, 120, 130, 140 into a common sample area, in particular in a common direction 20 , at an angle 175 to the surface normal 174 of the HOE 150.
  • the angle 175 can have a value between 40 and 70 degrees, preferably between 50 and 50 degrees.
  • the angle should preferably be selected in such a way that Fresnel reflections are avoided, which occur in particular when the angle of incidence on the hologram corresponds to the angle of reflection.
  • a distance 126 between circuit board 171 and HOE 150 is preferably at least three times greater, more preferably at least five times greater than a distance 127 between the light sources 110, 120, 130, 140. It is therefore also advantageous if the light sources 110, 120, 130, 140 are placed as close together as possible in order to achieve a good overlap of the emission cones.
  • the device 100 can also have an aperture 124 in order to bring the light deflected by the HOE 150 to a congruent area as far as possible and thus to realize an illumination situation of the sample area 200 that is as identical as possible for all light sources.
  • the light beams are propagated in the carrier medium of the hologram or the HOE, usually a glass plate.
  • Such an arrangement is shown in a further exemplary embodiment of the device 100 according to the invention in accordance with FIG.
  • the device 100 comprises a transparent plate 190 as the transparent body 180, to which the two light sources 110, 120 in the form of LEDs adjoin with as little air gap as possible (possibly mediated by a layer adapted to the refractive index).
  • the transparent plate 190 can be, for example, a glass plate 190 or another transparent carrier medium, for example based on transparent plastic.
  • the light coupled into the transparent plate 190 by the light sources 110, 120 is deflected onto the common sample area 200 by a HOE 150, which is also adjacent to the plate 190 and comprises a reflection hologram.
  • the device can have further HOE 151,
  • the HOE150 could also include a transmission hologram and/or be placed on the opposite side of the plate 190.
  • the first HOE can also extend over a greater width along the plate 190 and thus replace the further HOE 151, 152.
  • FIG. 7 shows a flow chart 600 for an exemplary embodiment of the method 600 according to the invention, which can be carried out, for example, with one of the exemplary embodiments according to FIGS.
  • a first step 601 of the method 600 the device 100 according to the invention is provided.
  • a sample 210 can be placed in the common sample area 200 .
  • a third In step 603 light from the first light source 110 and thereafter or simultaneously light from the second light source 120 is directed via the HOE onto the common sample area in order to excite fluorophores in the sample 210, for example.
  • a fourth step 604 which can take place at the same time as the third step 603, the sample 210 is sent out
  • Fluorescence radiation is detected with the measuring device 300, for example a camera 300 or a photodiode, for a subsequent analysis of the sample 210.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (100) und ein Verfahren (600) zur Bestrahlung einer insbesondere biologischen Probe (210), umfassend eine erste Lichtquelle (110), eine zweite Lichtquelle (110) und zumindest ein holografisch-optisches Bauelement (150), wobei die erste Lichtquelle (110), die zweite Lichtquelle (120) und das holografisch-optisches Bauelement (150) derart zueinander angeordnet sind, dass erstes Licht (10, 11) aus der ersten Lichtquelle (110) und zweites Licht (30, 31)aus der zweiten Lichtquelle (120) über das holografisch-optisches Bauelement (150) auf einen gemeinsamen Probenbereich (200) zur Bestrahlung der Probe (210) gelenkt werden

Description

Beschreibung
Titel
Vorrichtung, Einrichtung und Verfahren zur Bestrahlung einer insbesondere biologischen Probe mit einem holografisch-optischen Bauelement
Stand der Technik
Insbesondere in den Biowissenschaften stützen sich zahlreiche experimentelle Methoden auf Fluoreszenzphänomene. Neben der Grundlagenforschung finden Fluoreszenzmessungen auch vielfach Anwendungen in der Medizintechnik, beispielsweise in der Durchflusszytometrie, bei der quantitativen Echtzeit-PCR, bei Antikörpertests oder bei der Histopathologie.
Besondere Bedeutung kommt bei den relevanten Instrumenten der Lichtquelle zu, denn jede Fluoreszenzmessung erfordert eine Anregung der Probe mit einem ausgewählten Wellenlängenband. Aufgabe der Lichtquelle ist es dabei, Licht hoher spektraler Dichte im Bereich der Absorptionsbande des jeweiligen Fluorophors zu liefern. Gleichzeitig muss das Licht aber auf ein genau definiertes Wellenlängenintervall beschränkt sein, um die spektral meist nicht weit entfernten Fluoreszenzwellenlängen nicht zu überstrahlen. Diese Anforderungen verschärfen sich, wenn mehrere Farbstoffe separat adressiert werden sollen, die unterschiedliche, meist überlappende Anregungs- und Fluoreszenzbänder aufweisen. Die Lichtquelle muss dann zwischen verschiedenen Anregungsbändern umschalten können, die sich spektral durch präzise definierte Wellenlängenbänder mit steilen Flanken auszeichnen.
Nach dem Stand der Technik werden solche Lichtquellen realisiert, indem man entweder eine sehr breitbandige Lichtquelle (z.B. weiße Leuchtdiode, Glüh- oder Gasentladungslampe) mit wechselbaren dielektrischen Bandpassfiltern versieht, die beispielsweise auf einem Schieber oder Rad angeordnet sind, oder mehrere Lichtquellen verwendet, die entweder intrinsisch eingeschränkte Spektralbereiche besitzen (Laser, SLD) und/oder breitbandiger sind (z.B. farbige LED), aber durch jeweils einen festen Bandpassfilter spektral definiert werden. Bei Verwendung mehrerer Lichtquellen werden die Strahlengänge üblicherweise durch dichroitische Spiegel zur Deckung gebracht, bevor das Licht auf die Probe trifft.
Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Bestrahlung einer Probe. Die Vorrichtung umfasst eine erste Lichtquelle, eine zweite Lichtquelle und zumindest ein holografisch-optisches Bauelement. Die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und das holografisch-optische Bauelement sind dabei derart zueinander angeordnet, dass erstes Licht aus der ersten Lichtquelle und zweites Licht aus der zweiten Lichtquelle über das holografisch optisches Bauelement auf einen gemeinsamen Probenbereich zur Bestrahlung der Probe gelenkt werden.
