EP3924498A1 - Method for the biosynthesis of diosmin and/or hesperidin in a microorganism - Google Patents

Method for the biosynthesis of diosmin and/or hesperidin in a microorganism

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EP3924498A1
EP3924498A1 EP20703068.5A EP20703068A EP3924498A1 EP 3924498 A1 EP3924498 A1 EP 3924498A1 EP 20703068 A EP20703068 A EP 20703068A EP 3924498 A1 EP3924498 A1 EP 3924498A1
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EP
European Patent Office
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sequence
seq
exhibiting
polypeptides
activity
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Pending
Application number
EP20703068.5A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Cyrille PAUTHENIER
André Le Jeune
Hélène SCORNEC
Célia ROUSSEL
Laetitia JOUBERT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Laboratoires Servier SAS
Original Assignee
Laboratoires Servier SAS
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Publication date
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    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01006—Methionine adenosyltransferase (2.5.1.6), i.e. adenosylmethionine synthetase
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    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01023—Tyrosine ammonia-lyase (4.3.1.23)
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    • C12Y403/01024—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.24)
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    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03013—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3) dTDP-4-dehydrorhamnose 3,5-epimerase (5.1.3.13)
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    • C12Y602/01012—4-Coumarate-CoA ligase (6.2.1.12)
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing diosmin and hesperidin.
  • Dation is a mixture of flavonoids with vaso-tonic and vasculoprotective effects. This mixture is mainly composed of Diosmin ⁇ 85%, Hesperidin ⁇ 8% and traces of different flavones and their respective oxidized forms.
  • the current production method of the drug is the acid / base extraction from the peels of small oranges, a mixture of flavonoids containing mainly Hesperidin (94%) and a mixture of Isonaringine ( ⁇ 3%) , Neoponcirin ( ⁇ 2%) and Hesperetin ( ⁇ 1%). This mixture then undergoes controlled oxidation by a chemical process, transforming approximately 90% of the hesperidin into diosmin, and minority flavonoids in their oxidized form.
  • Daflon is linked to the supply of purified extract of orange flavonoids, which may vary due to climatic variations, fluctuations in currency prices and the difficulty of obtaining supplies from dozens of sites in several countries (mainly Mexico, Mediterranean Basin countries and China).
  • the inventors have developed a method for the biosynthesis of diosmin and hesperidin in a recombinant microorganism.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism comprising: a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding a glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0- rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or of diosmetin-7-O- glucoside; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose -reductase (RHM) capable
  • the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase is an enzyme from Citrus sinensis, Citrus clementina, Arubidopsis thaliana, Scuteiiaria baicolensis or Homo sapiens.
  • the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) can be an enzyme from Arabidopsis thaliana, Scuteiiaria baicolensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scuteiiaria baicolensis.
  • the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) is from Citrus sinensis or from Scuteiiaria baicolensis.
  • the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase can be selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone activity 7 -O-beta-D-glucosyltransferase.
  • enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity.
  • the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity
  • the 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT) is a plant enzyme, preferably of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus
  • the 6 "-O-rhamnosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-0-rhamnosyltransferase activity.
  • the 6" -0-rhamnosyltransferase is selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity.
  • UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM) is a plant enzyme, preferably from Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana.
  • UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase is selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP- activity glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
  • UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose activity 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
  • the microorganism according to the invention further comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL); and / or a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H);
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • CHS naringenin chalcone synthase
  • CH I chalcone isomerase
  • F3'H flavonoid 3'-monooxygenase
  • OMT O-methyltransferase
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine to L-Dopa and also p coumaric acid to caffeic acid; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a p-coumarate 3-hydroxylase capable of converting p-coumaric acid to caffeic acid.
  • the microorganism comprises
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity, and preferably a tyrosine ammonia lyase (TAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 123, 125, 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, and in particular a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95%
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53, 51, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, and preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
  • CHS chalcone synthase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 61 and 59 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity, and preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone isomerase activity.
  • CH I chalcone isomerase
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) from Callistephus chinensis, Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana, Pilosella officinarum, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Citrus clementina or Streptomyces avermitilis, in particular Callistephus chinensis, Perilla frutescens var.
  • F3'H flavonoid 3'-monooxygenase
  • an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from the enzymes of SEQ ID NOs: 7, 11, 17 , and 121 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 17, and 121 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • F3'H flavonoid 3'-monooxygenase
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT) of Citrus, in particular Citrus clementino or Citrus sinensis, Homo sapiens or Arabidopsis thaliana, preferably an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 119, 117, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting the O-methyltransferase activity.
  • OMT O-methyl-transferase
  • it comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 119, 117 and 89 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, preferably a sequence selected from SEQ ID NOs: 119 and 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity.
  • OMT O-methyl-transferase
  • the microorganism comprises
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65 and 77, preferably SEQ ID NOs: 65 and 77, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, and more particularly preferably a phenylalanine ammonia lyase (PAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • C4H a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; and very particularly preferably a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • the microorganism may further comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS), in particular a flavone synthase capable of producing luteolin from erodictyol, preferably from Arobidopsis thaliana, Petroselinum crispum, Zea mays, Lonicero japonica, Lonicera macranthoides, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussureo barorcatuarum, Scirrocirrinumus, Scirrushusellinum, Scirrocirratus, Saussureo barhusellinum, Scirrushirratus, Scirrushusellinum, Scirrushirratus, Scir
  • Flavone synthase can be selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 , 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity.
  • the FNS may be an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and presenting a flavone synthase activity, and preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity.
  • FNS flavone synthase
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • the CPR comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: 25, 23, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and in particular a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity.
  • the microorganism is a yeast or a bacterium, preferably a yeast of the genus Saccharomyces, in particular Saccharomyces cerevisiae, or a bacterium such as Escherichia coli.
  • the present invention also relates to the use of a microorganism as described in the present document for producing diosmin and / or hesperidin.
  • diosmin and / or hesperidin relates to a method of producing diosmin and / or hesperidin comprising culturing a microorganism as described herein, and optionally harvesting diosmin and / or hesperidin.
  • microorganism is meant a unicellular organism.
  • the microorganism is a bacterium or a yeast.
  • recombinant microorganism is understood a microorganism which is not found in nature and which contains a genome modified following an insertion, modification or deletion of one or more heterologous genetic elements.
  • nucleic acid is meant a nucleic acid which has been modified and does not exist in a naturally occurring microorganism.
  • this term can denote a coding sequence or gene which is operably linked to a promoter which is not the natural promoter. It can also refer to a coding sequence in which introns have been deleted for genes comprising exons and introns.
  • heterologous is understood that the gene has been introduced by genetic engineering into the cell. It can be present there in episomal or chromosomal form. The origin of the gene may be different from the cell into which it is introduced. However, the gene can also come from the same species as the cell into which it is introduced but it is considered heterologous due to its environment which is not natural.
  • the gene or nucleic acid sequence is heterologous because he / she is under the control of a promoter other than his / her natural promoter, he / she is introduced in a different place from this one where he / she is naturally located.
  • the host cell may contain a copy of the endogenous gene prior to the introduction of the heterologous gene or it may not contain an endogenous copy.
  • the nucleic acid sequence may be heterologous in the sense that the coding sequence has been optimized for expression in the host microorganism.
  • a heterologous nucleic sequence encodes a protein which is heterologous to the host cell, that is to say which is not naturally present in yeast.
  • the term "native" or "endogenous", relative to the host microorganism refers to a genetic element or protein naturally present in said microorganism.
  • gene denotes any nucleic acid encoding a protein.
  • the term gene encompasses DNA, such as cDNA or gDNA, as well as RNA.
  • the gene can first be prepared by recombinant, enzymatic and / or chemical techniques, and then replicated in a host cell or an in vitro system.
  • the gene typically comprises an open reading frame encoding a desired protein.
  • the gene may contain additional sequences such as a transcription terminator or a signal peptide. Due to the degeneration of the genetic code, several nucleic acids can encode a particular polypeptide.
  • the codons in the coding sequence for a given polypeptide can be altered such that optimal expression in a particular microorganism is obtained, for example by using codon translation tables appropriate for that microorganism.
  • Nucleic acids can also be optimized to a GC content preferable for the particular yeast and / or to reduce the number of repeat sequences.
  • the heterologous nucleic acids have been optimized by codon for expression in the relevant microorganism. Optimization of codons can be accomplished by routine methods known in the art (see, eg, Welch, M., et al. (2011), Methods in Enzymology 498: 43-66).
  • operably linked refers to a configuration in which a control sequence is placed at an appropriate position relative to a coding sequence, such that the control sequence directs expression of the coding sequence.
  • control sequences denotes the nucleic acid sequences necessary for the expression of a gene.
  • the control sequences can be native or heterologous. Control sequences well known and currently used by those skilled in the art will be preferred. Such control sequences include, but are not limited to, a leader, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a signal peptide sequence and a transcription terminator. Preferably, the control sequences comprise a promoter and a transcription terminator.
  • expression cassette denotes a nucleic acid construct comprising a coding region, ie a gene, and a regulatory region, ie comprising one or more control sequences. , linked in an operational manner. Preferably, the control sequences are suitable for the host microorganism.
  • the term "expression vector” refers to a DNA or RNA molecule which comprises an expression cassette.
  • the expression vector is a linear or circular double stranded DNA molecule.
  • the vector may further include an origin of replication, a selection marker, etc.
  • percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention, is meant a percentage of nucleotides or of identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed at random and over their entire length.
  • the best alignment or optimal alignment is the alignment for which the percentage identity between the two sequences to be compared, as calculated below, is the highest.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by comparison window to identify and compare the local regions of sequence similarity.
  • Alignment for the purpose of determining percent amino acid sequence identity can be accomplished in various ways which are well known in the art, for example using computer software available on the web on the Internet such as http: //blast.ncbi.nlm. Nih.gov/ or http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Those skilled in the art can determine the appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithm necessary to achieve maximum alignment along the length of the sequences being compared.
  • percent amino acid sequence identity values refer to values generated using the EMBOSS Needle pair sequence alignment program which creates an optimal overall alignment of two sequences.
  • all identity percentages mentioned in this application can be set at at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, preferably at least 90% identity, more preferably at at least 95% identity.
  • all the percentages of sequence identity of the enzymes are at least 80% or at least 85%, preferably at least 90% or at least 95%, are considered as described. sequence identity.
  • the polypeptides may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 additions, substitutions or deletions relative to the sequences described in SEQ ID Nos.
  • these additions, substitutions or deletions are introduced at the N-terminus, C-terminus or at both ends.
  • the polypeptides can optionally be in the form of a fusion protein.
  • overexpression and “increased expression” as used herein are used interchangeably and mean that the expression of a gene or an enzyme is increased relative to an unmodified microorganism, e.g. a wild-type microorganism or not comprising the genetic modifications described herein.
  • wild is meant an unmodified microorganism existing in nature.
  • the increased expression of an enzyme is usually achieved by increasing the expression of the gene encoding said enzyme.
  • the terms "overexpression” and “expression” can be used interchangeably.
  • a person skilled in the art can use all the known techniques such as increasing the number of copies of the gene in the microorganism, using a promoter inducing a high level of expression of the gene, that is, a strong promoter, using elements stabilizing the corresponding messenger RNA or ribosome binding site (RBS) sequestration sequences and surrounding sequences.
  • overexpression can be obtained by increasing the number of copies of the gene in the microorganism.
  • One or more copies of the gene can be introduced into the genome by recombination methods known to those skilled in the art, including gene replacement or multicopy insertion (see for example international patent application WO 2015/092013 ).
  • an expression cassette comprising the gene, preferably placed under the control of a promoter strong, is integrated into the genome.
  • the gene can be carried by an expression vector, preferably a plasmid, comprising an expression cassette with the gene of interest placed preferably under the control of a strong promoter.
  • the expression vector may be present in the microorganism in one or more copies, depending on the nature of the origin of replication.
  • Overexpression of the gene can also be achieved by using a promoter inducing a high level of expression of the gene.
  • the promoter of an endogenous gene can be replaced by a stronger promoter, that is to say a promoter inducing a higher level of expression.
  • heterologous nucleic acid The endogenous gene under the control of a promoter which is not the natural promoter is called heterologous nucleic acid.
  • Promoters suitable for use in the present invention are known to those skilled in the art and can be constitutive or inducible, and be endogenous or heterologous.
  • the microorganism according to the present invention can be a eukaryotic or prokaryotic microorganism.
  • the microorganism is a eukaryote.
  • it is a yeast of the order of Saccharomycetales, Sporidiobolales and Schizosaccharomycetales.
  • the yeast may for example be selected from Pichia, Kluyveromyces, Soccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, or Dehoryomyces.
  • the yeast is selected from Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Soccharomyces cerevisiae, Soccharomyces carlshergensis, Soccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Soccharomyces kluyveri, Soccharomyces kluyveriomyces, Schidaharomyces ovisoccyceshyceshyida, Soccisoccomyces norceshidomyces norcesidomyces norcesidaceshidomyces albida, Soccidaomyces albidae, Soccidaomyces albida, Soccidaomyces albidae Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Dehoryomyces hansenii and Lipomyces starkeyi.
  • the microorganism is a Saccharomyces yeast, preferably a Saccharomyces cerevisiae yeast.
  • the microorganism can be a fungus, from preferably a filamentous fungus. Preferably, it is chosen from Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochiobolus or Pyricularia.
  • the fungus is chosen from Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, and Trichoderma viride.
  • the microorganism is a prokaryote.
  • it is a bacterium, in particular chosen from among the phyla Acidohacteria, Actinobacteria, Aguificae, Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrutesobacteresobacteres, Firmicmatiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrutesobacteresobacteria, Firmicmatiae, Nectrobacteria, Nectarmatiae, Firmicmatiae, Chlorobi, , Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacter
  • the bacterium belongs to the genus Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Anaerobiospirillum, Aguifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chlororybacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatobacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatobacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatobacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatobacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatobacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatos, , Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geohacter, Gloeobacter, Glu
  • the bacterium is chosen from the species Agrobacterium tumefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aguifex aeolicus, Aguifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliguefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Closumrevibickiidium, Ammonium, Closumidicidium, Brevibacterium ammoniagenes, Closumrevibickiidium, Closumidicidium, Bacillus amyloliguefacins, Brevibacterium ammoniagenes, Closumidicidium, Brevibacterium ammoniagenes, Closumidicidium, Brevibacterium ammoniagenes, Closumidicidium, Brevibacterium, Clostricidium, Closumidium, Bacillus amyloliguefacins, Brevibacterium.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces venezuelae.
  • the microorganisms may have been modified to increase the production of tyrosine and / or phenylalanine, preferably tyrosine.
  • the genes responsible for the feedback inhibition of the production of tyrosine and / or phenylalanine, preferably tyrosine can be inactivated.
  • the pathway for the biosynthesis of tyrosine and / or phenylalanine, preferably tyrosine can be optimized, in particular by redirecting the flow of carbon from other metabolic pathways towards that of tyrosine and / or of phenylalanine, preferably tyrosine.
  • the microorganism produces significant amounts of tyrosine and / or phenylalanine, in particular from a simple carbon source such as glucose.
  • the recombinant microorganism according to the present invention has been modified to produce hesperidin and / or diosmin.
  • the microorganism has been modified to introduce the enzymes necessary for the glycosylation of hesperetin and / or diosmetin in position 7 and the transfer of a rhamnose in position 6 of glucose from hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside.
  • the recombinant microorganism is capable of producing hesperetin and / or diosmetin, in particular it has been modified for this purpose.
  • hesperetin and / or diosmetin can be supplied to the microorganism, for example by adding these compounds to the culture medium.
  • the microorganism produces hesperidin.
  • Diosmin can then be prepared from hesperidin by chemical conversion, in particular by oxidation.
  • the microorganism produces hesperidin and diosmin.
  • the recombinant microorganism comprises:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin;
  • UGT flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) capable of producing UDP-rhamnose.
  • flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT), 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT), and UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6 -deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM) are enzymes heterologous to the microorganism.
  • UGT is an enzyme which transfers glucose to position 7 of hesperetin and / or diosmetin.
  • the name of the UGT is UDP-glucose: flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase or flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase. It is also called by the following names: uridine diphosphoglucose-flavanone 7-0-glucosyltransferase, naringenin 7-O-glucosyltransferase, and hesperetin 7-O-glucosyl-transferase. This enzyme belongs to the class of EC 2.4.1.185.
  • the inventors had to identify and select enzymes capable of accepting hesperetin and / or diosmetin as a substrate and of adding glucose at position 7 of these compounds.
  • the enzyme is selected so as to exhibit a preference for glycosylation at the 7-position of hesperetin and / or diosmetin.
  • the enzyme is specific for the 7-position of hesperetin and / or diosmetin.
  • the microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and diosmetin.
  • UGT flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase
  • 7-O-beta-glycosyltransferase activity is meant a UGT enzyme capable of adding glucose at position 7 of a flavonoid.
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase enzyme in the presence of NAD ( P) H, O2, and of a flavonoid, under optimal conditions (pH, ions ...), and the observation in UPLC-MS and in comparison with the expected standard of the appearance of a flavonoid having a glucose additional at position 7.
  • the flavonoid is hesperetin or diosmetin and the flavonoid having additional glucose at position 7 is their form with additional glucose at position 7, i.e. hesperetin 7- O-glucoside and diosmetin 7-0 glucoside.
  • the enzyme is only present in higher eukaryotes, especially in plants.
  • the enzyme can be obtained from plants of the genus Citrus, in particular Citrus maxima, Citrus sinensis, Citrus ciementina, Citrus mitis and Citrus x paradisi, Lysium, in particular Lysium harharum, Petunia, in particular Petunia x hybrida, Arabidopsis, in especially Arabidopsis thaliana, or Scutellaria, in particular Scutellaria baicalensis.
  • the UGT is an enzyme from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens.
  • the UGT is an enzyme from Arabidopsis thaliana or from Scutellaria baicalensis.
  • the UGT is an enzyme from Citrus sinensis, Citrus ciementina, Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Citrus sinensis or Scutellaria baicalensis.
  • the UGT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, in particular with hesperetin and / or diosmetin as substrate.
  • the UGT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O activity -beta-D-glucosyltransferase.
  • the UGT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity
  • the UGT may be Arabidopsis tholiono.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers NM_119576 and N P_567955.1, respectively, and more particularly in SEQ ID NO: 91.
  • the protein is also described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number UGT73B1.
  • the UGT is Scutellario baicalensis.
  • the nucleic acid sequences encoding a first UGT and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KU712253 and AMK52071.1, respectively, and more particularly in SEQ ID NO: 93.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140DPB7.
  • the nucleic acid sequences encoding a second UGT and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KU712254 and AMK52072.1, respectively, and more particularly in SEQ ID NO: 95.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140DPB8.
  • nucleic acid sequences encoding a third UGT and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KU712255 and AMK52073.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 97.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140DPB9.
  • the UGT can be Homo sapiens.
  • the UGT is UGT1A6 (UDP glucuronosyltransferase family 1 member A6).
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P19224.
  • the consensus coding sequence is described in NCBI under the number CCDS2507.1.
  • the sequence of this enzyme is described in SEQ ID NO: 99.
  • the UGT is UGT1A7 (UDP glucuronosyltransferase family 1 member A7).
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9HAW7.
  • the consensus coding sequence is described in NCBI under the number CCDS2506.1.
  • the sequence of this enzyme is described in SEQ ID NO: 101.
  • the UGT can also be from Citrus, in particular from Citrus sinensis or Citrus clementina.
  • Citrus sinensis UGT is described in SEQ ID NO: 113.
  • a nucleotide sequence encoding this enzyme is described in SEQ ID NO: 114.
  • the Citrus clementina UGT is described in SEQ ID NO: 115.
  • a nucleotide sequence encoding this enzyme is described in SEQ ID NO: 116.
  • the UGT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity.
  • RhaT 6-O-rhamnosyltransferase
  • RhaT is an enzyme which carries out the transfer of u n rhamnose to the 6-position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside.
  • RhaT is a 6-0-rhamnosyltransferase. This enzyme belongs to the class of EC 2.4.1.B53. The inventors had to identify and select enzymes capable of accepting rhesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside as substrate and of adding a rhamnose at position 6 of the glucose of these compounds.
  • the microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7- O-glucoside.
  • RhaT 6-O-rhamnosyltransferase
  • This enzyme is only present in higher eukaryotes, especially in plants.
  • 6-O-rhamnosyltransferase activity is meant the addition of a rhamnose at position 6 of glucose by the enzyme RhaT.
  • an enzymatic test can be performed which consists of in vitro incubation of the 6-O-rhamnosyltransferase enzyme in the presence of NAD (P) H, O2, and of a flavonoid, under optimal conditions (pH, ions ...), and the observation in UPLC-MS and in comparison to the expected standard of the appearance of a flavonoid where a rhamnose is added at position 6 of the glucose .
  • the flavonoid is hesperetin 7-0-glucoside or diosmetin 7-O-glucoside and the flavonoid to which a rhamnose is added at position 6 of glucose are hesperidin and diosmin.
  • this enzyme is an enzyme produced by a plant of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably of the species Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina.
  • the enzyme is an enzyme from Citrus sinensis or Citrus clementina.
  • 6-O-rhamnosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting 6-O-rhamnosyltransferase activity.
  • the RhaT can be from Citrus clementina. It is described in the Genbank database of NCBI under the number XM_006420965 for the nucleic sequence and under the number XP_006421028 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 103. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number V4RJL6.
  • the RhaT can also be from Citrus sinensis. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ119035 for the nucleic sequence and under number ABA18631.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 105. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A7ISD3.
  • the RhaT is from Citrus sinensis and is an enzyme comprising the sequence SEQ ID NO: 105 or a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequenced therewith and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity.
  • the RhaT is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity.
  • RH M UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP- 4-keto-L-rhamnose-reductase
  • RHM is a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase trifunctional enzyme. This enzyme is able to produce UDP-rhamnose from UDP-glucose. This enzyme belongs to the class of EC 4.2.1.76. UDP-rhamnose is required for 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) activity.
  • the microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L -rhamnose-reductase (RHM) capable of producing UDP-rhamnose.
  • This enzyme is only present in higher eukaryotes, especially in plants.
  • UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity is meant the transformation of 'UDP-glucose to UDP-rhamnose.
  • a enzymatic test can be carried out which consists of the in vitro incubation of the UDP-glucose enzyme of NAD (P) H, O2, under optimal conditions (pH, ions ...), and observation in UPLC-MS and in comparison to the expected standard of the appearance of UDP-rhamnose.
  • this enzyme is an enzyme produced by a plant of the genus Citrus, in particular Citrus sinensis, or by Arabidopsis thaliana.
  • LIDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109, 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity.
  • RHM can be from Citrus sinensis. It is described in the NCBI Genbank database under the number XM_006477756 for the nucleic acid sequence and under the number XP_006477819.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 107.
  • RHM can also be Arabidopsis thaliana.
  • the protein is described in the Genbank database of NCBI under the number AY081471 for the nucleic sequence and under the number AAM10033.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 109.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9SYM5.
  • the protein is described in the NCBI Genbank database under the number AJ565874 for the nucleic acid sequence and under the number CAD92667.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 111.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9LPG6.
  • the RHM an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity.
  • the RHM is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity.
  • the recombinant microorganism comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis, preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransfera
  • UGT fla
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, of preferably a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting a 6-O-rhamnosyltransferase activity, and preferably an RhaT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransfera
  • the recombinant microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose- reductase (RHM) as defined in the previous embodiment and a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably from Arabidopsis thaliana or from Scutellaria baicalensis, preferably from flavanone 7-O-beta - D-glucosyltransferase (UGT) selected
  • the microorganism comprises
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from among SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta activity -D-glucosyltransferase, and more particularly preferably, selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a selected UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose- reductase from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose activity 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
  • the enzymes described above are enzymes from higher eukaryotes, preferably plant enzymes.
  • the enzymes originate from plants of the same genus, for example of the same species. Modifications allowing the production of hesperetin and / or diosmetin
  • either hesperetin and / or diosmetin are supplied to the microorganism, or the microorganism is capable of producing hesperetin and / or diosmetin.
  • the microorganism is, or has been, modified to be capable of producing hesperetin and / or diosmetin.
  • the inventors have therefore further developed a biosynthetic pathway allowing the microorganism to produce hesperetin and / or diosmetin.
  • Hesperetin and / or diosmetin can be obtained from naringenin and apigenin.
  • the flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) is an enzyme which carries out the addition of a hydroxyl group at the 3 'position of naringenin and / or apigenin. This enzyme belongs to the class of EC 1.14.14.82. It is also called flavone 3'-hydroxylase.
  • the inventors had to identify and select enzymes capable of accepting naringenin and / or apigenin as substrate and of adding a hydroxyl group at the 3 'position of these compounds.
  • the enzyme is selected so as to exhibit a preference for hydroxylation at the 3 'position of naringenin and / or apigenin.
  • the enzyme is specific for the 3 'position of naringenin and / or apigenin, in particular with respect to the 5' position in order to avoid double hydroxylation at the 3 'and 5 positions. ', and preferably also avoid hydroxylation at the 5' position.
  • the flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) is an enzyme which carries out the addition of a hydroxyl group at the 3 'position of naringenin and / or apigenin. This enzyme belongs to the class of EC 1.14.14.82. It is also called a flavonoid 3'-hydroxylase.
  • 3'-monooxygenase flavonoid activity is meant the transformation of a flavonoid into a 3 'hydroxylated flavonoid by an F3'H, CPR dependent enzyme.
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of the flavonoid 3 'monooxygenase enzyme in the presence of NAD (P) H, O2, and d 'a flavonoid, under optimal conditions (pH, ions, etc.), and observation in UPLC-MS and in comparison with the expected standard of the appearance of a 3'-hydroxylated flavonoid.
  • the flavonoid is naringenin or apigenin and the 3'-hydroxylated flavonoid is their 3'-hydroxylated form, i.e. Eriodictyol or Luteolin.
  • the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of adding a hydroxyl in position 3 'of naringenin and / or apigenin.
  • F3'H flavonoid 3'-monooxygenase
  • F3'H is a plant enzyme, in particular plants of the genus Allium, Arabidopsis, Brassica, Callistephus, Coiumnea, Citrus, Dianthus, Gentiana, Gerbera, Glycine, Fragaria, Ipomoea, Malus, Matthiola, Osteospermum , Oryza, Phanerochaete, Perilla, Petroselinum, Pelargonium, Pilosella, Petunia, Sinningia, Sorghum, Torenia, Vitis or Zea, for example of Allium cepa, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Coiumnea hybrida, Callistephus chinensis, Citrus sinensis, Dianthus clement caryophyllus, Fragaria vesca, Fragaria x ananassa, Gerbera hybrida, Glycine max, Gentiana triflora, Ipomoea nil, Ipomoe
  • F3'H is an enzyme from plants of the genus Allium, Brassica, Callistephus, Coiumnea, Citrus, Dianthus, Gentiana, Gerbera, Glycine, Fragaria, Ipomoea, Malus, Matthiola, Osteospermum, Oryza, Phanerochaete , Perilla, Petroselinum, Pelargonium, Pilosella, Petunia, Sinningia, Sorghum, Torenia, Vitis or Zea, for example of Allium cepa, Brassica napus, Coiumnea hybrida, Callistephus chinensis, Citrus sinensis, Citrus clementina, Dianthus caryophyllus, Fragaria vesca, Fragaria x
  • the F3′H is an enzyme from Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis, Citrus sinensis, Arahidopsis thaliana or Pilosella officinarum.
  • F3'H can be an enzyme from Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis and Pilosella officinarum.
  • F3'H is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 and 121, in particularly among SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 and 121, in particularly among SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the 3'-monooxygenase flavonoid activity, in particular with naringenin and / or apigenin as substrate and with hydroxylation at the 3 'position.
  • F3'H is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • F3'H is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 75, 80, 85 , 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • the F3′H can be an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 15, 80, 85, 90 or 95%, identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity
  • the F3'H may be from Perilla frutescens var. twitched.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB045593.1 and BAB59005.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 2 and 1.
  • the F3'H may be from Phanerochaete chrysosporium.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB597870.1 and BAL05157.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 4 and 3.
  • the F3'H can be from Petunia x hybrida.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AF155332.1 and AAD56282.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 6 and 5.
  • the F3'H may be from Callistephus chinensis.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AF313488.1 and AAG49298.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 8 and 7.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AF313489.1 and AAG49299.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 10 and 9.
  • the F3'H can be from Gerbera hybrida.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers DQ218417.1 and ABA64468.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 12 and 11.
  • the F3'H can be from Osteospermum hybrid cultivar.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers DQ250711.1 and ABB29899.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 14 and 13.
  • the F3'H can be from Citrus clementina.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers XM_006440673.1 and XP_006440736.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 16 and 15.
  • the F3'H can be from Citrus sinensis.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers XM_006477592.2 and XP_006477655.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 18 and 17.
  • the F3'H may be from Pilosella officinarum.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers DQ319866.2 and ABC47161.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 20 and 19.
  • the F3'H can be from Streptomyces avermitilis.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers SAV_4539 and WP_010985964.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 22 and 21.
  • the F3'H can be Arabidopsis thaliana.
  • a nucleic acid sequence encoding this enzyme and the protein sequence are described in NCBI under the reference numbers NM_120881.2 and N P_196416.1, respectively and more particularly in SEQ ID NOs: 122 and 121.
  • F3′H is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • F3′H is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121, and the polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%. , at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • F3′H is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7 and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • F3'H is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90 % or at least 95% identity of sequence with the sequence SEQ ID NO: 17, and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • F3'H is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85 %, at least 90% or at least 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 121, and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • F3′H is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 11 and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90 % or at least 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 11, and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
  • the flavonoid 3'-monooxygenase requires the presence of NADPH to effect the addition of the hydroxyl group.
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid encoding a cytochrome P450 reductase, a NADPH-cytochrome P450 reductase.
  • This enzyme belongs to the class of EC 1.6.2.4.
  • Cytochrome P450 reductase originates from a eukaryote, in particular from a yeast, for example of the genus Saccharomycetales, or from a plant, for example a plant of the genus Arabidopsis, Ammi, Avicennia, Comellia, Camptotheca, Cotharanthus, Citrus, Glycine, Heiianthus, Lotus, Mesembryanthemum, Phaseolus, Physcomitrella, Pinus, Populus, Ruta, Saccharum, Solanum, Vigna, Vitis or Zea.
  • the cytochrome P450 reductase originates from a eukaryote, for example from yeast, in particular from Saccharomyces cerevisiae, or from a plant, for example from Cotharanthus roseus or Arabidopsis thaliana.
