EP4058591A1 - Determination par spectrometrie de masse de la sensibilite ou de la resistance de bacteries a un antibiotique - Google Patents

Determination par spectrometrie de masse de la sensibilite ou de la resistance de bacteries a un antibiotique

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Publication number
EP4058591A1
EP4058591A1 EP20861979.1A EP20861979A EP4058591A1 EP 4058591 A1 EP4058591 A1 EP 4058591A1 EP 20861979 A EP20861979 A EP 20861979A EP 4058591 A1 EP4058591 A1 EP 4058591A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
antibiotic
bacterium
sample
colistin
mass spectrometry
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20861979.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Philippe Charrier
Nadine Perrot
Gilles Zambardi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP4058591A1 publication Critical patent/EP4058591A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention belongs to the field of microbiology and relates more particularly to the determination by mass spectrometry of the sensitivity or resistance of bacteria to an antibiotic inducing the rupture of its wall and / or of its cytoplasmic membrane.
  • antimicrobial resistance is one of the most serious threats to global health today. Due to misuse of these drugs, G antimicrobial resistance is believed to be the cause of 12,500 deaths per year in France and could become the leading cause of death in the world in 2050.
  • antibiotics have some undesirable effects, which vary according to the molecules. Most are mild, but a few can be serious or even serious. Thus, certain antibiotics can increase the morbidity, even mortality, of patients due to undesirable side effects, in particular neurotoxic and nephrotoxic (Poirel L et al., 2017). This is particularly the case with certain antibiotics which act on the bacterial wall and / or the plasma membrane of certain bacteria.
  • Colistin for example, a polymyxin antibiotic that acts on the bacterial cytoplasmic membrane, binds to the surface of the membranes of nephron tubular cells, resulting in albuminuric interstitial nephritis. Colistin also has a neuromuscular blocking effect by blocking the presynaptic release of acetyl choline and reducing the sensitivity of postsynaptic receptors (Spapen, 2011).
  • antibiotics should only be used if the pathogenic bacteria (ies) are sensitive to them and for some of them only reserved for last resort treatments.
  • rapid determination of the sensitivity or resistance of an identified bacterium to an antibiotic is essential, preferably before initiating treatment, or failing that as early as possible.
  • CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
  • EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
  • This time can be from 1 to 2 hours for a b-lactamase like KPC, but must generally be much longer for less active or less abundant b-lactamases in the cell (Mirande et al., 2015). Bacterial proteins are not directly observed in these methods. Bacterial lysis under the action of the antibiotic is not sought.
  • the objective of the present invention is to provide a method for determining the sensitivity or the resistance of at least one identified bacterium to at least one antibiotic, which overcomes the drawbacks of the methods of the art.
  • prior art namely to provide an inexpensive method, without the use of detergents, without reagents specific to each species, giving a result in a short time, less than an hour, and usable in routine clinic, without requiring highly qualified personnel.
  • the invention proposes a new method for determining the sensitivity or the resistance of at least one identified bacterium to at least one antibiotic, comprising the following steps: a) bringing a sample comprising said bacterium into contact with said said bacterium.
  • At least one antibiotic said antibiotic inducing the rupture of the bacterial wall and / or of the cytoplasmic membrane and causing the release of the intracellular compounds of said bacterium when the latter is said to be “sensitive” to said at least one antibiotic, b) incubation of said bacteria sample with said at least one antibiotic, c) purification of said sample by removing intact bacteria and cell debris, d) analysis of the purified sample by mass spectrometry, e) detection of the presence or absence of at least one peak of at least one protein characteristic of said bacterium, f) determining the sensitivity or resistance of said bacterial population to said antibiotic.
  • the sample can come from different sources.
  • samples of biological origin in particular animal or human.
  • Such a sample can correspond to a sample of biological fluid, of the whole blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, organic secretion type, to a tissue sample or to isolated cells.
  • This sample can be used as it is, or will preferably be subjected beforehand to its contact with the antibiotic, to a preparation of enrichment or culture type, to a concentration and / or to an extraction or purification step. according to methods known to those skilled in the art.
  • a preparation cannot correspond to a lysis step which results in the disintegration of the microorganisms and a loss of their content before coming into contact with the antibiotic.
  • the sample can be used as an inoculum.
  • the sample may first have been cultured in broth or on agar so as to enrich it with bacteria.
  • agar or broth are well known to those skilled in the art.
  • the sample will preferably include a single bacterial species. However, it is not excluded to use a sample comprising several bacteria. In this case, it will be preferable that the bacteria are known to be susceptible to developing different resistance mechanisms, so as to know which one would present the resistance that would be identified.
  • the bacteria which can be characterized by the method of the invention are all bacteria, pathogenic or not, encountered both in industry and in the clinic.
  • bacterium covers Gram-positive or Gram-negative bacteria.
  • the bacterium is a Gram-negative bacterium, preferably chosen from the following species and subspecies: Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter junii, Citrobacter freundii, Enterobacter asburiae, Enterobacteron cloacae, Pseudomain Salmonella enteritica serotype Enteritidis, Salmonella enteritica serotype Paratyphi B variant Java, Salmonella enteritica serotype Agona, Salmonella enteritica serotype Enteritidis, Salmonella enteritica serotype Haifa, Salmonella enteritica serotype Newport and Pseudomonas aeruginosa.
  • sensitivity of at least one identified bacterium to at least one antibiotic we mean the ability of this antibiotic to kill or sufficiently inhibit the growth of this bacterium.
  • Determination of sensitivity means determining the susceptibility of a bacterium to be killed or whose growth is inhibited by an antibiotic.
  • resistance of at least one identified bacterium to at least one antibiotic is meant a phenomenon according to which the bacterium retains all or part of its viability, its growth or its reproduction, when it is exposed to a concentration of antibiotic which is recognized as being effective against this bacterium in the absence of resistance.
  • This resistance can be acquired by one or more strains of a bacterial species naturally sensitive to this antibiotic. This resistance can also be innate or natural.
  • resistance to antibiotics can be chromosomal and / or extra-chromosomal resistance, also called plasmid.
  • determination of resistance to at least one antibiotic is meant the determination of the ability of a bacterium to multiply when exposed to an antibiotic to which it is naturally sensitive.
  • the method which is the subject of the present invention is also applicable to bacterial strains which express heteroresistance, that is to say that only a part, minority or not, of the population of a bacterial clone expresses this resistance.
  • antibiotic any chemical substance, natural or synthetic, which has a specific action on bacteria.
  • the antibiotic induces the rupture of the bacterial wall and / or of the cytoplasmic membrane thus causing the release of the intracellular compounds of the bacterium when the latter is sensitive to this antibiotic.
  • Antibiotics inducing rupture of the bacterial wall and those inducing rupture of the membrane cytoplasmic cells are distinguished by their mode of action on bacteria. It is essential, in the context of the present invention, that the rupture of the bacterial wall and / or of the cytoplasmic membrane be induced by the antibiotic and not by the action of a solvent or of an acid.
  • a bacterial lysis using a solvent, such as acetonitrile or an alcohol (ethanol, methanol, etc.), and / or acid, such as formic acid.
  • the objective of this lysis step is to release intracellular proteins, to observe them by spectrometry and for example to identify the microorganism.
  • this lysis step is not carried out so that the release of the intracellular compounds of the bacterium is only due to the action of the antibiotic when the latter is sensitive to this. antibiotic and not that of a solvent or an acid and thus does not distort the result.
  • antibiotics acting on the bacterial wall there are those inducing the inhibition of the synthesis of precursors of the wall, those inducing the inhibition of the transfer of the precursors from the wall to a carrier lipid, this normally allowing their transport through the plasma membrane and those inducing inhibition of the insertion of glycanic units, precursors of the wall, and of transpeptidation.
  • antibiotics acting on the insertion of glycanic units, precursors of the wall, and of transpeptidation we can cite the b-lactams, which inhibit the transpeptidase involved in the synthesis of the wall or the glycopeptides , which bind to a peptidoglycan synthetic intermediate.
  • cytoplasmic membrane The existence of an intact cytoplasmic membrane is necessary for bacterial survival. Its role is twofold, on the one hand it allows to sequester metabolites and ions necessary inside the cytoplasm, on the other hand, it makes it possible to maintain a proton gradient between the inside and the outside of the cell, generated by the respiratory chain and the Krebs cycle and which allows the storage of cellular energy. This proton gradient feeds GATR synthase which makes GATR. Any disturbance of the waterproofing of the membrane breaks these confinements, the chemiosmotic energy is dissipated and the contents of the cytoplasm leak into the extracellular environment. There are a number of antibiotic molecules which act on the cytoplasmic membrane of cells, either by acting as detergents which disorganize lipids, or by forming a pore in the cytoplasmic membrane which will cause the release of cellular compounds.
  • polymyxins act as cationic detergents: thanks to their amphipathic character, they penetrate into the bacterial cell and are inserted among the phospholipids of the wall, thus disrupting membrane permeability.
  • Gramicidin is a peptide which fits into the membrane forming a cylindrical pore allowing the escape of cations.
  • the antibiotic is chosen from polymyxins, b-lactams, aminoglycosides, quinolones and glycopeptides, preferably the antibiotic is a polymyxin and is chosen from colistin and polymyxin B.
  • the antibiotic has a concentration of between twice the minimum inhibitory concentration and ten times the minimum inhibitory concentration for the bacterial population studied.
  • the antibiotic has a concentration at least ten times greater than the minimum inhibitory concentration of the antibiotic for the bacterial population studied.
  • the antibiotic has a concentration at least one hundred times greater than the minimum inhibitory concentration of the antibiotic for the bacterial population studied.
  • the antibiotic has a concentration at least a thousand times greater than the minimum inhibitory concentration of the antibiotic for the bacterial population studied. The inventors have demonstrated, against all expectations, that the process according to the invention works at such concentrations. In fact, it is not easy to use this range of concentrations for an antibiotic because, on the one hand, in the context of an analysis by mass spectrometry, the peaks corresponding to the antibiotic could mask the peaks corresponding to the characteristic proteins of the bacteria.
  • the ionization step is in fact subject to competition between molecules, generally favorable to the most abundant molecules in the sample, namely the antibiotic in the present case.
  • the high concentration of antibiotic therefore risked preventing the detection of protein peaks.
  • concentrations can be toxic to a patient if prescribed.
  • the minimum inhibitory concentration, or MIC is the lowest concentration of antibiotics capable of inhibiting in vitro any visible culture of the strain studied at a given temperature and for a defined period of time. This value characterizes the bacteriostatic effect of an antibiotic on a bacterium.
  • the MIC is specific for an antibiotic / bacterium pair, each strain having its own value, depending on the natural and / or acquired resistance for the tested molecule.
  • a compound known to accelerate the enzymatic reaction implemented in the resistance mechanism considered can also be brought into contact with the sample.
  • This compound can for example be zinc, in the ZnC ′ b or zinc sulfate form in particular, which is an important co-factor for the activity of metallo -b-lactamases.
  • This compound can be added in combination with the antibiotic or at any other time in the preparation of the sample.
  • the method comprises an incubation step to allow the interaction between the bacterial population (s) and the antibiotic (s).
  • the conditions and the incubation time will be adapted by those skilled in the art according to the populations to be analyzed.
  • the sample can be left at a temperature belonging, for example, to a range from 15 to 100 ° C, and in particular at room temperature (22 ° C). It is also possible to transfer it to a thermostatically controlled enclosure, for example at 37 ° C.
  • the incubation temperature will be 50 ° C or about 50 ° C.
  • the inventors have surprisingly shown that a high incubation temperature (of the order of 50 ° C), which can be lethal to bacteria, is suitable within the scope of the present invention.
  • the incubation time should be sufficient to allow lysis of the bacteria when they are sensitive and thus allow the subsequent detection by mass spectrometry of its intracellular compounds, in particular of intracellular proteins which have been released. Incubation is most often carried out for a period of between 45 and 90 minutes, preferably for less than 30 minutes, more preferably for less than 15 minutes and even more preferably for less than 10 minutes. This represents an advantage over the methods of the prior art, in particular those described in applications US 2008/009029, WO 2014/187517, where the time required for incubation exceeds two hours. This long time is necessary to ensure that the bacteria have responded well to the action of the antibiotic by modification, respectively bacterial growth or protein patina. Such an effect is not sought in the method according to the invention. Thus, it is not necessary to wait a sufficient time to allow a division of the bacterial cells, or even a change in the level of expression of their proteins.
  • the method of the invention may comprise, after the incubation step, a homogenization step.
  • this step must not induce the rupture of the bacterial wall and / or of the cytoplasmic membrane, in particular by cavitation.
  • This step could in particular be implemented by techniques such as sonication, mechanical or magnetic vortexing, using a thermal mixer, of the thermomixer type, provided that these techniques do not cause the rupture of the cell. bacterial wall and / or cytoplasmic membrane.
  • This step makes it possible to intimately mix the antibiotic and the microorganism to be analyzed and to reduce the incubation time necessary for the diffusion of the antibiotic in the vicinity of the wall and / or the membrane.
  • the sonication technique consists of the incubation of microtubes in an ultrasonic bath.
  • the sonication takes place for a period of between 5 and 90 minutes.
  • the mechanical vortexing takes place for a period of between 5 and 90 minutes.
  • the magnetic vortexing takes place for a period of between 5 and 90 minutes.
  • the method comprises a step of purifying said sample by removing intact bacteria and cellular debris.
  • This step consists in keeping in the sample only the intracellular compounds released by the bacterium analyzed when the latter has been brought into contact with an antibiotic to which it is sensitive.
  • the non-sensitive bacteria, which will be intact, and the cellular debris, following lysis are eliminated from the sample to be analyzed.
  • this sample purification step could in particular be implemented by techniques such as centrifugation, filtration, chromatography or else electrophoresis.
  • multidimensional chromatography can be used by combining separation by ion exchange chromatography with reverse phase chromatography, as described by T. Fortin et al. (2009) or H. Keshishian et al. (2007) for the analysis of proteotypic protein peptides.
  • the chromatographic medium can be in a column or in a cartridge (solid phase extraction).
  • the electrophoretic or chromatographic fraction (or the retention time in mono or multidimensional chromatography) of the proteotypic peptides is characteristic of each peptide and the implementation of these techniques therefore makes it possible to select the proteotypic peptide (s) to be assayed.
  • Such fractionation of the peptides generated makes it possible to increase the specificity of the subsequent assay by mass spectrometry. It is also possible to work on whole proteins, in particular by a so-called “top-down” technology as synthesized by Donnelly et al. (Nature Methods, 2019). In these studies, the electrophoretic or chromatographic fraction (or the retention time in mono or multidimensional chromatography) of the proteins is characteristic of each protein and the implementation of these techniques therefore makes it possible to select the protein or proteins to be assayed.
  • the centrifugation takes place for a period of between 1 and 60 minutes and at a speed of rotation of between 300 g and 30,000 g.
  • the filtration consists of filtration on a filter with a porosity of between 0.02 and 0.22mpi.
  • electrophoresis consists of a separation technology under the action of an electric field.
  • electrophoresis can be chosen from isotachophoresis, electrophoresis on polyacrylamide gel in the presence of Sodium Dodecyl Sulfate (SDS-PAGE), isoelectrofocusing (IEF), or else two-dimensional electrophoresis which is a combination of IEF and SDS-PAGE.
  • chromatography consists of a separation of molecules present in a mobile phase using a stationary phase.
  • the chromatography may be chosen from among thin layer chromatography, chromatography on a solid phase extraction cartridge (SPE) or chromatography on a chromatography column.
