EP4208560A1 - Verfahren zur enzymatischen oxidation von sulfinsäuren zu sulfonsäuren - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen oxidation von sulfinsäuren zu sulfonsäuren

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EP4208560A1
EP4208560A1 EP21742779.8A EP21742779A EP4208560A1 EP 4208560 A1 EP4208560 A1 EP 4208560A1 EP 21742779 A EP21742779 A EP 21742779A EP 4208560 A1 EP4208560 A1 EP 4208560A1
Authority
EP
European Patent Office
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acid
hypotaurine
taurine
cysteine
oxidase
Prior art date
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Pending
Application number
EP21742779.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wacker Chemie AG filed Critical Wacker Chemie AG
Publication of EP4208560A1 publication Critical patent/EP4208560A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C303/00—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides
    • C07C303/02—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides of sulfonic acids or halides thereof
    • C07C303/16—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides of sulfonic acids or halides thereof by oxidation of thiols, sulfides, hydropolysulfides, or polysulfides with formation of sulfo or halosulfonyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03013—Alcohol oxidase (1.1.3.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the invention relates to a method for the enzymatic oxidation of sulfinic acids of the formula H2N-CH(R)-CH2-SO2H to sulfonic acids of the formula H2N-CH(R)-CH2-SO3H using an enzyme selected from the class of H2O2-generating oxidases in the presence its substrate, in particular for the enzymatic oxidation of L-cysteine sulfinic acid to L-cysteic acid and of hypotaurine to taurine.
  • the salts of the sulfinic acids are the sulfinates.
  • Sulfonic acids are organic sulfur compounds with the general structure R-SO2-OH, where R is an organic radical.
  • R is an organic radical.
  • Their salts and esters with the general structure R-S020 or R1-SO2-O-R2 (Ri, R2 are each organic residues) are called sulfonates.
  • the naturally occurring sulfinic acids include, for example, L-cysteine sulfinic acid and hypotaurine.
  • Occurring sulfonic acids include, for example, L-cysteic acid and taurine.
  • Taurine (2-aminoethanesulfonic acid, CAS number 107-35-7) is an aminosulfonic acid that occurs naturally in nature as a breakdown product of the amino acids cysteine and methionine. Taurine is of economic importance, is e.g. a component of energy drinks and is also used in pet food, e.g. for cats or in fish farming (Salze and Davis, Aquaculture (2015) 437: 215-229). However, health-promoting effects are also attributed to taurine (Ripps and Shen, Molecular Vision (2012) 18: 2673-2686).
  • taurine is currently produced chemically.
  • a process from Changshu Yudong Chemical Factory is known, which starts with ethylene and leads to taurine via ethyleneimine.
  • biotechnological processes for the production of taurine are increasingly being investigated.
  • taurine occurs almost exclusively in the animal kingdom, with only a few examples of its occurrence in plants, algae or bacteria.
  • There are various biosynthetic pathways to taurine see e.g. the KEGG Pathway database: "Taurine and hypotaurine metabolism", including starting from L-cysteine.
  • the most important synthetic steps leading from L-cysteine to taurine are given in equations (1) to (5) shown.
  • L-cysteic acid -> taurine + CO2 In a first step, L-cysteine is oxidized to L-cysteine sulfinic acid (3-sulfinoalanine, CAS number 207121-48-0) by the enzyme cysteine dioxygenase (CDO, EC 1.13.11.20).
  • Cysteine sulfinate decarboxylase (CSAD, EC 4.1.1.29) decarboxylates L-cysteine sulfinic acid to hypotaurine (2-aminoethanesulphinic acid, CAS number 300-84-5) and can decarboxylate L-cysteic acid to taurine in a similar reaction.
  • hypotaurine is generally the main product. If taurine is to be the product, chemical processes for the oxidation of hypotaurine must be used.
  • hypotaurine could be chemically oxidized to taurine in cell extracts for analytical purposes by treatment with H2O2. No method has been described how hypotaurine can be converted to taurine in a non-chemical step for further use.
  • WO 17/213142 A1 (Ajinomoto) describes a taurine-producing strain which was obtained by heterologous expression of a cysteine dioxygenase and an L-cysteinesulfinic acid decarboxylase in an originally cysteine-producing strain.
  • the main product was hypotaurine with a maximum of 450 mM yield, which could only be converted to taurine by subsequent chemical-alkaline treatment and only in low yield.
  • EM01 uses the cofactors NADH or NADPH in stoichiometric amounts.
  • NADH or NADPH used in stoichiometric amounts.
  • the use of these commercially expensive cofactors makes technical use uneconomical.
  • the object of the present invention was therefore to provide an economically favorable biotechnological process for oxidizing sulfinic acids to sulfonic acids, in particular L-cysteine sulfinic acid to L-cysteic acid and hypotaurine to taurine.
  • the problem was solved by a process for the enzymatic oxidation of sulfinic acids of the formula H2N-CH(R)-CH2-SO2H to sulfonic acids of the formula H2N-CH(R)-CH2-SO3H using an enzyme selected from the class of H2O2-generating oxidases in the presence of their substrate.
  • the process is preferably characterized in that the sulfinic acid is aminoalkylsulfinic acid, particularly preferably 2-aminoalkylsulfinic acid.
  • the process is preferably characterized in that the sulfonic acid is aminoalkylsulfonic acid, particularly preferably 2-
  • Aminoalkylsulfonic acid is.
  • the sulfinic acid is particularly preferably aminoalkylsulfinic acid and the sulphonic acid is aminoalkylsulphonic acid.
  • the radical R can be any and is preferably hydrogen, an organic, linear, branched, cyclic, saturated or unsaturated, aromatic or heteroaromatic radical, with or without substituents. This means that the radicals R can be substituted or unsubstituted.
  • Saturated or unsaturated radicals with C 1 -C 4 -, particularly preferably C 1 -C 4 -alkyl, vinyl, in particular methyl or ethyl, in particular methyl, are preferably used deployed.
  • the invention thus also relates to the enzymatic oxidation of L-cysteine sulfinic acid to L-cysteic acid and of hypotaurine to taurine as a process step in a biotechnological production of taurine.
  • the substrate of the enzyme selected from the class of H 2 O 2 -generating oxidases means the substance that can be oxidized by the oxidase.
  • the oxidase reacts with its oxidizable substrate according to formula (7).
  • Suitable H 2 O 2 -generating oxidases can be found in the "KEGG Enzyme” database under the search term "oxidase” as a subset of the enzymes listed there. Of the large number of H2O2-generating oxidases, however, only those oxidases that use an inexpensive substrate to generate H2O2 by oxidizing it according to Equation (7) are of interest for process engineering use.
  • H 2 0 2 -generating oxidases examples include glucose oxidase (EC 1.1.3.4), hexose oxidase (EC 1.1.3.5), alcohol oxidase (EC 1.1.3.13), secondary alcohol oxidase (EC 1.1.3.18), pyranose oxidase ( EC 1.1.3.10), L-lactate oxidase (EC 1.1.3.2), aryl alcohol oxidase (EC 1.1.3.7), galactose oxidase (EC 1.1.3.4), glucose oxidase (EC 1.1.3.4), hexose oxidase (EC 1.1.3.5), alcohol oxidase (EC 1.1.3.13), secondary alcohol oxidase (EC 1.1.3.18), pyranose oxidase ( EC 1.1.3.10), L-lactate oxidase (EC 1.1.3.2), aryl alcohol oxidase (EC 1.1.3.7), galactose oxidas
  • H 2 0 2 - generating oxidases are glucose oxidase (EC 1.1.3.4), hexose oxidase (EC 1.1.3.5), alcohol oxidase (EC 1.1.3.13), secondary alcohol oxidase (EC 1.1.3.18), pyranose oxidase (EC 1.1.3.10), L-lactate oxidase (EC 1.1.3.4), glucose oxidase (EC 1.1.3.4), hexose oxidase (EC 1.1.3.5), alcohol oxidase (EC 1.1.3.13), secondary alcohol oxidase (EC 1.1.3.18), pyranose oxidase (EC 1.1.3.10), L-lactate oxidase (EC
  • the method according to the invention is preferably characterized in that the combination of H2O2-generating oxidase and its oxidizable substrate is selected from glucose oxidase/glucose,
  • alcohol oxidase/methanol1 alcohol oxidase/ethanol
  • secondary alcohol oxidase/isopropanol secondary alcohol oxidase/isopropanol
  • L-lactate oxidase/lactate L-lactate oxidase/lactate
  • the method is characterized in that the H 2 O 2 -generating oxidase is alcohol oxidase and a primary alcohol, particularly preferably methanol, is present as the substrate.
  • a primary alcohol particularly preferably methanol
  • the H 2 O 2 -generating oxidase is an enzyme of the alcohol oxidase class EC 1.1.3.13 of the KEGG database.
  • Alcohols are compounds of the general formula R-OH with one or more hydroxy groups that do not have a functional group with a higher priority. A distinction is made between alcohols according to the number of C and H atoms on the C atom of the functional group to which the hydroxyl group is also attached. In the case of primary alcohols, two H atoms are bonded to this C atom in addition to one C atom, so that the general Formula RCH2OH results. In addition, a primary alcohol becomes an aldehyde through oxidation. For example, ethanol becomes the aldehyde ethanal by splitting off 2 H atoms.
  • Preferred primary alcohols include methanol and ethanol, most preferably the primary alcohol is methanol.
  • R is an alkyl, alkenyl or alkynyl radical, but not an aryl radical, an acyl radical or a heteroatom.
  • the method is characterized in that the H2O2-generating oxidase is glucose oxidase and glucose is present as the substrate.
  • the H 2 O 2 -generating oxidase is an enzyme of the class EC 1.1.3.4 of the KEGG database, referred to as glucose oxidase.
  • a prerequisite for the technical implementation of the process is the availability of the H 2 O 2 -generating oxidase and an inexpensive oxidizable substrate.
  • H 2 O 2 -generating oxidases can be produced, for example, by cultivating a suitable production strain which naturally produces the relevant oxidase (homologous production) or as a result of expression of a suitable recombinant gene construct in a host organism (heterologous production).
  • suitable production strain which naturally produces the relevant oxidase
  • heterologous production or as a result of expression of a suitable recombinant gene construct in a host organism (heterologous production).
  • various H2O2-generating oxidases are commercially available, which can have a positive effect on the economics of the process.
  • oxidases examples include alcohol oxidase AOX from the yeast Pichia pastoris (available, for example, from Sigma-Aldrich) or glucose oxidase GOX from the fungus Aspergillus niger (available, for example, from Sigma-Aldrich from homologous and heterologous production).
  • glucose oxidase is the enzyme sold under the trade name Gluzyme® (Novozymes) for Applications eg in the baking industry. It is preferred that the tbC ⁇ -generating oxidase is produced by fermentation.
  • the substrate of the H2O2-generating oxidase is decisive for the economics of the process.
  • the substrate is a primary alcohol, preferably selected from methanol or ethanol.
  • the AOX enzyme generates H2O2 with methanol after reaction (9):
  • the substrate is D-glucose.
  • the GOX enzyme generates H2O2 with D-glucose after reaction (10):
  • a process within the meaning of the invention is defined as a multi-stage sequence of work steps where, in one or more consecutive reaction batches, a starting material is converted into the product via the intermediate products determined by the reaction conditions in a predefined order.
  • a biotechnological process within the meaning of the invention is defined as the use of enzymes, cells or whole organisms in technical applications for the production of chemical compounds, such as the production of taurine from hypotaurine using a glucose oxidase.
  • chemical processes there are processes that are characterized by chemical process steps.
  • a batch or reaction batch is defined as a mixture of educt (starting material), enzyme and possibly other reactants, in which the educt is converted into a product under defined conditions.
  • An approach or reaction approach of The present invention comprises at least one sulfinic acid of the formula H 2 N—CH(R)—CH 2 —SO 2 H, at least one enzyme selected from the class of fhCh-generating oxidases, the substrate that can be oxidized by the oxidase, and atmospheric oxygen O 2 .
  • Biotransformation is defined as the conversion of an educt into the product under enzymatic catalysis.
  • the method according to the invention is a biotransformation.
  • the yield of the reaction can be given as a volume yield in absolute volume-related amount of product (mM or g/L) or as a relative yield of product in percent of the starting material used (taking into account the molecular weights of the starting material and the product), also called as percentage yield.
  • the molar yield denotes the total molar amount of sulfonic acid of the formula H 2 N—CH(R)—CH 2 —SO 3 H after enzymatic oxidation by an H 2 O 2 -generating oxidase in the presence their substrate in relation to the sum of the molar amounts of sulfinic acid of the formula H 2 N-CH (R)-CH 2 -SO 2 H and sulfonic acid of the formula H 2 N-CH (R)-CH 2 -S0 3 used in this reaction H.
  • Fermentation is a process step for the production of cell cultures in which a microbial production strain is made to grow under defined conditions of culture medium, temperature, pH, oxygen supply and medium mixing.
  • the aim of fermentation is to produce a protein/enzyme and/or a metabolite, each with the highest possible yield, for further use in a process.
  • the enzyme activity is given in U/ml, 1 U/ml being defined as the conversion of 1 pmol substrate/min in 1 ml test mixture under test conditions.
  • the area of the DNA or RNA that begins with a start codon and ends with a stop codon and codes for the amino acid sequence of a protein is called the open reading frame (ORF, synonymous with cds, coding sequence).
  • the ORF is also referred to as the coding region or structural gene.
  • the DNA section that contains all the basic information for the production of a biologically active RNA is referred to as a gene or expression unit.
  • a gene contains the DNA section from which a single-stranded RNA copy is produced by transcription and the expression signals that are involved in the regulation of this copying process.
  • the expression signals include, for example, at least one promoter, a transcription start, a translation start and a ribosome binding site. Furthermore, a terminator and one or more operators are possible as expression signals.
  • mRNA also known as messenger RNA or messenger RNA
  • messenger RNA is a single-stranded ribonucleic acid (RNA) that carries the genetic information for the construction of a protein.
  • RNA ribonucleic acid
  • An mRNA provides the building instructions for a specific protein in a cell.
  • the mRNA molecule carries the message from the genetic information (DNA) necessary for protein construction to the protein-constructing ribosomes.
  • DNA genetic information
  • a cell it is formed as a transcript of a section of DNA belonging to a gene. The genetic information stored in the DNA is not changed in the process.
  • mRNA messenger RNA
  • the coding region of the mature mRNA is then translated into the protein sequence
  • Eukaryotic gene with exon/intron structure are expressed in prokaryotic organisms, since the processing of the exon/intron structure does not take place in prokaryotes, it is necessary to retranslate the protein sequence or the coding region of the mature mRNA into intron-free DNA from the protein sequence or the mRNA derived gene sequences, exactly this process of reverse translation is meant.It is preferred that simultaneously with the reverse translation of the mRNA sequence into DNA sequence, a sequence optimization, ie adaptation to the codon usage of the corresponding prokaryote takes place (codon optimization).
  • An operon is defined as a superordinate expression unit in which several genes are transcribed under the control of only one promoter, but each is translated from its own ribosome binding site.
  • a gene construct is a circular DNA molecule (plasmid, vector) in which at least one gene is linked to other genetic elements (eg promoter, ribosome binding site (RBS), terminator, selection marker, origin of replication).
  • the genetic elements of the gene construct cause its extrachromosomal inheritance during cell growth and the production of the protein encoded by the gene.
  • tbC ⁇ -generating oxidases in combination with their oxidizable substrate are suitable for oxidizing sulfinic acids such as L-cysteine sulfinic acid and hypotaurine to the corresponding sulfonic acids L-cysteic acid and taurine, respectively. This observation was new and surprising.
  • H2O2 is basically suitable for the oxidation of sulfinic acids to sulfonic acids.
  • H2O2 must be used in at least stoichiometric amounts according to equation (8), so that correspondingly large amounts of H2O2 are required to produce larger amounts of a sulfonic acid.
  • H 2 O 2 -generating oxidases have been known for a long time, it was therefore not possible for the person skilled in the art to foresee whether the amount of H2O2 formed from the alcohol oxidase reaction or the glucose oxidase reaction is sufficient to oxidize larger amounts of sulfinic acids.
  • the method according to the invention therefore not only has the advantage that it is a biotechnological method, but also that it can be implemented on an industrial scale and it is an economically favorable method since it does not require expensive cofactors.
  • hypotaurine in a concentration of 20 g/l relevant for chemical synthesis was surprisingly oxidized almost quantitatively to taurine by glucose oxidase/glucose.
  • the invention thus provides a biotechnological process which is suitable for the ever increasing demand for the sustainable production of sulfonic acids such as taurine, avoiding chemical synthesis steps, for use in the food, feed or pharmaceutical sectors.
  • the method is preferably characterized in that the sulfinic acid is 2-aminoethanesulphinic acid (hypotaurine) and the sulphonic acid formed is 2-aminoethanesulphonic acid (taurine).
  • the enzymatic process according to the invention for the oxidation of a sulfinic acid to the sulfonic acid is preferably carried out at a temperature of 15°C to 80°C, particularly preferably from 20°C to 60°C and particularly preferably from 25°C to 50°C.
  • the pH at which the method according to the invention can be carried out depends on the enzymatic properties of the H 2 O 2 -generating oxidase. As described in the examples, the reaction of the alcohol oxidase was carried out at pH 7.5 and that of the glucose oxidase at pH 5.5.
  • the pH range at which the reaction is preferably carried out is pH 3.0 to pH 8.5, more preferably pH 4.0 to pH 8.0 and most preferably pH 4.5 to pH 7.5.
  • the process according to the invention is carried out with the supply of atmospheric oxygen, either by passive input, as occurs by mixing the reaction mixture, e.g. on an incubation shaker, or by active input, as occurs by gassing with compressed air.
  • the dosage of the H 2 0 2 -generating oxidase in the method according to the invention determines, in addition to parameters such as temperature, pH and oxygenation, the conversion of the reaction and is chosen so that the reaction can be carried out with the lowest possible dosage of H 2 0 2 -generating oxidase in the shortest possible time he follows.
  • the dosage of the H 2 O 2 -generating oxidase such as glucose oxidase is preferably 1 U/ml to 200 U/ml, particularly preferably 2 U/ml to 150 U/ml and particularly preferably 4 U/ml to 100 U/ml.