  • cytochrome P450 reductase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity.
  • cytochrome P450 reductase can be selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity.
  • the cytochrome P450 reductase can be from Cathoronthus roseus. It is described in the NCBI Genbank database under the number X69791.1 for the nucleic acid sequence and under the number CAA49446.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 24 and 23, respectively. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q05001.
  • the cytochrome P450 reductase can be from Saccharomyces cerevisiae. It is described in the Genbank database of NCBI under the number N M_001179172.1 for the nucleic sequence and under the number N PJD11908.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 26 and 25, respectively. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P16603.
  • Cytochrome P450 reductase can be chimeric. It is described in the article Aigrain et al (2009, EM BO reports, 10, 742-747. The nucleic acid sequence encoding this enzyme and the protein sequence are described in SEQ ID Nos: 28 and 27, respectively.
  • the cytochrome P450 reductase can be from Arabidopsis thaliana.
  • cytochrome P450 comes from Arabidopsis thaliana, it can be called ATR. It is described in the Genbank database from NCBI under the number NM_118585.4 for the nucleic acid sequence and under the number N P_194183.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 30 and 29, respectively.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9SB48.
  • cytochrome P450 reductase can be from Arabidopsis thaliana and be described in the NCBI Genbank database under the number NM_179141.2 for the nucleic acid sequence and under the number N P_849472.2 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 32 and 31, respectively.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9SUM3.
  • a new copy of a coding sequence for CPR as defined above is introduced into the yeast.
  • the yeast is Saccharomyces cerevisiae and the CPR is from the same yeast, the promoter of the endogenous gene encoding CPR is replaced by a strong promoter.
  • the expression of CPR is increased compared to wild yeast; CPR is therefore overexpressed in modified yeast.
  • the F3′H and the CPR come from the same origin, the same species.
  • OMT O-methyltransferase
  • O-methyltransferases are a very large family of enzymes with targets that are difficult to pinpoint. The inventors had to identify and select O-methyltransferases capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position (para position).
  • the enzyme has been selected so as to exhibit a preference for methylation at the 4 'position of erodictyol and / or luteolin.
  • the enzyme is specific for the 4 'position of erodictyol and / or luteolin.
  • the methyl group introduced by the enzyme on erodictyol and / or luteolin is found in position 4 'in 60% of cases, the remainder being introduced in position 3', preferably in 70% of cases, and more preferably in 80% of cases.
  • 4'O-methyltransferase activity is meant the transformation of a 4'-hydroxyflavonoid into a 4'-methoxyflavonoid by a 4'-O-methyltransferase enzyme.
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme 4'-0-methyltransferase, a 4 ' - hyd roxy f I a vo n o ⁇ d e, of S-adenosyl-L-methionine, under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of 4'-methoxyflavonoid is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • the 4 '- h y d roxyf I a vo n o ⁇ d e is erodictyol or luteolin and will be transformed respectively into their 4'-methoxyflavonoid form, that is to say into hesperetin or into diosmetin.
  • the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 '.
  • This enzyme is only present in higher eukaryotes, especially in plants.
  • O-methyltransferase is an enzyme from Arabidopsis thaliana.
  • O-methyltransferase is from a higher eukaryote, preferably a mammal.
  • O-methyltransferase (OMT) is of human origin (Homo sapiens).
  • GOMT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in the 4 'position.
  • GOMT is selected from the enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity.
  • GOMT is selected from the enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO 87 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity.
  • OMT can be Arabidopsis thaliana.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers NM_118755.4 and N P_567739.1, respectively.
  • the protein is also described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9C5D7, and more particularly in SEQ ID No: 87.
  • GOMT is Homo sapiens.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers NM_007310.2 and N PJ309294.1, respectively.
  • the protein is also described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P21964, and more particularly in SEQ ID No: 89.
  • Homo sapiens OMT has the advantage of accepting erodictyol and luteolin as a substrate for methylation, while Arabidopsis thaliana GOMT has a strong preference for erodictyol. Conversely, if the synthesis of hesperetin is to be promoted by compared to that of diosmetin, OMT of Arabidopsis thaliana may have an advantage.
  • GOMT is an OMT of Citrus, in particular Citrus clementina or Citrus sinensis.
  • GOMT is selected from an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting O-methyl-transferase activity.
  • the OMT is selected from an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting the O-methyltransferase activity.
  • OMT is selected from an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting O-methyl-transferase activity.
  • the OMTs of Citrus and Arahidopsis thaliana described above have the advantage of specifically methylating erodictyol at the 4 'position.
  • the microorganism further comprises a heterologous or endogenous sequence encoding an enzyme synthesizing S-adenosyl-L-methionine, an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT).
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT), in particular capable of methylating erodictyol and / or luteolin at the 4 'position and a sequence of ′.
  • OMT O-methyl-transferase
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • the SAMT originate from a yeast, in particular from Saccharomyces cerevisiae, most particularly when the microorganism is a yeast.
  • S-adenosylmethionine synthetase is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity.
  • the S-adenosylmethionine synthetase can be from Saccharomyces cerevisiae. It is described in the NCBI Genbank database under the number NM_001180810.3 for the nucleic acid sequence and under the number NPJD10790.3 for the protein sequence. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P19358.
  • a new copy of a coding sequence for SAMT as defined above is introduced into the microorganism.
  • the microorganism is Saccharomyces cerevisiae
  • the promoter of the endogenous gene encoding SAMT is replaced by a strong promoter.
  • the expression of SAMT is increased compared to the wild microorganism; SAMT is therefore overexpressed in the modified microorganism.
  • the microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 'and a heterologous or endogenous sequence encoding a S-adenosylmethionine synthetase (SAMT) capable of producing S-adenosyl-L-methionine.
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • FNS Flavone synthase
  • Diosmetin can be produced from luteolin. It can also be obtained from erodictyol, either by transforming it into luteolin then by preparing diosmetin from luteolin, or by transforming it into hesperetin and then by preparing diosmetin from hesperetin.
  • the enzyme capable of converting erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin is a flavone synthase (FNS).
  • the flavone synthase is also capable of converting erodictyol into luteolin.
  • the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular a flavone synthase capable of to produce luteolin from erodictyol and / or diosmetin from hesperetin.
  • flavone synthase activity is meant the transformation of a flavanone into a flavone by an FNSI enzyme (independent CPR) or an FNSII (dependent CPR).
  • an enzymatic test can be performed which consists of in vitro incubation in the case of FNSI of a mixture composed of the enzyme flavone synthase (FNSI), a flavanone, 2-oxoglutarate, C> 2, under optimal conditions (pH, temperature, ions ...) and in the case of FNSII of a mixture composed of the FNSII enzyme, of a flavanone, of NAD (P) H, of 02, under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of the flavone corresponding to the flavanone is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • the flavanone is erodictyol or hesperetin and will be converted respectively into their flavone form, that is to say into luteolin or diosmetin.
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT), in particular capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 '; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular a flavone synthase capable of producing luteolin from erodictyol and / or diosmetin from hesperetin.
  • OMT O-methyl-transferase
  • the flavone synthase is an enzyme derived from plants, for example of the genus Aethusa, Angelica, Antirrhinum, Apium, Arabidopsis, Callistephus, Camellia, Conium, Cuminum, Cynara, Dahlio, Dorcoceras, Erythranthe, Lonicera, Medicago, Oryzo, Perilla , Petroselinum, Plectranthus, Populus, Saussurea, Scutellaria or Zea, in particular of the genus Arabidopsis, Lonicera, Medicago, Oryza, Petroselinum, Populus or Zea, in particular of Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Petrosum sativa, Oryza sativa , Populus deltoids, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveo
  • the flavone synthase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143 , 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavone synthase activity.
  • the flavone synthase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity.
  • the FNS is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity.
  • FNS flavone synthase
  • FNSI flavone synthase 1
  • FNSIII flavone synthase 2
  • the FNS is a type I flavone synthase. In another embodiment, the FNS is a type II flavone synthase. In a further embodiment, the microorganism comprises a type I flavone synthase and a type II flavone synthase.
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding type I flavone synthase (FNSI).
  • FNSI heterologous nucleic acid sequence encoding type I flavone synthase
  • FNSI can be a plant flavone synthase such as Petroselinum crispum, Oryza sativa, Populus delto ⁇ des, Medicago truncatula, Apium graveolens, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica orchangelica, or Conium maculatum, in particular from Petroselinum crispum, Populus deltiva, Medicago truncatula, preferably from Petroselinum crispum.
  • a plant flavone synthase such as Petroselinum crispum, Oryza sativa, Populus delto ⁇ des, Medicago truncatula, Apium graveolens, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica orchangelica, or Conium maculatum, in particular from Petroselinum crispum, Populus deltiva,
  • the FNSI can be an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 37, 127, 137, 141, 143 and 145 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity.
  • the FNSI can be an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence. and exhibiting flavone synthase activity.
  • the FNSI can be from Petroselinum crispum. It is described in the NCBI Genbank database under number AY817680.1 for the nucleic acid sequence and under number AAX21541.1 for the protein sequence. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q7XZQ8. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 37 and 38, respectively.
  • the FNSI can also be Angeüca orchongelica. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ683352.1 for the nucleic acid sequence and under number ABG78793.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 127 and 128, respectively.
  • FNSI can also be Apium graveolens. It is described in NCBI's Genbank database under number AY817676.1 for the nucleic acid sequence and under number AAX21537.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 137 and 138, respectively.
  • the FNSI can also be from Cuminum cyminum. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ683349.1 for the nucleic acid sequence and under number ABG78790.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 141 and 142, respectively.
  • the FNSI can also be Aethuso cynapium. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ683350.1 for the nucleic acid sequence and under number DQ683350.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 143 and 144, respectively.
  • the FNSI can also be from Conium maculatum. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ683354.1 for the nucleic acid sequence and under number ABG78795.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 145 and 146, respectively.
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a type II flavone synthase (FNSII).
  • FNSII can be a plant flavone synthase, for example of Arabidopsis thaliana, Zea mays, of the genus Lonicera such as for example Lonicera japonica and Lonicera mocronthoides, Callistephus chinensis, Medicago truncatula, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussureo medronthuso, Saussureo medronthuso barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceros hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii, in particular a flavone synthase of Arabidopsis thaliana, Zea mays or of the genus Lonicera such as for example Lonicera macranthoides and Loniceraides.
  • the genus Lonicera such as
  • the flavone synthase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 129, 131, 133, 135, 139, 147, 149, 151, 153, 155 , 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33 and 35 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Lonicera japonica.
  • the enzyme may be an enzyme described in the Genbank database of NCBI under the number KU127576.1 for the nucleic sequence and under the number AMQ91109.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQs. ID Nos: 34 and 33, respectively.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Lonicera macranthoides.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KU127580.1 and AMQ91113.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 36 and 35, respectively.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Cynara cardunculus var scolymus.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers JN825735.1 and AFG31000.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 130 and 129, respectively.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Perilla frutescens var crispa.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB045592.1 and BAB59004.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 132 and 131, respectively.
  • the FNS flavone synthase is FNSII from Dahlia pinnata.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB769842.1 and BAM72335.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 134 and 133, respectively.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Callistephus chinensis.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AF188612.1 and AAF04115.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 136 and 135, respectively.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Medicago truncatula.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers DQ354373.1 and ABC86159.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 140 and 139, respectively.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Camellia sinensis.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers FJ169499.1 and ACH99109.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 148 and 147, respectively.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Saussurea medusa.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KF170286.1 and AGV40781.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 150 and 149, respectively.
  • the FNS flavone synthase is FNSII from Plectranthus barbatus.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and sequences proteins are described in NCBI under the reference numbers KF606861.1 and AHJ89438.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 152 and 151, respectively.
  • the FNS flavone synthase is an FNSII from Scutellaria boicalensis.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KT963454.1 and AMW91729.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 154 and 153, respectively.
  • the FNS flavone synthase is FNSII from Dorcoceras hygrometricum.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KV013332.1 and KZV23934.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 156 and 155, respectively.
  • the FNS flavone synthase is FNSII from Antirrhinum majus.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB028151.1 and BAA84071.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 158 and 157, respectively.
  • the FNS flavone synthase is FNSII from Erythronthe lewisii.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KX710102.1 and AOR81894.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 160 and 159, respectively.
  • the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a type II flavone synthase (FNSII) and a type I flavone synthase, for example a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 129, 131, 133, 135, 139, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity and an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 37, 127, 137, 141, 143 and 145 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity, preferably a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33 and 35 and polypeptides comprising a sequence having at least 60
  • FNS type II, FNSII requires the presence of cytochrome P450 reductase (CPR). If the microorganism does not include cytochrome P450 reductase, it will therefore be necessary to introduce a heterologous cytochrome P450 reductase. If the microorganism already includes one, it is possible to consider either the overexpression of an endogenous cytochrome P450 reductase (for example by replacing the promoter with a strong promoter or by adding one or more copies of the coding sequence) or also introduce a heterologous cytochrome P450 reductase.
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • the type II FNS and the CPR come from the same origin, the same species.
  • the microorganism preferably comprises the enzymes allowing the production of the hesperitin and / or diosmetin from naringenin and / or apigenin.
  • the recombinant microorganism comprises:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, from Citrus sinensis, from Citrus clementino, from Scutellaria hoicalensis or from Homo sapiens, preferably from Citrus sinensis or from Scutellaria baicalensis; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) capable of producing UDP-rhamnose; preferably an RHM of Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto- L-rhamnose reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107
  • an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 1, 9, 11, 13, 15, 17 , 19, 21 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with one of these sequences and exhibiting flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70,
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaiiana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • OMT O-methyltransferase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaiiana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and a methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117, 119 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with one of these sequences
  • the recombinant microorganism comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arobidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a n rhamnose to the 6 position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside; preferably a RhaT of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably a 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a selected sequence from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 6-O-rhamnosyltransferase activity;
  • RhaT 6-O-rhamnosyltransfer
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) capable of producing UDP-rhamnose; preferably an RHM of Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably a RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting activity UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs:
  • an F3′H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from among enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaliana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • OMT O-methyltransferase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaliana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; and
  • the microorganism comprises - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-0-beta-D-glucosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, and very particularly preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose - reductase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting activity UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and very particularly preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO : 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 'and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and a methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity; and
  • O-methyltransferase O-methyltransferase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of producing a flavone from a flavanone, in particular capable of transforming naringenin into apigenin, and / or erodictyol into luteolin, of preferably transforming erodictyol into luteolin and comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting flavone synthase activity.
  • FNS flavone synthase
  • the microorganism comprises each of these heterologous nucleic acid sequences.
  • the recombinant microorganism comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin;
  • UGT flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to the 6-position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside ;
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) capable of producing U DP-rhamnose;
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin;
  • F3′H flavonoid 3′-monooxygenase
  • heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position;
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of producing a flavone from a flavanone, in particular capable of transforming naringenin into apigenin, erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin , preferably to convert erodictyol to luteolin.
  • FNS flavone synthase
  • the recombinant microorganism further comprises a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT), in particular from Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity.
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • Each enzyme can be chosen from the enzymes described above.
  • naringenin and apigenin are known in plants, in particular from glucose, tyrosine or phenylalanine.
  • Microorganisms notably E. coli and Saccharomyces cerevisiae, have been modified to produce naringenin and / or and apigenin (Hwang El, et al. 2003. Appl Environ Microbiol. 2003, 69 (5): 2699-2706 ; Jiang Hl, et al. 2005. Appl Environ Microbiol. 2005, 71 (6): 2962-9; Pandey et al, 2016, Biotechnol Adv., 34, 634-662).
  • naringenin and apigenin can be that described in Figure 1.
  • the microorganism comprises the enzymes necessary for the synthesis of naringenin and / or apigenin from tyrosine. In a second embodiment, the microorganism comprises the enzymes necessary for the synthesis of naringenin and / or apigenin from phenylalanine.
  • the microorganism comprises the enzymes necessary for the synthesis of naringenin and / or apigenin from tyrosine and phenylalanine.
  • TAL is a tyrosine ammonia lyase. This enzyme is able to produce p-coumaric acid from tyrosine. This enzyme belongs to the class of EC 4.3.1.23.
  • phenylalanine ammonia lyase activity is meant the transformation of phenylalanine into frans-cinnamic acid by an enzyme Phenylalanine ammonia lyase.
  • Phenylalanine ammonia lyase activity an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme phenylalanine ammonia lyase and phenylalanine under optimal conditions (pH, temperature , ions ). After a certain incubation time, the appearance of trans-cinnamic acid is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • a tyrosine ammonia lyase can also exhibit a phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity as defined above and / or a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL) activity.
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase.
  • this enzyme is an enzyme produced by a bacterium of the genus Rhodobacter or a bacterium of the genus Flavobacteriaceae.
  • this enzyme is produced by a bacterium Rhodobacter capsulatus, or Rhodobacter sphaeroides.
  • this enzyme is produced by a Flavobacterium johnsoniae bacterium.
  • this enzyme is an enzyme produced by a yeast, in particular a yeast of the genus Rhodotorula, for example Rhodotorula glutinis.
  • Other organisms also produce such an enzyme, for example Camellia sinensis, Fragaria x ananassa, Ralstonia metallidurans, or Zea mays.
  • tyrosine ammonia lyase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 39 and 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with one of these sequences and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity.
  • the TAL is from Flavobacterium johnsoniae. It is described in the Genbank database from NCBI under the number KR095306.1 for the nucleic acid sequence and under the number AKE50827.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 40 and 39.
  • the TAL is from Rhodotorula glutinis. It is described in the Genbank database of NCBI under the number KF765779.1 for the nucleic acid sequence and under the number AGZ04575.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 42 and 41, respectively.
  • the tyrosine ammonia lyase is selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity.
  • 4CL 4-Coumarate-CoA ligase
  • 4CL is a 4-coumarate-CoA ligase. This enzyme is able to produce 4-coumaroyl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A and to produce caffeoyl-CoA from caffeic acid and Coenzyme A. This enzyme belongs to the class of EC 6.2.1.12.
  • 4-coumarate-CoA ligase activity is meant the conversion of p-coumaric acid to p-coumaroyl-CoA or caffeic acid to caffeoyl-CoA by a 4-coumarate CoA ligase enzyme.
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme 4-coumarate-CoA ligase, acid p -coumaric or caffeic acid, ATP and CoA under optimal conditions (pH, temperature, ions ).
  • the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase.
  • this enzyme is an enzyme produced by a plant, for example Abies, Arabidopsis, Agastache, Amorpho, Brassica, Citrus, Cathayo, Cedrus, Crocus, Larix, Festuca, Glycine, Jugions, Keteleeria, Lithospermum, Lolium, Lotus, Lycopersicon , Molus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Nothotsuga, Oryza, Phaseolus, Pelargonium, Petroselinum, Physcomitrella, Piceo, Prunus, Pseudolarix, Pseudotsuga, Roso, Rubus, Ryzo, Saccharum, Suaeda, Pi nus, Populus, Solanum, Tritellicung Tsuga, Vitis or Zea.
  • a plant for example Abies, Arabidopsis, Agastache, Amorpho, Brassica, Citrus, Cathayo, Cedrus, Crocus, La
  • this enzyme is an enzyme produced by a microorganism, for example Aspergillus, Mycosphaerella, Mycobacterium, Neisseria, Neurospora, Streptomyces, Rhodobacter or Yarrowia.
  • a microorganism for example Aspergillus, Mycosphaerella, Mycobacterium, Neisseria, Neurospora, Streptomyces, Rhodobacter or Yarrowia.
  • this enzyme is an enzyme produced by a plant, preferably Arabidopsis thaliana, Citrus clementina or Petroselinum crispum, in particular Arabidopsis thaliana or Petroselinum crispum, or by a bacterium, preferably of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces clavuligerus.
  • the 4-coumarate-CoA ligase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47, 49, 123 and 125 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity.
  • 4-coumarate-CoA ligase is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 43, 45, 47 and 49, preferably SEQ ID NOs: 45 and 49, and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity.
  • the 4CL is Arabidopsis tholiana. It is described in the Genbank database from NCBI under the number AY099747.1 for the nucleic sequence and under the number AAM20598.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 44 and 43, respectively.
  • the 4CL is from Petroselinum crispum. It is described in the NCBI Genbank database under number X13324.1 or X13325.1 for the nucleic acid sequence and under the number CAA31696.1 or CAA31697.1 for the protein sequence, respectively.
  • the proteins are described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P14912 and P14913, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 46 and 45, and 48 and 47, respectively.
  • 4CL is from Petroselinum crispum and is described in the Genbank database of NCBI under the number X13324.1 for the nucleic sequence and under the number CAA31696.1 for the protein sequence, and in UniProtKB / Swiss Prot under the number reference number P14912, and more particularly in SEQ ID Nos: 46 and 45, respectively.
  • the 4CL is from Streptomyces clavuiigerus. It is described in the Genbank database of NCBI under the number CP016559.1 for the nucleic sequence and under the number ANW18832.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 50 and 49, respectively.
  • the 4CL is Arabidopsis tholiana.
  • a nucleotide sequence as well as the protein sequence of this enzyme are described respectively in SEQ ID NOs: 124 and 123.
  • the 4CL is from Citrus clementina and a nucleotide sequence as well as the protein sequence of this enzyme are described respectively in SEQ ID NOs: 126 and 125.
  • 4CL is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 45, 123 and 125, preferably SEQ ID NOs: 123 and 45, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity.
  • 4CL is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequenced and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity.
  • CHS is a chalcone synthase.
  • This enzyme is able to produce naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA and to produce erodictyol-chalcone from caffeoyl-CoA and malonyl-CoA.
  • This enzyme belongs to the class of EC 2.3.1.74.
  • chalcone synthase activity is meant the transformation of p-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA ⁇ to naringenin chalcone or of caffeoyl-CoA and malonyl-CoA-to eriodictyol chalcone by a chalcone synthase enzyme.
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme Chalcone synthase, coumaroyl-CoA or caffeoyl-CoA and malonyl -CoA under optimal conditions (pH, temperature, ions ). After a certain incubation time, the appearance respectively of Naringenin chalcone or erodictyol chalcone is observed in HPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • the microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase.
  • This enzyme can be an enzyme produced by a plant, in particular of the genus Arabidopsis, Aveno, Cosmos, Citrus, Daucus, Fagopyrum, Freesia, Glycine, Glycyrrhiza, Humulus, Hypericum, Flordeum, Jugions, Medicogo, Phaseolus, Physcomitrella, Plagiochasmo, Petroselinum, Pueraria, Rubus, Secale, Scutellaria, Silene, Sinopis, Spinacia, Stellaria, Triticum, Tulipa, Verbeno, Vitis, or Xanthisma, e.g.
  • this enzyme is an enzyme produced by a plant, for example of the genus Citrus, in particular Citrus sinensis, or of Hordeum vulgare, or by a bacterium, preferably of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces clavuligerus.
  • the chalcone synthase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity.
  • the chalcone synthase is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity.
  • the CHS is from Hordeum vulgare. It is described in the Genbank database of NCBI under the number Y09233.1 for the nucleic acid sequence and under the number CAA70435.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 52 and 51, respectively.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q96562.
  • the CHS is from Citrus sinensis. It is described in the Genbank database from NCBI under the number AB009351.1 for the nucleic acid sequence and under the number BAA81664.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 54 and 53, respectively.
  • the CHS is from Citrus sinensis. It is described in the Genbank database of NCBI under the number XM_006489733.1 for the nucleic sequence and under the number XPJD06489796.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 56 and 55, respectively.
  • the CHS is from Streptomyces clavuligerus. It is described in the Genbank database from NCBI under the number CP016559.1 for the nucleic sequence and under the number ANW16917.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 58 and 57, respectively.
  • the microorganism can be modified to increase the synthesis of malonyl-CoA.
  • CHI is a chalcone isomerase. It is able to produce naringenin from Naringenin chalcone and produce eriodictyol from eriodictyol chalcone. This enzyme belongs to the class of EC 5.5.1.6.
  • Chalcone isomerase activity is meant the transformation of naringenin chalcone or erodictyol chalcone into naringenin or eriodictyol by a chalcone isomerase enzyme.
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme Chalcone isomerase, naringenin chalcone or erodictyol chalcone under optimal conditions. (pH, temperature, ions ). After a certain incubation time, the appearance of Naringenin or erodictyol respectively is observed in H PLC-MS compared to the expected standard.
  • the microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase.
  • This enzyme can come from a plant, in particular of the genus Arabidopsis, Ginkgo, Oncidium, Perilla, Citrus or Trigoneiia, for example Arabidopsis thaliana, Ginkgo biloba, Oncidium Gower Ramsey, Perilla frutescens, Citrus Sinensis or Trigoneiia foenum-graecum.
  • this enzyme is an enzyme produced by a plant, for example Arabidopsis thaliana or by a bacterium, preferably of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces clavuligerus.
  • the chalcone isomerase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 59 and 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity.
  • the chalcone isomerase is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone isomerase activity.
  • the CH I is from Streptomyces clavuligerus. It is described in the Genbank database of NCBI under the number CP016559.1 for the nucleic acid sequence and under the number ANW16918.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 60 and 59, respectively.
  • the CHI is Arabidopsis thaliano. It is described in the Genbank database of NCBI under the number N M_115370.4 for the nucleic acid sequence and under the number NP_191072.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 62 and 61, respectively.
  • FNS Flavone synthase
  • Apigenin can be prepared from naringenin using a flavone synthase (FNS). It is able to produce apigenin from naringenin.
  • FNS flavone synthase
  • the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular capable of producing apigenin from naringenin and / or a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular capable of producing luteolin from erodictyol, and / or a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular capable of producing diosmetin from hesperetin.
  • the SNSF can be chosen from those described above.
  • the microorganism can also comprise the enzymes necessary for the synthesis of p-coumaric acid from phenylalanine.
  • the microorganism may further comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H).
  • PAL belongs to the class of EC 4.3.1.24. It is able to produce cinnamic acid from phenylalanine.
  • phenylalanine ammonia lyase activity is meant the transformation of phenylalanine into frans-cinnamic acid by an enzyme Phenylalanine ammonia lyase.
  • Phenylalanine ammonia lyase activity an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme phenylalanine ammonia lyase and phenylalanine under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.) ⁇ After a certain incubation time, the appearance of trans-cinnamic acid is observed in UPLC-MS compared to the expected standard.
  • the enzyme is from a plant, for example a plant of the genus Arobidopsis, Agastache, Ananas, Asparagus, Brassica, Bromheadia, Bambusa, Beta, Betula, Citrus, Cucumis, Came Ilia, Capsicum, Cassia, Catharanthus, Cicer , Citrullus, Coffea, Cucurbita, Cynodon, Daucus, Dendrobium, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Eucalyptus, Gallus, Ginkgo, Glycine, Hordeum, Helianthus, Ipomoea, Lactuca, Lithospermum, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Eucalyptus, Gallus, Ginkgo, Glycine, Hordeum, Helianthus, Ipomoea, Lactuca, Lithospermum, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Eucalyptus, Gallus, Ginkgo, Gly
  • phenylalanine ammonia lyase may further exhibit tyrosine ammonia lyase (TAL) activity and / or dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL) activity as described below.
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • the phenylalanine ammonia lyase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity.
  • PAL is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 65 and 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity.
  • PAL is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity.
  • the PAL of Citrus sinensis is described in the Genbank database of NCBI under the number XM_006481431.2 for the nucleic sequence and under the number XP_006481494.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQs ID Nos: 64 and 63, respectively.
  • the PAL of Citrus sinensis is described in the Genbank database of NCBI under the number XM_006488000.2 for the nucleic acid sequence and under the number XP_006488063.1 for the protein sequence, and more particularly in the SEQ ID Nos: 66 and 65, respectively.
  • the PAL of Arabidopsis tholiona is described in the Genbank database of NCBI under the number NM_115186.4 for the nucleic sequence and under the number N P_190894.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 78 and 77, respectively.
  • PTAL phenylalanine / tyrosine ammonia lyase
  • C4H belongs to the class of EC 1.14.13.11. It is able to produce p-coumaric acid from cinnamic acid.
  • trans-cinnamate 4-monooxygenase activity is meant the conversion of trans-cinnamic acid to p-coumaric acid by a trans-cinnamate 4-monooxygenase (CPR dependent) enzyme.
  • CPR dependent trans-cinnamate 4-monooxygenase activity
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme trans-cinnamate 4-monooxygenase, cinnamic acid , NADPH, H + and O2 under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of 4-hydroxycinnamate (p-coumaric acid) is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • the enzyme is from a plant, for example a plant of the genus Arobidopsis, Ammi, Avicennia, Camellia, Camptotheca, Catharanthus, Citrus, Glycine, Helianthus, Lotus, Mesembryanthemum, Physcomitreila, Phaseoius, Pi nus, Populus, Ruta , Saccharum, Solonum, Vitis, Vigna or Zea.
  • the cinnamate 4-hydroxylase (C4H) is from Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana.
  • the cinnamate 4-hydroxylase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
  • C4H is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
  • the C4H of Citrus sinensis is described in the Genbank database of NCBI under the number NMJD01288840.1 for the nucleic sequence and under the number NP_001275769.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQs. ID Nos: 68 and 67, respectively.
  • the C4H of Citrus sinensis is described in the Genbank database of NCBI under the number NM_001288895.1 for the nucleic sequence and under the number NP_001275824.1 for the protein sequence, and more particularly in the SEQ ID Nos: 70 and 69, respectively.
  • the C4H of Arabidopsis thaliana is described in the Genbank database of NCBI under the number NM_128601.3 for the nucleic sequence and under the number N P_180607.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 80 and 79, respectively.
  • the biosynthesis of erodictyol can also comprise the synthesis of L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) from tyrosine followed by caffeic acid from L -DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine).
  • L-DOPA 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine
  • caffeic acid L -DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine).
  • the following enzymes are required.
  • To convert tyrosine to L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) two subunits are needed, HpaB and HpaC.
  • HpaB is a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit.
  • this enzyme is an enzyme produced by a bacterium, preferably Escherichia coii.
  • 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase activity.
  • the HpaB is from Escherichia coli. It is described in the Genbank database of NCBI under the number CAQ34705.1 for the protein sequence, and more particularly in the sequence SEQ ID No: 83. A nucleic sequence encoding this enzyme is described in the sequence SEQ ID No: 84. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140NG21.
  • HpaC is a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase subunit.
  • the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC) subunit.
  • p-coumarate 3 hydroxylase activity is meant the conversion of p-coumaric acid to caffeic acid and / or L-tyrosine to L-Dopa using an enzyme complex composed of HpaB (4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase oxidase) and HpaC (4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase reductase).
