EP4003968A1 - Verfahren zur herstellung eines cumarin-caged forskolinderivats, forskolinderivat und verwendung des forskolinderivats - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines cumarin-caged forskolinderivats, forskolinderivat und verwendung des forskolinderivats

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EP4003968A1
EP4003968A1 EP20743062.0A EP20743062A EP4003968A1 EP 4003968 A1 EP4003968 A1 EP 4003968A1 EP 20743062 A EP20743062 A EP 20743062A EP 4003968 A1 EP4003968 A1 EP 4003968A1
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EP
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oxo
methyl
chromen
bromo
methoxymethoxy
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Withdrawn
Application number
EP20743062.0A
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Arnd Baumann
Dirk BIER
Marcus HOLSCHBACH
Birte DREWES
Thomas GENSCH
Bernd Neumaier
Sabine BALFANZ
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Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Publication date
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Definitions

  • the invention relates to a method for producing a coumarin-caged forskolin derivative, a corresponding forskolin derivative and the use of the forskolin derivative.
  • Forskolin is a diterpene of the Labdan type from Coleus forskohlii (syn. Plectranthus barbatus), from the Lamiaceae family.
  • Caged compounds are chemically modified compounds that release a defined substance when exposed to light of certain wavelengths. Its main area of application is biochemical and cell biological research. 1 ⁇ 2 biologically active compounds are equipped with a photolabile protective group ("cage") and are thus temporarily biologically inactive. The photolabile protective group is irreversibly split off by means of irradiation with light, and the previously inactive compound exhibits its specific biological activity again. Caged compounds are used to release effectors at a specific time at a specific location if their direct application is difficult or too slow to directly achieve the desired concentration at the location of action, e.g. B. inside a cell. The inactive caged connection can become on the other hand, enrich it at the target through slow diffusion and release a sufficient amount of effector in a short time with subsequent exposure.
  • GPCR G-protein-coupled receptor
  • Forskolin is used experimentally as a direct stimulator of adenylyl cyclases (ACs).
  • ACs adenylyl cyclases
  • Water-soluble forskolin derivatives such as. B. the commercially available Colforsin (NKH 477, see Figure 1, prior art), 6 are typically acylated at C-6 or C-7 with a polar aliphatic amine see. 7,8 These derivatives are usually even more selective for adenylyl cyclases and have lower off-target activities. 9
  • the disadvantage is that there are no water-soluble forskolin derivatives that can be released under light control. There is therefore no “inactive” caged compound of forskolin that accumulates at the target through diffusion and targeted directly at the site of action through subsequent photolysis can be released in a very short time.
  • the main difficulty is the complexity of a synthetic route.
  • the object of the invention is to provide a method for producing “coumarin-caged forskolin derivatives”. Furthermore, it is an object of the invention to provide the corresponding cuma rin-caged forskolin derivatives in order to be able to carry out cell- or tissue-based examinations with them.
  • auxiliary materials of steps a. to f. can advantageously correspond to those of the exemplary embodiment.
  • the first carbamoylation according to step a ( Figure 3) with a polar aprotic solvent, e.g. dimethylformamide (DMF), N-methylformamide (NMF), tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile (ACN) , Dimethylpropylenurea (DMPU), pyrinine, acetone between about 10 ° C to 30 ° C.
  • a polar aprotic solvent e.g. dimethylformamide (DMF), N-methylformamide (NMF), tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile (ACN) , Dimethylpropylenurea (DMPU), pyrinine, acetone between about 10 ° C to 30 ° C.
  • a polar aprotic solvent e.g. dimethylformamide (DMF), N-methylformamide (NMF), tetrahydr
  • the first deprotection according to step b. ( Figure 4) can be carried out with a mineral base and an aqueous-alkanolic solvent between about 10 ° C to 30 ° C.
  • the second carbamoylation according to step c. can advantageously with a polar aprotic solvent, e.g. dimethylformamide (DMF), N-methylformamide (NMF), tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile (ACN), dimethylpropylenurea (DMPU), pyrinine, acetone and an auxiliary base, e.g.
  • a polar aprotic solvent e.g. dimethylformamide (DMF), N-methylformamide (NMF), tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile (ACN), dimethylpropylenurea (DMPU), pyrinine, acetone and an auxiliary base, e.g.
  • a polar aprotic solvent e.g. dimethylformamide (DMF), N-methylformamide (NMF), tetrahydrofuran (THF
  • DBU diazabicycloundecene
  • Et3N triethylamine
  • DIEA diisopropylethylamine
  • NMM N-methylmorpholine
  • tributylamine min and for example a catalyst such as Py * HCl with the exclusion of light between about 0 ° C to 10 ° C.
  • the acetylation according to step d. can with a polar aprotic solvent, e.g. dimethylformamide (DMF), N-methylformamide (NMF), tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile (ACN), dimethylpropylenurea (DMPU), pyrinine, acetone and a Acetylating reagent, for example acetyl chloride, acetic anhydride, and with the exclusion of light between about 0 ° C to 10 ° C.
  • a polar aprotic solvent e.g. dimethylformamide (DMF), N-methylformamide (NMF), tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile (ACN), dimethylpropylenurea (DMPU), pyrinine, acetone and a Acetylating reagent, for example acetyl chlor
  • the second deprotection according to step e. ( Figure 7) can be mixed with an organic acid such as formic acid, acetic acid, propionic acid and so on and any alkanol, e.g. B. methanol, ethanol and so on between about 10 ° C to 30 ° C.
  • organic acid such as formic acid, acetic acid, propionic acid and so on
  • any alkanol e.g. B. methanol, ethanol and so on between about 10 ° C to 30 ° C.
  • the third deprotection according to step f. can, for example, with a mild catalyst, such as. B. NaHS0 4 * SiC> 2 in a non-polar aprotic solvent such as CH2Cl2, benzene, ether and so on and between about 10 ° C to 30 ° C.
  • a mild catalyst such as. B. NaHS0 4 * SiC> 2 in a non-polar aprotic solvent such as CH2Cl2, benzene, ether and so on and between about 10 ° C to 30 ° C.
  • the coumarin-caged forskolin derivative is used
  • a first carbamoylation of a (pseudo) halogen-substituted, protected coumarin is carried out (analogous to FIG. 3), in order to insert an N-methylalkylenediamine function there.
  • a nitrophenyl carbonate of the protected, (pseudo) halogen-substituted 4-hydroxymethylcoumarin 6 or its analogs is reacted with trifluoro-N- (2- (methylamino) alkyl) acetamide 5 or its analogs.
  • the trifluoroacetyl group is then split off (first deprotection, analogous to FIG. 4).
  • the amine 3 (or its analogues) formed in this way is coupled to the completely protected forskolin carbonate 2 in the next step by a second carbamoylation (analogous to FIG. 5).
