EP4033887A1

EP4033887A1 - Procede d'elicitation controlee de plants de piment durant leur culture pour augmenter leur synthese de metabolites secondaires d'interet industriel

Info

Publication number: EP4033887A1
Application number: EP20771893.3A
Authority: EP
Inventors: François Gautier; Camille ROZIER; Michel Magnin; Ramón Gerardo GUEVARA-GONZALEZ
Original assignee: Id4feed; Universidad Autonoma De Queretaro
Current assignee: Id4feed; Universidad Autonoma De Queretaro
Priority date: 2019-09-24
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2022-08-03
Also published as: FR3100955A1; FR3100955B1; WO2021058410A1

Abstract

L'invention a pour objet un procédé d'élicitation contrôlée de plantes en culture pour augmenter leur synthèse de métabolites secondaires. L'invention se caractérise en ce qu'il comprend les étapes suivantes selon lesquelles : - d'une part, lesdites plantes sont traitées par application d'une solution de peroxyde d'hydrogène (H2O2) à une concentration comprise entre 1 mM et 800 mM, et - d'autre part, un déficit hydrique est généré par arrêt total de l'irrigation desdites plantes en culture, ledit traitement H2O2 et ledit déficit hydrique étant réalisés, de manière concomitante ou séparée, entre 1 et 5 jours avant la récolte, et - on récolte des fruits issus des plantes ainsi traitées dans lesquels la synthèse de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, a été augmentée. L'invention concerne également les plantes choisies parmi les Solanacées, susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'invention, ainsi que l'utilisation du procédé selon l'invention chez des plantes choisies parmi les Solanacées, pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de métabolites secondaires, préférentiellement de capsaïcinoïdes, synthétisés par lesdites plantes a été augmentée.

Description

PROCEDE D’ELICITATION CONTROLEE DE PLANTS DE PIMENT DURANT LEUR CULTURE POUR AUGMENTER LEUR SYNTHESE DE METABOLITES SECONDAIRES

D’INTERET INDUSTRIEL

Domaine technique

[0001 ] La présente invention concerne un procédé d’induction d’un profil d’expression de gènes e† de métabolites secondaires chez des plantes en culture par une élicifafion contrôlée en utilisant notamment du peroxyde d’hydrogène, e† les plantes ainsi obtenues.

Technique antérieure

[0002] Pour éviter l’usage de pesticides, l’agriculture cherche à favoriser des pratiques plus durables e† plus respectueuses de l’environnement. Pour répondre à ces nouvelles exigences, les agriculteurs doivent se tourner vers l’exploitation e† la rentabilisation des ressources naturelles par le biais de pratiques agricoles combinant la performance e† la protection des cultures à un moindre coût écologique. Dans ce contexte, le développement de molécules biologiques capables de stimuler les défenses naturelles des végétaux (SDN) es† une stratégie qui attire de plus en plus l’attention. Une molécule SDN es† un éliciteur susceptible de déclencher une série d’évènements biochimiques menant à l’expression de la résistance chez la plante. La perception du signal par des récepteurs membranaires spécifiques e† sa transduction par diverses voies de signalisation conduisent à la synthèse e† à l’accumulation synchronisée de molécules parmi lesquelles certaines von† jouer un rôle structural alors que d’autres von† exercer une fonction de résistance au stress. Les progrès remarquables accomplis ces dernières années en termes de compréhension des mécanismes impliqués dans la résistance induite chez les plantes se traduisent par la commercialisation d’un nombre de plus en plus important de SDN capables de stimuler le « système immunitaire » des plantes en mimant l’effet des agents pathogènes.

[0003] On distingue plus particulièrement le stress abiotique e† le stress biotique. En pratique, il n’es† pas toujours évident de savoir si des symptômes son† liés à un « désordre physiologique » (par exemple une carence minérale), ou à l’action d’un agent pathogène. Par ailleurs, face à un certain nombre de stress abiotiques ou biotiques comme le déficit hydrique, carences en minéraux ou les attaques parasitaires, il existe des solutions culturales (irrigation, amendements, traitements phytosanitaires...) e† des solutions génétiques (utilisation d’espèces appropriées aux conditions pédoclimatiques, amélioration variétale).

[0004] Les physiologistes qui se son† penchés sur les mécanismes sous- jacents aux résistances on† pu identifier des mécanismes biochimiques impliqués dans les tolérances aux stress abiotiques, ainsi que d’autres, différents, e† spécifiquement impliqués dans les résistances aux stress biotiques. Les mécanismes de résistance à ces deux familles de contraintes apparaissent être fondamentalement distincts.

[0005] La question de la résistance ou de la tolérance aux stress rejoint le problème agricole concret de la stabilité des rendements.

[0006] Du point de vue agronomique, la tolérance au stress va se mesurer par l’impact du stress sur le rendement (graines, parties végétatives, dépendammen† des cultures) et/ou la qualité des produits.

[0007] Le piment ( Capsicum spp.) es† l'une des principales cultures rentables de Solanacées cultivées pour son pouvoir piquant. Il es† bien connu que le pouvoir piquant du piment es† dû aux capsaïcinoïdes, qui son† majoritairement des capsaïcines e† des dihydrocapsaïcines (Kaale, E. et al., Détermination of Capsaicinoids in topical cream by liquid-liquid extraction and liquid chromatography, J. Pharm Biomed 2002, Anal. 30: 1331 ).

[0008] La capsaïcine procure une sensation chaude, épicée, piquante ainsi qu'un effet engourdissant, brûlant ou picotant lorsqu'elle es† appliquée par voie orale ou topique.