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzymes HpaB, HpaC, p-coumaric acid or L- Tyrosine, FAD and NADH under optimal conditions (pH, temperature, ions ). After a certain incubation time, the appearance of caffeic acid or L-Dopa is observed by HPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • this enzyme is an enzyme produced by a bacterium, preferably Escherichia coli.
  • HpaC 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase
  • SEQ ID NO: 85 is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase activity.
  • the HpaC is from Escherichia coli. It is described in the Genbank database of NCBI under the number CAQ34704.1 for the protein sequence, and more particularly in the sequence SEQ ID No: 85. A sequence nucleic acid encoding this enzyme is described in the sequence SEQ ID No: 86. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140NG67. Together, HpaB and HpaC are able to produce L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) from tyrosine.
  • the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) and a heterologous nucleic acid sequence encoding 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC).
  • HpaB 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase
  • HpaC 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase
  • this route also requires the presence of an enzyme capable of synthesizing caffeic acid from L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL).
  • L-DOPA 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • dihydroxyphenylalanine ammonia lyase activity is meant the conversion of L-Dopa to trans-caffeic acid by a dihydroxyphenylalanine ammonia lyase enzyme.
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme dihydroxyphenylalanine ammonia lyase and L-dopa (levodopa) under the conditions optimal (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of trans-caffeic acid is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • the microorganism can thus comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit, a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase subunit ( HpaC) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL).
  • HpaB 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase
  • HpaC 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase subunit
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • an enzyme for converting tyrosine into L-Dopa and an enzyme for converting p-coumaric acid into acid caffeic. It is respectively a 4-methoxybenzoate O-demethylase, also called 4-methoxybenzoate monooxygenase (O-demethylant) which has the L-tyrosine hydroxylase activity belonging to the class of EC 1.14.99.15 and a p- coumarate-3-hydroxylase possessing p-coumarate 3-hydroxylase activity belonging to the class of EC 1.14.13.
  • O-demethylase also called 4-methoxybenzoate monooxygenase (O-demethylant) which has the L-tyrosine hydroxylase activity belonging to the class of EC 1.14.99.15 and a p- coumarate-3-hydroxylase possessing p-coumarate 3-hydroxylase activity belonging to the class of EC 1.14.13.
  • L-tyrosine hydroxylase activity is meant the conversion of p-coumaric acid to caffeic acid and / or L-tyrosine to L-Dopa using a p-coumarate 3 hydroxylase (CPR dependent) enzyme.
  • CPR dependent p-coumarate 3 hydroxylase
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme p-coumarate 3 hydroxylase, p-coumaric acid or of L-Tyrosine, the necessary co-factors under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of caffeic acid or L-Dopa is observed by HPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • p-coumarate 3 hydroxylase activity is meant the conversion of p-coumaric acid to caffeic acid and / or L-tyrosine to L-Dopa using a p-coumarate 3 hydroxylase (CPR dependent) enzyme.
  • CPR dependent p-coumarate 3 hydroxylase
  • an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme p-coumarate 3 hydroxylase, p-coumaric acid or L-Tyrosine, under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of caffeic acid or L-Dopa is observed by HPLC-MS in comparison with the expected standard.
  • the recombinant microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase (CYP) capable of converting tyrosine into L-Dopa and also p coumaric acid into caffeic acid.
  • CYP 4-methoxybenzoate O-demethylase
  • 4-methoxybenzoate O-demethylase is an enzyme from bacteria, in particular from Rhodopseudomonas palustris, Pseudomonas putida, or Escherichia coli, from plants, in particular from Beta vulgaris, from mammals, in particular from Oryctolagus cunicuius, or from fungus, especially Rhodotorula glutinis.
  • 4-methoxybenzoate O-demethylase is an enzyme from Rhodopseudomonas palustris, Saccharothrix espanaensis, or Beta vulgaris.
  • 4-methoxybenzoate O-demethylase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 73 and 75 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting L-tyrosine hydrolase activity.
  • the 4-methoxybenzoate O-demethylase can also be from Beta vulgaris.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in SEQ ID Nos: 74 and 73, respectively.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss P rot under the reference number P0DKI2.
  • the 4-methoxybenzoate O-demethylase can be from Saccharothrix espanaensis.
  • the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers NC_005296.1 and WP_011157377.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 76 and 75.
  • the protein is described in UniProtKB / Swiss P rot under the reference number Q6N8N2.
  • the microorganism may include a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase and a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL).
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • the recombinant microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a coumarate 3-hydroxylase (Coum3H) capable of converting p-coumaric acid into caffeic acid.
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a coumarate 3-hydroxylase (Coum3H) capable of converting p-coumaric acid into caffeic acid.
  • the coumarate 3-hydroxylase is an enzyme from bacteria, in particular from Saccharothrix,
  • the 4-methoxybenzoate O-demethylase is selected the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 71 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting coumarate 3-hydroxylase activity.
  • nucleic acid sequence encoding this enzyme and protein sequence is described in NCBI under the reference numbers DQ357071.1 and ABC88666.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 72 and 71.
  • the microorganism may comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a coumarate 3-hydroxylase and a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL). Additional enzyme combination
  • the microorganism preferably comprises the enzymes allowing the production of naringenin and / or or apigenin from tyrosine and / or phenylalanine, preferably from tyrosine.
  • the microorganism comprises
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding a glucose in position 7 of hesperetin and / or diosmetin,
  • UGT flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O- glucoside,
  • RhaT rhamnosyltransferase
  • O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 '
  • heterologous nucleic acid sequence encoding an FNS enzyme and a heterologous nucleic acid sequence encoding a CPR enzyme and further comprises
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • CL 4-coumaroyl-CoA ligase
  • CHS chalcone synthase
  • CHI chalcone isomerase
  • the microorganism comprises
  • OMT O-methyltransferase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 '; preferably an OMT from Citrus clementina, Citrus sinensis, Arahidopsis tholiano or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and a methylation in position 4 ', preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95%
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of hydroxylating naringenin and / or apigenin in position 3 'and comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the '3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, and very particularly preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7, and polypeptides
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and in particular from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 41 and 39 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity
  • TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) of Citrus sinensis, of Hordeum vulgore or of Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53, 51, 55 and 57 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I) of Arabidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus in particular a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 61 and 59 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity; preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity .
  • CH I chalcone isomerase
  • the microorganism comprises one of the combinations of UGT, RhaT and RHM enzymes described above, in particular
  • - flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; and
  • UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase selected from enzymes comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP activity -4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
  • the microorganism further comprises
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65 and 77, preferably SEQ ID NOs: 65 and 77, and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, and more particularly preferably a phenylalanine am monia lyase (PAL) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • C4H a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; and very particularly preferably a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • the microorganism comprises: - a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, and very particularly preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; and
  • OMT O-methyltransferase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of hydroxylating naringenin and / or apigenin in position 3 'and comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the activity flavonoid 3'-monooxygenase, preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at less 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably chosen from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity; and
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • chalcone synthase comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
  • CHI chalcone isomerase
  • the microorganism comprises one of the combinations of UGT, RhaT and RHM enzymes described above, in particular
  • flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; and
  • UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase selected from enzymes comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP activity -4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
  • the microorganism further comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) as described. in the previous embodiment.
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • the microorganism further comprises a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT); in particular of Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity.
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • the microorganism comprises:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis, preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus ciementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus ciementina, preferably a 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-O-rhamnosyltransferase activity, and preferably an RhaT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltrans
  • keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var.
  • an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19 and 21 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably selected from among enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and having a flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus rose us or of Arabidopsis thaliana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, in particular a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaliana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; optionally, a heterologous or endogenous nucleic acid sequence en
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin to apigenin, erodictyol to luteolin and / or hesperetin to diosmetin, preferably of converting eriodictyol to luteolin; preferably an SNF of Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Pop u lus delto ⁇ des, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminapelium, Aethusa cynica Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea formuladusa, Plectrant
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A; preferably Arabidopsis thaliana, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA activity ligase;
  • 4CL 4-coumarate-CoA ligase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA; preferably from Citrus sinensis, from Hordeum vulgare or from Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, and more particularly preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptid
  • the microorganism comprises the heterologous nucleic acid sequences encoding the enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS, CHI, and optionally for the enzymes CPR, FNS and SAMT , as described in the previous embodiment and further comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity, in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase
  • the microorganism comprises the heterologous nucleic acid sequences encoding the enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, O MT, 4CL, CHS, CHI, and optionally for the enzymes CPR, FNS and SAMT, as described in the previous embodiment and further comprises:
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit, preferably comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity, and a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase subunit ( HpaC), preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase activity; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of
  • the microorganism comprises the heterologous nucleic acid sequences encoding the enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS, CHI, and optionally for the enzymes CPR, FNS and SAMT , as described in the previous embodiment and further comprises:
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase in particular a PAL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, preferably a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60
  • C4H
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit preferably comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase subunit reductase (HpaC) preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with the latter and exhibiting a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase activity
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL) capable of producing caffeic acid from L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine).
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • the microorganism comprises:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity;
  • UGT flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose- reductase (RH M) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP- activity.
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • chalcone synthase comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity;
  • CHS chalcone synthase
  • CHI chalcone isomerase
  • F3'H flavonoid 3'-monooxygenase
  • F3'H a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7 and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity;
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting flavone synthase activity
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • OMT O-methyltransferase
  • the microorganism further comprises a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT), in particular a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity.
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • the origin of the enzymes or of a set of enzymes may be chosen so that their origin is the same or is close.
  • the enzymes or the set of enzymes can be derived from bacteria, for example bacteria of the same genus or of the same species.
  • the enzymes or the set of enzymes may be derived from plants, for example plants of the same genus or of the same species. Indeed, these common origins allow the enzymes to work together optimally.
  • the microorganisms comprise a metabolic pathway for the biosynthesis of tyrosine.
  • the microorganisms may have been modified to have an increased production of tyrosine compared to a wild strain.
  • the microorganisms may have been modified so that the carbon flow is redirected towards the biosynthesis of tyrosine.
  • the microorganisms may have been modified to reduce or eliminate feedback inhibitions of tyrosine biosynthesis.
  • the microorganisms comprise a metabolic pathway for the biosynthesis of phenylalanine.
  • the microorganisms may have been modified to have an increased production of phenylalanine compared to a wild strain.
  • the microorganisms may have been modified so that the carbon flow is redirected towards the biosynthesis of phenylalanine.
  • the microorganisms may have been modified to reduce or eliminate feedback inhibitions of phenylalanine biosynthesis.
  • the microorganisms comprise a metabolic pathway for the biosynthesis of phenylalanine and tyrosine.
  • the microorganisms may have been modified to have an increased production of phenylalanine and tyrosine compared to a wild strain.
  • the microorganisms may have been modified so that the carbon flow is redirected towards the biosynthesis of phenylalanine and tyrosine.
  • the microorganisms may have been modified to reduce or eliminate feedback inhibitions of phenylalanine and tyrosine biosynthesis.
  • Each nucleic acid sequence encoding an enzyme as described above is included in an expression cassette.
  • the coding nucleic sequences have been optimized for expression in the host microorganism.
  • the coding nucleic sequence is operably linked to the elements necessary for the expression of the gene, in particular for transcription and translation. These elements are chosen so as to be functional in the host recombinant microorganism. These elements can include, for example, transcription promoters, transcription activators, terminator sequences, initiation and termination codons. The methods for selecting these elements as a function of the host cell in which expression is desired are well known to those skilled in the art.
  • the promoter is a strong promoter.
  • the promoter can optionally be inducible.
  • the promoter can be selected from the following promoters: Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, the bacteriophage T3 or T7 RNA polymerase promoters, the polyhedrin promoter, the lambda phage PR or PL promoter.
  • the promoter is pLac.
  • the promoter can be selected from the following promoters: the pTDH3 promoter, the pTEF1 promoter, the pTEF2 promoter, the pCCW12 promoter, the pH HF2 promoter, the pHTB2 promoter and the pRPL18B promoter.
  • inducible promoters which can be used in yeast are the tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1, PH05 promoters.
  • All or part of the expression cassettes comprising the nucleic acid sequences encoding the enzymes as described or a combination of some of these can be included in a common expression vector or in different expression vectors.
  • the present invention therefore relates to a vector comprising two nucleic acid sequences chosen from a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT), a heterologous nucleic acid sequence encoding for a 6 ′′ -0-rhamnosyltransferase (RhaT) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM), preferably a vector comprises these three sequences.
  • the present invention therefore relates to a vector comprising two nucleic acid sequences chosen from
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis , preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably a 6 "- O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-0-rhamnosyltransferase activity, and preferably a RhaT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rham
  • RHM M UDP-glucose 4,6- dehydratase / U DP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L- rhamnose reductase (RH M) from Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4 activity -keto-L-rhamnose-reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptid
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-0-beta-D-glucosyltransferase (UGT) of Arabidopsis thaliana, Scutelloria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis , preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91,
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably a 6 "- O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / U DP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L- rhamnose reductase (RH M) from Citrus sinensis or from Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D- activity glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides
  • the vector comprises two nucleic acid sequences chosen from
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-0-beta-D-glucosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity sequenced with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity;
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose -reductase (RHM) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP activity glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose
  • the microorganism comprises all three.
  • the coding nucleic sequences and the sequences of the enzymes are as described above.
  • By comprising a nucleic acid sequence is also understood to include an expression cassette comprising the nucleic acid sequence.
  • the vector may further comprise one or more nucleic acid sequences selected from: a nucleic acid sequence encoding an O-methyltran sera (OMT), a nucleic acid sequence encoding an F3'H, a nucleic acid sequence encoding a CPR, a nucleic acid sequence encoding an FNS, a nucleic acid sequence encoding a SAMT, a nucleic acid sequence encoding a TAL, a nucleic acid sequence encoding a 4CL, a nucleic acid sequence encoding a CHS, a nucleic acid sequence encoding a CHI, a nucleic acid sequence encoding a PAL, a nucleic acid sequence encoding a C4H, a nucleic acid sequence encoding an HpaB, and a nucleic acid sequence encoding a DAL, each of these enzymes being as defined above, as well as their combinations.
  • OMT O-methyltran sera
  • F3'H a nu
  • the vector further comprises one or more sequences chosen from a nucleic acid sequence encoding an OMT, a nucleic acid sequence encoding an F3'H, a nucleic acid sequence encoding a CPR, a nucleic acid sequence encoding an FNS, a nucleic acid sequence encoding a TAL, a nucleic acid sequence encoding a 4CL, a nucleic acid sequence encoding a CHS, a nucleic acid sequence encoding for a CHI, a nucleic acid sequence encoding a PAL and a nucleic acid sequence encoding a C4H.
  • the vector can also comprise one or more nucleic acid sequences chosen from:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis or Pilosella officinarum, in particular Perilla frutescens var.
  • F3′H flavonoid 3′-monooxygenase
  • an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85
  • cytochrome P450 reductase preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaliona; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity
  • OMT O-methyltransferase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaliana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and a methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117, 119 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting O-methyl
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin into apigenin, erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin, preferably of converting erodictyol into luteolin; preferably an SNF of Arabidopsis thaliana, Lonicera joponica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus delto ⁇ des, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminapelium, Aethusa cynica arcelica, Cuminum cyminapelium, Aethusa cynica maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA; preferably from Citrus sinensis, from Hordeum vulgare or from Streptomyces clovuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, and preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase capable of producing naringenin from naringenin chalcone; preferably Arabidopsis thaliana or Streptomyces clovuligerus, in particular a CH I comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 59 and 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity, and preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity;
  • CH I chalcone isomerase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity, preferably a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine, and preferably a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity;
  • nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (H paB) subunit preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity
  • a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC) subunit preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4- activity hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase; or a nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine into
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • the vector can also comprise one or more nucleic acid sequences chosen from:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var.
  • F3′H flavonoid 3′-monooxygenase
  • an F3′H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from among enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaliana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating ero
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin into apigenin, erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin, preferably of converting erodictyol into luteolin; preferably an SNF of Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus delto ⁇ des, or Zea mays, preferably of Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, and Petroselinum crispum; preferably an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone syntha
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A; preferably Arabidopsis thaliana, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
  • 4CL 4-coumarate-CoA ligase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA; preferably from Citrus sinensis, from Hordeum vulgare or from Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity;
  • CHS chalcone synthase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase capable of producing naringenin from naringenin chalcone; of preference of Arabidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus, in particular a CH I comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 59 and 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity;
  • CH I chalcone isomerase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine;
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity
  • a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC) subunit preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate activity 3-monooxygenase reductase; or a nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine into L
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • the vector can also comprise one or more nucleic acid sequences chosen from:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 11, 17, and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 3'-monooxygenase flavonoid activity, and very particularly preferably an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavonoid 3'-monooxygen
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and very particularly preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) capable of producing p-coumaric acid from tyrosine and comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity;
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • 4CL 4-coumarate-CoA ligase capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and from Coenzyme A and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, preferably comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and
  • heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA and comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity;
  • CHS chalcone synthase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine.
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • the vector comprises a nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase, in particular capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 'and a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H ), in particular capable of adding a hydroxyl at the 3 'position of naringenin and / or apigenin; or
  • heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of hydroxylating in the 3 'position naringenin and / or apigenin; a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase; and a heterologous nucleic acid sequence encoding flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin to apigenin, erodictyol to luteolin and / or hesperetin to diosmetin, preferably of converting eriotdictyol to luteolin.
  • FNS flavone synthase
  • the vector can thus comprise several nucleic acid sequences chosen from among them, in particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleic acid sequences chosen from among them.
  • the vector can in particular comprise combinations of particular coding sequences as described above.
  • the vectors comprise heterologous coding sequences as long as the coding sequences can be optimized for the host microorganism, be under the control of a heterologous promoter and / or can combine coding sequences which are not from the same organism of origin and / or which are not present in the same arrangement.
  • the vector can be any DNA sequence into which it is possible to insert foreign nucleic acids, the vectors allowing the introduction of foreign DNA into the host microorganism.
  • the vector can be for example a plasmid, a phagemid, a cosmid, an artificial chromosome, in particular a YAC, or a BAC.
  • Expression vectors can include nucleic acid sequences encoding selection markers.
  • the selection markers can be genes for resistance to one or more antibiotics or genes for auxotrophy.
  • the auxotrophy gene can for example be URA3, LEU2, HIS3 or TRP1.
  • the antibiotic resistance gene may for example preferably be a resistance gene to ampicillin, kanamycin, hygromycin, geneticin and / or nureseothricin.
  • the host microorganism may be transiently or stably transformed / transfected and the nucleic acid, cassette or vector may be contained therein as an episome or as integrated into the genome of the host microorganism.
  • the expression vector can also comprise one or more sequences allowing the targeted insertion of the vector, of the expression cassette or of the nucleic acid into the genome of the host microorganism.
  • the expression cassettes comprising the nucleic acid sequences encoding the enzymes as described above or a combination of some of these can be inserted into the / a chromosome of the recombinant microorganism.
  • all or part of the expression cassettes comprising the nucleic acid sequences encoding the enzymes as described or a combination of some of these can be preserved in episomal form, in particular in the form of a plasmid.
  • the microorganism can comprise several copies of nucleic acid sequences encoding an enzyme as described above. In particular, it can comprise 2 to 10 copies, for example 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 copies of a nucleic acid sequence encoding an enzyme as described above.
  • the present invention relates to a method for preparing a microorganism according to the present invention comprising the introduction of nucleic acid sequences encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT), in particular capable of add glucose in position 7 of hesperetin and diosmetin; for a 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT), in particular capable of transferring a rhamnose to the 6-position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside; and for a UDP -glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP- 4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM), in particular capable of producing UDP-rhamnose in the microorganism and the selection of microorganism
  • the method can further comprise the introduction of one or more nucleic acid sequences chosen from:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis or Pilosella officinarum, in particular Perilla frutescens var.
  • F3′H flavonoid 3′-monooxygenase
  • an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19 and 21 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably selected from among enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a selected sequence from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90
  • cytochrome P450 reductase preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharonthus roseus or of Arabidopsis thaliono; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, in particular a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaliana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synth
  • SAMT S-adenosyl methionine synthetase
  • a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting S-adenosyl methionine synthetase activity
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A; preferably Arahidopsis thaliana, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, and preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity sequenced with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
  • 4CL 4-coumarate-CoA ligase
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA; preferably from Citrus sinensis, from Hordeum vulgare or from Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, and more particularly preferably a CHS comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 53 and polypeptid
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine, in particular a C4H comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60
  • DAL dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase
  • the method comprises the introduction:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arahidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis , preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably an RhaT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-0-rhamnosyltransferase activity, in particular a 6" -0-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyl
  • RHM M UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose -reductase (RH M) of Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4- activity keto-L-rhamnose reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having
  • OMT O-methyltransferase
  • a heterologous nucleic acid sequence coding for an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position preferably, an OMT from Citrus clementina, Citrus sinensis, Arabidopsis thaüana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in the 4 'position , preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of hydroxylating naringenin and / or apigenin in position 3 'and comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85 %, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, and very particularly preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7, and polypeptides comprising
  • cytochrome P450 reductase a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, in particular a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 , 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, in particular a flavone synthase (FNS) and comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 33, 35, 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least
  • SAMT S-adenosylmethionine synthetase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 41 and 39 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity
  • TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) from Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; in particular, a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 123, 125, 45, 43, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequenced with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; very particularly preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptide
  • chalcone synthase of Citrus sinensis, of Hordeum vulgare or of Streptomyces clavuligerus
  • a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53, 51, 55 and 57 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity
  • a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI) of Arabidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus in particular a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 61 and 59 and polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity; preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity .
  • the method comprises the introduction of all of these sequences.
  • the method further comprises introducing:
  • a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65 and 77, preferably SEQ ID NOs: 65 and 77, and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, and more particularly preferably a phenylalanine ammonia lyase (PAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • C4H a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; and very particularly preferably a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • the method comprises the introduction of combinations of particular coding sequences as described above.
  • the present invention relates to the use of a microorganism according to the present invention for the production of diosmin and / or hesperidin.
  • it relates to the use of a microorganism according to the present invention for the production of diosmin.
  • it relates to the use of a microorganism according to the present invention for the production of hesperidin.
  • it relates to the use of a microorganism according to the present invention for the production of diosmin and hesperidin.
  • the present invention also relates to a method of producing diosmin and / or hesperidin comprising the cultivation of a microorganism according to the present invention, in particular under conditions allowing or favorable to the production of diosmin and / or hesperidin and optionally the recovery and / or purification of the diosmin and / or hesperidin produced.
  • the conditions for culturing the microorganism according to the invention can be adapted according to conventional techniques, well known to those skilled in the art.
  • the microorganism is cultivated in an appropriate culture medium.
  • suitable culture medium generally designates a culture medium providing nutrients which are essential or beneficial for the maintenance and / or growth of said microorganism, such as carbon sources; nitrogenous sources such as ammonium sulfate; sources of phosphorus, for example, potassium phosphate monobasic; trace elements, for example copper, iodide, iron, magnesium, zinc or molybdate salts; vitamins and other growth factors such as amino acids or other growth promoters.
  • a defoamer can be added as needed.
  • this suitable culture medium can be chemically defined or complex.
  • the culture medium can thus be of identical or similar composition to a synthetic medium, as defined by Verduyn et al., (Yeast.
  • the culture medium can comprise a simple carbon source, such as glucose, fructose, xylose, ethanol, glycerol, galactose, sucrose, cellulose, cellobiose, starch, polymers of glucose, molasses, or byproducts of these sugars.
  • a simple carbon source such as glucose, fructose, xylose, ethanol, glycerol, galactose, sucrose, cellulose, cellobiose, starch, polymers of glucose, molasses, or byproducts of these sugars.
  • the production of diosmin and / or hesperidin by the microorganism according to the invention is obtained without supplying naringenin, apigenin, erodictyol, luteolin, hesperetin and / or diosmetin in the medium of culture, preferably without addition of naringenin, apigenin, erodictyol, luteolin, hesperetin and diosmetin in the culture medium.
  • any mode of culture allowing the production on an industrial scale of molecules of interest can be envisaged.
  • the culture is carried out in bioreactors, in particular in batch, fed-batch, chemostat and / or continuous culture mode. Controlled vitamin supply during the process may also benefit productivity (Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2002. 60: 67-72).
  • the culture is generally carried out in bioreactors, with possible steps of solid and / or liquid precultures in Erlenmeyer flasks, with an appropriate culture medium.
  • the culture conditions of the microorganisms according to the invention are easily adaptable by a person skilled in the art, depending on the microorganism.
  • the culture temperature is in particular for yeasts between 20 ° C and 40 ° C, preferably between 28 ° C and 35 ° C, and more particularly around 30 ° C for cerevisiae.
  • the microorganism according to the present invention can be cultured for 1 to 30 days, and preferably 1 to 10 days.
  • a microorganism according to the present invention is capable of producing diosmin and / or hesperidin in a minimum amount of 1 mg / l of culture medium, preferably 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 , 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mg / l of culture medium, optionally 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 mg / l of culture medium.
  • Figure 1 Description of the metabolic pathways of hesperidin and diosmin production.
  • Figure 2 Production of erodictyol from naringenin by the strain FL_405 (F3'H4 + CPR2). Control strain: CF235. Observation of the disappearance of the naringenin peak and the appearance of an erodictyol peak in the FL-405 strain.
  • Figure 3 Production of luteolin from apigenin by the strain FL_405 (F3′H4 + CPR2). Control strain: CF235. Observation of the disappearance of the apigenin peak and appearance of a luteolin peak in strain FL-405.
  • Figure 4 Production of Apigenin from naringenin by strain SC744 (FNSII1 + CPR2). Control strain: CF234. Observation of the disappearance of the naringenin peak and appearance of an apigenin peak in the strain.
  • Figure 5 Production of luteolin from erodictyol SC744 (FNSII1 + CPR2). Control strain: CF234. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a luteolin peak in the strain.
  • Figure 6 Production of erodictyol and luteolin by strain SC1500. Control strain: CF237. Observation of erodictyol and luteolin peaks.
  • Figure 7 Production of hesperetin from erodictyol by strains SC 1612 (MET + SAM) and SC 1614 (MET + SAM). Control strain: CF235. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a hesperetin peak in the strains.
  • Figure 8 Production of diosmetin from luteolin by strain SC 1612 (MET + SAM) and SC 1614 (MET + SAM). Control strain: CF235. Observation of the disappearance of the luteolin peak and appearance of a diosmetin peak in the strains.
  • Figure 9 Production of diosmetin from hesperetin by strain SC744 (FNSII + CPR). Control strain: CF234. Observation of the disappearance of the hesperetin peak and appearance of a diosmetin peak in the strain.
  • Figure 10 Production of hesperetin from erodictyol by E. coli EC26 (MET + SAM).
  • Control strain E. coli MH1. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a hesperetin peak in the strain.
  • FIG. 11 Production of diosmetin from luteolin by E. coli EC26 (MET + SAM).
  • Control strain E. coli MH1. Observation of the disappearance of the luteolin peak and appearance of a diosmetin peak in the strain.
  • Figure 12 Production of diosmetin from hesperetin by E. coli EC30 (FNSII).
  • Control strain E. coli MH1. Observation of the disappearance of the hesperetin peak and appearance of a diosmetin peak in the strain.
  • Figure 13 Production of hesperetin and diosmetin by strain SC1508. Control strain: CF237. Observation of hesperetin peaks in diosmetin.
  • Figure 14 Production of hesperidin from hesperetin by strain FL 547 (GT + RHM + RHAT). Control strain: CF 233. Observation of the disappearance of the hesperetin peak and appearance of the hesperidin peak.
  • Figure 15 Production of diosmin from diosmetin by strain FL 547 (GT + RHM + RHAT). Control strain: CF 233. Observation of the disappearance of the disometin peak and appearance of the diosmin peak.
  • Figure 16 Production of hesperedin from hesperetin by E. coli EC38, EC45 and EC47 (GT + RHM + RHAT). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the hesperetin peak and appearance of the hesperidin peak.
  • Figure 17 Production of diosmin from diosmetin by E. coli EC38, EC45 and EC47 (GT + RH M + RHAT). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the diosmetin peak and appearance of the diosmin peak.
  • Figure 18 Production of hesperidin and diosmin by strains SC1509, SC1530, SC1529, SC1568 and SC2410. Control strain: CF237. Observation of hesperidin and diosmin peaks.
  • Figure 19 Production of erodictyol and luteolin by strains SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC2428 and SC1500.
  • Control strain CF237.
  • Figure 20 Production of hesperetin and homoeriodictyol by strains SC2147, SC2151, SC1612 and SC1614. Control strain: CF235.
  • Figure 21 Production of diosmetin and chrysoeriol by strains SC2147, SC2151, SC1612 and SC1614. Control strain: CF235.
  • Figure 22 Production of hesperetin from erodictyol by E. coli EC41 (M ET + SAM).
  • Control strain E. coli MH1. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a hesperetin peak in the strain.
  • Figure 23 Production of hesperetin from erodictyol by E. coli EC43 (M ET + SAM).
  • Control strain E. coli MH1. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a hesperetin peak in the strain.
  • Figure 24 Production of diosmetin from luteolin by E. coli EC43 (MET + SAM).
  • Control strain E. coli MH1. Observation of the disappearance of the luteolin peak and appearance of a diosmetin peak in the strain.
  • Figure 25 Production of hesperetin and diosmetin by strain SC2408. Control strain: CF237. Observation of hesperetin peaks in diosmetin.
  • Figure 26 Production of hesperetin and diosmetin by strain SC2409. Control strain: CF237. Observation of hesperetin peaks in diosmetin.
  • Figure 27 Production of hesperetin and diosmetin by strains SC2408, SC2409 and SC1508. Control strain: CF237.
  • Figure 28 Production of hesperidin and diosmin by strains SC1579, SC1584, SC1621 and SC1626.
  • yeasts used in the examples were obtained from Saccharomyces cerevisiae FY1679-28A (Tettelin et al., 1995 https://doi.org/10.1016/S1067-
  • This yeast has a quadri auxotrophy for uracil, tryptophan, histidine and leucine.
  • the strains of bacteria used in the examples were obtained from Escherichia coli MH1.
  • the genes optimized for expression in yeast have been synthesized by Eurofins genomics, Ebersberg, Germany or Biomatik, Cambridge, Canada or Twist Biosciences, San Francisco, USA or DC Biosciences, Dundee, UK.