Die Probe umfasst vorzugsweise ein Material, das bei geeigneter optischer Anregung zur Fluoreszenz angeregt werden kann, insbesondere aufgrund in der Probe enthaltener oder der Probe zugegebener Fluorophore. Bei der Probe kann es sich insbesondere um eine biologische Probe handeln. Beispielsweise kann die Probe Teile einer Körperflüssigkeit eines Tieres oder eines Menschen umfassen, beispielsweise Bestandteile aus Blut, Urin, Sputum oder einem Abstrich oder aus einer Gewebeprobe. Insbesondere kann die Probe Nukleinsäuren oder Abschnitte von Nukleinsäuren beinhalten, bevorzugt vervielfältigte Teile von Nukleinsäuren aus einer isothermalen oder auf Polymerase- Kettenreaktion („PCR“) basierenden Vervielfältigung von Nukleinsäure-Abschnitten. Beispielsweise kann die Probe ein Produkt aus einem Nachweisverfahren zum Nachweis von Krankheitserregern umfassen, insbesondere ein Produkt aus einer isothermalen oder PCR-basierten DNA- Amplifikation, wobei der Nachweis eines Vorliegens bestimmter Krankheitserreger insbesondere über eine fluoreszenz-basierte Auslese von mit Fluorophoren gekennzeichneten DNA-Proben erfolgen soll. Darüber hinaus ist die Erfindung jedoch grundsätzlich für jede Anwendung und für jede dafür verwendete Vorrichtung geeignet, bei welcher fluoreszierende Untersuchungsgegenstände mit mehreren Wellenlängenbändern beleuchtet werden müssen, insbesondere im Bereich der Life Science, der Forensik und auch beim Schutz und bei der Echtheitsprüfung von Produkten, insbesondere Dokumenten gegen Produktpiraterie.
Bei den Lichtquellen kann es sich beispielsweise um Leuchtdioden („LED“), Superlumineszenz- oder Laserdioden, Glühlampen, Gasentladungslampen oder auch durch Primärquellen angeregte Leuchtmittel wie beispielsweise phosphorkonvertierte Quellen handeln. Bevorzugt weist die erste Lichtquelle ein erstes Emissionsspektrum auf, welches sich von einem zweiten Emissionsspektrum der zweiten Lichtquelle unterscheidet. Somit kann sich das erste Licht in seinem Wellenlängenspektrum von dem zweiten Licht vorzugsweise unterscheiden. In vorteilhaften Ausführungen umfassen die erste oder die zweite Lichtquelle strahlformende Elemente (z.B. Hohlspiegel, Fresnel oder refraktive Linsen) und/oder spektral filternde Elemente (z.B. dielektrische Filter oder Farbgläser). Insbesondere können die erste oder die zweite Lichtquelle einen Bandpassfilter zur definierten Begrenzung des emittierten Lichts umfassen. Durch solche Bandpassfilter kann der Spektralbereich der Lichtquellen vorteilhafterweise schmalbandiger und flankensteiler eingeschränkt werden, als dies allein durch die intrinsische spektrale Breite des holografisch optisches Bauelements möglich ist. Ferner kann Streulicht mit unerwünschten Wellenlängen reduziert werden. Alternativ oder zusätzlich können solche strahlformende und/oder spektral filternde Elemente an anderen Stellen der Vorrichtung angeordnet sein, insbesondere zwischen dem holografisch-optischen Bauelement und dem Probenbereich bzw. der Probe.
Bei dem holografisch-optisches Bauelement (auch abgekürzt als „HOE“ bezeichnet) handelt es sich insbesondere um ein Element, dessen holografische Eigenschaften für die Optik von Geräten verwendet werden kann, um beispielsweise herkömmliche Linsen, Spiegel und Prismen zu ersetzen. Das HOE umfasst vorzugsweise ein Substrat zur mechanischen Stabilisierung (z.B. Glas oder Kunststoff), sowie mindestens eine oder mehrere optisch wirksame Schichten, in die ein oder mehrere Hologramme eingeschrieben sind. Das HOE ist, wie oben angeführt, ausgelegt, Licht der der ersten und zweiten Lichtquelle zumindest anteilig auf den Probenbereich zu lenken. Die intrinsische Wellenlängenselektivität der Hologramme kann dabei vorzugsweise als erwünschte Filterfunktion genutzt werden, um ein speziellen Wellenlängenband zur Beleuchtung des Probenbereichs und der Probe zu selektieren. In vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung kann das holografisch-optische Bauelement ein Reflexionshologramm oder ein Transmissionshologramm umfassen, welches als Oberflächenhologramm oder bevorzugt als Volumenhologramm ausgestaltet ist. Das holografisch-optische Bauelement ist somit vorzugsweise ausgebildet, bei relativ zum HOE vorgegebener Platzierung der ersten Lichtquelle mit dem ersten Emissionsspektrum und der zweiten Lichtquelle mit dem zweiten Emissionsspektrum zumindest einen Teil des Licht aus der ersten Lichtquelle und einen Teil des Lichts aus der zweiten Lichtquelle auf einen vorgegebenen Probenbereich zu lenken.
Unter dem (gemeinsamen) Probenbereich ist ein bestimmter räumlicher Bereich relativ zum HOE und vorzugsweise relativ zu den beiden Lichtquellen zu verstehen, insbesondere ein bestimmter Raumwinkelbereich, in welchem eine Probe für eine erfindungsgemäße Beleuchtung platziert werden kann.
Durch die Erfindung wird somit vorteilhafterweise eine Anregungsoptik für Fluoreszenzspektroskopie bereitgestellt, wobei Anregungslicht aus unterschiedlichen Anregungskanälen über das holografisch-optische Bauelement auf die zu untersuchende Probe gelenkt werden kann. Dabei kann das holografisch-optisches Bauelement vorteilhafterweise mehrere Funktionen erfüllen, insbesondere aufgrund dafür ausgebildeter holografischer Strukturen in einer oder mehreren holografischen Schichten des HOE. Zum einen ist das HOE vorzugsweise ausgestaltet, mehrere Strahlengänge geometrisch zu vereinigen, und damit auf das HOE einfallende Lichtstrahlen aus verschiedenen Richtungen in einen gemeinsamen Bereich, insbesondere eine gemeinsame Richtung umzulenken, insbesondere über durch das HOE verursachte Reflexion oder Transmission. Außerdem kann das HOE ausgestaltet sein, nur Lichtstrahlen bestimmter Wellenlängen in eine bestimmte Richtung zu lenken, vorzugsweise auf die Probe. Dies hat ferner den Vorteil, dass auf Bandpassfilter verzichtet werden kann. Darüber hinaus kann das HOE ausgebildet sein, eine intrinsische Strahlungsverteilung einer oder mehrere der Lichtquellen zu formen, insbesondere zu filtern, zu beugen, zu fokussieren/bündeln, zu kollimieren und/oder aufzuweiten, ohne dabei sonst übliche Filter, Beugungsgitter, Linsen oder gekrümmte Spiegel zu benötigen. Ferner kann das HOE eingerichtet sein, Licht vorgegebener Wellenlängen zu beugen, insbesondere an der kurz- und/oder langwelligen Flanke eines vorgegebenen Wellenlängenbandes. Das HOE kann dabei bevorzugt ausgebildet sein, eine oder mehrere dieser Funktionen gleichzeitig zu erfüllen. Mit anderen Worten kann das HOE für Licht vorgegebener Wellenlängen und/oder aus vorgegebenen Richtungen strahlformend wirken. Bevorzugt kann das HOE darüber hinaus für Licht anderer Wellenlängen und/oder aus anderen vorgegebenen Richtungen durchlässig sein, also solches Licht, wenn überhaupt, nur geringfügig beeinflussen.