  • the substrate which can be oxidized by the PhC ⁇ -generating oxidase is preferably used in the process according to the invention in at least an equimolar amount, based on the molar content of the sulfinic acid (molar ratio
  • sulfinic acid:oxidizable substrate preferably at least 1:1).
  • a molar ratio of sulfinic acid:oxidizable substrate of at least 1:2 and particularly preferably of at least 1:5 is particularly preferred.
  • the reaction time depends on the dosage of the H2O2-generating oxidase and is preferably a maximum of 72 hours, particularly preferably a maximum of 48 hours and particularly preferably a maximum of 24 hours.
  • Water is preferably used as the solvent for the reaction.
  • the concentration of the sulfinic acid in the batch is preferably at least 1 g/l, particularly preferably at least 10 g/l and particularly preferably at least 20 g/l.
  • the molar conversion of sulfinic acid to sulfonic acid in the biotransformation according to the invention is preferably at least 60%, particularly preferably at least 80% and particularly preferably at least 90%.
  • the process according to the invention for the oxidation of sulfinic acids can be operated in a batch or continuous manner.
  • discontinuous operation batch operation
  • all reactants are added to the batch in the course of the reaction and the batch is worked up after the reaction has ended.
  • the oxidase enzyme is presented as a stationary phase, for example in a membrane reactor or immobilized on a carrier and brought the substrates comprising a sulfinic acid and a substrate oxidizable by the ThCh-generating oxidase as mobile phase with the stationary phase in contact.
  • the contact time of the mobile phase with the stationary phase is preferably set so that the sulfinic acid can react to form the sulfonic acid product.
  • the sulfonic acid from the enzymatic oxidation according to the invention can either be used further directly without further work-up steps or can be enriched or purified by means of known methods. The degree of enrichment depends on further use.
  • the process is characterized in that the sulfonic acid, particularly preferably taurine, is isolated from the reaction mixture.
  • Methods for isolating sulfonic acids, in particular taurine are known to those skilled in the art from methods for isolating, for example, amino acids. They include, for example, filtration, centrifugation, extraction, adsorption, ion exchange chromatography, precipitation, crystallization.
  • the process according to the invention reveals a new and unexpected route for the enzymatic oxidation of sulfinic acids to the corresponding sulfonic acids and is particularly suitable for the biotechnological production of L-cysteic acid and taurine.
  • the content of sulfinic acid (educt) and sulfonic acid (product) is determined at the beginning, at various times during the reaction and at the end of the reaction in order to monitor the progress of the reaction.
  • the content of a solution or cell culture of sulfinic acid of the formula H 2 N-CH (R)-CH 2 - SO2H such as the hypotaurine content or the content of sulfonic acids of the formula H2N-CH (R)-CH2-SO3H such as the taurine content can be determined as follows:
  • the content can be quantified directly from an aliquot of the batch, provided the concentration of the sulfinic acid starting material at the beginning of the reaction is at least 0.1 g/L, corresponding to an equivalent concentration of the sulphonic acid product at the end of the reaction with complete conversion, determined e.g. by HPLC.
  • concentration of the sulfinic acid starting material at the beginning of the reaction is at least 0.1 g/L, corresponding to an equivalent concentration of the sulphonic acid product at the end of the reaction with complete conversion, determined e.g. by HPLC.
  • an aliquot of 1 ml is taken from the mixture, incubated for 5 min at 80 °C, then all solid components are separated off, for example by centrifuging for 5 minutes at maximum speed in a table centrifuge, and the supernatant is quantified by HPLC calibrated for the sulfinic acid or sulfonic acid in question, as e.g. described in example 1 for hypotaurine and taurine.
  • the sample can be concentrated beforehand to increase the measurement accuracy for both the sulfinic acid educt and the sulfonic acid product, e.g. by evaporating the sample and redissolving it in an appropriate volume of H2O (e.g. 10% of the sample volume, corresponding to a 10-fold concentration).
  • an appropriate volume of H2O e.g. 10% of the sample volume, corresponding to a 10-fold concentration
  • a culture broth containing sulfinic acid is used in the method according to the invention, it can be used directly in the quantification. Alternatively, it is also possible first to remove the cells from the culture broth, for example by centrifugation or filtration, and to use the resulting sulfinic acid-containing cell culture supernatant in the method according to the invention. It is also possible to isolate the sulfinic acid from the cell culture supernatant by means of methods known per se and to use the purified sulfinic acid in the process according to the invention. The following biotransformation assay can be used to demonstrate the method according to the invention and to determine the conversion:
  • the solution or culture containing sulfinic acid such as culture broth containing hypotaurine, preferably fermenter broth, or the corresponding cell culture supernatant, the purified or commercially available sulfinic acid, such as hypotaurine, is used to produce a biotransformation approach.
  • the biotransformation batch on a laboratory scale has a batch volume of 10 ml and contains at least 0.1 g/L sulfinic acid (as described above from the culture/culture broth/fermenter broth, the centrifuged culture supernatant or as a purified substance and quantified accordingly or as a commercial product dosed accordingly).
  • the batch volume can also be higher depending on the production scale and is e.g. at least 1 L on the preparative scale.
  • the H2O2-generating oxidase preferably AOX or GOX
  • the substrate that can be oxidized by this oxidase are added so that the dosage of the enzyme activity is at least 1 U/ ml.
  • AOX at least 1% (v/v) methanol, i.e. at least 0.1 ml per 10 ml reaction mixture, is added as the substrate of the AOX enzyme.
  • a substrate of the GOX enzyme glucose is added to the reaction mixture in a dosage of at least 10 g/L.
  • the biotransformation batch is supplied with atmospheric oxygen, either passively by mixing, e.g. on an incubation shaker or with a stirrer, in each case with access to air, or actively by introducing compressed air or pure oxygen with and without mixing.
  • the pH of the reaction is 7.5 if AOX is used.
  • the pH of the reaction is 5.5 if GOX is used.
  • the pH of the batch can be kept constant by, for example, equipping it with a pH electrode which is connected to a pH control unit which doses a correction agent (lye or acid) from a burette (the so-called pH stat method).
  • the reaction temperature is 25°C (AOX) or 30°C (GOX).
  • the progress of the reaction can be increased by consuming the Starting material hypotaurine and formation of the product taurine can be monitored, with the quantitative determination of hypotaurine and taurine being able to be carried out, for example, by HPLC.
  • the time at which the reaction ends is chosen according to the progress of the reaction.
  • the end of the reaction is preferably selected when the molar yield of sulfonic acid of the formula H2N-CH(R)-CH2-SO3H, such as taurine, is at least 60%, particularly preferably at least 80% and particularly preferably at least 90%.
  • the sulfonic acid of the formula H2N-CH(R)-CH2-SO3H formed in the reaction mixture is then available for further use.
  • Sulfinic acids can originate from chemical or fermentative production, it being preferred that the sulfinic acid used in the process according to the invention originates from fermentative production.
  • the method is particularly preferably characterized in that the sulfinic acid is hypotaurine and this originates from fermentative production.
  • the sulfinic acids of the formula H2N-CH(R)-CH2-SO2H such as hypotaurine come from fermentative production and a sulfonic acid of the formula H2N-CH(R)-CH2-SO3H such as taurine is formed from this in the process according to the invention, the great advantage that by means of the present invention, a biotechnological process for the production of sulfonic acids of the formula H2N-CH (R) -CH2-SO3H such as taurine is made available. This method does not require any chemical reaction steps.
  • Bacterial strains eg E. coli, Corynebacterium glutamicum, Pantoea ananatis, Bacillus subtillis), algae (eg Chlamydomonas reinhardtii), yeasts are suitable for the production of sulfinic acids of the formula H 2 N-CH(R)-CH 2 -SO 2 H such as hypotaurine (e.g. Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia llpolytlca) or fungi (e.g. Aspergillus niger).
  • hypotaurine e.g. Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia llpolytlca
  • fungi e.g. Aspergillus niger
  • a microorganism strain suitable for hypotaurine production is used.
  • a microorganism strain suitable for hypotaurine production is characterized in that it contains a metabolic pathway that leads to hypotaurine according to one of the metabolic pathways specified in the KEGG Pathway database "Taurine and hypotaurine metabolism". Since the biosynthesis of hypotaurine according to equations (1) and (3 ) starts from L-cysteine, a microorganism strain is preferred which is also suitable for cysteine production.As described, for example, by Wada and Takagi, Appl.Microbiol.Biotechnol.(2006) 73: 48-54, cysteine production is in a wild-type microorganism strictly regulated, so that a microorganism strain with a regulated cysteine biosynthetic pathway, as documented in the prior art, is not suitable for the production of economically usable amounts of hypotaurine.
  • a microorganism strain with a deregulated cysteine biosynthetic pathway and thus suitable for cysteine production is characterized in that it has at least one of the following changes: a) The microorganism strain is characterized by a modified serA gene, coding for a 3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA ) with a feedback inhibition by L-serine that is reduced by a factor of at least two compared to the corresponding wild-type enzyme (as described, for example, in EP 1950 287 B1), it being possible for the SerA enzyme activity to be determined photometrically, for example, by the SerA substrate 3- Phosphohydroxypyruvate dependent oxidation of NADH as described by McKitrick and Pizer, J. Bacteriol. (1980) 141:235-245.
  • SerA enzyme activity to be determined photometrically, for example, by the SerA substrate 3- Phosphohydroxypyruvate dependent oxidation of NADH as described by McKitrick and Pizer, J. Bacteriol.
  • 3-phosphoglycerate dehydrogenase have a factor of at least 5 compared to the corresponding wild-type enzyme, in particular feedback inhibition by L-serine is preferably reduced by a factor of at least 10 and in an additionally preferred embodiment by a factor of at least 50.
  • the microorganism strain contains an altered cysE gene, coding for a serine-O-acetyl-transferase (CysE), which has feedback inhibition by cysteine that is reduced by a factor of at least two compared to the corresponding wild-type enzyme (such as described for example in EP 0858 510 B1 or Nakamori et al., Appl Env Microbiol (1998) 64: 1607-1611), where the CysE enzyme activity can be determined photometrically, for example, by the consumption of the CysE substrate acetyl-CoA as a result the reaction with L-serine to O-acetyl-L-serine as described, for example, by Nakamori et al., Appl.
  • CysE serine-O-acetyl-transferase
  • cysE serine-O-acetyltransferase
  • the microorganism strain has a cysteine export from the cell which is increased by a factor of at least two by overexpression of an efflux gene compared to the corresponding wild-type cell, it being possible for the cysteine export to be determined by photometric measurement of the extracellular cysteine content Gaitonde, Biochem. J.
  • an efflux gene preferably leads to a cysteine export from the cell that is increased by a factor of at least 5, particularly preferably by a factor of at least 10, particularly preferably by a factor of at least 20, compared to a wild-type cell.
  • the efflux gene preferably comes from the group ydeD (see EP 0885 962 B1), yfiK (see EP 1382 684 B1), cydDC (see WO 2004/113373 A1), bcr (see US 2005-221453 AA) and emrAB (see US 2005 -221453 AA) from E. coli or the corresponding homologous gene from another microorganism.
  • the microorganism strain suitable for hypotaurine production is used according to the prior art, preferably by fermentation, for the production of hypotaurine.
  • a hypotaurine-containing culture broth is produced, preferably fermenter broth.
  • the content of hypotaurine and possibly taurine as a by-product can be quantified from the culture broth.
  • an aliquot of 1 ml is taken from the culture broth with a cell density OD 6 oo/nil of at least 1.0/ml, incubated for 5 min at 80° C., then all solid components are separated off, for example by centrifuging for 5 minutes at maximum speed in a table centrifuge and the supernatant quantitated by HPLC calibrated for hypotaurine and taurine, eg as described in example 1 for hypotaurine and taurine.
  • isotope analysis to determine whether a substance such as hypotaurine, which he wants to use as sulfinic acid in the process, comes from chemical or fermentative production.
  • a method of isotope analysis suitable for differentiation is, for example, in Sieper et al., Rapid Commun. mass spectrum. (2006) 20: 2521-2527 and is based on the determination of the isotope ratios for eg C or N, which are different depending on whether a product comes from chemical (petroleum-based) or natural (plant-based) production.
  • the method described in Example 5 for the production of hypotaurine is one of the methods of natural (plant-based) production, since the Cultivation of the production strain used glucose came from plant production according to the prior art.
  • homologous genes, proteins or homologous sequences mean that the DNA or amino acid sequences of these genes, DNA sections or proteins are at least 70%, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90% identical.
  • the degree of DNA identity is determined by the "nucleotide blast” program found at http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, which is based on the blastn algorithm.
  • algorithm parameters for an alignment of two or more nucleotide sequences the default parameters were used.
  • the method is characterized in that the sulfinic acid is hypotaurine is and this hypotaurine comes from bacterial production, ie was produced with the help of a bacterial production strain.
  • the bacterial production strain is preferably a strain of the species Escherichia coli.
  • the preferred bacterial production strain is also characterized in that it is suitable for cysteine production.
  • Strains suitable and preferred for cysteine production are the E. coli K12 W3110 x pCys and E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys strains disclosed in the examples.
  • Example 5 of the present invention heterologous expression of a CDO gene encoding a cysteine dioxygenase and a CSAD gene encoding a cysteine sulfinic acid decarboxylase in the W3110 x pCys-derived strain W3110 x pCys-CDOrn- CSADhs as well as in the strain W3110-ppsA-MHI x pCys derived from W3110-ppsA-MHI x pCys for the production of hypotaurine and only little taurine is formed.
  • a microorganism strain designated ppsA-MHI is characterized in that it lacks the coding sequence of the wt-ppsA gene and has replaced this with the ppsA-MHI cds, SEQ ID NO: 9, encoding a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 10.
  • ppsA designates the gene encoding a protein with the enzyme activity of the enzyme class designated in the KEGG database with the number EC 2.7.9.2.
  • the corresponding protein is also referred to as PpsA or as phosphoenolpyruvate synthase (PEP synthase) or synonymously as phosphoenolpyruvate-H 2 O-dikinase.
  • the enzyme class is defined as being able to produce pyruvate from phosphoenolpyruvate in a reversible reaction according to the formula:
  • H2O2-generating oxidases in the hypotaurine production strain.
  • Genes for suitable H2O2-generating oxidases can be identified in databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • glucose oxidase heterologously produced in E. coli is the GOX gene from Penicillium amagasakiense (Witt et al., App. Environ. Microbiol (1998) 64: 1405-1411).
  • a biotechnological process for the production of taurine is preferred in which hypotaurine is produced in a first step by growing a production strain and in a second step the hypotaurine formed is oxidized enzymatically to taurine without further processing, the enzymatic oxidation of hypotaurine to taurine by glucose oxidase /D-glucose is particularly preferred.
  • the examples of the present invention disclose the biotechnological production of hypotaurine (example 5) and its enzymatic oxidation to taurine (example 6).
  • the method is characterized in that the sulfinic acid is hypotaurine and this hypotaurine originates from bacterial production, ie was produced using a bacterial production strain which has a deregulated cysteine biosynthetic pathway.
  • the definition given above applies for the microorganism strain with deregulated cysteine biosynthetic pathway.
  • Cysteine is particularly preferably produced first, which according to equation (1) is further converted by the CDO enzyme contained in the production strain to cysteine sulfinic acid (CDO reaction) and according to equation (3) by the CSAD enzyme also contained in the production strain to hypotaurine (CSAD -Reaction) reacts.
  • the method is particularly preferably characterized in that the sulfinic acid is hypotaurine produced by means of a bacterial production strain and the production strain is one of the strains E. coli K12 W3110 x pCYS-CDOrn-CSADhs or E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCYS-CDOrn-CSADhs, particularly preferably the strain E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCYS-CDOrn-CSADhs.
  • the invention thus also shows production strains for the biotechnological production of hypotaurine.
  • a particularly preferred starting strain is one of the E. coli K 12 W3110 x pCys E. coli K 12 W3110-ppsA-MHI x pCys strains suitable for cysteine production.
  • the vector pCys (Fig. 1) was modified to incorporate the genes for cysteine dioxygenase from Rattus norvegicus (CDOrn),
  • SEQ ID NO: 1 coding for a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 and for L-cysteinesulfinic acid decarboxylase from Homo sapiens (CSADhs), SEQ ID NO: 3, nt 1 to nt 1509, coding for a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 expanded.
  • the vector pCys-CDOrn-CSADhs suitable for hypotaurine production was created (FIG. 2).
  • the CDO gene used is not limited to the Rattus norvegicus species. Any CDO gene is suitable, its gene product (protein) derived from the mRNA according to Equation (1) capable of oxidizing L-cysteine to L-cysteine sulfinic acid. Such proteins can be found, for example, in the NCBI database if you search for CDO proteins in the "protein" sub-database using the search term "cysteine dioxygenase".
  • CDO proteins known from the prior art and not limited to these are preferably the CDO protein from Homo sapiens (human), Cyprinus carpio (carp) or Synechococcus (alga) or a protein with a 70% homologous amino acid sequence, especially preferably a protein with an 80% homologous amino acid sequence and particularly preferably the amino acid sequence of the CDO protein has the sequence given in SEQ ID NO: 2 and is encoded by the DNA sequence given in SEQ ID NO: 1.
  • the CSAD gene used is not limited to the species Homo sapiens. Any CSAD gene is suitable whose gene product (protein) derived from the mRNA according to equation (3) is suitable for decarboxylating L-cysteine sulfinic acid to hypotaurine. Such proteins can be found, for example, in the NCBI database by searching for CSAD proteins in the "protein" sub-database using the search term "cysteine sulfinic acid decarboxylase". Further CSAD proteins known from the prior art and not limited to these are preferably the CSAD protein from Rattus norvegicus (rat), Cyprinus carpio (carp), Synechococcus (algae) or E.
  • Amino acid sequence, particularly preferably a protein with an 80% homologous amino acid sequence thereto and particularly preferably the amino acid sequence of the CSAD protein has the sequence given in SEQ ID NO: 4 and is encoded by the DNA given in SEQ ID NO: 3 of nt 1-1509 -Sequence.
  • a gene construct containing the CDO and CSAD gene such as particularly preferably the construct pCys-CDOrn-CSADhs can according to the prior art using recombinant DNA techniques known to those skilled in the art, as described in detail in Example 4, for example.