  • SPE solid phase extraction cartridge
  • the cartridge or the column may contain a chromatographic compound to ensure the selectivity of the method according to the physicochemical properties of the molecules of interest.
  • this compound may allow reverse phase chromatography (Cl 8, C8 or C4), serum exclusion chromatography, ion exchange chromatography or affinity chromatography.
  • the mass spectrometry to be implemented in the method of the invention is widely known to those skilled in the art as a powerful tool for the analysis and detection of different types of molecules.
  • any type of molecule that can be ionized can be detected based on its molecular mass using a mass spectrometer.
  • certain mass spectrometry technologies may be more suitable.
  • the mass spectrometry method used for the detection comprises a step of ionization of the target molecule in so-called molecular ions, in this case a step of ionization of the proteins of at least one bacterium. , and a step of separating the molecular ions obtained as a function of their mass.
  • an ionization source intended to ionize the molecules present in the sample to be analyzed, that is to say to impart a positive or negative charge to these molecules;
  • a detector intended to measure the signal produced either directly by the molecular ions, or by ions produced from the molecular ions, as detailed below.
  • the ionization step necessary for the implementation of mass spectrometry can be implemented by any method known to those skilled in the art.
  • the ionization source makes it possible to bring the molecules to be assayed in a gaseous and ionized state.
  • An ionization source can be used either in positive mode to study positive ions, or in negative mode to study negative ions.
  • F AB fast atoms
  • MAB metastable atoms
  • SIMS LSIMS
  • ICP inductive plasma coupling
  • APCI atmospheric pressure
  • APPI photoionization at atmospheric pressure
  • MALDI matrix-assisted laser desorption-ionization
  • SELDI surface
  • DIOS on silicon
  • DESI desorption - electrospray ionization
  • nDESI nano desorption - electrospray ionization
  • LAESI laser ablation
  • REIMS rapid MS evaporative ionization
  • the mass analysis step necessary for the implementation of mass spectrometry can be carried out by any method known to those skilled in the art.
  • the mass analyzer makes it possible to separate the molecules to be assayed, in a gaseous and ionized state, according to their mass-to-charge ratio (m / z).
  • m / z mass-to-charge ratio
  • any mass spectrometry method suitable for the detection of at least one bacterial molecule can be used within the framework of the invention.
  • the mass spectrometry used is matrix-assisted desorption-ionization mass spectrometry and time-of-flight measurement (MALDI-TOF) which in particular has the advantage of a relatively simple implementation.
  • MALDI-TOF matrix-assisted desorption-ionization mass spectrometry and time-of-flight measurement
  • a MALDI ionization source allows molecules to be ionized from a sample in the solid state. Prior to its ionization, the sample is preferably brought into contact with a matrix.
  • the matrix used advantageously contains a compound chosen from 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (ie sinapic acid or sinapinic acid); ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (ie alpha-cyano, alpha-matrix or CHCA), ferulic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid (ie DHB).
  • deposition on a layer of dry matrix deposition on a layer of dry matrix
  • deposition with a drop of matrix known as “dried drop” deposition
  • deposition on a layer of matrix then addition of a drop of matrix, known as “sandwich” deposition .
  • the matrices are photosensitive and crystallize in the presence of the sample while preserving the integrity of the molecules.
  • Such matrices in particular suitable for the MALDI-TOF technique, are well known and chosen from; 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid; ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, ferulic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid.
  • Many other compounds are known to those skilled in the art.
  • the target that is to say the support on which the sample is deposited
  • the target can directly play the role of matrix, as in the case of “Nano-Assisted Laser Desorption / Ionization” (NALDI) or “ Desorption / Ionization On Silicon ”(DIOS).
  • NALDI Nano-Assisted Laser Desorption / Ionization
  • DIOS Desorption / Ionization On Silicon
  • the laser beam can have any type of wavelength favorable to sublimation or vaporization of the matrix.
  • the ultraviolet or even infrared wavelength will be used.
  • such a compound is dissolved, most often in water, preferably of “ultrapure” quality, or in a water / organic solvent (s) mixture.
  • organic solvent e.g., acetone, acetonitrile, methanol or ethanol.
  • Trifluoroacetic acid (TFA) can sometimes be added.
  • An example of a matrix consists, for example, of 20 mg / ml of sinapic acid in an acetonitrile / water / TFA mixture of 50/50 / 0.1 (v / v).
  • the organic solvent allows the hydrophobic molecules present in the sample to dissolve in the solution, while the water allows the dissolution of the hydrophilic molecules.
  • the presence of acid, such as TFA promotes ionization of sample molecules by uptake of a proton (H +).
  • the solvent present in the matrix is then evaporated, for example, by leaving the sample at a temperature belonging, for example, to the range from 17 to 30 ° C, and in particular at room temperature (22 ° C) for a few minutes. , for example from 1 minute to 2h.
  • This evaporation of the solvent allows the crystallization of the matrix in which the sample is distributed.
  • the sample, placed within the crystalline matrix is subjected to gentle ionization. This ionization will preferably be carried out with a nitrogen laser emitting a UV ray at 337.1 nm.
  • the sample is subjected to laser excitation.
  • the crystals of the matrix then absorb the photon energy and the restitution of this energy causes the sublimation of the matrix, the desorption of the sample and the appearance of matter in a state called plasma.
  • charge exchanges take place between matrix and sample molecules. For example, protons can be stripped from the matrix and transferred to proteins and peptides in the sample. This step allows a gentle ionization of bio molecules without inducing their destruction.
  • the samples thus release ions of different sizes. These are then accelerated by an electric field and fly freely in a tube under reduced pressure, called the flight tube.
  • the pressure applied during ionization and during the acceleration of the ions generated most often belongs to the range going from 10 6 to 10 9 millibar (mbar).
  • the smaller ions will then "travel" faster than the larger ions, thus allowing their separation.
  • a detector At the terminal end of the flight tube is located a detector.
  • the flight time of ions is used to calculate their mass.
  • a mass spectrum is obtained, representing the intensity of the signal corresponding to the number of ionized molecules of the same mass on charge (m / z), as a function of the m / z ratio of the molecules which strike the detector.
  • the m / z ratio is expressed in Thomson (Th).
  • the separation of molecular ions according to their m / z ratio can be carried out only once (simple mass spectrometry or MS), or else several successive MS separations can be carried out.
  • MS / MS or MS 2 .
  • MS / MS / MS or MS 3 and more generally, when n successive MS separations are carried out, the analysis is called MS n .
  • the mass spectrometry used in the method of the invention is tandem mass spectrometry (MS 2 , MS 3 , MS 4 or MS 5 ), where several mass analyzers are coupled together.
  • a first analyzer separates the ions
  • a collision cell allows the ions to fragment
  • a second analyzer separates the fragment ions.
  • Some analyzers such as ion traps or the LT-ICR, combine several analyzers in one and allow ions to be fragmented and analyzed. the fragments directly.
  • This technology allows a successive separation in two mass analyzers, which has in particular the advantage of having very good specificity by selecting an ion in the first analyzer, by fragmenting it and by analyzing its daughter ions in the second analyzer.
  • the separation can be carried out in a MALDI-TOF-TOF which comprises two time-of-flight analyzers and the same ease of use as a MALDI-TOF.
  • the ionization source can be from any type of source known to those skilled in the art and the mass analyzer from any type of mass analyzer known to those skilled in the art.
  • the mass spectrometry is in tandem and uses an electrospray source and a combination of at least two of the aforementioned analyzers.
  • ionization can be implemented as follows: the sample containing the target molecules is introduced into an electrospray ionization source which makes it possible to ionize a molecule while making it pass from a liquid state to a gaseous state .
  • the molecules are thus transformed into molecular ions which correspond to the initial molecules.
  • the molecular ions obtained then correspond to the molecules initially present in the liquid sample, with in positive mode one, two or even three or more additional protons and therefore carry one, two or even three or more charges.
  • the target molecule when the target molecule is a protein in the liquid phase, ionization using an electrospray source operating in positive mode, leads to ions in the gaseous state, with one, two, or even three or more additional protons and which are therefore carriers of one, two, or even three or more charges.
  • This type of source is particularly well suited when the target molecules, such as proteins, are separated beforehand by reverse phase liquid chromatography.
  • the SRM (Selected Reaction Monitoring) modes in the case of detection or assay of a single target molecule, MRM (Multiple Reaction Monitoring) in the event of detection or assay of several target molecules, or else PRM (Parallel Reaction Monitoring) are special uses of MS 2 separation.
  • MRM 3 mode is a particular use of MS / MS / MS separation (WO 2010136706).
  • SRM, MRM, PRM and MRM 3 techniques are targeted mass spectrometry techniques, which means that the ions of the molecule to be detected are specifically targeted for analysis.
  • DDA data dependent acquisition
  • DIA data independent acquisition
  • the DDA approach consists of i) acquiring an MS spectrum, ii) successively selecting each precursor ion observed on the MS spectrum with an intense signal, iii) successively fragmenting each precursor ion and acquiring its MS / MS spectrum , iv) query databases such as SWISS-PROT or NCBI, through software such as Mascot (Matrix Science, London, United Kingdom) or SEQUEST (Thermo Scientif ⁇ c, Waltham, United States of America), to identify the molecule having a high probability of corresponding to the observed MS / MS spectrum.
  • This method can lead to the identification of a molecule characteristic of a microorganism without necessarily targeting its analysis a priori.
  • DIA methods do not include step ii).
  • a set of ions is fragmented and analyzed in step iii) independently of their relative intensity.
  • a mass window possibly comprising several precursor ions is selected in the first mass analyzer.
  • These so-called several precursor ions are transferred to the following analyzer (s) in order to be fragmented and analyzed simultaneously.
  • This technique is particularly advantageous when using a high-resolution mass spectrometer, capable of identifying with great precision all of the fragment ions corresponding respectively to the various precursor ions selected concomitantly.
  • MS assay In the case of detection in MS / MS mode, essentially two steps are added, compared to an MS assay, which are: a fragmentation of the molecular ions, then called precursor ions, to give daughter ions, called fragment ions, and a separation of the daughter ions called fragment ions as a function of their mass / charge (m / z) 2 , the ratio (m / z) i corresponding to the ratio (m / z) of the precursor ions.
  • fragment ion an ion derived from the precursor ion, following a fragmentation step and whose mass to charge m / z ratio is different from the precursor ion.
  • the pairs (m / z) i and (m / z) 2 are called transitions and are representative of the characteristic ions to be detected.
  • the choice of the characteristic ions which are detected to be correlated with the target molecule is carried out conventionally by a person skilled in the art so as to lead advantageously to the most sensitive, the most specific and the most robust assays possible, in terms of reproducibility and reliability. .
  • SRM mode or even of MRM mode, is to specifically select a precursor ion, to fragment it, then to specifically select one of its fragment ions.
  • devices of the triple quadrupole type or triple quadrupole hybrids with ion trap are generally used (WO 2011/045544).
  • PRM mode differs from SRM and MRM modes by the use of a latest high resolution analyzer. The latter makes it possible to detect all the fragment ions in parallel with a sufficient resolution to ensure the specificity of the method (Peterson AC et al., 2012).
  • hybrid devices of the quadrupole and time-of-flight (Q-TOF) type or of the ion trap and orbitrap type, or else quadrupoles and orbitrap are generally used.
  • the first quadrupole (Ql) makes it possible to filter the molecular ions, characteristic of the protein to be assayed, as a function of their mass to charge ratio (m / z). Only the ions having the mass / charge ratio of the desired protein, called ratios (m / z) n, are transmitted into the second quadrupole (q2) and play the role of precursor ions for the subsequent fragmentation.
  • the q2 analyzer makes it possible to fragment ions of mass / charge ratio (m / z) n into fragment ions.
  • Fragmentation is usually achieved by collision of precursor ions with an inert gas, such as nitrogen or argon in q2.
  • the fragment ions are transmitted in the orbitrap which determines their m / z ratio.
  • the fragment ions having the mass / charge ratio (m / z) Î2 of fragments characteristic of the i th protein sought are then detected, or even quantified.
  • This mode of operation has a double selectivity, in relation to the selection of the precursor ion on the one hand and the selection of at least one fragment ion on the other hand.
  • Mass spectrometry in SRM, MRM or PRM mode is advantageous for quantification insofar as it quantitatively detects fragment ions characteristic of the molecule to be detected, or even quantified.
  • an MS detection method is advantageous because it can be carried out in a few minutes and it requires a mass spectrometer with a single analyzer, that is ie a less complex instrument than a tandem mass spectrometer used in MS / MS.
  • an MS / MS detection method is also advantageous because it makes it possible to generate a specific fragment of the molecules to be detected and thus to bring great specificity to the method according to the invention.
  • the MS / MS spectrometry is MRM, which has the advantage of using an analysis cycle time in the mass spectrometer of a few tens of milliseconds, which makes it possible to detect with great sensitivity, and in a multiplexed fashion, a large number of different molecules.
  • the MS / MS spectrometry is PRM, which has the advantage of using several fragment ions to characterize the detection of the target molecule.
  • the method according to the invention can be implemented using a MALDI-TOF, as described by Claydon et al. and by T. Krishnamurthy and P. Ross.
  • the analysis combines the acquisition of a mass spectrum and the interpretation of expert software. It is extremely simple and can be done in a matter of minutes.
  • the method according to the invention can also be implemented with an electrospray source on a raw sample, as described by S. Vaidyanathan et al. or by R. Everley et al. after chromatographic separation. Different ranges of m / z then make it possible to identify the characteristic proteins of the microorganisms to be analyzed.
  • S. Vaidyanathan et al. used a window between 200 and 2000 Th and R. Everley et al. a window between 620 and 2450 Th.
  • the mass spectra can also be deconvoluted to access the mass of proteins independently of their state of charge.
  • R. Everley et al. thus exploited masses between approximately 5,000 and 50,000 Da.
  • the spectrum generated by Mass spectrometry will show at least one peak of at least one protein characteristic of this bacterial population.
  • protein peak characteristic of a bacterial population is meant a peak which makes it possible to distinguish a bacterial population from any other type of molecular sample.
  • Reference spectra obtained by mass spectrometry technology, in particular MALDI-TOF, for a given bacterium corresponding to its majority and characteristic proteins, are available and recorded in databases available with commercial devices, and allow, by comparison, determining the sensitivity of this bacterium to the antibiotic with which it has been in contact.
  • the at least one characteristic protein is chosen from ribosomal proteins and DNA binding proteins.
  • the at least one characteristic protein is chosen from the induced stationary phase protein associated with the ribosome (Stationary-phase-induced ribosome-associated protein, SPIRAP), the acid stress chaperone protein HdeB (Acid stress chaperone HdeB), 50S ribosomal proteins (L29, L31, L32, L33 and L35).
  • the at least one characteristic protein is chosen from the DNA binding protein H-NS (DNA binding protein H-NS), the ribosomal proteins L29, L31, L34 and US9.
  • the method comprises a step of calculating the ratio between the intensity at least one protein peak characteristic of the bacterium and the intensity of at least one characteristic peak of the antibiotic used.
  • the ratio is calculated with the sum of the intensities of the characteristic protein peaks of the bacterium.
  • the ratio is calculated with the sum of the intensities of the characteristic peaks of the antibiotic used.
  • the method comprises, after the step of calculating the ratio, a step of determining the sensitivity or the resistance of the bacterial population to the antibiotic as a function of the ratio obtained and a threshold fixed for each species.
  • a threshold fixed for each species.
  • the method according to the invention further comprises a step of identifying the family, the genus, or, preferably, the species of a bacterial population.