Die Erfindung ermöglicht somit vorteilhafterweise, dass die Probe mit spektral verschiedenem Licht aus derselben Richtung über das HOE beleuchtet werden kann. Insbesondere ist durch die Erfindung eine wellenlängensensitive, deterministische Umlenkung von Licht möglich, wie oben beschrieben. Dies ist insbesondere dann besonders vorteilhaft, wenn in der Probe befindliche verschiedene Fluorophore mit unterschiedlichen Anregungsspektren unter gleichen geometrischen Beleuchtungsbedingungen angeregt werden sollen, also wenn unabhängig von der spektralen Verteilung des Lichts die Probe der gleichen Beleuchtungssituation ausgesetzt werden soll. Im Gegensatz zu einer Beleuchtung der Probe mit räumlich getrennten Lichtquellen hat die über die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglichte gleiche Beleuchtung den besonderen Vorteil, dass Inhomogenitäten in der Probe in gleicher Weise durch unterschiedliches Anregungslicht beleuchtet werden und unterschiedlichen Fluoreszenzsignal nicht unterschiedliche beeinflussen.
Im Gegensatz zu der eingangs erläuterten Lösung mit breitbandiger Lichtquelle und wechselbaren Filtern hat die erfindungsgemäße Vorrichtung den Vorteil, dass keine beweglichen Teile und ein damit verbundener fehler- und verschleißanfälliger Mechanismus erforderlich sind. Ferner wird vermieden, dass ein großer Teil des durch die breitbandige Lichtquelle erzeugten Lichts ungenützt bleibt, eventuell durch weitere Maßnahmen abgeschirmt werden, und die damit einhergehende Abwärme abgeführt werden muss. Auch gegenüber den eingangs erläuterten Lösungen mit mehreren Lichtquellen weist die Erfindung besondere Vorteile auf. Die erfindungsgemäße Lösung ist deutlich kostengünstiger realisierbar als die Verwendung mehrerer Lichtquellen. Denn für Lichtquellen mit intrinsisch eingeschränkten Spektralbereichen werden oftmals Laser- oder Superlumineszenzdioden und für breitbandige Lichtquellen werden vergleichsweise teure dielektrische Bandpassfilter benötigt. Darüber hinaus benötigt die erfindungsgemäße Vorrichtung aufgrund der besonderen Eigenschaften des HOE keine zusätzlichen optischen Bauteile wie beispielsweise dichroitische Spiegel für eine Vereinigung der Strahlengänge der verschiedenen Lichtquellen.
Die Erfindung stellt somit eine ressourcensparende, kompakte und vergleichsweise kostengünstige Anregungsoptik bereit, welche besonders für den Einsatz in der Low-Cost-Molekulardiagnostik geeignet ist, insbesondere für die Anwendung in Lab-on-a-Chip-Plattformen, bevorzugt bei quantitativer Echtzeit-PCR mit Multiplex- Funktionalität, beispielsweise bei Point-of-Care- Lösungen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung sind das HOE und die beiden Lichtquellen derart zueinander angeordnet, dass erstes Licht aus der ersten Lichtquelle und zweites Licht aus der zweiten Lichtquelle über das HOE auf einen gemeinsamen Lichtweg oder Strahlengang zur Bestrahlung der Probe gelenkt werden, vorzugsweise über eine Reflexion durch das HOE, wozu das HOE eine Reflexionshologramm umfasst. Der gemeinsame Lichtweg beziehungsweise gemeinsame Strahlengang kann dabei insbesondere durch zumindest teilweise, vorzugsweise komplett überlappende Strahlengänge oder Strahlenprofile verwirklicht werden. Im Spezialfall ebener Wellen des von den Lichtquellen ausgesendeten Lichts ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung eine zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig deckungsgleiche Wellenfront der von dem HOE umgelenkten Lichtstrahlen.
Die Vorrichtung kann in vorteilhafter Weiterbildung auch mehr als zwei Lichtquellen wie oben beschrieben umfassen, wobei die weiteren Lichtquellen ebenfalls strahlformende und/oder spektral filternde Elemente wie oben ausgeführt aufweisen können. Gemäß vorteilhaften Ausgestaltungen umfasst die Vorrichtung insbesondere zwischen zwei und sechs, bevorzugt zwischen zwei und vier Lichtquellen, insbesondere für molekulardiagnostische Anwendungen geeignete Lichtquellen. Somit kann der Probenbereich vorteilhafterweise in gleicher Weise mit vielen verschiedenen Lichtspektren beleuchtet werden. Gemäß besonderer Ausgestaltung umfasst die Vorrichtung zumindest eine dritte Lichtquelle und das holografisch-optisches Bauelement ist ausgebildet, für Licht vorgegebener Wellenlängen aus der dritten Lichtquelle durchlässig zu sein.
Damit ist vorteilhafterweise eine besonders kompakte Ausführung der Vorrichtung möglich, bei welcher sich das HOE zwischen der dritten Lichtquelle und den beiden anderen Lichtquellen sowie der Probe befindet. Mit anderen Worten ist das HOE ausgebildet, Licht aus der ersten und der zweiten Lichtquelle auf die Probe umlenken und Licht aus der dritten Lichtquelle passieren zu lassen, so dass vorzugsweise Licht aus allen drei Lichtquellen aus derselben Richtung auf den Probenbereich und insbesondere auf die Probe trifft. Das HOE hat gemäß dieser Ausgestaltung somit bevorzugt, mit Ausnahme von nicht vollständig vermeidbaren Effekten durch Grenzflächen- und Materialeigenschaften (Fresnel- Reflexion sowie geringfügige Streuung und Absorption), keine deutliche Wirkung auf Licht vorgegebener Wellenlänger aus der dritten Lichtquelle. Weitere Lichtquellen können in bevorzugten Ausgestaltungen auf derselben Seite des HOE wie die erste und zweite Lichtquelle oder auf derselben Seite wie die dritte Lichtquelle platziert werden, so dass ausgewähltes Licht aus diesen Lichtquellen ebenfalls über das HOE umgelenkt bzw. durch das HOE geleitet wird. In anderen Ausgestaltung kann das HOE eingerichtet sein, Licht vorgegebener Wellenlängen aus einer vorgegebenen Richtung durch das HOE passieren zu lassen und dabei die Richtung abzuändern, so dass ein Effekt wie bei einer Beugung von Licht eintritt.
In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung umfasst die Vorrichtung ein oder mehrere weitere optische Elemente, insbesondere Blenden, Linsen und/oder Shutter oder andere strahlformende und/oder spektral filternde Elemente wie oben beschrieben. Diese weiteren optischen Elemente können bezüglich des holografisch-optisches Bauelements derart angeordnet sein, um von dem HOE umgelenktes Licht aus den Lichtquellen abzuändern, insbesondere zu bündeln, fokussieren und/oder umzulenken. Dies hat den Vorteil, dass das von dem holografisch-optisches Bauelement umgelenkte Licht vor dem Auftreffen auf eine Probe weiter angepasst werden kann.