[0009] La capsaïcine es† connue pour être utilisée dans les produits pharmaceutiques, les cosmétiques, les aliments e† les boissons (Mathur, R. et al., 2000, The hottes† chilli variety in India, Curr.Sci. 79 (3): 287). A titre d’exemples, plusieurs études rapportent une grande variété d'activités biologiques des capsaïcinoïdes, telles que des effets antioxydants, analgésiques, a n†i-†u moraux, anti-obésité e† an†i-inflamma†oires (Luo X-J étal., 201 1 , Recen† advances in †he study on capsaicinoids and capsinoids. Eur J Pharmacol 650: 1-7). Un autre effet pharmacologique majeur de la capsaïcine es† son effet antimicrobien contre une grande variété de microorganismes, notamment des bactéries, des champignons et des virus, montrant des effets bénéfiques possibles sur de nombreuses maladies (Reyes- Escogido ML et al., 201 1, Chemical and pharmacological aspecfsof capsaicin. Molécules 16: 1253-1270; Veloso J et al., 2013, Properfies of capsaicinoids for fhe confrol of fungi and oomycefes pafhogenic fo pepper. Plan† Biol 16: 177-185).

[0010] Bien que la variabilité génétique en matière de pouvoir piquant soi† grande e† qu'un grand nombre de variétés e† d'hybrides aient été divulgués par de nombreuses organisations, très peu d'efforts on† été déployés pour augmenter la teneur en capsaïcine du fruit du piment (Tewari VP., Development of high Capsaicin Chillies ( Capsicum annuum L.) and their implications for †he manufacture of export products, J. Plantation Cultures, 1990, 18(1 ):1 ). L'une des exigences de base pour augmenter la teneur en capsaïcine dans les cultivars de piment es† d'identifier le matériel génétique à forte teneur en capsaïcine.

[001 1 ] La culture de cellules végétales es† une technologie alternative pour la production de composés phytochimiques à valeur ajoutée. L'élicitation des métabolites secondaires en utilisant des champignons, des bactéries e† des levures es† connue (Dicosmo e† Misawa, Elicitation of secondary metabolism in plan† cultures Trend in Biotechnology 3: 318, 1985; Sudhakar Johnson T. et al., . Elicitation of capsaicin production in freely suspended cells and immobilized cell cultures of Capsicum frutescens Mill. Food Biotechnol. 5: 197, 1993).

[0012] De nombreux autres éliciteurs biotiques et/ou abiotiques son† également décrits pour augmenter la résistance aux stress des plantes de manière générale e† la production de métabolites secondaires.

[0013] On connaît plus particulièrement la publication M. Vargas- Herndndez et al. (2016, Influence of hydrogen peroxide foliar applications on in vitro antimicrobial activity in Capsicum chinense Jacq., Plan† Biosystems - An International Journal Dealing wi†h ail Aspects of Plan† Biology, 151 :2, 269- 275) don† le bu† es† d'évaluer l'effet d’applications foliaires de peroxyde d'hydrogène sur l'activité antimicrobienne d’extraits méthanoliques de Capsicum chinense Jacq.. Pour cela, les graines on† été immergées dans une solution de nitrate de potassium (200 ppm) pendant 24 h puis on† été semées dans un substrat préalablement désinfecté, à savoir un mélange mousse- fourbe-vermiculife dans un rapport de 4:1 . Après 2 semaines, les planfules on† été transplantées dans des conteneurs de 5 L avec le même substrat, puis transférées dans une serre (T = 26°C, HR = 60%, jour 16 h). Au cours du processus, les plantes on† été arrosées trois fois par semaine avec une solution nutritive Steiner (Stainer AA, 1984, The universal nutrien† solution, Proceedings of IWOSC 1984 6th International Congress on Soilless Culture, 29 April-May 1984, Wageningen, The Netherlands). Des applications foliaires de peroxyde d’hydrogène (18 mM) on† été effectuées tous les 15 jours pendant 104 jours jusqu’à ce que la récolte soi† obtenue, comme indiqué ailleurs (Garcia-Mier L et al., 2013, Agriculture and bioactives: achieving bo†h crop yield and phytochemicals, In† J Mol Sci 14: 4203-4222). Les échantillons on† été stockés à -70°C jusqu'à l'analyse. Les effets de l'application de peroxyde d'hydrogène sur l'accumulation de métabolites de C. chinense var. Jaguar e† var. Chichen Itza on† ainsi été évalués. Les teneurs totales en composés phénoliques, flavonoïdes e† capsaïcinoïdes des deux variétés traitées au peroxyde d'hydrogène on† été significativement plus élevées que celles du témoin.

[0014] Néanmoins, bien que le résulta† du traitement au peroxyde d’hydrogène consiste en une augmentation de la teneur en composés phénoliques, flavonoïdes e† capsaïcinoïdes, un tel traitement es† utilisé pour augmenter l'activité antimicrobienne des plants de piment e† non l’effet piquant du piment.

[0015] La publication Zunun-Perez et al. (« Effec† of foliar application of salicylic acid, hydrogen peroxide and a xyloglucan oligosaccharide on capsiate content and gene expression associated wi†h capsinoids synthesis in Capsicum annuum L », Journal of Biosciences, Indian Academy of Sciences, IN, vol. 42, no. 2, 20 avril 2017, pages 245-250) décrit également les effets d'une application foliaire de peroxyde d'hydrogène sur la biosynthèse de capsiates, analogues non piquants de capsaïcinoïdes, dans Capsicum annuum L. Le traitement au peroxyde d'hydrogène augmente de façon significative la teneur des plantes en capsiate ainsi que l'expression des gènes associés à la voie de biosynthèse des capsaïcinoïdes.