  • FIG.l represents a MALDI-TOF spectrum of colistin sulphate at 10 qg / ml between 100 and 4000 Th.
  • Scale of the abscissas mass over load (m / z or Th).
  • Ordinate scale % Int for relative intensity expressed as a percentage of the strongest peak intensity;
  • FIG.2 represents a MALDI-TOF spectrum of colistin sulphate at 10 qg / ml between 2000 and 4500 Th.
  • Scale of the abscissa mass over charge (m / z or Th).
  • Ordinate scale % Int for relative intensity expressed as a percentage of the strongest peak intensity;
  • FIG. 3 represents a MALDI-TOF spectrum between 4500 and 10000 Th of the strain EC_S treated according to Example II;
  • FIG. 4 represents a MALDI-TOF spectrum between 4,500 and 10,000 Th of the EC_R strain treated according to Example II;
  • FIG. 5 represents a MALDI-TOF spectrum between 4500 and 10000 Th of strain S treated according to Example III;
  • FIG.6 represents a MALDI-TOF spectrum between 4500 and 10000 Th of the strain RI 6 treated according to Example III
  • FIG. 7 represents a MALDI-TOF spectrum between 4500 and 10000 Th of strain S treated according to Example IV;
  • FIG. 8 represents a MALDI-TOF spectrum between 4500 and 10000 Th of the strain RI 6 treated according to Example IV;
  • FIG. 9 shows MALDI-TOF spectra between 4,500 and 10,000 Th of the following strains of Escherichia coli: EC R16, EC R17, EC S10 and EC S15, treated according to Example V;
  • FIG. 10 shows MALDI-TOF spectra between 4,500 and 10,000 Th of the following strains of Klebsiella pnemoniae: KP S10, KP S15, KP R9 and KP R16, treated according to Example V;
  • FIG. 11 shows MALDI-TOF spectra between 4,500 and 10,000 Th of the following strains of Acinetobacter baumannii: AB_S044, AB_S045, AB_S046 and AB R-E105 treated according to Example V;
  • FIG. 12 represents MALDI-TOF spectra between 4,500 and 10,000 Th of the following strains of Pseudomonas aeruginosa: PA_S062, PA_SE64,
  • PA RE66 and PA RE68 treated according to Example V.
  • Colistin (or polymyxin E) is an antibiotic of the polymyxin class naturally produced by Paenibacillus polymyxa subsp. colistinus (Benedict RG et al., 1947). Five classes of polymyxin (A, B, C, D, E) are known but only polymyxin B and E (or colistin) are used therapeutically (Dortet L et al., 2016).
  • colistin is an antibiotic from the polymyxin family which acts on the bacterial cytoplasmic membrane. Thanks to their amphipathic character, like cationic detergents, they will penetrate into the bacterial cell and insert themselves among the phospholipids of the wall, thus disrupting membrane permeability.
  • Colistin is used as the antibiotic of last resort for infection with multi-resistant bacteria. This is the case when strains of Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. or Acine tobacco ter spp. simultaneously resistant to antibiotics of the class of Carbapenems, Aminoglycosides and Fluoroquinolones (Hancock RE, 1997). These multi-resistance phenomena are worryingly increasing in some countries, such as Greece or Italy, and are forcing doctors to prescribe colistin. This more frequent use is unfortunately accompanied by the emergence of germs resistant to colistin (Dortet L et al., 2016).
  • Colistin of the crude formula C52H98N16O13 has a theoretical monoisotopic mass of 1154,750 Da and a theoretical average chemical mass of 1155,434Da. After ionization with a proton, it is detectable by MALDI-TOF mass spectrometry in the form of an isotopic mass whose first peak (monoisotopic peak) has a mass of 1155.758 Da or in the form of an unresolved mass with an apex at 1156.442 Da.
  • the possibility of detecting the monoisotopic peak or only the apex of the isotopic massif depends on the resolution of the mass spectrometer. High-resolution instruments can generally detect the mono isotopic peak while low-resolution instruments only detect the apex of the isotopic mass.
  • Figure 1 shows the mass spectrum obtained over the mass range 100 and 4000 Th and shows a massif at 1156.46 m / z and another massif at 1170.56 m / z.
  • the first corresponds to native colistin and the second corresponds to methylated colistin (+14 Da).
  • colistin comprises 4 amine functions capable of methylation.
  • Figure 2 is an observation of the spectrum over the 2000-4500 m / z mass range. There are four clearly defined peaks around 2283; 2987, 3439 and 4143 m / z. These peaks correspond to polymers of colistin. The mass difference between the peaks at 2283 and 3439 m / z is 1156 m / z, which is the mass of colistin. The same is true for the gap between the peaks at 4143 and 2987 m / z.
  • E. coli is an intestinal (Gram negative) bacterium of mammals, commensal in humans. Some strains of E. coli can be pathogenic, leading to gastroenteritis, urinary tract infections, meningitis, or sepsis. E. coli is a species usually sensitive to colistin but some strains are known to have developed chromosomal or plasmid resistance mechanisms. As part of this trial, two strains were analyzed, one strain of E. coli sensitive to colistin, it will be called EC_S, and a resistant strain, which will be called EC R.
  • Figure 3 shows the mass spectrum obtained for the strain EC_S. In the mass window between 4500 and 10,000 Th, the presence of not very intense peaks different from the colistin peaks is observed. These peaks are mainly at 4650.01, 4666.55, 6258.69, 6318.33, 6414.85, 7176.22, 7276.56 and 7871.90 m / z. A poorly resolved massif is also visible around 5370 m / z.
  • the masses 6318.33, 7162.22, 7276.56 and 7871.90 correspond respectively to the peaks 6316.14, 7158.68, 7274.39, and 7872.02 of E. coli which have been identified as corresponding to the ribosomal proteins L32, L35, L29 and L31, respectively (Arnold RJ and Reilly JP. 1999; Wilcox SK et al., 2001; Ryzhov V and Fenselau C, 2001; Jones JJ et al., 2003 ; Kallow W et al., 2010; Welker M and Moore ERB, 2011; Momo RA et al., 2013) These proteins are therefore characteristic of E. coli.
  • colistin concentration (2.5 mg / ml) corresponds to 1250 times the minimum inhibitory concentration (MIC) above which a strain is considered to be resistant.
  • Figure 4 shows the mass spectrum obtained for the strain EC_R.
  • the massif at 5313 and the peaks at 4649 and 4666 m / z are still detected, on the other hand the proteins of E. coli L32, L35, L29 and L31, characterized by peaks 6316.14, 7158.68, 7274.39, and 7872.02 m / z, respectively, are not visible. No bacterial protein is therefore detectable.
  • the bacterium therefore does not seem to have undergone a rupture of its cytoplasmic membrane during an incubation of 4 hours at 37 ° C in the presence of 2.5 mg / ml of colistin, a concentration very much above the MIC.
  • the method therefore makes it possible to show that the EC_R strain is resistant to colistin.
  • the E. coli S and RI 6 strains are analyzed with the same protocol as Example II except for the incubation period of 30 minutes at 37 ° C.
  • Strain S is sensitive to colistin and strain RI 6 is resistant to colistin.
  • Figure 5 shows the mass spectrum obtained for the strain S. This spectrum shows intense peaks at 6257.2, 6318.7, 7275.4 and 7871.6 m / z. These peaks are respectively characteristic of the ribosomal proteins L33, L32, L29 and L31 of E. coli.
  • the S strain therefore underwent a rupture of its cytoplasmic membrane during an incubation of 30 min at 37 ° C. in the presence of 2.5 mg / ml of colistin. Its sensitive nature to colistin has therefore been confirmed.
  • Figure 6 shows the mass spectrum obtained for strain RI 6. Unlike the spectrum for strain S ( Figure 5), this spectrum shows no intense peak between 6000 and 10,000 m / z. It was therefore not lysed during a 30 min incubation at 37 ° C in the presence of 2.5 mg / ml of colistin. The method confirms the resistance of this strain to colistin.
  • E. coli RI 6 and S strains are analyzed with the same protocol as Example III except for incubation at 50 ° C.
  • Figure 7 shows the mass spectrum obtained for strain S.
  • Strain S clearly shows intense peaks at 6256.4, 6316.9, 7274.1 and 7870.2 m / z. These peaks are respectively characteristic of the ribosomal proteins L33, L32, L29 and L31.
  • the cytoplasmic membrane of strain S was therefore lysed during an incubation of 30 min at 50 ° C in the presence of 2.5 mg / ml of colistin. The sensitivity to colistin of the S strain is therefore confirmed.
  • Figure 8 shows the mass spectrum obtained for the strain RI 6. This spectrum shows no intense peak between 6000 and 10000 m / z. This strain was therefore not lysed during an incubation of 30 min at 50 ° C in the presence of 2.5 mg / ml of colistin. The resistance to colistin of this strain is therefore confirmed.
  • the peaks of the proteins L33, L32, L29 and L31 are more intense after an incubation at 50 ° C than after an incubation at 37 ° C for the sensitive strain, while they remain almost undetectable for the resistant strain. .
  • thermomixer incubation of the mixture for a period of 10 minutes at 50 ° C with stirring at 1400 rotations per minute using a thermomixer.
  • the characteristic proteins of the species Klebsiella pneumoniae are the DNA binding protein H-NS (DNA binding protein H-NS), the ribosomal proteins L29, L31, L34 and US9, the cold shock protein containing a CsbD domain (CsbD domain-containing protein), and the uncharacterized proteins of m / z 6290 and 8308. These proteins are characterized respectively by the peaks of 7705 ⁇ DNA binding protein H-NS), 7274 (L29), 7743 (L31), 5381 (L34), 7384 (US9), 8309 (CsbD), plus or minus 1000 parts per million (ppm). The hypothetical proteins are characterized by peaks 6290 and 7678, plus or minus 1000 parts per million (ppm).
  • Figures 9 and 10 show the mass spectra obtained respectively for the strains of E. coli and K. pneumoniae presented in Table 1.
  • the spectra for the strains EC S10, EC S15, KP S10 and KP S15 show peaks characteristic of their species and are therefore sensitive to colistin.
  • the strains EC R16, EC R17, KP R9 and KP R16 do not show peaks characteristic of their species and are therefore resistant to colistin.
  • strains of A. baumannii (AB S044, AB S045, AB S046, AB R-E105), Pseudomonas aeruginosa (PA S062, PA SE64, PA RE66, PA RE68) are analyzed with the protocol described in example V. Thus they are incubated in presence of 20 ⁇ g / ml of colistin.
  • Figure 11 shows the mass spectra obtained for the strains of A. baumannii presented in Table 2.
  • the strains AB_S044, AB_S045, AB S046 exhibit protein peaks characteristic of their species, in particular at approximately 5748 and 5770 Th, and are therefore sensitive to colistin.
  • the AB R-E105 strain does not exhibit protein peaks characteristic of its species and is therefore resistant to colistin.
  • Figure 12 shows the mass spectra obtained for the strains of P. aeruginosa presented in Table 2.
  • the strains PA_S062 and PA_SE64 show peaks characteristic of their species, in particular at approximately 5449, 5469, 5793 and 6975 Th, and are therefore sensitive to colistin.
  • the PA RE66 and PA RE68 strains do not exhibit peaks characteristic of their species and are therefore resistant to colistin.
  • test were carried out with the method of the present invention to determine the sensitivity or resistance of several bacteria of several strains such as in Example V and comprising the following steps:
  • a resistant microorganism will have a low ratio and a sensitive microorganism will have a high ratio.
  • the threshold is set empirically by observing the results. A person skilled in the art will know how to determine this threshold without difficulty. In the examples which will follow, a method of determining this threshold will be illustrated.
  • E. coli E. coli
  • proteins characteristic of the E. coli species are analyzed. They are the following proteins: the induced stationary phase protein associated with the ribosome (Stationary-phase-induced ribosome-associated protein, SPIRAP), the acid stress chaperone protein HdeB (Acid stress chaperone HdeB) and the ribosomal proteins 50S ( 50S ribosomal proteins), L29, L31 and L33.
  • Table 3 shows the intensity of the peak observed for colistin and for each characteristic protein of E. coli.
  • the strains K. pneumoniae KP S 10-1, KP S 10-2, KP S 15-1, KP S15-2, KP R9- 1, KP R9-2, KP RI 6-1 and KP RI 6-2, are also studied and the characteristic proteins of the species K. pneumoniae are analyzed. These characteristic proteins are the DNA binding protein H-NS (DNA binding protein H-NS), the ribosomal proteins L29, L31, L34 and US9, the cold shock protein containing a CsbD domain (CsbD domain-containing protein) , and the uncharacterized proteins of m / z 6290 and 8308.
  • DNA binding protein H-NS DNA binding protein H-NS
  • ribosomal proteins L29, L31, L34 and US9 the cold shock protein containing a CsbD domain (CsbD domain-containing protein)
  • Table 5 below shows the intensity of the peak observed for colistin and for each protein characteristic of K. pneumoniae.
  • Table 6 below shows the result of the ratio between the intensity of the peak observed for each protein and the intensity of the peak observed for colistin as well as the sum of these ratios for each species.
  • the results presented in Table 6 show that the KP-S15 and KP-S10 strains exhibit a sum of the ratios greater than 0.45 while the KP-R16 and KP-R9 strains exhibit a sum of the ratios less than 0.11.
  • the inventors set the value of the threshold at 0.45. Consequently, in this scenario, the strains whose sum of the ratios is strictly less than 0.45 will be considered as resistant and conversely the strains whose sum of the ratios is greater than or equal to 0.45 will be considered as sensitive.
  • the KP-S15 and KP-S10 strains are therefore classified as sensitive while the KP-R16 and KP-R9 strains are classified as resistant.

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Abstract

Procédé pour déterminer la sensibilité ou de la résistance d'au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact d'un échantillon comprenant ladite bactérie avec ledit au moins un antibiotique, ledit antibiotique induisant la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique et provoquant la libération des composés intracellulaires de ladite bactérie lorsque celle-ci est dite « sensible » audit au moins un antibiotique, b) incubation dudit échantillon avec ledit au moins un antibiotique, c) purification dudit échantillon par élimination des bactéries intacts et des débris cellulaires, d) analyse de l'échantillon purifié par spectrométrie de masse, e) détection de la présence ou de l'absence d'au moins un pic d'au moins une protéine caractéristique de ladite bactérie, et f) détermination de la sensibilité ou de la résistance de ladite population bactérienne au dit antibiotique.

Description

DESCRIPTION
Titre : DETERMINATION PAR SPECTROMETRIE DE MASSE DE LA SENSIBILITE OU DE LA RESISTANCE DE BACTERIES A UN ANTIBIOTIQUE
La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et concerne, plus particulièrement, la détermination par spectrométrie de masse de la sensibilité ou de la résistance de bactéries à un antibiotique induisant la rupture de sa paroi et/ou de sa membrane cytoplasmique.
Au XIXe siècle, la découverte de l’existence des microorganismes et de leur rôle dans les maladies infectieuses a permis d’envisager leur traitement. La lutte antibactérienne a démarré avec la mise au point de l’arsphénamine en 1907, qui fut utilisée avec succès pour traiter la syphilis. C’est toutefois la découverte de la pénicilline, suivie de nombreux autres antibiotiques, qui a mené à une démocratisation de leur usage. Les antibiotiques ont permis de sauver la vie et d’améliorer la santé des patients et constituent assurément l’un des plus grands succès de la médecine moderne.