In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung sind die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle auf einem Mantel eines Kegels oder eines Kegelstumpfs, insbesondere auf einem Kreis, um die Austrittsachse des holografisch-optisches Bauelements angeordnet. Unter der Austrittsachse ist dabei insbesondere die Richtung zu verstehen, in welche das HOE aufgrund seiner Ausgestaltung Licht bestimmungsgemäß aussendet oder umlenkt. Dabei kann das holografisch-optisches Bauelement bevorzugt an oder in der Spitze des Kegels beziehungsweise des Kegelstumpfs angeordnet sein. Unter dem Mantel kann dabei nur die gedachte geometrische Form des geometrischen Objekts eines Kegels beziehungsweise eines Kegelstumpfs verstanden werden.
Alternativ können die erste und/oder die zweite Lichtquelle tatsächlich auf einem oder in einem Mantel eines bevorzugt zumindest teilweise kegelförmigen, pyramidenförmigen, kegelstumpfförmigen oder pyramidenstumpfförmigen Bauteils angeordnet sein. Dies hat den Vorteil, dass sich rotationssymmetrische Formteile kostengünstig und präzise hersteilen lassen können und dass der Justageaufwand aufgrund der Ausnutzung der Geometrie des Formteils deutlich verringert ist. In einem bevorzugten Grenzfall sind die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle auf einem Kreis um die Austrittsachse des holografisch optisches Bauelements angeordnet. Insbesondere kann es sich bei diesem Bauteil ferner um einen Hohlkörper handeln. In diesem Fall können die Lichtquellen und/oder das HOE im Inneren, insbesondere an oder in einer Innenwand, des Hohlkörpers angebracht sein.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weist die Vorrichtung ein oder mehrere Spiegel auf. Die Spiegel sind dabei bezüglich der Lichtquellen und dem holografisch-optisches Bauelement derart angeordnet, dass von den Lichtquellen ausgesandtes Licht über die Spiegel auf das holografisch-optisches Bauelement gelenkt wird. Vorzugsweise können die Spiegel auf oder an dem oben beschriebenen Mantel des Bauteils angeordnet sein. Wenn die Vorrichtung wie oben beschrieben einen Hohlkörper aufweist, können ein oder mehrere Spiegel auf einer Innenseite des Hohlkörpers angebracht sein, insbesondere auf einer Innenseite des Mantels des Hohlkörpers. Ein Teil des Mantels kann auch als Spiegel ausgebildet sein, beispielsweise aufgrund eines reflektierenden Bereichs einer Oberfläche des Mantels, beispielsweise eine spiegelnde metallische Fläche. Somit können die ein oder mehreren Spiegel Teil eines sich verjüngenden Mantels sein, insbesondere Teil eines Mantels eines vorzugsweise als Hohlkörper ausgebildeten Kegels, Kegelstumpfs, Pyramide oder Pyramidenstumpfs.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weist die Vorrichtung einen transparenten Körper auf, welcher derart angeordnet ist, dass Licht von zumindest einer Lichtquelle durch den transparenten Körper geleitet werden kann, vorzugsweise unter Ausnutzung von Totalreflexion innerhalb des Körpers. Dies hat den Vorteil, dass Lichtstrahlen von zumindest einer Lichtquelle über den massiven transparenten Körper zum HOE geleitet und/oder vom HOE zum Probenbereich geleitet werden können. Insbesondere kann der transparente Körper zwischen zumindest einer Lichtquelle, vorzugsweise zwischen beiden Lichtquellen, und dem HOE angeordnet sein. Der transparente Körper kann dazu zumindest teilweise aus Glas oder transparentem Kunststoff bestehen. Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung kann das HOE auf oder in dem transparenten Körper angebracht oder angeordnet sein. Dies hat den Vorteil, dass für die Platzierung des HOE kein eigenes Substrat benötigt wird. In einer vorzugsweisen Ausgestaltung grenzen zumindest eine Lichtquelle und das HOE an den transparenten Körper an, wobei der Körper als Platte ausgeformt sein kann. Dies hat den Vorteil, dass durch die Lichtquelle in den Körper eingekoppeltes Licht durch den Körper zum HOE geleitet werden kann, vorzugsweise unter Ausnutzung von Totalreflexion. Das HOE kann dabei beispielsweise ein Reflexionshologramm oder ein Transmissionshologramm zur Auskopplung des Licht aus dem Körper aufweisen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind die Lichtquellen auf einer gemeinsamen Platine angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass nur ein Bauteil für eine wohldefinierte Platzierung der Lichtquellen erforderlich ist.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das holografisch-optisches Bauelement ausgestaltet, einfallende Strahlung zu kollimieren oder zu fokussieren. Bei der einfallenden Strahlung kann es sich um eine ebene Welle, eine divergierende Strahlung oder eine konvergierende Strahlung handeln. Bei der divergierenden Strahlung kann es sich insbesondere um einen Teil einer Strahlung mit kugelförmiger Wellenfront handeln, wie sie beispielsweise von einer annähernd punktförmigen Lichtquelle ausgesendet wird. Gegenstand der Erfindung ist auch eine Einrichtung zur Untersuchung einer insbesondere biologischen Probe, wobei die Einrichtung eine erfindungsgemäße Vorrichtung und eine Messeinrichtung zur Erfassung von von einer aufgenommenen Probe emittierten Lichts, insbesondere von Fluoreszenzlicht, umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bestrahlung einer insbesondere biologischen Probe mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung, also ein Verfahren, wobei erstes Licht aus einer ersten Lichtquelle und zweites Licht aus einer zweiten Lichtquelle über ein holografisch-optisches Bauelement auf einen gemeinsamen Probenbereich, insbesondere auf einen gemeinsamen Lichtweg, zur Bestrahlung der Probe gelenkt werden. Wie oben erläutert, ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere für eine Anwendung in Lab-on-a- Chip-Plattformen geeignet, bevorzugt für Fluoreszenzmessungen bei (quantitativer) Echtzeit-PCR mit Multiplex- Funktionalität, beispielsweise bei Point- of-Care-Lösungen. Zu den weiteren Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auf die oben beschriebenen Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwiesen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen
Figuren 1 bis 6 Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung und Einrichtung und Figur 7 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsformen der Erfindung
Figur 1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100. Die Vorrichtung 100 umfasst ein holografisch-optisches Bauelement 150 („HOE“), eine erste Lichtquelle 110 und ein zweite Lichtquelle 120, um eine in einem Probenbereich 200 platzierte Probe 210 zu beleuchten. Beispielsweise umfasst die Probe wie oben beschrieben über Polymerase- Kettenreaktion vervielfältigte DNA-Abschnitte, welche über eine Anregung von Fluoreszenzsonden in der Probe nachgewiesen werden sollen. Figur 1 zeigt auch ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Einrichtung 1000 umfassend das Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 und eine Messeinrichtung 300, wobei die Messeinrichtung 300 eingerichtet ist, beispielsweise als Kamera, um von der Probe 210 emittiertes Fluoreszenzlicht zu erfassen.