  • a CDO gene which codes for cysteine dioxygenase
  • a CSAD gene which codes for a cysteine sulfinic acid decarboxylase
  • the CDO and CSAD gene can each be cloned into the vector with its own promoter and possibly terminator as independent expression units or else, in any order, as an operon under the control of only one promoter will. Also possible is an operon structure in which the CDO and CSAD genes, each with their own ribosome binding site, are cloned behind one of the genes already present on the vector and are expressed under the control of the promoter of the relevant gene. In addition, all other conceivable combinations of expression under its own promoter and as an operon are possible for the CDO and the CSAD gene.
  • CDO and CSAD gene as separate expression units independently of the vector ensuring deregulated cysteine biosynthesis, such as pCys, into a separate vector, or to integrate them into the genome of a host organism such as E. coli.
  • the vector is particularly preferably pCys-CDOrn-CSADhs, in which the CDO and the CSAD gene are behind the in pCys contained serA317 gene are cloned so that their expression takes place under the control of the serA317 promoter according to a sequence of expression units: serA promoter->(serA317-cds)->RBS-(CDOrn-cds)->RBS-(CSADhs- cds)-rrnB terminator .
  • a configuration of the expression units in which the CSAD cds is arranged in front of the CDO cds is also possible.
  • pCys-CDOrn-CSADhs is also characterized by the fact that it ensures deregulated cysteine biosynthesis by expressing expression units for the feedback-resistant variant serA317 of 3-phosphoglycerate dehydrogenase (serA gene), the feedback-resistant variant CysEX of serine -O- acetyl transferase (cysE gene) and the ydeD gene of a cysteine efflux protein.
  • the invention relates to vectors which contain at least one, preferably two and particularly preferably three of the genes serA317, cysEX or ydeD, it being possible for the genes concerned to be contained in any selection and sequence on the vector.
  • CDO and CSAD have been cloned into a vector, this is then transformed into a suitable host strain in a known manner.
  • a suitable host strain Any microorganism that is accessible to recombinant DNA techniques and that is suitable for the fermentative production of recombinant proteins is suitable as a host strain.
  • the preferred host strain is a strain of the species Escherichia coli, particularly preferably the strain E. coli K12 W3110 or E. coli K12 W3110-ppsA-MHI.
  • strains obtained from the transformation are suitable for the production of hypotaurine, as described in Example 5.
  • the production of hypotaurine using particularly preferably one of the strains E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs or E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs can be done by cultivation in shake flasks (as described in example 5) or on a production scale by fermentation of the strain.
  • the hypotaurine formed is converted to taurine by enzymatic oxidation.
  • the hypotaurine-containing cell culture is incubated with an H 2 O 2 -generating oxidase in the presence of its substrate, such as, for example, with a glucose oxidase in the presence of glucose (see Example 6).
  • the method is characterized in that the sulfinic acid is cysteine sulfinic acid and the resulting sulphonic acid is cysteic acid.
  • the process is preferably characterized in that the molar yield of sulphonic acids of the formula H 2 N-CH(R)-CH 2 -SO 3 H based on the additive molar concentration of sulfinic acids of the formula H 2 N-CH(R)- used CH 2 -SO 2 H and sulfonic acids of the formula H 2 N-CH(R)-CH 2 -SO 3 H is at least 60%, more preferably at least 80% and most preferably at least 90%.
  • the amount of sulfinic acid used is preferably at least 1 mM (109.2 mg/L), particularly preferably at least 10 mM (1.1 g/L) and particularly preferably at least 100 mM (10.9 g/L).
  • the molar content of the sulfinic and sulfonic acids used in the enzymatic oxidation is determined at the beginning and at the end of the reaction by means of HPLC, as is known in the prior art. For example, the determination can be carried out as described in Example 1, taking into account the molecular weights 109.2 g/mol for hypotaurine and 125.2 g/mol for taurine.
  • the molar content of sulfonic acid in the batch at the end of the reaction in relation to the total molar content of sulfinic acid and sulfonic acid at the beginning of the reaction gives the molar yield of the sulfonic acid expressed as a percentage.
  • Figure 1 pCys.
  • bla gene conferring resistance to ampicillin
  • kanR gene conferring resistance to kanamycin araC: araC gene (repressor gene)
  • P araC promoter of the araC gene
  • P araB promoter of the araB gene
  • Bet Lambda Phage Bet recombination gene
  • RepA plasmid replication protein
  • gene sacB levansucrase gene
  • pr-f primer binding site f
  • pr-r primer binding site r
  • OriC origin of replication C
  • TetR gene conferring resistance to tetracycline
  • serA317 serA (3-phosphoglycerate dehydrogenase gene coding for amino acids 1 to 317)
  • cds cysE X cysE (serine O-acetyltransferase gene, feedback resistant) eds
  • ORF306 ydeD (cysteine efflux gene) eds Seal: restriction enzyme site Seal PpuMI: restriction enzyme site PpuMI CDOrn: CDO (cysteine dioxygenase) R. norvegicus eds CSADhs: CSAD (cysteine sulfinic acid decarboxylase) H. sapiens eds
  • RBS ribosome binding site
  • Example 1 Oxidation of hypotaurine and cysteine sulfinic acid with alcohol oxidase (AOX)
  • the second batch without AOX received 30 mM 100 mM Na phosphate, pH 7.5.
  • the batches were shaken at 25° C. and 140 rpm (Infors chest shaker).
  • 1 ml of each batch was removed, incubated for 5 min at 80° C., centrifuged for 5 min at 13000 rpm (HeraeusTM FrescoTM 21 centrifuge) and the supernatants analyzed by HPLC.
  • the content of L-cysteinesulfinic acid and L-cysteic acid in the batch with AOX and in the batch without AOX at the beginning (0 h) and after a reaction time of 5 h is summarized in Table 1.
  • the reaction was investigated in two parallel runs, i.e. with and without AOX.
  • 12 mg of hypotaurine (Sigma-Aldrich) were each weighed into two 100 ml Erlenmeyer flasks, dissolved in 9.9 ml of 100 mM Na phosphate, pH 7.5, and 0.1 ml of methanol (final concentration 1%, v/v) were added.
  • 30 ml of commercially available AOX from Pichia pastoris (Sigma-Aldrich) dissolved in 100 mM Na phosphate, pH 7.5, were added in one batch. According to the manufacturer's information on the enzyme activity, the AOX activity in the batch was 5 U/ml.
  • the batch without AOX received 30 mM 100 mM Na phosphate, pH 7.5.
  • the batches were shaken at 25° C. and 140 rpm (Infors chest shaker).
  • 1 ml of each batch was removed, incubated for 5 min at 80° C., centrifuged for 5 min at 13000 rpm (HeraeusTM FrescoTM 21 centrifuge) and the supernatants analyzed by HPLC.
  • the content of hypotaurine and taurine in the mixture with alcohol oxidase (AOX) and in the mixture without alcohol oxidase at the beginning (0 h) and after a reaction time of 5 h is summarized in Table 2.
  • An HPLC method calibrated for L-cysteinesulfinic acid, L-cysteic acid, hypotaurine and taurine was used for the quantitative determination of the compounds quantitatively analyzed in the examples, with all reference substances used for calibration being commercially available (Sigma-Aldrich).
  • An HPLC device from Agilent, model 1260 Infinity II, equipped with a pre-column derivatization known from the analysis of amino acids with o-phthaldialdehyde (OPA derivatization) from the same manufacturer was used.
  • the HPLC device was equipped with a fluorescence detector to detect the OPA-derivatized products of L-cysteine sulfinic acid, L-cysteic acid, hypotaurine and taurine. The detector was set to an excitation wavelength of 330 nm and an emission wavelength of 450 nm.
  • An AccucoreTM aQ column from Thermo ScientificTM was also used.
  • Eluent A 25 mM Na phosphate, pH 6.0
  • Eluent B methanol
  • the reaction was investigated in two parallel approaches, ie with and without GOX.
  • 100 ml 12 mg of L-cysteine sulfinic acid ⁇ H2O (Sigma-Aldrich) were each weighed into Erlenmeyer flasks, dissolved in 9.5 ml of 100 mM Na acetate, pH 5.5, and 0.5 ml of a 200 g/L glucose solution in the same buffer was added.
  • 50 ml of commercially available GOX from Aspergillus niger (Sigma-Aldrich), dissolved in 100 mM Na acetate, pH 5.5, were added in one batch. According to the manufacturer's information, the GOX activity in the batch was 5 U/ml.
  • the batch without GOX received 50 mM 100 mM Na acetate, pH 5.5.
  • the batches were shaken at 30° C. and 140 rpm (Infors chest shaker).
  • 1 ml of each batch was removed, incubated for 5 min at 80° C., centrifuged for 5 min at 13000 rpm (HeraeusTM FrescoTM 21 centrifuge) and the supernatants analyzed by HPLC as described above.
  • the reaction was investigated in two parallel approaches, ie with and without GOX.
  • 12 mg of hypotaurine (Sigma-Aldrich) were each weighed into two 100 ml Erlenmeyer flasks, dissolved in 9.5 ml of 100 mM Na acetate, pH 5.5, and 0.5 ml of a 200 g/L glucose solution in the same added buffer.
  • 50 ml of commercially available GOX from Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) dissolved in 100 mM Na acetate, pH 5.5, were added in one batch. According to the manufacturer's information, the GOX activity in the batch was 5 U/ml.
  • the batch without GOX received 50 mM 100 mM Na acetate, pH 5.5.
  • the batches were shaken at 30° C. and 140 rpm (Infors chest shaker).
  • 1 ml of each batch was removed, incubated for 5 min at 80° C., centrifuged for 5 min at 13000 rpm (HeraeusTM FrescoTM 21 centrifuge) and the supernatants analyzed by HPLC as described above.
  • the reaction was investigated in two parallel approaches, i.e. with different doses of the enzyme GOX, with the concentration of the substrate to be oxidized, hypotaurine, being 20 g/L in each case.
  • Example 4 Preparation of the hypotaurine production strains E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs and E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs Cysteine dioxygenase CDOrn:
  • CDOrn The amino acid sequence of the cysteine dioxygenase from Rattus norvegicus is disclosed in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database under the sequence ID: AAH70509.1.
  • a DNA sequence codon-optimized for expression in E. coli publicly available Eurofins Genomics GENEius software was derived from the amino acid sequence and produced synthetically (Eurofins Genomics).
  • This DNA sequence designated CDOrn is disclosed in SEQ ID NO: 1 encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • CSADhs The amino acid sequence of the cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSADhs) from Homo sapiens is disclosed in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database under the sequence ID: XP_016861786.1.
  • a DNA sequence codon-optimized for expression in E. coli publicly accessible Eurofins Genomics GENEius software was derived from the amino acid sequence.
  • This DNA sequence designated CSADhs is disclosed in SEQ ID NO: 3, nt 1 to 1509, encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the DNA sequence of the E. coli rrnB terminator (SEQ ID NO :3, nt 1510 to 1842) was linked to nt 1509.
  • the DNA sequence of the rrnB terminator is disclosed in Orosz et al., Eur. J. Biochem. (1991) 201:653-659.
  • Fig. 1 denotes the plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317, a derivative of the plasmid disclosed in EP 0885 962 B1 pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306.
  • the plasmid pACYCl84-cysEX-GAPDH-ORF3 06 contains in addition to the Origin of replication and a tetracycline resistance gene (starting vector pACYC184) the cysEX allele, which codes for a serine-O-acetyl-transferase with reduced feedback inhibition by cysteine, and the efflux gene ydeD (ORF306), whose expression is controlled by the constitutive GAPDH promoter will.
  • serA317 In order to obtain pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317, the serA317 gene fragment coding for the N-terminal 317 amino acids of the SerA protein from E. coli and disclosed in Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184 (referred to therein as "NSD:317") behind the ydeD (ORF306) efflux gene.
  • SerA317 encodes a serine feedback-resistant variant of 3-phosphoglycerate dehydrogenase.
  • the expression of serA317 is regulated by the serA promoter.
  • E. coli cells transformed with pCys produce cysteine, the starting product for the subsequent products cysteine sulfinic acid and hypotaurine.
  • pCys was cut with Seal and PpuMI.
  • the 6.1 kb vector fragment released in the process was isolated after preparative agarose gel electrophoresis ( QIAquick® Gel Extraction Kit, Qiagen).
  • the CDOrn DNA was derived from the synthetic DNA SEQ ID NO: 1 (CDOrn) by PCR (“PhusionTM High-Fidelity" DNA Polymerase, Thermo ScientificTM) with the primers cdorn-lf (SEQ ID NO: 5) and csadhs- 2r (SEQ ID NO:6) and isolated as a 0.6 kb fragment.
  • Primer cdorn-lf comprised, starting from the 5' end, 28 nt overlapping with the 3' end of the 6.1 kb pCys Scal/PpuMI vector fragment (nt 1 to 28 in SEQ ID NO: 5) obtained by Scal digestion, a ribosome binding site (RBS) (nt 31 to 36 in SEQ ID NO: 5) and the first 22 nt of the CDOrn eds (SEQ ID NO 5, nt 44 to 65).
  • RBS ribosome binding site
  • Primer csadhs-2r comprised, in reverse complement form, starting from the 5' end, 22 nt overlapping the start of the CSADhs cds (SEQ ID NO: 6, nt 1 to 22), followed by a ribosome binding site (SEQ ID NO: 6, nt 30 to 35) and the last 20 nt of the CDOrn cds (SEQ ID NO: 6, nt 38 to 57).
  • Primer csadhs-3f comprised, starting from the 5' end, 20 nt overlapping with the 3' end of the CDOrn cds (nt 1 to 20 in SEQ ID NO: 7), a ribosome binding site (nt 23 to 28 in SEQ ID NO: 7) and the first 22 nt of the CSADhs cds (SEQ ID NO 7, nt 36 to 57).
  • Primer glf-2r comprised, in reverse complementary form, starting from the 5' end, 33 nt overlapping with the 5' end obtained by PpuMI digestion of the 6.1 kb pCys Scal/PpuMI vector fragment (nt 1 to 33 in SEQ ID NO: 8) followed by the last 22 nt of the rrnB terminator (SEQ ID NO: 8, nt 34 to 55).
  • E. coli NEB® 10-beta cells were then transformed with the ligation mixture. Clones from the transformation were selected on LBtet. LBtet contained 10 g/L tryptone (GIBCOTM), 5 g/L yeast extract (BD Biosciences), 5 g/L NaCl, 15 g/L agar and 15 mg/L tetracycline (Sigma-Aldrich). A single clone from the transformation was analyzed by culturing in LBtet liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl and 15 mg/L tetracycline) and isolating the vector from the cell pellet of cultivation. The correct 8.5 kb vector was named pCys-CDOrn-CSADhs ( Figure 2).
  • the strain Escherichia coli K12 W3110 (commercially available under the strain number DSM 5911 from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) was used.
  • E. coli K12 W3110-ppsA-MHI The strain E. coli K12 W3110-ppsA-MHI was used.
  • E. coli K12 W3110-ppsA-MHI is characterized by the mutated ppsA gene ppsA-MHI (SEQ ID NO: 9), coding for a protein with the protein sequence from SEQ ID NO: 10 and the enzyme activity of a PEP synthase (in enzyme class designated with the number EC 2.7.9.2 in the KEGG database).
  • E. coli K12 W3110-ppsA-MHI was produced using the combination of Lambda-Red recombination and counter-selection screening for genetic modification known to those skilled in the art (see e.g. Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245).
  • E. coli K12 W3110 was transformed with the plasmid pKD46 (FIG. 3, disclosed in the “GenBank” gene database under the accession number AY048746.1) and the E. coli W3110 ⁇ pKD46 strain was isolated (ampicillin selection).
  • the 3.2 kb Kan-sacB cassette was isolated by PCR with the primers pps-9f (SEQ ID NO: 11, binds to the site designated "pr-f" in Fig. 4) and pps-10r (SEQ ID NO: 12, binds at the site designated "pr-r” in Fig. 4) isolated.
  • the plasmid pKansacB contains expression cassettes both for the kanamycin (Kan) resistance gene and for the sacB gene, coding for the enzyme levansucrase.
  • coli kanamycin resistance gene (Kan), encoding an aminoglycoside Phosphotransferase is disclosed in the NCBI database under accession number SH02_03400.
  • the B. subtilis sacB gene is disclosed in the NCBI database under accession number 936413.
  • Primer pps-9f contains the first 30 nt of the ppsA WT gene (identical to SEQ ID NO: 9, nt 1 to 30) followed by 20 nt of the site designated "pr-f" in Figure 4.
  • Primer pps -lOr contains the last 30 nt of the ppsA WT gene, in reverse complementary form (identical to SEQ ID NO: 9, nt 2350 - 2379) and connected thereto 20 nt of the site designated "pr-r” in Fig. 4 .
  • E. coli W3110 x pKD46 was transformed with the 3.2 kb Kan-sacB cassette and kanamycin-resistant clones isolated.
  • LBSC plates (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 7% sucrose, 1.5% agar and 15 mg/L kanamycin). Clones with an integrated sacB gene produced toxic levan from sucrose, which led to growth inhibition (sucrose-sensitive). A kanamycin resistant and sucrose sensitive clone was selected and designated W3110-ppsA::Kan-sacB x pKD46.
  • W3110-ppsA::Kan-sacB x pKD46 was transformed with DNA of the ppsA-MHI gene (SEQ ID NO: 9, produced synthetically, Eurofins Genomics) and clones on LBS plates (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 7% sucrose, 1.5% agar) without kanamycin. Only clones that no longer contained an active sacB gene could grow on LBS plates.
  • clones were transferred to LBkan plates (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 1.5% agar, 15 mg/L kanamycin) in order to select those clones that also had no active Kan gene and whose growth was inhibited in the presence of kanamycin.
  • E. coli K12 W3110 and E. coli K12 W3110-ppsA-MHI strains were transformed into E. coli K12 W3110 and E. coli K12 W3110-ppsA-MHI strains.
  • E. coli K12 W3110 and E. coli K12 W3110-ppsA-MHI were transformed with the vector pCys.
  • Transformants were selected on LBtet. One clone each was isolated.
  • the strains were named E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs and E. coli K12 W3110 x pCys or, analogously, E.
  • E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs and E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs were used as production strains to produce hypotaurine.
  • E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs From E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs, E. coli K12 W3110 x pCys, E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs and E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys strains a preculture was produced in LBtet liquid medium (cultivation at 37° C. and 120 rpm overnight).