  • the coupled product 7 (or its analogues) is acetylated on forskolin (acetylation analogous to FIG. 6) and completely deprotected in two further steps to form caged forskolin JCF 1 or its analogues (second and third deprotection, analogous to FIGS. 7 and 8 ).
  • Step a. of claim 1 then reads for the general synthesis method: 2,2,2-trifluoro-N- (2-methylamino- G
  • JCF 1 (or its analogues provided according to the invention) is cleaved after irradiation with light in a photolysis to forskolin- (2- (methylamino) ethyl) carbamate 10 (or its homologues), CO2 and the corresponding methyl coumarin derivative (FIG. 9) .
  • the other coumarin-caged forskolin derivatives according to the invention are cleaved analogously to the homologous forskolin carbamates, CO 2 and the corresponding methyl coumarin derivatives.
  • the coumarin-caged forskolin derivative can advantageously be introduced into a cell and, after the irradiation, the increase in the intracellular cAMP concentration, which occurs due to the binding of the biologically active forskolin carbamate 10 to membrane-bound adenylyl cyclases endogenously in the cells, measured using a fluorescence-based sensitive detection method becomes.
  • Figure 1 Forskolin and NKH 477 (prior art).
  • FIG. 2 Synthesis overview of JCF 1 from protected forskolin 2 and a coumarin derivative 3 functionalized with N-methylethylenediamine.
  • Figure 7 Synthesis of (3R, 4aR, 5S, 6S, 6aS, 1 OS, 10aR, 1 ObS) -6 - (((2 - ((((6-bromo-7- (methoxymethoxy) -2-oxo- 2H-chromen-4-yl) methoxy) carbonyl) (methyl) amino) ethyl) carbamoyl) oxy) -l 0, 1 Ob-dihydroxy-3, 4a, 7, 7, 1 Oa-pentamethyl-1 -oxo-3 -vinyldodecahydro-1 Fl-benzo [f] chromen-5-yl acetate 9 (step e.).
  • Figure 8 Synthesis of (3R, 4aR, 5S, 6S, 6aS, 10S, 10aR, 10bS) -6 - (((2 - ((((6-bromo-7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene- 4-yl) methoxy) carbonyl) (methyl) amino) ethyl) carbamoyl) oxy) - 10.1 Ob-dihydroxy-3,4a, 7,7,10a-pentamethyl-1-oxo-3-vinyldodecahydro-1H-benzo [f] chromen-5-yl acetate, (JCF 1) (step f.).
  • FIG. 9 Photolysis of JCF 1
  • FIG. 10 Irradiation of JCF 1 and cleavage to forskolin carbamate 10
  • FIG. 11 Relative fluorescence when loaded with 10 mM JCF 1; the times were measured at intervals of 1 min.
  • FIG. 12 Relative fluorescence when loaded with 30 mM JCF 1; the times were measured at intervals of 1 min.
  • FIG. 13 Relative fluorescence when loaded with 10 mM NHK 477; the times were measured at intervals of 1 min.
  • FIG. 14 Relative fluorescence when loaded with 30 mM NHK 477; the times were measured at intervals of 1 min.
  • FIG. 15 Relative fluorescence without loading (negative control); the times were measured at intervals of 1 min.
  • Figure 1 shows the prior art, forskolin and NKH 477.
  • JCF 1 as a coumarin-caged forskolin derivative is synthesized in a 6-step synthesis starting from protected forskolin 2 and a coumarin derivative 3 functionalized with N-methylethylenediamine (FIG. 2).
  • the six synthesis stages (FIG. 3 to FIG. 8) and the synthesis products mentioned therein with the reference numerals 1, 3, 4, 7, 8, 9 are not previously known from the literature. Their overall yield is 5% based on the carbonate 6.
  • JCF 1 (or its analogues) can be split under irradiation with light to give the desired forskolin carbamate 10 (FIG. 9 and FIG. 10) and thus qualifies for the biological application mentioned above.
  • JCF 1 The photolysis of JCF 1 is carried out under controlled conditions in order to quantitatively demonstrate the release of forskolin carbamate 10 as a function of the amount of light absorbed: 0.16 ml of a 100 mM solution of JCF 1 in MeOH are placed in a quartz glass cuvette (width: 4 mm; depth (optical path): 10 mm -> filling height 4 mm) given.
  • the "Intensilight” light source excitation lamp of a Nikon TI Eclipse fluorescence microscope
  • the excitation source the light of which passes through a gel light guide (active diameter: 4 mm) and a narrow band pass filter (368.8 nm ⁇ 5 nm) onto the liquid column in the cuvette is directed.
  • the irradiated samples are then mass spectrometrically (mass spectrometer: MSQ Plus from ThermoScientific; ionization: ESI interface with a cone voltage of 50 V, eluent: methanol, water, glacial acetic acid, / 50, 50, 0.02 / vol, vol, vol ; Flow rate 0.2 ml / min; direct injections of 20 m ⁇ of the respective irradiated samples via a Rheodyne injection valve (7725i)).
  • the mass trace m / z 51 1 and the mass range m / z 807-811 are recorded.
  • the integrals of the peaks of the chromatogram of the mass trace m / z 51 1 are evaluated (see FIG. 10). With an exposure time of 320 seconds, no more signals can be detected in the mass range m / z 807-811 (starting compound), so that, under the conditions described above, complete conversion can be assumed after this time.
  • reaction can also be carried out in an analogous manner with the analogs of JCF-1 provided according to the invention.
  • the influx of Ca 2+ can be detected with Ca 2+ -sensitive dyes or genetically-coded Ca 2+ indicators, such as GCaMP sensors, in a fluorescence reader or with a fluorescence microscope.
  • Ca 2+ -sensitive dyes or genetically-coded Ca 2+ indicators such as GCaMP sensors
  • GCaMP sensors genetically-coded Ca 2+ indicators
  • a cell line which, in addition to the above-mentioned CNG channel, also constitutively expresses the genetically encoded Ca 2+ indicator GCaMP3.0 (Tian et al., 2009).
  • the GCaMP3.0 protein consists of a circularly permuted EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), at the N-terminal a binding peptide for calmodulin from the myosin light Chain kinase (Ml 3 peptide) and C-terminal of a calmodulin are fused.
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • Ml 3 peptide myosin light Chain kinase
  • C-terminal of a calmodulin are fused.
  • GCaMP3.0 does not emit fluorescence at low intracellular Ca 2+ concentrations. When the intracellular Ca 2+ concentration increases, Ca 2+ ions bind to the calmodulin. This then interacts with the M13 peptide and a conformational change of the total protein results.
  • GCaMP3.0 fluoresces after exposure to a wavelength of 480 nm at 510 nm. The Ca 2+ -dependent change in the fluorescence change can be recorded and quantified
  • the use of the JCF 1 is universally suitable for all cell- and tissue-based samples in which the intracellular cAMP concentration should be increased.