Das HOE 150 umfasst ein oder mehrere Hologramme, beispielsweise als Volumenhologramme, welche in eine oder mehrere Photopolymerschichten eingebettet sein können. Die Photopolymerschichten können auf einem geeigneten Träger aufgebracht sein, beispielsweise eine Glasplatte, oder auch zwischen zwei Trägern eingebettet sein, beispielsweise in laminierter Form. Bei einer Ausgestaltung als Volumenhologramm kann das Hologramm in die Schicht(en) entsprechend der gewünschten Anordnung der Lichtquellen zum HOE und zum Probenbereich einbelichtet werden. Bei einer Ausgestaltung als Hologramm mit lokaler Variation der Schichtdicke kann das Hologramm beispielsweise mit Hilfe einer Prägevorlage (auch „Master“ genannt) in die Schicht eingeprägt werden.
Wie in Figur 1 dargestellt, sind die erste Lichtquelle 110, die zweite Lichtquelle 120 und das holografisch-optisches Bauelement 150 derart zueinander angeordnet, dass erstes Licht 10 aus der ersten Lichtquelle 110 und zweites Licht 30 aus der zweiten Lichtquelle 120 über das HOE 150 auf einen gemeinsamen Probenbereich 200 zur Bestrahlung der Probe 210 gelenkt werden kann. Dazu ist das HOE 100 derart ausgestaltet, dass es planare Lichtwellen, insbesondere kollimierte Strahlung, einer ersten Wellenlänge aus einer ersten Richtung auf einen gemeinsamen Probenbereich 200 lenkt. Unter „Lichtwellen einer ... Wellenlänge“ sind hier und im folgenden insbesondere Lichtwellen mit Wellenlängen aus einem Wellenlängenintervall endlicher Breite gemeint, also insbesondere Lichtwellen mit Wellenlängen aus einem bestimmten Wellenlängenspektrum endlicher Breite.
Das HOE 150 ist in diesem Beispiel so spezifiziert, dass es planare Lichtwellen (kollimierte Strahlen) einer ersten Wellenlänge aus einer ersten Richtung 10 in eine zweite Richtung 20 umlenkt, vorzugsweise senkrecht zur Oberfläche des HOE 150 wie in Figur 1 dargestellt. Das HOE 150 ist ferner derart ausgelegt, dass planare Lichtwellen einer zweiten Wellenlänge aus einer dritten Richtung 30 ebenfalls in die zweite Richtung 20 umgelenkt werden, also beide Lichtwege vereinigt werden. Vorzugsweise wird wie dargestellt ein Reflexionshologramm verwendet, weil damit in der Praxis meist eine bessere Qualität hinsichtlich Beugungseffizienz und Lichtstreuung erreichbar ist. Alternativ ist jedoch eine Ausgestaltung der Vorrichtung 100 auch mit einem Transmissionshologramm möglich. Wie oben erläutert, kann das HOE 150 insbesondere (zusätzlich) ausgestaltet sein, eine Wellenselektion abhängig von der Richtung des auf das HOE 150 einfallenden Lichts vorzunehmen.
Wie in Figur 1 dargestellt, werden zwei Lichtquellen 110, 120, vorzugsweise Leuchtdioden (LEDs), so angebracht, dass sie das HOE 150 beleuchten können, wobei Wellenlänge und Einstrahlrichtung der Auslegung des Hologramms des HOE 150 entsprechen müssen. Beispielsweise kann es sich bei der ersten Lichtquelle 110 um eine LED handeln, die Licht mit einer Zentralwellenlänge von etwa 472 Nanometer (nm) und einer Halbwertsbreite von 15 nm abstrahlt. Die zweite Lichtquelle 120 könnte beispielsweise ebenfalls eine LED sein, die Licht mit einer Zentralwellenlänge von etwa 530 nm und einer Halbwertsbreite von 32 nm abstrahlt. Das HOE 150 ist also in diesem Beispiel ausgelegt, von der ersten Lichtquelle 110 kommendes Licht mit einer Wellenlänge von 472 nm und von der zweiten Lichtquelle 120 kommendes Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm in eine gemeinsame Richtung 20 zum Probenbereich 200 hin umzulenken. Die Effizienz des Hologramms des HOE 150 folgt dabei typischerweise einer Lorentzverteilung mit einer Breite von beispielsweise 15 nm um die jeweilige Zentralwellenlänge, die nicht zwingend genau mit den Zentralwellenlängen der LEDs 110, 120, übereinstimmen muss. Vorzugsweise schränkt das HOE 150 die umgelenkte Strahlung auf den durch die eigene Halbwertsbreite gegebenen Bereich ein und hält ihn betriebsabhängig, insbesondere abhängig von Temperatur und Bestromung, und trotz der durch Fertigungstoleranzen variierenden Zentralwellenlängen der LEDs gegenüber stabil.
Das HOE 150 vereinigt somit die beiden aus unterschiedlichen Richtungen 10,
30 einfallenden Strahlen auf einen gemeinsamen Strahlengang 20, so dass die Probe 210 durch An- und Ausschalten der einzelnen Lichtquellen 110, 120 mit unterschiedlichen Wellenlängen aus der gleichen Richtung 20 beleuchtet werden kann. Das in der Figur 1 für zwei Lichtquellen 110, 120 und zwei Richtungen 10, 30 mit zwei verschiedenen Wellenlängenspektren gezeigte Ausführungsbeispiel kann bei Bedarf um zusätzliche Lichtquellen erweitert werden. Ferner ist die in der Figur 1 gezeigte Symmetrie der Lichtquellen 110, 120 in Bezug auf das HOE 150 nicht zwingend. Die Lichtquellen 110, 120 können insbesondere, anders als dargestellt, bezüglich des HOE derart angeordnet sein, dass von ihnen ausgestrahltes Licht unterschiedliche Einfallwinkel zu einer Flächennormalen des HOE 150 bildet. Auch das HOE 150 kann ausgestaltet sein, bei vorgegebenen Einfallswinkeln das von den Lichtquellen 110, 120 einfallende Licht nicht wie dargestellt entlang der Flächennormalen des HOE150, sondern in einem anderen Winkel zur Flächennormalen umzulenken.
Für molekulardiagnostischen Anwendungen wie beispielsweise bei einer quantitativen Polymerase- Kettenreaktion mit Multiplex-Funktion kann die Vorrichtung 100 vorzugsweise zwei bis sechs Lichtquellen aufweisen, besonders bevorzugt vier Lichtquellen. Beispielsweise können die zwei oder mehr Lichtquellen auf einem Kreis um eine senkrecht zum HOE stehende Achse, insbesondere um eine Oberflächennormale des HOE, welche in der zweiten Richtung 20 gemäß Figur 1 liegt, angeordnet werden, wie weiter unten erläutert. Dies hat optische, konstruktive und fertigungstechnische Vorteile. Die maximale Anzahl an Lichtquellen ist nur durch praktische Gründen beschränkt, insbesondere durch begrenzten Bauraum und eine sinkende Effizienz des HOE 150 mit steigendem Multiplexgrad. Für eine Verbesserung der Lichtausbeute kann es vorteilhaft sein, das Licht der Lichtquellen 110, 120 durch optische Sammelelemente 111, 121 auf das HOE 150 zu konzentrieren, je nach optischer Auslegung des Hologramms des HOE 150 und Strahlengang kollimiert oder gebündelt. Hier können aus dem Stand der Technik bekannte refraktive oder diffraktive optische Elemente zum Einsatz kommen, also beispielsweise einfache Linsen, parabolische Sammellinsen, Fresnel-Linsen, HOEs oder Kombinationen dieser Elemente.