  • Main culture 0.5 ml of the preculture was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask (with baffle) with 30 ml SM1-Ac medium, also containing 15 g/L glucose, 2 g/L Na2S2O3 x 5 H2O, 0.1 g/L L L-isoleucine, 0.1 g/L D,L-methionine, 0.1 g/L L-threonine, 5 mg/L vitamin B1 and 15 mg/L tetracycline.
  • SM1-Ac medium also containing 15 g/L glucose, 2 g/L Na2S2O3 x 5 H2O, 0.1 g/L L L-isoleucine, 0.1 g/L D,L-methionine, 0.1 g/L L-threonine, 5 mg/L vitamin B1 and 15 mg/L tetracycline.
  • Composition of the SM1-Ac medium 12 g/LK 2 HPO 4 , 3 g/L KH 2 PO 4 , 5 g/L NH 4 acetate, 0.3 g/L MgSO 4 x 7 H 2 0, 0.015 g /L CaCl2 x 2 H 2 0.002 g/L FeSO 4 x 7 H 2 0.1 g/L Na 3 citrate x 2 H 2 0.0.1 g/L NaCl; 1 ml/L trace element solution.
  • composition of the trace element solution 0.15 g/L Na 2 Mo0 4 x 2 H 2 0, 2.5 g/L H3BO3, 0.7 g/L CoCl 2 x 6 H 2 0, 0.25 g/L CuS0 4 x 5 H 2 0. 1.6 g/L MnCl 2 x 4 H 2 0. 0.3 g/L ZnS0 4 x 7 H 2 0.
  • the main culture was incubated for 24 h at 30° C. and 140 rpm in a chest shaker (Infors). After 24 h, 1 ml samples were taken and the cell density OD ö oo/nil (optical density of the main culture, measured photometrically at 600 nm) measured with a GenesysTM 10S UV-Vis spectrophotometer from Thermo-ScientificTM, as well as the content of Hypotaurine and taurine determined by HPLC. The content of hypotaurine in the culture supernatant determined by HPLC was for E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs (cell density OD ö oo/nil of the culture: 5.3/ml)
  • the hypotaurine contained in the shake flask culture (Example 5) of 157.3 mg/L (strain W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs) and 1059.2 mg/L (strain W3110-ppsA-MHI x pCys -CDOrn-CSADhs) was completely consumed and taurine was formed in a concentration of 212.8 mg/L or 1355.6 mg/L.
  • the molar yield was determined taking into account the different molecular weights (109.2 g/mol for hypotaurine, 125.2 g/mol for taurine).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren der Formel H2N-CH(R)-CH2-SO2H zu Sulfonsäuren der Formel H2N-CH(R)-CH2-SO3H mit einem Enzym ausgewählt aus der Klasse der H2O2-generierenden Oxidasen in Gegenwart ihres Substrats, insbesondere zur enzymatischen Oxidation von L-Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure und von Hypotaurin zu Taurin unter Verwendung von Alkoholoxidase und Glucoseoxidase.

Description

Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H zu Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H mit einem Enzym ausgewählt aus der Klasse der H202-generierenden Oxidasen in Gegenwart ihres Substrats, insbesondere zur enzymatischen Oxidation von L-Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure und von Hypotaurin zu Taurin.
Sulfinsäuren sind eine Klasse von chemischen Verbindungen mit organisch gebundenem Schwefel und Sauerstoff der allgemeinen Struktur R-S(=0)-OH, wobei R ein organischer Rest ist. Die Grundsubstanz Sulfinsäure besitzt die Struktur H-S(=0)-OH und ist tautomer zur Sulfoxylsäure HO-S-OH. Die Salze der Sulfinsäuren sind die Sulfinate.
Sulfonsäuren sind organische Schwefelverbindungen mit der allgemeinen Struktur R-SO2-OH, wobei R ein organischer Rest ist. Ihre Salze und Ester mit der allgemeinen Struktur R-S020 bzw. R1-SO2-O-R2 (Ri, R2 jeweils organische Reste) heißen Sulfonate .
Die Umwandlung von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren ist chemisch durch Oxidation, z.B. mit Peroxiden, möglich (siehe z.B. Chauvin and Pratt, Angew. Chem. Int. Ed. (2017) 56: 6255- 6259) . In der chemischen Industrie ist eine mögliche enzymatische Oxidation von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren nicht von Bedeutung, ist jedoch für biotechnologische Verfahren zur Herstellung in der Natur vorkommender Sulfonsäuren aus den korrespondierenden Sulfinsäuren von Interesse.
Zu den in der Natur vorkommenden Sulfinsäuren gehören z.B. L- Cysteinsulfinsäure und Hypotaurin. Zu den in der Natur vorkommenden Sulfonsäuren gehören z.B. L-Cysteinsäure und Taurin.
Taurin (2-Aminoethansulfonsäure, CAS-Nummer 107-35-7) ist eine Aminosulfonsäure, die natürlicherweise in der Natur als Abbauprodukt der Aminosäuren Cystein und Methionin vorkommt. Taurin hat wirtschaftliche Bedeutung, ist z.B. Bestandteil von Energiedrinks und wird auch in der Tiernahrung, z.B. für Katzen oder in der Fischzucht (Salze and Davis, Aquaculture (2015) 437: 215-229), eingesetzt. Taurin werden jedoch auch gesundheitsfördernde Effekte zugeschrieben (Ripps and Shen, Molecular Vision (2012) 18: 2673-2686).
Für den kommerziellen Gebrauch wird Taurin gegenwärtig chemisch hergestellt. Bekannt ist z.B. ein Verfahren der Fa. Changshu Yudong Chemical Factory, das von Ethylen ausgeht und über Ethylenimin zum Taurin führt. Mit dem von Konsumentenwünschen beförderten Trend weg von chemisch hergestellten Inhaltsstoffen werden zunehmend biotechnologische Verfahren zur Herstellung von Taurin untersucht .
In der Natur kommt Taurin fast ausschließlich im Tierreich vor, mit nur wenigen Beispielen für ein Vorkommen in Pflanzen, Algen oder Bakterien. Es gibt verschiedene biosynthetische Wege zum Taurin (siehe z.B. die KEGG Pathway Datenbank: „Taurine and hypotaurine metabolism"), u.a. ausgehend von L- Cystein. Die wichtigsten Syntheseschritte, die von L-Cystein zu Taurin führen, sind in den Gleichungen (1) bis (5) dargestellt .
(1) L-Cystein + O2 -> L-Cysteinsulfinsäure
(2) L-Cysteinsulfinsäure + t O2 -> L-Cysteinsäure
(3) L-Cysteinsulfinsäure -> Hypotaurin + CO2
(4) Hypotaurin + t O2 -> Taurin
(5) L-Cysteinsäure -> Taurin + CO2 (1): In einem ersten Schritt wird L-Cystein durch das Enzym Cysteindioxygenase (CDO, EC 1.13.11.20) zu L- Cysteinsulfinsäure (3-Sulfinoalanin, CAS Nummer 207121-48-0) oxidiert .
(3) und (5): Cysteinsulfinatdecarboxylase (CSAD, EC 4.1.1.29) decarboxyliert L-Cysteinsulfinsäure zu Hypotaurin (2- Aminoethansulfinsäure, CAS Nummer 300-84-5) und kann in einer ähnlichen Reaktion L-Cysteinsäure zu Taurin decarboxylieren.
(2) und (4): Bisher nicht eindeutig geklärt ist die Oxidation von Cysteinsulfinsäure zu Cysteinsäure sowie die Oxidation von Hypotaurin zu Taurin.
Ein Nachteil der bekannten biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Taurin liegt darin, dass Hypotaurin im allgemeinen das Hauptprodukt ist. Soll Taurin das Produkt sein, so muss auf chemische Verfahren zur Oxidation von Hypotaurin zurückgegriffen werden.
Honjoh et al. (2010), Amino Acids 38: 1173-1183 beschreiben einen gentechnisch veränderten Hefestamm, der die CDO- und CSAD-Gene aus Karpfen (Cyprinus carpio) heterolog exprimiert. Hauptprodukt war Hypotaurin und daneben ein geringerer Anteil an Taurin. Beide Produkte wurden intrazellulär akkumuliert.
Für die Produktanalyse war daher ein Zellaufschluss erforderlich. Hypotaurin konnte in Zellextrakten für analytische Zwecke chemisch durch Behandlung mit H2O2 zu Taurin oxidiert werden. Es wurde kein Verfahren beschrieben, wie Hypotaurin in einem nicht-chemischen Schritt für die weitere Verwendung zu Taurin umgewandelt werden kann.
WO 17/213142 Al (Ajinomoto) beschreibt einen Taurin produzierenden Stamm, der durch heterologe Expression einer Cystein Dioxygenase und einer L-Cysteinsulfinsäure Decarboxylase in einem ursprünglich Cystein-produzierenden Stamm erhalten wurde. Hauptprodukt war Hypotaurin mit max. 450 mM Ausbeute, das nur durch nachträgliche chemisch-alkalische Behandlung und auch nur in geringer Ausbeute zu Taurin umgewandelt werden konnte.
US 2019-0062757 Al (KnipBio) beschreibt heterologe Produktionsstämme zur Herstellung von Taurin oder seiner Vorläufersubstanzen, wobei die offenbarten Produktionsstämme in der Mehrzahl kein einheitliches Produktprofil aufwiesen und die besten Ausbeuten für Hypotaurin erzielt wurden. Die erzielten Ausbeuten waren darüberhinaus mit max. 419 ng/ml Hypotaurin, ohne nachweisbares Taurin, sehr gering.
Die im Stand der Technik offenbarten biotechnologischen Ansätze zur Herstellung von Taurin haben neben den geringen Ausbeuten den Nachteil eines uneinheitlichen Produktspektrums, wobei Hypotaurin als Hauptprodukt und Taurin nur als Nebenprodukt anfällt.
Einen Ansatz zur enzymatischen Oxidation von Hypotaurin offenbaren Veeravalli et al. (2020), bioRxiv Preprint Server doi: https://doi.org/10.1101/750273. Sie beschreiben die Flavin-abhängige Monooxygenase 1 (EM01) aus Säugern als ein
Enzym für die Konversion von Hypotaurin zu Taurin. Die Oxidation verläuft nach Gleichung (6):
(6) Hypotaurin + NAD(P)H + 02 -> Taurin + NAD(P) + H20
Von dem Enzym EM01 aus Säugern zur Konversion von Hypotaurin zu Taurin nach Gleichung (6) ist nicht bekannt, ob es sich auch zur Oxidation anderer Sulfinsäuren der Formel H2N-CH(R)- CH2-S02H eignet.
Zur Oxidation von Hypotaurin verwendet EM01 in stöchiometrischen Mengen die Cofaktoren NADH oder NADPH. Der Einsatz dieser kommerziell teuren Cofaktoren macht den technischen Einsatz unwirtschaftlich. Weiterhin ist für das in Säugern identifizierte EMOl kein für die großtechnische Produktion geeignetes Herstellungsverfahren bekannt. Somit ist keine Wirtschaftlichkeit für die enzymatische Oxidation unter Verwendung des EMOl-Enzyms gegeben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein wirtschaftlich günstiges biotechnologisches Verfahren zur Oxidation von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren, insbesondere von L-Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure und von Hypotaurin zu Taurin bereitzustellen.
Gelöst wurde die Aufgabe durch ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H zu Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H mit einem Enzym ausgewählt aus der Klasse der H202-generierenden Oxidasen in Gegenwart ihres Substrats. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Aminoalkylsulfinsäure, besonders bevorzugt 2- Aminoalkylsulfinsäure handelt. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfonsäure um Aminoalkylsulfonsäure, besonders bevorzugt 2-
Aminoalkylsulfonsäure handelt. Besonders bevorzugt handelt es ich bei der Sulfinsäure um Aminoalkylsulfinsäure und bei der Sulfonsäure um Aminoalkylsulfonsäure.
Der Rest R kann beliebig sein und ist bevorzugt Wasserstoff, ein organischer, linearer, verzweigter, cyclischer, gesättigter oder ungesättigter, aromatischer oder heteroaromatischer Rest, mit oder ohne Substituenten. Das bedeutet, dass die Reste R substituiert oder unsubstituiert sein können. Bevorzugte Substituenten sind -CN, -NCO, -NR2, - COOH, -COOR, -Halogen, -(Meth)acryl, -Epoxy, -SH, -OH, -CONR2, -O-R, -CO-R, -COO-R, -OCO-R, oder -OCOO-R, -S-R, -NR-, -N=R, - N=N-R, oder -P=R. Vorzugsweise werden gesättigte oder ungesättigte Reste mit C1-C4-, besonders bevorzugt Ci-C4-Alkyl, Vinyl, insbesondere Methyl oder Ethyl, im speziellen Methyl eingesetzt. R ist bevorzugt ausgewählt aus R = H oder R = CO2H, d.h. es ist bevorzugt, dass es sich bei der Sulfinsäure um Hypotaurin oder Cysteinsulfinsäure handelt. Insbesondere bevorzugt ist R = H.
Von der Erfindung betroffen ist somit auch die enzymatische Oxidation von L-Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure und von Hypotaurin zu Taurin als Verfahrensschritt einer biotechnologischen Herstellung von Taurin.
Unter dem Substrat des Enzyms ausgewählt aus der Klasse der H202-generierenden Oxidasen ist der Stoff zu verstehen, der durch die Oxidase oxidierbar ist. Die Oxidase reagiert mit ihrem oxidierbaren Substrat nach der Formel (7).
(7) Substrat + O2 -> Substrat(OX) + H2O2
Die durch die H202-generierenden Oxidase katalysierte Gesamtreaktion erfolgt nach der Gleichung (8):
(8) Substrat + 02 + H2N-CH (R)-CH2-S02H ->
Substrat(ox) + H202 + H2N-CH (R)-CH2-S02H ->
Substrat(ox) + H20 + H2N-CH (R)-CH2-S03H
Geeignete H202-generierende Oxidasen sind in der „KEGG Enzyme" Datenbank unter dem Suchbegriff „Oxidase" als Teilmenge der dort aufgeführten Enzyme zu finden. Aus der Vielzahl der H2O2- generierenden Oxidasen sind für den verfahrenstechnischen Einsatz allerdings nur solche Oxidasen von Interesse, die ein kostengünstiges Substrat verwenden, um durch dessen Oxidation nach Gleichung (7) H2O2 zu generieren.
Beispiele bevorzugter geeigneter H202-generierender Oxidasen und nicht auf diese beschränkt sind Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4), Hexoseoxidase (EC 1.1.3.5), Alkoholoxidase (EC 1.1.3.13), Sekundäralkoholoxidase (EC 1.1.3.18), Pyranoseoxidase (EC 1.1.3.10), L-Lactatoxidase (EC 1.1.3.2), Arylalkoholoxidase (EC 1.1.3.7), Galactoseoxidase (EC
1.1.3.9), L-Sorboseoxidase (EC 1.1.3.11), Aldehydoxidase (EC
1.2.3.1), Pyruvatoxidase (EC 1.2.3.3 oder EC 1.2.3.6), Oxalatoxidase (EC 1.2.3.4), Glyoxylatoxidase (EC 1.2.3.5), L- Aminosäureoxidase (EC 1.4.3.2), D-Aminosäureoxidase (EC
1.4.3.3 oder EC 1.4.3.1), Sulfitoxidase (EC 1.8.3.1), Thioloxidase (EC 1.8.3.2).
Besonders bevorzugte H202- enerierende Oxidasen sind Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4), Hexoseoxidase (EC 1.1.3.5), Alkoholoxidase (EC 1.1.3.13), Sekundäralkoholoxidase (EC 1.1.3.18), Pyranoseoxidase (EC 1.1.3.10), L-Lactatoxidase (EC
1.1.3.2) .
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren aus diesem Grund dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination aus H2O2- generierender Oxidase und ihrem oxidierbaren Substrat ausgewählt ist aus Glucoseoxidase/Glucose,
Alkoholoxidase/Methano1 , Alkoholoxidase/Ethanol, Sekundäralkoholoxidase/Isopropanol und L-Lactatoxidase/Lactat.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der H202-generierenden Oxidase um Alkoholoxidase handelt und als Substrat ein primärer Alkohol, besonders bevorzugt Methanol, vorhanden ist. D.h. es handelt sich bei der H202-generierenden Oxidase um ein Enzym der mit Alkoholoxidasen bezeichneten Klasse EC 1.1.3.13 der KEGG-Datenbank .
Alkohole sind Verbindungen der allgemeinen Formel R-OH mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, die keine funktionelle Gruppe mit einer höheren Priorität besitzen. Man unterscheidet Alkohole nach der Zahl der C- und H-Atome an dem C-Atom der funktionellen Gruppe, an das auch die Hydroxygruppe gebunden ist. Bei primären Alkoholen sind an dieses C-Atom neben einem C-Atom zwei H-Atome gebunden, so dass sich die allgemeine Formel RCH2OH ergibt. Zudem wird ein primärer Alkohol durch Oxidation zu einem Aldehyd. Beispielsweise wird aus Ethanol unter Abspaltung von 2 H-Atomen das Aldehyd Ethanal.
Zu den bevorzugten primären Alkoholen zählen Methanol und Ethanol, besonders bevorzugt handelt es sich beim primären Alkohol um Methanol.
Im Falle der Alkohole ist R ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl- Rest, jedoch kein Aryl-Rest, Acyl-Rest oder ein Heteroatom.
In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der H2O2- generierenden Oxidase um Glucoseoxidase handelt und als Substrat Glucose vorhanden ist. D.h. es handelt sich bei der H202-generierenden Oxidase um ein Enzym der mit Glucoseoxidase bezeichneten Klasse EC 1.1.3.4 der KEGG-Datenbank.
Voraussetzung für die technische Umsetzung des Verfahrens ist die Verfügbarkeit der H202-generierenden Oxidase sowie ein kostengünstiges oxidierbares Substrat.