  • the cpr2 gene SEQ ID NO: 26 was amplified from genomic DNA.
  • the genes obtained by synthesis or by PCR comprise, at the 5 'and 3' end, a BbsI (GAAGAC) or Bsal (GGTCTC) restriction site.
  • the pSBK vector comprises a yeast selection marker URA, or LEU or TRP or HIS and the vector pSB1K3 comprises a kanamycin resistance marker.
  • the strains were cultured in 1 ml of minimum nitrogen base medium (Dutscher, Brumath, Fr) supplemented with glucose at 20 g / l for the yeasts and in 1 ml of M9 supplemented with glucose at 4 gl 1 for E. coli in a 24-well plate (Starlab, Orsay, Fr) at 30 ° C. for 72 h with continuous stirring at 200 RPM.
  • minimum nitrogen base medium Dutscher, Brumath, Fr
  • M9 supplemented with glucose at 4 gl 1 for E. coli in a 24-well plate (Starlab, Orsay, Fr) at 30 ° C. for 72 h with continuous stirring at 200 RPM.
  • naringenin or apigenin was added at a concentration of 100 mg.l 1 to determine the activity of F3'H
  • naringenin or erodictyol was added at a concentration of 100 mg.l 1 to determine the activity of FNSII
  • erodictyol or luteolin was added at a concentration of 100 mg.l 1 to determine the activity of METs
  • hesperetin or diosmetin was added added at a concentration of 100 mg.l 1 to determine the activity of GTs
  • hesperetin 7-O-glucioside and or diosmetin 7-O-glucoside was determined the activity of RFIM and RFIAT.
  • Each strain was inoculated at OD 0.2 from a 24 hour pre-culture cultivated under the same conditions.
  • the final concentrations of the internal standards are: Diosmin C13 0.5 mg / L
  • Mobile phase A is a solution of 0.1% formic acid in LC / MS grade water and mobile phase B is a solution of 0.1% formic acid in pure acetonitrile of LC / MS quality.
  • the temperature of the column is 50 ° C and the temperature of the autosampler is 10 ° C.
  • Two chromatographic conditions could be used for the detection of the flavonoids of interest:
  • the ions monitored and the fragmentation conditions for the molecules of interest are:
  • F3′H Constructs for each of the F3′H were carried out in a vector carrying the URA selection marker (Table 6). Constructs each comprising SAM2 and only one of the different CPRs were created in a vector carrying the LEU selection marker (Table 7). Two vectors comprising only the URA or LEU selection marker were also created as a control. The marker genes make it possible to identify and select the cells which have integrated the gene of interest. [Table 6] List of the different F3′H constructions tested.
  • strain FL 405 has the constructs FL 26 and FL 401.
  • the control strain (without the genes) having the TT URA and TT LEU constructs is called CF235.
  • FNSII For each of the following FNSII, constructs in a TRP vector were performed (Table 8). The same vectors with the LEU selection marker each containing SAM2 and a different CPR were used to test FNSII (Table 9).
  • strain SC 744 has the constructs FL 620 and FL 401.
  • the control strain (without the genes) possessing the TT TRP and TT LEU constructs is named CF234.
  • strain SC1500 comprises the constructions FL 26, FL 602, FL 808 and FL 822;
  • strain SC2424 comprising the constructions FL 1031 + FL 602 + FL 822 + TT HIS;
  • strain SC2425 comprising the constructions FL 26 + FL 602 + FL 822 + TT HIS;
  • strain SC2426 comprising the constructions FL 31 + FL 602 + FL 822 + TT HIS;
  • the strain SC2427 comprises the constructions FL 1031, FL 602, FL 808 and FL 822; and - strain SC2428 comprising the constructions FL 31 + FL 602 + FL 808 + FL 822.
  • the control strain (without the genes) possessing the constructions TT LIRA, TT TRP, TT HIS and TT LEU is named CF237.
  • SC2429 FL 1111 + FL 1031 + FL 121 SC2451: FL 1113 + FL 26 + FL 121 SC2430: FL 1112 + FL 1031 + FL 121 SC2452: FL 1114 + FL 26 + FL 121 SC2431: FL 1113 + FL 1031 + FL 121 25 SC2453: FL 1115 + FL 26 + FL 121 SC2432: FL 1114 + FL 1031 + FL 121 SC2459: FL 1111 + FL 26 + TT LEU SC2433: FL 1115 + FL 1031 + FL 121 SC2460: FL 1112 + FL 26 + TT LEU SC2439: FL 1111 + FL 1031 + TT LEU SC2461: FL 1113 + FL 26 + TT LEU SC2440: FL 1112 + FL 1031 + TT LEU SC2462: FL 1114 + FL 26 + TT LEU SC2441: FL 1113 + FL 1031 + TT LEU 30 SC2463: FL 1115 + FL 26 + TT LEU SC2442: FL 1114 + FL 1031 + FL
  • SC2450 FL 1112 + FL 26 + FL 121
  • the control strain (without the genes) possessing the constructions TT LIRA, TT TRP, TT HIS and TT LEU is named CF237.
  • the strain SC1508 comprises the constructions FL 121 + FL 268 + FL 602 + FL 808 of table 14.
  • the strain SC2408 comprises the constructions FL 121 + FL 469 + FL 602 + FL 808 of table 14.
  • the strain SC2409 comprises the constructions FL 121 + FL 475 + FL 602 + FL 808 from table 14.
  • control strain (without the genes) having the constructions TT LEU, TT URA, TT TRP and
  • TT HIS is named CF237.
  • the control strain (without the genes) having the TT URA construct is called CF233.
  • the control strain (without the genes) having the TT URA construct is called CF233.
  • the different assemblies carried out with the different RHATs will make it possible to verify the enzymatic activity of the RHATs and also make it possible to determine the most effective RHATs.
  • the control strain (without the genes) having the TT URA construct is called CF233.
  • the strain SC1509 comprises the constructs FL 121 + FL 511 + FL 602 + FL 808.
  • the strain SC1530 comprises the constructs FL 121 + FL 603 + FL 602 + FL 808.
  • the strain SC1529 comprises the constructs FL 121 + FL 554 + FL 602 + FL 808.
  • Strain SC1568 comprises the constructs FL 121 + FL 556 + FL 602 + FL 808.
  • the strain SC2410 comprises the constructs FL 121 + FL 1100 + FL 602 + FL 808.
  • the strain SC1579 comprises the constructs FL 401 + FL 547 + FL 602 + FL 828.
  • the strain SC1584 comprises the constructs FL 401 + FL 554 + FL 602 + FL 828.
  • the strain SC1621 comprises the constructs FL 401 + FL 556 + FL 602 + FL 828.
  • the strain SC1626 comprises the constructs FL 401 + FL 603 + FL 602 + FL 828.
  • the control strain (without the genes) possessing the constructions TT LEU, TT URA, TT TRP and TT HIS is called CF237.
  • Tables 20 and 21 below show the production of erodictyol (Table 20) and luteolin (Table 21) obtained by cultivating the strains comprising the F3′H listed in Table 6 and the constructions of Table 7, in the presence respectively naringenin and apigenin.
  • strains are well capable of producing erodictyol from naringenin, in different concentrations depending on the F3′H and the CPR used (see FIG. 2).
  • strains are well capable of producing luteolin from apigenin, in different concentrations depending on the F3′H and the CPR used (see FIG. 3).
  • Tables 22 and 23 below show the production of apigenin (Table 22) and luteolin (Table 23) obtained by culturing the strains comprising the FNSII listed in Table 8 and the constructions of Table 9, in the presence respectively of naringenin and erodictyol.
  • Apigenin concentration in mg.l 1 )
  • strains are well capable of producing apigenin and luteolin from naringenin and erodictyol, in different concentrations depending on the SNSF used ( Figures 4 and 5).
  • All strains are capable of producing diosmetin from naringenin.
  • the production of diosmetin is greatly increased by the addition of a CPR.
  • SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC1500 and SC2428 have all the enzymes from the pathway to erodyctiol and luteolin and are capable of producing luteolin and erodictyol at from glucose.
  • strain SC1500 corresponds to Figure 6, where the peaks of erodictyol and luteolin are observed. Similar results are obtained for the strains SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, and SC2428. The production of erodictyol and luteolin for each of the strains SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC1500 and SC2428 is shown in Figure 19.
  • PAL and C4H enzymes to the biosynthetic pathway makes it possible to obtain significantly higher concentrations of erodictyol and luteolin.These can be up to 6 times greater than the concentrations obtained with the strains containing the same enzymes with the exception of PAL and C4H (cf. figure 19, for example by comparing the strain SC2425 without PAL / C4H and the strain SC1500 with PAL / C4H or the strain SC2426 without PAL / C4H and the strain SC2428 with PAL / C4H).
  • the results for the production of hesperetin and diosmetin from erodictyol and luteolin by the strains SC1612, SC1614, SC2147 and SC2151 are presented respectively in Figures 7, 8, 20 and 21.
  • the yeast strains SC1612, SC1614, SC2147 and SC2151 are well capable of producing hesperetin and / or diosmetin.
  • strains SC2147, SC2151 and SC1612 are capable of specifically producing hesperetin, that is to say of specifically methylating the hydroxyl in position 4 'of erodictyol (FIG. 20).
  • the strain SC1614 for its part produces a mixture of hesperetin and homoeriodictyol.
  • strain SC2151 is moreover capable of producing around 40 mg / L of hesperetin (FIG. 20).
  • the strains SC2147, SC1612 and SC1614 are for their part capable of producing diosmetin from luteolin ( Figure 21).
  • the yeast strain SC744 is well capable of producing diosmetin from hesperetin.
  • the results for the production of hesperetin from erodictyol by the strain EC26, EC41 and EC43 are shown in Figures 10, 22 and 23 and the production of diosmetin from luteolin by the strains EC26 and EC43 are shown in Figures 11 and 24.
  • the E. coli strains EC26, EC41 and EC43 are well capable of producing hesperetin and / or diosmetin.
  • the results for the production of diosmetin from hesperetin by strain EC30 are shown in Figure 12.
  • the E. coli EC30 strain is well capable of producing diosmetin from hesperetin.
  • strain SC1508, SC2408 and SC2409 possessing all the enzymes of the pathway up to hesperetin and diosmetin are capable of producing hesperetin and / or diosmetin from glucose ( Figure 27).
  • strain SC2408 produces on the order of 25 mg / L of hesperetin and approximately 5 mg / L of diosmetin.
  • the different strains are well capable of producing resperidin and / or diosmin from hesperetin and diosmetin, in different concentrations depending on the GTs used.
  • strains are well capable of producing rhesperidin and diosmin from hesperetin and diosmetin, in different concentrations depending on the RHMs used.
  • the different strains are well capable of producing hesperidin and diosmin from hesperetin and diosmetin, in different concentrations depending on the GTs, RHMs and RHATs used.
  • the yeasts tested with the different constructs are well capable of producing hesperidin and diosmin.
  • strains are well capable of producing hesperidin from hesperetin.
  • strains are well capable of producing diosmin from diosmetin.
  • strains possessing all the enzymes of the pathway are capable of producing hesperidin and / or diosmin.

Abstract

The present invention relates to a recombinant microorganism modified to be capable of producing diosmin and hesperidin and to the use thereof for producing diosmin and/or hesperidin.

Description

METHODE DE BIOSYNTHESE DE LA DIOSMINE ET/OU DE L'HESPERIDINE DANS UN MICROORGANISME METHOD OF BIOSYNTHESIS OF DIOSMINE AND / OR HESPERIDINE IN A MICROORGANISM
DOMAINE DE L'INVENTION FIELD OF THE INVENTION
La présente invention est relative à une méthode de production de la diosmine et de l'hespéridine. The present invention relates to a method for producing diosmin and hesperidin.
ARRI ERE-PLAN TECHNOLOGIQUE TECHNOLOGICAL BACKGROUND
Le Dation est un mélange de flavonoïdes ayant des effets vaso-toniques et vasculo- protecteurs. Ce mélange est principalement composé de Diosmine ~85 %, d'Hespéridine ~8 % et de traces de différentes flavones et de leu rs formes oxydées respectives. Dation is a mixture of flavonoids with vaso-tonic and vasculoprotective effects. This mixture is mainly composed of Diosmin ~ 85%, Hesperidin ~ 8% and traces of different flavones and their respective oxidized forms.
La méthode de production actuelle du médicament est l'extraction acido/basique à partir d'écorce de petites oranges, d'un mélange de flavonoïdes contenant principalement de l'Hespéridine (94%) et un mélange d'Isonaringine (~3%), de Néoponcirine (~2%) et d'Hespérétine (<1%). Ce mélange subit ensuite une oxydation contrôlée par un procédé chimique, transformant environ 90 % de l'hespéridine en diosmine, et des flavonoïdes minoritaires dans leur forme oxydée. The current production method of the drug is the acid / base extraction from the peels of small oranges, a mixture of flavonoids containing mainly Hesperidin (94%) and a mixture of Isonaringine (~ 3%) , Neoponcirin (~ 2%) and Hesperetin (<1%). This mixture then undergoes controlled oxidation by a chemical process, transforming approximately 90% of the hesperidin into diosmin, and minority flavonoids in their oxidized form.
Ainsi, la production de Daflon est liée à l'approvisionnement en extrait purifié de flavonoïdes d'orange, qui peut varier suite à des variations climatiques, des fluctuations du cours des monnaies et la difficulté de s'approvisionner sur des dizaines de sites dans plusieurs pays (principalement le Mexique, les pays du bassin méditerranéen et la Chine). Thus, the production of Daflon is linked to the supply of purified extract of orange flavonoids, which may vary due to climatic variations, fluctuations in currency prices and the difficulty of obtaining supplies from dozens of sites in several countries (mainly Mexico, Mediterranean Basin countries and China).
Il serait donc précieux de disposer de mode alternatif de production du Daflon ne dépendant pas des aléas de l'approvisionnement en extrait purifié de flavonoïdes d'orange. Ainsi, il existe un besoin non satisfait de procédé de biosynthèse de la diosmine et de l'hespéridine. It would therefore be valuable to have an alternative mode of production of Daflon that does not depend on the vagaries of the supply of purified extract of orange flavonoids. Thus, there is an unmet need for a method of biosynthesis of diosmin and hesperidin.
RESU ME DE L'INVENTION RESULTS OF THE INVENTION
Les inventeurs ont mis au point une méthode de biosynthèse de la diosmine et de l'hespéridine dans un microorganisme recombinant. The inventors have developed a method for the biosynthesis of diosmin and hesperidin in a recombinant microorganism.
Ainsi, la présente invention est relative à un microorganisme recombinant comprenant : une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et/ou la diosmétine ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) capable de transférer u n rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou de la diosmétine-7-O-glucoside; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RHM) capable de produire de l'U DP-rhamnose. Thus, the present invention relates to a recombinant microorganism comprising: a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding a glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0- rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or of diosmetin-7-O- glucoside; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose -reductase (RHM) capable of producing U DP-rhamnose.
De préférence, la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) est une enzyme de Citrus sinensis, de Citrus clementina, d'Arubidopsis thaliana, de Scuteiiaria baicolensis ou d’Homo sapiens. En particulier, la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) peut être une enzyme d’Arabidopsis thaliana, de Scuteiiaria baicolensis ou d’Homo sapiens, de préférence d’Arabidopsis thaliana ou de Scuteiiaria baicolensis. De manière préférée, la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) est de Citrus sinensis ou de Scuteiiaria baicolensis. Preferably, the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) is an enzyme from Citrus sinensis, Citrus clementina, Arubidopsis thaliana, Scuteiiaria baicolensis or Homo sapiens. In particular, the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) can be an enzyme from Arabidopsis thaliana, Scuteiiaria baicolensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scuteiiaria baicolensis. Preferably, the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) is from Citrus sinensis or from Scuteiiaria baicolensis.
La flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase peut être sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase. En particulier, elle peut être sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase. De préférence, la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NOs: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase The flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase can be selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone activity 7 -O-beta-D-glucosyltransferase. In particular, it can be selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity. Preferably, the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity
De préférence, la 6"-0-rhamnosyltransferase (RhaT) est une enzyme de plante, de préférence du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus dementina. De préférence, la 6"-0-rhamnosyltransferase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase. De manière plus particulièrement préférée, la 6"-0-rhamnosyltransferase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NOs: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0- rhamnosyltransferase. Preferably, the 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT) is a plant enzyme, preferably of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus Preferably, the 6 "-O-rhamnosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-0-rhamnosyltransferase activity. More particularly preferably, the 6" -0-rhamnosyltransferase is selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity.
De préférence, l'UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase (RHM) est une enzyme de plante, de préférence de Citrus sinensis ou d'Arabidopsis thaliana. De préférence, l'UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. De manière plus particulièrement préférée, l'UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NOs: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto- 6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. Dans un mode de réalisation, le microorganisme selon l'invention comprend en outre : une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) ; et/ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une une cinnamate 4-hydroxylase (C4H) ; Preferably, UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM) is a plant enzyme, preferably from Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana. Preferably, UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase is selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP- activity glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase. More particularly preferably, UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose activity 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase. In one embodiment, the microorganism according to the invention further comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL); and / or a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H);
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL);
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une naringénine- chalcone synthase (CHS) ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a naringenin chalcone synthase (CHS);
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CH I) ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I);
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H);
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl- transférase (OMT), et a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT), and
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4- méthoxybenzoate O-déméthylase capable de convertir la tyrosine en L-Dopa et également l'acide p coumarique en acide caféique; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une p-coumarate 3-hydroxylase capable de convertir l'acide p-coumarique en acide caféique. optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine to L-Dopa and also p coumaric acid to caffeic acid; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a p-coumarate 3-hydroxylase capable of converting p-coumaric acid to caffeic acid.
De préférence, le microorganisme comprend Preferably, the microorganism comprises
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 41 et 39 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase, et de préférence une tyrosine ammonia lyase (TAL) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 41 and 39 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity, and preferably a tyrosine ammonia lyase (TAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 123, 125, 43, 45, 47 et 49 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase, de préférence une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO: 123, 125 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase, et en particulier une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4-coumarate- CoA ligase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 123, 125, 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, and in particular a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53, 51, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, et de préférence une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53, 51, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, and preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CH I) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 61 et 59 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase, et de préférence une CHI comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase. a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 61 and 59 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity, and preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone isomerase activity.
De préférence, le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) de Callistephus chinensis, Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana, Pilosella officinarum, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Citrus clementina ou Streptomyces avermitilis, en particulier de Callistephus chinensis, Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana ou Pilosella officinarum, de préférence une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7 , 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes de SEQ ID NOs: 7, 11, 17, et 121 et les polypeptides ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase. Preferably, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) from Callistephus chinensis, Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana, Pilosella officinarum, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Citrus clementina or Streptomyces avermitilis, in particular Callistephus chinensis, Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana or Pilosella officinarum, preferably an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from the enzymes of SEQ ID NOs: 7, 11, 17 , and 121 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
De manière plus particulièrement préférée, le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7, 17, et 121 et les polypeptides ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7 et les polypeptides ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase. More particularly preferably, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 17, and 121 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
De préférence, le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl-transférase (OMT)de Citrus, en particulier Citrus clementino ou Citrus sinensis, d'Homo sapiens ou d’Arabidopsis thaliana, de préférence une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 119, 117, 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité O-méthyltransférase. de manière plus particulièrement préférée, il comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl-transférase (OMT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 119, 117 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité O-méthyltransférase, de préférence une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 119 et 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité O- méthyltransférase. Preferably, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT) of Citrus, in particular Citrus clementino or Citrus sinensis, Homo sapiens or Arabidopsis thaliana, preferably an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 119, 117, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting the O-methyltransferase activity. more particularly preferably, it comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 119, 117 and 89 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, preferably a sequence selected from SEQ ID NOs: 119 and 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity.
De préférence, le microorganisme comprend Preferably, the microorganism comprises
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) , en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65 et 77, de préférence SEQ ID NO : 65 et 77, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, et de manière plus particulièrement préférée une phénylalanine am monia lyase (PAL) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65 and 77, preferably SEQ ID NOs: 65 and 77, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, and more particularly preferably a phenylalanine ammonia lyase (PAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase ; et de manière tout particulièrement préférée une cinnamate 4- hydroxylase (C4H) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4- hydroxylase . - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; and very particularly preferably a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
Le microorganisme peut comprendre en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS), en particulier une flavone synthase capable de produire la lutéoline à partir de l'ériodictyol, de préférence d’Arobidopsis thaliana, Petroselinum crispum, Zea mays, Lonicero japonica, Lonicera macranthoides, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussureo médusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata ou Erythranthe lewisii. La flavone synthase (FNS) peut être sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase. En particulier la FNS peut être une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, et de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase. The microorganism may further comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS), in particular a flavone synthase capable of producing luteolin from erodictyol, preferably from Arobidopsis thaliana, Petroselinum crispum, Zea mays, Lonicero japonica, Lonicera macranthoides, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussureo barorcatuarum, Scirrocirrinumus, Scirrushusellinum, Scirrocirratus, Saussureo barhusellinum, Scirrushirratus, Scirrushusellinum, Scirrushirratus, Scirrushusellinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii. Flavone synthase (FNS) can be selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 , 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity. In particular the FNS may be an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and presenting a flavone synthase activity, and preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity.
Il peut également comprendre en outre : It may also further include:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) ; et/ou a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR); and or
une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S- adénosylméthionine synthétase (SAMT). a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT).
De préférence, la CPR comprend une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 25, 23, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, et de manière particulière une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cytochrome P450 réductase. Preferably, the CPR comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: 25, 23, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and in particular a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity.
De préférence, le microorganisme est une levure ou une bactérie, de préférence une levure du genre Saccharomyces, en particulier Saccharomyces cerevisiae, ou une bactérie comme Escherichia coli. Preferably, the microorganism is a yeast or a bacterium, preferably a yeast of the genus Saccharomyces, in particular Saccharomyces cerevisiae, or a bacterium such as Escherichia coli.
La présente invention est également relative à l'utilisation d'un microorganisme tel que décrit dans le présent document pour produire de la diosmine et/ou de l'hespéridine. The present invention also relates to the use of a microorganism as described in the present document for producing diosmin and / or hesperidin.
En outre, elle est relative à une méthode de production de la diosmine et/ou de l'hespéridine comprenant la culture d'un microorganisme tel que décrit dans le présent document, et facultativement la récolte de la diosmine et/ou de l'hespéridine. In addition, it relates to a method of producing diosmin and / or hesperidin comprising culturing a microorganism as described herein, and optionally harvesting diosmin and / or hesperidin. .
De préférence, lors de l'utilisation du microorganisme selon l'invention pour produire de la diosmine et/ou de l'hespéridine en ce qu'il n'y a pas d'apport de naringénine, d'apigénine, d'ériodictyol, de lutéoline, d'hespérétine et/ou de diosmétine dans le milieu de culture. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'I NVENTION Preferably, when using the microorganism according to the invention to produce diosmin and / or hesperidin in that there is no contribution of naringenin, apigenin, erodictyol, luteolin, hesperetin and / or diosmetin in the culture medium. DETAILED DESCRIPTION OF THE I NVENTION
Les voies de biosynthèse de l'hespéridine dans l'écorce de petites oranges sont mal connues. Les inventeurs ont donc exploré plusieurs voies de biosynthèse et ont réussi à mettre au point la biosynthèse de la diosmine et de l'hespéridine dans un microorganisme recombinant. Little is known about the biosynthetic pathways of hesperidin in the peel of small oranges. The inventors have therefore explored several routes of biosynthesis and have succeeded in developing the biosynthesis of diosmin and hesperidin in a recombinant microorganism.
Définition Definition
Par « microorganisme » est entendu un organisme unicellulaire. De préférence, le microorganisme est une bactérie ou une levure. By "microorganism" is meant a unicellular organism. Preferably, the microorganism is a bacterium or a yeast.
Par « microorganisme recombinant » est entendu un microorganisme qui ne se trouve pas dans la nature et qui contient un génome modifié suite à une insertion, modification ou délétion d'un ou plusieurs éléments génétiques hétérologues. By “recombinant microorganism” is understood a microorganism which is not found in nature and which contains a genome modified following an insertion, modification or deletion of one or more heterologous genetic elements.
Par « acide nucléique recombinant » est entendu un acide nucléique qui a été modifié et n'existe pas dans un microorganisme naturel. Par exemple, ce terme peut désigner une séquence codante ou gène qui est lié de manière opérationnelle à un promoteur qui n'est pas le promoteur naturel. Cela peut également désigner une séquence codante dans laquelle les introns ont été supprimés pour des gènes comprenant des exons et des introns. Par « hétérologue » est entendu que le gène a été introduit par génie génétique dans la cellule. Il peut y être présent sous forme épisomale ou chromosomique. L'origine du gène peut être différente de la cellule dans laquelle il est introduit. Cependant, le gène peut également provenir de la même espèce que la cellule dans laquelle il est introduit mais il est considéré comme hétérologue en raison de son environnement qui n'est pas naturel. Par exemple, le gène ou la séquence nucléique est hétérologue car il/elle est sous le contrôle d'un promoteur autre que son promoteur naturel, il/elle est introduit(e) dans un endroit différent de celui-ci où il/elle est situé(e) naturellement. La cellule hôte peut contenir une copie du gène endogène préalablement à l'introduction du gène hétérologue ou elle peut ne pas contenir de copie endogène. Par ailleurs, la séquence d'acide nucléique peut être hétérologue dans le sens où la séquence codante a été optimisée pour l'expression dans le microorganisme hôte. De manière préférée, dans le présent document, une séquence nucléique hétérologue code pour une protéine qui est hétérologue à la cellule hôte, c'est-à-dire qui n'est pas naturellement présente dans la levure. Tel qu'utilisé ici, le terme «natif» ou «endogène», par rapport au microorganisme hôte, se réfère à un élément génétique ou à une protéine naturellement présente dans ledit microorganisme. By "recombinant nucleic acid" is meant a nucleic acid which has been modified and does not exist in a naturally occurring microorganism. For example, this term can denote a coding sequence or gene which is operably linked to a promoter which is not the natural promoter. It can also refer to a coding sequence in which introns have been deleted for genes comprising exons and introns. By "heterologous" is understood that the gene has been introduced by genetic engineering into the cell. It can be present there in episomal or chromosomal form. The origin of the gene may be different from the cell into which it is introduced. However, the gene can also come from the same species as the cell into which it is introduced but it is considered heterologous due to its environment which is not natural. For example, the gene or nucleic acid sequence is heterologous because he / she is under the control of a promoter other than his / her natural promoter, he / she is introduced in a different place from this one where he / she is naturally located. The host cell may contain a copy of the endogenous gene prior to the introduction of the heterologous gene or it may not contain an endogenous copy. Furthermore, the nucleic acid sequence may be heterologous in the sense that the coding sequence has been optimized for expression in the host microorganism. Preferably, in the present document, a heterologous nucleic sequence encodes a protein which is heterologous to the host cell, that is to say which is not naturally present in yeast. As used herein, the term "native" or "endogenous", relative to the host microorganism, refers to a genetic element or protein naturally present in said microorganism.
Le terme « gène » désigne tout acide nucléique codant pour une protéine. Le terme gène englobe l'ADN, comme l'ADNc ou l'ADNg, ainsi que l'ARN. Le gène peut d'abord être préparé par des techniques recombinantes, enzymatiques et/ou chimiques, et ensuite répliqué dans une cellule hôte ou un système in vitro. Le gène comprend typiquement un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine souhaitée. Le gène peut contenir des séquences supplémentaires telles qu'un terminateur de transcription ou un peptide signal. En raison de la dégénérescence du code génétique, plusieurs acides nucléiques peuvent coder un polypeptide particulier. Ainsi, les codons dans la séquence codante pour un polypeptide donné peuvent être modifiés de telle sorte que l'expression optimale dans un microorganisme particulier soit obtenue, par exemple en utilisant des tables de traduction de codon appropriées pour ce microorganisme. Les acides nucléiques peuvent également être optimisés selon une teneur en GC préférable pour la levure particulière et/ou pour réduire le nombre de séquences répétées. Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques hétérologues ont été optimisés par codon pour une expression dans le microorganisme concerné. L'optimisation des codons peut être effectuée par des procédés de routine connus dans la technique (voir, par exemple, Welch, M., et al. (2011), Methods in Enzymology 498: 43-66). The term “gene” denotes any nucleic acid encoding a protein. The term gene encompasses DNA, such as cDNA or gDNA, as well as RNA. The gene can first be prepared by recombinant, enzymatic and / or chemical techniques, and then replicated in a host cell or an in vitro system. The gene typically comprises an open reading frame encoding a desired protein. The gene may contain additional sequences such as a transcription terminator or a signal peptide. Due to the degeneration of the genetic code, several nucleic acids can encode a particular polypeptide. Thus, the codons in the coding sequence for a given polypeptide can be altered such that optimal expression in a particular microorganism is obtained, for example by using codon translation tables appropriate for that microorganism. Nucleic acids can also be optimized to a GC content preferable for the particular yeast and / or to reduce the number of repeat sequences. In some embodiments, the heterologous nucleic acids have been optimized by codon for expression in the relevant microorganism. Optimization of codons can be accomplished by routine methods known in the art (see, eg, Welch, M., et al. (2011), Methods in Enzymology 498: 43-66).
Le terme « lié de manière opérationnelle » désigne une configuration dans laquelle une séquence de contrôle est placée à une position appropriée par rapport à une séquence codante, de telle sorte que la séquence de contrôle dirige l'expression de la séquence codante. The term "operably linked" refers to a configuration in which a control sequence is placed at an appropriate position relative to a coding sequence, such that the control sequence directs expression of the coding sequence.
Le terme « séquences de contrôle » désigne les séquences d'acide nucléique nécessaires à l'expression d'un gène. Les séquences de contrôle peuvent être natives ou hétérologues. Des séquences de contrôle bien connues et actuellement utilisées par l'homme du métier seront préférées. De telles séquences de contrôle comprennent, mais sans s'y limiter, un leader, une séquence de polyadénylation, une séquence de propeptide, un promoteur, une séquence de peptide de signal et un terminateur de transcription. De préférence, les séquences de contrôle comprennent un promoteur et un terminateur de transcription. Le terme « cassette d'expression » désigne une construction d'acide nucléique comprenant une région codante, c'est-à-dire un gène, et une région de régulation, c'est-à-dire comprenant une ou plusieurs séquences de contrôle, liées de manière opérationnelle. De préférence, les séquences de contrôle conviennent au microorganisme hôte. The term “control sequences” denotes the nucleic acid sequences necessary for the expression of a gene. The control sequences can be native or heterologous. Control sequences well known and currently used by those skilled in the art will be preferred. Such control sequences include, but are not limited to, a leader, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a signal peptide sequence and a transcription terminator. Preferably, the control sequences comprise a promoter and a transcription terminator. The term “expression cassette” denotes a nucleic acid construct comprising a coding region, ie a gene, and a regulatory region, ie comprising one or more control sequences. , linked in an operational manner. Preferably, the control sequences are suitable for the host microorganism.