Obgleich bereits das Hologramm des HOE 150 grundsätzlich wellenlängenselektiv wirkt, kann die Vorrichtung 100 Bandpassfilter 112, 122 aufweisen, wie in Figur 1 dargestellt. Vorzugsweise werden diese wie gezeigt nach den Sammelelementen 111, 121 angeordnet, wo die von den Lichtquellen 110, 120 emittierten Strahlen eine möglichst enge Winkelverteilung aufweisen. Vorzugsweise wird dabei mit den Bandpassfiltern 112, 122 der Raum von Lichtquelle 110, 120 und Sammeloptik 111, 121 von dem Raum des HOE 150 optisch getrennt (beispielsweise durch abschirmende Flächen oder in einem Tubus, wie in Figur 1 dargestellt), so dass keine Lichtanteile von Lichtquelle 110, 120 zu HOE 150 am Bandpassfilter 112, 122 vorbei gelangen können. Die optionalen Bandpassfilter 112, 122 haben wie oben beschrieben den vorteilhaften Effekt, den Spektralbereich der Lichtquellen 110, 120 schmalbandiger und flankensteiler einzuschränken, als dies durch die intrinsische spektrale Breite des Hologramms des HOE 150 in der Regel möglich ist. Ferner kann damit Streulicht mit unerwünschten Wellenlängen reduziert werden.
Wie ferner in Figur 1 gezeigt, kann die Vorrichtung 100 ein weiteres Sammelelement 220, insbesondere eine Sammellinse, zur Fokussierung die Strahlen 20 auf die Probe 210 aufweisen. Außerdem kann die Vorrichtung 100 weitere optische Elemente wie Blenden, Linsen und Shutter umfassen, um den vereinigten Strahlengang 20 nach dem HOE weiter zu formen.
Das in Figur 1 gezeigt Ausführungsbeispiel ist insbesondere zur Umlenkung ebener Wellen oder kollimierter Strahlen geeignet. Dies ist besonders dann vorteilhaft, wenn zusätzlich zur Bereinigung von Streulicht Interferenzfilter 112, 122 (Bandpass- oder Kantenfilter) eingesetzt werden sollen, beispielsweise vor einzelnen Lichtquelle oder auch ein dem HOE 150 nachgeschalteter Multibandpassfilter.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung 100 ermöglicht es aber auch, mit dem HOE 150 nicht nur eine wellenlängenselektive Umlenkung zu realisieren, sondern auch die Wellenfront des einfallenden Lichts zu formen. Figur 2a zeigt ein Ausführungsbeispiel, bei dem die von der jeweiligen Lichtquelle 110, 120, ausgehende Kugelwelle 11, 31 in eine auf die Probe 210 zulaufende Kugelwelle 21 umgelenkt wird. Im Strahlenbild formuliert wird dabei das divergente Licht der Lichtquellen 110, 120 von dem HOE 150 auf großer Querschnittsfläche eingesammelt und auf die Probe 210 fokussiert. Alternativ sind auch Ausführungsbeispiele der Vorrichtung 100 realisierbar, bei denen das HOE 150 entweder proben- oder lichtquellseitig eine vergleichsweise ebene Welle vorsieht und auf dieser Seite die Integration eines Bandpassfilters ermöglicht, zur jeweils anderen Seite aber sammelnd oder bündelnd wirkt. Wie oben zu Figur 1 angeführt, ist auch die in der Figur 2a gezeigte Symmetrie der Lichtquellen 110, 120 in Bezug auf das HOE 150 nicht zwingend.
Figur 2b zeigt eine Weiterbildung des Ausführungsbeispiels von Figur 2a, welche eine zusätzliche dritte Lichtquelle 130 zu den ersten beiden Lichtquellen 110, 120 aufweist, wobei Licht aus der dritten Lichtquelle 130 vorzugsweise ohne Beeinflussung durch das HOE die Probe bestrahlt. Insbesondere kann die dritten Lichtquelle 130 auf der den ersten beiden Lichtquellen 110, 120 abgewandten Seite des HOEs 150 angeordnet sein. Das HOE 150 kann dabei bevorzugt ausgebildet sein, für Licht 40 eines vorgegebenen Wellenlängenbereichs aus der dritten Lichtquelle 130 durchlässig zu sein. Dies hat den Vorteil, dass solches Licht aus der dritten Lichtquelle 130 praktisch ohne Beeinflussung zusätzlich auf die Probe 210 einwirken kann, vorzugsweise aus derselben Richtung wie das über das HOE umgelenkte Licht aus der ersten und zweiten Lichtquelle 110, 120. Hierbei wird der Vorteil der hohen Wellenlängenselektivität von HOEs ausgenutzt, um gleichzeitig eine Reflexion von Licht und eine Transmission von anderem Licht zu realisieren, so dass vorteilhafterweise Lichtquellen 110, 120, 130 an unterschiedlichen Orten bezüglich des HOEs platziert werden können und trotzdem eine Bestrahlung der Probe 210 mit Licht aller dieser Lichtquellen 110, 120, 130 aus derselben Richtung ermöglicht wird. Mit anderen Worten kann das HOE 150 derart realisiert werden, dass es Licht bestimmter Wellenlängen aus bestimmten Richtungen in eine gewünschte Zielrichtung umlenkt und gleichzeitig Licht bestimmter anderer Wellenlängen und/oder aus bestimmten anderen Richtungen in dieselbe Zielrichtung praktisch ungehindert passieren lässt. Beispielsweise könnten die Lichtquellen 110, 120, 130 Peakwellenlängen von 470 nm, 530 nm, 590 nm, 630 nm, 405 nm oder 385 nm haben. Sofern das holografische Material für eine der anwendungsseitig gewünschten Wellenlängen nicht geeignet ist, beispielsweise für 385 nm, ist es möglich, gemäß Figur 2b die Quelle 130 mit jener Wellenlänge vorzusehen. Auch das erste Ausführungsbeispiel gemäß Figur 1 kann bezüglich des HOEs 150 und der dritten Lichtquelle 130 entsprechend weitergebildet werden. Wie in Figur 2b dargestellt, kann die Vorrichtung 100 weitere vor der dritten Lichtquelle 130 angeordnete Linsen 131, 132 und/oder Bandpassfilter 133 aufweisen, um je nach Bedarf Licht aus der dritten Lichtquelle zu sammeln/zerstreuen bzw. zu filtern.