[0016] En revanche, on connaît le document W02006038049 qui se rapporte à un procédé de préparation d'une formulation de pulvérisation utile pour améliorer les niveaux de piquant de Capsicum. La pulvérisation appliquée sur les végétaux Capsicum assure des niveaux de piquant accrus comparativement aux niveaux des capsaïcinoïdes de contrôle et améliore également les intermédiaires propres à la biosynthèse des capsaïcinoïdes. La composition de pulvérisation utilisée pour augmenter le pouvoir piquant du fait de la présence d’intermédiaires de capsaïcinoïdes ou de phénylpropanoïde ou d'une combinaison de ceux-ci dans les fruits de la famille des Solanacées, comprend 2,5 x 10¹ à 10 x 10¹ (0,25-2% en poids)/v) d’un élicifeur biofique choisi dans un groupe comprenant les extraits fongiques d’Aspergillus n/ger, Aspergillus parasiticus et Rhizopus oligosporus et leur mélange, ainsi que 1 x 10⁵ à 5 x 10⁵ (1 -5 M) d’un élicifeur abiotique choisi dans un groupe comprenant le méfhyl-jasmonafe et l’acide salicylique dans un véhicule approprié.

[0017] Néanmoins, l’utilisation d’un élicifeur biofique, notamment fongique, nécessite des étapes de pré-culfures et de cultures du champignon (ou de la bactérie) et des manipulations en milieu stérile et contrôlé (contrôle de non-confaminafion de l’inoculum afin d’obtenir un extrait pur provenant uniquement de la souche d’inférêf). L’exfrai† de champignon, de chimie complexe e† variable en fonction des conditions de culture, devra de même être contrôlé e† standardisé par des analyses chimiques. Ce††e étape reste donc coûteuse e† consommatrice de temps. En outre, les souches utilisées dans ce procédé peuvent-être responsables, chez l’Homme, de maladies pulmonaires (aspergillose) e† requiert donc des précautions de manipulations.

[0018] Par ailleurs, on connaît l’utilisation d’éliciteur abiotique tel qu’un stress hydrique pour augmenter la production de métabolites secondaires.

[0019] Par exemple, Paongpetch Phimchan ef al. (« Impact of Drough† Stress on †he Accumulation of Capsaicinoids in Capsicum Cultivars wi†h Different Initial Capsaicinoid Levels », HortScience, vol. 47, no. 9,1 septembre 2012, pages 1204-1209) décrit les effets de l’application d’un stress hydrique (privation d’eau) sur le rendement en fruits e† sur l'accumulation de capsaïcinoïdes dans des cultivars plus ou moins piquants de Capsicum e† conclu† que les niveaux de capsaïcinoïdes augmentent pendant le stress hydrique uniquement pour certains des cultivars e† pas ceux ayant déjà un haut goû† piquant i.e une teneur déjà élevée en capsaïcinoïdes (échelle de Scoville supérieur à 70000). Le seul stress hydrique appliqué dans cette étude ne parvient donc pas à augmenter la synthèse de capsaïcinoïdes dans les piments très piquants ; Arum Pratiwi et al. (« The Effect of Water Stress on Growth and Capsaicin Content of Cayenne Pepper (Capcisum frutences L.) », Biol. Sei. Journal of Applied Environmenfal and Biological Sciences, 1 janvier 2017, pages 76-80) décri† les effets du stress hydrique sur le contenu en capsaïcine du piment de Cayenne (unités sur l’échelle de Scoville comprises entre 30000 e† 50000) e† sur les paramètres de croissance, e† conclu† que plus le stress hydrique es† important, plus le contenu en capsaïcine es† élevé dans les plantes cultivées, mais en contrepartie, la croissance du piment es† inhibée ; e† Sung et al. (« Capsaicin biosynfhesis in wafer-sfressed ho† pepper fruits », Bot. Bull. Acad. Sin. (2005) 46: 35-42) décrit des études sur la biosynfhèse de la capsaïcine dans des fruits de Capsicum annuum L var. annuum soumis à un stress hydrique e† conclu† que les niveaux de capsaïcine augmentent de façon importante dans le placenta e† le péricarpe des fruits de Capsicum annuum L var. annuum « Beauty Zes† » sous stress hydrique, parallèlement à l’activité enzymatique d’enzymes participant à la synthèse des capsaïcinoïdes (capsaicinoid synthetase, phenylalanyne amonia lyase) alors que la teneur en capsaïcine dans le placenta des fruits de « Hungariana » n’es† pas significativement augmentée.