Tel qu'utilisé ici, le terme « vecteur d'expression » désigne une molécule d'ADN ou d'ARN qui comprend une cassette d'expression. De préférence, le vecteur d'expression est une molécule d'ADN double brin linéaire ou circulaire. Le vecteur peut comprendre en outre une origine de réplication, un marqueur de sélection, etc. As used herein, the term "expression vector" refers to a DNA or RNA molecule which comprises an expression cassette. Preferably, the expression vector is a linear or circular double stranded DNA molecule. The vector may further include an origin of replication, a selection marker, etc.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d’acide nucléique ou d’acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d’acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l’alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci- après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d’acide nucléique ou d’acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement aux fins de la détermination du pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé de diverses façons qui sont bien connues dans le domaine, par exemple en utilisant des logiciels informatiques disponibles sur le Web sur Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. Nih.gov/ ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). L'homme du métier peut déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement, y compris tout algorithme nécessaire pour obtenir un alignement maximal sur toute la longueur des séquences comparées. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés se réfère à des valeurs générées à l'aide du programme d'alignement de séquence de paires EMBOSS Needle qui crée un alignement global optimal de deux séquences à l'aide de l'algorithme Needleman-Wunsch, dans lequel tous les paramètres de recherche sont définis par défaut Matrice de notation = BLOSUM62, Gap ouvert = 10, Gap extension = 0,5, pénalité d'intervalle d'extrémité = faux, intervalle d'extrémité ouvert = 10 et écart d'extrémité étendue = 0,5. Dans certains modes de réalisation, tous les pourcentages d'identité mentionnés dans cette demande peuvent être fixés à au moins 60%, au moins 70%, au moins 80%, au moins 85%, de préférence à au moins 90% d'identité, plus préférablement à au moins 95% d'identité. En particulier, sont considérés comme décrits les modes de réalisations dans lesquels tous les pourcentages d'identité de séquence des enzymes sont d'au moins 80% ou au moins 85%, de préférence d'au moins 90% ou au moins 95% d’identité de séquence. By “percentage identity” between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention, is meant a percentage of nucleotides or of identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed at random and over their entire length. The best alignment or optimal alignment is the alignment for which the percentage identity between the two sequences to be compared, as calculated below, is the highest. Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by comparison window to identify and compare the local regions of sequence similarity. Alignment for the purpose of determining percent amino acid sequence identity can be accomplished in various ways which are well known in the art, for example using computer software available on the web on the Internet such as http: //blast.ncbi.nlm. Nih.gov/ or http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Those skilled in the art can determine the appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithm necessary to achieve maximum alignment along the length of the sequences being compared. For purposes of the present invention, percent amino acid sequence identity values refer to values generated using the EMBOSS Needle pair sequence alignment program which creates an optimal overall alignment of two sequences. using the Needleman-Wunsch algorithm, in which all search parameters are set by default Scoring matrix = BLOSUM62, Open gap = 10, Gap extension = 0.5, End gap penalty = False , open end gap = 10 and extended end gap = 0.5. In some modes of realization, all identity percentages mentioned in this application can be set at at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, preferably at least 90% identity, more preferably at at least 95% identity. In particular, embodiments in which all the percentages of sequence identity of the enzymes are at least 80% or at least 85%, preferably at least 90% or at least 95%, are considered as described. sequence identity.
Dans un mode de réalisation, les polypeptides peuvent présenter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 additions, substitutions ou délétions par rapport aux séquences décrites dans les SEQ ID Nos. En particulier, ces additions, substitutions ou délétions sont introduites à l'extrémité N-terminale, C-terminale ou aux deux extrémités. In one embodiment, the polypeptides may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 additions, substitutions or deletions relative to the sequences described in SEQ ID Nos. In particular, these additions, substitutions or deletions are introduced at the N-terminus, C-terminus or at both ends.
Les polypeptides peuvent éventuellement se présenter sous forme de protéine de fusion. Les termes « surexpression » et « augmentation d’expression » tels qu’utilisés ici, sont utilisés de manière interchangeable et signifient que l’expression d’un gène ou d’une enzyme est augmentée par rapport à un microorganisme non modifié, par exemple un microorganisme de type sauvage ou ne comprenant pas les modifications génétiques décrites ici. Par « sauvage » est entendu un microorganisme non-modifié existant dans la nature. L’expression accrue d’une enzyme est habituellement obtenue en augmentant l’expression du gène codant pour ladite enzyme. Dans des modes de réalisation dans lesquels le gène ou l’enzyme n’est pas naturellement présent dans le microorganisme de l’invention, c'est-à-dire un gène ou une enzyme hétérologue, les termes « surexpression » et « expression » peuvent être utilisés de manière interchangeable. Pour augmenter l'expression d'un gène, l'homme du métier peut utiliser toutes les techniques connues telles que l'augmentation du nombre de copies du gène dans le microorganisme, en utilisant un promoteur induisant un niveau élevé d'expression du gène, c'est-à-dire un promoteur fort, en utilisant des éléments stabilisants l'ARN messager correspondant ou les séquences de séquestration du site de liaison de ribosome (RBS) et les séquences qui les entourent. En particulier, la surexpression peut être obtenue en augmentant le nombre de copies du gène dans le microorganisme. Une ou plusieurs copies du gène peuvent être introduites dans le génome par des procédés de recombinaison, connus de l'homme du métier, y compris le remplacement des gènes ou l’insertion multicopie (voir par exemple la demande de brevet international WO 2015/092013). De préférence, une cassette d’expression comprenant le gène, de préférence placé sous le contrôle d’un promoteur fort, est intégrée au génome. En variante, le gène peut être porté par un vecteur d'expression, de préférence un plasmide, comprenant une cassette d'expression avec le gène d'intérêt placé de préférence sous le contrôle d'un promoteur fort. Le vecteur d'expression peut être présent dans le microorganisme en une ou plusieurs copies, selon la nature de l'origine de la réplication. La surexpression du gène peut également être obtenue en utilisant un promoteur induisant un niveau élevé d'expression du gène. Par exemple, le promoteur d'un gène endogène peut être remplacé par un promoteur plus fort, c'est-à-dire un promoteur induisant un niveau d'expression plus élevé. Le gène endogène sous le contrôle d'un promoteur qui n'est pas le promoteur naturel est qualifié d'acide nucléique hétérologue. Les promoteurs appropriés pour être utilisés dans la présente invention sont connus de l’homme du métier et peuvent être constitutifs ou inductibles, et être endogènes ou hétérologues. The polypeptides can optionally be in the form of a fusion protein. The terms "overexpression" and "increased expression" as used herein are used interchangeably and mean that the expression of a gene or an enzyme is increased relative to an unmodified microorganism, e.g. a wild-type microorganism or not comprising the genetic modifications described herein. By "wild" is meant an unmodified microorganism existing in nature. The increased expression of an enzyme is usually achieved by increasing the expression of the gene encoding said enzyme. In embodiments in which the gene or enzyme is not naturally present in the microorganism of the invention, i.e. a heterologous gene or enzyme, the terms "overexpression" and "expression" can be used interchangeably. To increase the expression of a gene, a person skilled in the art can use all the known techniques such as increasing the number of copies of the gene in the microorganism, using a promoter inducing a high level of expression of the gene, that is, a strong promoter, using elements stabilizing the corresponding messenger RNA or ribosome binding site (RBS) sequestration sequences and surrounding sequences. In particular, overexpression can be obtained by increasing the number of copies of the gene in the microorganism. One or more copies of the gene can be introduced into the genome by recombination methods known to those skilled in the art, including gene replacement or multicopy insertion (see for example international patent application WO 2015/092013 ). Preferably, an expression cassette comprising the gene, preferably placed under the control of a promoter strong, is integrated into the genome. As a variant, the gene can be carried by an expression vector, preferably a plasmid, comprising an expression cassette with the gene of interest placed preferably under the control of a strong promoter. The expression vector may be present in the microorganism in one or more copies, depending on the nature of the origin of replication. Overexpression of the gene can also be achieved by using a promoter inducing a high level of expression of the gene. For example, the promoter of an endogenous gene can be replaced by a stronger promoter, that is to say a promoter inducing a higher level of expression. The endogenous gene under the control of a promoter which is not the natural promoter is called heterologous nucleic acid. Promoters suitable for use in the present invention are known to those skilled in the art and can be constitutive or inducible, and be endogenous or heterologous.
Par « comprenant » est également entendu « consistant » ou « consistant essentiellement ». Par « consistant essentiellement » est entendu que la séquence peut présenter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 additions, substitutions ou délétions par rapport aux séquences décrites dans les SEQ ID Nos. By “comprising” is also understood “consisting” or “essentially consisting”. By "consisting essentially" is understood that the sequence may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 additions, substitutions or deletions with respect to the sequences described in SEQ ID Nos.
Microorganismes recombinants Recombinant microorganisms
Le microorganisme selon la présente invention peut être un microorganisme eucaryote ou procaryote. The microorganism according to the present invention can be a eukaryotic or prokaryotic microorganism.
Dans un premier mode de réalisation, le microorganisme est un eucaryote. De préférence, il est une levure de l'ordre des Saccharomycetales, Sporidiobolales et Schizosaccharomycetales. La levure peut par exemple être sélectionnée parmi Pichia, Kluyveromyces, Soccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, ou Dehoryomyces. Dans un mode de réalisation, la levure est choisie parmi Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Soccharomyces cerevisiae, Soccharomyces carlshergensis, Soccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Soccharomyces kluyveri, Soccharomyces norhensis, Soccharomyces oviformis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Dehoryomyces hansenii et Lipomyces starkeyi. Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme est une levure Saccharomyces, de préférence une levure Saccharomyces cerevisiae. De manière alternative, le microorganisme peut être un champignon, de préférence un champignon filamenteux. De préférence, il est choisi parmi Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochiobolus ou Pyricularia. Préférentiellement, le champignon est choisi parmi Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, et Trichoderma viride. In a first embodiment, the microorganism is a eukaryote. Preferably, it is a yeast of the order of Saccharomycetales, Sporidiobolales and Schizosaccharomycetales. The yeast may for example be selected from Pichia, Kluyveromyces, Soccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, or Dehoryomyces. In one embodiment, the yeast is selected from Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Soccharomyces cerevisiae, Soccharomyces carlshergensis, Soccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Soccharomyces kluyveri, Soccharomyces kluyveriomyces, Schidaharomyces ovisoccyceshyceshyida, Soccisoccomyces norceshidomyces norcesidomyces norcesidaceshidomyces albida, Soccidaomyces albidae, Soccidaomyces albida, Soccidaomyces albidae Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Dehoryomyces hansenii and Lipomyces starkeyi. In a preferred embodiment, the microorganism is a Saccharomyces yeast, preferably a Saccharomyces cerevisiae yeast. Alternatively, the microorganism can be a fungus, from preferably a filamentous fungus. Preferably, it is chosen from Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochiobolus or Pyricularia. Preferably, the fungus is chosen from Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, and Trichoderma viride.
Dans un deuxième mode de réalisation, le microorganisme est un procaryote. De préférence, il est une bactérie, notamment choisie parmi les phyla Acidohacteria, Actinobacteria, Aguificae, Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, ou Verrucomicrobia. De manière préférée, la bactérie appartient au genre Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Anaerobiospirillum, Aguifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobium, Chromatium, Chlorobaculum, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geohacter, Gloeobacter, Gluconobacter, Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Microcystis, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrospina, Nitrospira, Nostoc, Phormidium, Prochlorococcus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptomyces, Synechoccus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Trichodesmium, ou Zymomonas. De manière encore préférée, la bactérie est choisie parmi les espèces Agrobacterium tumefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aguifex aeolicus, Aguifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliguefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium pasteurianum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beigerinckii, Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Gluconobacter oxydons, Hydrogenobacter thermophilus, Klebsiella oxytoca, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Mannheimia succiniciproducens, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium etli, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Streptomyces coelicolor, Zymomonas mobilis, Acaryochloris marina, Anabaena variabilis, Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Chlorobium tepidum, Chlorobaculum sp., Cyanothece sp., Gloeobacter violacé us, Microcystis aeruginosa, Nostoc punctiforme, Prochlorococcus marinus, Synechococcus elongatus, Synechocystis sp., Thermosynechococcus elongatus, Trichodesmium erythraeum, et Rhodopseudomonas palustris. Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme est une bactérie Escherichia coli, par exemple E. coli BL21, E. coli BL21 (DE3), E. coli MG1655 ou E. coli W31 10 et leurs dérivés. Dans un mode de réalisation alternatif, le microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces, en particulier Streptomyces venezuelae. In a second embodiment, the microorganism is a prokaryote. Preferably, it is a bacterium, in particular chosen from among the phyla Acidohacteria, Actinobacteria, Aguificae, Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrutesobacteresobacteres, Firmicmatiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrutesobacteresobacteria, Firmicmatiae, Nectrobacteria, Nectarmatiae, Firmicmatiae, Chlorobi, , Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, or Verrucomicrobia. Preferably, the bacterium belongs to the genus Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Anaerobiospirillum, Aguifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chlororybacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatobacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatobacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatobacterium, Burkholderia, Chlorobriobidium, Chromatos, , Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geohacter, Gloeobacter, Gluconobacter, Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Gloeobacter, Gluconobacter, Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Microcystea, Nitrospidosporidae, Nitrospi-troCiSiNoBacterium, Microcysteudomonus, Nitrospi-tridium, Nitrospi-troCiBacterium, Microcysteudomonus, Nitrospiracillus, Nitrospi-Bacterium, Nitrospitrospira, Nitrosospiospi , Ralstonia, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptomyces, Synechoccus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Trichodesmium, or Zymomonas. Even more preferably, the bacterium is chosen from the species Agrobacterium tumefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aguifex aeolicus, Aguifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliguefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Closumrevibickiidium, Ammonium, Closumidicidium, Brevibacterium ammoniagenes, Closumrevibickiidium, Closumidicidium, Bacillus amyloliguefacins, Brevibacterium ammoniagenes, Closumidicidium, Brevibacterium ammoniagenes, Closumidicidium, Brevibacterium, Clostricidium, Closumidium, Bacillus amyloliguefacins, Brevibacterium. , Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Gluconobacter oxydons, Hydrogenobacter thermophilus, Klebsiella oxytoca, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Psproducondomeudomeudominosa, Psprosondomeudomeudominica, Psprizondomeudomineus, Psudondomeudomineus, Psudondomeudominica, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Psprizondomeudomeudomeudomeudomeudomeudomeudomeudomineus putida, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium etli, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigellaenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Dysomonicolus variineus aureusisomycesa, Aneusochlorosis aureus, Aneusochlorosis aureus, Aneus and Choneusis, Aneusochlorosis, Aneuschlorosis aureus, Aneus, Zona, Zona, Zona and Chlorocci, Aneusochlorosis, Aneuschlorosis, Aneus and Choneusis aureusis, Aneus, Zona, Acidochloro, Aneusa, Zona, Zona, Acidochlorosis Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Chlorobium tepidum, Chlorobaculum sp., Cyanothece sp., Gloeobacter violaceous us, Microcystis aeruginosa, Nostoc punctiforme, Prochlorococcus marinus, Synechococcus elongatus, Synechocystis sp., Elmasynustrdomichiumus In a preferred embodiment, the microorganism is an Escherichia coli bacterium, for example E. coli BL21, E. coli BL21 (DE3), E. coli MG1655 or E. coli W31 and their derivatives. In an alternative embodiment, the microorganism is a bacterium of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces venezuelae.
Les microorganismes peuvent avoir été modifiés pour augmenter la production de tyrosine et/ou de phénylalanine, de préférence de la tyrosine. Notamment, les gènes responsables de la rétro-inhibition de la production de la tyrosine et/ou phénylalanine, de préférence de la tyrosine, peuvent être inactivés. De manière alternative ou cumulative, la voie de la biosynthèse de la tyrosine et/ou phénylalanine, de préférence de la tyrosine, peut être optimisée, notamment en redirigeant le flux de carbone d'autres voies métaboliques vers celle de la tyrosine et/ou de la phénylalanine, de préférence de la tyrosine. Ces modifications et ces gènes sont bien connus de l'homme du métier (voir US 8,809,028 ; Pandey et al, 2016, Biotechnol Adv., 34, 634-662). The microorganisms may have been modified to increase the production of tyrosine and / or phenylalanine, preferably tyrosine. In particular, the genes responsible for the feedback inhibition of the production of tyrosine and / or phenylalanine, preferably tyrosine, can be inactivated. Alternatively or cumulatively, the pathway for the biosynthesis of tyrosine and / or phenylalanine, preferably tyrosine, can be optimized, in particular by redirecting the flow of carbon from other metabolic pathways towards that of tyrosine and / or of phenylalanine, preferably tyrosine. These modifications and these genes are well known to those skilled in the art (see US Pat. No. 8,809,028; Pandey et al, 2016, Biotechnol Adv., 34, 634-662).
Ainsi, dans un mode de réalisation, le microorganisme produit des quantités importantes de tyrosine et/ou de phénylalanine, en particulier à partir d'une source carbonée simple comme le glucose. Thus, in one embodiment, the microorganism produces significant amounts of tyrosine and / or phenylalanine, in particular from a simple carbon source such as glucose.
Modifications permettant la production d'hespéridine et/ou de diosmine Modifications allowing the production of hesperidin and / or diosmin
Le microorganisme recombinant selon la présente invention a été modifié pour produire de l'hespéridine et/ou de la diosmine. Notamment, pour permettre au microorganisme de synthétiser l'hespéridine et/ou la diosmine à partir de l'hespérétine et/ou de la diosmétine respectivement, le microoganisme a été modifié pour introduire les enzymes nécessaires à la glycosylation de l'hespérétine et/ou de la diosmétine en position 7 et au transfert d'un rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7- O-glucoside. Dans un premier mode de réalisation, le microorganisme recombinant est capable de produire de l'hespérétine et/ou de la diosmétine, en particulier il a été modifié dans ce but. Dans un mode de réalisation alternatif, l'hespérétine et/ou la diosmétine peuvent être apportées au microorganisme, par exemple par ajout de ces composés dans le milieu de culture. The recombinant microorganism according to the present invention has been modified to produce hesperidin and / or diosmin. In particular, to allow the microorganism to synthesize hesperidin and / or diosmin from hesperetin and / or diosmetin respectively, the microorganism has been modified to introduce the enzymes necessary for the glycosylation of hesperetin and / or diosmetin in position 7 and the transfer of a rhamnose in position 6 of glucose from hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside. In a first embodiment, the recombinant microorganism is capable of producing hesperetin and / or diosmetin, in particular it has been modified for this purpose. In an alternative embodiment, hesperetin and / or diosmetin can be supplied to the microorganism, for example by adding these compounds to the culture medium.
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme produit l'hespéridine. La diosmine peut alors être préparée à partir de l'hespéridine par conversion chimique, notamment par oxydation. In a particular embodiment, the microorganism produces hesperidin. Diosmin can then be prepared from hesperidin by chemical conversion, in particular by oxidation.
Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme produit l'hespéridine et la diosmine. In a preferred embodiment, the microorganism produces hesperidin and diosmin.
Ainsi, le microorganisme recombinant comprend : Thus, the recombinant microorganism comprises:
a. une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et/ou la diosmétine ; at. a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin;
b. une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6-0- rhamnosyltransferase (RhaT) capable de transférer un rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O- glucoside; et b. a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside; and
c. une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4- kéto-L-rhamnose-réductase (RHM) capable de produire de l'UDP-rhamnose. vs. a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) capable of producing UDP-rhamnose.
Dans un mode de réalisation, la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT), la 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) et l'UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D- glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase (RHM) sont des enzymes hétérologues au microorganisme. In one embodiment, flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT), 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT), and UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6 -deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM) are enzymes heterologous to the microorganism.
UGT : Flavanone 7-O-bêta-glucosyltransférase UGT: Flavanone 7-O-beta-glucosyltransferase
L'UGT est une enzyme qui réalise le transfert d'un glucose en position 7 de l'hespérétine et/ou de la diosmétine. Le nom de l'UGT est UDP-glucose : flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase ou flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase. Elle est également appelée par les dénominations suivantes : uridine diphosphoglucose-flavanone 7-0- glucosyltransférase, naringénine 7-O-glucosyltransférase, et hespérétine 7-O-glucosyl- transférase. Cette enzyme appartient à la classe des EC 2.4.1.185. Les inventeurs ont dû identifier et sélectionner des enzymes capables d'accepter de l'hespérétine et/ou de la diosmétine comme substrat et d'ajouter un glucose en position 7 de ces composés. De préférence, l'enzyme est sélectionnée de sorte à présenter une préférence pour une glycosylation en position 7 de l'hespérétine et/ou de la diosmétine. Dans un mode de réalisation préféré, l'enzyme est spécifique de la position 7 de l'hespérétine et/ou de la diosmétine. UGT is an enzyme which transfers glucose to position 7 of hesperetin and / or diosmetin. The name of the UGT is UDP-glucose: flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase or flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase. It is also called by the following names: uridine diphosphoglucose-flavanone 7-0-glucosyltransferase, naringenin 7-O-glucosyltransferase, and hesperetin 7-O-glucosyl-transferase. This enzyme belongs to the class of EC 2.4.1.185. The inventors had to identify and select enzymes capable of accepting hesperetin and / or diosmetin as a substrate and of adding glucose at position 7 of these compounds. Preferably, the enzyme is selected so as to exhibit a preference for glycosylation at the 7-position of hesperetin and / or diosmetin. In a preferred embodiment, the enzyme is specific for the 7-position of hesperetin and / or diosmetin.
Le microorganisme comprend donc une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et la diosmétine. The microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and diosmetin.
Par « activité 7-O-bêta-glycosyltransférase » est entendue une enzyme UGT capable de rajouter un glucose en position 7 d'un flavonoïde. Pour déterminer s'il y a une activité 7-O- bêta-glycosyltransférase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro de l'enzyme flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase en présence de NAD(P)H, O2, et d'un flavonoïde, dans des conditions optimales (pH, ions...), et l'observation en UPLC-MS et en comparaison au standard attendu de l'apparition d'un flavonoïde ayant un glucose supplémentaire en position 7. De préférence, le flavonoïde est l'hespérétine ou la diosmétine et le flavonoïde ayant un glucose supplémentaire en position 7 est leur forme avec un glucose supplémentaire en position 7, c'est-à-dire l'hespérétine 7-O-glucoside et la diosmétine 7-0 glucoside. By “7-O-beta-glycosyltransferase activity” is meant a UGT enzyme capable of adding glucose at position 7 of a flavonoid. To determine if there is 7-O-beta-glycosyltransferase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase enzyme in the presence of NAD ( P) H, O2, and of a flavonoid, under optimal conditions (pH, ions ...), and the observation in UPLC-MS and in comparison with the expected standard of the appearance of a flavonoid having a glucose additional at position 7. Preferably the flavonoid is hesperetin or diosmetin and the flavonoid having additional glucose at position 7 is their form with additional glucose at position 7, i.e. hesperetin 7- O-glucoside and diosmetin 7-0 glucoside.
Cette enzyme n'est présente que dans des eucaryotes supérieurs, en particulier dans les plantes. Par exemple, l'enzyme peut provenir de plantes du genre Citrus, en particulier Citrus maxima, Citrus sinensis, Citrus ciementina, Citrus mitis et Citrus x paradisi, Lysium, en particulier Lysium harharum, Pétunia, en particulier Pétunia x hybrida, Arabidopsis, en particulier Arabidopsis thaliana, ou Scutellaria, en particulier Scutellaria baicalensis. This enzyme is only present in higher eukaryotes, especially in plants. For example, the enzyme can be obtained from plants of the genus Citrus, in particular Citrus maxima, Citrus sinensis, Citrus ciementina, Citrus mitis and Citrus x paradisi, Lysium, in particular Lysium harharum, Petunia, in particular Petunia x hybrida, Arabidopsis, in especially Arabidopsis thaliana, or Scutellaria, in particular Scutellaria baicalensis.
Dans un mode de réalisation, l'UGT est une enzyme d 'Arabidopsis thaliana, de Scutellaria baicalensis ou d’Homo sapiens. De préférence, l'UGT est une enzyme d 'Arabidopsis thaliana ou de Scutellaria baicalensis. In one embodiment, the UGT is an enzyme from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens. Preferably, the UGT is an enzyme from Arabidopsis thaliana or from Scutellaria baicalensis.
Dans un mode de réalisation préféré, l'UGT est une enzyme de Citrus sinensis, de Citrus ciementina, d 'Arabidopsis thaliana, de Scutellaria baicalensis ou d’Homo sapiens, de préférence de Citrus sinensis ou de Scutellaria baicalensis. In a preferred embodiment, the UGT is an enzyme from Citrus sinensis, Citrus ciementina, Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Citrus sinensis or Scutellaria baicalensis.
Dans un mode de réalisation particulier, l'UGT est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, notamment avec l'hespérétine et/ou de la diosmétine comme substrat. In a particular embodiment, the UGT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, in particular with hesperetin and / or diosmetin as substrate.
Dans un mode de réalisation préféré, l'UGT est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase. De manière plus particulièrement préféré, l'UGT est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase In a preferred embodiment, the UGT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O activity -beta-D-glucosyltransferase. More particularly preferably, the UGT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity
Ainsi, l'UGT peut être d’Arabidopsis tholiono. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence NM_119576 et N P_567955.1, respectivement, et plus particulièrement dans la SEQ ID NO : 91. La protéine est également décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence UGT73B1. Thus, the UGT may be Arabidopsis tholiono. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers NM_119576 and N P_567955.1, respectively, and more particularly in SEQ ID NO: 91. The protein is also described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number UGT73B1.
De manière alternative, l'UGT est de Scutellario baicalensis. Dans un premier aspect, les séquences nucléiques codant une première UGT et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KU712253 et AMK52071.1, respectivement, et plus particulièrement dans la SEQ ID NO : 93. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence A0A140DPB7. Dans un deuxième aspect, les séquences nucléiques codant une seconde UGT et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KU712254 et AMK52072.1, respectivement, et plus particulièrement dans la SEQ ID NO : 95. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence A0A140DPB8. Dans un troisième aspect, les séquences nucléiques codant une troisième UGT et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KU712255 et AMK52073.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 97. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence A0A140DPB9. Alternatively, the UGT is Scutellario baicalensis. In a first aspect, the nucleic acid sequences encoding a first UGT and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KU712253 and AMK52071.1, respectively, and more particularly in SEQ ID NO: 93. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140DPB7. In a second aspect, the nucleic acid sequences encoding a second UGT and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KU712254 and AMK52072.1, respectively, and more particularly in SEQ ID NO: 95. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140DPB8. In a third aspect, the nucleic acid sequences encoding a third UGT and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KU712255 and AMK52073.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 97. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140DPB9.
Par ailleurs, l'UGT peut être d’Homo sapiens. Dans un premier aspect, l'UGT est UGT1A6 (UDP glucuronosyltransferase family 1 member A6). La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence P19224. La séquence codante consensus est décrite dans NCBI sous le numéro CCDS2507.1. La séquence de cette enzyme est décrite dans la SEQ ID NO : 99. Dans un second aspect, l'UGT est UGT1A7 (UDP glucuronosyltransferase family 1 member A7). La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q9HAW7. La séquence codante consensus est décrite dans NCBI sous le numéro CCDS2506.1. la séquence de cette enzyme est décrite dans la SEQ ID NO : 101. On the other hand, the UGT can be Homo sapiens. In a first aspect, the UGT is UGT1A6 (UDP glucuronosyltransferase family 1 member A6). The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P19224. The consensus coding sequence is described in NCBI under the number CCDS2507.1. The sequence of this enzyme is described in SEQ ID NO: 99. In a second aspect, the UGT is UGT1A7 (UDP glucuronosyltransferase family 1 member A7). The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9HAW7. The consensus coding sequence is described in NCBI under the number CCDS2506.1. the sequence of this enzyme is described in SEQ ID NO: 101.
L'UGT peut également est de Citrus, en particulier de Citrus sinensis ou Citrus clementina. En particulier, l'UGT de Citrus sinensis est décrite dans la SEQ ID NO : 113. Une séquence nucléotidique codant pour cette enzyme est décrite dans la SEQ ID NO : 114. L'UGT de Citrus clementina est décrite dans la SEQ ID NO : 115. Une séquence nucléotidique codant pour cette enzyme est décrite dans la SEQ ID NO : 116. The UGT can also be from Citrus, in particular from Citrus sinensis or Citrus clementina. In particular, the Citrus sinensis UGT is described in SEQ ID NO: 113. A nucleotide sequence encoding this enzyme is described in SEQ ID NO: 114. The Citrus clementina UGT is described in SEQ ID NO: 115. A nucleotide sequence encoding this enzyme is described in SEQ ID NO: 116.
Selon un mode de réalisation préféré, l'UGT est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NOs: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase. According to a preferred embodiment, the UGT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity.
RhaT : 6-O-rhamnosyltransférase RhaT: 6-O-rhamnosyltransferase
La RhaT est une enzyme qui réalise le transfert d'u n rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O-glucoside. La RhaT est une 6-0- rhamnosyltransferase. Cette enzyme appartient à la classe des EC 2.4.1.B53. Les inventeurs ont dû identifier et sélectionner des enzymes capables d'accepter de rhespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O-glucoside comme substrat et d'ajouter un rhamnose en position 6 du glucose de ces composés. RhaT is an enzyme which carries out the transfer of u n rhamnose to the 6-position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside. RhaT is a 6-0-rhamnosyltransferase. This enzyme belongs to the class of EC 2.4.1.B53. The inventors had to identify and select enzymes capable of accepting rhesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside as substrate and of adding a rhamnose at position 6 of the glucose of these compounds.