L’efficacité remarquable des antibiotiques a motivé leur utilisation massive et répétée en santé humaine et animale. Ainsi ils ont malheureusement été victimes de leur succès : leur administration répétée et parfois abusive a engendré l’émergence de souches de bactéries qui leur résistent. En effet dans une population de bactéries, il peut naturellement exister une fraction qui résiste partiellement ou totalement à l’action de l’antibiotique grâce à différents mécanismes. Ainsi, lorsque l’on soumet les bactéries à un antibiotique, on détruit celles qui y sont sensibles, et il ne reste que les bactéries ayant survécu, qui peuvent proliférer. L’application d’antibiotiques constitue une pression de sélection favorisant les bactéries résistantes. Les bactéries peuvent obtenir leur capacité à résister à un antibiotique donné spontanément par mutations génétiques, mais aussi l’acquérir par la transmission de fragments d’ADN de bactérie à bactérie, ce qui accélère la propagation des résistances.
Ponctuelles au départ, ces résistances sont devenues massives et préoccupantes. Certaines souches sont multirésistantes, c’est-à-dire résistantes à plusieurs antibiotiques. D’autres sont même devenues toto-résistantes, c’est-à-dire résistantes à quasiment tous les antibiotiques disponibles. Ce phénomène, encore rare en France mais en augmentation constante, place les médecins dans une impasse thérapeutique en ne disposant plus d’aucune solution pour lutter contre l’infection.
Selon l’Organisation mondiale de la santé, « la résistance aux antibiotiques constitue aujourd’hui l’une des plus graves menaces pesant sur la santé mondiale ». Due au mauvais usage de ces médicaments, G antibiorésistance serait à l’origine de 12 500 décès par an en France et pourrait devenir la première cause de mortalité dans le monde en 2050.
Par ailleurs, il est important de noter qu’un traitement à l’aide d’un antibiotique n’est pas toujours un acte anodin pour le patient. En effet, les antibiotiques comportent quelques effets indésirables, variables selon les molécules. La plupart sont bénins, mais quelques-uns peuvent être sérieux, voire graves. Ainsi certains antibiotiques peuvent accroître la morbidité, voir la mortalité, des malades du fait d’effets secondaires indésirables, notamment neurotoxique et néphrotoxiques (Poirel L et al., 2017). C’est notamment le cas de certains antibiotiques agissant sur la paroi bactérienne et/ou la membrane plasmique de certaines bactéries. La colistine, par exemple, antibiotique de la famille des polymyxines agissant sur la membrane cytoplasmique bactérienne, se fixe à la surface des membranes des cellules tubulaires du néphron, ce qui se traduit par une néphrite interstitielle albuminurique. La colistine a également un effet de blocage neuro-musculaire en bloquant la libération pré-synaptique de l’acétyl choline et en réduisant la sensibilité des récepteurs post-synaptiques (Spapen, 2011).
Ces effets notamment les effets neurotoxiques doivent particulièrement être surveillés, notamment lors de traitement à haute dose. Ainsi ces antibiotiques sont réservés à des cas extrêmes, comme lorsque les bactéries sont résistantes à tous les autres antibiotiques, et à l'usage topique, tel que le traitement local des infections de la peau, des muqueuses, des yeux ou des oreilles. Dans le cas d'une otite, il faut avoir à l'esprit que l'administration d’une polymyxine, sur un tympan perforé peut entraîner une toxicité cochléaire et vestibulaire irréversible.
Pour toutes les raisons invoquées ci-dessus, les antibiotiques ne doivent être utilisés que si la ou les bactéries pathogènes y sont sensibles et pour certains d’entre eux uniquement réservés aux traitements de dernier recours.
Dans ce contexte, la détermination rapide de la sensibilité ou de la résistance d’une bactérie identifiée à un antibiotique est indispensable, de préférence avant d’engager un traitement, ou à défaut le plus tôt possible.
A l’heure actuelle le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) et l’European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) recommandent conjointement la méthode phénotypique de microdilution en bouillon, ou broth micro-dilution (BDM), notamment pour la détermination de la résistance à la polymyxine, antibiotique agissant au niveau de la membrane cytoplasmique. Cette méthode peut être considérée comme la méthode de référence, néanmoins elle est longue, assez lourde à mettre en œuvre et n’est pas adaptée aux contraintes des laboratoires de microbiologie clinique (Poirel L et al., 2017). De plus des résultats non reproductibles et non interprétables ont été décrits pour la détermination de la sensibilité de certains antibiotiques agissant sur la membrane cytoplasmique, notamment la colistine, probablement dus au phénomène d’hétérorésistance à la colistine (Landman D et al., 2013). Enfin, les souches hébergeant un plasmide conférant une résistance plasmidique ne sont pas toujours détectées.
Les autres méthodes classiques, incluant la dilution en agar ou encore la diffusion à partir de disque ou de gradient, ne sont explicitement pas recommandées par le CLSI et l’ECAST pour certains antibiotiques tels que les polymixines. Ceci peut s’expliquer par leurs propriétés polycationiques qui favorisent leur adsorption sur les surfaces et leur capacité à former des micelles qui peinent à diffuser correctement dans les géloses (Hindler JA et al., 2013). En outre le phénomène d’hétérorésistance semble compliquer l’utilisation de ces méthodes (Landman D et al., 2013).
D’autres méthodes ont également été proposées en remplacement des méthodes phénotypiques, notamment dans la demande WO 2015/48696. Cette demande décrit un procédé pour déterminer la sensibilité par mise en contact avec un antibiotique, à une concentration proche de la concentration minimale inhibitrice (CMI), suivi d’une lyse, mécanique ou chimique, puis d’une détermination du taux de lyse. La sensibilité est établie en fonction de la comparaison de ce taux de lyse à une valeur seuil. Le taux de lyse est notamment déterminé à l’aide du marquage des composants intracellulaires présents en dehors de la cellule bactérienne lysée. Ainsi sont proposées l’utilisation de la coloration au bleu de Coomassie, la mesure de la luminescence de l’ATP ou encore l’utilisation de sondes peptidiques d’acide nucléique (PNA) avec une étiquette fluorescente qui s’hybrident avec des acides nucléiques.
Néanmoins, ces méthodes nécessitent, en plus de l’utilisation d’un antibiotique, des conditions lysant les parois bactériennes à l’aide notamment d’un détergent. Or l’utilisation de détergents est considérée comme incompatible avec la spectrométrie de masse MALDI- TOF. En effet, les détergents génèrent des ions qui masquent le signal des protéines. De plus, les bactéries ont des parois avec des structures biochimiques pouvant changer d’une espèce à l’autre. De ce fait, différentes espèces peuvent être plus ou moins résistantes aux conditions de lyse et le choix de ces conditions de lyse peut s’avérer délicat pour éviter les résultats faussement négatifs ou faussement positifs.
Des méthodes de détection de mécanismes de résistance par MALDI-TOF après mise en contact avec un antibiotique et sans culture sont connues. Notamment dans les demandes WO 2018/099500 et WO 2011/154517, déposées par la société Bruker Daltonik GMBH, où l’hydrolyse des b-lactamines par action des b-lactamases est détectée. Dans ces demandes, une modification de la masse de l’antibiotique est détectée après réaction avec les b-lactamases de l’échantillon bactérien. Ces méthodes nécessitent la mesure des taux d’antibiotique actif et hydrolysé après un certain temps d’action des b-lactamases. Ce temps peut être d’une à 2 heures pour une b-lactamase comme KPC, mais doit généralement être beaucoup plus long pour des b-lactamases moins actives ou moins abondantes dans la cellule (Mirande et al., 2015). Les protéines bactériennes ne sont pas directement observées dans ces méthodes. La lyse bactérienne sous l’action de l’antibiotique n’est pas recherchée.
De même, des procédés de détection de la résistance en MALDI-TOF après mise en culture des microorganismes en présence d’antibiotiques sont connus et sont décrits par exemple dans les demandes WO 2014/187517, US 2008/009029 et EP 2 801 825.
Dans la demande WO 2014/187517, lorsque le germe est résistant à l’antibiotique, le procédé mesure une augmentation de la biomasse bactérienne. Alors que dans la demande US 2008/009029, lorsque le germe est résistant à l’antibiotique, le procédé décrit une altération du paterne protéique bactérien, au cours de la culture. Ces procédés nécessitent donc un temps de culture suffisamment long pour s’assurer que les bactéries ont répondu à l’action de l’antibiotique, soit en se multipliant, après éventuellement un temps de latence ou en ne se divisant plus (WO 2014/187517) soit en modifiant, ou pas, leur paterne protéique (US 2008/009029). Par ailleurs chez certaines espèces et pour certains types de résistance il n’y a aucune modification du paterne protéique.
Dans ce contexte, l’objectif de la présente invention est de proposer un procédé de détermination de la sensibilité ou de la résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, qui permette de palier les inconvénients des procédés de l’art antérieur, à savoir fournir un procédé peu coûteux, sans utilisation de détergeant, sans réactifs spécifiques à chaque espèce, donnant un résultat en un temps court, inférieur à une heure, et utilisable en clinique de routine, sans nécessiter un personnel hautement qualifié.
A cette fin, l’invention propose un nouveau procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact d’un échantillon comprenant ladite bactérie avec ledit au moins un antibiotique, ledit antibiotique induisant la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique et provoquant la libération des composés intracellulaires de ladite bactérie lorsque celle-ci est dite « sensible » audit au moins un antibiotique, b) incubation dudit échantillon avec ledit au moins un antibiotique, c) purification dudit échantillon par élimination des bactéries intacts et des débris cellulaires, d) analyse de l’échantillon purifié par spectrométrie de masse, e) détection de la présence ou de l’absence d’au moins un pic d’au moins une protéine caractéristique de ladite bactérie, f) détermination de la sensibilité ou de la résistance de ladite population bactérienne au dit antibiotique.
Dans le cadre du procédé de l’invention, l’échantillon pourra provenir de différentes sources. A titre d'exemples, nous pouvons citer les échantillons d'origine biologique, notamment animale ou humaine. Un tel échantillon peut correspondre à un prélèvement de fluide biologique, du type sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, sécrétion organique, à un prélèvement tissulaire ou à des cellules isolées. Ce prélèvement pourra être utilisé tel quel, ou sera, de préférence, soumis préalablement à sa mise en contact avec l’antibiotique, à une préparation de type enrichissement ou culture, à une concentration et/ou à une étape d'extraction ou de purification selon des méthodes connues de l'homme du métier. Néanmoins, une telle préparation ne peut pas correspondre à une étape de lyse qui entraîne la désintégration des micro -organismes et une perte de leur contenu avant la mise en contact avec l’antibiotique. L’échantillon pourra être utilisé sous la forme d’un inoculum.
Le plus souvent, l’échantillon pourra au préalable avoir été mis en culture dans un bouillon ou sur une gélose de manière à l'enrichir en bactérie. De tels milieux, gélosés ou en bouillon, sont bien connus de l’homme de l’art.
L’échantillon, comprendra, de préférence, une seule espèce bactérienne. Il n'est cependant pas exclu d’utiliser un échantillon comprenant plusieurs bactéries. Dans ce cas, il sera préférable que les bactéries soient connues pour être susceptibles de développer des mécanismes de résistance différents, de manière à savoir lequel présenterait la résistance qui serait identifiée.
Les bactéries qui peuvent être caractérisées par le procédé de l’invention sont toutes les bactéries, pathogènes ou non, rencontrées tant dans l’industrie que dans la clinique.
Au sens de la présente invention, le terme bactérie recouvre les bactéries à Gram positif ou à Gram négatif.
Avantageusement la bactérie est une bactérie à Gram négatif, préférentiellement choisie parmi les espèces et sous-espèces suivantes : Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter junii, Citrobacter freundii, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas fluorescens, Salmonella enteritica sérotype Enteritidis, Salmonella enteritica sérotype Paratyphi B variant Java, Salmonella enteritica sérotype Agona, Salmonella enteritica sérotype Enteritidis, Salmonella enteritica sérotype Haifa, Salmonella enteritica sérotype Newport et Pseudomonas aeruginosa.
Par sensibilité d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, on entend la capacité de cet antibiotique à tuer ou inhiber suffisamment la croissance de cette bactérie.
Par détermination de la sensibilité en entend détermination de la susceptibilité d’une bactérie à être tuer ou dont la croissance est inhibée par un antibiotique.
Par résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, on entend un phénomène selon lequel la bactérie conserve tout ou partie de sa viabilité, de sa croissance ou de sa reproduction, quand elle est exposée à une concentration d'antibiotique qui est reconnue comme étant efficace vis-à-vis de cette bactérie en l’absence de résistance. Cette résistance peut être acquise par une ou plusieurs souches d’une espèce bactérienne naturellement sensible à cet antibiotique. Cette résistance peut également être innée ou naturelle.
Dans le cadre de la présente invention, la résistance aux antibiotiques peut être une résistance chromosomique et/ou extra-chromosomique, également appelé plasmidique.
La génétique bactérienne ayant trait aux mécanismes de résistance aux antibiotiques est largement décrite dans la littérature notamment dans l’ouvrage de référence ANTIBIOGRAMME (P. Courvalin et R.Leclercq, 2012, 3e Edition, Chapitre 3. GENETIQUE DE LA RESISTANCE).
Par détermination de la résistance à au moins un antibiotique, on entend la détermination de la capacité d’une bactérie à se multiplier lorsqu’elle est exposée à un antibiotique auquel elle est naturellement sensible.
Le procédé objet de la présente invention est également applicable aux souches bactériennes qui expriment une hétérorésistance, c’est-à-dire que seule une partie, minoritaire ou non, de la population d’un clone bactérien exprime cette résistance.
Par antibiotique on entend toute substance chimique, naturelle ou synthétique, qui a une action spécifique sur les bactéries.
Dans le cadre de la présente invention, l’antibiotique induit la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique provoquant ainsi la libération des composés intracellulaires de la bactérie lorsque celle-ci est sensible à cet antibiotique. Les antibiotiques induisant la rupture de la paroi bactérienne et ceux induisant la rupture de la membrane cytoplasmique se distinguent par leur mode d’action sur les bactéries. Il est essentiel, dans le cadre de la présente invention, que la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique soient induites par l’antibiotique et non pas par l’action d’un solvant ou d’un acide. En effet, dans une analyse par spectrométrie de masse, il est classique de prévoir une lyse bactérienne à l’aide de solvant, tel que l’acétonitrile ou un alcool (éthanol, méthanol...), et/ou d’acide, tel que l’acide formique. L’objectif de cette étape de lyse est de libérer des protéines intracellulaires, pour les observer par spectrométrie et par exemple identifier le microorganisme. Dans le cadre de la présente invention il est important que cette étape de lyse ne soit pas réalisée afin que la libération des composés intracellulaires de la bactérie ne soit due qu’à l’action de l’antibiotique lorsque celle-ci est sensible à cet antibiotique et non pas à celle d’un solvant ou un acide et ainsi ne pas fausser le résultat.
Parmi les antibiotiques agissant sur la paroi bactérienne, il y a ceux induisant l’inhibition de la synthèse de précurseurs de la paroi, ceux induisant l’inhibition du transfert des précurseurs de la paroi sur un lipide porteur, ceci permettant normalement leur transport à travers la membrane plasmique et ceux induisant l’inhibition de l'insertion des unités glycaniques, précurseurs de la paroi, et de la transpeptidation.
Le blocage de la synthèse de la paroi fragilise fortement l'enveloppe externe des bactéries, qui deviennent très sensibles à des stress extérieurs (pression osmotique, température, stress mécanique) induisant la lyse cellulaire et provoquant ainsi la libération des composés intracellulaires.