[0020] Ainsi, une plante soumise à un stress hydrique trop important va voir son métabolisme enzymatique diminuer fortement, avec une réduction parexemple du fonctionnement du cycle de Calvin, mais aussi une diminution dans sa respiration, de ses échanges ioniques e† donc du prélèvement des minéraux nécessaires à ses apports. A ceci peu† s’ajouter une fermeture des stomates e† donc des échanges gazeux réduits délétères à la photosynthèse, la génération d’espèces réactives oxygénées (ou radicaux libres) e† des réactions d’oxydation en chaîne induisant des dommages au sein de la plante, au niveau de l’ADN par exemple, ... (Lawlor and Cornic, 2002, « Pho†osyn†he†ic carbon assimilation and associated metabolism in relation †o water déficits in higher plants », Plan†, cell & environment, 25(2), 275-294 ; Ashraf et al., 2013, « Drought-induced modulation in growth and minerai nu†rien†s in canola (Brassica napus L.). Pak. », J. Bo†, 45(1 ), 93-98 ; Hossain et al., 2013, « Cross protection by cold-shock †o salinity and drough† stress- induced oxidative stress in mustard (Brassica campestris L.) seedlings », Molecular Plant Breeding, 4 ; Praba etal., 2009, « Identification of physiological traits underlying culfivar différences in droughf tolérance in rice and wheaf », Journal of Agronomy and Crop Science, 195(1 ), 30-46).

[0021 ] Le choix des élicifeurs, biofiques ef/ou abiotiques, n’es† pas chose évidente. Alors qu’un éliciteur peu† s’avérer très efficace e† inoffensif sur un genre ou une espèce donnée, il peu† être tou† à fai† inutile, inefficace sur une autre espèce ou un autre genre. Ceci peu† même aller jusqu’à des effets délétères pour la plante dans certains cas (Asgari-Targhi et al., 2018, « Potential benefits and phy†o†oxici†y of bulk and nano-chi†osan on †he growth, morphogenesis, physiology, and micropropagation of Capsicum annuum », Plan† Physiology and Biochemistry, 127, 393-402 ; Rady ef a/., 2019, « Maize (Zea mays L.) grains extrac† mi†iga†es †he deleterious effects of sait stress on common bean (Phaseolus vulgaris L.) growth and physiology », The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 94(6), 777-789). Ce phénomène a même été observé à l’échelle du cultivar, guidant les agriculteurs notamment à utiliser un cultivar plutôt qu’un autre dans des régions soumises à des stress environnementaux spécifiques (Martinez et al., 2001 , « Differential responses of superoxide dismutase in freezing résistant Solanum curtilobum and freezing sensitive Solanum tuberosum subjected †o oxidative and water stress », Plan† Science, 160(3), 505-515 ; Hassen etal., 2014, « Effec† of sait stress (NaCI) on germination and early seedling parameters of three pepper cultivars (Capsicum annuum L.) », Journal of Stress Physiology & Biochemistry, 10(1 )). La réception différentielle d’un signal de stress va orienter la production des métabolites de défenses (phytoalexines). Ainsi, appliquer un stress à une espèce résistante ne conduira pas forcément à la production des métabolites secondaires désirés (Hichem et al., 2009, « Differential responses of †wo maize (Zea mays L.) varieties †o sait stress: changes on polyphenols composition of foliage and oxidative damages », Industrial Crops and Products, 30(1 ), 144-151 ; Sànchez-Rodriguez et al., 201 1, « Differential responses of five cherry †oma†o varieties †o water stress: changes on phenolic métabolites and related enzymes », Phytochemistry, 72(8), 723-729). Appliquer un éliciteur donné à une plante qui lui es† sensible, à une dose assez élevée, pourrai† de même bloquer sa croissance, voire la tuer. [0022] Lors de l’application d’un ou plusieurs stress, la plante alloue son énergie au métabolisme secondaire (défense) au détriment de sa croissance/développemen† (métabolisme primaire). L’exposition de la plante à différents stress induit chez elle des réponses hormonales et de défenses coûteuses en énergie. Si la limite de dépense es† dépassée, le rendement (métabolisme primaire alloué au développement) ou même survie de la plante peuvent-être engagés (Nguyen et al., 2016, « How plants handle multiple stresses: hormonal interactions underlying responses †o abiotic stress and insec† herbivory », Plan† Molecular Biology, 91 (6), 727-740 ; Rejeb ét al., 2014, « Plan† responses †o simultaneous biotic and abiotic stress: molecular mechanisms », Plants, 3(4), 458-475).

Problème technique

[0023] Considérant ce qui précède, bien que les capsaïcinoïdes e† d'autres composés provoquant le pouvoir piquant soient produits naturellement dans les fruits de Capsicum, un problème que se propose de résoudre la présente invention es† de développer un nouveau procédé d’élicitation contrôlée, facile à mettre en oeuvre notamment pour des cultures en champs, conférant un plus grand pouvoir piquant aux fruits de Capsicum sans impacter la croissance, le rendement en fruit ou même la viabilité des plantes.

Solution technique

[0024] La solution à ce problème posé a pour premier objet un procédé d’élicitation contrôlée de plantes en culture pour augmenter leur synthèse de métabolites secondaires comprenant les étapes suivantes selon lesquelles :

- d’une par†, lesdites plantes son† traitées par application d’une solution de peroxyde d’hydrogène (H2O2) à une concentration comprise entre 1 mM e† 800 mM, e†

- d’autre par†, un déficit hydrique es† généré par arrêt total de l’irrigation desdites plantes en culture, ledit traitement H2O2 e† ledit déficit hydrique étant réalisés, de manière concomitante ou séparée, entre 1 e† 5 jours avant la récolte, e†

- on récolte des fruits issus des plantes ainsi traitées dans lesquels la synthèse de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, a été augmentée. [0025] Elle a pour deuxième objet des plantes choisies parmi les Solanacées, préférentiellement des plants de piment ( Capsicum spp.), susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention dans lesquelles la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, préférentiellement capsaïcinoïdes, synthétisés dans leurs fruits a été augmentée.