Le microorganisme comprend donc une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) capable de transférer un rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O-glucoside. Cette enzyme n'est présente que dans des eucaryotes supérieurs, en particulier dans les plantes. Par « activité 6-O-rhamnosyltransferase » est entendu l'ajout d'un rhamnose en position 6 du glucose par l'enzyme RhaT. Pour déterminer s'il y a une activité 6-O- rhamnosyltransferase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro de l'enzyme 6-O-rhamnosyltransferase en présence de NAD(P)H, O2, et d'un flavonoïde, dans des conditions optimales (pH, ions...), et l'observation en UPLC-MS et en comparaison au standard attendu de l'apparition d'un flavonoïde où es ajouté un rhamnose en position 6 du glucose. De préférence, le flavonoïde est l'hespérétine 7-0- glucoside ou la diosmétine 7-O-glucoside et le flavonoïde où est ajouté un rhamnose en position 6 du glucose sont l'hespéridine et la diosmine. The microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7- O-glucoside. This enzyme is only present in higher eukaryotes, especially in plants. By “6-O-rhamnosyltransferase activity” is meant the addition of a rhamnose at position 6 of glucose by the enzyme RhaT. To determine if there is 6-O-rhamnosyltransferase activity, an enzymatic test can be performed which consists of in vitro incubation of the 6-O-rhamnosyltransferase enzyme in the presence of NAD (P) H, O2, and of a flavonoid, under optimal conditions (pH, ions ...), and the observation in UPLC-MS and in comparison to the expected standard of the appearance of a flavonoid where a rhamnose is added at position 6 of the glucose . Preferably, the flavonoid is hesperetin 7-0-glucoside or diosmetin 7-O-glucoside and the flavonoid to which a rhamnose is added at position 6 of glucose are hesperidin and diosmin.
De préférence, cette enzyme est une enzyme produite par une plante du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence de l'espèce Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina. De préférence, l'enzyme est une enzyme provenance de Citrus sinensis ou Citrus clementina. Preferably, this enzyme is an enzyme produced by a plant of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably of the species Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina. Preferably, the enzyme is an enzyme from Citrus sinensis or Citrus clementina.
Dans un mode de réalisation particulier, la 6-O-rhamnosyltransferase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6-O- rhamnosyltransferase. In a particular embodiment, 6-O-rhamnosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting 6-O-rhamnosyltransferase activity.
Ainsi, la RhaT peut être de Citrus clementina. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro XM_006420965 pour la séquence nucléique et sous le numéro XP_006421028 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID NO : 103. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence V4RJL6. Thus, the RhaT can be from Citrus clementina. It is described in the Genbank database of NCBI under the number XM_006420965 for the nucleic sequence and under the number XP_006421028 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 103. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number V4RJL6.
La RhaT peut également être de Citrus sinensis. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro DQ119035 pour la séquence nucléique et sous le numéro ABA18631.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID NO : 105. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence A7ISD3. Dans un mode de réalisation particulier, la RhaT est de Citrus sinensis et est une enzyme comprenant la séquence SEQ ID NO: 105 ou un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase. The RhaT can also be from Citrus sinensis. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ119035 for the nucleic sequence and under number ABA18631.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 105. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A7ISD3. In a particular embodiment, the RhaT is from Citrus sinensis and is an enzyme comprising the sequence SEQ ID NO: 105 or a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequenced therewith and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity.
Dans un mode de réalisation préféré, le RhaT est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase. In a preferred embodiment, the RhaT is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity.
RH M : UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP- 4-kéto-L-rhamnose-réductase RH M: UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP- 4-keto-L-rhamnose-reductase
La RHM est une enzyme trifonctionnelle UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6- désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. Cette enzyme est capable de produire de l'UDP-rhamnose à partir de l'UDP-glucose. Cette enzyme appartient à la classe des EC 4.2.1.76. L'UDP-rhamnose est nécessaire pour une activité de la 6-0- rhamnosyltransferase (RhaT). RHM is a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase trifunctional enzyme. This enzyme is able to produce UDP-rhamnose from UDP-glucose. This enzyme belongs to the class of EC 4.2.1.76. UDP-rhamnose is required for 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) activity.
Le microorganisme comprend donc une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase (RHM) capable de produire de l'UDP- rhamnose. Cette enzyme n'est présente que dans des eucaryotes supérieurs, en particulier dans les plantes. The microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L -rhamnose-reductase (RHM) capable of producing UDP-rhamnose. This enzyme is only present in higher eukaryotes, especially in plants.
Par « activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase» est entendue la transformation de l'UDP- glucose en UDP-rhamnose. Pour déterminer s'il y a une activité UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro de l'enzyme UDP-glucose de NAD(P)H, O2, dans des conditions optimales (pH, ions...), et l'observation en UPLC-MS et en comparaison au standard attendu de l'apparition d'un UDP-rhamnose. By "UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity" is meant the transformation of 'UDP-glucose to UDP-rhamnose. To determine if there is UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose reductase activity, a enzymatic test can be carried out which consists of the in vitro incubation of the UDP-glucose enzyme of NAD (P) H, O2, under optimal conditions (pH, ions ...), and observation in UPLC-MS and in comparison to the expected standard of the appearance of UDP-rhamnose.
De préférence, cette enzyme est une enzyme produite par une plante du genre Citrus, en particulier Citrus sinensis, ou par Arabidopsis thaliana. Dans un mode de réalisation particulier, l'LIDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6- désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109, 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase. Preferably, this enzyme is an enzyme produced by a plant of the genus Citrus, in particular Citrus sinensis, or by Arabidopsis thaliana. In a particular embodiment, LIDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109, 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity.
La RHM peut être de Citrus sinensis. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro XM_006477756 pour la séquence nucléique et sous le numéro XP_006477819.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans la SEQ ID NO : 107. RHM can be from Citrus sinensis. It is described in the NCBI Genbank database under the number XM_006477756 for the nucleic acid sequence and under the number XP_006477819.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 107.
La RHM peut également être d'Arabidopsis thaliana. Dans un premier aspect, la protéine est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro AY081471 pour la séquence nucléique et sous le numéro AAM10033.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans la SEQ ID NO : 109. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q9SYM5. Dans un deuxième aspect, la protéine est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro AJ565874 pour la séquence nucléique et sous le numéro CAD92667.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans la SEQ ID NO : 111. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q9LPG6. RHM can also be Arabidopsis thaliana. In a first aspect, the protein is described in the Genbank database of NCBI under the number AY081471 for the nucleic sequence and under the number AAM10033.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 109. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9SYM5. In a second aspect, the protein is described in the NCBI Genbank database under the number AJ565874 for the nucleic acid sequence and under the number CAD92667.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID NO: 111. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9LPG6.
Dans un mode de réalisation particulier, la RHM une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6- désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. In a particular embodiment, the RHM an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity.
Dans un mode de réalisation préféré, la RHM est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy- D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. In a preferred embodiment, the RHM is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity.
Combinaison d'enzymes Combination of enzymes
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme recombinant comprend : une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) d’Arabidopsis thaliana, de Scutellaria baicalensis ou d’Homo sapiens, de préférence d’Arabidopsis thaliana ou de Scutellaria baicalensis, de préférence une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; de manière particulière une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase, et de manière tout particulièrement préférée, comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase, en particulier comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; In a particular embodiment, the recombinant microorganism comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis, preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, and very particularly preferably, comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 , 115 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, in particular comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone activity 7-O-beta-D-glucosyltransferase;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6-0- rhamnosyltransferase (RhaT) du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus clementina, de préférence une 6-0- rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6-O-rhamnosyltransferase, et de préférence une RhaT comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NOs: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RHM) de Citrus sinensis ou d’Arabidopsis thaüana, de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase, en particulier une RHM comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase, et de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NOs: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D- glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, of preferably a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting a 6-O-rhamnosyltransferase activity, and preferably an RhaT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) of Citrus sinensis or Arabidopsis thaüana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and showing UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L activity -rhamnose-reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity, and preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NO s: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto activity -6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme recombinant comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase (RHM) telles que définies dans le mode de réalisation précédent et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) d’Arabidopsis thaliana, de Scutellaria baicalensis ou d’Homo sapiens, de préférence d’Arabidopsis thaliana ou de Scutellaria baicalensis, de préférence une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; de manière particulière une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase. In another particular embodiment, the recombinant microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose- reductase (RHM) as defined in the previous embodiment and a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably from Arabidopsis thaliana or from Scutellaria baicalensis, preferably from flavanone 7-O-beta - D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanon activity e 7-O-beta-D-glucosyltransferase; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity.
Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme comprend In a preferred embodiment, the microorganism comprises
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O- bêta-D-glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi les SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, et de manière plus particulièrement préférée, sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from among SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta activity -D-glucosyltransferase, and more particularly preferably, selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and presenting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant une 6"-0- rhamnosyltransferase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NOs: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NOs: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP- glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase. - a heterologous nucleic acid sequence encoding a selected UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose- reductase from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose activity 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
Dans un mode de réalisation particulier, les enzymes ci-dessus décrites sont des enzymes d'eucaryotes supérieurs, de préférence des enzymes de plante. Dans un mode de réalisation particulier, les enzymes proviennent de plantes du même genre, par exemple de même espèce. Modifications permettant la production d'hespérétine et/ou de diosmétine In a particular embodiment, the enzymes described above are enzymes from higher eukaryotes, preferably plant enzymes. In a particular embodiment, the enzymes originate from plants of the same genus, for example of the same species. Modifications allowing the production of hesperetin and / or diosmetin
Comme indiqué précédemment, soit l'hespérétine et/ou la diosmétine sont apportées au microorganisme, soit le microorganisme est capable de produire l'hespérétine et/ou la diosmétine. En particulier, le microorganisme est, ou a été modifié pour être capable de produire l'hespérétine et/ou la diosmétine. Les inventeurs ont donc en outre développé une voie de biosynthèse permettant au microorganisme de produire l'hespérétine et/ou la diosmétine. As indicated above, either hesperetin and / or diosmetin are supplied to the microorganism, or the microorganism is capable of producing hesperetin and / or diosmetin. In particular, the microorganism is, or has been, modified to be capable of producing hesperetin and / or diosmetin. The inventors have therefore further developed a biosynthetic pathway allowing the microorganism to produce hesperetin and / or diosmetin.
De Naringénine/Apigénine à Hespérétine/Diosmétine From Naringenin / Apigenin to Hesperetin / Diosmetin
L'hespérétine et/ou la diosmétine peuvent être obtenues à partir de la naringénine et de l'apigénine. Hesperetin and / or diosmetin can be obtained from naringenin and apigenin.
Plusieurs stratégies de biosynthèse étaient possibles. Pour préparer l'hespérétine et/ou de la diosmétine, il est nécessaire de procéder à deux modifications : la méthylation de l'hydroxyle en position 4' et l'hydroxylation de la position 3'. Ainsi, pour augmenter la spécificité de la méthylation de l'hydroxyle en position 4', il semble logique de procéder d'abord à la méthylation du groupe hydroxyle déjà présent avant d'ajouter un second groupe hydroxyle en position 3'. Tout au contraire, les inventeurs ont abouti à la conclusion qu'il était nécessaire de procéder d'abord à l'hydroxylation puis à la méthylation, malgré le risque de problème de spécificité de méthylation dû à l'introduction du deuxième hydroxyle. Several biosynthetic strategies were possible. To prepare hesperetin and / or diosmetin, it is necessary to carry out two modifications: methylation of the hydroxyl at the 4 'position and the hydroxylation of the 3' position. Thus, to increase the specificity of the methylation of the hydroxyl at the 4 'position, it seems logical to first proceed with the methylation of the hydroxyl group already present before adding a second hydroxyl group at the 3' position. Quite the contrary, the inventors have come to the conclusion that it is necessary to proceed first with the hydroxylation and then with the methylation, despite the risk of methylation specificity problem due to the introduction of the second hydroxyl.
F3'H : Flavonoïde 3'-monooxygénase F3'H: Flavonoid 3'-monooxygenase
La flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) est une enzyme qui réalise l'addition d'un groupe hydroxyle en position 3' de la naringénine et/ou de l'apigénine. Cette enzyme appartient à la classe des EC 1.14.14.82. Elle est également appelée flavone 3'-hydroxylase. The flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) is an enzyme which carries out the addition of a hydroxyl group at the 3 'position of naringenin and / or apigenin. This enzyme belongs to the class of EC 1.14.14.82. It is also called flavone 3'-hydroxylase.
Les inventeurs ont dû identifier et sélectionner des enzymes capables d'accepter la naringénine et/ou l'apigénine comme substrat et d'ajouter un groupe hydroxyle en position 3' de ces composés. De préférence, l'enzyme est sélectionnée de sorte à présenter une préférence pour une hydroxylation en position 3' de la naringénine et/ou de l'apigénine. Dans un mode de réalisation préféré, l'enzyme est spécifique de la position 3' de la naringénine et/ou de l'apigénine, en particulier par rapport à la position 5' afin d'éviter une double hydroxylation en positions 3' et 5', et de préférence éviter également une hydroxylation en position 5'. La flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) est une enzyme qui réalise l'addition d'un groupe hydroxyle en position 3' de la naringénine et/ou de l'apigénine. Cette enzyme appartient à la classe des EC 1.14.14.82. Elle est également appelée flavonoïde 3'-hydroxylase. The inventors had to identify and select enzymes capable of accepting naringenin and / or apigenin as substrate and of adding a hydroxyl group at the 3 'position of these compounds. Preferably, the enzyme is selected so as to exhibit a preference for hydroxylation at the 3 'position of naringenin and / or apigenin. In a preferred embodiment, the enzyme is specific for the 3 'position of naringenin and / or apigenin, in particular with respect to the 5' position in order to avoid double hydroxylation at the 3 'and 5 positions. ', and preferably also avoid hydroxylation at the 5' position. The flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) is an enzyme which carries out the addition of a hydroxyl group at the 3 'position of naringenin and / or apigenin. This enzyme belongs to the class of EC 1.14.14.82. It is also called a flavonoid 3'-hydroxylase.
Par « activité flavonoïde 3'-monooxygénase » est entendue la transformation d'un flavonoïde en flavonoïde 3' hydroxylé par une enzyme F3'H, CPR dépendante. Pour déterminer s'il y a une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro de l'enzyme flavonoïde 3' monooxygénase en présence de NAD(P)H, O2, et d'un flavonoïde, dans des conditions optimales (pH, ions...), et l'observation en UPLC-MS et en comparaison au standard attendu de l'apparition d'un flavonoïde 3'-hydroxylé. De préférence, le flavonoïde est la naringénine ou l'apigénine et le flavonoïde 3'-hydroxylé est leur forme 3’-hydroxylé, c'est-à-dire Eriodictyol ou Lutéoline. Le microorganisme peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) capable d'ajouter un hydroxyle en position 3' de la naringénine et/ou de l'apigénine. By "3'-monooxygenase flavonoid activity" is meant the transformation of a flavonoid into a 3 'hydroxylated flavonoid by an F3'H, CPR dependent enzyme. To determine if there is flavonoid 3'-monooxygenase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of the flavonoid 3 'monooxygenase enzyme in the presence of NAD (P) H, O2, and d 'a flavonoid, under optimal conditions (pH, ions, etc.), and observation in UPLC-MS and in comparison with the expected standard of the appearance of a 3'-hydroxylated flavonoid. Preferably, the flavonoid is naringenin or apigenin and the 3'-hydroxylated flavonoid is their 3'-hydroxylated form, i.e. Eriodictyol or Luteolin. The microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of adding a hydroxyl in position 3 'of naringenin and / or apigenin.
Dans un mode de réalisation, la F3'H est une enzyme de plante, notamment de plantes du genre Allium, Arabidopsis, Brassica, Callistephus, Coiumnea, Citrus, Dianthus, Gentiana, Gerbera, Glycine, Fragaria, Ipomoea, Malus, Matthiola, Osteospermum, Oryza, Phanerochaete, Perilla, Petroselinum, Pélargonium, Pilosella, Pétunia, Sinningia, Sorghum, Torenia, Vitis ou Zea, par exemple de Allium cepa, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Coiumnea hybrida, Callistephus chinensis, Citrus sinensis, Citrus clementina, Dianthus caryophyllus, Fragaria vesca, Fragaria x ananassa, Gerbera hybrida, Glycine max, Gentiana triflora, Ipomoea nil, Ipomoea purpurea, Ipomoea tricolor, Matthiola incana, Malus domestica, Osteospermum hybrid cultivar, Oryza sativa, Phanerochaete chrysosporium, Pilosella officinarum, Petroselinum crispum, Pélargonium x hortorum, Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Sinningia cardinalis, Sorghum hicolor, Torenia sp, Torenia hybrid cultivar, Vitis vinifera ou Zea mays. Dans un mode de réalisation plus spécifique, la F3'H est une enzyme de plantes du genre Allium, Brassica, Callistephus, Coiumnea, Citrus, Dianthus, Gentiana, Gerbera, Glycine, Fragaria, Ipomoea, Malus, Matthiola, Osteospermum, Oryza, Phanerochaete, Perilla, Petroselinum, Pélargonium, Pilosella, Pétunia, Sinningia, Sorghum, Torenia, Vitis ou Zea, par exemple de Allium cepa, Brassica napus, Coiumnea hybrida, Callistephus chinensis, Citrus sinensis, Citrus clementina, Dianthus caryophyllus, Fragaria vesca, Fragaria x ananassa, Gerbera hybrida, Glycine max, Gentiana triflora, Ipomoea nil, Ipomoea purpurea, Ipomoea tricolor, Matthiola incono, Malus domestica, Osteospermum hybrid cultivar, Oryza sativa, Phanerochaete chrysosporium, Pilosella officinarum, Petroselinum crispum, Pélargonium x hortorum, Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Sinningia cardinalis, Sorghum bicolor, Torenia sp, Torenia hybrid cultivar, Vitis vinifera ou Zea mays. In one embodiment, F3'H is a plant enzyme, in particular plants of the genus Allium, Arabidopsis, Brassica, Callistephus, Coiumnea, Citrus, Dianthus, Gentiana, Gerbera, Glycine, Fragaria, Ipomoea, Malus, Matthiola, Osteospermum , Oryza, Phanerochaete, Perilla, Petroselinum, Pelargonium, Pilosella, Petunia, Sinningia, Sorghum, Torenia, Vitis or Zea, for example of Allium cepa, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Coiumnea hybrida, Callistephus chinensis, Citrus sinensis, Dianthus clement caryophyllus, Fragaria vesca, Fragaria x ananassa, Gerbera hybrida, Glycine max, Gentiana triflora, Ipomoea nil, Ipomoea purpurea, Ipomoea tricolor, Matthiola incana, Malus domestica, Osteospermum hybrid cultivar, Oryza sativa, Phanerochaete, Petoselinisparum officonium, Proselinum officonium, x hortorum, Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Sinningia cardinalis, Sorghum hicolor, Torenia sp, Torenia hybrid cultivar, Vitis vinifera or Zea mays. In a more specific embodiment, F3'H is an enzyme from plants of the genus Allium, Brassica, Callistephus, Coiumnea, Citrus, Dianthus, Gentiana, Gerbera, Glycine, Fragaria, Ipomoea, Malus, Matthiola, Osteospermum, Oryza, Phanerochaete , Perilla, Petroselinum, Pelargonium, Pilosella, Petunia, Sinningia, Sorghum, Torenia, Vitis or Zea, for example of Allium cepa, Brassica napus, Coiumnea hybrida, Callistephus chinensis, Citrus sinensis, Citrus clementina, Dianthus caryophyllus, Fragaria vesca, Fragaria xyophyllus, Fragaria vesca ananassa, Gerbera hybrida, Glycine max, Gentiana triflora, Ipomoea nil, Ipomoea purpurea, Ipomoea tricolor, Matthiola incono, Malus domestica, Osteospermum hybrid cultivar, Oryza sativa, Phanerochaete chrysosporium, Pilosella officinarum, Petroselinum crispum, Pelargonium x hortorum, Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Sinningia cardinalis, Sorghum bicolor, Torenia sp, Torenia hybrid cultivar, Vitis vinifera or Zea mays.
De préférence, la F3'H est une enzyme de Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis, Citrus sinensis, Arahidopsis thaliana ou Pilosella officinarum. En particulier, la F3'H peut être une enzyme de Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis et Pilosella officinarum. Preferably, the F3′H is an enzyme from Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis, Citrus sinensis, Arahidopsis thaliana or Pilosella officinarum. In particular, F3'H can be an enzyme from Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis and Pilosella officinarum.
Dans un mode de réalisation particulier, la F3'H est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 et 121, en particulier parmi SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 et 121, en particulier parmi SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 et 19, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase, notamment avec la naringénine et/ou de l'apigénine comme substrat et avec une hydroxylation en position 3'. Dans un mode de réalisation particulier, la F3'H est une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 5, 7, 17 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase. In a particular embodiment, F3'H is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 and 121, in particularly among SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 and 121, in particularly among SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the 3'-monooxygenase flavonoid activity, in particular with naringenin and / or apigenin as substrate and with hydroxylation at the 3 'position. In a particular embodiment, F3'H is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
Dans un mode de réalisation préféré, la F3'H est une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 11, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase. De manière tout particulièrement préférée, la F3'H peut être une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 17 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 15, 80, 85, 90 ou 95 %, d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase In a preferred embodiment, F3'H is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 75, 80, 85 , 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity. Very particularly preferably, the F3′H can be an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 15, 80, 85, 90 or 95%, identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity
Ainsi, la F3'H peut être de Perilla frutescens var. crispa. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AB045593.1 et BAB59005.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 2 et 1. Thus, the F3'H may be from Perilla frutescens var. twitched. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB045593.1 and BAB59005.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 2 and 1.
La F3'H peut être de Phanerochaete chrysosporium. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AB597870.1 et BAL05157.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 4 et 3. The F3'H may be from Phanerochaete chrysosporium. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB597870.1 and BAL05157.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 4 and 3.
La F3'H peut être de Pétunia x hybrida. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AF155332.1 et AAD56282.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 6 et 5. The F3'H can be from Petunia x hybrida. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AF155332.1 and AAD56282.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 6 and 5.
La F3'H peut être de Callistephus chinensis. Dans un mode de réalisation, les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AF313488.1 et AAG49298.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 8 et 7. Dans un autre mode de réalisation, les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AF313489.1 et AAG49299.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 10 et 9. The F3'H may be from Callistephus chinensis. In one embodiment, the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AF313488.1 and AAG49298.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 8 and 7. In another embodiment, the nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AF313489.1 and AAG49299.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 10 and 9.
La F3'H peut être de Gerbera hybrida. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence DQ218417.1 et ABA64468.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 12 et 11. The F3'H can be from Gerbera hybrida. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers DQ218417.1 and ABA64468.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 12 and 11.
La F3'H peut être de Osteospermum hybrid cultivar. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence DQ250711.1 et ABB29899.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 14 et 13. The F3'H can be from Osteospermum hybrid cultivar. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers DQ250711.1 and ABB29899.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 14 and 13.
La F3'H peut être de Citrus clementina. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence XM_006440673.1 et XP_006440736.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 16 et 15. La F3'H peut être de Citrus sinensis. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence XM_006477592.2 et XP_006477655.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 18 et 17. The F3'H can be from Citrus clementina. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers XM_006440673.1 and XP_006440736.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 16 and 15. The F3'H can be from Citrus sinensis. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers XM_006477592.2 and XP_006477655.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 18 and 17.
La F3'H peut être de Pilosella officinarum. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence DQ319866.2 et ABC47161.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 20 et 19. The F3'H may be from Pilosella officinarum. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers DQ319866.2 and ABC47161.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 20 and 19.
La F3'H peut être de Streptomyces avermitilis. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence SAV_4539 et WP_010985964.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 22 et 21. The F3'H can be from Streptomyces avermitilis. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers SAV_4539 and WP_010985964.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 22 and 21.
La F3'H peut être d’Arabidopsis thaliana. Une séquence nucléique codant cette enzyme et la séquence protéique sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence NM_120881.2 et N P_196416.1, respectivement et plus particulièrement dans les SEQ ID NOs : 122 et 121. The F3'H can be Arabidopsis thaliana. A nucleic acid sequence encoding this enzyme and the protein sequence are described in NCBI under the reference numbers NM_120881.2 and N P_196416.1, respectively and more particularly in SEQ ID NOs: 122 and 121.
De préférence, la F3'H est une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 11, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase. De manière tout particulièrement préférée, la F3'H est une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase. Preferably, F3′H is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity. Very particularly preferably, F3′H is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121, and the polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%. , at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
Selon un mode de réalisation préféré, la F3'H est une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 7 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 % ou au moins 95 % d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase. According to a preferred embodiment, F3′H is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7 and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la F3'H est une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 17 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 % ou au moins 95 % d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO: 17, et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase. According to another particular embodiment, F3'H is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90 % or at least 95% identity of sequence with the sequence SEQ ID NO: 17, and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la F3'H est une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 % ou au moins 95 % d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO: 121, et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase. According to another particular embodiment, F3'H is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85 %, at least 90% or at least 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 121, and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la F3'H est une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 11 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 % ou au moins 95 % d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO: 11, et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase. According to another particular embodiment, F3′H is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 11 and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90 % or at least 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 11, and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
CPR : cytochrome P450 réductase CPR: cytochrome P450 reductase
La flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) nécessite la présence de NADPH pour réaliser l'addition du groupe hydroxyle. The flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) requires the presence of NADPH to effect the addition of the hydroxyl group.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme comprend un acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase, une NADPH- cytochrome P450 réductase. Cette enzyme appartient à la classe des EC 1.6.2.4. Thus, in a preferred embodiment, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid encoding a cytochrome P450 reductase, a NADPH-cytochrome P450 reductase. This enzyme belongs to the class of EC 1.6.2.4.
La cytochrome P450 réductase provient d'un eucaryote, notamment d'une levure, par exemple du genre Saccharomycetales, ou d'une plante, par exemple une plante du genre Arabidopsis, Ammi, Avicennia, Comellia, Camptotheca, Cotharanthus, Citrus, Glycine, Heiianthus, Lotus, Mesembryanthemum, Phaseolus, Physcomitrella, Pinus, Populus, Ruta, Saccharum, Solanum, Vigna, Vitis ou Zea. Cytochrome P450 reductase originates from a eukaryote, in particular from a yeast, for example of the genus Saccharomycetales, or from a plant, for example a plant of the genus Arabidopsis, Ammi, Avicennia, Comellia, Camptotheca, Cotharanthus, Citrus, Glycine, Heiianthus, Lotus, Mesembryanthemum, Phaseolus, Physcomitrella, Pinus, Populus, Ruta, Saccharum, Solanum, Vigna, Vitis or Zea.
Dans un mode de réalisation préféré, la cytochrome P450 réductase provient d'un eucaryote, par exemple de levure, en particulier de Saccharomyces cerevisiae, ou de plante, par exemple de Cotharanthus roseus ou d 'Arabidopsis thaliana. In a preferred embodiment, the cytochrome P450 reductase originates from a eukaryote, for example from yeast, in particular from Saccharomyces cerevisiae, or from a plant, for example from Cotharanthus roseus or Arabidopsis thaliana.
Dans un mode de réalisation particulier, la cytochrome P450 réductase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes com prenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase. Dans un mode de réalisation très particulier, la cytochrome P450 réductase peut être sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cytochrome P450 réductase. In a particular embodiment, cytochrome P450 reductase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity. In a very particular embodiment, cytochrome P450 reductase can be selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity.
Par exemple, la cytochrome P450 réductase peut être de Cathoronthus roseus. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro X69791.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro CAA49446.1 pou r la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 24 et 23, respectivement. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q05001. For example, the cytochrome P450 reductase can be from Cathoronthus roseus. It is described in the NCBI Genbank database under the number X69791.1 for the nucleic acid sequence and under the number CAA49446.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 24 and 23, respectively. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q05001.
La cytochrome P450 réductase peut être de Saccharomyces cerevisiae. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro N M_001179172.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro N PJD11908.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 26 et 25, respectivement. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence P16603. The cytochrome P450 reductase can be from Saccharomyces cerevisiae. It is described in the Genbank database of NCBI under the number N M_001179172.1 for the nucleic sequence and under the number N PJD11908.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 26 and 25, respectively. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P16603.
La cytochrome P450 réductase peut être chimérique. Elle est décrite dans l'article Aigrain et al (2009, EM BO reports, 10, 742-747. La séquence nucléique codant cette enzyme et la séquence protéique sont décrites dans les SEQ ID Nos : 28 et 27, respectivement. Cytochrome P450 reductase can be chimeric. It is described in the article Aigrain et al (2009, EM BO reports, 10, 742-747. The nucleic acid sequence encoding this enzyme and the protein sequence are described in SEQ ID Nos: 28 and 27, respectively.
Par ailleurs, la cytochrome P450 réductase peut être d’Arabidopsis thaliana. Lorsque la cytochrome P450 provient d'Arabidopsis thaliana, on peut la nommer l'ATR. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro NM_118585.4 pour la séquence nucléique et sous le numéro N P_194183.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 30 et 29, respectivement. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q9SB48. On the other hand, the cytochrome P450 reductase can be from Arabidopsis thaliana. When cytochrome P450 comes from Arabidopsis thaliana, it can be called ATR. It is described in the Genbank database from NCBI under the number NM_118585.4 for the nucleic acid sequence and under the number N P_194183.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 30 and 29, respectively. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9SB48.
En outre, la cytochrome P450 réductase peut être d’Arabidopsis thaliana et être décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro NM_179141.2 pour la séquence nucléique et sous le numéro N P_849472.2 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 32 et 31, respectivement. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q9SUM3. In addition, the cytochrome P450 reductase can be from Arabidopsis thaliana and be described in the NCBI Genbank database under the number NM_179141.2 for the nucleic acid sequence and under the number N P_849472.2 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 32 and 31, respectively. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9SUM3.
Dans un mode de réalisation, une nouvelle copie d'u ne séquence codante pour CPR comme définie ci-dessus est introduite dans la levure. Dans un autre mode de réalisation, lorsque la levure est Saccharomyces cerevisiae et que la CPR provient de la même levure, le promoteur du gène endogène codant pour CPR est remplacé par un promoteur fort. Ainsi, l'expression de la CPR est augmentée par rapport à la levure sauvage ; la CPR est donc surexprimée dans la levure modifiée. In one embodiment, a new copy of a coding sequence for CPR as defined above is introduced into the yeast. In another embodiment, when the yeast is Saccharomyces cerevisiae and the CPR is from the same yeast, the promoter of the endogenous gene encoding CPR is replaced by a strong promoter. Thus, the expression of CPR is increased compared to wild yeast; CPR is therefore overexpressed in modified yeast.
Dans un mode de réalisation particulier, la F3'H et la CPR proviennent de la même origine, la même espèce. In a particular embodiment, the F3′H and the CPR come from the same origin, the same species.
