EP4281119A1 - Markierungsvorläufer und radiotracer zur nuklearmedizinischen diagnose und therapie von prostatakrebs induzierten knochenmetastasen - Google Patents

Markierungsvorläufer und radiotracer zur nuklearmedizinischen diagnose und therapie von prostatakrebs induzierten knochenmetastasen

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EP4281119A1
EP4281119A1 EP22703899.9A EP22703899A EP4281119A1 EP 4281119 A1 EP4281119 A1 EP 4281119A1 EP 22703899 A EP22703899 A EP 22703899A EP 4281119 A1 EP4281119 A1 EP 4281119A1
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EP
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kue
acid
psma
linker
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EP22703899.9A
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English (en)
French (fr)
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Frank RÖSCH
Tilman GRUS
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Scv Spezialchemikalienvertrieb GmbH
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Publication date
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    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom

Definitions

  • the present invention relates to a label precursor for complexing radioactive isotopes, comprising a chelator Chel and two target vectors for PSMA and bone metastases conjugated with the chelator Chel.
  • the compounds according to the invention are intended for imaging nuclear medicine diagnosis and treatment (theranostics) of prostate cancer-induced bone metastases.
  • PET positron emission tomography
  • SPECT single photon emission computed tomography
  • tumor cells and metastases are marked or irradiated with a radioactive isotope such as gallium-68 ( 68 Ga) or lutetium-177 ( 177 Lu).
  • labeling precursors are used, which bind the respective radioisotope coordinatively ( 68 Ga, 99m Tc, 177 Lu) and form a radiotracer.
  • the marker precursors comprise a chelator as an essential chemical component for the effective and stable complexation of the radioisotope and a biological target vector as a functional component that binds to a defined target structure in the tumor tissue.
  • the biological target vector has a high affinity for transmembrane receptors, proteins, enzymes or other structures of tumor cells.
  • the radioisotope-labeled theranostic or radiotracer After intravenous injection into the bloodstream, the radioisotope-labeled theranostic or radiotracer accumulates on or within the cells of the primary tumor and metastatic tissue.
  • the aim is to deposit such a dose of radiation in the tumor that the tissue dies.
  • the radiation dose transmitted to the healthy tissue should remain so low that damage there can be tolerated.
  • the configuration and chemical properties of the target vector are modified by the chelator and its affinity for tumor cells is usually strongly influenced. Accordingly, the coupling between the chelator and the target vector is tailored in complex trial and error experiments or so-called biochemical screenings.
  • a large number of marker precursors comprising the chelator and the target vector are synthesized and, in particular, the affinity to tumor cells is quantified.
  • the chelator and chemical coupling to the target vector are decisive for the biological and nuclear medicine potency of the respective radio-theranostic.
  • the tag precursor must meet other requirements such as
  • prostate cancer is the most common type of cancer and the third leading cause of death from cancer.
  • tumor growth is slow. If diagnosed at an early stage, the 5-year survival rate is almost 100%. If the disease is only discovered after the tumor has metastasized, the survival rate falls dramatically. In turn, treating the tumor too early and too aggressively can unnecessarily impair the patient's quality of life. So e.g. B. surgical removal of the prostate can lead to incontinence and impotence.
  • a reliable diagnosis and information about the stage of the disease are essential for successful treatment with a high quality of life for the patient.
  • a widespread diagnostic tool, in addition to a doctor palpating the prostate, is the determination of tumor markers in the patient's blood.
  • PSA prostate-specific antigen
  • PSMA Prostate Specific Membrane Antigen
  • PSMA prostate-specific membrane antigen
  • PSMA protein structure of PSMA.
  • Another approach is the enzymatic one activity of PSMA that is well understood.
  • An aromatic binding pocket is located in front of the center with the two Zn 2+ ions.
  • the protein is able to expand and adapt to the binding partner (induced fit), so that it can also bind folic acid in addition to NAAG, with the pteroic acid group docking in the aromatic binding pocket.
  • the use of the enzymatic affinity of PSMA enables the substrate to be taken up by the cell (endocytosis) independently of enzymatic cleavage of the substrate.
  • PSMA inhibitors in particular are well suited as target vectors for imaging diagnostic and theranostic radiopharmaceuticals or radiotracers.
  • the radioactively labeled inhibitors bind to the active center of the enzyme, but are not converted there. The bond between the inhibitor and the radioactive label is therefore not broken.
  • the inhibitor with the radioactive label is absorbed into the cell and accumulates in the tumor cells.
  • Inhibitors with high affinity for PSMA usually contain a glutamate motif and an enzymatically non-cleavable structure.
  • a highly effective PSMA inhibitor is 2-phosphonomethylglutaric acid or 2-phosphonomethylpentanedioic acid (2-PMPA), in which the glutamate motif is linked to a phosphonate group that cannot be cleaved by PSMA.
  • Another group of PSMA inhibitors used in the clinically relevant radiopharmaceuticals PSMA-11 (Scheme 2) and PSMA-617 (Scheme 3) are urea-based inhibitors.
  • the binding motif L-lysine-urea-L-glutamate is hexyl (hexyl linker) to an aromatic HBED chelator (N,N'-bis(2-hydroxy-5 -(ethylene-beta-carboxy)benzyl)ethylenediamine N,N'-diacetate).
  • Bisphosphonates are used in clinical practice for the treatment of disorders of bone and calcium metabolism. These include Paget's disease, osteoporosis and the conventional systemic therapy of bone tumors. Bisphosphonates are characterized by a pronounced selectivity in their accumulation of mineral calcium phosphate. This is based on the formation of a bidentate chelate complex of the bisphosphonates with calcium(II) ions. Bisphosphonates adsorb preferentially in areas of rapid bone turnover. In bone metastases, an intensive remodeling takes place compared to healthy tissue. Bisphosphonates therefore accumulate to a greater extent in bone metastases and initiate various processes there.
  • bisphosphonates inhibit the mineralization of bone substance and bone resorption. This effect is based i.a. on the inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), an enzyme in the HMG-CoA reductase (mevalonate) pathway. Inhibiting the enzyme stops the production of farnesyl, an important molecule for anchoring signaling proteins to the cell membrane (FPPS), and cell apoptosis is initiated.
  • FPPS farnesyl pyrophosphate synthase
  • mevalonate HMG-CoA reductase
  • the selective accumulation of bisphosphonates on the bone surface promotes the apoptosis of osteogenic cells, especially osteoclasts, which take up bisphosphonates to an increased extent when the bone matrix is demineralized.
  • the increased apoptosis of osteoclasts in turn causes an antiresorptive effect.
  • the clinically relevant bisphosphonates are: clodronate, etidronate, pamidronate, risedronate and zoledronate.
  • Zoledronate (ZOL), a hydroxy-bisphosphonate with a heteroaromatic N unit, has proven to be a particularly effective radiotracer for theranostics of bone metastases.
  • Zoledronate conjugated with the chelators NODAGA and DOTA (Scheme 4) represents the currently most potent radio-theranostics for bone metastases.
  • monomeric radiotracers with the above-described PSMA target vector KuE are currently preferably used.
  • PSMA is also expressed on the surface of healthy cells. Therefore, monomeric radiotracers with PSMA target vector are also enriched to a considerable extent in healthy tissue.
  • the associated radiation dose causes various toxic side effects. These are particularly pronounced with radiotracers labeled with 225 Ac ( 225 actinium), which damage the salivary glands totally and irreversibly. Therefore, the form of therapy with the radioisotope 225 Ac is no longer used.
  • the object of the present invention is to provide label precursors and radiotracers for a gentle and effective treatment of metastatic prostate cancer. This object is achieved by a label precursor for complexing radioactive isotopes with the structure
  • a first target vector TV1 is selected from the group consisting of PSMA inhibitors
  • a second target vector TV2 is selected from the group consisting of bisphosphonates
  • a first linker L1 has a structure selected from ; G ; ; ; and ; wherein G same is;
  • a second linker L2 has a structure selected from ; ; and wherein R1, R2 and R3 are independently selected from the group comprising amide, carboxamide, phosphinate, alkyl, triazole, thiourea, ethylene, maleimide, furan, azole, oxazole, thiophene, thiazole, azine, thiazine, naphthalene, quinoline, pyrrole, imidazole, pyrazole, tetrazole, thiadiazole, oxadiazole, pyridine, pyrimidine, triazine, tetrazine, thiazine, oxazine , naphthalene, chromene or thiochromene residues, -(CH 2 )-, -(CH 2 CH 2 O)-, -CH 2 -CH(COOH)-NH- and -(CH 2 ) q NH- with
  • a chelator Chel is selected from the group comprising FUpypa, EDTA (ethylenediaminetetraacetate), EDTMP (diethylenetriaminepenta(methylenephosphonic acid)), DTPA (diethylenetriaminepentaacetate) and its derivatives, DOTA (dodeca-1,4,7,10-tetraamine-tetraacetate) , DOTAGA (2-( 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-4,7,10)-pentanedioic acid) and other DOTA derivatives, TRITA (Trideca-l,4,7,10-tetraamine-tetraacetate), TETA ( Tetradeca-1,4,8,11-tetraamine-tetraacetate) and its derivatives, NOTA (nona-1,4,7-triamine-triacetate) and its derivatives such as NOTAGA (1,4,7-triazacyclonane,1-glutaric acid ,4,7-acetate
  • the chelator Chel is DOTA; - the chelator Chel is H4pypa;
  • the chelator Chel is DOTAGA; the second linker L2 comprises at least one residue selected from the second linker L2 at least one squaric acid residue includes; the second linker L2 comprises at least one residue selected from
  • the second linker L2 at least one imidazole residue includes
  • Figure 5 shows the labeling kinetics of a label precursor
  • FIG. 6 shows the stability of a radiotracer in a physiological environment
  • Fig. 7 binding affinities to hydroxyapatite
  • the chelator Chel, the target vectors TV1, TV2 and the linkers L1, L2 are preferably conjugated by means of an amide coupling reaction.
  • Amide coupling, the backbone of proteins, is the most commonly used reaction in medicinal chemistry.
  • a generic example of an amide coupling is shown in Scheme 5.
  • amide coupling strategies provide a facile route to the synthesis of new compounds. Numerous reagents and protocols for amide coupling are known to those skilled in the art. The most common amide coupling strategy relies on the condensation of a carboxylic acid with an amine. The carboxylic acid is usually activated for this purpose. Remaining functional groups are protected prior to activation. The reaction takes place in two steps either in a reaction medium (single pot) with direct conversion of the activated carboxylic acid or in two steps with isolation of an activated "trapped" carboxylic acid and conversion with an amine.
  • the carboxylate reacts with a coupling agent to form a reactive intermediate that can be isolated or reacted directly with an amine.
  • a coupling agent to form a reactive intermediate that can be isolated or reacted directly with an amine.
  • Numerous reagents are available for carboxylic acid activation, such as acid halides (chloride, fluoride), azides, anhydrides, or carbodiimides.
  • esters such as pentafluorophenyl or hydroxysuccinic imido esters can be formed as reactive intermediates.
  • Intermediates derived from acyl chlorides or azides are highly reactive. However, harsh reaction conditions and high reactivity often prevent their use for sensitive substrates or amino acids.
  • amide coupling strategies that use carbodiimides such as DCC (dicyclohexylcarbodiimide) or DIC (diisopropylcarbodiimide) open up a wide range of applications.
  • additives are used to improve reaction efficiency.
  • Aminium salts are highly efficient peptide coupling reagents with short reaction times and minimal racemization. With some additives, such as HOBt, racemization can even be completely avoided.
  • Aminium reagents are used in equimolar amounts to the carboxylic acid to prevent excessive reaction with the free amine of the peptide.
  • Phosphonium salts react with carboxylate resulting in typically requires two equivalents of a base such as DIEA.
  • a key advantage of phosphonium salts over iminium reagents is that phosphonium does not react with the free amino group of the amine component. This enables couplings in equimolar ratios of acid and amine and helps to avoid intramolecular cyclization of linear peptides and excessive use of expensive amine components.
  • chelators used according to the invention such as DOTA in particular, have one or more carboxy or amide groups. Accordingly, these chelators can be readily conjugated to linkers L1, L2 using any of the amide coupling strategies known in the art.
  • Schemes 6 and 7 show coupling examples of the linker target vector unit L1-TV1 with a chelator Chel
  • Schemes 8-10 show coupling examples of L2-TV2 with a chelator Chel.
  • Scheme 8 Amide coupling of a linker L2 to a chelator Chel using HATU and HOBt in an organic solvent with the addition of an organic base.
  • the chelator Chel is intended for labeling the label precursor of the present invention with a radioisotope selected from the group consisting of 44 Sc, 47 Sc, 55 Co, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 66 Ga, 67 Ga, 68 Ga, 89 Zr, 86 Y, 90 Y, 89 Zr, 90 Nb, 99m Tc, m ln, 135 Nm, 140 Pr, 159 Gd, 149 Tb, 160 Tb, 161 Tb, 165 Er, 166 Dy, 166 Ho, 175 Yb
  • a radioisotope selected from the group consisting of 44 Sc, 47 Sc, 55 Co, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 66 Ga, 67 Ga, 68 Ga, 89 Zr, 86 Y, 90 Y, 89 Zr, 90 Nb, 99m Tc, m ln, 135 Nm, 140 Pr, 159 Gd, 149 Tb, 160 Tb, 161 Tb, 165
  • the chelator DOTA which is well suited for the complexation of 68 Ga as well as 177 Lu, is preferred according to the invention.