[0026] Enfin, elle a pour troisième et dernier objet l’utilisation du procédé selon l’invention chez des plantes choisies parmi les Solanacées, préférentiellement des plants de piment (Capsicum spp.), pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, préférentiellement capsaïcinoïdes, synthétisés par lesdifes plantes a été augmentée.

Avantages apportés

[0027] Le procédé développé selon l’invention es† facile à mettre en oeuvre e† à reproduire dans le temps.

[0028] Il permet d’augmenter significativement, de manière additive voire synergique, le rendement en métabolites secondaires d’intérêt tels que les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpènes, en particulier en capsaïcinoïdes.

[0029] Le procédé défini† les limites en termes de combinaison, dosage, durée... à ne pas dépasser pour les éliciteurs utilisés dans le cadre de l’invention, plus particulièrement sur le genre Capsicum, de même que les optimums afin de cibler la synthèse de capsaïcinoïdes la plus importante sans impacter la croissance, le rendement en fruit ou même la viabilité des plantes. Brève description des dessins

[0030] L’invention e† les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description e† des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, illustrés au regard des dessins annexés dans lesquels :

[0031 ] La Figure 1 représente le pourcentage de capsaïcinoïdes totaux (capsaïcine + dihydrocapsaïcine) chez des fruits de piment (C. chinense cv. Helios) traité avec du peroxyde d’hydrogène (H2O2, 400mM) et/ou ayant subi un déficit hydrique (arrêt total de l’irrigation) 3 jours avant récolte. [0032] La Figure 2 représente l’expression de gènes de l’aminotransférase (pamt), keto acyl synthase (kas), capsaicin synthase (a†3) et de la phenyl alanine ammonia lyase (pal) chez des fruits de piment (C. chinense cv. Helios) traité avec du peroxyde d’hydrogène (H2O2, 400 mM) et/ou ayant subi un déficit hydrique (arrêt de l’irrigation) 3 jours avant récolte. Description des modes de réalisation

[0033] L’invention concerne un procédé d’élicifafion contrôlée de plantes en culture pour augmenter leur synthèse de métabolites secondaires comprenant les étapes suivantes selon lesquelles :

- d’autre par†, un défie!† hydrique es† généré par arrêt total de l’irrigation desdifes plantes en culture, ledit traitement H2O2 e† ledit déficit hydrique étant réalisés, de manière concomitante ou séparée, entre 1 e† 5 jours avant la récolte, e†

- on récolte des fruits issus des plantes ainsi traitées dans lesquels la synthèse de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, carofénoïdes, ferpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, a été augmentée.

[0034] Les plantes préférentiellement mises en œuvre dans le procédé selon l’invention son† des Solanacées, plus préférentiellement des plants de piment ( Capsicum spp.), encore plus préférentiellement des plants de piment choisis parmi C. chinense Bhuf Jolokia, C. chinense cv. Helios (piment Habanero) e† C. annuum L. cv Don Benifo (piment Jalapeho) .

[0035] Les plantes peuvent être cultivées sur de petites surfaces d’études, en serre (par exemple de l’ordre de 100 m²), ou encore sur de plus grandes surfaces, dans la mesure où les conditions du procédé selon l’invention peuvent être contrôlées.

[0036] Il es† important de noter que, mis à par† les traitements au peroxyde d’hydrogène e† le déficit en eau avant chaque récolte, la culture des plantes doit être réalisée dans des conditions normales de production en termes de nutrition e† d’irrigation afin de permettre un rendement e† une performance classiquement attendus pour les plantes. [0037] A titre d’exemple illustratif de conditions normales pour la culture des plantes, une lumière naturelle (phofopériode de 13h de jour e† 11 h d’obscurité), des températures entre 25 e† 28°C e† une humidité relative entre 55 e† 65% on† été appliquées sur des plantes saines.

[0038] Comme démontré dans les exemples décrits ci-après, le traitement H2O2 e† le déficit hydrique agissent de manière additive significativement, voir en synergie dans l’augmentation de la teneur en capsaïcinoïdes des fruits récoltés e† éventuellement dans l’expression des gènes des voies de biosynthèse associées.

[0039] Or, un tel effet additif significatif voire synergique es† inattendu en ce que le cumul de deux élicitations (stress) appliquées sur une plante es† communément attendu pour aboutir à une augmentation plafond inférieure à l’addition des deux effets pris distinctement.

[0040] Le traitement au H2O2 es† préférentiellement réalisé avec une solution aqueuse de H2O2.

[0041 ] Plus préférentiellement, le traitement au H2O2 es† réalisé avec une solution aqueuse de H2O2 à une concentration comprise entre 10 mM e† 500 mM, préférentiellement entre 200 mM e† 450 mM, encore plus préférentiellement de l’ordre de 400 mM.

[0042] Dans certains essais non illustrés dans la présente invention, les concentrations de la solution de peroxyde d’hydrogène (H2O2) se son† avérées trop élevées e† donc délétères pour la croissance de la plante (toxicité au niveau de la zone d’application) ou trop faibles (aucune induction de stress e† de facto, aucune augmentation de production de capsaïcinoïdes), notamment lorsque le traitement H2O2 es† cumulé avec un stress hydrique.

[0043] Aux concentrations utilisées dans le procédé selon l’invention, le traitement au H2O2 es† avantageusement appliqué par spray au niveau des feuilles desdites plantes, avec un volume correspondant à l’apparition de gouttelettes au niveau des feuilles.