  • the possibility of activating the biologically active compound at defined times and within the cell, for example by local release by means of punctiform exposure, has great advantages over conventional strategies in which an increase in the intracellular cAMP concentration, e.g. via GPCR signaling pathways, via the stimulation of the adenylyl cyclases eg NKH 477, or the inhibition of the cell's own phosphodiesterases, which hydrolyze the cAMP to AMP, eg by IBMX. With the latter method, there are always changes in the cAMP concentration in the entire cell or within the cell or tissue association.
  • the use of the biologically inactive compound 1 also enables the kinetics of cellular processes, which are controlled by increasing the intracellular cAMP concentration, to be recorded with a high time resolution in the sub-second range.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Cumarin-caged Forskolinderivats, das Forskolinderivat an sich und die Verwendung des Forskolinderivats.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur Herstellung eines Cumarin-caged Forskolinderivats, Forskolinderivat und
Verwendung des Forskolinderivats
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Cumarin-caged Forskolin- derivats, ein entsprechendes Forskolinderivat und die Verwendung des Forskolinderivats.
Stand der Technik
Forskolin ist ein Diterpen vom Labdan-Typ aus Coleus forskohlii (syn. Plectranthus bar- batus), aus der Familie der Lamiaceae.
Es ist bekannt, dass Forskolin direkt, aber unspezifisch, Adenylat-Cyclasen aktiviert. Es fuhrt darüber zu einer Erhöhung der intrazellulären cAMP -Konzentration. Über diesen Angriffs punkt können verschiedene cAMP-abhängige Signaltransduktionswege beeinflusst werden. Forskolin wird daher als Werkzeug in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt (König, Gabriele M.. Forskolin. letzte Aktualisierung: Mai 2012. In: Römpp [online]: Georg Thieme Verlag KG [Zugriff am: 17.06.2019] verfügbar unter:
https://roempD.thieme.de/roempp4.0/do/data/RD-06-016921.
Zu diesem Zweck werden unter anderem die sogenannten Caged- Verbindungen genutzt. Caged- Verbindungen („caged compounds“) sind chemisch modifizierte Verbindungen, die bei Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlängen eine definierte Substanz freisetzen. Ihr Hauptanwendungsgebiet ist die biochemische und zellbiologische Forschung.1·2 Biologisch aktive Verbindungen werden mit einer photolabilen Schutzgruppe ("cage") ausgestattet und sind somit temporär biologisch inaktiv. Mittels einer Lichteinstrahlung wird die photolabile Schutzgruppe irreversibel abgespalten, und die zuvor inaktive Verbindung weist wieder ihre spezifische biologische Aktivität auf. Caged- Verbindungen werden dazu verwendet, Effektoren zu einer bestimmten Zeit an einem bestimmten Ort freizusetzen, wenn deren direkte Applikation schwierig oder zu langsam ist, um die gewünschte Konzentration am Wirkort direkt zu erreichen, wie z. B. im Innern einer Zelle. Die inaktive Caged- Verbindung kann sich dagegen auch durch langsame Diffusion am Ziel anreichem und bei anschließender Belichtung eine genügende Menge Effektor in kurzer Zeit freisetzen.
Durch die Verwendung von geeigneten Blitzlampen oder Lasern ist es möglich, einen biochemischen Prozess, z.B. eine enzymatisch katalysierte Reaktion oder eine Signalübertra- gung, sehr schnell zu starten (Piko- bis Millisekunden).
Um die Zeitabhängigkeit von G-Protein gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signalkaskaden zu untersuchen, im vorliegenden Fall um eine detaillierte Untersuchung eines Ade- nylylzyklase-vermittelten Signalwegs durchzufuhren, könnten Caged- Verbindungen eingesetzt werden. Cumarin ist eine etablierte Cage-Gruppe, bisher z. B. von caged mRNA und DNA.3 G- Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie membrangebundener Rezeptoren und regulieren eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Die Aktivierung von GPCRs induziert intrazelluläre Konzentrationsänderungen von sekundären Botenstoffen, wie z. B. von zyklischem Adenosin-3‘,5‘-monophosphat (cAMP) und Calcium (Ca2+). Diese sekundä- ren Effekte werden durch spezifische Signalkaskaden induziert. Die Aktivierung membrangebundener Adenylatzyklasen (ACs) fuhrt zur Produktion von cAMP.
Das natürlich vorkommende Diterpen Forskolin wird als direkter Stimulator der Adenylat- Cyclase experimentell in der Biochemie und Pharmakologie genutzt.4,5 Als Folge der Enzymaktivierung wird in der Zelle die Umwandlung von Adenosintriphosphat (ATP) zum Signal- Stoff cAMP katalysiert. Auf diese Weise greift Forskolin zentral in die Signaltransduktionswege vieler G-Protein-gekoppelter Rezeptoren ein.
Forskolin wird somit experimentell als direkter Stimulator von Adenylylzyklasen (ACs) genutzt. Wasserlösliche Forskolinderivate, wie z. B. das käufliche Colforsin (NKH 477, siehe Figur 1, Stand der Technik),6 sind typischerweise an C-6 oder C-7 mit einem polaren aliphati- sehen Amin acyliert.7,8 Diese Derivate sind in der Regel noch selektiver für Adenylylzyklasen und weisen dabei geringere Off-Target-Aktivitäten auf.9
Nachteilig gibt es jedoch keine wasserlöslichen Forskolinderivate, die lichtgesteuert freisetz- bar sind. Es gibt somit keine„inaktive“ caged- Verbindung des Forskolins, die sich durch Diffusion am Ziel anreichert und durch anschließende Photolyse gezielt direkt am Wirkort in sehr kurzer Zeit freigesetzt werden kann. Die Hauptschwierigkeit ist die Komplexität eines Syntheseweges.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zur Herstellung von„Cumarin-caged Forskolinde- rivaten“ bereitzustellen. Ferner ist es eine Aufgabe der Erfindung die entsprechenden Cuma rin-caged Forskolinderivate bereitzustellen, um damit zell- oder gewebebasierte Untersuchungen durchfuhren zu können.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst mit dem Verfahren nach Patentanspruch 1, sowie den Cumarin- caged Forskolinderivaten und dessen Verwendungen gemäß den Nebenansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentan sprüchen.