  • the chelator H 2 pypa is also used in particular for the complexation of 177 Lu.
  • the synthesis of FUpypa is shown in Scheme 12.
  • the radioisotopes 68 Ga and 177 Lu are used in particular for nuclear medicine theranostics (diagnosis and therapy).
  • the invention also provides for the use of
  • radioisotopes selected from the group consisting of 44 Sc, 47 Sc, 55 Co, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 66 Ga, 67 Ga, 68 Ga, 89 Zr, 86 Y, 90 Y, 89 Zr, 90 Nb, 99m Tc, m ln, 135 Sm, 159 Gd, 149 Tb, 160 Tb, 161 Tb, i65 Er , 166 Dy, 166 Ho, 175 Yb, 177 Lu, 186 Re, 188 Re, 211 At, 212 Pb , 213 Bi, 225 Ac and 232 Th.
  • squaric acid as a component of a linker of a bisphosphonate targeting vector increases the affinity for hydroxyapatite in bone tissue.
  • This beneficial effect is demonstrated by the adsorption therms of conjugates of the chelator NODAGA with squaric acid pamidronate (NODAGA.QS.Pam) and NODAGA with zoledronate (NODAGA.Zol).
  • NODAGA.QS.Pam squaric acid pamidronate
  • NODAGA.Zol NODAGA.Zol
  • schemes 23 and 24 show conjugates of the chelator NODAGA with squaric acid pamidronate (NODAGA.QS.Pam) and NODAGA with zoledronate (NODAGA.Zol) as well as the respective adsorption coefficients KLF measured by the method of Langmuir and Freundlich.
  • the adsorption coefficient KLF of the conjugate NODAGA.QS.Pam is about three times that of NODAGA. Zol containing an imidazole residue instead of a squaric acid group. From this it is immediately apparent that squaric acid significantly increases the affinity of the bisphosphonate group for bone tissue. Furthermore, in vivo PET studies (positron emission tomography) on young, healthy Wistar rats with the radiotracer [ 68 Ga]Ga-NODAGA.QS.Pam (cf. Fig. 2) show a high accumulation in the epiphyses, which are characterized in young animals - analogous to bone metastases - by rapid renewal and remodeling of bone tissue.
  • the PSMA inhibitor L-lysine-urea-L-glutamate (KuE) is used as a target vector for PSMA, for example, using a known method according to Benesovä et al. (Linker Modification Strategies To Control the Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)-Targeting and Pharmacokinetic Properties of DOTA-Conjugated PSMA Inhibitors; J Med Chem, 2016, 59 (5), 1761-1775) (cf. Scheme 25).
  • lysine bound to a solid phase in particular a polymer resin and protected with tert-butyloxycarbonyl (tert-butyl), is reacted with doubly tert-butyl-protected glutamic acid.
  • L-lysine-urea-L-glutamate (KuE) is split off using TFA and at the same time completely deprotected. The product can then be separated from free lysine by semipreparative HPLC with a yield of 71%.
  • Scheme 25 Solid-phase synthesis of the PSMA inhibitor KuE; (a) DIPEA, triphosgene, DCM 0 °C, 4h; (b) H-Lys(tBoc)-2CT-polystyrene solid phase, DCM, RT, 16h; (c) TFA, RT, 71%.
  • the PSMA-I inhibitor KuE (1) can then be coupled to a label precursor using diethyl squarate as a coupling agent.
  • the coupling of KuE (1) to squaric acid diester takes place in 0.5 M phosphate buffer at a pH value of pH 7. After the addition of both starting materials, the pH value must be readjusted with sodium hydroxide solution (1 M), since the buffering capacity of the phosphate buffer is not sufficient is.
  • the simple amidation of the acid (Scheme 26) occurs rapidly at room temperature with a short reaction time.
  • KuE-QS (2) is obtained after HPLC purification with an overall yield of 16%.
  • the KuE squaric acid monoester obtained in this way can be stored and used as a building block for further syntheses.
  • Example 3 Solid phase-based synthesis of the KuE unit and the PSMA-617 linker
  • the synthesis proceeds from the commercially available DO2A(tBu)-GABz, which is functionalized on the secondary amine with a Boc-protected amino group.
  • the benzyl protecting group of the glutaric acid side chain of DOTAGA(COOtBu)3(NHBoc)-GABz (4) is reductively removed to allow coupling to the target vector.
  • the PSMA-617 linker is then coupled to the chelator (5) via amide coupling.
  • the protected PSMA-617 derivative (6) obtained by the amide coupling is deprotected using trifluoroacetic acid (TFA) and dissolved from the solid phase.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the pamidronate squaric acid moiety is synthesized and coupled to compound (7) (Scheme 30).
  • pamidronate (8) is first prepared and coupled to squaric acid diester in aqueous phosphate buffer with a pH of 7.
  • the conjugation of the pamidronate squaric acid group (9) with DOTAGA.KuE-617 (7) takes place in aqueous phosphate buffer with a pH of 9 (cf. Scheme 30).
  • the tag precursor Pam.QS. DOTAGA.KuE-617 (10) is obtained after HPLC purification with a yield of 49%.
  • compound (13) is fully deprotected in TFA/DCM and decoupled from the solid phase to obtain compound (14).
  • the second target vector (9), consisting of pamidronate and squaric acid, is included Compound (14) conjugated.
  • the second target vector is previously synthesized in the same manner as shown in Scheme 30.
  • Example 6 In vitro investigation of the compounds NH2.DOTAGA.KuE-617, NH2.DOTAGA.QS.KuE and Pam.SA.DOTAGA.KuE-617
  • the affinity of the KuE target vector with a lipophilic linker - analogous to PSMA-617 - and with a squaric acid linker was determined using the compounds NH 2 .DOTAGA.KUE-617 and NH2.DOTAGA.QS.KuE (structural formulas (8) and (10) in Scheme 32).
  • LNCaP cells were pipetted into multiwell plates (Merck Millipore MultiscreenTM). A defined amount or concentration of the reference compound 68 Ga[Ga]PSMA-10 with a known Kd value was added to the compounds to be analyzed in increasing concentrations and incubated in the wells with the LNCaP cells for 45 min. After washing several times, the cell-bound activity was determined. The ICso values and Ki values given in Table 1 were calculated on the basis of the inhibition curves obtained.
  • the PSMA affinity of the final tag precursor Pam.SA.DOTAGA.KuE-617 (10) was determined.
  • the IC50 value is 49.8 ⁇ 10 nM.
  • the tag precursor DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 (see Scheme 17 and structural formula (15) in Scheme 31) is dissolved in 1 mL of an aqueous ammonium acetate buffer solution (1 M, pH 5.5) labeled with 177 Lu.
  • the radiochemical yield (RCY) as a function of the amount of label precursor contained in the ammonium acetate buffer solution (5, 10 and 30 nmol) is shown in FIG.
  • the radiochemical yield (RCY) reaches a value of > 90% after 5 min.
  • Radiochemical yield and purity are determined by radio thin layer chromatography (radio-TLC) and radio high pressure liquid chromatography (radio-HPLC). Radio thin layer chromatography gives an Rf value of 0.0 for the radiotracer [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617. In contrast, unbound [ 177 Lu]Lu 3+ in citrate buffer mobile phase has an Rf value of 0.8 to 1.0. A retention time tR of 9.8 min is measured for the radiotracer in analytical radio high-pressure liquid chromatography.
  • Figure 6 shows stability measurements of the radiotracer [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 in phosphate buffered saline (PBS), isotonic saline (NaCl) and human serum (HS). Even after 14 days in PBS and isotonic saline (NaCl), > 98% of the radiotracer [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 is still present in complexed form. In human serum (HS), stability is slightly lower at 93% at 9 days, with stability remaining at 93% at 14 days.
  • PBS phosphate buffered saline
  • NaCl isotonic saline
  • HS human serum
  • the lipophilicity of [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 is determined by determining the partition equilibrium of the compound in a mixture of n-octanol and PBS. Measured values for the LogDy/i coefficient of [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 and [ 117 Lu]Lu-PSMA-617 are presented in Table 2. The results show that [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 has practically the same lipophilicity as PSMA-617. Table 2: Radiotracer lipophilicity
  • FIG. 7 shows measured values for the accumulation of [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617, [ 117 Lu]Lu-PSMA-617 and [ 117 Lu]Lu 3+ on ordinary HAP as well as HAP pretreated or blocked with pamidronate, free [ 117 Lu]Lu 3+ being known to have a high affinity for HAP and serving as a reference.
  • the fraction of the radiotracer [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 bound to HAP is 98.2 %, slightly below the value of 99 measured for free [ 117 Lu]Lu 3+ .9%.
  • [ 117 Lu]Lu-PSMA-617 there is an enriched proportion of only 1.2% on HAP. Accumulation on HAP previously treated with excess pamidronate was also measured to determine selectivity. This results in values of 7.3% for [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE- 617 and 4.9% for free [ 117 Lu]Lu 3+ , which indicate a high selectivity for HAP To take.
  • the binding affinity to PSMA for the radiotracer or label precursor DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 and reference structures is determined by means of comparative radioligand assays. Corresponding measured values for the inhibition constant Ki are shown in Table 3.
  • Ki value for [ nat Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 is approximately the same as for the tag precursor DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617. From this it can be seen that complexation with lutetium does not adversely affect the binding affinity to PSMA.
  • radiotracer [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 organ accumulation in Balb/c mice with induced LNCaP tumors was investigated. The results are shown in Fig.8.
  • the accumulation of the radiotracer [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 in tumor and femur is comparable with values of 4.2 ⁇ 0.7 %ID/g and 3.4 ⁇ 0, respectively .4 %ID/g.
  • accumulation in the bones cannot be blocked by administering the PSMA inhibitor PMPA (2-phosphonomethylpentanedioic acid).
  • the uptake in the bone is not caused by PSMA, since no PSMA is expressed.
  • the kidneys show a high accumulation of [ 117 Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617, which can also be greatly reduced by administration of PMPA.
  • accumulation in the liver and spleen is not PSMA-specific.
  • the ratio of accumulations in tumor and blood is extraordinarily high with values of 210 and 170 respectively and indicates low haematological side effects.
  • the 1 H and 13 C NMR measurements were performed on a Bruker Avance III HD 300 spectrometer (300 MHz, 5 mm BBFO probehead with z-gradient and ATM and BACS 60 sample changer), a Bruker Avance II 400 spectro meter (400MHz, 5mm z-gradient BBFO probehead, ATM and SampleXPress 60 sample changer) and an Avance III 600 spectrometer (600MHz, 5mm z-gradient TCI CryoProbe probehead with ATM and SampleXPress Lite 16 sample changer) performed by Bruker.
  • the LC/MS measurements were performed on an Agilent Technologies 1220 Infinity LC system coupled to an Agilent Technologies 6130B Single Quadrupole LC/MS system.
  • the glutamate-urea-lysine binding motif KuE and the linker of the KuE-617 ligand are synthesized according to established solid-phase peptide chemistry according to a method proposed by Benesovä et al. (Benesovä, M.; Shufer, M.; Bauder-Wüst, U.; Afshar-Oromieh, A.; Kratochwil, C.; Mier, W.; Haberkorn, U.; Kopka, K.; Eder, M.
  • Bis(tert-butyl)-L-glutamate hydrochloride (4.5 g, 15.21 mmol) and DIPEA (7.98 g, 10.5 mL, 61.74 mmol) are dissolved in dry dichloromethane (200 mL). and cooled to 0 °C.
  • Triphosgene (1.56 g, 5.26 mmol) in dichloromethane (30 mL) was added dropwise over a period of 4.5 h. After the addition is complete, the solution is stirred for an additional hour.
  • the Fmoc-protecting group of Fmoc-L-Lysine(Alloc)-Wang resin (1.65 g, 1.5 mmol, 0.9 mmol/g) is removed by placing it in a piperidine/DMF solution (1: 1) stirred for 15 minutes followed by a wash with dichloromethane.
  • the deprotected L-lysine (Alloc)-Wang resin is added to the previously prepared solution and stirred at room temperature overnight. The resin is washed with dichloromethane (15 mL) and used without further purification.
  • Tetrakis(triphenylphosphine)palladium (516 mg, 0.45 mmol) and morpholine (3.92 g, 3.92 mL, 45 mmol) are dissolved in dichloromethane (12 mL) and added. The solution is stirred for 24 hours with the exclusion of light. It is then washed with dichloromethane (15 mL), 1% DIPEA solution in DMF (3 x 13 mL) and sodium diethyldithiocarbamate trihydrate solution (15 mg/mL) in DMF (9 x 10.5 mL x 5 minutes) to Obtain resin-bound and Alloc-deprotected glutamate-urea-lysine conjugate.
  • Fmoc-3-(2-Naphthyl)-L-Alanine (1.75 g, 4.00 mmol), HATU (1.52 g, 4.00 mmol), HOBt (540 mg, 4 mmol) and DIPEA (780 mg, 1.02 mL, 6.03 mmol) are dissolved in dry DMF (10 mL) and added to the resin. The solution is stirred overnight and then washed with DMF (10 mL) and dichloromethane (10 mL). To remove the Fmoc group, the resin is stirred in a piperidine/DMF solution (1:1, 3 x 11 mL) for 10 minutes each and washed with DMF (10 mL) and dichloromethane (10 mL).