A titre d’exemples d’antibiotiques induisant l’inhibition de la synthèse de précurseurs de la paroi, nous pouvons citer la D-cyclosérine ou encore la fosfomycine.
A titre d’exemple d’antibiotique inhibant le transfert des précurseurs de la paroi sur un lipide porteur nous pouvons citer la bacitracine.
A titre d’exemples d’antibiotiques agissant sur l’insertion des unités glycaniques, précurseurs de la paroi, et de la transpeptidation, nous pouvons citer les b-lactamines, qui inhibent la transpeptidase intervenant dans la synthèse de la paroi ou encore les glycopeptides, qui se lient à un intermédiaire de synthèse du peptidoglycane.
L'existence d'une membrane cytoplasmique intacte est nécessaire à la survie bactérienne. Son rôle est double, d’une part elle permet de séquestrer métabolites et ions nécessaires à l'intérieur du cytoplasme, d'autre part, elle permet de maintenir un gradient de protons entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule, généré par la chaîne respiratoire et le cycle de Krebs et qui permet le stockage de l'énergie cellulaire. Ce gradient de protons alimente GATR synthase qui fabrique GATR. Toute perturbation de l'imperméabilité de la membrane rompt ces confinements, l'énergie chimiosmotique est dissipée et le contenu du cytoplasme fuit dans le milieu extracellulaire. Il existe un certain nombre de molécules antibiotiques qui agissent sur la membrane cytoplasmique des cellules, soit en agissant comme des détergents qui désorganisent les lipides, soit en formant un pore dans la membrane cytoplasmique qui va provoquer la libération des composés cellulaires.
A titre d’exemples d’antibiotiques agissant au niveau de la membrane cytoplasmique, nous pouvons citer les polymyxines ou encore gramicidine. Les polymyxines agissent comme des détergents cationiques : grâce à leur caractère amphipathique, elles pénètrent dans la cellule bactérienne et s'insèrent parmi les phospholipides de la paroi, perturbant ainsi la perméabilité membranaire. La gramicidine est un peptide qui s'insère dans la membrane en formant un pore cylindrique permettant la fuite des cations.
Avantageusement, l’antibiotique est choisi parmi les polymyxines, les b- lactamines, les aminosides, les quinolones et les glycopeptides, préférentiellement l’antibiotique est une polymyxine et est choisi parmi la colistine et la polymyxine B.
Avantageusement, et selon l’invention, l’antibiotique présente une concentration comprise entre deux fois la concentration minimale inhibitrice et dix fois la concentration minimale inhibitrice pour la population bactérienne étudiée.
Dans un mode de réalisation particulier, l’antibiotique présente une concentration au moins dix fois supérieure à la concentration minimale inhibitrice de l’antibiotique pour la population bactérienne étudiée. De manière préférentielle, l’antibiotique présente une concentration au moins cent fois supérieure à la concentration minimale inhibitrice de l’antibiotique pour la population bactérienne étudiée. Et encore plus préférentiellement, l’antibiotique présente une concentration au moins mille fois supérieure à la concentration minimale inhibitrice de l’antibiotique pour la population bactérienne étudiée. Les inventeurs ont démontré, contre toute attente, que le procédé selon l’invention fonctionnait à de telles concentrations. En effet il n’est pas évident d’utiliser cette gamme de concentrations pour un antibiotique car d’une part dans le cadre d’une analyse par spectrométrie de masse les pics correspondant à l’antibiotique pouvaient masquer les pics correspondants aux protéines caractéristiques de la bactérie. L’étape d’ionisation est en effet sujette à une compétition entre molécules, généralement favorable aux molécules les plus abondantes de l’échantillon, à savoir l’antibiotique dans le cas présent. La forte concentration d’antibiotique risquait donc d’empêcher la détection des pics de protéines. D’autre part de telles concentrations peuvent être toxiques pour un patient si elles sont prescrites. Dans le cadre de la présente invention, la concentration minimale inhibitrice, ou CMI, est la plus faible concentration d’antibiotiques capable d’inhiber in vitro toute culture visible de la souche étudiée à une température donnée et pendant une période de temps définie. Cette valeur caractérise l’effet bactériostatique d’un antibiotique sur une bactérie. La CMI est spécifique d’un couple antibiotique/bactérie, chaque souche ayant sa propre valeur, en fonction des résistances naturelles et/ou acquises pour la molécule testée.
Avantageusement, en plus de l’antibiotique, un composé connu pour accélérer la réaction enzymatique mise en œuvre dans le mécanisme de résistance considéré peut être également mis en contact avec l’échantillon. Ce composé peut par exemple être du zinc, sous la forme ZnC’b ou sulfate de zinc notamment, qui est un co-facteur important pour l'activité des métallo -b-lactamases. Ce composé peut être ajouté en combinaison avec l'antibiotique ou à tout autre moment dans la préparation de l’échantillon.
Dans le cadre de la présente invention, suite à l’étape de mise en contact de l’échantillon avec un antibiotique, le procédé comprend une étape d’incubation pour permettre l'interaction entre la ou les populations bactériennes et le ou les antibiotiques.
Les conditions et le temps d'incubation seront adaptés par l'homme du métier en fonction des populations à analyser. L’échantillon peut être laissé à une température appartenant, par exemple, à une gamme allant de 15 à 100°C, et notamment à température ambiante (22°C). Il est également possible de le transférer dans une enceinte thermostatée, par exemple à 37°C.
Avantageusement, et selon l’invention, la température d’incubation sera de 50°C ou environ 50°C. Les inventeurs ont montré, de façon surprenante, qu’une température d’incubation élevée (de l’ordre de 50°C), pouvant être létale pour les bactéries, était adaptée dans le cadre de la présente invention.
Dans les conditions sélectionnées, le temps d’incubation devra être suffisant pour permettre la lyse des bactéries lorsque celles-ci sont sensibles et ainsi permettre la détection ultérieure par spectrométrie de masse de ses composés intracellulaires notamment de protéines intracellulaires qui auront été libérées. L’incubation est, le plus souvent, réalisée pendant une durée comprise entre 45 et 90 minutes, préférentiellement pendant moins de 30 minutes, plus préférentiellement pendant moins de 15 minutes et encore plus préférentiellement pendant moins de 10 minutes. Ceci représente un avantage par rapport aux procédés de l’art antérieur, notamment ceux décrits dans les demandes US 2008/009029, WO 2014/187517, où le temps nécessaire à l’incubation dépasse les deux heures. Ce temps long est nécessaire pour s’assurer que les bactéries ont bien répondu à l’action de l’antibiotique par modification, respectivement de la croissance bactérienne ou du paterne protéique. Un tel effet n’est pas recherché dans le procédé selon l’invention. Ainsi, il n’est pas nécessaire d’attendre une durée suffisante pour permettre une division des cellules bactériennes, ni même un changement du taux d’expression de leurs protéines.
Il a été constaté, dans le cadre de l'invention, que la réalisation d'une telle étape d'incubation ne gênait en rien une identification ultérieure d’une bactérie, s’il était souhaité de réaliser une telle caractérisation, en plus de la détermination de la sensibilité ou de la résistance.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé de l’invention peut comprendre après l’étape d’incubation, une étape d’homogénéisation. Dans le cadre de la présente invention, si le procédé comprend une étape d’homogénéisation, cette étape ne doit pas induire la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique, notamment par cavitation. Cette étape pourra notamment être mise en œuvre par des techniques telle que la sonication, le vortex mécanique ou magnétique, à l’aide d’un mélangeur thermique, de type thermomixeur, si tant est que ces techniques n’induisent pas la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique.
Cette étape permet de mélanger intimement l’antibiotique et le microorganisme à analyser et de réduire le temps d’incubation nécessaire à la diffusion de l’antibiotique au voisinage de la paroi et/ou de la membrane.
Selon la présente invention la technique de sonication consiste en l’incubation de microtubes dans un bain à ultrason.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, la sonication se déroule pendant une durée comprise entre 5 et 90 minutes.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, le vortexage mécanique se déroule pendant une durée comprise entre 5 et 90 minutes.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, le vortexage magnétique se déroule pendant une durée comprise entre 5 et 90 minutes.
Dans le cadre de la présente invention, le procédé comprend une étape de purification dudit échantillon par élimination des bactéries intactes et des débris cellulaires. Cette étape consiste à conserver dans l’échantillon uniquement les composés intracellulaires libérés par la bactérie analysée lorsque celle-ci a été mise en contact avec un antibiotique auquel elle est sensible. Ainsi les bactéries non sensibles, qui seront intactes, et les débris cellulaires, suite à la lyse, sont éliminés de l’échantillon à analyser. Avantageusement, cette étape de purification de l’échantillon pourra notamment être mis en œuvre par des techniques telle que la centrifugation, la filtration, la chromatographie ou encore l’électrophorèse.
Ces techniques séparatives peuvent être utilisées seules ou combinées entre elles pour obtenir une séparation multidimensionnelle. Par exemple, une chromatographie multidimensionnelle peut être utilisée en associant une séparation par chromatographie d’échange d’ions à une chromatographie en phase inverse, comme décrit par T. Fortin et al. (2009) ou H. Keshishian et al. (2007) pour l’analyse de peptides protéiques protéotypiques. Dans ces travaux, le milieu chromatographique peut être en colonne ou en cartouche (extraction en phase solide). La fraction électrophorétique ou chromatographique (ou le temps de rétention en chromatographie mono ou multidimensionnelle) des peptides protéotypiques est caractéristique de chaque peptide et la mise en œuvre de ces techniques permet donc de sélectionner le ou les peptides protéotypiques à doser. Un tel fractionnement des peptides générés permet d’accroître la spécificité du dosage ultérieur par spectrométrie de masse. Il est également possible de travailler sur des protéines entières notamment par une technologie dite « top-down » comme synthétisées par Donnelly et al., (Nature Methods, 2019). Dans ces travaux, la fraction électrophorétique ou chromatographique (ou le temps de rétention en chromatographie mono ou multidimensionnelle) des protéines est caractéristique de chaque protéine et la mise en œuvre de ces techniques permet donc de sélectionner la ou les protéines à doser.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, la centrifugation se déroule pendant une durée comprise entre 1 et 60 minutes et à une vitesse de rotation comprise entre 300 g et 30 000 g.
Dans le cadre de la présente invention, la filtration consiste en une filtration sur filtre de porosité comprise entre 0.02 et 0.22mpi.
Dans le cadre de la présente invention, l’électrophorèse consiste en une technologie de séparation sous l’action d’un champ électrique. De nombreuses techniques et leurs variantes sont bien connues de l’homme du métier. A titre d’exemple et sans être limitatif, l’électrophorèse pourra être choisie parmi l’isotachophorèse, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de Sulfate Dodecyl de Sodium (SDS-PAGE), l’isoéléctrofocalisation (IEF), ou encore l’électrophorèse bi-dimensionnelle qui est une combinaison d’IEF et de SDS-PAGE.
Dans le cadre de la présente invention, la chromatographie consiste en une séparation de molécules présentes dans une phase mobile à l’aide d’une phase stationnaire. De nombreuses techniques et leurs variantes sont bien connues de rhomme du métier. A titre d’exemple et sans être limitatif, la chromatographie pourra être choisie parmi la chromatographie sur couche mince, la chromatographie sur cartouche d’extraction en phase solide (SPE) ou la chromatographie sur colonne de chromatographie. La cartouche ou la colonne pourra contenir un composé chromatographique pour assurer la sélectivité de la méthode selon les propriétés physicochimiques des molécules d’intérêt. A titre d’exemple et sans être limitatif, ce composé pourra permettre une chromatographie phase inverse (Cl 8, C8 ou C4), une chromatographie d’exclusion sérique, une chromatographie d’échange d’ions ou une chromatographie d’affinité.
La spectrométrie de masse à mettre en œuvre dans le procédé de l’invention est largement connue de l’homme du métier comme un outil puissant pour l’analyse et la détection de différents types de molécules. De façon générale, tout type de molécule pouvant être ionisée peut être détecté en fonction de sa masse moléculaire à l’aide d’un spectromètre de masse. Selon la nature de la molécule à détecter, d’origine protéique ou métabolique, certaines technologies de spectrométrie de masse peuvent être plus adaptées. Néanmoins, quelle que soit la méthode de spectrométrie de masse utilisée pour la détection, cette dernière comprend une étape d’ionisation de la molécule cible en ions dits moléculaires, dans le cas présent une étape d’ionisation des protéines d’au moins une bactérie, et une étape de séparation des ions moléculaires obtenus en fonction de leur masse.
Tous les spectromètres de masse comportent donc :
- une source d’ionisation destinée à ioniser les molécules présentes dans l’échantillon à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces molécules;
- un analyseur de masse destiné à séparer les molécules ionisées, ou ions moléculaires, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z) ;
- un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci- après.
L’étape d’ionisation nécessaire pour la mise en œuvre d’une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l’homme du métier. La source d'ionisation permet d’amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. On peut citer, notamment : - l'ionisation électronique (El), l'ionisation chimique (CI) et la désorption- ionisation chimique (DCI) ;
- le bombardement par atomes rapides (F AB), atomes métastables (MAB) ou ions (SIMS, LSIMS) ;
- le couplage plasma inductif (ICP) ;
- l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI) ;
- l'électronébulisation ou électrospray (ESI) ;
- la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI), activée par une surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS) ;
- l’ionisation à pression atmosphérique, par exemple par désorption- ionisation par électronébulisation (DESI), nano désorption-ionisation par électronébulisation (nDESI), ionisation électrospray par ablation laser (LAESI), ionisation par évaporation MS rapide (REIMS), ou paperspray;
- l’ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART).
L’étape d’analyse de masse nécessaire pour la mise en œuvre d’une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l’homme du métier. L’analyseur de masse permet de séparer les molécules à doser, sous un état gazeux et ionisé, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z). Plusieurs types d’analyseur de masse existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripôle ou quadrupède (Q), mobilité ionique, piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnétique ou électrique, le temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique, ou encore l’orbitrap.
D’une manière générale, toute méthode de spectrométrie de masse adaptée à la détection d’au moins une molécule bactérienne peut être utilisée dans le cadre de l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier, la spectrométrie de masse utilisée est la spectrométrie de masse par désorption-ionisation assistée par matrice et mesure du temps de vol (MALDI-TOF) qui présente notamment l’avantage d’une mise en œuvre relativement simple.
Une source d’ionisation MALDI permet d’ioniser des molécules, à partir d’un échantillon à l’état solide. Préalablement à son ionisation, l’échantillon est préférentiellement mis en contact avec une matrice. La matrice utilisée contient avantageusement un composé choisi parmi l'acide 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique (i.e. acide sinapique ou acide sinapinique) ; l’acide a- cyano-4-hydroxycinnamique (i.e. alpha-cyano, alpha- matrice ou CHCA), l'acide férulique et l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (i.e. DHB).
Il existe plusieurs techniques de dépôt qui pourront être utilisées dans le cadre de l'invention pour mettre l'échantillon en contact avec la matrice ; dépôt sur une couche de matrice sèche, dit dépôt « couche mince », dépôt avec une goutte de matrice, dit dépôt « goutte séchée », dépôt sur une couche de matrice, puis rajout d’une goutte de matrice, dit dépôt « sandwich ».