Beschreibung der Erfindung
Ein Verfahren zur Herstellung eines speziellen Cumarin-caged Forskolinderivats JCF 1 mit der Formel
ist gekennzeichnet durch die Schritte: a. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl me- thyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 mit der Formel
4 durch eine erste Carbamoylierung von 2,2,2-Trifluor-N-(2-methylamino-ethyl)-acetamid 5 und 6-Brom-7-methoxymethoxy cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat 6 (Figur 3), b. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- aminoethyl)(methyI)carbamat 3 mit der Formel
durch eine erste Entschützung von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 (Figur 4), c. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- (((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 11 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy-2,4al , 10, 10, 12a- pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2': 1 ,2]naphtho[l ,8-de] [1 ,3]dioxin-l 1 - yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 gemäß der Formel durch eine zweite Carbamoylierung von 7-Desacetylforskolin-6,7-carbonat 1,9- dimethylformamid dimethyl acetal 2 und (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen- 4-yl)methyl (2-aminoethyl)(methyl)carbamat 3 (Figur 5), d. Synthese von (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l lS,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6-(dimethylamino)-
2,4al ,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2': 1 ,2]naphtho[l ,8- de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 gemäß der Formel durch eine Acetylierung von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2-(((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 1 1 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy- 2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2' : 1 ,2]naphtho[ 1 ,8- de][l,3]dioxin-l l-yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 (Figur 6), e. Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 1 Ob-dihydroxy-3 ,4a, 7, 7, 1 Oa- pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f]chromen-5-yl-acetat 9 gemäß der Formel
durch eine zweite Entschützung von (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l lS,12S,12aR)-l l-(((2-((((6- Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6-(dimethylamino)- 2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2' ; l ,2]naphtho[ 1 ,8- de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 (Figur 7), f. Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-hydroxy-2- oxo-2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(niethyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 1 Ob- dihydroxy-3,4a,7,7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3-vinyldodecahydro- 1 H-benzo[f]chromen-5-yl acetat (JCF 1) gemäß der Formel durch eine drite Entschützung von (3R,4aR,5S,6S,6aS,I0S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 10b-dihydroxy-3 ,4a, 7, 7, 10a- pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f]chromen-5-yl acetat 9 (Figur 8).
Die übrigen Hilfsstoffe der Schrite a. bis f. können vorteilhaft denen des Ausführungsbei- spiels entsprechen.
In einer Ausgestaltung der Erfindung kann die erste Carbamoylierung gemäß Schrit a (Figur 3) mit einem polar-aprotischen Lösemitel, z.B. Dimethylformamid (DMF), N- Methylformamid (NMF), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril (ACN), Dimethylpropylenhamstoff (DMPU), Pyrinin, Aceton zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt werden.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann die erste Entschützung gemäß Schrit b. (Figur 4) mit einer mineralischen Base und einem wässrig-alkanolischen Lösemitel zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt werden.
Die zweite Carbamoylierung gemäß Schrit c. (Figur 5) kann vorteilhaft mit einem polar- aprotischen Lösemitel, z.B. Dimethylformamid (DMF), N-Methylformamid (NMF), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril (ACN), Dimethylpropylenhamstoff (DMPU), Pyrinin, Aceton und einer Hilfsbase, z.B. Diazabicycloundecen (DBU), Triethylamin (Et3N) Diisopropylethylamin (DIEA), N-Methylmorpholin (NMM), Tributyla- min und beispielsweise einem Katalysator, z.B. Py*HCl unter Ausschluss von Licht zwischen etwa 0 °C bis 10 °C durchgeführt werden.
Die Acetylierung gemäß Schritt d. (Figur 6) kann mit einem polar-aprotischen Lösemittel, z.B. Dimethylformamid (DMF), N-Methylformamid (NMF), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril (ACN), Dimethylpropylenhamstoff (DMPU), Pyrinin, Aceton und einem Acetylierungsreagenz, z.B. Acetylchlorid, Acetanhydrid, und unter Ausschluss von Licht zwischen etwa 0 °C bis 10 °C durchgeführt werden.
Die zweite Entschützung gemäß Schritt e. (Figur 7) kann mit einer organischen Säure, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und so weiter und einem beliebigen Alkanol, z. B. Methanol, Ethanol und so weiter zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt werden.
Die dritte Entschützung gemäß Schritt f. (Figur 8) kann z.B. mit einem milden Katalysator, wie z. B. NaHS04*SiC>2 in einem unpolar-aprotischen Lösemittel, z.B. CH2CI2, Benzol, Ether und so weiter und zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß wird das Cumarin-caged Forskolinderivat
(3R,4aR,5 S,6S,6aS, 1 OS, 1 OaR, 10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 10b-dihydroxy-3 ,4a, 7, 7, 10a- pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f]chromen-5-yl acetat (JCF 1) gemäß der Formel:
beansprucht. Die nachfolgenden Zwischenprodukte werden vorteilhaft während des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmalig bereitgestellt und beansprucht und sind entsprechend in der Literatur bisher unserer Kenntnis nach noch nicht beschrieben worden:
(6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- aminoethyl)(methyl)carbamat 3 gemäß der Formel
sowie (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2- trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 gemäß der Formel
sowie (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- (((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 1 1 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy-2,4al , 10, 10,12a- pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2': 1 ,2]naphtho[ 1 ,8-de] [ 1 ,3]dioxin- 1 1- yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 gemäß der Formel
sowie außerdem (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l lS,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6-(dimethylamino)- 2,4al,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2': l,2]naphtho[l,8- de][l ,3]dioxin-12-yl acetat 8 gemäß der Formel
und auch (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo- 2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-l 0,10b- dihydroxy-3,4a,7,7, 1 Oa-pentamethyl-1 -oxo-3-vinyldodecahydro- 1 H-benzo[f]chromen-5-yl acetat 9 gemäß der Formel
Allgemeine Synthesebeschreibung Caged-Forskolinderivate zur Photolyse in Zellen und Geweben mit resultierender Erhöhung der cAMP-Konzentration werden erfindungsgemäß in sechs Schritten a. bis f. synthetisiert.
Vor der Kopplung des geschützten Forskolins 2 (Figur 2 und Figur 5) mit dem Cumarin-Cage 3 bzw. dessen Analogen (siehe Figur 5) wird eine erste Carbamoylierung eines (Pseudo- )Halogensubstituierten, geschützten Cumarins durchgefuhrt (analog der Figur 3), um dort eine N-Methylalkylendiaminfunktion einzufügen. Dazu wird ein Nitrophenylcarbonat des geschützten, (Pseudo-)Halogensubstituierten 4-Hydroxymethylcumarins 6 bzw. dessen Analogen mit Trifluor-N-(2-(methylamino)alkyl)acetamid 5 bzw. dessen Analogen umgesetzt. Anschließend wird die Trifluoracetylgruppe abgespalten (erste Entschützung, analog der Figur 4). Das hierbei entstandene Amin 3 (bzw. dessen Analoge) wird im nächsten Schritt durch eine zweite Carbamoylierung an das vollständig geschützte Forskolincarbonat 2 gekoppelt (analog Figur 5). Das gekoppelte Produkt 7 (bzw. dessen Analoge) wird am Forskolin acetyliert (Ace- tylierung analog Figur 6) und in zwei weiteren Schritten vollständig zum Caged-Forskolin JCF 1 bzw. dessen Analogen entschützt (zweite und dritte Entschützung, analog Figuren 7 und 8).