  • Fmoc-4-Amc-OH (1.52 g, 4 mmol), HATU (1.52 g, 4 mmol), HOBt (540 mg, 4 mmol) and DIPEA (780 mg, 1.02 mL, 6.03 mmol) are added to the resin in dry DMF (10 mL). The solution is stirred for two days and then washed with DMF (10 mL) and dichloromethane (10 mL). To remove the Fmoc group, the reaction solution is stirred in a piperidine/DMF solution (1:1, 11 mL) for 10 min each and washed with DMF (10 mL) and dichloromethane (10 mL) to release the resin-bound KuE to obtain -617 ligands.
  • Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (506 mg, 0.0011 mmol), HATU (415 mg, 0.0011 mg), HOBt (146 mg, 0.0011 mmol) and DIPEA (277 ⁇ l, 211 mg, 0.00162 mmol) are dissolved in acetonitrile (4 ml) and stirred for 30 min.
  • the KuE-617 resin 300 mg, 0.0027 mmol, 0.09 mmol/g is added and the mixture stirred at room temperature for 1 day.
  • the resin is mixed with acetonitrile (10 mL) and dichloromethane (10 mL) and kept for subsequent synthesis steps.
  • the Fmoc-L-Lys(Boc)-KuE-617 resin is stirred in a mixture of DMF and piperidine (1:1, 6 mL) for 1 hour.
  • the Fmoc-deprotected resin is washed with DMF (10 mL) and Washed in dichloromethane (10 mL) and used in the next step without further purification.
  • DOTA-Tris(tert-butyl ester) (310 mg, 0.54 pmol), HATU 308 mg, 0.00081 mmol), HOBt (110 mg, 0.00081 mmol) and DIPEA (184 ⁇ l, 140 mg, 0.0011 mmol) are dissolved in acetonitrile (4 ml) and stirred for 30 min.
  • L-Lys(Boc)-KuE-617 resin (461 mg, 0.00027 mmol, 0.9 mmol/g) is added and the mixture stirred at room temperature for 1 day. The resin is washed with acetonitrile (10 mL) and dichloromethane (10 mL) and used in the next step without further purification.
  • DOTA(tBu)3-L-Lys(Boc)-KuE-617-resin (536 mg, 0.00027 mmol, 0.9 mmol/g) is dissolved in a solution of TFA and dichloromethane (1:1, 4th ml) stirred.
  • Radiolabeling is performed in 1 ml of 1 M ammonium acetate buffer at pH 5.5. Reactions are performed with different amounts of precursor (5, 10 and 30 nmol) and at 95 °C with 40-50 MBq nca lutetium-177.
  • Radio thin layer chromatography TLC silica gel 60 F254 from Merck
  • citrate buffer pH 4
  • HPLC 7000 Hitachi LaChrom column: Merck Chromolith® RP-18e, 5-95% MeCN (+ 0.1% TFA)/ 95-5% water (+0.1% TFA) in 10 min
  • Radio thin layer chromatography samples are measured and evaluated with the TLC Imager CR-35 Bio Test imager from Elysia-Raytest (Straubenhardt, Germany) with AI DA software.
  • LogD7.4 values of the respective compound are determined via the distribution coefficients in n-octanol and PBS.
  • the labeling solution is adjusted to pH 7.4 and 5 MBq is diluted in 700 ⁇ l n-octanol and 700 ⁇ l PBS. It is shaken at 1500 rpm for 2 min and then centrifuged. 400 ⁇ l of the n-octanol phase and 400 ⁇ l of the PBS phase were each transferred to a new Eppendorf tube. 3-6 ⁇ l are then pipetted onto a TLC plate and analyzed using a phosphor imager. The LogDy/i value is calculated using the ratio of the activities of the two phases. The measurement of each phase is also repeated two more times with the higher activity sample so that three LogD7.4 values can be obtained and an average calculated.
  • Hydroxyapatite (20 mg) is incubated in saline (1 mL) for 24 h. 50 ⁇ l of the radiotracer [ 177 Lu]Lu-DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 (5 MBq) or [ 177 Lu]Lu-PSMA-617 (5 MBq) are added. Each suspension is vortexed for 20 s and incubated for 1 h at room temperature. Each suspension is then passed through a filter (CHROMAFIL® Xtra PTFE-45/13) and the supernatant washed with water (500 ⁇ l).
  • a filter CHROMAFIL® Xtra PTFE-45/1
  • the radioactivity of the liquids obtained and supernatants containing HAP are each measured with a curiemeter (activimeter Isomed 2010 MED Nuclear-Medizintechnik Dresden GmbH).
  • the binding of [ 177 Lu]Lu-DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 and [ 177 Lu]Lu-PSMA-617 are determined as a percentage of the activity absorbed on HAP.
  • the HAP binding of free Lu-177 is measured in an analogous manner. Comparative measurements are carried out on blocked hydroxyapatite in an analogous manner.
  • Non-active (cold) [ nat Lu]Lu complexes are prepared by shaking a solution containing the label precursor DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 (371 ⁇ L, 1 mg/mL, 250 nmol) with LuCh (129 ⁇ L , 1 mg/mL, 375 nmol, metal to label precursor ratio 1.5:1) in 1M ammonium acetate buffer at 95°C for 2 hours. Complex formation is monitored by ESI-LC/MS.
  • the PSMA binding affinity is determined according to the method described by Benesovä et al. (Benesovä, M.; Shufer, M.; Bauder-Wüst, U.; Afshar-Oromieh, A.; Kratochwil, C.; Mier, W.; Haberkorn, U.; Kopka, K.; Eder, M. Preclinical Evaluation of a Tailor-Made DOTA-Conjugated PSMA Inhibitor with Optimized Linker Moiety for Imaging and Endoradiotherapy of Prostate Cancer J Nucl Med 2015, 56 (6), 914-920).
  • PSMA-positive LNCaP cells from Sigma-Aldrich in RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific), 100 pg/ml streptomycin and 100 units/ml penicillin at 37 °C in 5 % CO2 cultivated.
  • the LNCaP cells are incubated for 45 min with increasing concentrations of the label precursor-containing solutions in the presence of 0.75 nM [ 68 Ga]Ga-PSMA-10. Free radioactivity is removed by several washes with ice-cold PBS.
  • the samples obtained are measured in a y counter (2480 WIZARD2 Automatic Gamma Counter, PerkinElmer). The measurement data is evaluated in GraphPad Prism 9 using non-linear regression.

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Abstract

Ein Markierungsvorläufer für nuklearmedizinische Diagnostik und Theranostik hat die Struktur (Formula (I)) oder (Formula (II)) mit einem ersten PSMA-spezifischen Targetvektor TV1, einem zweiten osteoaffinen Targetvektor TV2, einem Chelator Chel zum Komplexieren eines Radioisotop und zwei oder drei Linkern L1, L2 und L3.

Description

Markierungsvorläufer und Radiotracer zur nuklearmedizinischen Diagnose und Therapie von Prostatakrebs induzierten Knochenmetastasen
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Markierungsvorläufer zum Komplexieren von radioaktiven Isotopen, umfassend einen Chelator Chel und zwei mit dem Chelator Chel konjungierte Targetvektoren für PSMA und Knochenmetastasen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind vorgesehen für die bildgebende nuklearmedizinische Diagnose und Behandlung (Theranostik) von durch Prostatakrebs induzierten Knochenmetastasen.
Radiotheranostika
In der klinischen Praxis werden seit etwa 15 Jahren in zunehmendem Umfang bildgebende nuklearmedizinische Diagnoseverfahren, wie Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (single photon emission computed tomography, SPECT) eingesetzt. Jüngst gewinnen auch theranostische Verfahren zunehmend an Bedeutung.
In der nuklearmedizinischen Diagnostik und Therapie werden Tumorzellen und Metastasen mit einem radioaktiven Isotop, wie beispielsweise Gallium-68 (68Ga) oder Lutetium-177 (177Lu) markiert bzw. bestrahlt. Hierbei werden u. a. Markierungsvorläufer eingesetzt, die das jeweilige Radioisotop koordinativ (68Ga, 99mTc, 177Lu) binden und einen Radiotracer bilden. Die Markierungsvorläufer umfassen als wesentliche chemische Komponente einen Chelator für die effektive und stabile Komplexierung des Radioisotops sowie als funktionelle Komponente einen biologischen Targetvektor, der an eine definierte Zielstruktur im Tumorgewebe binden. In der Regel weist der biologische Targetvektor eine hohe Affinität zu transmembranständigen Rezeptoren, Proteinen, Enzymen oder anderen Strukturen von Tumorzellen auf.
Nach intravenöser Injektion in den Blutkreislauf reichert sich das mit einem Radioisotop markierte Theranostikum bzw. der Radiotracer auf oder in den Zellen des primären Tumors und metastasierenden Gewebes an. Ziel ist es, im Tumor eine solche Strahlendosis zu deponieren, dass das Gewebe abstirbt. Gleichzeitig soll die dem gesunden Gewebe vermittelte Strahlendosis so gering bleiben, das dort Schäden toleriert werden können.
Durch den Chelator werden die Konfiguration und chemischen Eigenschaften des Target- vektors modifiziert und in der Regel dessen Affinität zu Tumorzellen stark beeinflusst. Dem- entsprechend wird die Kopplung zwischen dem Chelator und den Targetvektor in aufwendigen Trial-and-Error Versuchen bzw. sogenannten biochemischen Screenings maßgeschneidert. Hierbei wird eine große Zahl von, den Chelator und den Targetvektor umfassenden Markierungsvorläufern synthetisiert und insbesondere die Affinität zu Tumorzellen quantifiziert. Der Chelator und die chemische Kopplung mit dem Targetvektor sind maßgeblich für die biologische und nuklearmedizinische Potenz des jeweiligen Radio- Theranostikums.
Zusätzlich zu einer hohen Affinität muss der Markierungsvorläufer weitere Anforderungen erfüllen, wie
- schnelle und effektive Komplexierung des jeweiligen Radioisotops;
- hohe Selektivität des finalen Radio-Theranostikums für Tumorzellen und Metastasen - insbesondere Knochenmetastasen - relativ zu gesundem Gewebe;
- in vivo Stabilität, d.h. biochemische Beständigkeit des finalen Radio-Theranostikums in Blutserum unter physiologischen Bedingungen.
Prostatakrebs
Für Männer in den Industrieländern ist Prostatakrebs die häufigste Krebsart und die dritthäufigste tödliche Krebserkrankung. Das Tumorwachstum schreitet bei dieser Erkrankung nur langsam voran. Bei einer Diagnose im frühen Stadium liegt die 5-Jahre Überlebensrate bei nahezu 100%. Wird die Krankheit erst entdeckt, wenn der Tumor metastasiert hat, sinkt die Überlebensrate dramatisch. Ein zu frühes und zu aggressives Vorgehen gegen den Tumor kann wiederum die Lebensqualität des Patienten unnötig beeinträchtigen. So kann z. B. die operative Entfernung der Prostata zu Inkontinenz und Impotenz führen. Eine sichere Diagnose und Informationen über das Stadium der Krankheit sind essentiell für eine erfolgreiche Behandlung mit hoher Lebensqualität des Patienten. Ein weitverbreitetes Diagnosemittel neben dem Abtasten der Prostata durch einen Arzt ist die Bestimmung von Tumormarkern im Blut des Patienten. Der prominenteste Marker für ein Prostatakarzinom ist die Konzentration des prostataspezifischen Antigens (PSA) im Blut. Allerdings ist die Aussagekraft der PSA- Konzentration umstritten, da Patienten mit leicht erhöhten Werten oft kein Prostatakarzinom haben, jedoch 15% der Patienten mit Prostatakarzinom keine erhöhte PSA-Konzentration im Blut zeigen.
Prostataspezifisches Membranantigen (PSMA)
Eine Zielstruktur für die Diagnose von Prostatatumoren ist das prostataspezifische Membranantigen (PSMA). Im Gegensatz zu PSA kann PSMA im Blut nicht nachgewiesen werden. Es ist ein membrangebundenes Glykoprotein mit enzymatischer Aktivität. Seine Aufgabe ist die Abspaltung von C-terminalem Glutamat von N-Acetyl-Aspartyl-Glutamat (NAAG) und Folsäure-(poly)-y-Glutamat. PSMA tritt in normalem Gewebe kaum auf, wird aber von Prostatakarzinomzellen stark überexprimiert, wobei die Expression mit dem Stadium der Tumorerkrankung eng korreliert. Anteilig zu etwa 40 % exprimieren auch Lymphknoten- und Knochenmetastasen von Prostatakarzinomen PSMA.
Eine Strategie des molekularen Targetings von PSMA besteht darin, mit Antikörpern an die Proteinstruktur des PSMA zu binden. Eine weitere Herangehensweise ist die enzymatische Aktivität von PSMA, die gut verstanden ist, zu nutzen. In der enzymatischen Bindungstasche von PSMA befinden sich zwei Zn2+-Ionen, die Glutamat binden. Vor dem Zentrum mit den beiden Zn2+-Ionen befindet sich eine aromatische Bindungstasche. Das Protein ist in der Lage sich aufzuweiten und an die Bindungspartner anzupassen (induced fit), so dass es neben NAAG auch Folsäure binden kann, wobei die Pteroinsäuregruppe in der aromatischen Bindungstasche andockt. Die Nutzung der enzymatischen Affinität von PSMA ermöglicht die Aufnahme des Substrates in die Zelle (Endozytose) unabhängig von einer enzymatischen Spaltung des Substrates.