H202-generierende Oxidasen sind herstellbar z.B. durch Kultivierung eines geeigneten Produktionsstammes, der die betreffende Oxidase natürlicherweise produziert (homologe Produktion) oder infolge Expression eines geeigneten rekombinanten Genkonstrukts in einem Wirtsorganismus (heterologe Produktion). Darüber hinaus sind verschiedene H2O2- generierende Oxidasen kommerziell verfügbar, was sich positiv auf die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens auswirken kann. Beispiele für kommerziell verfügbare Oxidasen sind Alkoholoxidase AOX aus der Hefe Pichia pastoris (erhältlich z.B. von Sigma-Aldrich) oder Glucoseoxidase GOX aus dem Pilz Aspergillus niger (erhältlich z.B. von Sigma-Aldrich aus homologer wie heterologer Produktion). Ein weiteres Beispiel einer kommerziell verfügbaren Glucoseoxidase ist das unter dem Markennamen Gluzyme® vertriebene Enzym (Novozymes) für Anwendungen z.B. in der Backindustrie. Es ist bevorzugt, dass die tbC^-generierende Oxidase fermentativ hergestellt wird.
Für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens ist darüber hinaus die kostengünstige Verfügbarkeit des Substrats der H2O2- generierenden Oxidase entscheidend. Im Falle der AOX Alkoholoxidase ist das Substrat ein primärer Alkohol, bevorzugt ausgewählt aus Methanol oder Ethanol. Das AOX Enzym generiert H2O2 mit Methanol nach Reaktion (9):
(9) Methanol + O2 -> Formaldehyd und H2O2
Im Falle der Glucoseoxidase GOX ist das Substrat D-Glucose.
Das GOX Enzym generiert H2O2 mit D-Glucose nach Reaktion (10):
(10) D-Glucose + O2 -> D-Glucono-1,5-Lacton + H2O2
Ein Verfahren im Sinne der Erfindung ist definiert als eine mehrstufige Abfolge von Arbeitsschritten, wo in einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Reaktionsansätzen in einer vorab definierten Reihenfolge ein Edukt (Ausgangsstoff) über die durch die Reaktionsbedingungen festgelegten Zwischenprodukte in das Produkt umgewandelt wird.
Ein biotechnologisches Verfahren im Sinne der Erfindung ist definiert als die Nutzung von Enzymen, Zellen oder ganzen Organismen in technischen Anwendungen zur Herstellung chemischer Verbindungen, wie z.B. der Herstellung von Taurin aus Hypotaurin unter Verwendung einer Glucoseoxidase. Im Gegensatz zu biotechnologischen Verfahren stehen Verfahren, die sich durch chemische Verfahrensschritte auszeichnen.
Ein Ansatz oder Reaktionsansatz ist definiert als Mischung aus Edukt (Ausgangsstoff), Enzym und ggf. weiteren Reaktanden, bei dem das Edukt unter definierten Bedingungen in ein Produkt überführt wird. Ein Ansatz oder Reaktionsansatz der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens eine Sulfinsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H, mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Klasse der fhCh-generierenden Oxidasen, das durch die Oxidase oxidierbare Substrat und Luftsauerstoff O2.
Biotransformation ist definiert als Überführung eines Edukts in das Produkt unter enzymatischer Katalyse. Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Biotransformation.
Die Ausbeute der Reaktion kann angegeben werden als Volumenausbeute in absoluter, auf das Volumen bezogene Menge Produkt (mM oder g/L) oder als relative Ausbeute von Produkt in Prozent des eingesetzten Edukts (unter Berücksichtigung der Molekulargewichte des Edukts und des Produkts), auch bezeichnet als prozentuale Ausbeute. Im Rahmen der Erfindung bezeichnet die molare Ausbeute, ausgedrückt in Prozent, die molare Gesamtmenge an Sulfonsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H nach der enzymatischen Oxidation durch eine H202-generierende Oxidase in Gegenwart ihres Substrats im Verhältnis zur Summe der in diese Reaktion eingesetzten molaren Menge an Sulfinsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H und Sulfonsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-S03H.
Fermentation ist ein Verfahrensschritt zur Herstellung von Zellkulturen, bei dem ein mikrobieller Produktionsstamm unter definierten Bedingungen von Kulturmedium, Temperatur, pH, Sauerstoffzufuhr und Mediumsdurchmischung zum Wachstum gebracht wird. Ziel der Fermentation ist, abhängig von der Konfiguration des Produktionsstamms, die Produktion eines Proteins/Enzyms und/oder eines Stoffwechselprodukts, jeweils mit möglichst hoher Ausbeute, für die weitere Verwendung in einem Verfahren.
Die Enzymaktivität wird angegeben in U/ml, wobei 1 U/ml definiert ist als der Umsatz von 1 pmol Substrat/min in 1 ml Testansatz unter Testbedingungen. Als offener Leserahmen (open reading frame, ORF, gleichbedeu tend mit cds, coding sequence) wird derjenige Bereich der DNS bzw. RNS bezeichnet, der mit einem Startcodon beginnt und mit einem Stoppcodon endet und für die Aminosäuresequenz eines Proteins codiert. Der ORF wird auch als codierende Region oder Strukturgen bezeichnet.
Als Gen oder Expressionseinheit wird der DNS-Abschnitt bezeichnet, der alle Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNS enthält. Ein Gen enthält den DNS- Abschnitt, von dem durch Transkription eine einzelsträngige RNS-Kopie hergestellt wird und die Expressionssignale, die an der Regulation dieses Kopiervorgangs beteiligt sind. Zu den Expressionssignalen zählen z.B. mindestens ein Promotor, ein Transkriptions-, ein Translationsstart und eine Ribosomenbindestelle. Des Weiteren sind als Expressionssignale ein Terminator und ein oder mehrere Operatoren möglich.
Eine mRNS, auch messenger-RNS oder Boten-RNS genannt, ist eine einzelsträngige Ribonukleinsäure (RNS), welche die genetische Information für den Aufbau eines Proteins trägt. Mit einer mRNS steht die Bauanleitung für ein bestimmtes Protein in einer Zelle zur Verfügung. Das mRNS-Molekül trägt die zum Proteinaufbau notwendige Botschaft aus der Erbinformation (DNS) an die proteinaufbauenden Ribosomen. In einer Zelle wird es gebildet als Transkript eines zu einem Gen gehörenden Teilabschnitts der DNS. Die in der DNS gespeicherte genetische Information wird dabei nicht verändert.
Gene eukaryotischer Organismen sind überwiegend sog.
Mosaikgene und enthalten im Gegensatz zu prokaryotischen Genen auch nichtcodierende Abschnitte, sog. Introns (engl. intragenic regions). Codierende Sequenzen, sog. Exons (engl. expressed regions) sind DNS-Abschnitte eines eukaryotischen Gens, die nach der Transkription in RNS von den Ribosomen in die Aminosäure-Sequenz eines Proteins übersetzt werden. Die Introns werden nach der Transkription der DNS zur RNS aus dem Primärtranskript gespleißt. Die von Introns befreite proteincodierende RNS wird als messenger-RNS (mRNS), auch als „reife" mRNS bezeichnet. Diese wird weiteren Modifikationen wie dem Capping und der Polyadenylierung unterzogen. Der codierende Bereich der reifen mRNS wird dann in die Proteinsequenz übersetzt. Soll ein eukaryotisches Gen mit Exon/Intronstruktur in prokaryotischen Organismen exprimiert werden, ist es notwendig, die Proteinsequenz oder den codierenden Bereich der reifen mRNS in Intron-freie DNS zurückzuübersetzen, da bei Prokaryoten die Prozessierung der Exon/Intronstruktur nicht stattfindet. Wenn im Rahmen dieser Erfindung von aus der Proteinsequenz oder der mRNS abgeleiteten Gensequenzen die Rede ist, ist genau dieser Prozess der Rückübersetzung gemeint. Es ist bevorzugt, dass gleichzeitig mit der Rückübersetzung der mRNS-Sequenz in DNS- Sequenz eine Sequenzoptimierung, d.h. Anpassung an die Codon- Nutzung des entsprechenden Prokaryoten erfolgt (Codon- Optimierung) .
Ein Operon ist definiert als übergeordnete Expressionseinheit, bei der mehrere Gene unter Kontrolle nur eines Promotors transkribiert, aber von jeweils einer eigenen Ribosomenbindestelle translatiert werden.
Als Genkonstrukt wird im Rahmen der Erfindung ein zirkuläres DNS-Molekül (Plasmid, Vektor) bezeichnet, bei dem mindestens ein Gen verknüpft ist mit weiteren genetischen Elementen (z.B. Promotor, Ribosomenbindestelle (RBS), Terminator, Selektionsmarker, Replikationsursprung). Die genetischen Elemente des Genkonstrukts bewirken seine extrachromosomale Vererbung während des Zellwachstum und die Produktion des vom Gen codierten Proteins. Wie in den Beispielen 1 und 2 der vorliegenden Erfindung offenbart, sind tbC^-generierende Oxidasen in Kombination mit ihrem oxidierbaren Substrat dazu geeignet, Sulfinsäuren wie z.B. L-Cysteinsulfinsäure und Hypotaurin zu den korrespondierenden Sulfonsäuren L-Cysteinsäure, bzw. Taurin zu oxidieren. Diese Beobachtung war neu und überraschend. Nach dem Stand der Technik, wenn auch weitgehend nur im analytischen Maßstab untersucht (siehe z.B. Chauvin and Pratt, Angew. Chem. Int. Ed. (2017) 56: 6255-6259), ist H2O2 grundsätzlich zur Oxidation von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren geeignet. Für eine quantitative Reaktion muss H2O2 nach Gleichung (8) jedoch mindestens in stöchiometrischen Mengen eingesetzt werden, so dass für die Herstellung größerer Mengen einer Sulfonsäure entsprechend große Mengen H2O2 erforderlich sind. Obwohl H202-generierende Oxidasen lange bekannt sind, war es für den Fachmann daher nicht abzusehen, ob die aus der Alkoholoxidase-Reaktion bzw. der Glucoseoxidase-Reaktion gebildete Menge H2O2 ausreichend ist, um größere Mengen der Sulfinsäuren zu oxidieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat somit nicht nur den Vorteil, dass es sich um ein biotechnologisches Verfahren handelt, sondern auch, dass es in technischem Maßstab umsetzbar ist und es sich dabei um ein wirtschaftlich günstiges Verfahren handelt, da es keine teuren Cofaktoren benötigt .
Wie in Beispiel 3 erstmals offenbart und nach dem Stand der Technik nicht zu erwarten, wurde z.B. Hypotaurin in einer für die chemische Synthese relevanten Konzentration von 20 g/L durch Glucoseoxidase/Glucose überraschend praktisch quantitativ zu Taurin oxidiert. Damit stellt die Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Verfügung, welches für die immer stärker nachgefragte nachhaltige Produktion von Sulfonsäuren wie z.B. Taurin, unter Vermeidung chemischer Syntheseschritte, für die Verwendung im Lebensmittel-, Futtermittel- oder Pharmabereich geeignet ist. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um 2-Aminoethansulfinsäure (Hypotaurin) und bei der entstehenden Sulfonsäure um 2- Aminoethansulfonsäure (Taurin) handelt.
Das erfindungsgemäße enzymatische Verfahren zur Oxidation einer Sulfinsäure zur Sulfonsäure wird bevorzugt bei einer Temperatur von 15°C bis 80°C durchgeführt, besonders bevorzugt von 20°C bis 60°C und insbesondere bevorzugt von 25°C bis 50°C.
Der pH, bei dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann, hängt ab von den enzymatischen Eigenschaften der H202-generierenden Oxidase. Wie in den Beispielen beschrieben, wurde die Reaktion der Alkoholoxidase bei pH 7,5 und die der Glucoseoxidase bei pH 5,5 durchgeführt. Der pH-Bereich, bei dem die Reaktion bevorzugt durchgeführt wird, beträgt pH 3,0 bis pH 8,5, besonders bevorzugt pH 4,0 bis pH 8,0 und insbesondere bevorzugt pH 4,5 bis pH 7,5.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Zufuhr von Luftsauerstoff durchgeführt, entweder durch passiven Eintrag, wie er durch Durchmischung des Reaktionsansatzes z.B. auf einem Inkubationsschüttler erfolgt, oder durch aktiven Eintrag, wie er durch Begasung mit Druckluft erfolgt.
Die Dosierung der H202-generierenden Oxidase im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt neben Parametern wie Temperatur, pH und Sauerstoffeintrag den Umsatz der Reaktion und wird so gewählt, dass die Reaktion bei möglichst geringer Dosierung der H202-generierenden Oxidase in möglichst kurzer Zeit erfolgt. Die Dosierung der H202-generierenden Oxidase wie z.B. der Glucoseoxidase beträgt bevorzugt 1 U/ml bis 200 U/ml, besonders bevorzugt 2 U/ml bis 150 U/ml und insbesondere bevorzugt 4 U/ml bis 100 U/ml. Das durch die PhC^-generierende Oxidase oxidierbare Substrat wird, bezogen auf den molaren Gehalt der Sulfinsäure, bevorzugt mindestens in äquimolarer Menge im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt (molares Verhältnis
Sulfinsäure :oxidierbares Substrat bevorzugt mindestens 1:1). Besonders bevorzugt ist ein molares Verhältnis Sulfinsäure :oxidierbares Substrat von mindestens 1:2 und insbesondere bevorzugt von mindestens 1:5.
Die Reaktionsdauer ist abhängig von der Dosierung der H2O2- generierenden Oxidase und beträgt bevorzugt maximal 72 h, besonders bevorzugt maximal 48 h und insbesondere bevorzugt maximal 24 h.
Als Lösemittel für die Reaktion wird bevorzugt Wasser verwendet .
Die Konzentration der Sulfinsäure im Ansatz beträgt bevorzugt mindestens 1 g/L, besonders bevorzugt mindestens 10 g/L und insbesondere bevorzugt mindestens 20 g/L.
Der molare Umsatz der Sulfinsäure zur Sulfonsäure in der erfindungsgemäßen Biotransformation beträgt bevorzugt mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 % und insbesondere bevorzugt mindestens 90 %.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Oxidation von Sulfinsäuren kann in diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Weise betrieben werden. Im diskontinuierlichen Betrieb (Batch Betrieb) werden dem Ansatz im Verlauf der Reaktion alle Reaktanden zugeführt und nach Beendigung der Reaktion der Ansatz aufgearbeitet.
Im kontinuierlichen Betrieb wird das Oxidase-Enzym als stationäre Phase vorgelegt, z.B. in einem Membranreaktor oder an einen Träger immobilisiert und die Substrate umfassend eine Sulfinsäure und ein durch die ThCh-generierende Oxidase oxidierbares Substrat als mobile Phase mit der stationären Phase in Kontakt gebracht. Die Kontaktzeit der mobilen Phase mit der stationären Phase wird dabei bevorzugt so eingestellt, dass die Sulfinsäure zum Produkt Sulfonsäure abreagieren kann.
Bevorzugt ist der diskontinuierliche (Batch) Betrieb.
Die Sulfonsäure aus der erfindungsgemäßen enzymatischen Oxidation kann entweder ohne weitere Aufarbeitungsschritte direkt weiterverwendet oder aber mittels bekannter Methoden angereichert oder gereinigt werden. Dabei ist der Grad der Anreicherung abhängig von der weiteren Verwendung.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfonsäure, besonders bevorzugt Taurin aus dem Reaktionsansatz isoliert wird.
Methoden zur Isolierung von Sulfonsäuren, im speziellen von Taurin, sind dem Fachmann aus Verfahren zur Isolierung z.B. von Aminosäuren bekannt. Sie umfassen z.B. Filtration, Zentrifugation, Extraktion, Adsorption, Ionenaustauscher- Chromatographie, Präzipitation, Kristallisation.
Das erfindungsgemäße Verfahren offenbart einen neuen und unerwarteten Weg zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren zu den entsprechenden Sulfonsäuren und ist insbesondere geeignet für die biotechnologische Herstellung von L- Cysteinsäure und Taurin.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Gehalt an Sulfinsäure (Edukt) und Sulfonsäure (Produkt) zu Beginn, zu verschiedenen Zeiten während der Reaktion und am Ende der Reaktion bestimmt, um den Reaktionsfortschritt zu verfolgen. Der Gehalt einer Lösung oder Zellkultur an Sulfinsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2- SO2H wie beispielsweise der Hypotauringehalt oder der Gehalt an Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H wie beispielsweise der Tauringehalt kann wie folgt bestimmt werden:
Der Gehalt kann direkt aus einem Aliquot des Ansatzes quantifiziert werden, sofern die Konzentration des Sulfinsäure-Edukts zu Beginn der Reaktion mindestens 0,1 g/L beträgt, entsprechend einer äquivalenten Konzentration des Sulfonsäure-Produkts am Ende der Reaktion bei vollständigem Umsatz, bestimmt z.B. durch HPLC. Dazu wird dem Ansatz ein Aliquot von 1 ml entnommen, 5 min bei 80 °C inkubiert, anschließend alle festen Bestandteile beispielsweise durch 5 minütiges Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge abgetrennt und der Überstand durch für die betreffende Sulfinsäure oder Sulfonsäure kalibrierte HPLC quantifiziert, wie z.B. in Beispiel 1 für Hypotaurin und Taurin beschrieben. Ist die Konzentration des Sulfinsäure- Edukts zu Beginn der Reaktion geringer als 0,1 g/L, kann die Probe zur Erhöhung der Messgenauigkeit sowohl für das Sulfinsäure-Edukt wie das Sulfonsäure-Produkt vorher aufkonzentriert werden, z.B. durch Eindampfen der Probe und Wiederauflösen in einem geeigneten Volumen H2O (z.B. 10 % des Probenvolumens, entsprechend einer 10-fachen Konzentrierung).
Wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine Sulfinsäure-haltige Kulturbrühe eingesetzt, so kann diese direkt in die Quantifizierung eingesetzt werden. Alternativ ist es auch möglich, zuerst die Zellen z.B. durch Zentrifugation oder Filtration aus der Kulturbrühe zu entfernen und den resultierenden Sulfinsäure-haltigen Zellkulturüberstand im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen. Es ist auch möglich, die Sulfinsäure mittels an sich bekannter Methoden aus dem Zellkulturüberstand zu isolieren und die aufgereinigte Sulfinsäure im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen. Als Nachweis des erfindungsgemäßen Verfahrens und zur Bestimmung des Umsatzes, kann folgender Biotransformationsassay dienen:
Die Sulfinsäure-haltige Lösung oder Kultur wie z.B. Hypotaurin-haltige Kulturbrühe, bevorzugt Fermenterbrühe, bzw. der entsprechende Zellkulturüberstand, die gereinigte oder kommerziell erhältliche Sulfinsäure wie z.B. Hypotaurin wird verwendet, um einen Biotransformationsansatz herzustellen. Der Biotransformationsansatz im Labormaßstab hat ein Ansatzvolumen von 10 ml und enthält mindestens 0,1 g/L Sulfinsäure (wie oben beschrieben aus der Kultur/Kulturbrühe/Fermenterbrühe, dem abzentrifugierten Kulturüberstand oder als gereinigte Substanz und entsprechend quantifiziert oder als entsprechend dosiertes kommerzielles Produkt). Das Ansatzvolumen kann auch in Abhängigkeit vom Produktionsmaßstab höher sein und beträgt z.B. im präparativen Maßstab mindestens 1 L. Die H2O2- generierende Oxidase, bevorzugt AOX oder GOX, und das durch diese Oxidase oxidierbare Substrat werden zugegeben, sodass die Dosierung der Enzymaktivität mindestens 1 U/ml, beträgt. Wenn AOX verwendet wird, wird als Substrat des AOX-Enzyms mindestens 1 % (v/v) Methanol, d.h. mindestens 0,1 ml auf 10 ml Reaktionsansatz zugegeben. Als Substrat des GOX-Enzyms wird Glucose in einer Dosierung von mindestens 10 g/L dem Reaktionsansatz zugegeben. Der Biotransformationsansatz wird mit Luftsauerstoff versorgt, entweder passiv durch Mischung z.B. auf einem Inkubationsschüttler oder mit einem Rührer, jeweils unter Luftzutritt oder aktiv durch Einträgen von Pressluft, bzw. von reinem Sauerstoff mit und ohne Mischung. Der pH der Reaktion beträgt 7,5, sofern AOX verwendet wird.
Der pH der Reaktion beträgt 5,5, sofern GOX verwendet wird.
Der pH des Ansatzes kann konstant gehalten werden, indem er z.B. mit einer pH-Elektrode ausgestattet wird, welche mit einer pH-Kontrolleinheit verbunden ist, die aus einer Bürette ein Korrekturmittel (Lauge oder Säure) zudosiert (sog. pH-Stat Verfahren) . Die Reaktionstemperatur beträgt 25°C (AOX) oder 30°C (GOX). Der Reaktionsfortschritt kann durch Verbrauch des Edukts Hypotaurin und Bildung des Produkts Taurin verfolgt werden, wobei die quantitative Bestimmung von Hypotaurin und Taurin z.B. durch HPLC erfolgen kann. Entsprechend des Reaktionsfortschritts wird der Zeitpunkt des Reaktionsendes gewählt. Bevorzugt wird das Reaktionsende gewählt, wenn die molare Ausbeute an Sulfonsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H wie beispielsweise Taurin mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80% und insbesondere bevorzugt mindestens 90% beträgt. Die im Reaktionsansatz gebildete Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H steht dann zur weiteren Verwendung zur Verfügung.
Sulfinsäuren können aus chemischer oder fermentativer Herstellung stammen, wobei es bevorzugt ist, dass die in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Sulfinsäure aus fermentativer Herstellung stammt. Besonders bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Hypotaurin handelt und dieses aus fermentativer Herstellung stammt. Wenn die Sulfinsäuren der Formel H2N-CH(R)- CH2-SO2H wie z.B. Hypotaurin aus fermentativer Herstellung stammt und aus dieser im erfindungsgemäßen Verfahren eine Sulfonsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H wie z.B. Taurin gebildet wird, ist der große Vorteil, dass mittels der vorliegenden Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H wie z.B. von Taurin zur Verfügung gestellt wird. Dieses Verfahren erfordert keine chemischen Reaktionsschritte.
Geeignet zur Produktion von Sulfinsäuren der Formel H2N-CH(R)- CH2-SO2H wie z.B. Hypotaurin sind Bakterienstämme (z.B. E. coli, Corynebakterium glutamicum, Pantoea ananatis, Bacillus subtllls), Algen (z.B.Chlamydomonas reinhardtii), Hefen (z.B. Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia llpolytlca) oder Pilze (z.B. Aspergillus niger). Wenn es sich bei der Sulfinsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H um Hypotaurin handelt, wird ein zur Hypotaurinproduktion geeigneter Mikroorganismenstamm verwendet. Ein zur Hypotaurinproduktion geeigneter Mikroorganismenstamm ist gekennzeichnet dadurch, dass er einen Stoffwechselweg enthält, der nach einem der in der KEGG Pathway Datenbank „Taurine and hypotaurine metabolism" angegebenen Stoffwechselwege zu Hypotaurin führt. Da die Biosynthese von Hypotaurin entsprechend der Gleichungen (1) und (3) von L-Cystein ausgeht, ist ein Mikroorganismenstamm bevorzugt, der auch zur Cysteinproduktion geeignet ist. Wie z.B. von Wada und Takagi, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 73: 48-54 beschrieben, ist die Cysteinproduktion in einem Wildtyp-Mikroorganismus strikt reguliert, sodass ein Mikroorganismenstamm mit einem reguliertem Cystein-Biosyntheseweg, wie im Stand der Technik dokumentiert, für die Produktion wirtschaftlich verwertbarer Mengen Hypotaurin nicht geeignet ist. Bevorzugt ist daher ein zur Hypotaurinproduktion geeigneter Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg.
Ein Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein- Biosyntheseweg und damit zur Cystein-Produktion geeignet ist dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine der folgenden Veränderungen aufweist: a) Der Mikroorganismenstamm zeichnet sich durch ein verändertes serA-Gen aus, codierend für eine 3- Phosphoglycerat Dehydrogenase (SerA) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch L-Serin (wie beispielsweise beschrieben in EP 1950 287 Bl), wobei die SerA-Enzymaktivität z.B. photometrisch bestimmt werden kann durch die vom SerA-Substrat 3-Phosphohydroxypyruvat abhängige Oxidation von NADH wie z.B. von McKitrick und Pizer, J. Bacteriol. (1980) 141: 235 - 245 beschrieben.
Besonders bevorzugte Varianten der 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase (serA) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinausgehend bevorzugten Ausführung um mindestens den Faktor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch L-Serin auf. und/oder b) Der Mikroorganismenstamm enthält ein verändertes cysE-Gen, codierend für eine Serin-O-Acetyl-Transferase (CysE), die im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor zwei verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein aufweist (wie beispielsweise beschrieben in EP 0858 510 Bl oder Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611), wobei die CysE-Enzymaktivität z.B. photometrisch bestimmt werden kann durch den Verbrauch des CysE-Substrats Acetyl-CoA infolge der Reaktion mit L-Serin zu O-Acetyl-L-Serin, wie z.B. von Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611 beschrieben. Besonders bevorzugte Varianten der Serin-O-Acetyl-Transferase (cysE) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinausgehend bevorzugten Ausführung um mindestens den Faktor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein auf. und/oder c) Der Mikroorganismenstamm weist einen durch Überexpression eines Effluxgens um mindestens den Faktor zwei erhöhten Cystein-Export aus der Zelle im Vergleich zu der entsprechenden Wildtypzelle auf, wobei der Cystein-Export bestimmt werden kann durch photometrische Messung des extrazellulären Cystein-Gehalts nach Gaitonde, Biochem. J. (1967) 104: 627 - 633 (umfassend Cystein, Cystin und das aus Cystein und Pyruvat gebildete Addukt 2-Methyl- Thiazolidin-2,4- (R)-dicarbonsaure), wie z.B. in EP 0885 962 Bl beschrieben.
Die Überexpression eines Effluxgens führt im Vergleich zu einer Wildtypzelle bevorzugt zu einem um mindestens den Faktor 5, besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 20 erhöhten Cystein-Export aus der Zelle. Das Effluxgen stammt vorzugsweise aus der Gruppe ydeD (siehe EP 0885 962 Bl), yfiK (siehe EP 1382 684 Bl), cydDC (siehe WO 2004/113373 Al), bcr (siehe US 2005-221453 AA) und emrAB (siehe US 2005-221453 AA) von E. coli oder dem entsprechend homologen Gen aus einem anderen Mikroorganismus .
Der zur Hypotaurinproduktion geeignete Mikroorganismenstamm wird entsprechend dem Stand der Technik, bevorzugt durch Fermentation, zur Produktion von Hypotaurin eingesetzt. Es entsteht eine Hypotaurin-haltige Kulturbrühe, bevorzugt Fermenterbrühe. Der Gehalt an Hypotaurin und ggf. Taurin als Nebenprodukt kann aus der Kulturbrühe quantifiziert werden. Dazu wird der Kulturbrühe mit einer Zelldichte OD6oo/nil von mindestens 1,0/ml ein Aliquot von 1 ml entnommen, 5 min bei 80 °C inkubiert, anschließend alle festen Bestandteile beispielsweise durch 5 minütiges Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge abgetrennt und der Überstand durch für Hypotaurin und Taurin kalibrierte HPLC quantifiziert, wie z.B. in Beispiel 1 für Hypotaurin und Taurin beschrieben.
Der Fachmann kann mittels Isotopenanalyse feststellen, ob ein Stoff wie beispielsweise Hypotaurin, den er als Sulfinsäure in das Verfahren einsetzen will, aus chemischer oder fermentativer Herstellung stammt. Ein zur Unterscheidung geeignetes Verfahren der Isotopenanalyse ist z.B. in Sieper et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. (2006) 20: 2521-2527 beschrieben und beruht auf der Bestimmung der Isotopenverhältnisse für z.B. C oder N, welche verschieden sind, je nachdem ob ein Produkt aus chemischer (Erdöl basierter) oder natürlicher (Pflanzen-basierter) Herstellung stammt. Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin zählt dabei zu den Verfahren natürlicher (Pflanzen-basierter) Herstellung, da die zur Anzucht des Produktionsstammes verwendete Glucose entsprechend dem Stand der Technik aus pflanzlicher Produktion stammte.
Unter homologen Genen, Proteinen bzw. homologen Sequenzen ist zu verstehen, dass die DNS- oder Aminosäure-Sequenzen dieser Gene, DNS-Abschnitte oder Proteine zu mindestens 70%, bevorzugt zu mindestens 80% und besonders bevorzugt zu mindestens 90% identisch sind.
Der Grad der DNA-Identität wird durch das Programm „nucleotide blast", zu finden auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, bestimmt, welches auf dem blastn-Algorithmus basiert. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Nukleotidsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust Parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die entsprechenden voreingestellten Scoring Parameter sind: Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap Costs = Linear.
Für den Vergleich von Proteinsequenzen wird das Programm „protein blast", auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, genutzt. Dieses Programm greift auf den blastp-Algorithmus zurück. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Proteinsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die voreingestellten Scoring Parameter sind: Matrix = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Compositional adjustments = Conditional compositional score matrix adjustment.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Hypotaurin handelt und dieses Hypotaurin aus bakterieller Herstellung stammt, d.h. mit Hilfe eines bakteriellen Produktionsstamms hergestellt wurde. Beim bakteriellen Produktionsstamm handelt es sich bevorzugt um einen Stamm der Art Escherichia coli.
Der bevorzugte bakterielle Produktionsstamm zeichnet sich darüberhinaus dadurch aus, dass er zur Cystein-Produktion geeignet ist. Zur Cystein-Produktion geeignete und bevorzugte Stämme sind die in den Beispielen offenbarten Stämme E. coli K12 W3110 x pCys und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys. Wie in Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung offenbart, führt die heterologe Expression eines CDO-Gens, kodierend für eine Cystein-Dioxygenase und eines CSAD-Gens, kodierend für eine Cysteinsulfinsäure-Decarboxylase in dem aus W3110 x pCys abgeleiteten Stamm W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs sowie in dem aus W3110-ppsA-MHI x pCys abgeleiteten Stamm W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs zur Produktion von Hypotaurin und es wird nur wenig Taurin gebildet.
Bei einem mit ppsA-MHI bezeichneten Mikroorganismenstamm, ist dieser dadurch gekennzeichnet, dass diesem die kodierende Sequenz des Wt-ppsA-Gens fehlt und diese durch die ppsA-MHI cds, SEQ ID NO: 9 ersetzt wurde, kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10. ppsA bezeichnet das Gen, das ein Protein mit der Enzymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzymklasse codiert. Das entsprechende Protein wird auch bezeichnet mit PpsA oder als Phosphoenolpyruvat-Synthase (PEP-Synthase) oder auch synonym als Phosphoenolpyruvat-H20-Dikinase. Die Enzymklasse ist dadurch definiert, dass sie in einer reversiblen Reaktion Pyruvat aus Phosphoenolpyruvat herstellen kann gemäß der Formel:
(11) Phosphoenolpyruvat +Phosphat + AMP <-> Pyruvat + H2O + ATP Wie in Beispiel 6 offenbart, kann das Hypotaurin aus diesen Ansätzen durch Verwendung einer Glucoseoxidase zusammen mit D- Glucose in bisher nicht bekannter Weise vollständig zu Taurin umgewandelt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die biotechnologische Herstellung von Taurin durch eine Kombination der biosynthetischen Herstellung von Hypotaurin mit dessen enzymatischer Oxidation zu Taurin.
In einer Weiterführung und Vereinfachung des Verfahrens ist es auch denkbar, die H202-generierende Oxidase im Hypotaurin- Produktionsstamm zu exprimieren. Gene für geeignete H2O2- generierende Oxidasen können in Datenbanken wie NCBI (National Center for Biotechnology Information) identifiziert werden.
Ein Beispiel für eine heterolog in E. coli produzierte Glucoseoxidase ist das GOX-Gen aus Penicillium amagasakiense (Witt et al., App. Environ. Microbiol (1998) 64: 1405 - 1411).
Bevorzugt ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Taurin, bei dem in einem ersten Schritt Hypotaurin durch Anzucht eines Produktionsstammes hergestellt wird und in einem zweiten Schritt das gebildete Hypotaurin ohne weitere Aufarbeitung enzymatisch zu Taurin oxidiert wird, wobei die enzymatische Oxidation von Hypotaurin zu Taurin durch Glucoseoxidase/D-Glucose besonders bevorzugt ist. In den Beispielen der vorliegenden Erfindung sind die biotechnologische Herstellung von Hypotaurin (Beispiel 5) und dessen enzymatische Oxidation zu Taurin (Beispiel 6) offenbart .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Hypotaurin handelt und dieses Hypotaurin aus bakterieller Herstellung stammt, d.h. mit Hilfe eines bakteriellen Produktionsstamms hergestellt wurde, der einen deregulierten Cystein- Biosyntheseweg aufweist. Für den Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg gilt die oben gegebene Definition .
Besonders bevorzugt wird zuerst Cystein hergestellt, welches entsprechend der Gleichung (1) durch das im Produktionsstamm enthaltene CDO-Enzym weiter zu Cysteinsulfinsäure (CDO- Reaktion) und entsprechend der Gleichung (3) durch das ebenfalls im Produktionsstamm enthaltene CSAD-Enzym zu Hypotaurin (CSAD-Reaktion) reagiert.
Besonders bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um mittels eines bakteriellen Produktionstamms hergestelltes Hypotaurin und beim Produktionsstamm um einen der Stämme E. coli K12 W3110 x pCYS- CDOrn-CSADhs oder E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCYS-CDOrn- CSADhs, besonders bevorzugt um den Stamm E. coli K12 W3110- ppsA-MHI x pCYS-CDOrn-CSADhs handelt.
Die Erfindung zeigt somit auch Produktionsstämme zur biotechnologischen Herstellung von Hypotaurin. Besonders bevorzugter Ausgangsstamm ist einer der zur Cysteinproduktion geeigneten Stämme E. coli K 12 W3110 x pCys E. coli K 12 W3110-ppsA-MHI x pCys. Wie in Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung beschrieben, wurde der Vektor pCys (Fig. 1) um die Gene für Cystein Dioxygenase aus Rattus norvegicus (CDOrn),
SEQ ID NO: 1, kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 und für L-Cysteinsulfinsäure Decarboxylase aus Homo sapiens (CSADhs), SEQ ID NO: 3, nt 1 bis nt 1509, kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresquenz SEQ ID NO: 4 erweitert. Es entstand der zur Hypotaurin-Produktion geeignete Vektor pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2).
Dabei ist das verwendete CDO-Gen nicht auf die Spezies Rattus norvegicus beschränkt. Es ist jedes CDO-Gen geeignet, dessen aus der mRNS abgeleitetes Genprodukt (Protein) nach Gleichung (1) geeignet ist, L-Cystein zu L-Cysteinsulfinsäure zu oxidieren. Solche Proteine sind z.B. in der NCBI-Datenbank zu finden, wenn man in der „Protein" Unterdatenbank unter dem Suchbegriff „Cysteine Dioxygenase" nach CDO-Proteinen sucht. Weitere aus dem Stand der Technik bekannte CDO-Proteine und nicht auf diese beschränkt sind bevorzugt das CDO-Protein aus Homo sapiens (Mensch), Cyprinus carpio (Karpfen) oder Synechococcus (Alge) oder ein Protein mit dazu zu 70% homologer Aminosäuresequenz, besonders bevorzugt ein Protein mit dazu zu 80% homologer Aminosäuresequenz und insbesondere bevorzugt hat die Aminosäuresequenz des CDO-Proteins die in SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz und wird codiert durch die in SEQ ID NO: 1 angegebene DNS-Sequenz.
Desgleichen ist das verwendete CSAD-Gen nicht auf die Spezies Homo sapiens beschränkt. Es ist jedes CSAD-Gen geeignet, dessen aus der mRNS abgeleitetes Genprodukt (Protein) nach Gleichung (3) geeignet ist, L-Cysteinsulfinsäure zu Hypotaurin zu decarboxylieren. Solche Proteine sind z.B. in der NCBI- Datenbank zu finden, wenn man in der „Protein" Unterdatenbank unter dem Suchbegriff „Cysteine Sulfinic Acid Decarboxylase" nach CSAD-Proteinen sucht. Weitere aus dem Stand der Technik bekannte CSAD-Proteine und nicht auf diese beschränkt sind bevorzugt das CSAD-Protein aus Rattus norvegicus (Ratte), Cyprinus carpio (Karpfen), Synechococcus (Alge) oder E coli oder ein Protein mit dazu zu 70% homologer Aminosäuresequenz, besonders bevorzugt ein Protein mit dazu zu 80% homologer Aminosäuresequenz und insbesondere bevorzugt hat die Aminosäuresequenz des CSAD-Proteins die in SEQ ID NO: 4 angegebene Sequenz und wird codiert durch die in SEQ ID NO: 3 von nt 1-1509 angegebene DNS-Sequenz.