[0044] A titre d’exemple illustratif de volume correspondant à l’apparition de gouttelettes sur les feuilles, on peu† citer un volume d’au moins 0,005 mL/cm². Par exemple, le volume moyen pour un mélange de feuilles « jeunes » e† de feuilles plus « âgées » es† de 0,0076 +/- 0,001 mL/cm². [0045] Le traitement au H2O2 est réalisé entre 1 et 5 jours avant chaque récolte, préférentiellement 3 jours avant chaque récolte pendant la période de production de fruits par lesdifes plantes, afin de ne pas perturber et diminuer le rendement en fruits et augmenter la teneur de capsaïcinoïdes de ces cultures élicifées.

[0046] Le déficit hydrique es† généré par arrêt total de l’irrigation.

[0047] Il es† important que les conditions de culture des plantes permettent de se prémunir de toute irrigation naturelle ou requérant une intervention humaine entre 1 e† 5 jours avant chaque récolte, préférentiellement 3 jours avant chaque récolte pendant la période de production de fruits par lesdites plantes.

[0048] En dehors de ces périodes, une bonne irrigation doit en revanche être maintenue.

[0049] De même que pour les concentrations en H2O2, un stress hydrique amené trop précocement dans la croissance de la plante (trop en amon† de la récolte) ou trop longtemps s’avère, de plus lorsqu’il es† cumulé à l’application de peroxyde d’hydrogène (H2O2), va nuire de manière réversible ou parfois irréversible au développement de la plante e† donc au rendement en fruit.

[0050] Selon un mode de réalisation du procédé selon l’invention, le traitement au H2O2 e† le défie!† hydrique son† réalisés de manière séparée entre 1 e† 5 jours avant la récolte. A titre d’exemples illustratifs, le traitement au H2O2 es† réalisé 5 jours avant la récolte puis le déficit hydrique es† réalisé 4, 3, 2 ou 1 jour(s) avant la récolte, ou inversement ; selon un autre exemple, le traitement au H2O2 es† réalisé 4 jours avant la récolte puis le déficit hydrique es† réalisé 3, 2 ou 1 jour(s) avant la récolte, ou inversement ; selon un autre exemple encore, le traitement au H2O2 es† réalisé 3 jours avant la récolte puis le déficit hydrique es† réalisé 2 ou 1 jour(s) avant la récolte, ou inversement ; enfin, selon un dernier exemple, le traitement au H2O2 es† réalisé 2 jours avant la récolte puis le déficit hydrique es† réalisé 1 jour avant la récolte, ou inversement.

[0051 ] Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l’invention, le traitement au H2O2 e† le déficit hydrique son† réalisés de manière concomitante, par exemple 1 , 2, 3, 4 ou 5 jours avant la récolte, préférentiellement 3 jours avant la récolte.

[0052] Par exemple, lorsqu’une combinaison d’un fraifemen† au EhC à 400mM e† d’un déficit hydrique (arrêt total de l’irrigation) son† réalisés 3 jours avant récolte, les niveaux de capsaïcinoïdes on† atteint jusqu’à 4,5 voire 4,7%. Ainsi, un effet significativement additif a minima voire synergique de ces 2 éliciteurs appliqués sur les plantes avant récolte e† utilisés en combinaison a été obtenu.

[0053] Selon un mode de réalisation avantageux du procédé selon l’invention, le traitement au H2O2 e† le déficit hydrique son† réalisés de manière périodique toutes les deux semaines avant chaque récolte pendant la période de production de fruits par lesdites plantes, préférentiellement respectivement au moins 3 fois, plus préférentiellement respectivement au moins 8 fois.

[0054] Selon un exemple particulier de réalisation du procédé selon l’invention, à partir du moment où la floraison commence, les fruits de plants de piment âgés de 40 jours post-anthèse, période à laquelle la fleur es† totalement ouverte e† fonctionnelle, doivent-être récoltés, e† l’élicitation contrôlée par le traitement au peroxyde d’hydrogène e† le déficit en eau doivent être appliqués de manière concomitante ou séparée, entre 1 e† 5 jours avant la récolte. Etant donné que les plantes continuent de produire des fruits durant 2-3 mois, ce††e procédure peu† être poursuivie toutes les 2 semaines.

[0055] En dehors des plages de traitement au H2O2 e† de déficit hydrique, aucun traitement au H2O2 ne doit être réalisé e† une bonne irrigation doit être maintenue.

[0056] Les métabolites secondaires don† la synthèse es† augmentée par le procédé selon l’invention son† choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, préférentiellement des capsaïcinoïdes.

[0057] Les métabolites secondaires don† la synthèse es† augmentée son† plus préférentiellement des capsaïcinoïdes choisis parmi la capsaïcine, dihydrocapsaïcine (8-méthyl-N-vanillylnonamide), nordihydrocapsaïcine (7- méthyl-N-vanillyloctamide), homodihydrocapsaïcine (9-méthyl-N- vcmillyldécamide), homocapsaïcine (trans-9-méthyl-N-vanillyl-7- décénamide), préférentiellement la capsaïcine, dihydrocapsaïcine et nordihydrocapsaïcine.

[0058] Un autre objet de l’invention concerne des plantes choisies parmi les Solanacées, préférentiellement des plants de piment ( Capsicum spp.), susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention dans lesquelles la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, préférentiellement capsaïcinoïdes, synthétisés dans leurs fruits a été augmentée.

[0059] Enfin, un dernier objet de l’invention concerne l’utilisation du procédé selon l’invention chez des plantes choisies parmi les Solanacées, préférentiellement des plants de piment (Capsicum spp.), pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, préférentiellement capsaïcinoïdes, synthétisés par lesdites plantes a été augmentée.