Daher eignen sich insbesondere PSMA-Inhibitoren gut als Targetvektoren für bildgebende diagnostische und theranostische Radiopharmazeutika bzw. Radiotracer. Die radioaktiv markierten Inhibitoren binden an das aktive Zentrum des Enzyms, werden dort jedoch nicht umgesetzt. Die Bindung zwischen dem Inhibitor und dem radioaktiven Label wird also nicht gelöst. Begünstigt durch Endozytose wird der Inhibitor mit dem radioaktiven Label in die Zelle aufgenommen und in den Tumorzellen angereichert.
Inhibitoren mit hoher Affinität zu PSMA (Schema 1) enthalten in der Regel ein Glutamat-Motiv und eine enzymatisch nicht spaltbare Struktur. Ein hoch effektiver PSMA-Inhibitor ist 2-Phosphonomethyl-Glutarsäure bzw. 2-Phosphonomethyl-Pentandisäure (2-PMPA), in der das Glutamat-Motiv an eine durch PSMA nicht spaltbare Phosphonatgruppe gebunden ist. Eine weitere Gruppe von PSMA-Inhibitoren, die in den klinisch relevanten Radiopharmaka PSMA-11 (Schema 2) und PSMA-617 (Schema 3) genutzt wird, bilden Harnstoff-basierte Inhibitoren.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, zusätzlich zu der Bindungstasche für das Glutamat-Motiv die aromatische Bindungstasche von PSMA zu adressieren. Beispielsweise ist in dem hoch wirksamen Radiopharmakon PSMA-11 das Bindungsmotiv L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) über Hexyl (Hexyl-Linker) an einen aromatischen HBED-Chelator (N,N'-Bis(2-hydroxy-5-(ethylen- beta-carboxy)benzyl)ethylendiamin N,N'-diacetat) gebunden.
Wird L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) hingegen an den nicht-aromatischen Chelator DOTA (l,4,7,10-Tetraazacyclododecan-l,4,7,10-tetraacetat) gebunden, so ist eine verminderte Affinität und Anreicherung in Tumorgewebe zu konstatieren. Um dennoch den DOTA-Chelator für ein PSMA-affines Radiopharmakon mit therapeutischen Radioisotopen, wie 177Lu oder 225Ac nutzen zu können, muss der Linker angepasst werden. Mittels gezielter Substitution von Hexyl durch verschiedene aromatische Strukturen wurde das hoch wirksame Radiopharmakon PSMA-617, der derzeitige Goldstandard, gefunden. -PMPA L-Glu-Urea-L-Glu KuE Tetrazol-Butansäure-Urea-L-Glu
Schema 1: PSMA-lnhibitoren
Schema 2: Markierungsvorläufer PSMA-11
Schema 3: Markierungsvorläufer PSMA-617 Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Markierungsvorläufern für Diagnose und Theranostik von Krebserkrankungen mit radioaktiven Isotopen bekannt. WO 2015055318 Al offenbart Radiotracer für die Diagnose und Theranostik von Prostata- oder epithelialen Karzinomen, wie unter anderem, die in Schema 3 gezeigte Verbindung PSIVIA-617.
Knochenmetastasen und Bisphosphonate
Bisphosphonate (BP) werden in der klinischen Praxis für die Behandlung von Störungen des Knochen- und Calciumstoffwechsels eingesetzt. Hierzu zählen Morbus Paget, Osteoporose und die konventionelle systemische Therapie von Knochentumoren. Bisphosphonate zeichnen sich durch eine ausgeprägte Selektivität in ihrer Anreicherung an mineralischem Calciumphosphat aus. Diese beruht auf der Ausbildung eines zweizähnigen Chelatkomplexes der Bisphosphonate mit Calcium(ll)-Ionen. Bisphosphonate adsorbieren bevorzugt in Bereichen mit schnellem Knochenumbau. In Knochenmetastasen findet im Vergleich zu gesundem Gewebe ein intensiver Umbau statt. Daher reichern sich Bisphosphonate in verstärktem Maß in Knochenmetastasen an und initiieren dort verschiedene Vorgänge.
Zum anderen hemmen Bisphosphonate die Mineralisierung der Knochensubstanz und den Knochenabbau. Diese Wirkung beruht u. a. auf der Hemmung der Farnesyl-Pyrophosphat- Synthase (FPPS), einem Enzym im HMG-CoA- Reduktase-(Mevalonat)-Weg. Durch die Hemmung des Enzyms wird die Produktion von Farnesyl, einem wichtigen Molekül zur Verankerung von Signalproteinen an der Zellmembran (FPPS) unterbunden und die Apoptose derZelle initiert. Somit erfüllen Bisphosphonat-Derivate als solche bereits auf zellularer Ebene eine therapeutische Funktion.
Die selektive Anreicherung von Bisphosphonaten an der Knochenoberfläche fördert die Apoptose osteogener Zellen, insbesondere von Osteoklasten, welche bei Demineralisierung der Knochenmatrix in verstärktem Maß Bisphosphonate aufnehmen. Die vermehrte Apoptose von Osteoklasten bewirkt wiederum einen antiresorptiven Effekt.
Die klinisch relevanten Bisphosphonate sind: Clodronat, Etidronat, Pamidronat, Risedronat und Zoledronat.
Als besonders effektiver Radiotracer für die Theranostik von Knochenmetastasen hat sich Zoledronat (ZOL), ein Hydroxy-Bisphosphonat mit einer heteroaromatischen N-Einheit erwiesen. Mit den Chelatoren NODAGA- und DOTA-konjugiertes Zoledronat (Schema 4) repräsentiert die derzeit potentesten Radio-Theranostika für Knochenmetastasen.
Schema 4: Tracer DOTA-Zoledronat (links) und NODAGA-Zoledronat (rechts)
Bei der Behandlung von Prostatakarzinomen und -metastasen in fortgeschrittenem Stadium werden zurzeit vorzugsweise monomere Radiotracer mit dem vorstehend beschriebenen PSMA-Targetvektor KuE eingesetzt. PSMA wird auch auf der Oberfläche von gesunden Zellen exprimiert. Daher werden monomere Radiotracer mit PSMA-Targetvektor in beträchtlichem Umfang auch in gesundem Gewebe angereichert. Die damit einhergehende Strahlendosis verursacht diverse toxische Nebenwirkungen. Besonders ausgeprägt sind diese bei mit 225Ac (225Actinium) markierten Radiotracern, welche die Speicheldrüsen total und irreversibel schädigen. Daher wird die Therapieform mit dem Radioisotop 225Ac nicht mehr verwendet.
Trotz eines durch verbesserte Diagnose bedingten Rückgangs der Patientenzahlen mit metastasierendem Prostatakrebs in den letzten Jahren, ist die Zahl der Patienten mit Prostatakrebs-Metastasen immer noch hoch, wobei etwa 80 % der Metastasen Knochengewebe befallen. Bei metastasierenden Prostatakarzinomen sinkt die Überlebensrate drastisch. Dies gilt in besonderem Maß für Knochenmetastasen. Zudem verursachen Knochenmetastasen starke Schmerzen und beeinträchtigen die Lebensqualität erheblich. In der Regel verbleibt als klinische Option lediglich die palliative Behandlung (Gandaglia, G., et al., Impact of Metastases on Survival in Patients with Metastatic Prostate Cancer, European Urology, 2015, 68 (2), 325-334).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Markierungsvorläufer und Radiotracer für eine schonende und effektive Behandlung von metastasierendem Prostatkrebs bereitzustellen. Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Markierungsvorläufer zum Komplexieren von radioaktiven Isotopen mit der Struktur
TVl-L1-Chel-L2-TV2 oder
Chel mit X = CH oder N worin
- ein ersterTargetvektorTVl gewählt ist aus der Gruppe von PSMA-Inhibitoren, umfassend
- ein zweiter Targetvektor TV2 gewählt ist aus der Gruppe der Bisphosphonate, umfassend
- ein erster Linker L1 eine Struktur aufweist, die gewählt ist aus ; G ; ; ; und ; worin G gleich ist;
01, 02 und 03 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid- Reste, -(CH2)- , -(CH2CH2O)- , -CH2-CH(COOH)-NH- und -(CH2)qNH- mit q = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; p1, p2 und p3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Menge {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20};
- ein zweiter Linker L2 eine Struktur aufweist, die gewählt ist aus ; ; und worin R1, R2 und R3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-, Furan-, Azol-, Oxazol-, Thiophen-, Thiazol-, Azin-, Thiazin-, Naphthalin-, Chinolin-, Pyrrol-, Imidazol-, Pyrazol-, Tetrazol-, Thiadiazol-, Oxadiazol-, Pyrridin-, Pyrimidin-, Triazin-, Tetrazin-, Thiazin-, Oxazin-, Naphthalin- Chromen- oder Thiochromen-Reste, -(CH2)-, -(CH2CH2O)-, -CH2-CH(COOH)-NH- und -(CH2)qNH- mit q = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; s1, s2 und s3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Menge {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20};
- ein dritter Linker L3 eine Struktur aufweist, die gewählt ist aus ; ; und ; worin TI, T2 und T3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid- Reste, -(CH2)- , -(CH2CH2O)- , -CH2-CH(COOH)-NH- und -(CH2)VNH- mit v = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; ul, u2 und u3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Menge {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20};
- QS ein Quadratsäurerest ist; und
- ein Chelator Chel gewählt ist aus der Gruppe, umfassend FUpypa, EDTA (Ethylendiamintetraacetat), EDTMP (Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure)), DTPA (Diethylentriaminpentaacetat) und dessen Derivate, DOTA (Dodeca-1,4,7,10- tetraamin-tetraacetat), DOTAGA (2-( 1,4,7, 10-Tetraazacyclododecan-4, 7,10)- pentandisäure) und anderen DOTA-Derivaten, TRITA (Trideca-l,4,7,10-tetraamin- tetraacetat), TETA (Tetradeca-l,4,8,ll-tetraamin-tetraacetat) und dessen Derivate, NOTA (Nona-l,4,7-triamin-triacetat) und dessen Derivate wie beispielsweise NOTAGA (l,4,7-triazacyclononan,l-glutarsäure,4,7-acetat), TRAP (Triazacyclononan- phosphinsäure), NOPO (l,4,7-triazacyclononan-l,4-bis[methylen(hydroxymethyl) phosphinsäure]-7-[methylen(2-carboxyethyl) phosphinsäure]), PEPA (Pentadeca- 1,4,7,10,13-pentaaminpentaacetat), HEHA (Hexadeca-l,4,7,10,13,16-hexaamin- hexaacetat) und dessen Derivate, HBED (Hydroxybenzyl-ethylen-diamin) und dessen Derivate, DEDPA und dessen Derivate, wie H2DEDPA (l,2-[[6-(carboxylat-)pyridin-2- yl]methylamin]ethan), DFO (Deferoxamin) und dessen Derivate, Trishydroxypyridinon (THP) und dessen Derivate wie YM103, TEAP (Tetraazycyclodecan-phosphinsäure) und dessen Derivate, AAZTA (6-Amino-6-methylperhydro-l,4-diazepin-N,N,N',N'-tetraacetat) und Derivate wie DATA ((6-Pentansäure)-6-(amino)methyl-l,4-diazepin triacetat); SarAr (l-N-(4-aminobenzyl)-3,6,10,13,16,19-hexaazabicyclo[6.6.6]-eicosan-l,8-diamin) und Salze davon, (NH2)2SAR (l,8-diamino-3,6,10,13,16,19-hexaazabicyclo[6.6.6]icosane) und Salze und Derivate davon, Aminothiole und deren Derivate. Zweckmäßige Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Markierungsvorläufers sind gekennzeichnet durch die nachfolgenden Merkmale in beliebiger Kombination, insoweit sich die Merkmale nicht gegenseitig ausschließen, und denen zufolge:
- der Chelator Chel gleich DOTA ist; - der Chelator Chel gleich H4pypa ist;
- der Chelator Chel gleich DATA ist;
- der Chelator Chel gleich DOTAGA ist; der zweite Linker L2 mindestens einen Rest umfasst, der gewählt ist aus der zweite Linker L2 mindestens einen Quadratsäure-Rest umfasst; der zweite Linker L2 mindestens einen Rest umfasst, der gewählt ist aus
- die Linker L1 und L2 gleich sind (L1 = L2) ;
- die Linker L1 und L3 gleich sind (L1 = L2) ;
- die Linker L2 und L3 gleich sind (L2 = L3) ; - die Linker L1, L2 und L3 gleich sind (L1 = L2 = L3) ; der zweite Linker L2 einen Rest umfasst, der gewählt ist aus der Gruppe, umfassend einen Rest von Pyrrol
Imidazol 1,2-Thiazin
Pyrazol
1,3-Thiazin
1,2,5-Oxadiazol,2,3-Triazol 1 ,4-Thiazin ,2,4-Triazol 1,3-Oxazin
Thi
Thiazol 1 ,2,4-Triazin 2H-Chromen
1,2-Thiazol 1,3,5-Triazin 4H-Chromen
Thiadiazol 1,2,3,4-Tetrazin 2H-Thiochromen
Oxazol
4H-Thiochromen und Derivaten der vorstehenden Reste; der zweite Linker L2 mindestens einen Imidazol-Rest umfasst;
G gleich ist; - der Markierungsvorläufer die Struktur aufweist.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Beispielen näher erläutert. Es zeigt
Fig. 1 die funktionellen Komponenten eines Radiotracers;
Fig. 2 in vivo PET-Aufnahmen von Wistar-Ratten; Fig. 3 Diagramme zum zeitlichen Verlauf von SUV und dem PET-Signalverhältnis von Epiphyse und Blut; und
Fig. 4 das Ergebnis einer Docking-Simulation für die PSMA-Bindungstasche;
Fig. 5 die Markierungskinetik eines Markierungsvorläufers;
Fig. 6 die Stabilität eines Radiotracers in physiologischem Milieu; Fig. 7 Bindungsaffinitäten zu Hydroxyapatit;
Fig. 8 ex vivo Organanreicherungen ohne und mit Blockierung von PSMA.