Ein Genkonstrukt enthaltend das CDO- und CSAD-Gen, wie beispielsweise besonders bevorzugt das Konstrukt pCys-CDOrn- CSADhs kann entsprechend dem Stand der Technik mit Hilfe von dem Fachmann bekannten rekombinanten DNS-Techniken hergestellt werden, wie z.B. in Beispiel 4 detailliert beschrieben.
Dazu werden ein CDO-Gen, das für die Cystein-Dioxygenase codiert, und ein CSAD-Gen, das für eine Cysteinsulfinsäure- Decarboxylase codiert, in einen hierfür geeigneten Vektor kloniert. Grundsätzlich ist jeder Vektor geeignet, mit dem sich das CDO- und das CSAD-Gen in einem Produktionsstamm exprimieren lassen.
Zur Herstellung eines das CDO- und CSAD-Gen enthaltenden Genkonstrukts können das CDO- und CSAD-Gen jeweils mit eigenem Promotor und ggf. Terminator als eigenständige Expressionseinheiten oder aber auch, in beliebiger Reihenfolge, als Operon unter Kontrolle nur eines Promotors in den Vektor kloniert werden. Weiterhin möglich ist eine Operonstruktur, bei der das CDO- und CSAD-Gen, jeweils mit eigener Ribosomenbindestelle, hinter eines der sich bereits auf dem Vektor befindlichen Gene kloniert und unter Kontrolle des Promotors des betreffenden Gens exprimiert werden. Für das CDO- und das CSAD-Gen sind darüber hinaus alle weiteren denkbaren Kombinationen aus Expression unter eigenem Promotor und als Operon möglich.
Ebenso denkbar ist, das CDO- und CSAD-Gen als eigene Expressionseinheiten unabhängig von dem eine deregulierte Cystein Biosynthese gewährleistenden Vektor wie z.B. pCys in einen eigenen Vektor zu klonieren, bzw. ins Genom eines Wirtsorganismus wie E. coli zu integrieren.
Für die Expression des CDO- und CSAD-Gens bevorzugt ist die Form eines künstlichen Operons jeweils mit eigener Ribosomenbindestelle (RBS), aber ohne eigenen Promotor.
Besonders bevorzugt handelt es sich beim Vektor um pCys-CDOrn- CSADhs, bei dem das CDO- und das CSAD-Gen hinter das in pCys enthaltene serA317-Gen kloniert werden, so dass ihre Expression unter Kontrolle des serA317-Promotors erfolgt entsprechend einer Reihenfolge der Expressionseinheiten: serA- Promotor-> (serA317-cds)->RBS-(CDOrn-cds)->RBS-(CSADhs-cds)- rrnB-Terminator . Dabei ist eine Konfiguration der Expressionseinheiten, bei der die CSAD-cds vor der CDO-cds angeordnet ist, ebenso möglich. pCys-CDOrn-CSADhs zeichnet sich darüber hinaus dadurch aus, dass er eine deregulierte Cystein-Biosynthese gewährleistet, indem er Expressionseinheiten für die Feedback-resistente Variante serA317 der 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase (serA- Gen), die Feedback-resistente Variante CysEX der Serin-O- Acetyl-Transferase (cysE-Gen) sowie das ydeD-Gen eines Cystein-Efflux Proteins umfasst. Von der Erfindung betroffen sind Vektoren, die mindestens eines, bevorzugt zwei und besonders bevorzugt drei der Gene serA317, cysEX oder ydeD enthalten, wobei die betroffenen Gene in beliebiger Auswahl und Reihenfolge auf dem Vektor enthalten sein können.
Wenn CDO und CSAD in einen Vektor kloniert wurden, wird dieser anschließend in bekannter Weise in einen geeigneten Wirtsstamm transformiert. Als Wirtsstamm eignet sich jeder Mikroorganismus, der rekombinanten DNS-Techniken zugänglich ist und der für eine fermentative Herstellung von rekombinanten Proteinen geeignet ist. Bevorzugter Wirtsstamm ist ein Stamm der Art Escherichia coli, besonders bevorzugt der Stamm E. coli K12 W3110 oder E. coli K12 W3110-ppsA-MHI. Die aus der Transformation erhaltenen Stämme wie besonders bevorzugt W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs oder W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs sind zur Produktion von Hypotaurin geeignet, wie in Beispiel 5 beschrieben.
Die Herstellung von Hypotaurin unter Verwendung von besonders bevorzugt einem der Stämme E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn- CSADhs oder E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs kann dabei durch Anzucht im Schüttelkolben erfolgen (wie in Beispiel 5 beschrieben) oder im Produktionsmaßstab durch Fermentation des Stammes.
Das gebildete Hypotaurin wird im erfindungsgemäßen Verfahren durch enzymatische Oxidation zu Taurin umgewandelt. Dazu wird die Hypotaurin-haltige Zellkultur mit einer H202-generierenden Oxidase in Gegenwart ihres Substrats wie beispielsweise mit einer Glucoseoxidase in Gegenwart von Glucose inkubiert (siehe Beispiel 6).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Cysteinsulfinsäure und bei der entstehenden Sulfonsäure um Cysteinsäure handelt.
Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die molare Ausbeute an Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H bezogen auf die eingesetzte additive molare Konzentration an Sulfinsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H und Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80% und insbesondere bevorzugt mindestens 90% beträgt. Bevorzugt beträgt dabei die eingesetzte Menge Sulfinsäure mindestens 1 mM (109,2 mg/L), besonders bevorzugt mindestens 10 mM (1,1 g/L) und insbesondere bevorzugt mindestens 100 mM (10,9 g/L).
Um den Wert der molaren Ausbeute zu bestimmen, werden der molare Gehalt der in die enzymatische Oxidation eingesetzten Sulfin- und Sulfonsäuren zu Beginn und am Ende der Reaktion mittels HPLC wie im Stand der Technik bekannt bestimmt. Beispielsweise kann die Bestimmung erfolgen, wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei die Molekulargewichte 109,2 g/Mol für Hypotaurin und 125,2 g/Mol für Taurin berücksichtigt werden. Der molare Gehalt Sulfonsäure im Ansatz am Ende der Reaktion im Verhältnis zum aufsummierten molaren Gehalt aus Sulfinsäure und Sulfonsäure zu Beginn der Reaktion ergibt die molare Ausbeute der Sulfonsäure, ausgedrückt in Prozent.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide. Fig. 1: pCys.
Fig. 2: pCys-CDOrn-CSADhs.
Fig. 3: pKD46.
Fig. 4: pKan-SacB.
In den Figuren verwendete Abkürzungen : bla: Gen, das Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht
(ß-Lactamase) kanR: Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht araC: araC-Gen (Repressorgen)
P araC: Promotor des araC-Gens
P araB: Promotor des araB-Gens
Garn: Lambda Phage Gam-Rekombinationsgen
Bet: Lambda Phage Bet-Rekombinationsgen
Exo: Lambda Phage Exo-Rekombinationsgen
ORI101: Temperatur-sensitiver Replikationsursprung
RepA: Gen für das Plasmid-Replikationsprotein A sacB: Levansucrase-Gen pr-f: Bindungsstelle f für Primer (vorwärts) pr-r: Bindungsstelle r für Primer (revers) OriC: Replikationsursprung C
TetR: Gen, das Resistenz gegen Tetracyclin verleiht
P15A ORI: Replikationsursprung serA317 : serA (3-Phosphoglycerat Dehydrogenase-Gen, codiert für Aminosäure 1 bis 317) cds cysE X: cysE (Serin-O-Acetyltransferase-Gen, Feedback resistent) eds
ORF306: ydeD (Cystein Efflux-Gen) eds Seal: Schnittstelle für das Restriktionsenzym Seal PpuMI: Schnittstelle für das Restriktionsenzym PpuMI CDOrn: CDO (Cystein Dioxygenase) R. norvegicus eds CSADhs: CSAD (Cysteinsulfinsäure Decarboxylase) H. sapiens eds
RBS: Ribosomenbindestelle
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne diese auf sie zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Oxidation von Hypotaurin und Cysteinsulfinsäure mit Alkoholoxidase (AOX)
A) Oxidation von Cysteinsulfinsäure zu Cysteinsäure mit AOX:
Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit und ohne AOX, untersucht. In zwei 100 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 12 mg L-Cysteinsulfinsäure x H2O (Sigma-Aldrich) eingewogen, in 9,9 ml 100 mM Na- Phosphat, pH 7,5 gelöst und 0,1 ml Methanol
(Endkonzentration 1%, v/v) zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden in einem Ansatz 30 mΐ kommerziell erhältlicher AOX aus Pichia pastoris (Sigma-Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Nach den Angaben des Herstellers zur Enzymaktivität betrug die AOX-Aktivität im Ansatz 5 U/ml.
Der zweite Ansatz ohne AOX (Vergleichsansatz) erhielt 30 mΐ 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Die Ansätze wurden bei 25°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler). Zu Beginn und 5 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC analysiert. Der Gehalt an L- Cysteinsulfinsäure und L-Cysteinsäure im Ansatz mit AOX und im Ansatz ohne AOX zu Beginn (0 h) und nach 5 h Reaktionsdauer ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von L-
Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure durch AOX in Gegenwart von Methanol
+ 5 U/ml AOX ohne AOX
Zeit L-Cystein- L-Cystein- L-Cystein- L-Cystein- sulfinsäure säure sulfinsäure säure
[mg/L] [mg/L] [mg/L] [mg/L]
0 h 1171,5 0,0 1239,3 0,0 5 h 13,4 1023,3 1244,3 0,0
B) Oxidation von Hypotaurin zu Taurin mit AOX :
Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit und ohne AOX, untersucht. In zwei 100 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 12 mg Hypotaurin (Sigma- Aldrich) eingewogen, in 9,9 ml 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5 gelöst und 0,1 ml Methanol (Endkonzentration 1%, v/v) zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden in einem Ansatz 30 mΐ kommerziell erhältlicher AOX aus Pichia pastoris (Sigma- Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Nach den Angaben des Herstellers zur Enzymaktivität betrug die AOX-Aktivität im Ansatz 5 U/ml. Der Ansatz ohne AOX (Vergleichsansatz) erhielt 30 mΐ 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Die Ansätze wurden bei 25°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler) . Zu Beginn und 5 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC analysiert. Der Gehalt an Hypotaurin und Taurin im Ansatz mit Alkoholoxidase (AOX) und im Ansatz ohne Alkoholoxidase zu Beginn (0 h) und nach 5 h Reaktionsdauer ist in Tabelle 2 zusammengefasst .
Tabelle 2: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von
Hypotaurin zu Taurin durch AOX in Gegenwart von Methanol HPLC-Analytik von L-Cysteinsulfinsäure, L-Cysteinsäure, Hypotaurin und Taurin:
Zur quantitativen Bestimmung der in den Beispielen quantitativ analysierten Verbindungen wurde eine jeweils für L- Cysteinsulfinsäure, L-Cysteinsäure, Hypotaurin und Taurin kalibrierte HPLC-Methode eingesetzt, wobei alle zur Kalibrierung verwendeten Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich waren (Sigma-Aldrich). Verwendet wurde ein HPLC- Gerät der Fa. Agilent, Modell 1260 Infinity II, ausgerüstet mit einer aus der Analytik von Aminosäuren bekannten Vorsäulenderivatisierung mit o-Phtaldialdehyd (OPA- Derivatisierung) vom gleichen Hersteller. Zum Nachweis der OPA-derivatisierten Produkte von L-Cysteinsulfinsäure, L- Cysteinsäure, Hypotaurin und Taurin war das HPLC-Gerät mit einem Fluoreszenzdetektor ausgerüstet. Der Detektor war eingestellt auf eine Excitationswellenlänge von 330 nm und eine Emissionswellenlänge von 450 nm. Des weiteren verwendet wurde eine Accucore™ aQ Säule der Fa. Thermo Scientific™,
Länge 100 mm, innerer Durchmesser 4,6 mm, Partikelgröße 2,6 pm, im Säulenofen auf 40°C temperiert.
Laufmittel A: 25 mM Na-Phosphat, pH 6,0 Laufmittel B:Methanol
Die Trennung erfolgte im Gradientenmodus: 0 - 25 min, 10% Laufmittel B auf 60% Laufmittel B, gefolgt von 2 min 60% Laufmittel B auf 100% Laufmittel B, gefolgt von weiteren 2 min 100% Laufmittel B, bei einer Flußrate von 0,5 ml/min. Retentionszeit von L-Cysteinsäure: 3,2 min. Retentionszeit von L-Cysteinsulfinsäure : 4,1 min. Retentionszeit von Taurin: 14,8 min. Retentionszeit von Hypotaurin: 15,7 min.
Beispiel 2: Oxidation von Hypotaurin und Cysteinsulfinsäure mit Glucoseoxidase (GOX)
A) Oxidation von Cysteinsulfinsäure zu Cysteinsäure mit GOX:
Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit und ohne GOX, untersucht. In zwei 100 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 12 mg L-Cysteinsulfinsäure x H2O (Sigma-Aldrich) eingewogen, in 9,5 ml 100 mM Na-Acetat, pH 5,5 gelöst und 0,5 ml einer 200 g/L Glucose Lösung im gleichen Puffer zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden in einem Ansatz 50 mΐ kommerziell erhältlicher GOX aus Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Nach den Angaben des Herstellers betrug die GOX-Aktivität im Ansatz 5 U/ml. Der Ansatz ohne GOX (Vergleichsansatz) erhielt 50 mΐ 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Die Ansätze wurden bei 30°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler). Zu Beginn und 5 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC wie oben beschrieben analysiert.
Der Gehalt an L-Cysteinsulfinsäure und L-Cysteinsäure im Ansatz mit GOX und im Ansatz ohne GOX zu Beginn (0 h) und nach 5 h Reaktionsdauer ist in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von L- Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure durch GOX in Gegenwart von Glucose
+ 5 U/ml GOX ohne GOX -Cystein- L-Cystein- L-Cystein- L-Cystein- lfinsäure säure lfinsäure säure
[mg/L] [mg/L] [mg/L] [mg/L]
1322,7 0,0 1146,3 0,0 3,0 1279,3 1171,3 0,0
B) Oxidation von Hypotaurin zu Taurin mit GOX :
Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit und ohne GOX, untersucht. In zwei 100 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 12 mg Hypotaurin (Sigma- Aldrich) eingewogen, in 9,5 ml 100 mM Na-Acetat, pH 5,5 gelöst und 0,5 ml einer 200 g/L Glucose Lösung im gleichen Puffer zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden in einem Ansatz 50 mΐ kommerziell erhältlicher GOX aus Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Nach den Angaben des Herstellers betrug die GOX- Aktivität im Ansatz 5 U/ml. Der Ansatz ohne GOX (Vergleichsansatz) erhielt 50 mΐ 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Die Ansätze wurden bei 30°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler) . Zu Beginn und 5 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC wie oben beschrieben analysiert.
Der Gehalt an Hypotaurin und Taurin im Ansatz mit GOX und im Ansatz ohne GOX zu Beginn (0 h) und nach 5 h Reaktionsdauer ist in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von
Hypotaurin zu Taurin durch GOX in Gegenwart von Glucose
Beispiel 3: Präparative Oxidation von Hypotaurin zu Taurin mit GOX
Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit unterschiedlicher Dosierung des Enzyms GOX, untersucht, wobei die Konzentration des zu oxidierenden Substrats Hypotaurin jeweils 20 g/L betrug.
In Ansatz 1 wurde in einem 100 ml Erlenmeyerkolben 200 mg Hypotaurin (Sigma-Aldrich) eingewogen, in 6,95 ml 100 mM Na- Acetat, pH 5,5 gelöst und 3 ml einer 200 g/L Glucose Lösung im gleichen Puffer zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden 50 mΐ kommerziell erhältlicher GOX aus Aspergillus niger (Sigma- Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Nach den Angaben des Herstellers zur Enzymaktivität betrug die GOX- Aktivität im Ansatz 5 U/ml.
In Ansatz 2 wurde in einem 100 ml Erlenmeyerkolben 200 mg Hypotaurin (Sigma-Aldrich) eingewogen, in 6,5 ml 100 mM Na- Acetat, pH 5,5 gelöst und 3 ml einer 200 g/L Glucose Lösung im gleichen Puffer zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden 500 mΐ kommerziell erhältlicher GOX aus Aspergillus niger (Sigma- Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Nach den Angaben des Herstellers zur Enzymaktivität betrug die GOX- Aktivität im Ansatz 50 U/ml.
Die Ansätze 1 und 2 wurden bei 30°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler).3 h, 6 h und 24 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC wie oben beschrieben analysiert. Der zeitliche Verlauf der Reaktionen ist in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von Hypotaurin zu Taurin durch GOX in Gegenwart von Glucose
Beispiel 4: Herstellung der Hypotaurin ProduktionsStämme E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs Cystein Dioxygenase CDOrn:
CDOrn: Die Aminosäuresequenz der Cystein-Dioxygenase aus Rattus norvegicus ist in der NCBI (National Center for Biotechnology Information) Datenbank unter der Sequence ID: AAH70509.1 offenbart. Aus der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) abgeleitet und synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics). Diese mit CDOrn bezeichnete DNS-Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 offenbart, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2.
Cysteinsulfinsäure Decarboxylase CSADhs:
CSADhs: Die Aminosäuresequenz der Cysteinsulfinsäure- Decarboxylase (CSADhs) aus Homo sapiens ist in der NCBI (National Center for Biotechnology Information) Datenbank unter der Sequence ID: XP_016861786.1 offenbart. Aus der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) abgeleitet. Diese mit CSADhs bezeichnete DNS-Sequenz ist in SEQ ID NO: 3, nt 1 bis 1509 offenbart, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 4. Die DNS-Sequenz des E. coli rrnB-Terminators (SEQ ID NO:3, nt 1510 bis 1842) wurde mit nt 1509 verknüpft.
Die DNS-Sequenz des rrnB-Terminators ist offenbart in Orosz et al., Eur. J. Biochem. (1991) 201: 653 -659. Die in SEQ ID NO:3 offenbarte DNS, bestehend aus der CSADhs cds und dem rrnB- Terminator wurde synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics) und erhielt die Bezeichnung CSADhs-rrnB.