Généralement, les matrices sont photosensibles et cristallisent en présence de l'échantillon tout en préservant l'intégrité des molécules. De telles matrices, notamment adaptées à la technique MALDI-TOF, sont bien connues et choisies parmi ; l’acide 3,5- diméthoxy-4-hydroxycinnamique; l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique, l'acide férulique et l’acide 2,5- dihydroxybenzoïque. De nombreux autres composés sont connus de l’homme du métier. Il existe même des matrices liquides qui ne cristallisent ni à pression atmosphérique, ni même sous vide (Tholey and Heinzie 2006). Tout autre composé qui permettra d’ioniser les molécules de l'échantillon sous l'effet d'un rayon laser pourra être utilisé. Notamment, la cible, c'est-à-dire le support sur lequel est déposé l'échantillon, pourra directement jouer le rôle de matrice, comme dans le cas des techniques « Nano-Assisted Laser Desorption/Ionization » (NALDI) ou « Desorption/Ionization On Silicon » (DIOS). Le rayon laser pourra avoir tout type de longueur d’onde favorable à la sublimation ou à la vaporisation de la matrice. De préférence, la longueur d'onde ultraviolette ou même infrarouge sera utilisée.
Dans la matrice, un tel composé est mis en solution, le plus souvent dans l'eau, de préférence de qualité « ultrapure », ou dans un mélange eau/solvant(s) organique(s). A titre d'exemple de solvants organiques classiquement utilisés, on peut citer, l'acétone, l'acétonitrile, le méthanol ou l’éthanol. L’acide trifluoroacétique (TFA) peut parfois être ajouté. Un exemple de matrice est, par exemple, constituée de 20 mg/mL d'acide sinapique dans un mélange acétonitrile/eau/TFA de 50/50/0,1 (v/v). Le solvant organique permet aux molécules hydrophobes présentes dans l'échantillon de se dissoudre dans la solution, alors que l'eau permet la dissolution des molécules hydrophiles. La présence d'acide, tel que le TFA, favorise l’ionisation des molécules de l’échantillon par captation d’un proton (H+).
Le solvant présent dans la matrice est ensuite évaporé, par exemple, en laissant l’échantillon à une température appartenant, par exemple, à la gamme allant de 17 à 30°C, et notamment à température ambiante (22°C) pendant quelques minutes, par exemple de 1 mn à 2h. Cette évaporation du solvant permet la cristallisation de la matrice dans laquelle l’échantillon est réparti. Ensuite, l’échantillon, placé au sein de la matrice cristallisée, est soumis à une ionisation douce. Cette ionisation sera, de préférence, réalisée avec un laser à azote émettant un rayon UV à 337.1 nm.
Lors de l’ionisation, l’échantillon est soumis à une excitation par laser. Les cristaux de la matrice absorbent alors l’énergie photonique et la restitution de cette énergie entraîne la sublimation de la matrice, la désorption de l’échantillon et l’apparition de matière dans un état qualifié de plasma. Au sein de ce plasma, il se produit des échanges de charges entre molécules de matrice et d’échantillon. Par exemple, des protons peuvent être arrachés à la matrice et transférés aux protéines et aux peptides de l’échantillon. Cette étape permet une ionisation douce des bio molécules sans induire leurs destructions. Les échantillons libèrent ainsi des ions de différentes tailles. Ces derniers sont alors accélérés par un champ électrique et volent librement dans un tube sous pression réduite, nommé tube de vol. La pression appliquée lors de l’ionisation et lors de l’accélération des ions générés appartient le plus souvent à la gamme allant de 106 à 109 millibar (mbar). Les ions les plus petits vont alors « voyager » plus rapidement que les ions plus gros permettant ainsi leurs séparations. A l’extrémité terminale du tube de vol est situé un détecteur. La durée de vol des ions est utilisée pour calculer leur masse. Ainsi, un spectre de masse est obtenu, représentant l’intensité du signal correspondant au nombre de molécules ionisées d’une même masse sur charge (m/z), en fonction du rapport m/z des molécules qui frappent le détecteur. Le rapport m/z est exprimé en Thomson (Th). Une fois introduite dans le spectromètre de masse, le spectre d’un échantillon est obtenu très rapidement, le plus souvent en moins d’une minute.
La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être mise en œuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l’analyse est appelée MS/MS, ou MS2. Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l’analyse est appelée MS/MS/MS, ou MS3 et plus généralement, lorsque n séparations MS successives sont réalisées, l’analyse est appelée MSn.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la spectrométrie de masse utilisée dans le procédé de l’invention est une spectrométrie de masse en tandem (MS2, MS3, MS4 ou MS5), où plusieurs analyseurs de masse sont couplés entre eux. Par exemple, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le LT- ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement. Cette technologie permet une séparation successive dans deux analyseurs de masse, ce qui a notamment l'avantage de présenter une très bonne spécificité en sélectionnant un ion dans le premier analyseur, en le fragmentant et en analysant ses ions fils dans le deuxième analyseur.
Avantageusement, la séparation peut être réalisée dans un MALDI-TOF-TOF qui comporte deux analyseurs à temps de vol et la même simplicité d’utilisation qu’un MALDI- TOF.
Alternativement, la source d'ionisation peut être de tout type de source connue de l’homme du métier et l’analyseur de masse de tout type d’analyseur de masse connu de l’homme du métier.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la spectrométrie de masse est en tandem et utilise une source électrospray et une combinaison d’au moins deux des analyseurs précédemment cités.
Notamment, l’ionisation peut être mise en œuvre comme suit : l’échantillon contenant les molécules cibles est introduit dans une source d'ionisation électrospray qui permet d’ioniser une molécule tout en la faisant passer d’un état liquide à un état gazeux. Les molécules sont ainsi transformées en ions moléculaires qui correspondent aux molécules initiales. Les ions moléculaires obtenus correspondent alors aux molécules initialement présentes dans l’échantillon liquide, avec en mode positif un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus. Par exemple, lorsque la molécule cible est une protéine en phase liquide, une ionisation grâce à une source électrospray fonctionnant en mode positif, conduit à des ions à l’état gazeux, avec un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et qui sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus. Ce type de source est particulièrement bien adapté, lorsque les molécules cibles, telles que des protéines, sont préalablement séparées par chromatographie liquide en phase inverse.
Parmi les techniques mettant en œuvre plusieurs séparations successives, les modes SRM ( Selected Reaction Monitoring ) en cas de détection ou dosage d’une seule molécule cible, MRM {Multiple Reaction Monitoring ) en cas de détection ou dosage de plusieurs molécules cibles, ou bien PRM {Parallel Reaction Monitoring ) sont des utilisations particulières de séparation MS2. De même le mode MRM3 est une utilisation particulière de séparation en MS/MS/MS (WO 2010136706). Les techniques SRM, MRM, PRM et MRM3 sont des techniques de spectrométrie de masse ciblée, ce qui signifie que les ions de la molécule à détecter sont spécifiquement ciblés pour être analysés. De même, les techniques DDA (data dépendent acquisition) ou DIA (data independent acquisition) mettent en œuvre plusieurs séparations successives. Cependant, elles ne ciblent pas au moins un ion en particulier. A titre d’exemple, l’approche DDA consiste à i) acquérir un spectre MS, ii) sélectionner successivement chaque ion précurseur observé sur le spectre MS avec un signal intense, iii) fragmenter successivement chaque ion précurseur et acquérir son spectre MS/MS, iv) interroger des bases de données telles que SWISS-PROT ou NCBI, aux travers de logiciels tels que Mascot (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) ou SEQUEST (Thermo Scientifïc, Waltham, Etats-Unis d’Amérique), pour identifier la molécule ayant une forte probabilité de correspondre au spectre MS/MS observé. Cette méthode peut conduire à l’identification d’une molécule caractéristique d’un microorganisme sans pour autant cibler son analyse à priori. Les méthodes DIA ne comportent pas d’étape ii). Un ensemble d’ions est fragmenté et analysé à l’étape iii) indépendamment de leur intensité relative. Autrement dit, au lieu de fragmenter les ions un à un en fonction de l’acquisition réalisé en i), une fenêtre de masse comportant éventuellement plusieurs ions précurseurs est sélectionnée dans le premier analyseur de masse. Ces dits plusieurs ions précurseurs sont transférés dans le ou les analyseurs suivants pour être fragmentés et analysés simultanément. Cette technique est particulièrement avantageuse lors de l’utilisation d’un spectromètre de masse à haute résolution, capable d’identifier avec une grande précision l’ensemble des ions fragments correspondant respectivement aux différents ions précurseurs sélectionnés de façon concomitante.
Dans le cas d’une détection en mode MS simple, c’est le rapport masse/charge des ions moléculaires obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter.
Dans le cas d’une détection en mode MS/MS, essentiellement deux étapes sont ajoutées, par rapport à un dosage MS qui sont : une fragmentation des ions moléculaires, alors appelés ions précurseurs, pour donner des ions fils, dit ions fragments, et une séparation des ions fils dit ions fragments en fonction de leur masse/charge (m/z)2, le rapport (m/z)i correspondant au rapport (m/z) des ions précurseurs.
C’est alors le rapport masse/charge des ions fragments ainsi obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter. Par ion fragment, on entend un ion issu de l’ion précurseur, suite à une étape de fragmentation et dont le rapport masse sur charge m/z est différent de l’ion précurseur.
Les couples (m/z)i et (m/z)2 sont baptisés transitions et sont représentatifs des ions caractéristiques à détecter. Le choix des ions caractéristiques qui sont détectés pour être corrélés à la molécule cible est effectué classiquement par l’homme du métier de façon à conduire avantageusement aux dosages les plus sensibles, les plus spécifiques et les plus robustes possibles, en termes de reproductibilité et fiabilité.
Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l’un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripôle ou des hybrides triple quadripôles à trappe ionique sont généralement utilisés (WO 2011/045544). Le principe du mode PRM se distingue des modes SRM et MRM par l’utilisation d’un dernier analyseur à haute résolution. Ce dernier permet de détecter en parallèle l’ensemble des ions fragments avec une résolution suffisante pour assurer la spécificité de la méthode (Peterson AC et al., 2012). Pour une analyse PRM, des dispositifs hybrides de type quadripôles et temps de vol (Q-TOF) ou de type trappe ionique et orbitrap, ou encore quadripôles et orbitrap sont généralement utilisés.
Dans le cas d’un dispositif quadripôles et orbitrap (Q1 q2 Orbitrap) utilisé en mode PRM, en vue du dosage ou de la détection d’une protéine cible, le premier quadripôle (Ql) permet de filtrer les ions moléculaires, caractéristiques de la protéine à doser, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z). Seuls les ions ayant le ratio masse/charge de la protéine recherchée, ratios appelés (m/z)n, sont transmis dans le deuxième quadripôle (q2) et jouent le rôle d’ions précurseurs pour la fragmentation ultérieure. L’analyseur q2 permet de fragmenter les ions de ratio masse/charge (m/z)n en ions fragments. La fragmentation est généralement obtenue par collision des ions précurseurs avec un gaz inerte, comme de l’azote ou de l’argon dans q2. Les ions fragments sont transmis dans l’orbitrap qui détermine leur ratio m/z. Les ions fragments ayant le ratio masse/charge (m/z)Î2 de fragments caractéristiques de la ieme protéine recherchée sont alors détectés, voire quantifiés.
Ce mode de fonctionnement présente une double sélectivité, en relation avec la sélection de l’ion précurseur d’une part et de la sélection d’au moins un ion fragment d’autre part.
La spectrométrie de masse en mode SRM, MRM ou PRM est avantageuse pour la quantification dans la mesure où elle détecte de façon quantitative des ions fragments caractéristiques de la molécule à détecter, voir quantifier.
L’utilisation d’un procédé de détection par MS est avantageux car il peut être réalisé en quelques minutes et qu’il nécessite un spectromètre de masse avec un seul analyseur, c’est à dire un instrument moins complexe qu’un spectromètre de masse en tandem utilisé en MS/MS.
L’utilisation d’un procédé de détection par MS/MS est également avantageux car il permet de générer un fragment spécifique des molécules à détecter et ainsi d’apporter une grande spécificité au procédé selon l’invention.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la spectrométrie MS/MS est de la MRM, ce qui a pour avantage d’utiliser un temps de cycle d’analyse dans le spectromètre de masse de quelques dizaines de millisecondes, ce qui permet de détecter avec une grande sensibilité, et de façon multiplexée, un grand nombre de molécules différentes.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la spectrométrie MS/MS est de la PRM, ce qui a pour avantage d’utiliser plusieurs ions fragments pour caractériser la détection de la molécule cible.
Avantageusement, le procédé selon l’invention peut être mis en œuvre à l’aide d’un MALDI-TOF, comme décrit par Claydon et al. et par T. Krishnamurthy et P. Ross. L’analyse associe l’acquisition d’un spectre de masse et l’interprétation d’un logiciel expert. Elle est extrêmement simple et peut être effectuée en quelques minutes.
Le procédé selon l’invention peut également être mis en œuvre avec une source électrospray sur échantillon brut, comme décrit par S. Vaidyanathan et al. ou encore par R. Everley et al. après séparation chromatographique. Différentes gammes de m/z permettent alors d’identifier les protéines caractéristiques des microorganismes à analyser. S. Vaidyanathan et al. ont utilisé une fenêtre entre 200 et 2000 Th et R. Everley et al. une fenêtre entre 620 et 2450 Th. Les spectres de masse peuvent également être déconvolués pour accéder à la masse des protéines indépendamment de leur état de charge. R. Everley et al. ont ainsi exploité les masses entre environ 5 000 et 50 000 Da.
L’identification de bactéries, via la détection de leurs protéines présentes dans l’échantillon par MRM en mode ciblé, a été décrite par la demanderesse dans la demande WO 2011/045544. L’identification en mode non ciblé a également été largement appliquée par de nombreuses équipes. A titre d’exemple, il est possible de citer les travaux de Mânes N. et al. qui ont étudié le peptidome de Salmonelle enterica, ou les travaux de R. Nandakumar et al. ou de L. Hemychova et al. qui ont étudié le protéome de bactéries après digestion des protéines avec de la trypsine.
Ainsi dans le cadre de la présente invention lorsqu’une population bactérienne est sensible à un antibiotique induisant la rupture de sa paroi bactérienne et/ou de sa membrane cytoplasmique et libérant ainsi ses composés intracellulaires, le spectre généré par spectrométrie de masse présentera au moins un pic d’au moins une protéine caractéristique de cette population bactérienne.
On entend dans le cadre de la présente invention par pic de protéine caractéristique d’une population bactérienne, un pic qui permet de distinguer une population bactérienne de tout autre type d’échantillon moléculaire.
A contrario, lorsqu’une population bactérienne est résistante à un antibiotique, ce dernier ne provoque pas la rupture de sa paroi bactérienne ni de sa membrane cytoplasmique et par conséquent ne libère pas de composés intracellulaires, ainsi le spectre généré par spectrométrie de masse ne présentera pas de pic de protéine caractéristique de cette population bactérienne.
Des spectres de référence obtenus par technologie de spectrométrie de masse, notamment MALDI-TOF, pour une bactérie donnée correspondant à ses protéines majoritaires et caractéristiques, sont disponibles et enregistrés dans des bases de données disponibles avec les appareils commerciaux, et permettent, par comparaison, la détermination de la sensibilité de cette bactérie à l’antibiotique avec lequel elle a été mise en contact.
Avantageusement et selon l’invention, la au moins une protéine caractéristique est choisie parmi les protéines ribosomiques et les protéines de liaison à l'ADN.
De manière plus avantageuse, lorsque la bactérie est Escherichia Coli, la au moins une protéine caractéristique est choisie parmi la protéine de phase stationnaire induite associée au ribosome ( Stationary-phase-induced ribosome-associated protein, SPIRAP), la protéine chaperonne de stress acide HdeB {Acid stress chaperone HdeB ), les protéines ribosomiques 50S ( 50S ribosomal proteins ) L29, L31, L32, L33 et L35.