In der Erfindung werden der Chelator Chel, die Targetvektoren TV1, TV2 und die Linker L1, L2 vorzugsweise mittels einer Amidkupplungsreaktion konjugiert. In der medizinischen Chemie ist die das Rückgrat von Proteinen bildende Amidkupplung die am häufigsten eingesetzte Reaktion. Ein generisches Beispiel einer Amidkupplung ist in Schema 5 gezeigt.
Schema 5: Amidkupplung
Aufgrund eines praktisch unbegrenzten Satzes leicht verfügbarer Carbonsäure- und Aminderivate eröffnen Amidkupplungsstrategien einen einfachen Weg für die Synthese neuer Verbindungen. Dem Fachmann sind zahlreiche Reagenzien und Protokolle für Amidkupplungen bekannt. Die gebräuchlichste Amidkupplungsstrategie beruht auf der Kondensation einer Carbonsäure mit einem Amin. Die Carbonsäure wird hierfür in der Regel aktiviert. Vor der Aktivierung werden verbleibende funktionelle Gruppen geschützt. Die Reaktion erfolgt in zwei Schritten entweder in einem Reaktionsmedium (single pot) unter direkter Umsetzung der aktivierten Carbonsäure oder in zwei Schritten unter Isolierung einer aktivierten "gefangenen" Carbonsäure und Umsetzung mit einem Amin.
Hierbei reagiert das Carboxylat mit einem Kupplungsreagenz unter Bildung eines reaktiven Zwischenprodukts, das isoliert oder direkt mit einem Amin umgesetzt werden kann. Für die Carbonsäureaktivierung stehen zahlreiche Reagenzien zur Verfügung, wie Säurehalogenide (Chlorid, Fluorid), Azide, Anhydride oder Carbodiimide. Zusätzlich können als reaktive Zwischenprodukte Ester wie Pentafluorphenyl- oder Hydroxysuccin-Imidoester gebildet werden. Aus Acylchloriden oder Aziden abgeleitete Zwischenprodukte sind hochreaktiv. Harsche Reaktionsbedingungen und hohe Reaktivität stehen jedoch häufig einer Anwendung für empfindliche Substrate oder Aminosäuren entgegen. Demgegenüber erschließen Amidkupplungsstrategien, die Carbodiimide wie DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) oder DIC (Diisopropylcarbodiimid) nutzen, ein breites Anwendungsspektrum. Häufig, insbesondere bei der Festphasensynthese werden Additive verwendet, um die Reaktionseffizienz zu verbessern. Aminiumsalze sind hocheffiziente Peptidkupplungsreagenzien mit kurzen Reaktionszeiten und minimaler Racemisierung. Mit einigen Additiven, wie beispielsweise HOBt kann die Racemisierung sogar vollständig vermieden werden. Aminiumreagenzien werden äquimolar zur Carbonsäure eingesetzt, um eine überschießende Reaktion mit dem freien Amin des Peptids zu verhindern. Phosphoniumsalze reagieren mit Carboxylat, was in der Regel zwei Äquivalente einer Base, wie beispielsweise DIEA erfordert. Ein wesentlicher Vorteil von Phosphoniumsalzen gegenüber Iminiumreagenzien besteht darin, dass Phosphonium nicht mit der freien Aminogruppe der Aminkomponente reagiert. Dies ermöglicht Kupplungen in äquimolarem Verhältnis von Säure und Amin und hilft, die intramolekularer Zyklisierung linearer Peptide sowie überschüssigen Einsatz teurer Aminkomponenten zu vermeiden.
Eine umfangreiche Zusammenstellung von Reaktionsstrategien und Reagenzien für Amidkupplungen findet sich in den Übersichtsartikeln:
- Analysis of Past and Present Synthetic Methodologies on Medicinal Chemistry: Where Have All the New Reactions Gone?; D. G. Brown, J. Boström; J. Med. Chem. 2016, 59 (10), 4443-4458;
- Peptide Coupling Reagents, More than a Letter Soup; A. El-Faham, F. Albericio; Chem. Rev. 2011, 111 (11), 6557-6602;
- Rethinking amide bond synthesis; V. R. Pattabiraman, J. W. Bode; Nature, Vol. 480 (2011) 471-479;
- Amide bond formation: beyond the myth of coupling reagents; E. Valeur, M. Bradley; Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 606-631.
Zahlreiche der erfindungsgemäß verwendeten Chelatoren, wie insbesondere DOTA, weisen eine oder mehrere Carboxy- oder Amidgruppen auf. Dementsprechend können diese Chelatoren mithilfe einer der im Stand der Technik bekannten Amidkupplungsstrategien auf einfache Weise mit den Linkern L1, L2 konjugiert werden. Schemata 6 und 7 zeigen Kupplungsbeispiele der Linker-Targetvektor-Einheit L1-TV1 mit einem Chelator Chel, Schemata 8-10 zeigen Kupplungsbeispiele von L2-TV2 mit einem Chelator Chel.
Schema 6: Amidkupplung eines Linkers L1 an einen Chelator Chel mittels HATU und HOBt in einem organischen Lösungsmittel mit Zusatz einer organischen Base.
Schema 7: Bildung einer Amidbindung mittels eines Quadratsäureethylesters zwischen einem Linker L1 und einem Chelator Chel bei einem pH Wert von 9 in einem wässrigen Puffer.
Schema 8: Amidkupplung eines Linkers L2 an einen Chelator Chel mittels HATU und HOBt in einem organischen Lösungsmittel mit Zusatz einer organischen Base.
Schema 9: NHS-Kupplung eines Chelators Chel in wässriger, leicht basischer Lösung.
Schema 10: NCS-Kupplung eines Chelators Chel in wässriger, leicht basischer Lösung. Chelator Chel für die Markierung mit einem Radioisotop
Der Chelator Chel ist vorgesehen für die Markierung des erfindungsgemäßen Markierungsvorläufers mit einem Radioisotop, das gewählt ist aus der Gruppe, umfassend 44Sc, 47Sc, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 86Y, 90Y, 89Zr, 90Nb, 99mTc, mln, 135Sm, 140Pr, 159Gd, 149Tb, 160Tb, 161Tb, 165Er, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Pb, 213Bi, 225Ac und 232Th. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Chelatoren für die Komplexierung der vorstehenden Radioisotope bekannt. In Schema 11 sind Beispiele erfindungsgemäß verwendeter Chelatoren wiedergegeben.
NOTA PEPA HEHA
(NH2)2SAR
Schema 11: Erfindungsgemäß verwendete Chelatoren
Der für die Komplexierung von 68Ga wie auch 177Lu gut geeignete Chelator DOTA ist erfindungsgemäß bevorzugt. Für die Komplexierung von 177Lu wird insbesondere auch der Chelator H2pypa verwendet. Die Synthese von FUpypa ist in Schema 12 gezeigt.
(i) DCC, tert-butyl alcohol, DCM, RT, 12h, 50%; (ii) NaBH4, dry MeOH, RT, 3-4h, 72%; (iii) SeO2, 1,4-Dioxan, 100 °C, 12h, 56%; (iv) 1. trock. MeOH, RT, lh; 2. NaBH3CN, trock. MeOH, 3h, 70%; (v) NaBH4, trock. MeOH, RT, 12h, 92%; (vi) PBr3, trock. CHCh/ACN, 60 °C, 18 h, 70%; (vii) K2CO3, trock. ACN, 60 °C, 24h, 70%; (viii) TFA/DCM, RT, 12h, 70%.
Schema 12: Synthese des Chelators H4pypa für die Komplexierung von 177Lu.
Radioisotope
Für die nuklearmedizinische Theranostik (Diagnose und Therapie) werden insbesondere die Radioisotope 68Ga bzw. 177Lu verwendet. Die Erfindung sieht zudem die Nutzung von
Radioisotopen vor, die gewählt sind aus der Gruppe, umfassend 44Sc, 47Sc, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 86Y, 90Y, 89Zr, 90Nb, 99mTc, mln, 135Sm, 159Gd, 149Tb, 160Tb, 161Tb, i65Er, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Pb, 213Bi, 225Ac und 232Th.
Nachfolgend sind Strukturformeln erfindungsgemäßer Markierungsvorläufer aufgeführt:
Schema 14: Pam.SA.DOTAGA.SA.KuE
5 Schema 17: DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617
Schema 19: Zol.DOTAGA.I&T
Schema 22: Zol.NCS.DOTAGA.I&T Beispiel 1: Quadratsäure als Affinitätspromoter für Bisphosphonate
Die Erfinder haben überraschend gefunden, dass Quadratsäure als Bestandteil eines Linkers eines Bisphosphonat-Targetvektors die Affinität zu Hydroxyapatit in Knochengewebe erhöht. Dieser vorteilhafte Effekt wird gezeigt anhand der Adsorptionsthermen von Konjugaten des Chelators NODAGA mit Quadratsäure-Pamidronat (NODAGA.QS.Pam) und NODAGA mit Zoledronat (NODAGA. Zol). Hierzu werden die Adsorptionsthermen gemäß dem Verfahren von Langmuir und Freundlich bestimmt.
Schema 23 und 24 zeigen zum Vergleich Konjugate des Chelators NODAGA mit Quadratsäure- Pamidronat (NODAGA.QS.Pam) und NODAGA mit Zoledronat (NODAGA. Zol) sowie die jeweiligen, nach dem Verfahren von Langmuir und Freundlich gemessenen Adsorptionskoeffizienten KLF.
KLF = 11,9 ± 13,3 ml/pimol
Schema 24: NODAGA.Zol
Der Adsorptionskoeffizient KLF des Konjugats NODAGA.QS.Pam ist etwa dreimal so groß wie der von NODAGA. Zol, das anstelle einer Quadratsäure-Gruppe einen Imidazol-Rest enthält. Hieraus ist unmittelbar ersichtlich, dass Quadratsäure die Affinität der Bisphosphonat-Gruppe zu Knochengewebe deutlich erhöht. Im Weiteren zeigen in vivo PET-Untersuchungen (Positronen-Emissions-Tomographie) an jungen, gesunden Wistar-Ratten mit dem Radiotracer [68Ga]Ga-NODAGA.QS.Pam (cf. Fig. 2) eine hohe Anreicherung in den Epiphysen, die sich bei Jungtieren - analog zu Knochenmetastasen - durch rasche Erneuerung und Umbildung von Knochengewebe auszeichnen.
Im Vergleich zu publizierten SUVs (Standardized Uptake Value, https://de.wikipedia.org/ wiki/SUV_(Nuklearmedizin)) für den PET-Radiomarker [68Ga]Ga-DOTA.Zol mit SUVEpiphyse = 17,4 kann mit [68Ga]NODAGA.QS.Pam ein merklich erhöhter Wert von SUVEpiphyse = 22,9 erzielt werden (cf. Fig. 3).
Zudem erfolgt die renale Ausscheidung von [68Ga]NODAGA.QS.Pam (% IDrenai = 40±4, 60 min p.i.) rascher als bei [68Ga]Ga-DOTA.Zol (% IDrenai = 33±17, 60 min p.i.). Hieraus ergibt sich für [68Ga]Ga-NODAGA.QS.Pam - wie in Fig. 3 gezeigt - ein höheres Epiphysen-zu-Blut- Verhältnis von 299,1 im Vergleich zu 30,3 für [68Ga]Ga-DOTA.Zol und dementsprechend besserer PET-Bildkontrast (bzw. Signal-Rausch-Verhältnis).
Beispiel 2: Synthese der KuE-Einheit
Als Targetvektor für PSMA wird z.B. der PSMA-Inhibitor L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) mittels eines bekannten Verfahrens nach Benesovä et al. (Linker Modification Strategies To Control the Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)-Targeting and Pharmacokinetic Properties of DOTA-Conjugated PSMA Inhibitors; J Med Chem, 2016, 59 (5), 1761-1775) synthetisiert (cf. Schema 25). Hierbei wird an eine Festphase, insbesondere ein Polymerharz gebundenes und mit tert-Butyloxycarbonyl (tert-Butyl) geschütztes Lysin mit zweifach tert-Butyl-geschützter Glutaminsäure umgesetzt. Nach Aktivierung der geschützten Glutaminsäure durch Triphosgen und der Kopplung an das festphasengebundene Lysin wird L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) mittels TFA abgespalten und zugleich vollständig entschützt. Das Produkt kann anschließend mittels semipräparativer HPLC von freiem Lysin mit einer Ausbeute von 71 % getrennt werden.
1 KuE
Schema 25: Festphasensynthese des PSMA-Inhibitors KuE; (a) DIPEA, Triphosgen, DCM 0 °C, 4h; (b) H-Lys(tBoc)-2CT-Polystyrol Festphase, DCM, RT, 16h; (c) TFA, RT, 71%.