Exemples

[0060] Exemple 1 : Exemple de procédé d’élicitation contrôlée selon l’invention de plants de piment traités avec du peroxyde d’hydrogène et avant subi un déficit hydrique [arrêt total de l’irrigation) avant récolte

[0061 ] Des plants de piment (C. chinense cv. Helios) ont été cultivés dans une serre de 500 m². Une solution UNIVERSAL STEINER a été utilisée comme engrais. Durant la période de culture, dans le but de contrôler la présence de ravageurs naturels, des observations quotidiennes ont été réalisées pour relever la présence d’aleurodes sur les feuilles, de même qu’un piégeage par des stickers disséminés aléatoirement dans la serre. Afin de lutter contre les ravageurs potentiels, des applications périodiques (tous les 30 jours) de CONFIDOR (Imidacloprid, Bayer CropScience) ont été réalisées en suivant les recommandations du fabricant. La variabilité entre chaque plante en termes de croissance et de développement (hauteur, diamètre de la tige basale, et rendement en fruits) a été mesurée en tant qu’indicateur de performance de la plante. Pour la culture des plantes, une lumière naturelle (photopériode de 13h de jour et 1 I h d’obscurité), des températures entre 25 e† 28°C e† une humidité relative entre 55 et 65% ont été appliquées. Les plants de piment obtenus grâce à ces conditions de culture étaient des plants sains avec un grand rendement de fruit.

Des applications foliaires de H2O2 à 400 mM on† été réalisées toutes les 2 semaines durant la période de culture (120 jours) à partir du stade physiologique 4-6 feuilles. L’élicitation a été menée en utilisant 400 mM de peroxyde d’hydrogène afin d’augmenter l’efficacité e† le rendement sur de plus grandes surfaces comme celles utilisées dans ce projet. La solution a été appliquée par spray sur chaque plante avec un volume correspondant à l’apparition de gouttelettes sur la plante.

Un stress hydrique a été réalisé par arrêt de l’irrigation durant les 3 jours précédant la récolte afin de ne pas perturber e† diminuer le rendement en fruits.

[0062] Exemple 2 : Pourcentage des capsaïcinoïdes totaux (capsaïcine + dihvdrocapsaïcine) chez les fruits de piment (C. chinense cv. Helios) cultivé et traité dans les conditions de l’exemple 1 avec du peroxyde d’hydrogène et/ou avant subi un déficit hydrique (arrêt total de l’irrigation) avant récolte

[0063] Concernant l’analyse des capsaïcinoïdes, l’extraction a été menée en plaçant 200 mg de matière végétale (fruit) fraîche broyée dans un tube Falcon de 50 mL auxquels on† été ajoutés 10 mL d’acétonitrile (grade HPLC). Trois réplicats on† été utilisés pour chaque condition. Les échantillons on† ensuite été passés aux ultrasons durant 3h par immersion des tubes Falcon dans un bain à 35-45°C avec une agitation forte toutes les 30 min. Les échantillons on† ensuite été centrifugés à 8000 rpm pendant 10 min à 4°C e† le surnageant filtré sur des ACRODISCS® à pores de 0,45 miti. Le filtra† a ensuite été placé dans des flacons ambrés. La quantification a été réalisées sur une FIPLC Agilen† série 1200 e† un quadripôle UV-VIS 6120 en utilisant une colonne Cl 8 Eclipse plus avec des tailles de particules de 5 miti. La phase mobile était composée d’acétonitrile/eau (70:30).

Les résultats obtenus son† illustrés par la Figure 1 dans laquelle les différentes lettres représentent les différences significatives entre les traitements (tes† de Tukey p<0,05).

La condition contrôle, sans élicitation, possède une teneur moyenne en capsaïcinoïdes d’environ 0,7% de matière sèche. La combinaison des deux éliciteurs selon l’invention (i.e. un traitement foliaire de peroxyde d’hydrogène à 400mM e† un stress hydrique) a permis d’augmenter la dose de capsaïcinoïdes de ces cultures élicifées de 0,7 à 4% en moyenne de matière sèche. Les niveaux de capsaïcinoïdes on† parfois atteint 4,5% voire 4,7% pour l’un des échantillons testés.

Il es† important de mentionner que lorsque le H2O2 uniquement es† utilisé en fan† qu’élicifeur sur ces cultures, les doses de capsaïcinoïdes son† seulement augmentées de 0,7 à 1 ,7% en moyenne de matière sèche. De même, lorsque le stress hydrique uniquement es† utilisé en fan† qu’élicifeur les doses de capsaïcinoïdes son† seulement augmentées de 0,7 à 2,1% en moyenne de matière sèche.

Ainsi, un effet au minimum significativement additif voire synergique de ces 2 éliciteurs appliqués sur les plantes avant récolte e† utilisés en combinaison a été obtenu.