Besonders vorteilhaft werden durch die genannten erfmdungsgemäßen Verfahrensschritte die erfmdungsgemäßen Cumarin-caged Forskolinderivate gemäß der allgemeinen Formel
n = 1-5; R1= OH; R2 = F, CI, Br, I, CN, -N3, -OCN, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -SeCN bereitgestellt. Diese sind für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet.
Es versteht sich, dass hierfür die Edukte zur Herstellung von JCF 1 Analogen, wie beschrieben, bis auf das vollständig geschützte Forskolin 2 entsprechend angepasst werden müssen.
An Stelle des spezifischen Edukts 4 mit der Formel wird hierzu das allgemeine Edukt (Pseudo)halogen-(methoxymethoxy-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)alkyl)carbamat mit der Formel
n = 1-5; R'= OH; R2 = F, CI, Br, I, CN, -N3, -OCN, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -SeCN in Schritt a. (analog Figur 3) von Anspruch 1 aus 2,2,2-Trifluor-N-(2-methylamino-alkyl)- acetamid und (Pseudohalogen)-methoxymethoxy cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat synthetisiert, um die Cumarin-caged Forskolinderivate gemäß der allgemeinen Formel bereit zu stellen.
Schritt a. von Anspruch 1 lautet dann für das allgemeine Syntheseverfahren: 2,2,2-T rifluor-N-(2-methylamino- G
alkyl)-acetamid O
(Pseudohalogen)-methoxymethoxy
cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat
(Pseudo)halogen-(methoxymethoxy-2-oxo-2H- chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2- trifluoroacetamido)alkyl)carbamate
Der weitere Syntheseweg dieser Derivate entspricht hierzu in Hinblick auf die Verfahrensparameter dem des Verfahrens zur Herstellung von JCF 1.
JCF 1 (bzw. dessen erfindungsgemäß bereit gestellte Analoge) wird nach einer Bestrahlung mit Licht in einer Photolyse zu Forskolin-(2-(methylamino)ethyl)carbamat 10 (bzw. dessen Homologe), CO2 und dem entsprechenden Methylcumarinderivat gespalten (Figur 9). Die übrigen erfindungsgemäßen Cumarin-caged Forskolinderivate werden analog zu den homologen Forskolincarbamaten, CO2 und den entsprechenden Methylcumarinderivaten gespalten.
Dies erschließt vorteilhaft eine Verwendung der erfindungsgemäßen Cumarin-caged Forskolinderivate zur Erhöhung der cAMP Konzentration in allen zell- und gewebebasierten Proben. Hierzu kann vorteilhaft das Cumarin-caged Forskolinderivat in eine Zelle eingebracht werden, und nach der Bestrahlung die Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration, die durch Bindung des biologisch aktiven Forskolincarbamat 10 an endogen in den Zellen vorhandenen, membranständigen Adenylylzyklasen erfolgt, mit einem fluoreszenzbasierten sensitiven Nachweisverfahren gemessen wird.
Ausfuhrungsbeispiel
Im Weiteren wird die Erfindung an Hand eines Syntheseweges fiir das Cumarin-caged Forskolinderivat 1 und der beigefiigten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung kommen soll.
Es zeigen:
Figur 1 : Forskolin und NKH 477 (Stand der Technik).
Figur 2: Syntheseübersicht von JCF 1 aus geschütztem Forskolin 2 und einem mit N- Methylethylendiamin funktionalisierten Cumarinderivat 3.
Figur 3: Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 (Schritt a.).
Figur 4: Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl
(2-aminoethyl)(methyl)carbamat 3 (Schritt b.).
Figur 5: Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl
(2-(((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 11 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy- 2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano [3 ',2' : 1 ,2]naphtho [ 1 ,8-de] [ 1 ,3]dioxin- 11- yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 (Schritt c.).
Figur 6: Synthese von (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l l S,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7-
(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6- (dimethylamino)-2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro- 2H,8H-pyrano[3',2': l,2]naphtho[l,8-de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 (Schritt d.).
Figur 7: Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS, 1 OS, lOaR, 1 ObS)-6-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-l 0, 1 Ob-dihydroxy- 3 ,4a, 7, 7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3 -vinyldodecahydro- 1 Fl-benzo [f] chromen-5- yl acetat 9 (Schritt e.).
Figur 8: Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7- hydroxy-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10,1 Ob-dihydroxy- 3,4a,7,7,10a-pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f]chromen-5- yl acetat, (JCF 1) (Schritt f.).
Figur 9: Photolyse von JCF 1 Figur 10: Bestrahlung von JCF 1 und Spaltung zu Forskolincarbamat 10 Figur 11 : Relative Fluoreszenz bei Beladung mit 10 mM JCF 1; die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen.
Figur 12: Relative Fluoreszenz bei Beladung mit 30 mM JCF 1; die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen.
Figur 13: Relative Fluoreszenz bei Beladung mit 10 mM NHK 477; die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen.
Figur 14: Relative Fluoreszenz bei Beladung mit 30 mM NHK 477; die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen.
Figur 15: Relative Fluoreszenz ohne Beladung (Negativkontrolle); die Zeitpunkte wurden im Abstand von 1 min gemessen. Figur 1 zeigt den Stand der Technik, Forskolin und NKH 477.
JCF 1 als Cumarin-caged Forskolinderivat wird in einer 6-stufigen Synthese ausgehend von geschütztem Forskolin 2 und einem mit N-Methylethylendiamin funktionalisierten Cumarinderivat 3 synthetisiert (Figur 2). Die sechs Synthesestufen (Figur 3 bis Figur 8) und die darin genannten Syntheseprodukte mit den Bezugszeichen 1, 3, 4, 7, 8, 9 sind bisher nicht literatur bekannt. Ihre Gesamtausbeute beträgt 5% bezogen auf das Carbonat 6.
Synthese
(6-Brom-7-('methoxymethoxyV2-oxo-2H-chromen-4-vnmethyl methyl('2-('2.2.2- trifluoroacetamidolethvDcarbamat 4 (Figur 3).
2,2,2-Trifluor-N-(2-methylamino-ethyl)-acetamid10,1 1 5 (536 mg, 3,15 mmol) und 6-Brom-7- methoxymethoxy cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat12 6 (1000 mg, 2,09 mmol) werden bei Raumtemperatur (RT) für 16h in 15 mL DMF gerührt. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird säulenchroma tographisch (Laufmittel EErnHex = 7:3) aufgereinigt.
Man erhält (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2- trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 (850 mg, 1,67 mmol, 80%) als farblose Kristalle.
MS (ESI+) m/z: [M + H]+ theor. 51 1,0; exp. 510,9.
('6-Brom-7-('methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- methyl (2-
aminoethviymethvBcarbamat 3 (Figur 4).