Herstellung des Vektors pCys-CDOrn-CSADhs:
- Vektor pCys (Fig. 1) bezeichnet das Plasmid pACYC184-cysEX- GAPDH-ORF306-serA317, ein Derivat des in EP 0885 962 Bl offenbarten Plasmids pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306. Das Plasmid pACYCl84-cysEX-GAPDH-ORF3 06 enthält neben dem Replikationsursprung und einem Tetracyclin-Resistenzgen (Ausgangsvektor pACYC184) das cysEX-Allel, das für eine Serin-O-Acetyl-Transferase mit einer verminderten Feedback- Hemmung durch Cystein codiert sowie das Effluxgen ydeD (ORF306), dessen Expression durch den konstitutiven GAPDH Promotor gesteuert wird.
Um pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317 zu erhalten, wurde in pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 das serA317 Genfragment codierend für die N-terminalen 317 Aminosäuren des SerA Proteins aus E. coli und offenbart in Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184 (darin bezeichnet als „NSD:317") hinter das ydeD (ORF306) Efflux Gen kloniert. SerA317 codiert für eine gegen Serin Feedback-resistente Variante der 3- Phosphoglycerat Dehydrogenase. Die Expression von serA317 wird gesteuert durch den serA-Promotor.
Mit pCys transformierte E. coli Zellen produzieren infolge einer deregulierten Biosynthese Cystein, das Ausgangsprodukt für die Folgeprodukte Cysteinsulfinsäure und Hypotaurin.
- Vektor pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2): pCys wurde mit Seal und PpuMI geschnitten. Das dabei freigesetzte 6,1 kb Vektorfragment wurde nach präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert (QIAquick® Gel Extraction Kit, Qiagen).
Die CDOrn-DNS wurde aus der synthetischen DNS SEQ ID NO: 1 (CDOrn) durch PCR („Phusion™ High-Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Primern cdorn-lf (SEQ ID NO: 5) und csadhs-2r (SEQ ID NO: 6) amplifiziert und als 0,6 kb großes Fragment isoliert.
Primer cdorn-lf umfasste, beginnend vom 5'-Ende, 28 nt überlappend mit dem durch Scal-Verdau erhaltenen 3'-Ende des 6,1 kb pCys Scal/PpuMI Vektorfragments (nt 1 bis 28 in SEQ ID NO: 5), eine Ribosomenbindestelle (RBS) (nt 31 bis 36 in SEQ ID NO: 5) sowie die ersten 22 nt der CDOrn eds (SEQ ID NO 5, nt 44 bis 65). Primer csadhs-2r umfasste, in revers-complementärer Form, beginnend vom 5'-Ende, 22 nt überlappend mit dem Start der CSADhs cds (SEQ ID NO: 6, nt 1 bis 22), gefolgt von einer Ribosomenbindestelle (SEQ ID NO: 6, nt 30 bis 35) sowie die letzten 20 nt der CDOrn cds (SEQ ID NO: 6, nt 38 bis 57).
- CSADhs-rrnB-DNS: Das DNS-Fragment wurde aus der synthetischen
DNS SEQ ID NO: 3 (CSADhs-rrnB) durch PCR („Phusion™ High-
Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Primern csadhs-3f (SEQ ID NO: 7) und glf-2r (SEQ ID NO: 8) amplifiziert und als 1,8 kb großes Fragment isoliert.
Primer csadhs-3f umfasste, beginnend vom 5'-Ende, 20 nt überlappend mit dem 3'-Ende der CDOrn cds (nt 1 bis 20 in SEQ ID NO: 7), eine Ribosomenbindestelle (nt 23 bis 28 in SEQ ID NO: 7) sowie die ersten 22 nt der CSADhs cds (SEQ ID NO 7, nt 36 bis 57).
Primer glf-2r umfasste, in revers-complementärer Form, beginnend vom 5'-Ende, 33 nt überlappend mit dem durch PpuMI- Verdau erhaltenen 5'-Ende des 6,1 kb pCys Scal/PpuMI Vektorfragments (nt 1 bis 33 in SEQ ID NO: 8), gefolgt von den letzten 22 nt des rrnB-Terminators (SEQ ID NO: 8, nt 34 bis 55).
- Vektor pCys-CDOrn-CSADhs: Das 6,1 kb pCys Scal/PpuMI Vektorfragment, das 0,6 kb CDOrn PCR-Produkt (CDOrn-DNS) und das 1,8 kb CSADhs-rrnB PCR-Produkt (CSADhs-rrnB-DNS) wurden mit dem NEBuilder® Klonierkit (NEB New England Biolabs) nach den Angaben des Herstellers ligiert.
Anschließend wurden E. coli NEB® 1O-beta-Zellen (NEB New England Biolabs) mit dem Ligationsansatz transformiert. Klone aus der Transformation wurden auf LBtet selektiert. LBtet enthielt 10 g/L Trypton (GIBCO™), 5 g/L Hefeextrakt (BD Biosciences), 5 g/L NaCl, 15 g/L Agar und 15 mg/L Tetracyclin (Sigma-Aldrich). Ein Einzelklon aus der Transformation wurde analysiert durch Anzucht in LBtet-Flüssigmedium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl und 15 mg/L Tetracyclin) und Isolierung des Vektors aus dem Zellpellet der Anzucht. Der korrekte 8,5 kb Vektor erhielt die Bezeichnung pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2).
- Stamm E. coli W3110:
Verwendet wurde der Stamm Escherichia coli K12 W3110 (käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 5911 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
- Stamm E. coli W3110-ppsA-MHI:
Verwendet wurde der Stamm E. coli K12 W3110-ppsA-MHI. E. coli K12 W3110-ppsA-MHI ist gekennzeichnet durch das mutierte ppsA-Gen ppsA-MHI (SEQ ID NO: 9), kodierend für ein Protein mit der Proteinsequenz aus SEQ ID NO: 10 und der Enzymaktivität einer PEP-Synthase (in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichnete Enzymklasse). E. coli K12 W3110-ppsA-MHI wurde hergestellt durch Verwendung der dem Fachmann bekannten Kombination aus Lambda-Red Rekombination und einem Gegenselektions-Screening zur genetischen Modifikation (siehe z.B. Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245). Um das ppsA WT-Gen von E. coli K12 W3110 gegen ppsA-MHI auszutauschen wurden folgende Schritte durchgeführt:
1) E. coli K12 W3110 wurde mit dem Plasmid pKD46 (Fig. 3, offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048746.1) transformiert und der Stamm E. coli W3110 x pKD46 isoliert (Ampicillin Selektion).
2) Vom Plasmid pKan-sacB (Fig. 4) wurde die 3,2 kb Kan-sacB- Kassette durch PCR mit den Primern pps-9f (SEQ ID NO: 11, bindet an der als „pr-f" bezeichneten Stelle in Fig. 4) und pps-10r (SEQ ID NO: 12, bindet an der als „pr-r" bezeichneten Stelle in Fig. 4) isoliert. Das Plasmid pKan- sacB enthält Expressionskassetten sowohl für das Kanamycin (Kan) Resistenz Gen wie für das sacB Gen, codierend für das Enzym Levansucrase. Das E. coli Kanamycin Resistenzgen (Kan), kodierend für eine Aminoglycosid- Phosphotransferase, ist offenbart in der NCBI Datenbank unter der Zugangsnummer SH02_03400. Das B. subtilis sacB- Gen ist offenbart in der NCBI Datenbank unter der Zugangsnummer 936413.
Primer pps-9f enthält die ersten 30 nt des ppsA-WT-Gens (identisch mit SEQ ID NO: 9, nt 1 bis 30) und daran angeschlossen 20 nt der als „pr-f" bezeichneten Stelle in Fig. 4. Primer pps-lOr enthält die letzten 30 nt des ppsA- WT-Gens, in revers komplementärer Form (identisch mit SEQ ID NO: 9, nt 2350 - 2379) und daran angeschlossen 20 nt der als „pr-r" bezeichneten Stelle in Fig. 4.
3) E. coli W3110 x pKD46 wurde mit der 3,2 kb Kan-sacB- Kassette transformiert und Kanamycin-resistente Klone isoliert.
4) Die Klone wurden auf LBSC-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 7% Saccharose, 1,5% Agar und 15 mg/L Kanamycin) überimpft. Klone mit integriertem sacB-Gen produzierten aus der Saccharose toxisches Levan, was zur Wachstumshemmung führte (Saccharose-sensitiv). Ein Kanamycin-resistenter und Saccharose-sensitiver Klon wurde ausgewählt und als W3110-ppsA::Kan-sacB x pKD46 bezeichnet.
5) W3110-ppsA::Kan-sacB x pKD46 wurde mit DNS des ppsA-MHI- Gens (SEQ ID NO: 9, synthetisch hergestellt, Fa. Eurofins Genomics) transformiert und Klone auf LBS-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 7% Saccharose, 1,5% Agar) ohne Kanamycin selektiert. Auf LBS-Platten konnten nur Klone wachsen, die kein aktives sacB-Gen mehr enthielten. Diese Klone wurden auf LBkan-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 1,5 % Agar, 15 mg/L Kanamycin) überimpft um solche Klone zu selektieren, die auch kein aktives Kan-Gen mehr enthielten und deren Wachstum in Gegenwart von Kanamycin gehemmt wurde.
6) Ein Klon mit positivem Wachstum in Gegenwart von Saccharose und negativem Wachstum in Gegenwart von Kanamycin wurde ausgewählt, das ppsA-MHI-Gen aus genomischer DNS des Stammes durch PCR isoliert und durch DNS-Sequenzierung (Eurofins Genomics) bestätigt, dass das ppsA-MHI Gen mit der DNS-Sequenz wie in SEQ ID NO: 9 offenbart integriert worden war, kodierend für ein Protein entsprechend der Sequenz aus SEQ ID NO: 10. Der Stamm, nach Entfernung des Plasmids pKD46 durch Inkubation bei 42°C erhielt die Bezeichnung E. coli W3110-ppsA-MHI.
- ProduktionsStämme: Plasmid-DNS des Vektors pCys-CDOrn-CSADhs wurde in die Stämme E. coli K12 W3110 und E. coli K12 W3110- ppsA-MHI transformiert. Zum Vergleich wurden E. coli K12 W3110 und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI mit dem Vektor pCys transformiert. Transformanten wurden auf LBtet selektiert. Jeweils ein Klon wurde isoliert. Die Stämme erhielten die Bezeichnung E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli K12 W3110 x pCys bzw. analog E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys. E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli K12 W3110- ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs wurden als Produktionsstämme zur Herstellung von Hypotaurin verwendet.
Beispiel 5: Produktion von Hypotaurin im Schüttelkolben
Von den Stämmen E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs, E. coli K12 W3110 x pCys, E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn- CSADhs und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys wurde in LBtet- Flüssigmedium jeweils eine Vorkultur hergestellt (Anzucht bei 37°C und 120 rpm über Nacht).
Hauptkultur: 0,5 ml der Vorkultur wurden in einen 300 ml Erlenmeyerkolben (mit Schikane) mit 30 ml SM1-Ac-Medium, darüber hinaus enthaltend 15 g/L Glucose, 2 g/L Na2S203 x 5 H2O, 0,1 g/L L-Isoleucin, 0,1 g/L D,L-Methionin, 0,1 g/L L- Threonin, 5 mg/L Vitamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin, überführt.
Zusammensetzung des SM1-Ac-Mediums: 12 g/L K2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 5 g/L NH4-Acetat, 0,3 g/L MgS04 x 7 H20, 0,015 g/L CaCl2 x 2 H20, 0,002 g/L FeS04 x 7 H20, 1 g/L Na3Citrat x 2 H20, 0,1 g/L NaCl; 1 ml/L Spurenelementlösung.
Zusammensetzung der Spurenelementlösung: 0,15 g/L Na2Mo04 x 2 H20, 2,5 g/L H3BO3, 0,7 g/L CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/L CuS04 x 5 H20, 1,6 g/L MnCl2 x 4 H20, 0,3 g/L ZnS04 x 7 H20.
Die Hauptkultur wurde für 24 h bei 30°C und 140 rpm in einem Truhenschüttler (Infors) inkubiert. Nach 24 h wurden 1 ml Proben entnommen und die Zelldichte ODöoo/nil (optische Dichte der Hauptkultur, photometrisch gemessen bei 600 nm) gemessen mit einem Genesys™ 10S UV-Vis Spektralphotometer der Fa. Thermo-Scientific™, sowie der Gehalt an Hypotaurin und Taurin durch HPLC bestimmt. Der durch HPLC bestimmte Gehalt an Hypotaurin im Kulturüberstand betrug für E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs (Zelldichte ODöoo/nil der Kultur: 5,3/ml)
157,3 mg/L. Der Taurin-Gehalt im Kulturüberstand betrug 52,8 mg/L.
Für E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs (Zelldichte ODeoo/nil der Kultur: 7,1/ml) betrug der durch HPLC bestimmte Gehalt an Hypotaurin im Kulturüberstand 1059,2 mg/L und an Taurin 304,1 mg/L.
Für beide Vergleichsstämme E. coli K12 W3110 x pCys (Zelldichte ODöoo/nil der Kultur: 6,1/ml) und E. coli K12 W3110- ppsA-MHI x pCys (Zelldichte ODöoo/nil der Kultur: 7,5/ml) konnte weder Hypotaurin noch Taurin nachgewiesen werden.
Beispiel 6: Oxidation von Hypotaurin aus der
Schüttelkolbenanzucht zu Taurin
Je 10 ml der Ansätze aus der Schüttelkolbenanzucht von E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli W3110-ppsA-MHI x pCys- CDOrn-CSADhs (Beispiel 5) wurden 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Megafuge® 1.0 R), 9,4 ml des jeweiligen Überstands in einen 100 ml Erlenmeyerkolben überführt und mit 0,7 M NaOH auf pH 5,5 eingestellt. 0,5 ml einer Lösung von 200 g/L Glucose in H20 (Endkonzentration 10 g/L im Ansatz) und 100 mΐ einer 1 U/mI Stammlösung von GOX aus Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5 wurden zugegeben (Endkonzentration 10 U/ml) und die Ansätze (10 ml Volumen) in einem Truhenschüttler (Infors) bei 30°C und 140 rpm inkubiert. Zu Beginn und 2 h nach Start der Inkubation wurden jeweils 1 ml des Ansatzes entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und der Überstand durch HPLC analysiert.
Wie in Tabelle 6 zusammengefasst, wurde das in der Schüttelkolbenkultur enthaltene Hypotaurin (Beispiel 5) von 157,3 mg/L (Stamm W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs) und 1059,2 mg/L (Stamm W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs) vollständig verbraucht und es entstand Taurin in einer Konzentration von 212,8 mg/L, bzw. 1355,6 mg/L. Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Molekulargewichte (109,2 g/Mol für Hypotaurin, 125,2 g/Mol für Taurin) wurde die molare Ausbeute bestimmt. Wie in Tabelle 6 angegeben, betrug für den Stamm W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs der Gehalt an Hypotaurin (1,4 mM) und Taurin (0,4 mM) zu Beginn der Reaktion zusammen 1,8 mM. 2 h nach Start der Reaktion betrug der Gehalt an Taurin 1,7 mM und Hypotaurin war nicht mehr nachweisbar. Die molare Ausbeute an Taurin aus der enzymatischen Oxidation eines Hypotaurin/Taurin Produktgemisches, d.h. bezogen auf den Gesamteinsatz an Hypotaurin und Taurin (1,4+0,4=1,8 mM) aus der Schüttelkolbenanzucht betrug 94,4 %. Für den Stamm W3110- ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs betrug der Gehalt an Hypotaurin (9,7 mM) und Taurin (2,4 mM) zu Beginn der Reaktion zusammen 12,1 mM. 2 h nach Start der Reaktion betrug der Gehalt an Taurin 10,8 mM und Hypotaurin war nicht mehr nachweisbar. Die molare Ausbeute an Taurin aus der enzymatischen Oxidation eines Hypotaurin/Taurin Produktgemisches, d.h. bezogen auf den Gesamteinsatz an Hypotaurin und Taurin (9,7+2,4=12,1 mM) aus der Schüttelkolbenanzucht betrug 89,3 %. Tabelle 6: Oxidation von Hypotaurin aus der
Schüttelkolbenanzucht des Stammes E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs bzw. des Stammes E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs zu Taurin nach 2 h Inkubation mit GOX in Gegenwart von Glucose
W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs:
Taurin mg/L mM
0 h 157,3 1,4 52,8 0,4
2 h 0,0 0,0 212,8 1,7
W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs
Taurin mg/L mM
0 h 1059,2 9,7 304,1 2,4 2 h 0,0 0,0 1355,6 10,8

Claims

Ansprüche :
1. Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H zu Sulfonsäuren der Formel H2N- CH (R)-CH2-SO3H mit einem Enzym ausgewählt aus der Klasse der H202- enerierenden Oxidasen in Gegenwart ihres Substrats .
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der H202-generierenden Oxidase um Alkoholoxidase handelt und als Substrat ein primärer Alkohol vorhanden ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der H202-generierenden Oxidase um Glucoseoxidase handelt und als Substrat Glucose vorhanden ist.
4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Aminoalkylsulfinsäure und bei der Sulfonsäure um Aminoalkylsulfonsäure handelt.
5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Sulfinsäure im Ansatz mindestens 1 g/L beträgt.
6. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um 2-Aminoethansulfinsäure (Hypotaurin) und bei der entstehenden Sulfonsäure um 2-Aminoethansulfonsäure (Taurin) handelt.
7. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfonsäure aus dem Reaktionsansatz isoliert wird.
8. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei Hypotaurin um Hypotaurin aus fermentativer Herstellung handelt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Hypotaurin aus bakterieller Herstellung stammt, d.h. mit Hilfe eines bakteriellen Produktionsstamms hergestellt wurde.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim bakteriellen Produktionsstamm um einen Stamm der Art Escherichia coli handelt.
11. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Produktionsstamm um einen Stamm mit dereguliertem Cystein- Biosyntheseweg handelt.
12. Verfahren gemäß Anspruch einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Produktionsstamm um einen der Stämme E. coli W3110 x pCys- CDOrn-CSADhs oder W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs handelt.
13. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Cysteinsulfinsäure und bei der entstehenden Sulfonsäure um Cysteinsäure handelt.
14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die molare Ausbeute an Sulfonsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H bezogen auf die insgesamt eingesetzte molare Konzentration an Sulfinsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H und Sulfonsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H mindestens 60% beträgt.
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