[0064] Exemple 3 : Expression de gènes de l’aminotransférase fpamt), - keto acyl svnthase fkas), capsaicin svnthase fat3) et de la phenyl alanine ammonia Ivase fpal) chez les fruits de piment IC. chinense cv. Helios) cultivé et traité dans les conditions de l’exemple 1 avec du peroxyde d’hydrogène et/ou avant subi un déficit hydrique [arrêt de l’irrigation) avant récolte

[0065] Une extraction de l’ARN total de 2 grammes de fruits de piment a été réalisée en utilisant le ki† TRIzol®Reagen† en combinaison avec le système d’isolation totale de l’ARN Promega SV. Trois réplicats on† été utilisés pour chaque condition. L’ARN total a été converti en ADNc à l’aide du ki† Rever† Aid First Strand cDNA Synthesis de Thermo Scientific. L’ADNc (500 ng) a été utilisé pour les analyses d’expression de gènes avec le système de détection de PCR en temps réel CFX96 TouchTM (Bio-Rad Laboratories, Inc). Des oligonucléotides spécifiques de la voie des capsaïcinoïdes (pam†, kas e† a†3) e† la pal (voie des phenylpropanoïdes) on† été utilisés pour les analyses. Les conditions d’amplification utilisées son† celles d’Abraham-Juarez e† al. (2008). Le gène de l’ubiquitine a été utilisé en tan† que gène de ménage.

Les résultats obtenus son† illustrés par la Figure 2 dans laquelle les lettres correspondent aux significafivifés relatives aux tests statistiques réalisés par gène étudié. Autrement dit, les différences a, b, c, d son† à comparer gène par gène (pam†, kas, a†3, pal) entre chaque condition et non au sein d’une même condition.

L’expression de gènes associés à la voie de biosynthèse des capsaïcinoïdes est augmentée chez des plantes traitées soit au peroxyde d’hydrogène (400 mM) uniquement, soit ayant subi un stress hydrique uniquement, soit traitées avec la combinaison traitement H2O2 et stress hydrique, en comparaison avec la condition contrôle (non-élicitée) et ce pour les quatre gènes analysés. Pour les 4 gènes, l’expression semble augmentée (tendance observée) lors de la combinaison traitement PhC -stress hydrique mais de manière non- significative. Le cumul de ces tendances d’augmentation d’expression de gènes lors de élicitation par la combinaison peut-être à l’origine de l’augmentation de quantité de capsaïcinoïdes dans les plantes ayant subi les deux élicitations (résultante).

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé d’élicitation contrôlée de plantes en culture pour augmenter leur synthèse de métabolites secondaires comprenant les étapes suivantes selon lesquelles :

- d’une part, lesdites plantes sont traitées par application d’une solution de peroxyde d’hydrogène (H2O2) à une concentration comprise entre 1 mM et 800 mM, et

- d’autre part, un déficit hydrique es† généré par arrêt total de l’irrigation desdites plantes en culture, ledit traitement H2O2 e† ledit déficit hydrique étant réalisés, de manière concomitante ou séparée, entre 1 e† 5 jours avant la récolte, e†

- on récolte des fruits issus des plantes ainsi traitées dans lesquels la synthèse de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, a été augmentée.

2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les plantes son† des Solanacées.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les Solanacées son† des plants de piment ( Capsicum spp.), préférentiellement des plants de piment choisis parmi C. chinense Bhuf Jolokia, C. chinense cv. Helios (piment Habanero) e† C. annuum L. cv Don Benifo (piment Jalapeno).

4. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le traitement au H2O2 es† réalisé avec une solution aqueuse de H2O2 à une concentration comprise entre 10 mM e† 500 mM e† appliqué par spray au niveau des feuilles desdites plantes.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le traitement au H2O2 es† réalisé avec une solution aqueuse de H2O2 à une concentration comprise entre 200 mM e† 450 mM, préférentiellement de 400 mM.

6. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le traitement au H2O2 e† le déficit hydrique son† réalisés de manière concomitante 3 jours avant la récolte.

7. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le traitement au H2O2 e† le déficit hydrique son† réalisés de manière périodique toutes les deux semaines avant chaque récolte pendant la période de production de fruits par lesdifes plantes.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le traitement au H2O2 e† le déficit hydrique son† réalisés de manière périodique toutes les deux semaines avant chaque récolte pendant la période de production de fruits par lesdites plantes, respectivement au moins 3 fois, préférentiellement respectivement au moins 8 fois.

9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les métabolites secondaires don† la synthèse es† augmentée son† des capsaïcinoïdes.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les métabolites secondaires don† la synthèse es† augmentée son† des capsaïcinoïdes choisis parmi la capsaïcine, dihydrocapsaïcine (8-méthyl-N- vanillylnonamide), nordihydrocapsaïcine (7-méfhyl-N-vanillylocfamide), homodihydrocapsaïcine (9-méfhyl-N-vanillyldécamide), homocapsaïcine (frans-9-méfhyl-N-vanillyl-7-décénamide).

1 1. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les capsaïcinoïdes don† la synthèse es† augmentée son† la capsaïcine, dihydrocapsaïcine et nordihydrocapsaïcine.

12. Utilisation du procédé selon l’une des revendications 1 à 1 1 chez des plantes choisies parmi les Solanacées, préférentiellement des plants de piment ( Capsicum spp.), pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, carofénoïdes, ferpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, synthétisés par lesdifes plantes a été augmentée.

13. Utilisation selon la revendication 12 chez des plants de piment (Capsicum spp.), préférentiellement des plants de piment choisis parmi C. chinense Bhuf Jolokia, C. chinense cv. Helios (piment Habanero) et C. annuum L. cv Don Benifo (piment Jalapeno ), pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, carofénoïdes, ferpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, synthétisés par lesdits plants de piment a été augmentée.

14. Utilisation selon la revendication 12 ou 13, pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de capsaïcinoïdes, préférentiellement la capsaïcine, dihydrocapsaïcine e† nordihydrocapsaïcine, synthétisés par lesdites plantes ou lesdits plants de piment a été augmentée.