Trifluorcarbamat 4 (200 mg, 0,39 mmol) wird bei Raumtemperatur für 2 h mit 25 mL MeOH und 25 mL NaOHaq (0,1 mol/L) im Ultraschallbad behandelt. Die Lösung wird mit HClaq (0,1 mol/L) neutralisiert und anschließend mit CH2CI2 extrahiert (3 x 50 mL). Die vereinigten organischen Phasen werden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CFLChMeOH = 9: 1) aufgereinigt. Man erhält (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- aminoethyl)(methyl)carbamat 3 (91 mg, 0,22 mmol, 58%) als farblose Kristalle.
MS (ESI+) m/z: [M + H]+ theor. 417,0; exp. 417,0.
(6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-vnmethyl (2-
(Yttt2R.4aR.4al R.6S.1 OaS.11 S.12S.12aRV6-tdimethylaminoV 12-hvdroxy-2,4al .10.10.12a- pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahvdro-2H.8H-pyranor3,.2,:1.21naphthori.8-deiri .31dioxin-l l- vnoxy)carbonyl')amino')ethyl)(methyl')carbamat 7 tFigur 51
Zu einer Lösung von 7-Desacetylforskolin-6,7-carbonat 1 ,9-dimethylformamid dimethyl acetal 2 (148 mg, 0,33 mmol) und Carbamat 3 (296 mg, 0,72 mmol) in 8 mL Pyridin wird bei 0 °C Pyridinhydrochlorid gegeben (8,4 mg, 0,073 mmol) und anschließend Diazabicycloun- decen (DBU, 1 ,386 mL, 8,9 pmol) zugetropft. Die Reaktionslösung wird 5 d bei 4 °C unter Ausschluss von Tageslicht im Kühlschrank gerührt. Es werden 50 mL CH2CI2 und 10 mL HClaq (0,1 mol/L) zugefügt. Die organische Phase wird abgetrennt und am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CH2Ch:MeOH = 9: 1) aufgereinigt.
Man erhält (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- (((((2R,4aR,4a 1 R,6S , 1 OaS, 11 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy-2,4al ,10,10,12a- pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H-pyrano[3',2': l,2]naphtho[l ,8-de][l,3]dioxin-l 1- yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 (250 mg, 0,29 mmol, 88%) als farblose Kristalle.
MS (ESI+) m/z: [M + H]+ theor. 866,3; exp. 866,3. t 2R,4aR,4a 1 R.6S .1 OaS .11 S„ 12S.12aRV 1 1 -(((!-((( t6-Brom-7-( methoxymethoxy V2-oxo-2H- chromen-4-vnmethoxylcarbonvn('methvBaminolethvBcarbamovBoxyV6-(dimethylaminoV
2.4al.l0.10.12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahvdro-2H.8H-pyranor3l.2': 1.21naphtho[T,8- deirL31dioxin-12-yl acetat 8 /Figur 6)
Eine Lösung des Alkohols 7 (150 mg, 170 pmol) in 1,5 mL Pyridin und 1,5 mL Essigsäureanhydrid wird 2 d bei 4 °C unter Ausschluss von Tageslicht im Kühlschrank gerührt. Nach der Zugabe von 20 mL H2O wird mit CH2CI2 extrahiert (3 x 20 mL). Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und mit Na2SC>4 getrocknet. Die organische Phase wird abgetrennt und am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CH2Ck:MeOH = 9:1) aufgereinigt.
Man erhält (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l l S,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7-(methoxymethoxy)- 2-oxo-2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6- (dimethylamino)-2,4al ,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano[3',2': l,2]naphtho[l ,8-de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 (61 mg, 67,4 pmol, 40%) als farblosen Schaum.
MS (ESI+) m/z: [M + H]+ theor. 908,3; exp. 908,3.
Eine Lösung des Acetals 8 (208 mg, 0,23 mmol) in 3,6 mL MeOH und 2,4 mL Eisessig wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. 5 mL gesättigte Na2C03-Lösung werden zugegeben und die wässrige Phase mit CH2CI2 (3 x 10 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CHCl3:EE = 1 : 1) aufgereinigt.
Man erhält (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2- oxo-2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10,10b- dihydroxy-3,4a,7,7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3-vinyldodecahydro- 1 H-benzo[f]chromen-5-yl acetat 9 (95 mg, 0,11 mmol, 48%) als farblose Kristalle.
MS (ESI+) m/z: [M + H]+ theor. 853,3; exp. 853,2. (,3R.4aR.5S.6S.6aS.10S.10aR.10bS 6-Brom-7-hvdroxy-2-oxo-2H-chromen-4-
yl)methoxyJcarbonvB(methyOaminoJethyl)carbamoyl)oxy')- 10, 10b-dihvdroxy-3.4a.7,7.10a- pentamethyl-1 -oxo-3 -vinyldodecahvdro-lH-benzorflchromen-5-yl acetat (JCF 1. Figur 81
Zu einer Lösung des MOM-ethers 9 (45 mg, 55 pmol) in 5 mL CH2CI2 wird aktiviertes, heißes NaHS04*SiC>213 (100 mg, 0,56 mmol) gegeben. Der Katalysator wird vor der Benutzung 48 h bei 120 °C aktiviert. Die Mischung wird 16 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Das Filtrat wird mit CH2CI2 (2 x 5 mL) gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Laufmittel CHCl3:EE = 1 : 1) aufgereinigt.
Man erhält (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-hydroxy-2-oxo-2H- chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10,10b-dihydroxy- 3,4a,7,7,10a-pentamethyl-l-oxo-3-vinyldodecahydro-lH-benzo[f]chromen-5-yl acetat (JCF 1) (29 mg, 36 pmol, 66%) als farblose Kristalle.
MS (ESI+) m/z: [M + H]+ theor. 809,2; exp. 809,2.
Photolvse
JCF 1 (bzw. dessen Analoge) lässt sich unter Bestrahlung mit Licht zum gewünschten Forsko- lincarbamat 10 spalten (Figur 9 und Figur 10) und qualifiziert sich somit für die unter die oben genannte biologische Anwendung.
Die Photolyse von JCF 1 wird unter kontrollierten Bedingungen durchgef hrt, um die Freiset zung von Forskolincarbamat 10 als Funktion der absorbierten Lichtmenge quantitativ nachzuweisen: 0,16 ml einer 100 mM Lösung von JCF 1 in MeOH werden in eine Quartzglas- küvette (Breite: 4 mm; Tiefe (optischer Weg): 10 mm -> Füllhöhe 4 mm) gegeben. Als Anregungsquelle wird die "Intensilight"-Lichtquelle (Anregungslampe eines Nikon TI Eclipse Fluoreszenzmikroskops) genutzt, deren Licht durch einen Gellichtleiter (aktiver Durchmesser: 4 mm) und einen schmalbandigen Bandpassfilter (368,8 nm ± 5 nm) auf die Flüssigkeitssäule in der Küvette geleitet wird. Als Anregungsleistung wurde 1,58 mW gewählt (Stellung 32 (32-fache Abschwächung)) am Steuergerät der Anregungslampe). Damit ergibt sich eine Bestrahlungsstärke von ca. 12,5 mW/cm2. Die Bestrahlung erfolgte in Zeitintervallen von 1 bis 500 Sekunden durch manuelles Öffnen und Schließen des Verschlusses.