Der PSMA-I inhibitor KuE (1) kann dann mittels Quadratsäurediethylester als Kupplungsreagenz an einen Markierungsvorläufer gekoppelt werden. Die Kopplung von KuE (1) an Quadratsäurediester erfolgt in 0,5 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von pH 7. Nach Zugabe beider Edukte muss der pH-Wert mit Natronlauge (1 M) nachjustiert werden, da die Pufferkapazität des Phosphatpuffers nicht ausreichend ist. Bei pH 7 erfolgt die einfache Amidierung der Säure (Schema 26) rasch bei Raumtemperatur mit kurzer Reaktionszeit. KuE- QS (2) wird nach HPLC -Aufreinigung mit einer Gesamtausbeute von 16 % erhalten.
Schema 26: Kupplung von KuE an Quadratsäure; (d) 0,5 M Phosphat- puffer pH 7, RT, 16h, 23%.
Der so erhaltene KuE-Quadratsäuremonoester ist lagerbar und kann als Baustein (building block) für weitere Synthesen verwendet werden.
Beispiel 3: Festphasen-basierte Synthese der KuE-Einheit und des PSMA-617 Linkers
Die Konjugation des Glutamat-Harnstoff-Lysin-Bindungsmotivs KuE mit einer aromatischen Linkereinheit erfolgt nach einer von Benesovä et al. (Linker Modification Strategies To Control the Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)-Targeting and Pharmacokinetic Properties of
DOTA-Conjugated PSMA Inhibitors; J Med Chem, 2016, 59 (5), 1761-1775) beschriebenen
Festphasen-Peptid-Synthese. Die von Benesovä et al. angegebene Synthese wurde geringfügig abgewandelt (cf. Schema 27).
Schema 27.1: Synthese der KuE-Einheit und Kupplung an einen aromatischen Linker;
(a) Triphosgen, DIPEA, DCM;
Schema 27.2: Synthese der KuE-Einheit und Kupplung an einen aromatischen Linker;
(b) 50% Piperidin in DMF; (c) Verbindung (I) in DCM;
Schema 27.3: Synthese der KuE-Einheit und Kupplung an einen aromatischen Linker;
(d) Tetrakis(triphenyl)palladium und Morpholin in DCM;
(e) Fmoc-3-(2-naphthyl)-L-alanin, HBTU und DIPEA in DMF;
Schema 27.4: Synthese der KuE-Einheit und Kupplung an einen aromatischen Linker;
(f) 50% Piperidin in DMF, Fmoc-4-Amc-OH, HBTU und DIPEA in DMF;
(g) 50% Piperidin in DMF.
Beispiel 4: Synthese des Markierungsvorläufers Pam.QS.DOTAGA.KuE-617
Zuerst wird die DOTAGA Unterstruktur synthetisiert. Dies erfolgte mit einer Ausbeute von 74 %. Schema 28: Synthese des kupplungsfähigen DOTAGA-Chelators.
Die Synthese erfolgt ausgehend vom kommerziell erhältlichen DO2A(tBu)-GABz, welches am sekundären Amin mit einer Boc-geschützten Aminogruppe funktionalisiert wird.
Die Benzylschutzgruppe der Glutarsäure-Seitenkette des DOTAGA(COOtBu)3(NHBoc)-GABz (4) wird reduktiv entfernt, um die Kupplung an den Targetvektor zu ermöglichen. Daraufhin wird der PSMA-617-Linker mittels Amidkupplung an den Chelator (5) gekuppelt.
Schema 29: Kupplung des Chelators (5) an die Linker PSMA-617.KuE-Einheit.
Die Kupplung des Chelators (5) an den KuE-gebundenen Linker ist in Schema 29 beschrieben.
Das durch die Amidkupplung erhaltene geschützte PSMA-617-Derivat (6) wird mit Hilfe von Trifluoressigsäure (TFA) entschützt und von der Festphase gelöst. Die Gesamtausbeute der zweistufigen Synthese betrug nach HPLC -Aufreinigung 6 %.
Im letzten Schritt wird die Pamidronat-Quadratsäure-Einheit synthetisiert und an Verbindung (7) gekuppelt (Schema 30). Ausgehend von ß-Alanin wird zunächst Pamidronat (8) hergestellt und in wässrigem Phosphatpuffer mit einem pH von 7 an Quadratsäurediester gekuppelt. Die Konjugation der Pamidronat-Quadratsäure-Gruppe (9) mit DOTAGA.KuE-617 (7) erfolgt in wässrigem Phosphatpuffer mit einem pH von 9 (cf. Schema 30). Der erfindungsgemäße Markierungsvorläufer Pam.QS. DOTAGA.KuE-617 (10) wird nach HPLC -Aufreinigung mit einer Ausbeute von 49 % erhalten.
Schema 30: Synthese von Pam.QS.DOTAGA.KuE-617
Beispiel 5: Synthese des Markierungsvorläufers DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617
Die Synthese des in Schema 17 gezeigten Markierungsvorläufers DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 ist in Schema 31 dargestellt. Zunächst werden der erste, an die Festphase gebundene Targetvektor KuE und der damit konjugierte aromatische Linker (Struktur (11) in Schema 31) in gleicher Weise, wie in Schema 27 gezeigt, synthetisiert. Daraufhin wird orthogonal geschütztes Lysin als Verbrückungseinheit X an den Linker konjugiert. Nach Fmoc- Entschützung (Struktur (12)) erfolgt die Kupplung mit DOTA-Tris(tert-butyl ester), wobei jeweils HATU als Reagenz für Amidbildung eingesetzt und die Verbindung gemäß Strukturformel (13) erhalten wird. Nachfolgend wird Verbindung (13) vollständig in TFA/DCM entschützt und von der Festphase entkoppelt, um Verbindung (14) zu erhalten. Schließlich wird der zweite, aus Pamidronat und Quadratsäure bestehende Targetvektor (9) mit Verbindung (14) konjugiert. Der zweite Targetvektor wird zuvor in gleicher Weise, wie in Schema 30 gezeigt, synthetisiert.
Schema 31: Synthese von_DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617
Beispiel 6: In vitro Untersuchung der Verbindungen NH2.DOTAGA.KuE-617, NH2.DOTAGA.QS.KuE und Pam.SA.DOTAGA.KuE-617
Mittels eines zellbasierten Assays wurde die Affinität des KuE-Targetvektors mit lipophilem Linker - analog zu PSMA-617 - sowie mit Quadratsäure-Linker anhand der Verbindungen NH2.DOTAGA.KUE-617 und NH2.DOTAGA.QS.KuE (Strukturformeln (8) und (10) in Schema 32) untersucht.
Schema 32: NH2.DOTAGA.KuE-617 (7) und NH2.DOTAGA.QS.KuE (16)
Für den Assay wurden LNCaP-Zellen in Multiwell-P latten (Merck Millipore Multiscreen™) pipettiert. Die zu analysierenden Verbindungen wurden in steigenden Konzentrationen jeweils mit einer definierten Menge bzw. Konzentration der Referenzverbindung 68Ga[Ga]PSMA-10 mit bekanntem Kd-Wert versetzt und 45 min lang in den Wells mit den LNCaP-Zellen inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurde die zellgebundene Aktivität bestimmt. Anhand der erhaltenen Inhibitionskurven wurden die in Tabelle 1 wiedergegebenen ICso-Werte und Ki-Werte berechnet.
Tabelle 1: ICso-Werte
Um die unspezifische Bindung zu bestimmen, wurden alle Verbindungen zudem mit einem Überschuss des PSMA-Inhibitors 2-PMPA (2-(Phosphonomethyl)-pentansäure) versetzt und dem gleichen LNCaP-Assay - wie vorstehend beschrieben - unterzogen.
Die Affinitäten der Quadratsäure-haltigen Verbindung NH2.DOTAGA.QS.KuE (16) und NH2.DOTAGA.KuE-617 (7) sind praktisch gleich groß und entsprechen in etwa denen der etablierten Verbindungen PSMA-617 und PSMA-11. Fig. 4 illustriert die Wechselwirkung der QS.KuE-Gruppe mit der Bindungstasche von PSMA. Der Aufwand für die Synthese der Quadratsäure-haltigen Verbindung NH2.DOTAGA. QS.KuE (lO) ist erheblich geringer im Vergleich zu den anderen Verbindungen. Die Verwendung von Quadratsäure als Linker zwischen dem Targetvektor KuE und einem Chelator eröffnet zudem eine einfache Möglichkeit, komplexere Markierungsvorläufer mit zwei voneinander verschiedenen Targetvektoren - vorliegend KuE und ein Bisphosphonat - quantitativ zu synthetisieren.
Des Weiteren wurde die PSMA-Affinität des finalen Markierungsvorläufers Pam.SA.DOTAGA.KuE-617 (10) bestimmt. Der IC50 Wert liegt bei 49,8 ± 10 nM.
Beispiel 7: Radiochemische Analyse von [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617
Bei einer Temperatur von 95° C wird der Markierungsvorläufer DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 (siehe Schema 17 und Strukturformel (15) in Schema 31) in 1 mL einer wässrigen Ammonium- acetat-Pufferlösung (1 M, pH 5,5) mit 177Lu markiert. Die radiochemische Ausbeute (RCY) als Funktion der in der Ammoniumacetat-Pufferlösung enthaltenen Menge des Markierungs- vorläufers (5, 10 und 30 nmol) ist in Fig. 5 wiedergegeben. Für eine Menge des Markierungsvorläufers von > 10 nmol erreicht die radiochemische Ausbeute (RCY) nach 5 min einen Wert von > 90 %. Demgegenüber beträgt bei einer Menge von 5 nmol Markierungs- vorläufer die Ausbeute nach 5 min lediglich 75 % und erreicht im weiteren Verlauf einen Plateauwert von 85 %. Die radiochemische Ausbeute und Reinheit werden mittels Radio- Dünnschichtchromatographie (radio-TLC) und Radio-Hochdruck-Flüssigchromatographie (radio-HPLC) bestimmt. Radio-Dünnschichtchromatographie liefert für den Radiotracer [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 einen Rf-Wert von 0,0. Demgegenüber ergibt sich für ungebundenes [177Lu]Lu3+ in Citratpuffer als mobile Phase ein Rf-Wert von 0,8 bis 1,0. Bei der analytischen_Radio-Hochdruck-Flüssigchromatographie wird für den Radiotracer eine Rückhaltezeit tR von 9,8 min gemessen.
In Fig. 6 sind Messwerte zur Stabilität des Radiotracers [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 in phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), isotonischer Kochsalzlösung (NaCI) und Humanserum (HS) dargestellt. Auch nach 14 Tagen in PBS und isotonischer Kochsalzlösung (NaCI) liegen > 98 % des Radiotracers [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 unverändert in komplexierter Form vor. In Humanserum (HS) ist die Stabilität mit 93 % nach 9 Tagen geringfügig niedriger, wobei die Stabilität nach 14 Tagen weiterhin 93 % beträgt.
Die Lipophilie von [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 wird durch die Bestimmung des Verteilungsgleichgewichts der Verbindung in einer Mischung aus n-Octanol und PBS bestimmt. Messwerte für den LogDy/i-Koeffizienten von [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE- 617 und [117Lu]Lu-PSMA-617 sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 praktisch die gleiche Lipophilie wie PSMA-617 aufweist. Tabelle 2: Radiotracer Lipophilie
Beispiel 8: Affinität zu Hydroxyapatit (HAP)
Calcium-haltiges kristallines Hydroxyapatit ist ein wesentlicher Bestandteil von Säugetier- knochen und eignet sich als Modellsubstrat für die in vitro Untersuchung der Bisphosphonat- Anreicherung in gesundem Knochengewebe sowie Knochenmetastasen. Fig. 7 zeigt Messwerte für die Anreicherung von [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617, [117Lu]Lu- PSMA-617 und [117Lu]Lu3+ auf gewöhnlichem HAP sowie mit Pamidronat vorbehandeltem bzw. blockiertem HAP, wobei freies [117Lu]Lu3+ bekanntermaßen eine hohe Affinität zu HAP aufweist und als Referenz dient. Der Anteil des auf HAP gebundenen Radiotracers [117Lu]Lu- DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 beträgt 98,2 % % und liegt geringfügig unter dem für freies [117Lu]Lu3+ gemessenen Wert von 99,9 %. Demgegenüber ergibt sich für [117Lu]Lu-PSMA-617 ein auf HAP angereicherter Anteil von lediglich 1,2 %. Um die Selektivität zu bestimmen, wurde zudem die Anreicherung auf zuvor mit einem Überschuss an Pamidronat behandeltem HAP gemessen. Hierbei ergeben sich Werte von 7,3 % für [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE- 617 und 4,9 % für freies [117Lu]Lu3+, die eine hohe Selektivität für HAP belegen.
Beispiel 9: in vitro Affinität zu PSMA
Mittels vergleichenden Radioliganden-Assays wird für den Radiotracer bzw. Markierungs- vorläufer DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 und Referenzstrukturen die Bindungsaffinität zu PSMA bestimmt. Entsprechende Messwerte für die Inhibierungskonstante Ki sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Der Ki-Wert für [natLu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 entspricht in etwa dem Wert für den Markierungsvorläufer DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617. Hieraus ist ersichtlich, dass die Komplexierung mit Lutetium die Bindungsaffinität zu PSMA nicht nachteilig beeinflusst. Verglichen mit DOTA.L-Lys.KuE-617 - entsprechend Strukturformel (14) in Schema 31 - ist der Ki-Wert von [natLu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 jedoch um einen Faktor von etwa 2 größer. Hieraus ist ersichtlich, dass die Quadratsäure-Pamidronat-Gruppe die Affinität zu PSMA verringert.