Alternativ kann das HOE 150 ausgebildet sein, Licht vorgegebener Wellenlängen aus der dritten Lichtquelle 130 und in besonderen Ausgestaltungen, wie oben bereits ausgeführt, auch Licht vorgegebener Wellenlängen aus der ersten und/oder zweiten Lichtquelle 110, 120 zu formen, insbesondere zu filtern, bündeln, zerstreuen und/oder beugen. Dies hat den Vorteil, dass das HOE die Funktionen von Filtern, Linsen bzw. Beugungsgittern übernimmt. Beispielhaft illustriert dazu Figur 2c eine Strahlformung von durch die dritte Lichtquelle 130 ausgesendetem Lichts durch das HOE 150. Gemäß diesem Beispiel ist das HOE 150 ausgebildet, ein vorgegebenes Wellenlängenspektrum 300 an der kurzwelligen Flanke 310 und/oder an der langwelligen Flanke 320 zu beugen (und damit effektiv das Spektrum 300 zuzuschneiden) und/oder durch das HOE 150 passierendes Licht 330 analog zu einer Sammellinse zu bündeln. Damit lässt sich ein intrinsisches Spektrum der Lichtquelle 130 auf effektive Weise auf eine schmalere, vorzugsweise flankensteilere Form zuschneiden, was vorteilhafterweise zu einem auf die Probe 210 einfallendes Spektrum führt, welches robuster gegen Schwankungen bezüglich Temperatur, Betriebsstrom oder Bauteiltoleranz der Lichtquelle 130 ist. In bevorzugter Ausgestaltung kann das HOE auch ausgebildet sein, die weggebeugten Lichtanteile 310, 320 in eine interne Mode und von dort vorzugsweise in ein Absorbermaterial oder eine Strahlfalle zu überführen, um Streulicht zu vermeiden.
Wie oben bereits erwähnt, kann es fertigungstechnisch vorteilhaft sein, die Lage der Lichtquellen 110, 120 auf einem Kreis 50 um die Austrittsachse 20 vorzusehen. In dem Ausführungsbeispiel gezeigt in Figur 3 sind mehrere Lichtquellen 110, 120 auf dem Mantel 161 eines Kegelstumpfs 160 derart angeordnet, dass ihre optischen Achsen ohne weitere Justage auf das Zentrum des HOE 150 weisen. Insbesondere sind die Lichtquellen 110, 120 entlang eines Kreises 162 um die Austrittsachse 20 des HOE 150 angeordnet. Der Kegelstumpf 160 ist dabei vorzugsweise rotationssymmetrisch um die Austrittsachse 20 des HOE 150 angeordnet, wobei die die Austrittsachse senkrecht zum flächigen HOE 150 steht, also deckungsgleich mit einer Flächennormalen des HOE 150 ist.
Bei dem in Figur 4 gezeigten Ausführungsbeispiel sind die erste Lichtquelle 110 und die zweite Lichtquelle 120 auf einer gemeinsamen Platine 170 angeordnet, was fertigungstechnisch von Vorteil ist. Bei der Platine 170 kann es sich insbesondere um ein für Optikbauteile übliches Substrat handeln, beispielsweise um eine in der Elektronik übliche Leiterplatte. Bei einer hohen Leistungsaufnahme der Lichtquellen 110, 120 kann die Platine einen Kern aus gut wärmeleitenden Material zur Ableitung der Abwärme aufweisen, beispielsweise umfassend Aluminium. Die Lenkung der kollimierten Strahlen 10, 30 auf das HOE 150 kann dann wie gezeigt über eine zumindest teilweise verspiegelte Oberfläche auf der Innenseite eines Pyramidenstumpfs 160 oder Kegelstumpfs 160 oder alternativ über an der Innenseite angebrachte Spiegel 163 erfolgen. Eine Verspiegelung der Innenfläche des Stumpfs 160 kann beispielsweise durch spiegelnde Metalloberflächen realisiert werden, insbesondere durch aufgedampftes Aluminium oder Silber. Die spiegelnden Oberflächen könnten auch gewölbt sein und damit ebenfalls eine optische Funktion erfüllen. Wie auch in Figur 3 angedeutet, kann das HOE 150 ebenfalls an oder in dem Stumpf 160 angeordnet sein.
Anstelle eines hohlen Körpers 160 kann die Vorrichtung 100 auch einen massiven, transparenten Körper 180 aufweisen, bei dem die Strahlumlenkung über Totalreflexion erfolgt. Der Körper 180 kann dazu Glas oder transparenten Kunststoff aufweisen.
Figur 5a zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100, umfassend mehrere Lichtquellen, insbesondere Leuchtdioden, in diesem Beispiel vier Lichtquellen, 110, 120, 130, 140. Die LEDs 110, 120, 130, 140 sind auf einer Platine 171 angeordnet, beispielsweise in einer zwei-mal-zwei- rasterförmigen Anordnung, wie in der Draufsicht auf die Platine 171 in Figur 5b gezeigt. Alternativ kann die Vorrichtung 100 auch mehr oder weniger Lichtquellen aufweisen, welche insbesondere in minimalem Abstand zueinander angeordnet sind, wie unten beschrieben.
Gegenüber einer Oberfläche der Platine 171 ist das HOE 150 angeordnet, welches vorzugsweise ausgestaltet ist, senkrecht einfallendes und in diesem Beispiel annähernd kugelförmiges Licht 10 aufgrund der annähernd punktförmigen Lichtquellen 110, 120, 130, 140 in einen gemeinsamen Probenbereich, insbesondere in eine gemeinsame Richtung 20, in einem Winkel 175 zur Flächennormalen 174 des HOE 150 umzulenken. Beispielsweise kann der Winkel 175 einen Wert zwischen 40 und 70 Grad, bevorzugt zwischen 50 und 50 Grad aufweisen. Vorzugsweise sollte der Winkel so gewählt werden, dass Fresnel- Reflexe vermieden werden, welche insbesondere auftreten, wenn der Einfallswinkel auf das Hologramm dem Ausfallswinkel entspricht. Für eine weitgehend deckungsgleiche Beleuchtung des HOE 150 ist ein Abstand 126 zwischen Platine 171 und HOE 150 vorzugsweise mindestens dreimal größer, ganz bevorzugt mindestens fünfmal größer als ein Abstand 127 zwischen den Lichtquellen 110, 120, 130, 140. Daher ist es auch vorteilhaft, wenn die Lichtquellen 110, 120, 130, 140 möglichst nahe beieinander platziert werden, um einen guten Überlapp der Emissionskegel zu erreichen.