Die bestrahlten Proben werden anschließend massenspektrometrisch (Massenspektrometer: MSQ Plus von ThermoScientific; Ionisation: ESI-Interface mit einer Cone-Spannung von 50 V, Eluent: Methanol, Wasser, Eisessig, / 50, 50, 0,02 / vol, vol, vol; Fließgeschwindigkeit 0,2 ml / min; Direktinjektionen von 20 mΐ der jeweiligen bestrahlten Proben über ein Rheodyne- Injektionsventil (7725i)) untersucht. Es werden die Massenspur m/z 51 1 und der Massenbereich m/z 807-811 aufgezeichnet. Ausgewertet werden die Integrale der Peaks des Chromato gramms der Massenspur m/z 51 1 (siehe Figur 10). Bei einer Belichtungszeit von 320 Sekunden sind im Massenbereich m/z 807-811 (Ausgangsverbindung) keine Signale mehr detek- tierbar, so dass unter den oben beschriebenen Bedingungen nach dieser Zeit von einer vollständigen Umsetzung auszugehen ist.
Es versteht sich, dass die Reaktion in analoger Weise auch mit den erfindungsgemäß bereit gestellten Analogen des JCF-1 durchgeführt werden kann.
Validierung
Wir haben die erfindungsgemäß beschriebene Substanz JCF 1 an eukaryotischen Zellkulturen validiert, in denen die Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration, die durch Bindung des biologisch aktiven Forskolincarbamats 10 (Figur 9) an endogen in den Zellen vorhandenen, membranständigen Adenylylzyklasen erfolgt, mit einem fluoreszenzbasierten sensitiven Nach weis verfahren gemessen.14 Hierzu haben wir eine Zelllinie verwendet, in der ein zyklisch Nukleotid-gesteuerter (CNG) Ionenkanal konstitutiv exprimiert wird. Diese Kanäle sind typischerweise in olfaktorisch sensorischen Neuronen des Riechepithels exprimiert und öffnen, wenn die intrazelluläre cAMP Konzentration steigt. Durch den Kanal fließen Kationen, u.a. Ca2+-Ionen in die Zelle. Der Einstrom von Ca2+ kann mit Ca2+-sensitiven Farbstoffen oder genetisch-kodierten Ca2+ Indikatoren, wie z.B. GCaMP-Sensoren, in einem Fluoreszenzlese gerät oder mit einem Fluoreszenzmikroskop erfasst werden. Zur Detektion der Ca2+ Signale haben wir eine Zelllinie hergestellt, die neben dem o.g. CNG-Kanal zusätzlich den genetisch kodierten Ca2+ Indikator GCaMP3.0 (Tian et al., 2009) konstitutiv exprimiert.15 Das GCaMP3.0 Protein besteht aus einem zirkulär permutierten EGFP (Enhanced Green Flu- orescent Protein), an das N-terminal ein Bindepeptid für Calmodulin aus der Myosin Leichte Ketten Kinase (Ml 3 -Peptid) und C-terminal ein Calmodulin fusioniert sind. Bei niedrigen intrazellulären Ca2+ Konzentrationen emittiert GCaMP3.0 keine Fluoreszenz. Wenn die intrazelluläre Ca2+ Konzentration steigt, binden Ca2+-Ionen an das Calmodulin. Dieses interagiert dann mit dem M13-Peptid und es resultiert eine Konformationsänderung des Gesamtproteins. In dieser Form fluoresziert GCaMP3.0 nach Belichtung mit einer Wellenlänge von 480 nm bei 510 nm. Die Ca2+-abhängige Änderung der Fluoreszenzänderung kann mit den oben genannten Verfahren erfasst und quantifiziert werden.
Zellen der beschriebenen Zelllinie wurden in 96er Multiwellplatten (MWP) ausgesät und bis zu einer Dichte von ca. 25.000 vermehrt. Das Medium wurde abgenommen und gegen Extrazellulärlösung, die 100 mM IBMX (Isobutylmethylxanthin) zur Inhibierung zelleigener Phos- phodiesterasen enthielt, ausgetauscht. Anschließend wurde die Basalfluoreszenz in den Vertiefungen der 96er MWP mit einem Fluoreszenzlesegerät gemessen. Zellen in je vier Vertiefungen wurden mit JCF 1 (10 mM und 30 mM) für 30 Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln beladen. Anschließend wurde nochmals die Basalfluoreszenz in den Vertiefungen gemessen, bevor mit einer UV-Lampeneinrichtung die 96er MWP Schale insgesamt belichtet wurde (Figur 11, Figur 12). Nach der Belichtung wurden 10 mM und 30 mM NKH 477 in je vier unabhängige Vertiefungen pipettiert und die Fluoreszenzänderungen im Fluoreszenzlesegerät gemessen (Figur 13, Figur 14). Als Negativkontrolle dienten Zellen, die nur mit der Extrazellulärlösung (mit IBMX) inkubiert worden waren (Figur 15). Es zeigte sich, dass die Freisetzung von Forskolincarbamat 10 aus der Cage- Verbindung JCF-1 durch UV-Belichtung zu einer deutlichen Erhöhung der Ca2+-abhängigen Fluoreszenzemission fuhrt. Die Fluoreszenzänderung erreichte unter diesen Bedingungen ca. 50% der Werte, die durch Zugabe des nicht-gecagten NKH 477 erreicht wurden. In Zellen, die weder mit JCF-1 noch mit NKH 477 (ohne Cage-Gruppe) inkubiert worden waren, wurde keine Änderung der Ca2+-abhängigen Fluoreszenzemission gemessen.