Tabelle 3: Affinität zu PSMA Beispiel 10: ex vivo Untersuchungen
Für den Radiotracer [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 wurde die Organanreicherung in Balb/c-Mäusen mit induzierten LNCaP-Tumoren untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt. Die Anreicherung des Radiotracers [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617 in Tumor und Femur ist vergleichbar mit Werten von 4,2 ± 0,7 %ID/g und respektive 3,4 ± 0,4 %ID/g. Im Gegensatz zum Tumor kann die Anreicherung im Knochen durch Verabreichung des PSMA-Inhibitors PMPA (2-Phosphonomethyl-Pentandisäure) nicht blockiert werden. Hieraus ist ersichtlich, dass die Aufnahme im Knochen nicht durch PSMA bedingt ist, da kein PSMA exprimiert wird. Mit einem Wert von 17 ± 2 %l D/g zeigen die Nieren eine hohe Anreicherung von [117Lu]Lu-DOTA.L-Lys(SA.Pam)KuE-617, die ebenfalls durch Gabe von PMPA stark reduziert werden kann. Demgegenüber ist die Anreicherung in Leber und Milz nicht PSMA-spezifisch. Das Verhältnis der Anreicherungen in Tumor und Blut ist mit Werten von 210 bzw. 170 außerordentlich hoch und deutet hin auf geringe hämatologische Nebenwirkungen.
Methoden und Materialien
Allgemeines
Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich, Merck, Fluka, AlfaAesar, VWR, AcrosOrganics, TCI, Iris Biotech oder Fisher Scientific bezogen und ohne zusätzliche Reinigung eingesetzt. Trockene Lösungsmittel wurden von Merck und VWR bezogen, deuterierte Lösungsmittel für NMR-Spektren von Deutero. PSMA-617 wurde von Hycultec erworben. Dünnschicht- chromatographie wurde mit Silicagel 60 F254 beschichteten Aluminiumplatten von Merck durchgeführt. Die Auswertung erfolgte durch Fluoreszenzextinktion bei X = 254 nm und Anfärbung mit Kaliumpermanganat. Die Radio-TLCs wurden mit einem CR-35 Bio Test Imager von Raytest und der Software AIDA (Raytest) ausgewertet. Die 1H- und 13C-NMR-Messungen wurden auf einem Bruker Avance III HD 300-Spektrometer (300 MHz, 5 mm BBFO-Probenkopf mit z-Gradient und ATM und BACS 60-Probenwechsler), einem Bruker Avance II 400-Spektro- meter (400 MHz, 5 mm BBFO-Probenkopf mit z-Gradient, ATM und SampleXPress 60 Probenwechsler) und ein Avance III 600-Spektrometer (600 MHz, 5 mm TCI CryoProbe Probenkopf mit z-Gradient und ATM und SampleXPress Lite 16 Probenwechsler) von Bruker durchgeführt. Die LC/MS-Messungen wurden auf einem Agilent Technologies 1220 Infinity LC- System durchgeführt, das mit einem Agilent Technologies 6130B Single Quadrupole LC/MS- System gekoppelt war. Die semipräparative HPLC-Reinigung wurde auf einem Hitachi LaChrom der Serie 7000 und den jeweils erwähnten Bedingungen und Säulen durchgeführt. Für radioaktive Markierungsexperimente wurde von ITM Garching bereitgestelltes [177Lu]LuCl3 in 0,04 M HCl verwendet. Organische Synthesen
Festphasensynthese des PSMA-Liganden (KuE-617 auf Polystyrol-Harz)
Die Synthese des Glutamat-Harnstoff-Lysin-Bindungsmotivs KuE und des Linkers des KuE-617- Liganden erfolgt gemäß etablierter Festphasen-Peptidchemie nach einem von Benesovä et al. (Benesovä, M.; Schäfer, M.; Bauder-Wüst, U.; Afshar-Oromieh, A.; Kratochwil, C.; Mier, W.; Haberkorn, U.; Kopka, K.; Eder, M. Preclinical Evaluation of a Tailor-Made DOTA-Conjugated PSMA Inhibitor with Optimized Linker Moiety for Imaging and Endoradiotherapy of Prostate Cancer. J. Nucl. Med. 2015, 56 (6), 914-920; Benesovä, M.; Bauder-Wüst, U.; Schäfer, M.; Klika, K. D.; Mier, W.; Haberkorn, U.; Kopka, K.; Eder, M. Linker Modification Strategies to Control the Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)-Targeting and Pharmacokinetic Properties of DOTA-Conjugated PSMA Inhibitors. J. Med. Chem. 2016, 59 (5), 1761-1775.) beschriebenen und geringfügig angepassten Verfahren. Bis(tert-butyl)-L-glutamat-Hydrochlorid (4,5 g, 15,21 mmol) und DIPEA (7,98 g, 10,5 ml, 61,74 mmol) werden in trockenem Dichlormethan (200 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt. Triphosgen (1,56 g, 5,26 mmol) in Dichlormethan (30 ml) werden tropfenweise über einen Zeitraum von 4,5 h zugegeben. Nach vollständiger Zugabe wird die Lösung eine weitere Stunde gerührt. Die Fmoc-Schutzgruppe von Fmoc-L-Lysin(Alloc)- Wang-Harz (1,65 g, 1,5 mMol, 0,9 mMol/g) wird entfernt, indem es in einer Piperidin/DMF- Lösung (1:1) für 15 Minuten gerührt wird, gefolgt von einem Waschschritt mit Dichlormethan. Das entschützte L-Lysin(Alloc)-Wang-Harz wird zu der zuvor hergestellten Lösung gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wird mit Dichlormethan (15 ml) gewaschen und ohne weitere Reinigung verwendet.
Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (516 mg, 0,45 mmol) und Morpholin (3,92 g, 3,92 mL, 45 mmol) werden in Dichlormethan (12 mL) gelöst und zugegeben. Die Lösung wird 24 h unter Lichtausschluss gerührt. Danach wird mit Dichlormethan (15 ml), l %iger DIPEA-Lösung in DMF (3 x 13 ml) und Natriumdiethyldithiocarbamat-Trihydratlösung (15 mg/ml) in DMF (9 x 10,5 ml x 5 Minuten) gewaschen, um das Harz-gebundene und Alloc-entschützte Glutamat-Harnstoff-Lysin-Konjugat zu erhalten. Fmoc-3-(2-Naphthyl)-L-Alanin (1,75 g, 4,00 mmol), HATU (1,52 g, 4,00 mmol), HOBt (540 mg, 4 mmol) und DIPEA (780 mg, 1,02 ml, 6,03 mmol) werden in trockenem DMF (10 ml) gelöst und zu dem Harz gegeben. Die Lösung wird über Nacht gerührt und anschließend mit DMF (10 ml) und Dichlormethan (10 ml) gewaschen. Um die Fmoc-Gruppe zu entfernen, wird das Harz in einer Piperidin/DMF-Lösung (1:1, 3 x 11 ml) für jeweils 10 Minuten gerührt und mit DMF (10 ml) und Dichlormethan (10 ml) gewaschen. Fmoc-4-Amc-OH (1,52 g, 4 mmol), HATU (1,52 g, 4 mmol), HOBt (540 mg, 4 mmol) und DIPEA (780 mg, 1,02 ml, 6,03 mmol) werden in trockenem DMF (10 ml) zu dem Harz gegeben. Die Lösung wird zwei Tage gerührt und dann mit DMF (10 ml) und Dichlormethan (10 ml) gewaschen. Um die Fmoc-Gruppe zu entfernen, wird die Reaktionslösung jeweils 10 Minuten lang in einer Piperidin/DMF-Lösung (1:1, 11 ml) gerührt und mit DMF (10 ml) und Dichlormethan (10 ml) gewaschen, um den harzgebundenen KuE-617-Liganden zu erhalten. Pamidronat-Synthese ß-Alanin (1,5 g, 0,017 Mol) und Phosphorsäure (2,76 g, 0,034 Mol) werden in Sulfolan (5,5 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt. Phosphortrichlorid (4,62 g, 2,95 ml, 0,034 mmol) werden tropfen- weise zugegeben. Die Lösung wird 3 h bei 75 °C gerührt. Wasser (15 ml) wird zugegeben und 12 h bei 100 °C gerührt. Schließlich wird Ethanol (15 ml) zugegeben und nach Kristallisation bei 0 °C für 3 Tage das Produkt Pamidronat (1,48 g, 0,006 mol, 37 %) als gelber Feststoff erhalten.
1H-NMR (300 MHz, D2O): δ [ppm] = 3,34 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,31 (tt, J = 13,7, 7,1 Hz, 2H).
13C-NMR (400 MHz, D2O): δ [ppm] = 72,58; 36,14; 30,54.
31P-NMR (121,5 MHz, D2O): δ [ppm] = 17,58 (s, 2P).
MS (ESI+): 236,0 [M+H]+, brechnet für C3HnNO7P2: 235,07 [M]+.
Synthese von Pamidronat-Quadratsäure-Ethylester
Pamidronat (500 mg, 2,13 mmol) wird in Phosphatpuffer (0,5 M, pH 7, 5 ml) gelöst. 3,4-Diethoxycyclobut-3-en-l,2-dion (Quadratsäurediethylester, SADE, 542 mg, 468 pl, 3,2 mmol) wird zugegeben und die Mischung 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Zur Kristallisation wird Ethanol (3 ml) zugegeben. Das Gemisch wird 3 Tage im Gefrierschrank stehengelassen, um die Kristallisation zu vervollständigen. Der weiße Niederschlag wird mit kaltem Ethanol gewaschen und das Produkt Pamidronat-Quadratsäure-Ethylester (0,58 g, 1,62 mol, 76 %) als weißer Feststoff erhalten.
TH-NMR (400 MHz, D2O): δ [ppm] = 4,79-4,62 (m, 2H), 3,31 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2.32-2.15 (m, 2H) 1,42 (dt, J = 11,7, 7,2 Hz, 3H).
31P-NMR (162 MHz, D2O): δ [ppm] = 17,92 (s), 2,26 (s).
MS (ESI+): 360,0 [M+H]+, 720,0 2[M+H]+, 763,0 2[M+Na]+, berechnet für C9H15NO10P2: 359,16 [M]+.
Fmoc-L-Lys(Boc)-KuE-617-Harz
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (506 mg, 0,0011 mmol), HATU (415 mg, 0,0011 mg), HOBt (146 mg, 0,0011 mmol) und DIPEA (277 pl, 211 mg, 0,00162 mmol) werden in Acetonitril (4 ml) gelöst und 30 min gerührt. Das KuE-617-Harz (300 mg, 0,0027 mmol, 0,09 mmol/g) wird zugegeben und das Gemisch einen Tag bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wird mit Acetonitril (10 ml) und Dichlormethan (10 ml) gemischt und für nachfolgende Syntheseschritte vorgehalten.
L-Lys(Boc)-KuE-617-Harz
Das Fmoc-L-Lys(Boc)-KuE-617-Harz wird eine Stunde lang in einer Mischung aus DMF und Piperidin (1:1, 6 ml) gerührt. Das von Fmoc entschützte Harz wird mit DMF (10 ml) und Dichlormethan (10 ml) gewaschen und im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
DOTA(tBu)3-L-Lys(Boc)-KuE-617-Harz
DOTA-Tris(tert-butylester) (310 mg, 0,54 pmol), HATU 308 mg, 0,00081 mmol), HOBt (110 mg, 0,00081 mmol) und DIPEA (184 pl, 140 mg, 0,0011 mmol) werden in Acetonitril gelöst (4 ml) und 30 min gerührt. L-Lys(Boc)-KuE-617-Harz (461 mg, 0,00027 mMol, 0,9 mMol/g) werden zugegeben und das Gemisch einen Tag bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wird mit Acetonitril (10 ml) und Dichlormethan (10 ml) gewaschen und im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
DOTA-L-Lys-KuE-617
DOTA(tBu)3-L-Lys(Boc)-KuE-617-Harz (536 mg, 0,00027 mmol, 0,9 mmol/g) wird 2 Stunden in einer Lösung aus TFA und Dichlormethan (1:1, 4 ml) gerührt. Die TFA/Dichlormethan-Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und das Produkt (10,6 mg, 0,0091 mmol, 4 %) nach semipräparativer HPLC-Reinigung als farbloses Pulver erhalten (Säule: LiChrospher 100 RP18 EC (250 x 10 mm) 5 p, Flussrate: 5 mL/min, H2O/MeCN + 0,1 % TFA, 25 % MeCN isokratisch, tR = 10,3 min).
MS (ESI+): 1172,5 [M+2H]+, 585,9 1/2[M+2H]+, 391,0 1/3[M+2H]+, berechnet für C55H83N11O17: 1170,33 [M]+.
DOTA-L-Lys(SA. Pam)-KuE-617
Verbindung (14) aus Schema 31 (10 mg, 0,0085 mmol) und Pamidronat-Quadratsäure- Ethylester (16 mg, 0,043 mmol) werden in Phosphatpuffer (0,5 M, pH 9, 1 ml) gelöst und 2 Tage gerührt. Das Produkt DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 (10,56 mg, 0,0071 mmol, 84 %) wird nach semipräparativer HPLC-Reinigung als farbloses Pulver erhalten (Säule: LiChrospher 100 RP18 EC (250 x 10 mm) 5 p, Flussrate: 5 ml/min, H2O/MeCN + 0,1 % TFA, 23 % bis 28 % MeCN in 20 min, tR = 8,2 min).