De manière plus avantageuse, lorsque la bactérie est Klebsiella pneumoniae, la au moins une protéine caractéristique est choisie parmi la protéine de liaison à l’ADN H-NS (DNA binding protein H-NS), les protéines ribosomiques L29, L31, L34 et US9.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, suite à l’étape e) de détection de la présence ou de l’absence de pic de protéine caractéristique de ladite bactérie, le procédé comprend une étape de calcul du ratio entre l’intensité d’au moins un pic de protéine caractéristique de la bactérie et l’intensité d’au moins un pic caractéristique de l’antibiotique utilisé.
Dans le cadre du mode de réalisation décrit dans le paragraphe précédent, lorsqu’il y a plusieurs pics de protéines caractéristiques le calcul du ratio se fait avec la somme des intensités des pics de protéines caractéristiques de la bactérie. De manière identique, lorsqu’il y a plusieurs pics caractéristiques de la colistine le calcul du ratio se fait avec la somme des intensités des pics caractéristiques de l’antibiotique utilisé.
Dans le cadre du mode de réalisation décrit dans les deux paragraphes précédents, le procédé comprend après l’étape du calcul du ratio une étape de détermination de la sensibilité ou de la résistance de la population bactérienne à l’antibiotique en fonction du ratio obtenu et d’un seuil fixé pour chaque espèce. L’homme du métier, à l’aide de ses connaissances, saura parfaitement déterminer un seuil qui permette de distinguer une bactérie résistante d’une bactérie sensible.
De manière avantageuse, le procédé selon l’invention comprend en plus, une étape d’identification de la famille, du genre, ou, de préférence, de l'espèce d'une population bactérienne.
Le procédé de l'invention et ses avantages ressortiront de la suite de la présente description relatant divers exemples non limitatifs de mise en œuvre du procédé de l’invention. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-après, qui se réfèrent aux figures annexées et dans lesquelles :
[Fig.l] représente un spectre MALDI-TOF de sulfate de colistine à 10 qg/ml entre 100 et 4000 Th. Echelle des abscisses : masse sur charge (m/z ou Th). Echelle des ordonnées : % Int pour intensité relative exprimée en pourcentage du pic d’intensité la plus forte ;
[Fig.2] représente un spectre MALDI-TOF de sulfate de colistine à 10 qg/ml entre 2000 et 4500 Th. Echelle des abscisses : masse sur charge (m/z ou Th). Echelle des ordonnées : % Int pour intensité relative exprimée en pourcentage du pic d’intensité la plus forte ;
[Fig.3] représente un spectre MALDI-TOF entre 4500 et 10000 Th de la souche EC_S traité selon l’exemple II ;
[Fig.4] représente un spectre MALDI-TOF entre 4500 et 10000 Th de la souche EC_R traité selon l’exemple II ;
[Fig.5] représente un spectre MALDI-TOF entre 4500 et 10000 Th de la souche S traitées selon l’exemple III ;
[Fig.6] représente un spectre MALDI-TOF entre 4500 et 10000 Th de la souche RI 6 traitées selon l’exemple III ; [Fig.7] représente un spectre MALDI-TOF entre 4500 et 10000 Th de la souche S traitée selon l’exemple IV ;
[Fig.8] représente un spectre MALDI-TOF entre 4500 et 10000 Th de la souche RI 6 traitées selon l’exemple IV ;
[Fig.9] représente des spectres MALDI-TOF entre 4 500 et 10 000 Th des souches suivantes d ’Escherichia coli : EC R16, EC R17, EC S10 et EC S15, traitées selon l’exemple V ;
[Fig.10] ] représente des spectres MALDI-TOF entre 4 500 et 10 000 Th des souches suivantes de Klebsiella pnemoniae : KP S10, KP S15, KP R9 et KP R16, traitées selon l’exemple V ;
[Fig.11] représente des spectres MALDI-TOF entre 4 500 et 10 000 Th des souches suivantes d ’Acinetobacter baumannii : AB_S044, AB_S045, AB_S046 et AB R-E105 traitées selon l’exemple V ;
[Fig.12] représente des spectres MALDI-TOF entre 4 500 et 10 000 Th des souches suivantes de Pseudomonas aeruginosa : PA_S062, PA_SE64,
PA RE66 et PA RE68 traitées selon l’exemple V.
Ces exemples ont pour but de faciliter la compréhension de l’invention, sa mise en œuvre et son utilisation. Ces exemples sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
EXEMPLES
L Profil MALDI-TOF de la colistine pure
La colistine (ou polymyxine E) est un antibiotique de la classe des polymyxine naturellement produits par Paenibacillus polymyxa subsp. colistinus (Benedict RG et al. , 1947). Cinq classes de polymyxine (A, B, C, D, E) sont connues mais seules les polymyxine B et E (ou colistine) sont utilisés en thérapeutique (Dortet L et al., 2016).
Pour rappel, la colistine est un antibiotique de la famille des polymyxines qui agissent sur la membrane cytoplasmique bactérienne. Grâce à leur caractère amphipathique tout comme des détergents cationiques, elles vont pénétrer dans la cellule bactérienne et s'insèrent parmi les phospholipides de la paroi, perturbant ainsi la perméabilité membranaire.
La colistine est utilisée comme antibiotique de dernier recours en cas d’infection par une bactérie multi-résistante. C’est le cas lorsque des souches d ’Enterobacteriaceae, de Pseudomonas spp. ou d'Acine tabac ter spp. résistent simultanément aux antibiotiques de la classe des Carbapénèmes, des Aminoglycosides et des Fluoroquinolones (Hancock RE, 1997). Ces phénomènes de multi-résistances augmentent de façon inquiétante dans certains pays, tels que la Grèce ou l’Italie, et oblige les médecins à prescrire de la colistine. Cet usage plus fréquent s’accompagne malheureusement de l’émergence de germes résistants à la colistine (Dortet L et al., 2016). Cette tendance est constatée tant chez les bactéries naturellement résistantes à la colistine, telle que Serratia, Morganella, Proteus ou Providencia, que chez des espèces habituellement sensibles mais ayant développé des mécanismes de résistance chromosomiques ou plasmidiques ( Klebsiella , Escherichia, Salmonella, Enterobacter, Shigella, etc). Un gène plasmidique (mcr-1) conférant la résistance à la colistine par transmission horizontale a été pour la première fois décrit en Chine récemment (Liu Y-Y et al., 2016). Depuis sa diffusion a été documentée, ainsi que l’existence de plusieurs variants (Chcn L et al., 2018), tant chez l’homme que chez les animaux. Ces observations inquiétantes font redouter une accélération de l’apparition de la résistance à la colistine (Dortet L et al., 2016).
La colistine de formule brute C52H98N16O13 a une masse monoisotopique théorique de 1154.750 Da et une masse chimique moyenne théorique de 1155.434Da. Après ionisation avec un proton, elle est détectable en spectrométrie de masse MALDI-TOF sous forme d’un massif isotopique dont le premier pic (pic monoisotopique) à une masse de 1155.758 Da ou sous forme d’un massif non résolu avec un apex à 1156.442 Da. La possibilité de détecter le pic monoisotopique ou seulement l’apex du massif isotopique dépend de la résolution du spectromètre de masse. Les instruments à haute résolution peuvent généralement détecter le pic mono iso topique alors que les instruments à faible résolution se contentent de la détection de l’apex du massif isotopique.
Des expériences préalables ont été menées pour détecter la colistine avec un instrument VITEK® MS Plus, un instrument de type MALDI-TOF, commercialisé par la société bioMérieux. Ces expériences ont été réalisées en mettant en œuvre les étapes ci-dessous :
- 1 mΐ de sulfate de colistine (Sigma référence C4461) diluée à 10pg/ml en eau a été déposée sur une cible jetable (bioMérieux référence 410893),
- 1 mΐ de matrice HCCA (bioMérieux, référence 411071) a été déposé sur la colistine,
- séchage de la cible,
- introduction de la cible dans l’instrument, et
- analyse avec une ionisation en mode positif pour une plage de mesure de 2 à 20 000 Th. L’extraction pulsée a été optimisée pour une masse de 2000 Th et la puissance laser a été fixée à 85. Cent profils de dix tirs ont été cumulés pour former un spectre de masse. Les pics ont été détectés après soustraction de la ligne de base et lissage du signal.
La Figure 1 présente le spectre de masse obtenus sur la gamme de masse 100 et 4000 Th et montre un massif à 1156.46 m/z et un autre massif à 1170.56 m/z. Le premier correspond à la colistine native et le second correspond à la colistine méthylée (+14 Da). En effet la colistine comporte 4 fonctions amines susceptibles de se méthyler.
Le pic à 1178.68 m/z correspond aux ions colistine monochargés avec adduit de sodium (+22 Da) et le pic à 1192.70 m/z aux ions colistine méthylés monochargés avec adduit de sodium (14 + 22 = +36 Da).
Ce travail permettra par la suite de distinguer les pics caractéristiques de la colistine des pics de protéines caractéristiques de la bactérie étudiée.
La Figure 2 est une observation du spectre sur la gamme de masse 2000- 4500 m/z. On observe quatre pics clairement définis, autour de 2283 ; 2987, 3439 et 4143 m/z. Ces pics correspondent à des polymères de colistine. L’écart de masse entre les pics à 2283 et 3439 m/z est de 1156 m/z, c’est-à-dire la masse de la colistine. Il en est de même pour l’écart entre les pics à 4143 et 2987 m/z.
Ce même profil de spectre a été obtenu (non illustré) pour toutes les concentrations de colistine testées (10, 5 et 2.5mg/ml) avec ou sans souches, sensible ou résistante, quel que soit le temps d’incubation (de 10 min à 4h). Ces pics correspondent donc à des molécules issues de la solution de sulfate de colistine utilisée (Sigma référence C4461), non caractéristiques de l’échantillon bactérien.
IL Détermination de la sensibilité ou de la résistance à la colistine chez Escherichia coli en 4 heures
Cet essai a été réalisé en utilisant le procédé selon l’invention afin de déterminer la sensibilité ou la résistance à colistine de la bactérie à Gram négatif Escherichia coli. Cette bactérie, également appelée colibacille et abrégée en E. coli, est une bactérie intestinale (Gram négatif) des Mammifères, commensale chez l'être humain. Certaines souches d'E. coli peuvent être pathogènes, entraînant alors des gastro-entérites, infections urinaires, méningites, ou sepsis. E. coli est une espèce habituellement sensible à la colistine mais certaines souches sont connues pour avoir développé des mécanismes de résistance chromosomiques ou plasmidiques. Dans le cadre de cet essai, deux souches ont été analysées, une souche d'E. coli sensible à la colistine, elle sera nommée EC_S, et une souche résistante, qui sera nommée EC R.
Cet essai a été réalisé en mettant en œuvre les étapes ci-dessous :
- préparation d’une suspension de souches EC_S et EC_R d’E. coli à 1 McFarland (McF) en eau (suspension medium, bioMérieux référence 70700),
- préparation d’une solution de sulfate de colistine (Sigma, référence C4461) à la concentration 5 mg/ml en eau pure (en tenant compte du titre de colistine indiqué par le fabriquant),
- mélange de 250 mΐ de chaque suspension avec 250 mΐ de colistine pour obtenir une solution de microorganisme à 0.5 McF et à la concentration de 2.5 mg/ml de colistine,
- homogénéisation à l’aide d’un vortex pendant une durée de 5 secondes,
- incubation du mélange 4 heures à 37°C,
- homogénéisation à l’aide d’un vortex pendant une durée de 5 secondes,
- centrifugation à 4700 tour par minute (1500g) pendant une durée de 5 minutes,
- dépôt de 1 mΐ du surnageant sur une cible jetable (bioMérieux référence 410893),
- dépôt sur la goûte de surnageant de 1 mΐ de matrice HCCA (bioMérieux, référence 411071),
- analyse de l’échantillon par spectrométrie MAFDI-TOF sur VITEK-MS Plus (bioMérieux) avec une méthode adaptée à la microbiologie, c’est-à-dire avec un mode d’ionisation positif et une gamme de masse de 2 000 à 20 000 Th.
- accumulation de 100 profils de 10 tirs et comparaison des données avec les données contenues dans les bases de données pour E. coli,
- observation de la présence ou de l’absence de pics de protéines caractéristiques d'E. coli.
- détermination de la sensibilité à la colistine si des protéines caractéristiques d'E. coli sont détectées ou de la résistance si aucune protéine d'E. coli n’est détectée. La Figure 3 présente le spectre de masse obtenu pour la souche EC_S. Dans la fenêtre de masse comprise entre 4500 et 10000 Th, on observe la présence de pics peu intenses différents des pics de colistine. Ces pics sont principalement à 4650.01, 4666.55, 6258.69, 6318.33, 6414.85, 7176.22, 7276.56 et 7871.90 m/z. Un massif mal résolu est également visible autour de 5370 m/z.
Les masses 6318.33, 7162.22, 7276.56 et 7871.90 correspondent respectivement aux pics 6316.14, 7158.68, 7274.39, et 7872.02 d'E. coli qui ont été identifiés comme correspondant respectivement aux protéines ribosomiques L32, L35, L29 et L31 (Arnold RJ and Reilly JP. 1999 ; Wilcox SK et al., 2001 ; Ryzhov V and Fenselau C, 2001 ; Jones JJ et al., 2003 ; Kallow W et al., 2010 ;Welker M and Moore ERB, 2011 ; Momo RA et al., 2013) Ces protéines sont donc caractéristiques d'E. coli. Cette observation indique que des cellules bactériennes ont subi une rupture de leur membrane cytoplasmique provoquent la libération des protéines ribosomiques dans le surnageant au cours des 4h d’incubation à 37°C en présence de 2,5 mg/ml de colistine. Ainsi le procédé selon l’invention permet de montrer que la souche EC_S est sensible à la colistine.
A noter que la concentration en colistine (2,5 mg/ml) correspond à 1250 fois la concentration minimale inhibitrice (CMI) au-delà de laquelle une souche est considérée comme résistante.
La Figure 4 présente le spectre de masse obtenu pour la souche EC_R. Le massif à 5313 et les pics à 4649 et 4666 m/z sont toujours détectés, en revanche les protéines d'E. coli L32, L35, L29 et L31, caractérisées respectivement par les pics 6316.14, 7158.68, 7274.39, et 7872.02 m/z ne sont pas visibles. Aucune protéine bactérienne n’est donc détectable. La bactérie ne semble donc pas avoir subi de rupture de sa membrane cytoplasmique au cours d’une incubation de 4h à 37°C en présence de 2,5 mg/ml de colistine, concentration très largement au-dessus de la CMI. Le procédé permet donc de montrer que la souche EC_R est résistante à la colistine.
III. Détermination de la sensibilité ou de la résistance à la colistine chez Escherichia coli en 30 minutes à 37°C
Cet essai a été réalisé pour démontrer que le procédé de l’invention permettait de déterminer la sensibilité ou la résistance en 30 minutes.
Les souches E. coli S et RI 6 sont analysées avec le même protocole que l’exemple II à l’exception de la durée d’incubation de 30 minutes à 37°C. La souche S est sensible à la colistine et la souche RI 6 est résistante à la colistine. La Figure 5, présente le spectre de masse obtenu pour la souche S. Ce spectre présente des pics intenses à 6257.2, 6318.7, 7275.4 et 7871.6 m/z. Ces pics sont respectivement caractéristiques des protéines ribosomiques L33, L32, L29 et L31 d’E. coli. La souche S a donc subi une rupture de sa membrane cytoplasmique lors d’une incubation de 30 min à 37°C en présence de 2.5 mg/ml de colistine. Son caractère sensible à la colistine a donc été confirmé.