Die Verwendung des JCF 1 ist universell für alle zell- sowie gewebebasierten Proben geeignet, bei denen die intrazelluläre cAMP Konzentration erhöht werden soll. Die Möglichkeit, die biologisch aktive Verbindung zu definierten Zeitpunkten und innerhalb der Zelle durch z.B. lokale Freisetzung mittels punktförmiger Belichtung zu aktivieren, hat große Vorteile gegenüber konventionellen Strategien, bei denen eine Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration z.B. über GPCR Signalwege, über die Stimulierung der Adenylylzyklasen mit z.B. NKH 477, oder die Inhibition zelleigener Phosphodiesterasen, die das cAMP zu AMP hydrolysieren, z.B. durch IBMX erfolgt. Bei den letztgenannten Verfahren kommt es immer zu Änderungen der cAMP Konzentration in der gesamten Zelle bzw. innerhalb des Zell- oder Gewebeverbandes. Der Einsatz der biologisch inaktiven Verbindung 1 ermöglicht darüber- hinaus die Kinetik zellulärer Prozesse, die durch die Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration gesteuert werden, mit hoher Zeitauflösung im Sub-Sekundenbereich zu erfas sen.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Cumarin-caged Forskolinderivats JCF 1 mit der Formel
gekennzeichnet durch die Schritte: a. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl me- thyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 mit der Formel
durch eine erste Carbamoylierung von 2,2,2-Trifluor-N-(2-methylamino-ethyl)- acetamid 5 und 6-Brom-7-methoxymethoxy cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl car- bonat 6, b. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- aminoethyl)(methyl)carbamat 3 mit der Formel
durch eine erste Entschützung von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H- chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4, c. Synthese von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- (((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 1 1 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy- 2,4al ,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano[3',2': 1 ,2]naphtho[l ,8-de] [1 ,3]dioxin- 11 - yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 gemäß der Formel
durch eine zweite Carbamoylierung von 7-Desacetylforskolin-6,7-carbonat 1,9- dimethylformamid dimethyl acetal 2 und (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H- chromen-4-yl)methyl (2-aminoethyl)(methyl)carbamat 3, d. Synthese von (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l lS,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7-
(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6-(dimethylamino)- 2,4al ,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano[3',2':l,2]naphtho[l,8-de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 gemäß der Formel durch eine Acetylierung von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methyl (2-(((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 11 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12- hydroxy-2,4al ,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano[3',2':l,2]naphtho[l,8-de][l,3]dioxin-l 1- yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7, e. Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7- (methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10,1 Ob-dihydroxy- 3, 4a, 7, 7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3-vinyldodecahydro- 1 H-benzo[f]chromen-5-yl.ace- tat 9 gemäß der Formel
durch eine zweite Entschützung von (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l lS,12S,12aR)-l 1- (((2-((((6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6-(dimethylamino)- 2,4al , 10, 10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano[3',2':l,2]naphtho[l,8-de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8, f. Synthese von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-hydroxy-2- oxo-2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10,1 Ob-dihydroxy-3 ,4a, 7, 7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3-vinyldodecahydro- 1 H- benzo[f]chromen-5-yl acetat (JCF 1) gemäß der Formel durch eine drite Entschützung von (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2- ((((6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10,1 Ob-dihydroxy- 3 ,4a, 7, 7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3 -vinyldodecahydro- 1 H-benzo [f]chromen-5 -yl ace- tat 9.
2. Verfahren nach Anspruch 1
dadurch gekennzeichnet, dass
die erste Carbamoylierung gemäß Schrit a. mit einem polar-aprotischen Lösemitel zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgefuhrt wird.
3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die erste Entschützung gemäß Schritt b. mit einer Base und einem wässrig- alkanolischen Lösemitel zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgefuhrt wird.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die zweite Carbamoylierung gemäß Schrit c. mit einem polar-aprotischen Lösemitel, einem Katalysator und einer Hilfsbase zwischen etwa 0 °C bis 10 °C durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Acetylierung gemäß Schritt d. mit einem polar-aprotischen Lösemittel und einem Acetylierungsreagenz zwischen etwa 0 °C bis 10 °C durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die zweite Entschützung gemäß Schritt e. mit einer organischen Säure und einem Alka- nol zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die dritte Entschützung gemäß Schritt f. mit einem Katalysator und mit einem unpolar- aprotischen Lösemittel zwischen etwa 10 °C bis 30 °C durchgefuhrt wird.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
in Schritt a. an Stelle von (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 zur Herstellung von JCF 1 das allgemeine Edukt (Pseudo)halogen-(methoxymethoxy-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methyl methyl(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)alkyl)carbamate mit der Formel
n = 1-5; R'= OH; R2 = F, CI, Br, I, CN, -N3, -OCN, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, - SeCN aus 2,2,2-Trifluor-N-(2-methylamino-alkyl)-acetamid und (Pseudohalogen)- methoxymethoxy cumarin-4-ylmethyl 4'-nitrophenyl carbonat synthetisiert wird zur Herstellung eines Cumarin-caged Forskolinderivat gemäß der allgemeinen Formel SeCN
9. Cumarin-caged Forskolinderivat gemäß der allgemeinen Formel
n = 1-5; R'= OH; R2 = F, CI, Br, I, CN, -N3, -OCN, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, - SeCN
10. Cumarin-caged Forskolinderivat (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6-(((2-((((6- Brom-7-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-4- yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 10b-dihydroxy- 3, 4a, 7, 7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3-vinyldodecahydro-l H-benzo[f]chromen-5-yl acetat (JCF 1) nach Anspruch 9 gemäß der Formel:
11. (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2- aminoethyl)(methyl)carbamat 3 gemäß der Formel
12. (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl methyl(2-(2,2,2- trifluoroacetamido)ethyl)carbamat 4 gemäß der Formel
13. (6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (2-
(((((2R,4aR,4al R,6S, 1 OaS, 11 S, 12S, 12aR)-6-(dimethylamino)- 12-hydroxy- 2,4al , 10,10, 12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano[3',2': l,2]naphtho[l,8-de][l,3]dioxin-l 1- yl)oxy)carbonyl)amino)ethyl)(methyl)carbamat 7 gemäß der Formel
14. (2R,4aR,4alR,6S,10aS,l l S,12S,12aR)-l l-(((2-((((6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-
2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)-6- (dimethylamino)-2,4al ,10,10,12a-pentamethyl-4-oxo-2-vinyldecahydro-2H,8H- pyrano[3',2':l,2]naphtho[l,8-de][l,3]dioxin-12-yl acetat 8 gemäß der Formel
15. (3R,4aR,5S,6S,6aS, 1 OS, 1 OaR, 10bS)-6-(((2-((((6-Brom-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H- chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)ethyl)carbamoyl)oxy)- 10, 1 Ob- dihydroxy-3 ,4a, 7, 7, 1 Oa-pentamethyl- 1 -oxo-3 -vinyldodecahydro- 1 H-benzo [f] chromen- 5-yl acetat 9 gemäß der Formel
16. Verwendung eines Cumarin-caged Forskolinderivats gemäß Anspruch 9 oder 10, bei der nach einer Bestrahlung mit Licht das Derivat in einer Photolyse zu Forskolin- carbamat 10, CO2 und dem entsprechenden Methylcumarinderivat gespalten wird.
17. Verwendung eines Cumarin-caged Forskolinderivats nach Anspruch 16,
zur Erhöhung der cAMP - Konzentration und Ca2+ Konzentration in zell- und gewebebasierten Proben.
18. V erwendung nach vorherigem Anspruch 16 oder 17,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Cumarin-caged Forskolinderivat in Zellen oder Gewebe eingebracht wird, und nach der Bestrahlung die Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration infolge der Erhöhung der cAMP Konzentration, die durch Bindung des biologisch aktiven Forskolin- carbamats 10 an endogen in den Zellen vorhandenen, membranständigen Adenylylzyk- lasen erfolgt, mit einem fluoreszenzbasierten Nachweisverfahren gemessen wird.
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