MS (ESI+): 511,3 1/3[M+H+2Na]+, 520,0 [1/3M+2K]+, 781,0 1/2[M+2K]+, berechnet für C62H92NI2O26P2: 1483,42 [M]+ .
Radiomarkierung von DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 mit Lutetium-177
Für die radioaktive Markierung wird [177Lu]LuCl3 in 0,04 M HCl (ITG, Garching, Deutschland) verwendet. Die radioaktive Markierung wird in 1 ml 1 M Ammoniumacetat-Puffer bei pH 5,5 durchgeführt. Reaktionen werden mit unterschiedlichen Mengen an Vorstufe (5, 10 und 30 nmol) und bei 95 °C mit 40-50 MBq n.c.a. Lutetium-177 durchgeführt. Zur Reaktionskontrolle wird Radio-Dünnschichtchromatographie (TLC Kieselgel 60 F254 von Merck) und Citratpuffer (pH 4) als mobile Phase sowie Hochdruck-Flüssigchromatographie unter Verwendung eines analytischen Instruments HPLC 7000 Hitachi LaChrom (Säule: Merck Chromolith® RP-18e, 5-95 % MeCN (+ 0,1 % TFA)/ 95-5 % Wasser (+0,1 % TFA) in 10 min) eingesetzt. Radio-Dünnschichtchromatographie-Proben werden mit dem TLC Imager CR-35 Bio Test-lmagervon Elysia-Raytest (Straubenhardt, Deutschland) mit AI DA Software gemessen und ausgewertet.
In vitro Stabilitätsuntersuchung
Stabilitätsuntersuchungen von mit 177Lu-markierten Verbindungen werden in Humanserum (HS, menschliches männliches AB-Plasma, USA-Herkunft, Sigma-Aldrich) und phosphat- gepufferter Kochsalzlösung (Sigma-Aldrich) durchgeführt. 5 MBq der radioaktiven Verbindung werden in 0,5 ml des Mediums für 14 Tage inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (1 h, 2 h, 5 h, 1 d, 2 d, 5 d, 7 d, 9 d und 14 d) werden Aliquots entnommen, um die radiochemische Stabilität zu bestimmen. Jede Messung wird dreifach durchgeführt.
Bestimmung der Lipophilie
LogD7,4-Wert der jeweiligen Verbindung werden über den Verteilungskoeffizienten in n- Octanol und PBS bestimmt. Die Markierungslösung wird auf pH 7,4 eingestellt und 5 MBq werden in 700 pl n-Octanol und 700 pl PBS verdünnt. Es wird 2 min lang bei 1500 U/min geschüttelt und anschließend zentrifugiert. 400 pl der n-Octanol-Phase und 400 pl der PBS- Phase wurden jeweils in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt. 3-6 pl werden dann auf eine TLC-Platte pipettiert und mittels Phosphor-Imager analysiert. Der LogDy/i-Wert wird anhand des Verhältnis der Aktivitäten der zwei Phasen berechnet. Die Messung jeder Phase wird zudem zwei weitere Male mit der Probe mit höherer Aktivität wiederholt, so dass drei LogD7,4-Werte erhalten und ein Mittelwert berechnet werden kann.
Messung der Hydroxyapatit-Affinität von 177Lu-markierten Verbindungen
Hydroxyapatit (20 mg) wird in Kochsalzlösung (1 ml) für 24 h inkubiert. 50 pl des Radiotracers [177Lu]Lu-DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 (5 MBq) bzw. [177Lu]Lu-PSMA-617 (5 MBq) werden zugegeben. Jede Suspension wird für 20 s mit einem Vortexmischer gerührt und l h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird jede Suspension durch einen Filter (CHROMAFIL® Xtra PTFE-45/13) geleitet und der Überstand mit Wasser (500 pl) gewaschen. Die Radioaktivität der erhaltenen Flüssigkeiten und HAP-haltigen Überstände werden jeweils mit einem Curiemeter (Aktivimeter Isomed 2010 MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH) gemessen. Die Bindung von [177Lu]Lu-DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 und [177Lu]Lu- PSMA-617 werden als Prozentsatz der an HAP absorbierten Aktivität bestimmt. Als Referenz wird die HAP-Bindung von freiem Lu-177 in analoger Weise gemessen. In analoger Weise werden Vergleichsmessungen an blockiertem Hydroxyapatit durchgeführt. Hierzu wird HAP (20 mg) in Kochsalzlösung (1 ml) mit Pamidronat (100 mg) inkubiert und jeweils die Aktivitäten von [177Lu]Lu-DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 sowie freiem Lu-177 bestimmt. In vitro Untersuchung der PSMA-Bindungsaffinität
Nichtaktive (kalte) [natLu]Lu-Komplexe werden durch Schütteln einer den Markierungsvorläufer DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 enthaltenden Lösung (371 pl, 1 mg/ml, 250 nmol) mit LuCh (129 pl, 1 mg/ml, 375 nmol, Metall-zu-Markierungsvorläufer-Verhältnis 1,5:1) in 1 M Ammoniumacetatpuffer bei 95 °C für 2 Stunden hergestellt. Die Komplexbildung wird mittels ESI-LC/MS überwacht.
Die PSMA-Bindungsaffinität wird gemäß dem von Benesovä et al. (Benesovä, M.; Schäfer, M.; Bauder-Wüst, U.; Afshar-Oromieh, A.; Kratochwil, C.; Mier, W.; Haberkorn, U.; Kopka, K.; Eder, M. Preclinical Evaluation of a Tailor-Made DOTA-Conjugated PSMA Inhibitor with Optimized Linker Moiety for Imaging and Endoradiotherapy of Prostate Cancer. J. Nucl. Med. 2015, 56 (6), 914-920.) beschriebenen kompetitiven Radioligand-Assay bestimmt. Hierzu werden PSMA-positive LNCaP-Zellen von Sigma-Aldrich in RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Thermo Fisher Scientific), 100 pg/ml Streptomycin und 100 Einheiten/ml Penicillin bei 37 °C in 5 % CO2 kultiviert. Die LNCaP-Zellen werden für 45 min mit steigenden Konzentrationen der die Markierungsvorläufer enthaltenden Lösungen in Gegenwart von 0,75 nM [68Ga]Ga-PSMA-10 inkubiert. Die freie Radioaktivität wird durch mehrere Waschschritte mit eiskaltem PBS entfernt. Die erhaltenen Proben werden in einem y-Zähler (2480 WIZARD2 Automatic Gamma Counter, PerkinElmer) gemessen. Die Messdaten werden in GraphPad Prism 9 mittels nichtlinearer Regression ausgewertet.
Ex vivo Untersuchungen
Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission des Landes Rheinland-Pfalz (gemäß §8 Abs. 1 Tierschutzgesetz, Landesuntersuchungsamt) genehmigt und gemäß den einschlägigen Bundesgesetzen und Institutsrichtlinien durchgeführt (Genehmigungs Nr. 23 177-07/G 21-1- 022). 6 bis 8 Wochen alte männliche BALB/cAnNRj (Janvier Labs) wurden subkutan mit 5xl06 LNCaP-Zellen in 200 pl 1:1 (v/v) Matrigel/PBS (Corning®) inokuliert. Die Messungen wurden durchgeführt, nachdem der Tumor ein Volumen von etwa 100 cm3 erreicht hat. Vor der intravenösen Injektion von 0,5 nmol [177Lu]Lu-DOTA-L-Lys(SA.Pam)-KuE-617 wurden die LNCaP-Tumor tragenden Mäuse mit 2 % Isofluran anästhetisiert. Die spezifische Aktivität betrug etwa 3 MBq/nmol. Die PSMA-Selektivität wurde durch Co-Injektion von 1,5 mmol PMPA je Maus untersucht. Die Tiere wurden 24 h p.i. getötet. Die Organe wurden gesammelt und gewogen. Die Radioaktivität wurde gemessen und als zerfallskorrigierter Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebemasse %l D/g berechnet.

Claims

42 Patentansprüche
1. Markierungsvorläufer zum Komplexieren von radioaktiven Isotopen mit der Struktur
TVl-Ll-Chel-L2-TV2 oder mit X = CH oder N worin
- ein erster Targetvektor TVl gewählt ist aus der Gruppe der PSMA-Inhibitoren, umfassend ein zweiter Targetvektor TV2 gewählt ist aus der Gruppe der Bisphosphonate, umfassend - ein erster Linker L1 eine Struktur aufweist, die gewählt ist aus ; ; ; ; und ; worin 43
G gleich ist;
01, 02 und 03 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-Reste, -(CH2)- , -(CH2CH2O)- , -CH2-CH(COOH)-NH- und -(CH2)qNH- mit q = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; pl, p2 und p3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Menge {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20};
- ein zweiter Linker L2 eine Struktur aufweist, die gewählt ist aus ; ; und worin RI, R2 und R3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-, Furan-, Azol-, Oxazol-, Thiophen-, Thiazol-, Azin-, Thiazin-, Naphthalin-, Chinolin-, Pyrrol-, Imidazol-, Pyrazol-, Tetrazol-, Thiadiazol-, Oxadiazol-, Pyrridin-, Pyrimidin-, Triazin-, Tetrazin-, Thiazin-, Oxazin-, Naphthalin- Chromen- oder Thiochromen-Reste, -(CH2)-, -(CH2CH2O)-, -CH2-CH(COOH)-NH- und - (CH2)qNH- mit q = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; sl, s2 und s3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Menge {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20};
- ein dritter Linker L3 eine Struktur aufweist, die gewählt ist aus ; ; und ; worin 44
TI, T2 und T3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-Reste, -(CH2)- , -(CH2CH2O)- , -CH2-CH(COOH)-NH- und -(CH2)VNH- mit v = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; u1, u2 und u3 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Menge {0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20};
- QS ein Quadratsäurerest ist; und
- ein Chelator Chel gewählt ist aus der Gruppe, umfassend FUpypa, EDTA (Ethylendiamintetraacetat), EDTMP
(Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure)), DTPA
(Diethylentriaminpentaacetat) und dessen Derivate, DOTA (Dodeca-1,4,7,10- tetraamin-tetraacetat), DOTAGA (2-(1, 4,7, 10-Tetraazacyclododecan-4, 7,10)- pentandisäure) und anderen DOTA-Derivaten, TRITA (Trideca-l,4,7,10-tetraamin- tetraacetat), TETA (Tetradeca-l,4,8,ll-tetraamin-tetraacetat) und dessen Derivate, NOTA (Nona-1,4,7-triamin-triacetat) und dessen Derivate wie beispielsweise NOTAGA (l,4,7-triazacyclononan,1-glutarsäure,4,7-acetat), TRAP
(Triazacyclononan-phosphinsäure), NOPO (1,4,7-triazacyclononan-l,4- bis[methylen(hydroxymethyl) phosphinsäure]-7-[methylen(2-carboxyethyl) phosphinsäure]), PEPA (Pentadeca-l,4,7,10,13-pentaaminpentaacetat), HEHA (Hexadeca-1,4,7,10,13,16-hexaamin-hexaacetat) und dessen Derivate, HBED (Hydroxybenzyl-ethylen-diamin) und dessen Derivate, DEDPA und dessen Derivate, wie H2DEDPA (1,2-[[6-(carboxylat-)pyridin-2-yl]methylamin]ethan), DFO (Deferoxamin) und dessen Derivate, Trishydroxypyridinon (THP) und dessen Derivate wie YM103, TEAP (Tetraazycyclodecan-phosphinsäure) und dessen Derivate, AAZTA (6-Amino-6-methylperhydro-l,4-diazepin-N,N,N',N'-tetraacetat) und Derivate wie DATA ((6-Pentansäure)-6-(amino)methyl-l,4-diazepin triacetat); SarAr (l-N-(4-aminobenzyl)-3,6,10,13,16,19-hexaazabicyclo[6.6.6]-eicosan-l,8- diamin) und Salze davon, (NH2)2SAR (l,8-diamino-3,6,10,13,16,19- hexaazabicyclo[6.6.6]icosane) und Salze und Derivate davon, Aminothiole und deren Derivate.
2. Markierungsvorläufer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelator Chel gleich DOTA, H4pypa, DATA oder DOTAGA ist.
3. Markierungsvorläufer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite
Linker L2 mindestens einen Rest umfasst, der gewählt ist aus
4. Markierungsvorläufer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Linker L2 mindestens einen Quadratsäure-Rest umfasst;
5. Markierungsvorläufer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Linker
L2 mindestens einen Rest umfasst, der gewählt ist aus
6. Markierungsvorläufer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Linker L2 mindestens einen Imidazol-Rest umfasst;
7. Markierungsvorläufer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder drei der Linker L1, L2 und L3 gleich sind.
8. Radiotracer, umfassend einen Markierungsvorläufer nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und ein radioaktives Isotop, das gewählt ist aus der Gruppe umfassend umfassend 44Sc, 47Sc, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 86Y, 90Y, 89Zr, 90Nb, 99mTc, mln, 135Sm, 140Pr, 159Gd, 149Tb, 160Tb, 161Tb, 165Er, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Pb, 213Bi, 225Ac und 232Th.
9. Radiotracer nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktive Isotop gleich 68Ga, 177Lu oder 225Ac ist.
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