La Figure 6, présente le spectre de masse obtenu pour la souche RI 6. Contrairement au spectre de la souche S (Figure 5), ce spectre ne présente aucun pic intense entre 6000 et 10000 m/z. Elle n’a donc pas été lysée lors d’une incubation de 30 min à 37°C en présence de 2.5 mg/ml de colistine. Le procédé confirme la résistance de cette souche à la colistine.
IV. Détermination de la sensibilité ou de la résistance à la colistine chez Escherichia coli en 30 minutes à 50°C
Les mêmes souches E. coli RI 6 et S sont analysées avec le même protocole que l’exemple III à l’exception d’une incubation à 50°C.
La Figure 7 présente le spectre de masse obtenu pour la souche S. La souche S présente clairement des pics intenses à 6256.4, 6316.9, 7274.1 et 7870.2 m/z. Ces pics sont respectivement caractéristiques des protéines ribosomiques L33, L32, L29 et L31. La membrane cytoplasmique de la souche S a donc été lysée lors d’une incubation de 30 min à 50°C en présence de 2.5 mg/ml de colistine. La sensibilité à la colistine de la souche S est donc confirmée.
La Figure 8 présente le spectre de masse obtenu pour la souche RI 6. Ce spectre ne présente aucun pic intense entre 6000 et 10000 m/z. Cette souche n’a donc pas été lysée lors d’une incubation de 30 min à 50°C en présence de 2.5 mg/ml de colistine. La résistance à la colistine de cette souche est donc confirmée.
De façon inattendue, les pics des protéines L33, L32, L29 et L31 sont plus intenses après une incubation à 50°C qu’après une incubation à 37°C pour la souche sensible, alors qu’ils restent quasiment indétectables pour la souche résistante.
V. Détermination de la sensibilité ou de la résistance de différentes bactéries à la colistine
Ces essais ont été réalisés avec le procédé de la présente invention pour déterminer la sensibilité ou la résistance de plusieurs bactéries de plusieurs souches différentes afin de démontrer la reproductibilité du procédé sur des bactéries et des souches différentes. Ces essais ont également été réalisés en utilisant une incubation de 10 min à 50°C pour montrer qu’il était possible d’utiliser un temps d’incubation très court. Les essais ont été réalisés en mettant en œuvre les étapes ci-dessous :
- préparation d’une suspension de microorganisme à 2 McF en eau (suspension medium, bioMérieux référence 70700),
- préparation d’une solution de sulfate de colistine (Sigma référence C4461) à la concentration 2X en eau pure (en tenant compte du titre de colistine indiqué par le fabriquant). X = 2,5 mg/ml pour E. coli et K. pnemoniae, et X = 20 qg/ml pour A. baumannii et P. aeruginosa.
- mélange de 200 mΐ de microorganismes en suspension et 200 mΐ de colistine 2X pour obtenir une solution de microorganismes à 1 McF et à la concentration X de colistine,
- réalisation en parallèle d’un témoin négatif en diluant la solution de microorganismes de l’étape 3 dans une solution d’eau pure (sans colistine).
- homogénéisation à l’aide d’un vortex pendant une durée de 5 secondes,
- incubation du mélange pendant une durée de 10 minutes à 50°C sous agitation à 1400 rotation par minute à l’aide d’un thermomixeur.
- homogénéisation à l’aide d’un vortex pendant une durée de 5 secondes,
- filtration avec un filtre de porosité 0,22 mhi (Centricon, Merck- Millipore).
- dépôt de 1 mΐ du filtrat sur une cible jetable (bioMérieux référence 410893).
- dépôt de 1 mΐ de matrice HCCA sur le filtrat (bioMérieux, référence 411071).
- analyse l’échantillon par spectrométrie MALDI-TOF avec une méthode classique en microbiologie, c’est-à-dire avec un mode d’ionisation positif et une gamme de masse de 2 000 à 20 000 Th.
- accumulation de 100 profils de 10 tirs et comparaison des données avec les données contenues dans les bases de données pour l’espèce étudiée,
- observation de la présence ou de l’absence de pics de protéines caractéristiques de l’espèce étudiée.
- détermination de la sensibilité à la colistine si des protéines caractéristiques de l’espèce étudiée sont détectées ou de la résistance si aucune protéine de l’espèce étudiée n’est détectée. - validation du résultat de détermination si le témoin négatif ne présente pas de pics de protéines du microorganisme.
Comme présenté dans le Tableau 1 ci-dessous, différentes souches d ’Escherichia coli (EC_S10, EC_S15, EC_R16, EC_R17) et de Klebsiella pnemoniae (KP S10, KP S15, KP R9, KP R16) ont été analysées avec le protocole décrit ci-dessus.
Afin de pouvoir évaluer l’efficacité du procédé selon l’invention, les différentes souches ont été préalablement analysées par microdilution en bouillon afin de déterminer leur statut (sensible ou résistante). Cette méthode est considérée comme la méthode de référence par le CLSI et l’EUCAST.
[Tableau 1]
Ainsi parmi les souches analysés certaines sont sensibles à la colistine et d’autres sont résistantes et parmi les souches résistantes certaines présentent une résistance chromosomique et d’autres une résistance plasmidique.
Les protéines caractéristiques de l’espèce Klebsiella pneumoniae sont la protéine de liaison à l’ADN H-NS {DNA binding protein H-NS), les protéines ribosomiques L29, L31, L34 et US9, la protéine de choc froid contenant un domaine CsbD ( CsbD domain-containing protein ), et les protéines non caractérisées de m/z 6290 et 8308. Ces protéines sont caractérisées respectivement par les pics de 7705 {DNA binding protein H-NS), 7274 (L29), 7743 (L31), 5381 (L34), 7384 (US9), 8309 (CsbD), plus ou moins 1000 parties par million (ppm). Les protéines hypothétiques sont quant à elles caractérisées par des pics 6290 et 7678, plus ou moins 1000 parties par million (ppm).
Les Figures 9 et 10 présentent les spectres de masse obtenus respectivement pour les souches d’E. coli et de K. pneumoniae présentées dans le Tableau 1. Les spectres pour les souches EC S10, EC S15, KP S10 et KP S15 présentent des pics caractéristiques de leur espèce et sont donc sensibles à la colistine. A contrario, les souches EC R16, EC R17, KP R9 et KP R16 ne présentent pas de pics caractéristiques de leur espèce et sont donc résistantes à la colistine.
Les résultats obtenus par la méthode de référence (microdilution en bouillon) ont donc été confirmés par le procédé selon la présente invention. En effet à l’aide du procédé de l’invention le même statut a été obtenu par microdilution en bouillon pour chaque souche.
Toujours dans le but de montrer le but de montrer la reproductibilité du procédé selon l’invention, dans le Tableau 2 ci-dessous, figure différentes souches d ’Acinetobacter baumannii (AB S044, AB S045, AB S046, AB R-E105) et de Pseudomonas aeruginosa (PA S062, PA SE64, PA RE66, PA RE68) qui ont été analysées selon le protocole décrit ci- dessus.
De même que précédemment, les différentes souches ont été préalablement analysées par microdilution en bouillon afin de déterminer leur statut (sensible ou résistante). [Tableau 2] :
Les souches d’A. baumannii (AB S044, AB S045, AB S046, AB R-E105), de Pseudomonas aeruginosa (PA S062, PA SE64, PA RE66, PA RE68) sont analysées avec le protocole décrit dans l’exemple V. Ainsi elles sont incubées en présence de 20 pg/ml de colistine.
La Figure 11 présente les spectres de masse obtenus pour les souches d'A. baumannii présentées dans le Tableau 2. Sur ces spectres les souches AB_S044, AB_S045, AB S046 présentent des pics de protéines caractéristiques de leur espèce, notamment à environ 5748 et 5770 Th, et sont donc sensibles à la colistine. Inversement, la souche AB R-E105 ne présente pas de pics protéines caractéristiques de son espèce et est donc résistante à la colistine.
La Figure 12 présente les spectres de masse obtenus pour les souches de P. aeruginosa présentées dans le Tableau 2. Sur ces spectres les souches PA_S062 et PA_SE64 présentent des pics caractéristiques de leur espèce, notamment à environ 5449, 5469, 5793 et 6975 Th, et sont donc sensibles à la colistine. Inversement, les souches PA RE66 et PA RE68 ne présentent pas de pics caractéristiques de leur espèce et sont donc résistantes à la colistine.
Comme précédemment, ces résultats montrent que le procédé selon l’invention permet de déterminer le statut de chaque souche. Ces résultats sont confirmés par la méthode dite de référence.
VI. Calcul d’un ratio pour déterminer la sensibilité ou la résistance d’une bactérie vis-à-vis d’un antibiotique
Dans le cadre de cette exemple, les essais ont été réalisés avec le procédé de la présente invention pour déterminer la sensibilité ou la résistance de plusieurs bactéries de plusieurs souches tel que dans l’exemple V et comprenant les étapes suivantes :
- mesurer l’intensité de chaque pic observé,
- effectuer un ratio entre la somme des intensités des pics de protéines du microorganisme et au moins 1 pics de colistine.
- déterminer le statut résistant ou sensible à la colistine en fonction de la somme des ratios obtenue et d’un seuil fixé pour chaque espèce.
- un microorganisme résistant aura un ratio faible et un microorganisme sensible un ratio élevé.
Dans le cadre de la présente invention, le seuil est fixé de façon empirique par observation des résultats. L’homme du métier saura, à l’aide de ses connaissances, déterminer ce seuil sans difficulté. Dans les exemples qui vont suivre un mode de détermination de ce seuil sera illustré.
Analyse des souches d’E. coli
Dans un premier temps les mêmes souches d’E. coli (EC S10, EC S15, EC R16, EC R17), utilisées précédemment, sont étudiées et les protéines caractéristiques de l’espèce E. coli sont analysées. Il s’agit des protéines suivantes : la protéine de phase stationnaire induite associée au ribosome ( Stationary-phase-induced ribosome-associated protein, SPIRAP), la protéine chaperonne de stress acide HdeB {Acid stress chaperone HdeB ) et les protéines ribosomiques 50S ( 50S ribosomal proteins), L29, L31 et L33.
Le Tableau 3 ci-dessous présente l’intensité du pic observé pour la colistine et pour chaque protéine caractéristique d'E. coli. [Tableau 3] :
Dans le Tableau 4 ci-dessous sont présentés le résultat du ratio entre l’intensité du pic observé pour chaque protéine et l’intensité du pic observé pour la colistine ainsi que la somme de ces ratios pour chaque espèce.
[Tableau 4] :
Les résultats présentés dans le Tableau 4 montrent que les souches EC-S10 et EC-S15 présentent une somme des ratios supérieure à 0,3, alors que les souches EC-R16 et EC- R17 présentent une somme des ratios nulle. Par observation de ces résultats, les inventeurs ont fixé la valeur du seuil à 0,30. Par conséquent, dans ce cas de figure, les souches dont la somme des ratios est strictement inférieure à 0,30 seront considérées comme résistantes et inversement les souches dont la somme des ratios est supérieure ou égale à 0,30 seront considérées comme sensibles. Les souches EC-S10 et EC-S15 sont donc classées comme sensibles alors que les souches EC-R16 et EC-R17 sont classées comme résistantes.
Analyse des souches de K. pneumoniae
Les souches K. pneumoniae KP S 10-1, KP S 10-2, KP S 15-1, KP S15-2, KP R9- 1, KP R9-2, KP RI 6-1 et KP RI 6-2, sont également étudiées et les protéines caractéristiques de l’espèce K. pneumoniae sont analysées. Ces protéines caractéristiques sont la protéine de liaison à T ADN H-NS {DNA binding protein H-NS), les protéines ribosomiques L29, L31, L34 et US9, la protéine de choc froid contenant un domaine CsbD ( CsbD domain-containing protein ), et les protéines non caractérisées de m/z 6290 et 8308.
Dans le Tableau 5 ci-dessous sont présentées l’intensité du pic observé pour la colistine et pour chaque protéine caractéristique de K. pneumoniae .
[Tableau 5] :
Le Tableau 6 ci-dessous présente le résultat du ratio entre l’intensité du pic observé pour chaque protéine et l’intensité du pic observé pour la colistine ainsi que la somme de ces ratios pour chaque espèce.
[Tableau 6] :
Les résultats présentés dans le Tableau 6 montrent que les souches KP-S15 et KP-S10 présentent une somme des ratios supérieure à 0,45 alors que les souches KP-R16 et KP-R9 présentent une somme des ratios inférieure à 0,11. Ainsi, par observation des résultats les inventeurs ont fixé la valeur du seuil à 0,45. Par conséquent, dans ce cas de figure, les souches dont la somme des ratios est strictement inférieure à 0,45 seront considérées comme résistantes et inversement les souches dont la somme des ratios est supérieure ou égale à 0,45 seront considérées comme sensibles. Les souches KP-S15 et KP-S10 sont donc classées comme sensibles alors que les souches KP-R16 et KP-R9 sont classées comme résistantes.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour déterminer la sensibilité ou de la résistance d’au moins une bactérie identifiée à au moins un antibiotique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact d’un échantillon comprenant ladite bactérie avec ledit au moins un antibiotique, ledit antibiotique induisant la rupture de la paroi bactérienne et/ou de la membrane cytoplasmique et provoquant la libération des composés intracellulaires de ladite bactérie lorsque celle-ci est dite « sensible » audit au moins un antibiotique, b) incubation dudit échantillon avec ledit au moins un antibiotique, c) purification dudit échantillon par élimination des bactéries intacts et des débris cellulaires, d) analyse de l’échantillon purifié par spectrométrie de masse, e) détection de la présence ou de l’absence d’au moins un pic d’au moins une protéine caractéristique de ladite bactérie, et f) détermination de la sensibilité ou de la résistance de ladite population bactérienne au dit antibiotique.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la spectrométrie de masse est de type MS, MS/MS ou MS suivie d’une spectrométrie de type MS/MS.
3. Procédé selon la revendication la revendication 2, dans lequel la spectrométrie de masse de type MS est une spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.
4. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la spectrométrie de masse de type MS/MS est une spectrométrie de masse de type PRM, SRM, MRM, DDA (data dépendent acquisition) ou DI A (data independent acquisition).
5. Procédé selon Tune des revendications précédentes, dans lequel l’étape de purification dudit échantillon se fait par au moins une des techniques suivantes, la centrifugation, la filtration, l’électrophorèse ou la chromatographie.
6. Procédé selon Tune des revendications précédentes, dans lequel l’antibiotique est choisi parmi les polymyxines, les b-lactamines, les aminosides, les quinolones et les glycopeptides.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l’antibiotique est une polymyxine et est choisi parmi la colistine et la polymyxine B.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel ledit antibiotique présente une concentration au moins dix fois supérieure à la concentration minimale inhibitrice dudit antibiotique pour ladite population bactérienne.
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la population bactérienne est une bactérie à Gram négatif.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la bactérie à Gram négatif est choisie parmi Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter junii, Citrobacter freundii, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas fluorescens, Salmonella Enteritidis, Salmonella Paratyphi B var.Java, Salmonella ser.Agona, Salmonella ser. Enteritidis, Salmonella ser. Haïfa, Salmonella ser.Newport et Pseudomonas aeruginosa.
11. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’étape d’incubation dure moins de 30 minutes.
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