Wie dargestellt kann die Vorrichtung 100 auch eine Blende 124 aufweisen, um von dem HOE 150 umgelenktes Licht möglichst auf einen deckungsgleichen Bereich zu bringen und damit eine für alle Lichtquellen möglichst identische Beleuchtungssituation des Probenbereichs 200 zu realisieren. Besonders kompakte und hardwaretechnisch minimalistische Konzepte sind möglich, wenn man statt einer Freistrahlanordnung die Lichtstrahlen im Trägermedium des Hologramms oder des HOE, meist einer Glasplatte propagieren lässt. Eine solche Anordnung ist in einem weiteren Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 gemäß Figur 6 gezeigt. Die Vorrichtung 100 umfasst in diesem Beispiel als transparenten Körper 180 eine transparente Platte 190, an welche die beiden Lichtquellen 110, 120 in Form von LEDs möglichst ohne Luftspalt (ggf. vermittelt durch eine brechungsindex-angepasste Schicht) angrenzen. Bei der transparenten Platte 190 kann es sich beispielsweise um eine Glasplatte 190 oder ein anderes transparentes Trägermedium handeln, beispielsweise basierend auf transparentem Kunststoff. Das von den Lichtquellen 110, 120 in die transparente Platte 190 eingekoppelte Licht wird von einem ebenfalls an die Platte 190 angrenzenden HOE 150, welches ein Reflexionshologramm umfasst, auf den gemeinsamen Probenbereich 200 umgelenkt. Neben einem Ausnutzen von Totalreflexion innerhalb der Platte 190 kann die Vorrichtung weitere HOE 151,
152 umfassen, welche ebenfalls an die Platte angrenzen und einfallende Strahlung umlenken, vorzugsweise in Richtung des ersten HOE 150. Wie in Figur 5 dargestellt, befinden sich alle drei HOE 150, 151, 152 fertigungstechnisch vorteilhaft auf derselben Seite der Platte 190 und umfassen jeweils ein Reflexionshologramm. Damit werden die von den Lichtquellen 110, 120 in die Platte 190 eingespeisten Lichtstrahlen sowohl über Totalreflexion als auch über die weiteren HOE 151, 152 zum ersten, dazwischen angeordnetem HOE 150 geleitet, welches das Licht 20 aus der Platte 190 auskoppelt. Alternativ könnte das HOE150 auch ein Transmissionshologramm aufweisen und/oder auf der gegenüberliegenden Seite der Platte 190 angeordnet sein. Alternativ kann sich das erste HOE auch über eine größere Breite entlang der Platte 190 erstrecken und damit die weiteren HOE 151, 152 ersetzen.
Figur 7 zeigt ein Flussdiagramm 600 zu einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens 600, welches beispielsweise mit einem der Ausführungsbeispiele gemäß der Figuren 1 bis 5 durchgeführt werden kann. In einem ersten Schritt 601 des Verfahrens 600 wird die erfindungsgemäße Vorrichtung 100 bereitgestellt. In einem zweiten Schritt 602 kann eine Probe 210 in dem gemeinsamen Probenbereich 200 platziert werden. In einem dritten Schritt 603 wird Licht aus der ersten Lichtquelle 110 und danach oder gleichzeitig Licht aus der zweiten Lichtquelle 120 über das HOE auf den gemeinsamen Probenbereich gelenkt, um beispielsweise Fluorophore in der Probe 210 anzuregen. In einem vierten Schritt 604, welcher gleichzeitig mit dem dritten Schritt 603 erfolgen kann, wird die von der Probe 210 ausgesendete
Fluoreszenzstrahlung mit der Messeinrichtung 300, also beispielsweise einer Kamera 300 oder einer Photodiode, für eine nachfolgende Analyse der Probe 210 erfasst.

Claims

Ansprüche
1. Vorrichtung (100) zur Bestrahlung einer insbesondere biologischen Probe (210), umfassend eine erste Lichtquelle (110), eine zweite Lichtquelle (110) und zumindest ein holografisch-optisches Bauelement (150), wobei die erste Lichtquelle (110), die zweite Lichtquelle (120) und das holografisch-optische Bauelement (150) derart zueinander angeordnet sind, dass erstes Licht (10, 11) aus der ersten Lichtquelle (110) und zweites Licht (30, 31) aus der zweiten Lichtquelle (120) über das holografisch-optisches Bauelement (150) auf einen Probenbereich (200) zur Bestrahlung der Probe (210) gelenkt werden.
2. Vorrichtung (100) nach Anspruch 1, wobei das erste Licht (10, 11) und das zweite Licht (30, 31) verschiedene Wellenlängenspektren aufweisen.
3. Vorrichtung (100) nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vorrichtung (100) eine dritte Lichtquelle (130) umfasst und wobei das holografisch-optisches Bauelement (150) ausgebildet ist, für drittes Licht (40) aus der dritten Lichtquelle (130) durchlässig zu sein.
4. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein oder mehrere optische Elemente (111, 121, 220), um von dem holografisch-optischen Bauelement (150) umgelenktes Licht aus den Lichtquellen abzuändern, insbesondere zu bündeln und/oder zu fokussieren.
5. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Lichtquelle (110) und/oder die zweite Lichtquelle (120) an einem Mantel (161) eines Bauteils (160), insbesondere eines Kegels, eines Kegelstumpfs, einer Pyramide oder eines Pyramidenstumpfs angeordnet sind.
6. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Lichtquelle (110) und/oder die zweite Lichtquelle (120) entlang eines Kreises (162) um die Austrittsachse (20) des holografisch-optisches Bauelements (150) angeordnet sind.
7. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung (100) ein oder mehrere Spiegel (163) aufweist, wobei die Spiegel (163) bezüglich der Lichtquellen (110, 120) und dem holografisch-optisches Bauelement (150) derart angeordnet sind, dass von den Lichtquellen (110, 120) ausgesandtes Licht (10, 30) über die Spiegel (163) auf das holografisch-optisches Bauelement (150) gelenkt wird.
8. Vorrichtung (100) nach Anspruch 7, wobei die ein oder mehreren Spiegel
(163) Teil eines sich verjüngenden Mantels (161) eines Bauteils (160) sind, insbesondere Teil eines Mantels eines Kegels, eines Kegelstumpfs, einer Pyramide oder eines Pyramidenstumpfs.
9. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung (100) einen transparenten Körper (180, 190) aufweist, welcher derart angeordnet ist, dass Licht (10, 11, 30, 31) von zumindest einer Lichtquelle (110, 120) durch den transparenten Körper (180, 190) geleitet werden kann.
10. Vorrichtung (100) nach Anspruch 9, wobei zumindest eine Lichtquelle (110, 120) und das holografisch-optisches Bauelement (150) an den transparenten Körper (180, 190) angrenzen.
11. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquellen (110, 120) auf einer gemeinsamen Platine (170) angeordnet sind.
12. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das holografisch-optisches Bauelement (150) ausgebildet ist, einfallende Strahlung (11,
31), insbesondere divergierendes Licht mit beispielsweiser kugelförmiger Wellenfront, zu kollimieren oder zu fokussieren.
13. Einrichtung (1000) zur Untersuchung einer insbesondere biologischen Probe (210), umfassend eine Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche und eine Messeinrichtung (300) zur Erfassung von von einer aufgenommenen Probe (210) emittierten Lichts, insbesondere von Fluoreszenzlicht.
14. Verfahren (600) zur Bestrahlung einer insbesondere biologischen Probe (210), wobei erstes Licht (10, 11) aus einer ersten Lichtquelle (110) und zweites Licht (30, 31) aus einer zweiten Lichtquelle (120) über ein holografisch-optisches Bauelement (150) auf einen gemeinsamen Probenbereich (200) zur Bestrahlung der Probe (210) gelenkt werden. 15. Verfahren (600) nach Anspruch 14, wobei das Verfahren (600) bei einer
Polymerase- Kettenreaktion eingesetzt wird, insbesondere bei einer quantitativen Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion.
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