OMT : O-méthyltransférase OMT: O-methyltransferase
Les O-méthyltransférases (OMT) sont une très large famille d'enzymes présentant des cibles difficiles à cerner. Les inventeurs ont dû identifier et sélectionner des O- méthyltransférases capables de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' (position para). O-methyltransferases (OMT) are a very large family of enzymes with targets that are difficult to pinpoint. The inventors had to identify and select O-methyltransferases capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position (para position).
De préférence, l'enzyme a été sélectionnée de sorte à présenter une préférence pour une méthylation en position 4' de l'ériodictyol et/ou la lutéoline. Dans un mode de réalisation préféré, l'enzyme est spécifique de la position 4' de l'ériodictyol et/ou la lutéoline. Par spécifique, est entendu que le groupe méthyle introduit par l'enzyme sur l'ériodictyol et/ou la lutéoline se trouve en position 4' dans 60 % des cas, le reste étant introduit en position 3', de préférence dans 70% des cas, et de manière encore préférée dans 80% des cas. Preferably, the enzyme has been selected so as to exhibit a preference for methylation at the 4 'position of erodictyol and / or luteolin. In a preferred embodiment, the enzyme is specific for the 4 'position of erodictyol and / or luteolin. By specific, it is understood that the methyl group introduced by the enzyme on erodictyol and / or luteolin is found in position 4 'in 60% of cases, the remainder being introduced in position 3', preferably in 70% of cases, and more preferably in 80% of cases.
Par « activité 4'O-méthyltransférase » est entendue la transformation d'un 4'- hydroxyflavonoïde en un 4'-méthoxyflavonoïde par une enzyme 4'-0-méthyltransférase. Pour déterminer s'il y a une activité 4'O-méthyltransférase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme 4'-0- méthyltransférase, d'un 4'- h y d roxy f I a vo n oïd e, de S-adenosyl-L-methionine, dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition du 4'-méthoxyflavonoïde est observée en UPLC-MS en comparaison au standard attendu. By "4'O-methyltransferase activity" is meant the transformation of a 4'-hydroxyflavonoid into a 4'-methoxyflavonoid by a 4'-O-methyltransferase enzyme. To determine if there is a 4'O-methyltransferase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme 4'-0-methyltransferase, a 4 ' - hyd roxy f I a vo n oïd e, of S-adenosyl-L-methionine, under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of 4'-methoxyflavonoid is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard.
Dans notre cas, le 4' - h y d roxyf I a vo n oïd e est l'ériodictyol ou la lutéoline et seront transformés respectivement en leur forme 4'-méthoxyflavonoïde c'est-à-dire en hespérétine ou en diosmétine. In our case, the 4 '- h y d roxyf I a vo n oïd e is erodictyol or luteolin and will be transformed respectively into their 4'-methoxyflavonoid form, that is to say into hesperetin or into diosmetin.
Le microorganisme peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4'. Cette enzyme n'est présente que dans des eucaryotes supérieurs, en particulier dans les plantes. The microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 '. This enzyme is only present in higher eukaryotes, especially in plants.
Dans un mode de réalisation, la O-méthyltransférase (OMT) est une enzyme d’Arabidopsis thaliana. Dans un autre mode de réalisation, la O-méthyltransférase (OMT) provient d'un eucaryote supérieur, de préférence d'un mammifère. En particulier, la O- méthyltransférase (OMT) est d'origine humaine (Homo sapiens). In one embodiment, O-methyltransferase (OMT) is an enzyme from Arabidopsis thaliana. In another embodiment, the O-methyltransferase (OMT) is from a higher eukaryote, preferably a mammal. In particular, O-methyltransferase (OMT) is of human origin (Homo sapiens).
Dans un mode de réalisation particulier, GOMT est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec une de ces séquences et présentant l'activité O-méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4'. In a particular embodiment, GOMT is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in the 4 'position.
Dans un mode de réalisation, GOMT est sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité O-méthyltransférase. In one embodiment, GOMT is selected from the enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity.
Dans un autre mode de réalisation, GOMT est sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO 87 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité O-méthyltransférase. In another embodiment, GOMT is selected from the enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO 87 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity.
Ainsi, OMT peut être d’Arabidopsis thaliana. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence NM_118755.4 et N P_567739.1, respectivement. La protéine est également décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q9C5D7, et plus particulièrement dans la SEQ ID No :87. Thus, OMT can be Arabidopsis thaliana. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers NM_118755.4 and N P_567739.1, respectively. The protein is also described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q9C5D7, and more particularly in SEQ ID No: 87.
De manière alternative, GOMT est d’Homo sapiens. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence NM_007310.2 et N PJ309294.1, respectivement. La protéine est également décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence P21964, et plus particulièrement dans la SEQ ID No :89. Alternatively, GOMT is Homo sapiens. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers NM_007310.2 and N PJ309294.1, respectively. The protein is also described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P21964, and more particularly in SEQ ID No: 89.
L'OMT d’Homo sapiens présente l'avantage d'accepter l'ériodictyol et la lutéoline comme substrat pour la méthylation alors que GOMT d’Arabidopsis thaliana présente une forte préférence pour l'ériodictyol. A contrario, si la synthèse d'hespérétine est à favoriser par rapport à celle de diosmétine, OMT d’Arabidopsis thaliana pourrait présenter un avantage. Homo sapiens OMT has the advantage of accepting erodictyol and luteolin as a substrate for methylation, while Arabidopsis thaliana GOMT has a strong preference for erodictyol. Conversely, if the synthesis of hesperetin is to be promoted by compared to that of diosmetin, OMT of Arabidopsis thaliana may have an advantage.
Dans un mode de réalisation préféré, GOMT est une OMT de Citrus, en particulier Citrus clementina ou Citrus sinensis. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, GOMT est sélectionnée parmi une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO 117 et 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité O-méthyl- transférase. In a preferred embodiment, GOMT is an OMT of Citrus, in particular Citrus clementina or Citrus sinensis. In a particularly preferred embodiment, GOMT is selected from an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting O-methyl-transferase activity.
De préférence, l'OMT est sélectionnée parmi une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité O-méthyl- transférase. Preferably, the OMT is selected from an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting the O-methyltransferase activity.
De manière alternative, l'OMT est sélectionnée parmi une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité O-méthyl-transférase. Alternatively, OMT is selected from an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting O-methyl-transferase activity.
Les OMT de Citrus et d’Arahidopsis thaliana décrites ci-dessus présentent l'avantage de méthyler spécifiquement l'ériodictyol en position 4'. The OMTs of Citrus and Arahidopsis thaliana described above have the advantage of specifically methylating erodictyol at the 4 'position.
Lors de la conception du microorganisme, les inventeurs ont constaté que cette étape de méthylation constituait une des étapes limitantes. De manière surprenante, malgré la présence du cofacteur S-adénosyl-L-méthionine dans le microorganisme, en particulier la levure, l'ajout d'une enzyme augmentant la synthèse de ce cofacteur permettait de lever l'aspect limitant de cette étape. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme comprend en outre une séquence hétérologue ou endogène codant pour une enzyme synthétisant la S-adénosyl-L-méthionine, une S-adénosylméthionine synthétase (SAMT). Cette enzyme appartient à la classe des EC 2.5.1.6. During the design of the microorganism, the inventors have observed that this methylation step constitutes one of the limiting steps. Surprisingly, despite the presence of the S-adenosyl-L-methionine cofactor in the microorganism, in particular yeast, the addition of an enzyme increasing the synthesis of this cofactor made it possible to remove the limiting aspect of this step. Thus, in a preferred embodiment, the microorganism further comprises a heterologous or endogenous sequence encoding an enzyme synthesizing S-adenosyl-L-methionine, an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT). This enzyme belongs to the class of EC 2.5.1.6.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl-transférase (OMT), en particulier capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' et une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S-adénosylméthionine synthétase (SAMT). Dans un mode de réalisation, la SAMT proviennent d'une levure, en particulier de Saccharomyces cerevisiae, tout particulièrement lorsque le microorganisme est une levure. Dans un mode de réalisation particulier, la S-adénosylméthionine synthétase est une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité S-adénosylméthionine synthétase. In one embodiment, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT), in particular capable of methylating erodictyol and / or luteolin at the 4 'position and a sequence of ′. heterologous or endogenous nucleic acid encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT). In one embodiment, the SAMT originate from a yeast, in particular from Saccharomyces cerevisiae, most particularly when the microorganism is a yeast. In a particular embodiment, S-adenosylmethionine synthetase is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity.
Par exemple, la S-adénosylméthionine synthétase peut être de Saccharomyces cerevisiae. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro NM_001180810.3 pour la séquence nucléique et sous le numéro NPJD10790.3 pour la séquence protéique. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence P19358. For example, the S-adenosylmethionine synthetase can be from Saccharomyces cerevisiae. It is described in the NCBI Genbank database under the number NM_001180810.3 for the nucleic acid sequence and under the number NPJD10790.3 for the protein sequence. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P19358.
Dans un mode de réalisation, une nouvelle copie d'une séquence codante pour SAMT comme définie ci-dessus est introduite dans le microorganisme. Dans un autre mode de réalisation, lorsque le microorganisme est Saccharomyces cerevisiae, le promoteur du gène endogène codant pour SAMT est remplacé par un promoteur fort. Ainsi, l'expression de la SAMT est augmentée par rapport au microorganisme sauvage ; la SAMT est donc surexprimée dans le microorganisme modifié. In one embodiment, a new copy of a coding sequence for SAMT as defined above is introduced into the microorganism. In another embodiment, when the microorganism is Saccharomyces cerevisiae, the promoter of the endogenous gene encoding SAMT is replaced by a strong promoter. Thus, the expression of SAMT is increased compared to the wild microorganism; SAMT is therefore overexpressed in the modified microorganism.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme comprend donc une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' et une séquence hétérologue ou endogène codant pour une S-adénosylméthionine synthétase (SAMT) capable de produire la S-adénosyl-L-méthionine. Thus, in a preferred embodiment, the microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 'and a heterologous or endogenous sequence encoding a S-adenosylmethionine synthetase (SAMT) capable of producing S-adenosyl-L-methionine.
FNS : Flavone synthase FNS: Flavone synthase
La diosmétine peut être produite à partir de la lutéoline. Elle peut également être obtenue à partir de l'ériodictyol, soit en le transformant en lutéoline puis en préparant la diosmétine à partir de la lutéoline, soit en le transformant en hespérétine puis en préparant la diosmétine à partir de l'hespérétine. L'enzyme capable de transformer l'ériodictyol en lutéoline et/ou l'hespérétine en diosmétine est une flavone synthase (FNS). Dans un mode de réalisation particulier, la flavone synthase est capable également de transformer l'ériodictyol en lutéoline. Diosmetin can be produced from luteolin. It can also be obtained from erodictyol, either by transforming it into luteolin then by preparing diosmetin from luteolin, or by transforming it into hesperetin and then by preparing diosmetin from hesperetin. The enzyme capable of converting erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin is a flavone synthase (FNS). In a particular embodiment, the flavone synthase is also capable of converting erodictyol into luteolin.
Ainsi, le microorganisme peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase, en particulier une flavone synthase capable de produire la lutéoline à partir de l'ériodictyol et/ou la diosmétine à partir de l'hespérétine. Thus, the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular a flavone synthase capable of to produce luteolin from erodictyol and / or diosmetin from hesperetin.
Par « activité flavone synthase » est entendue la transformation d'une flavanone en flavone par une enzyme FNSI (CPR indépendante) ou une FNSII (CPR dépendante). By "flavone synthase activity" is meant the transformation of a flavanone into a flavone by an FNSI enzyme (independent CPR) or an FNSII (dependent CPR).
Pour déterminer s'il y a une activité flavone synthase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro dans le cas de la FNSI d'un mélange composé de l'enzyme flavone synthase (FNSI), d'une flavanone, de 2-oxoglutarate, d'C>2, dans les conditions optimales (pH, température, ions...) et dans le cas de la FNSII d'un mélange composé de l'enzyme FNSII, d'une flavanone, de NAD(P)H, d'02, dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition de la flavone correspondante à la flavanone est observée en UPLC-MS en comparaison au standard attendu. De préférence, la flavanone est l'ériodictyol ou l'hespérétine et seront transformés respectivement en leur forme flavone c'est-à-dire en lutéoline ou diosmétine. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl-transférase (OMT), en particulier capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase, en particulier une flavone synthase capable de produire la lutéoline à partir de l'ériodictyol et/ou la diosmétine à partir de l'hespérétine. To determine if there is flavone synthase activity, an enzymatic test can be performed which consists of in vitro incubation in the case of FNSI of a mixture composed of the enzyme flavone synthase (FNSI), a flavanone, 2-oxoglutarate, C> 2, under optimal conditions (pH, temperature, ions ...) and in the case of FNSII of a mixture composed of the FNSII enzyme, of a flavanone, of NAD (P) H, of 02, under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of the flavone corresponding to the flavanone is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard. Preferably, the flavanone is erodictyol or hesperetin and will be converted respectively into their flavone form, that is to say into luteolin or diosmetin. Thus, in a particular embodiment, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT), in particular capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 '; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular a flavone synthase capable of producing luteolin from erodictyol and / or diosmetin from hesperetin.
De préférence, la flavone synthase est une enzyme provenant de plante, par exemple du genre Aethusa, Angelica, Antirrhinum, Apium, Arabidopsis, Callistephus, Camellia, Conium, Cuminum, Cynara, Dahlio, Dorcoceras, Erythranthe, Lonicera, Medicago, Oryzo, Perilla, Petroselinum, Plectranthus, Populus, Saussurea, Scutellaria ou Zea, en particulier du genre Arabidopsis, Lonicera, Medicago, Oryza, Petroselinum, Populus ou Zea notamment d 'Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea médusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata ou Erythranthe lewisii, en particulier d'Arahidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, ou Zea mays, de préférence de Petroselinum crispum, ou du genre Lonicera comme par exemple Lonicera japonica et Lonicera macranthoides. Preferably, the flavone synthase is an enzyme derived from plants, for example of the genus Aethusa, Angelica, Antirrhinum, Apium, Arabidopsis, Callistephus, Camellia, Conium, Cuminum, Cynara, Dahlio, Dorcoceras, Erythranthe, Lonicera, Medicago, Oryzo, Perilla , Petroselinum, Plectranthus, Populus, Saussurea, Scutellaria or Zea, in particular of the genus Arabidopsis, Lonicera, Medicago, Oryza, Petroselinum, Populus or Zea, in particular of Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Petrosum sativa, Oryza sativa , Populus deltoids, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea medusa, Plectranthus barbatus, Scasutesgrometricum Dorcirrilla, Perensinium frirrensium, Perensinumcirrilla, Perensinumcirrilla, Perensinumcirrilla, Perensinumcirrilla, Perensinum, Perensinum, Perensin, Perensin, Daisy, Irrigrilla var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii, in particular Arahidopsis thaliana, Lonicera japonica, Loni cera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoides, or Zea mays, preferably from Petroselinum crispum, or of the Lonicera genus such as, for example, Lonicera japonica and Lonicera macranthoides.
Dans un mode de réalisation particulier, la flavone synthase (FNS) est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase. En particulier, la flavone synthase (FNS) est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase. De préférence, la FNS est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase. In a particular embodiment, the flavone synthase (FNS) is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143 , 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavone synthase activity. In particular, the flavone synthase (FNS) is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity. Preferably, the FNS is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity.
Il existe deux sortes de flavone synthase (FNS) : la flavone synthase 1 (FNSI) et la flavone synthase 2 (FNSII). A partir d'une flavanone et de 2-oxoglutarate, la FNSI est capable de produire la flavone correspondante. L'enzyme FNSI appartient à la classe des EC 1.14.11.22. La FNSII appartient au groupe de P450 et nécessite la présence d'une cytochrome P450 réductase. L'enzyme FNSII appartient à la classe des EC 1.14.13. There are two kinds of flavone synthase (FNS): flavone synthase 1 (FNSI) and flavone synthase 2 (FNSII). From a flavanone and 2-oxoglutarate, FNSI is able to produce the corresponding flavone. The FNSI enzyme belongs to the class of EC 1.14.11.22. FNSII belongs to the P450 group and requires the presence of a cytochrome P450 reductase. The FNSII enzyme belongs to the class of EC 1.14.13.
Dans un mode de réalisation, la FNS est une flavone synthase de type I. Dans un autre mode de réalisation, la FNS est une flavone synthase de type II. Dans un mode de réalisation supplémentaire, le microorganisme comprend une flavone synthase de type I et une flavone synthase de type II. In one embodiment, the FNS is a type I flavone synthase. In another embodiment, the FNS is a type II flavone synthase. In a further embodiment, the microorganism comprises a type I flavone synthase and a type II flavone synthase.
Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase de type I (FNSI). L'avantage de la FNSI est qu'elle fonctionne sans cytochrome P450 réductase. In a preferred embodiment, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding type I flavone synthase (FNSI). The advantage of FNSI is that it works without cytochrome P450 reductase.
La FNSI peut être une flavone synthase de plante comme Petroselinum crispum, Oryza sativa, Populus deltoïdes, Medicago truncatula, Apium graveolens, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica orchangelica, ou Conium maculatum, en particulier de Petroselinum crispum, Oryza sativa, Populus deltoïdes, Medicago truncatula, de préférence de Petroselinum crispum. La FNSI peut être une enzyme comprenant une séquence choisie parmi les SEQ ID NOs: 37, 127, 137, 141, 143 et 145 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'un de ces séquences et présentant une activité flavone synthase. Dans un aspect particulier, la FNSI peut être une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase. FNSI can be a plant flavone synthase such as Petroselinum crispum, Oryza sativa, Populus deltoïdes, Medicago truncatula, Apium graveolens, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica orchangelica, or Conium maculatum, in particular from Petroselinum crispum, Populus deltiva, Medicago truncatula, preferably from Petroselinum crispum. The FNSI can be an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 37, 127, 137, 141, 143 and 145 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity. In a particular aspect, the FNSI can be an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence. and exhibiting flavone synthase activity.
Par exemple, la FNSI peut être de Petroselinum crispum. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro AY817680.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro AAX21541.1 pour la séquence protéique. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q7XZQ8. Les séquences en acides aminés et en acides nucléiques sont décrites dans les SEQ ID Nos : 37 et 38, respectivement. La FNSI peut également être d’Angeüca orchongelica. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro DQ683352.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro ABG78793.1 pour la séquence protéique. Les séquences en acides aminés et en acides nucléiques sont décrites dans les SEQ ID Nos : 127 et 128, respectivement. For example, the FNSI can be from Petroselinum crispum. It is described in the NCBI Genbank database under number AY817680.1 for the nucleic acid sequence and under number AAX21541.1 for the protein sequence. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q7XZQ8. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 37 and 38, respectively. The FNSI can also be Angeüca orchongelica. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ683352.1 for the nucleic acid sequence and under number ABG78793.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 127 and 128, respectively.
La FNSI peut également être d’Apium graveolens. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro AY817676.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro AAX21537.1 pour la séquence protéique. Les séquences en acides aminés et en acides nucléiques sont décrites dans les SEQ ID Nos : 137 et 138, respectivement. FNSI can also be Apium graveolens. It is described in NCBI's Genbank database under number AY817676.1 for the nucleic acid sequence and under number AAX21537.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 137 and 138, respectively.
La FNSI peut également être de Cuminum cyminum. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro DQ683349.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro ABG78790.1 pour la séquence protéique. Les séquences en acides aminés et en acides nucléiques sont décrites dans les SEQ ID Nos : 141 et 142, respectivement. The FNSI can also be from Cuminum cyminum. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ683349.1 for the nucleic acid sequence and under number ABG78790.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 141 and 142, respectively.
La FNSI peut également être d’Aethuso cynapium. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro DQ683350.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro DQ683350.1 pour la séquence protéique. Les séquences en acides aminés et en acides nucléiques sont décrites dans les SEQ ID Nos : 143 et 144, respectivement. The FNSI can also be Aethuso cynapium. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ683350.1 for the nucleic acid sequence and under number DQ683350.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 143 and 144, respectively.
La FNSI peut également être de Conium maculatum. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro DQ683354.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro ABG78795.1 pour la séquence protéique. Les séquences en acides aminés et en acides nucléiques sont décrites dans les SEQ ID Nos : 145 et 146, respectivement. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase de type II (FNSII). The FNSI can also be from Conium maculatum. It is described in the NCBI Genbank database under number DQ683354.1 for the nucleic acid sequence and under number ABG78795.1 for the protein sequence. The amino acid and nucleic acid sequences are described in SEQ ID Nos: 145 and 146, respectively. In another embodiment, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a type II flavone synthase (FNSII).
La FNSII peut être une flavone synthase de plante, par exemple d’Arabidopsis thaliana, Zea mays, du genre Lonicera comme par exemple Lonicera japonica et Lonicera mocronthoides, Callistephus chinensis, Medicago truncatula, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussureo meduso, Plectronthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceros hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata ou Erythranthe lewisii, en particulier une flavone synthase d'Arabidopsis thaliana, Zea mays ou du genre Lonicera comme par exemple Lonicera japonica et Lonicera macranthoides. Dans un mode de réalisation particulier, la flavone synthase (FNSII) est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 129, 131, 133, 135, 139, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33 et 35 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase. FNSII can be a plant flavone synthase, for example of Arabidopsis thaliana, Zea mays, of the genus Lonicera such as for example Lonicera japonica and Lonicera mocronthoides, Callistephus chinensis, Medicago truncatula, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussureo medronthuso, Saussureo medronthuso barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceros hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii, in particular a flavone synthase of Arabidopsis thaliana, Zea mays or of the genus Lonicera such as for example Lonicera macranthoides and Loniceraides. In a particular embodiment, the flavone synthase (FNSII) is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 129, 131, 133, 135, 139, 147, 149, 151, 153, 155 , 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33 and 35 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity.
Dans un mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Lonicera japonica. Dans ce mode de réalisation, l'enzyme peut être une enzyme décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro KU127576.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro AMQ91109.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 34 et 33, respectivement. In one embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Lonicera japonica. In this embodiment, the enzyme may be an enzyme described in the Genbank database of NCBI under the number KU127576.1 for the nucleic sequence and under the number AMQ91109.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQs. ID Nos: 34 and 33, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Lonicera macranthoides. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KU127580.1 et AMQ91113.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 36 et 35, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Lonicera macranthoides. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KU127580.1 and AMQ91113.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 36 and 35, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Cynara cardunculus var scolymus. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence JN825735.1 et AFG31000.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 130 et 129, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Cynara cardunculus var scolymus. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers JN825735.1 and AFG31000.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 130 and 129, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Perilla frutescens var crispa. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AB045592.1 et BAB59004.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 132 et 131, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Perilla frutescens var crispa. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB045592.1 and BAB59004.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 132 and 131, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Dahlia pinnata. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AB769842.1 et BAM72335.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 134 et 133, respectivement. Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Callistephus chinensis. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AF188612.1 et AAF04115.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 136 et 135, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is FNSII from Dahlia pinnata. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB769842.1 and BAM72335.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 134 and 133, respectively. In another embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Callistephus chinensis. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AF188612.1 and AAF04115.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 136 and 135, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Medicago truncatula. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence DQ354373.1 et ABC86159.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 140 et 139, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Medicago truncatula. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers DQ354373.1 and ABC86159.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 140 and 139, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Camellia sinensis. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence FJ169499.1 et ACH99109.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 148 et 147, respectivement. Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Saussurea médusa. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KF170286.1 et AGV40781.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 150 et 149, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Camellia sinensis. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers FJ169499.1 and ACH99109.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 148 and 147, respectively. In another embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Saussurea medusa. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KF170286.1 and AGV40781.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 150 and 149, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Plectranthus barbatus. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KF606861.1 et AHJ89438.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 152 et 151, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is FNSII from Plectranthus barbatus. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and sequences proteins are described in NCBI under the reference numbers KF606861.1 and AHJ89438.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 152 and 151, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Scutellaria boicalensis. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KT963454.1 et AMW91729.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 154 et 153, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is an FNSII from Scutellaria boicalensis. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KT963454.1 and AMW91729.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 154 and 153, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Dorcoceras hygrometricum. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KV013332.1 et KZV23934.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 156 et 155, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is FNSII from Dorcoceras hygrometricum. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KV013332.1 and KZV23934.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 156 and 155, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Antirrhinum majus. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence AB028151.1 et BAA84071.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 158 et 157, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is FNSII from Antirrhinum majus. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers AB028151.1 and BAA84071.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 158 and 157, respectively.
Dans un autre mode de réalisation, la flavone synthase FNS est une FNSII provenant de Erythronthe lewisii. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence KX710102.1 et AOR81894.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 160 et 159, respectivement. In another embodiment, the FNS flavone synthase is FNSII from Erythronthe lewisii. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers KX710102.1 and AOR81894.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 160 and 159, respectively.
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase de type II (FNSII) et une flavone synthase de type I, par exemple une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 129, 131, 133, 135, 139, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase et une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 37, 127, 137, 141, 143 et 145 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase, de préférence une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33 et 35 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase et une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase. In a particular embodiment, the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a type II flavone synthase (FNSII) and a type I flavone synthase, for example a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 129, 131, 133, 135, 139, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity and an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 37, 127, 137, 141, 143 and 145 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity, preferably a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33 and 35 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity and an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity.
Les FNS de type II, FNSII, nécessite la présence d'une cytochrome P450 réductase (CPR). Si le microorganisme ne comprend pas de cytochrome P450 réductase, il sera donc nécessaire d'introduire une cytochrome P450 réductase hétérologue. Si le microorganisme en comprend déjà une, il est possible d'envisager soit la surexpression d'une cytochrome P450 réductase endogène (par exemple en remplaçant le promoteur par un promoteur fort ou en ajoutant une ou plusieurs copies de la séquence codante) ou d'en introduire également une cytochrome P450 réductase hétérologue. FNS type II, FNSII, requires the presence of cytochrome P450 reductase (CPR). If the microorganism does not include cytochrome P450 reductase, it will therefore be necessary to introduce a heterologous cytochrome P450 reductase. If the microorganism already includes one, it is possible to consider either the overexpression of an endogenous cytochrome P450 reductase (for example by replacing the promoter with a strong promoter or by adding one or more copies of the coding sequence) or also introduce a heterologous cytochrome P450 reductase.
Dans un mode de réalisation particulier, la FNS de type II et la CPR proviennent de la même origine, la même espèce. In a particular embodiment, the type II FNS and the CPR come from the same origin, the same species.
Combinaison d'enzymes Combination of enzymes
Ainsi, outre les enzymes nécessaires à la biosynthèse de l'hespéridine et/ou la diosmine à partir de l'hespéritine et/ou la diosmétine, respectivement, telles que décrites précédemment, le microorganisme comprend de préférence les enzymes permettant la production de l'hespéritine et/ou la diosmétine à partir de la naringénine et/ou de l'apigénine. Thus, besides the enzymes necessary for the biosynthesis of hesperidin and / or diosmin from hesperitin and / or diosmetin, respectively, as described above, the microorganism preferably comprises the enzymes allowing the production of the hesperitin and / or diosmetin from naringenin and / or apigenin.
Dans un premier mode de réalisation particulier, le microorganisme recombinant comprend : In a first particular embodiment, the recombinant microorganism comprises:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et/ou la diosmétine ; de préférence une flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase (UGT) d’Arabidopsis thaliana, de Citrus sinensis, de Citrus clementino, de Scutellaria hoicalensis ou d’Homo sapiens, de préférence de Citrus sinensis ou de Scutellaria baicalensis ; de préférence une flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; de manière particulière une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6-0- rhamnosyltransferase (RhaT) capable de transférer u n rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O-glucoside; de préférence une RhaT du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus clementina, de préférence une 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6-O- rhamnosyltransferase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, from Citrus sinensis, from Citrus clementino, from Scutellaria hoicalensis or from Homo sapiens, preferably from Citrus sinensis or from Scutellaria baicalensis; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside; preferably a RhaT of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably a 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a selected sequence from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 6-O-rhamnosyltransferase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RHM) capable de produire de l'UDP-rhamnose ; de préférence une RHM de Citrus sinensis ou d'Arabidopsis thaliana, de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP- glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4- kéto-L-rhamnose-réductase, en particulier une RHM comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4- kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; en particulier capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; de préférence de Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis ou Pilosella officinarum, en particulier de Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis ou Pilosella officinarum, de préférence une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 1, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'- monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'- monooxygénase, en particulier une F3'H comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 11, 17 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) capable of producing UDP-rhamnose; preferably an RHM of Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto- L-rhamnose reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequenced and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; in particular capable of hydroxylating in position 3 'naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis or Pilosella officinarum, in particular of Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis or Pilosella officinarum, preferably an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 1, 9, 11, 13, 15, 17 , 19, 21 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with one of these sequences and exhibiting flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with any of these sequences and showing fl activity avonoid 3'-monooxygenase;
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) ; de préférence une CPR de Saccharomyces cerevisiae, ou de plante, par exemple de Catharanthus roseus ou d'Arabidopsis thaiiana ; de préférence une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR); preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaiiana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; de préférence une OMT d’Arabidopsis thaiiana ou d’Homo sapiens, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117, 119, 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O- méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 117, 119 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité O- méthyltransférase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaiiana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and a methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117, 119 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity; and
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) capable de produire une flavone à partir d'une flavanone, en particulier capable de transformer la naringénine en apigénine, et/ou l'ériodictyol en lutéoline, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline ; de préférence une FNS d'Arabidopsis tholiona, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicogo truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea médusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata ou Erythranthe lewisii, en particulier d'Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Med ica go truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes ou Zea mays, de préférence de Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, et Petroselinum crispum; de préférence une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35 et 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase. optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of producing a flavone from a flavanone, in particular capable of converting naringenin to apigenin, and / or erodictyol to luteolin, preferably convert erodictyol to luteolin; preferably an SNSF of Arabidopsis tholiona, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicogo truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Cuminum cyminum, Aethusa changensum, Camellium sinum, Aethusa changensum, Camellium sinum , Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea médusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii, in particular Arabidopsis thalonhoides, Lonicatera japonica, Lonicatera, Lonicatera, Lonicera japonica, Lonicera, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoides or Zea mays, preferably from Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, and Petroselinum crispum; preferably an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from among SEQ ID NOs: 33, 35 and 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme recombinant comprend : une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et/ou la diosmétine ; de préférence une flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase (UGT) d'Arobidopsis thaliana, de Scutellaria baicalensis ou d'Homo sapiens, de préférence d’Arabidopsis thaliana ou de Scutellaria baicalensis ; de préférence une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; de manière particulière une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; In another particular embodiment, the recombinant microorganism comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arobidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6-0- rhamnosyltransferase (RhaT) capable de transférer u n rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O-glucoside; de préférence une RhaT du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus clementina, de préférence une 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6-O- rhamnosyltransferase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a n rhamnose to the 6 position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside; preferably a RhaT of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably a 6-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a selected sequence from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 6-O-rhamnosyltransferase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RHM) capable de produire de l'UDP-rhamnose ; de préférence une RHM de Citrus sinensis ou d’Arabidopsis thaliana, de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP- glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4- kéto-L-rhamnose-réductase, en particulier une RHM comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4- kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; en particulier capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; de préférence de Perilla frutescens vor. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, et Pilosella officinarum, de préférence une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 et 19 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, en particulier une F3'H comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 5, 7, 17 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) capable of producing UDP-rhamnose; preferably an RHM of Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably a RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting activity UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP- activity. 4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; in particular capable of hydroxylating naringenin and / or apigenin in the 3 'position; preferably Perilla frutescens vor. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, and Pilosella officinarum, preferably an F3′H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from among enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity;
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) ; de préférence une CPR de Saccharomyces cerevisiae, ou de plante, par exemple de Catharanthus roseus ou d’Arabidopsis thaliana ; de préférence une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR); preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaliana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; de préférence une OMT d’Arabidopsis thaliana ou d’Homo sapiens, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O- méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence SEQ ID NO 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O-méthyltransférase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaliana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; and
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) capable de produire une flavone à partir d'une flavanone, en particulier capable de transformer la naringénine en apigénine, et/ou l'ériodictyol en lutéoline, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline ; de préférence une FNS d’Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, ou Zea mays, de préférence de Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, et Petroselinum crispum; de préférence une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase. optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of producing a flavone from a flavanone, in particular capable of converting naringenin to apigenin, and / or erodictyol to luteolin, preferably convert erodictyol to luteolin; preferably an SNF of Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, or Zea mays, preferably of Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, and Petroselinum crispum; preferably an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity.
Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme comprend - une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-0- bêta-D-glucosyltransférase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, et de manière tout particulièrement préférée sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase ; et In a preferred embodiment, the microorganism comprises - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-0-beta-D-glucosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, and very particularly preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and presenting an activity flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une l'UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP- glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose - reductase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting activity UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase; and
-une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7, 11, 17 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7, 17, et 121 et les polypeptides ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase, et de manière tout particulièrement préférée une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 7 et les polypeptides ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase ; -a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably a 3'-monooxygenase (F3'H) flavonoid comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 17, and 121 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, and very particularly preferably a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 7 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity;
-facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, et de manière tout particulièrement préférée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; et - optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and very particularly preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO : 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
-une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O- méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117, 119 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O-méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs : 117 et 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité O-méthyltransférase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 'and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and a methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity; and
-facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) capable de produire une flavone à partir d'une flavanone, en particulier capable de transformer la naringénine en apigénine, et/ou l'ériodictyol en lutéoline, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase. - optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of producing a flavone from a flavanone, in particular capable of transforming naringenin into apigenin, and / or erodictyol into luteolin, of preferably transforming erodictyol into luteolin and comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting flavone synthase activity.
De préférence, le microorganisme comprend chacune de ces séquences d'acide nucléique hétérologues. Preferably, the microorganism comprises each of these heterologous nucleic acid sequences.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme recombinant comprend : une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et/ou la diosmétine ; In another particular embodiment, the recombinant microorganism comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) capable de transférer u n rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O-glucoside; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to the 6-position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside ;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RHM) capable de produire de l'U DP-rhamnose ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase ( RHM) capable of producing U DP-rhamnose;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) capable de produire une flavone à partir d'une flavanone, en particulier capable de transformer la naringénine en apigénine, l'ériodictyol en lutéoline et/ou l'hespérétine en diosmétine, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline. a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of producing a flavone from a flavanone, in particular capable of transforming naringenin into apigenin, erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin , preferably to convert erodictyol to luteolin.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme recombinant comprend en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S- adénosylméthionine synthétase (SAMT), en particulier de Saccharomyces cerevisiae, par exemple une SAMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosylméthionine synthétase. In another particular embodiment, the recombinant microorganism further comprises a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT), in particular from Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity.
Chaque enzyme peut être choisie parmi les enzymes décrites ci-dessus. Each enzyme can be chosen from the enzymes described above.
Jusqu'à Naringénine et Apigénine Up to Naringenin and Apigenin
Différentes voies de biosynthèses de naringénine et de l'apigénine sont connues dans les plantes, en particulier à partir du glucose, de la tyrosine ou de la phénylalanine. Des microorganismes, notamment E. coli et Saccharomyces cerevisiae, ont été modifiés pour produire de la naringénine et/ou et de l'apigénine (Hwang El, et al. 2003. Appl Environ Microbiol. 2003, 69(5):2699-2706; Jiang Hl, et al. 2005. Appl Environ Microbiol. 2005, 71(6):2962-9 ; Pandey et al, 2016, Biotechnol Adv., 34, 634-662). Different pathways for the biosynthesis of naringenin and apigenin are known in plants, in particular from glucose, tyrosine or phenylalanine. Microorganisms, notably E. coli and Saccharomyces cerevisiae, have been modified to produce naringenin and / or and apigenin (Hwang El, et al. 2003. Appl Environ Microbiol. 2003, 69 (5): 2699-2706 ; Jiang Hl, et al. 2005. Appl Environ Microbiol. 2005, 71 (6): 2962-9; Pandey et al, 2016, Biotechnol Adv., 34, 634-662).
Par exemple, la voie de biosynthèse de la naringénine et de l'apigénine peut être celle décrite dans la Figure 1. For example, the pathway for the biosynthesis of naringenin and apigenin can be that described in Figure 1.
Dans un premier mode de réalisation, le microorganisme comprend les enzymes nécessaires pour la synthèse de la naringénine et/ou de l'apigénine à partir de la tyrosine. Dans un deuxième mode de réalisation, le microorganisme comprend les enzymes nécessaires pour la synthèse de la naringénine et/ou de l'apigénine à partir de la phénylalanine. In a first embodiment, the microorganism comprises the enzymes necessary for the synthesis of naringenin and / or apigenin from tyrosine. In a second embodiment, the microorganism comprises the enzymes necessary for the synthesis of naringenin and / or apigenin from phenylalanine.
Dans un troisième mode de réalisation, le microorganisme comprend les enzymes nécessaires pour la synthèse de la naringénine et/ou de l'apigénine à partir de la tyrosine et de la phénylalanine. In a third embodiment, the microorganism comprises the enzymes necessary for the synthesis of naringenin and / or apigenin from tyrosine and phenylalanine.
TAL : Tyrosine ammonia lyase TAL: Tyrosine ammonia lyase
La TAL est une tyrosine ammonia lyase. Cette enzyme est capable de produire de l'acide p- coumarique à partir de la tyrosine. Cette enzyme appartient à la classe des EC 4.3.1.23. TAL is a tyrosine ammonia lyase. This enzyme is able to produce p-coumaric acid from tyrosine. This enzyme belongs to the class of EC 4.3.1.23.
Par « activité phénylalanine ammonia lyase » est entendue la transformation de la Phénylalanine en acide frans-cinnamique par une enzyme Phénylalanine ammonia lyase. Pour déterminer s'il y a une activité phénylalanine ammonia lyase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme phénylalanine ammonia lyase et de phénylalanine dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition d'acide trans- cinnamique est observée en UPLC-MS en comparaison au standard attendu. Une tyrosine ammonia lyase (TAL) peut présenter en outre une activité phénylalanine ammonia lyase (PAL) telle que définie ci-dessus et/ou une activité dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL). By "phenylalanine ammonia lyase activity" is meant the transformation of phenylalanine into frans-cinnamic acid by an enzyme Phenylalanine ammonia lyase. To determine if there is phenylalanine ammonia lyase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme phenylalanine ammonia lyase and phenylalanine under optimal conditions (pH, temperature , ions ...). After a certain incubation time, the appearance of trans-cinnamic acid is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard. A tyrosine ammonia lyase (TAL) can also exhibit a phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity as defined above and / or a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL) activity.
Le microorganisme peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase. The microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase.
De préférence, cette enzyme est une enzyme produite par une bactérie du genre Rhodobacter ou une bactérie du genre Flavobacteriaceae. Dans un mode de réalisation particulier, cette enzyme est produite par une bactérie Rhodobacter capsulatus, ou Rhodobacter sphaeroides. Dans un autre mode de réalisation particulier, cette enzyme est produite par une bactérie Flavobacterium johnsoniae. Dans un autre mode de réalisation, cette enzyme est une enzyme produite par une levure, en particulier une levure du genre Rhodotorula, par exemple Rhodotorula glutinis. D'autres organismes produisent également une telle enzyme, par exemple Camellia sinensis, Fragaria x ananassa, Ralstonia metallidurans, ou Zea mays. Preferably, this enzyme is an enzyme produced by a bacterium of the genus Rhodobacter or a bacterium of the genus Flavobacteriaceae. In a particular embodiment, this enzyme is produced by a bacterium Rhodobacter capsulatus, or Rhodobacter sphaeroides. In another particular embodiment, this enzyme is produced by a Flavobacterium johnsoniae bacterium. In another embodiment, this enzyme is an enzyme produced by a yeast, in particular a yeast of the genus Rhodotorula, for example Rhodotorula glutinis. Other organisms also produce such an enzyme, for example Camellia sinensis, Fragaria x ananassa, Ralstonia metallidurans, or Zea mays.
Dans un mode de réalisation particulier, la tyrosine ammonia lyase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 39 et 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase. In a particular embodiment, tyrosine ammonia lyase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 39 and 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with one of these sequences and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity.
Dans un mode de réalisation, la TAL est de Flavobacterium johnsoniae. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro KR095306.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro AKE50827.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos :40 et 39. In one embodiment, the TAL is from Flavobacterium johnsoniae. It is described in the Genbank database from NCBI under the number KR095306.1 for the nucleic acid sequence and under the number AKE50827.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 40 and 39.
Dans un mode de réalisation particulier préféré, la TAL est de Rhodotorula glutinis. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro KF765779.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro AGZ04575.1 pou r la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 42 et 41, respectivement. In a particular preferred embodiment, the TAL is from Rhodotorula glutinis. It is described in the Genbank database of NCBI under the number KF765779.1 for the nucleic acid sequence and under the number AGZ04575.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 42 and 41, respectively.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la tyrosine ammonia lyase est sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase. 4CL : 4-Coumarate-CoA ligase In a particularly preferred embodiment, the tyrosine ammonia lyase is selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity. 4CL: 4-Coumarate-CoA ligase
La 4CL est une 4-coumarate-CoA ligase. Cette enzyme est capable de produire du 4- coumaroyl-CoA à partir de l'acide p-coumarique et de Coenzyme A et de produire du caffeoyl-CoA à partir de l'acide caféique et de Coenzyme A. Cette enzyme appartient à la classe des EC 6.2.1.12. 4CL is a 4-coumarate-CoA ligase. This enzyme is able to produce 4-coumaroyl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A and to produce caffeoyl-CoA from caffeic acid and Coenzyme A. This enzyme belongs to the class of EC 6.2.1.12.
Par « activité 4-coumarate-CoA ligase » est entendue la transformation de l'acide p- coumarique en p-coumaroyl-CoA ou de l'acide caféique en caffeoyl-CoA par une enzyme 4- coumarate CoA ligase. Pour déterminer s'il y a une activité 4-coumarate-CoA ligase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme 4-coumarate-CoA ligase, d'acide p-coumarique ou d'acide caféique, d'ATP et de CoA dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition du p-coumaroyl-CoA ou du caffeoyl-CoA est observée au s pectro photo mètre UV avec une longueur d'onde respectivement de 333 nm et de 346 nm en comparaison au standard attendu. By "4-coumarate-CoA ligase activity" is meant the conversion of p-coumaric acid to p-coumaroyl-CoA or caffeic acid to caffeoyl-CoA by a 4-coumarate CoA ligase enzyme. To determine if there is 4-coumarate-CoA ligase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme 4-coumarate-CoA ligase, acid p -coumaric or caffeic acid, ATP and CoA under optimal conditions (pH, temperature, ions ...). After a certain incubation time, the appearance of p-coumaroyl-CoA or caffeoyl-CoA is observed with a UV spectrophotometer with a wavelength of 333 nm and 346 nm respectively in comparison with the expected standard.
Le microorganisme peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumarate-CoA ligase. The microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase.
De préférence, cette enzyme est une enzyme produite par une plante, par exemple Abies, Arabidopsis, Agastache, Amorpho, Brassica, Citrus, Cathayo, Cedrus, Crocus, Larix, Festuca, Glycine, Jugions, Keteleeria, Lithospermum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Molus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Nothotsuga, Oryza, Phaseolus, Pélargonium, Petroselinum, Physcomitrella, Piceo, Prunus, Pseudolarix, Pseudotsuga, Roso, Rubus, Ryzo, Saccharum, Suaeda, Pi nus, Populus, Solanum, Thellungiella, Triticum, Tsuga, Vitis ou Zea. De manière alternative, cette enzyme est une enzyme produite par un microorganisme, par exemple Aspergillus, Mycosphaerella, Mycobacterium, Neisseria, Neurospora, Streptomyces, Rhodobacter ou Yarrowia. Preferably, this enzyme is an enzyme produced by a plant, for example Abies, Arabidopsis, Agastache, Amorpho, Brassica, Citrus, Cathayo, Cedrus, Crocus, Larix, Festuca, Glycine, Jugions, Keteleeria, Lithospermum, Lolium, Lotus, Lycopersicon , Molus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Nothotsuga, Oryza, Phaseolus, Pelargonium, Petroselinum, Physcomitrella, Piceo, Prunus, Pseudolarix, Pseudotsuga, Roso, Rubus, Ryzo, Saccharum, Suaeda, Pi nus, Populus, Solanum, Tritellicung Tsuga, Vitis or Zea. Alternatively, this enzyme is an enzyme produced by a microorganism, for example Aspergillus, Mycosphaerella, Mycobacterium, Neisseria, Neurospora, Streptomyces, Rhodobacter or Yarrowia.
Dans une mode de réalisation préféré, cette enzyme est une enzyme produite par une plante, de préférence Arabidopsis thaliana, Citrus clementina ou Petroselinum crispum, en particulier Arabidopsis thaliana ou Petroselinum crispum, ou par une bactérie, de préférence du genre Streptomyces, en particulier Streptomyces clavuligerus. In a preferred embodiment, this enzyme is an enzyme produced by a plant, preferably Arabidopsis thaliana, Citrus clementina or Petroselinum crispum, in particular Arabidopsis thaliana or Petroselinum crispum, or by a bacterium, preferably of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces clavuligerus.
Dans un mode de réalisation particulier, la 4-coumarate-CoA ligase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 43, 45, 47, 49, 123 et 125 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase. In a particular embodiment, the 4-coumarate-CoA ligase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47, 49, 123 and 125 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la 4-coumarate-CoA ligase est une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 43, 45, 47 et 49, de préférence SEQ ID NOs: 45 et 49, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase. In another particular embodiment, 4-coumarate-CoA ligase is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 43, 45, 47 and 49, preferably SEQ ID NOs: 45 and 49, and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity.
Dans un premier mode de réalisation particulier, la 4CL est d’Arabidopsis tholiana. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro AY099747.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro AAM20598.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 44 et 43, respectivement. In a first particular embodiment, the 4CL is Arabidopsis tholiana. It is described in the Genbank database from NCBI under the number AY099747.1 for the nucleic sequence and under the number AAM20598.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 44 and 43, respectively.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la 4CL est de Petroselinum crispum. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro X13324.1 ou X13325.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro CAA31696.1 ou CAA31697.1 pour la séquence protéique, respectivement. Les protéines sont décrites dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence P14912 et P14913, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 46 et 45, et 48 et 47, respectivement. De préférence, la 4CL est de Petroselinum crispum et est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro X13324.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro CAA31696.1 pour la séquence protéique, et dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence P14912, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos :46 et 45, respectivement. In a second particular embodiment, the 4CL is from Petroselinum crispum. It is described in the NCBI Genbank database under number X13324.1 or X13325.1 for the nucleic acid sequence and under the number CAA31696.1 or CAA31697.1 for the protein sequence, respectively. The proteins are described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number P14912 and P14913, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 46 and 45, and 48 and 47, respectively. Preferably, 4CL is from Petroselinum crispum and is described in the Genbank database of NCBI under the number X13324.1 for the nucleic sequence and under the number CAA31696.1 for the protein sequence, and in UniProtKB / Swiss Prot under the number reference number P14912, and more particularly in SEQ ID Nos: 46 and 45, respectively.
Dans un troisième mode de réalisation particulier, la 4CL est de Streptomyces clavuiigerus. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro CP016559.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro ANW18832.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 50 et 49, respectivement. In a third particular embodiment, the 4CL is from Streptomyces clavuiigerus. It is described in the Genbank database of NCBI under the number CP016559.1 for the nucleic sequence and under the number ANW18832.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 50 and 49, respectively.
Dans un quatrième mode de réalisation particulier, la 4CL est d’Arabidopsis tholiana. Une séquence nucléotidique ainsi que la séquence protéique de cette enzyme sont décrites respectivement dans les SEQ ID NOs : 124 et 123. In a fourth particular embodiment, the 4CL is Arabidopsis tholiana. A nucleotide sequence as well as the protein sequence of this enzyme are described respectively in SEQ ID NOs: 124 and 123.
Dans un cinquième mode de réalisation particulier, la 4CL est de Citrus clementina et une séquence nucléotidique ainsi que la séquence protéique de cette enzyme sont décrites respectivement dans les SEQ ID NOs : 126 et 125. Dans un mode de réalisation préféré, la 4CL est une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 45, 123 et 125, de préférence SEQ ID NOs: 123 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate- CoA ligase. De manière tout particulièrement préférée, la 4CL est une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase. In a fifth particular embodiment, the 4CL is from Citrus clementina and a nucleotide sequence as well as the protein sequence of this enzyme are described respectively in SEQ ID NOs: 126 and 125. In a preferred embodiment, 4CL is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 45, 123 and 125, preferably SEQ ID NOs: 123 and 45, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity. Very particularly preferably, 4CL is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequenced and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity.
CHS : Chalcone synthase CHS: Chalcone synthase
La CHS est une chalcone synthase. Cette enzyme est capable de produire de la naringénine- chalcone à partir du 4-coumaroyl-CoA et de malonyl-CoA et de produire de l'ériodictyol- chalcone à partir de caffeoyl-CoA et de malonyl-CoA. Cette enzyme appartient à la classe des EC 2.3.1.74. CHS is a chalcone synthase. This enzyme is able to produce naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA and to produce erodictyol-chalcone from caffeoyl-CoA and malonyl-CoA. This enzyme belongs to the class of EC 2.3.1.74.
Par « activité chalcone synthase » est entendue la transformation de p-coumaroyl-CoA et de malonyl-CoA a en naringénine chalcone ou de caffeoyl-CoA et de malonyl-CoA-en ériodictyol chalcone par une enzyme chalcone synthase. Pour déterminer s'il y a une activité chalcone synthase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme Chalcone synthase, de coumaroyl- CoA ou de caffeoyl-CoA et de malonyl-CoA dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition respectivement de la Naringénine chalcone ou de l'ériodictyol chalcone est observée en HPLC-MS en comparaison au standard attendu. By "chalcone synthase activity" is meant the transformation of p-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA α to naringenin chalcone or of caffeoyl-CoA and malonyl-CoA-to eriodictyol chalcone by a chalcone synthase enzyme. To determine if there is chalcone synthase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme Chalcone synthase, coumaroyl-CoA or caffeoyl-CoA and malonyl -CoA under optimal conditions (pH, temperature, ions ...). After a certain incubation time, the appearance respectively of Naringenin chalcone or erodictyol chalcone is observed in HPLC-MS in comparison with the expected standard.
Le microorganisme comprend donc une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une Chalcone synthase. The microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase.
Cette enzyme peut être une enzyme produite par une plante, notamment du genre Arabidopsis, Aveno, Cosmos, Citrus, Daucus, Fagopyrum, Freesia, Glycine, Glycyrrhiza, Humulus, Hypericum, Flordeum, Jugions, Medicogo, Phaseolus, Physcomitrella, Plagiochasmo, Petroselinum, Pueraria, Rubus, Secale, Scutellaria, Silene, Sinopis, Spinacia, Stellaria, Triticum, Tulipa, Verbeno, Vitis, ou Xanthisma, par exemple Arabidopsis thaliana, Aveno sativa, Cosmos sulphureus, Citrus sinensis, Doucus carota, Fagopyrum esculentum, Freesia hybrid cultivar, Glycine max, Glycyrrhiza echinata, Humulus lupulus, Hypericum androsaemum, Hordeum vulgare, Jugions sp., Medicago sativa, Phaseolus vulgaris, Physcomitrello patens, Plagiochasma appendiculatum, Petroselinum crispum, Pueraria montana var. lobata, Rubus idaeus, Secale cereale, Scutellaria baicalensis, Silene sp., Sinapis olbo, Spinacia oleracea, Stellaria longipes, Triticum aestivum, Tulipa hybrid cultivar, Verbena sp., Vitis vinifera, ou Xanthisma gracile. This enzyme can be an enzyme produced by a plant, in particular of the genus Arabidopsis, Aveno, Cosmos, Citrus, Daucus, Fagopyrum, Freesia, Glycine, Glycyrrhiza, Humulus, Hypericum, Flordeum, Jugions, Medicogo, Phaseolus, Physcomitrella, Plagiochasmo, Petroselinum, Pueraria, Rubus, Secale, Scutellaria, Silene, Sinopis, Spinacia, Stellaria, Triticum, Tulipa, Verbeno, Vitis, or Xanthisma, e.g. Arabidopsis thaliana, Aveno sativa, Cosmos sulphureus, Citrus sinensis, Doucus carota, Fagopyrum es hybridculentar, Fagopyrum cultivarsia cultiventarum, , Glycine max, Glycyrrhiza echinata, Humulus lupulus, Hypericum androsaemum, Hordeum vulgare, Jugions sp., Medicago sativa, Phaseolus vulgaris, Physcomitrello patens, Plagiochasma appendiculatum, Petroselinum crispum, Pueraria montana var. lobata, Rubus idaeus, Secale cereale, Scutellaria baicalensis, Silene sp., Sinapis olbo, Spinacia oleracea, Stellaria longipes, Triticum aestivum, Tulipa hybrid cultivar, Verbena sp., Vitis vinifera, or Xanthisma gracile.
De préférence, cette enzyme est une enzyme produite par une plante, par exemple du genre Citrus, en particuliers Citrus sinensis, ou de Hordeum vulgare ou par une bactérie, de préférence du genre Streptomyces, en particulier Streptomyces clavuligerus. Preferably, this enzyme is an enzyme produced by a plant, for example of the genus Citrus, in particular Citrus sinensis, or of Hordeum vulgare, or by a bacterium, preferably of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces clavuligerus.
Dans un mode de réalisation particulier, la chalcone synthase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 51, 53, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53 et 55 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase. In a particular embodiment, the chalcone synthase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la chalcone synthase est une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase. In a particularly preferred embodiment, the chalcone synthase is an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity.
Dans un premier mode de réalisation particulier, la CHS est de Hordeum vulgare. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro Y09233.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro CAA70435.1 pou r la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 52 et 51, respectivement. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence Q96562. In a first particular embodiment, the CHS is from Hordeum vulgare. It is described in the Genbank database of NCBI under the number Y09233.1 for the nucleic acid sequence and under the number CAA70435.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 52 and 51, respectively. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number Q96562.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la CHS est de Citrus sinensis. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro AB009351.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro BAA81664.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 54 et 53, respectivement. In a second particular embodiment, the CHS is from Citrus sinensis. It is described in the Genbank database from NCBI under the number AB009351.1 for the nucleic acid sequence and under the number BAA81664.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 54 and 53, respectively.
Dans un troisième mode de réalisation particulier, la CHS est de Citrus sinensis. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro XM_006489733.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro XPJD06489796.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 56 et 55, respectivement. Dans un quatrième mode de réalisation particulier, la CHS est d e Streptomyces clavuligerus. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro CP016559.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro ANW16917.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 58 et 57, respectivement. In a third particular embodiment, the CHS is from Citrus sinensis. It is described in the Genbank database of NCBI under the number XM_006489733.1 for the nucleic sequence and under the number XPJD06489796.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 56 and 55, respectively. In a fourth particular embodiment, the CHS is from Streptomyces clavuligerus. It is described in the Genbank database from NCBI under the number CP016559.1 for the nucleic sequence and under the number ANW16917.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 58 and 57, respectively.
La réaction catalysée par la chalcone synthase nécessitant la présence de malonyl-CoA, le microorganisme peut être modifié pour augmenter la synthèse de malonyl-CoA. Since the reaction catalyzed by chalcone synthase requires the presence of malonyl-CoA, the microorganism can be modified to increase the synthesis of malonyl-CoA.
CHI : Chalcone isomérase CHI: Chalcone isomerase
La CHI est une chalcone isomérase. Elle est capable de produire la naringénine à partir de la Naringénine chalcone et de produire de l'eriodictyol à partir d'ériodictyol chalcone. Cette enzyme appartient à la classe des EC 5.5.1.6. CHI is a chalcone isomerase. It is able to produce naringenin from Naringenin chalcone and produce eriodictyol from eriodictyol chalcone. This enzyme belongs to the class of EC 5.5.1.6.
Par « activité Chalcone isomérase » est entendue la transformation de naringénine chalcone ou d'ériodictyol chalcone en naringénine ou ériodictyol par une enzyme chalcone isomérase. Pour déterminer s'il y a une activité Chalcone isomérase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme Chalcone isomérase, de naringénine chalcone ou d'ériodictyol chalcone dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition respectivement de la Naringénine ou de l'ériodictyol est observée en H PLC-MS en comparaison au standard attendu. By "Chalcone isomerase activity" is meant the transformation of naringenin chalcone or erodictyol chalcone into naringenin or eriodictyol by a chalcone isomerase enzyme. To determine if there is chalcone isomerase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme Chalcone isomerase, naringenin chalcone or erodictyol chalcone under optimal conditions. (pH, temperature, ions ...). After a certain incubation time, the appearance of Naringenin or erodictyol respectively is observed in H PLC-MS compared to the expected standard.
Le microorganisme comprend donc une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase. The microorganism therefore comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase.
Cette enzyme peut provenir d'une plante, notamment du genre Arabidopsis, Ginkgo, Oncidium, Perilla, Citrus ou Trigoneiia, par exemple Arabidopsis thaliana, Ginkgo biloba, Oncidium Gower Ramsey, Perilla frutescens, Citrus Sinensis ou Trigoneiia foenum-graecum. De préférence, cette enzyme est une enzyme produite par une plante, par exemple Arabidopsis thaliana ou par une bactérie, de préférence du genre Streptomyces, en particulier Streptomyces clavuligerus. This enzyme can come from a plant, in particular of the genus Arabidopsis, Ginkgo, Oncidium, Perilla, Citrus or Trigoneiia, for example Arabidopsis thaliana, Ginkgo biloba, Oncidium Gower Ramsey, Perilla frutescens, Citrus Sinensis or Trigoneiia foenum-graecum. Preferably, this enzyme is an enzyme produced by a plant, for example Arabidopsis thaliana or by a bacterium, preferably of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces clavuligerus.
Dans un mode de réalisation particulier, la chalcone isomérase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 59 et 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase. In a particular embodiment, the chalcone isomerase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 59 and 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity.
Dans un mode de réalisation préféré, la chalcone isomérase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase. In a preferred embodiment, the chalcone isomerase is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone isomerase activity.
Dans un premier mode de réalisation particulier, la CH I est de Streptomyces clavuligerus. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro CP016559.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro ANW16918.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 60 et 59, respectivement. In a first particular embodiment, the CH I is from Streptomyces clavuligerus. It is described in the Genbank database of NCBI under the number CP016559.1 for the nucleic acid sequence and under the number ANW16918.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 60 and 59, respectively.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la CHI est d’Arabidopsis thaliano. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro N M_115370.4 pour la séquence nucléique et sous le numéro NP_191072.1pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 62 et 61, respectivement. In a second particular embodiment, the CHI is Arabidopsis thaliano. It is described in the Genbank database of NCBI under the number N M_115370.4 for the nucleic acid sequence and under the number NP_191072.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 62 and 61, respectively.
FNS: Flavone synthase FNS: Flavone synthase
L'apigénine peut être préparée à partir de la naringénine à l'aide d'une flavone synthase (FNS). Elle est capable de produire de l'apigénine à partir de la naringénine. Apigenin can be prepared from naringenin using a flavone synthase (FNS). It is able to produce apigenin from naringenin.
Le microorganisme peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase, en particulier capable de produire de l'apigénine à partir de la naringénine et/ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase, en particulier capable de produire de la lutéoline à partir d'ériodictyol, et/ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase, en particulier capable de produire la diosmétine à partir de l'hespérétine. The microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular capable of producing apigenin from naringenin and / or a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular capable of producing luteolin from erodictyol, and / or a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase, in particular capable of producing diosmetin from hesperetin.
La FNS peut être choisie parmi celles décrites précédemment. The SNSF can be chosen from those described above.
A partir de la phénylalanine From phenylalanine
Alternativement ou en complément, le microorganisme peut également comprendre les enzymes nécessaires pour la synthèse de l'acide p-coumarique à partir de la phénylalanine. Dans ce contexte, le microorganisme peut comprendre en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4-hydroxylase (C4H). La PAL appartient à la classe des EC 4.3.1.24. Elle est capable de produire de l'acide cinnamique à partir de la phénylalanine. Alternatively or in addition, the microorganism can also comprise the enzymes necessary for the synthesis of p-coumaric acid from phenylalanine. In this context, the microorganism may further comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H). PAL belongs to the class of EC 4.3.1.24. It is able to produce cinnamic acid from phenylalanine.
Par « activité phénylalanine ammonia lyase » est entendue la transformation de la Phénylalanine en acide frans-cinnamique par une enzyme Phénylalanine ammonia lyase. Pour déterminer s'il y a une activité phénylalanine ammonia lyase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme phénylalanine ammonia lyase et de phénylalanine dans les conditions optimales (pH, température, ions...)· Après un certain temps d'incubation, l'apparition d'acide trans- cinnamique est observée en UPLC-MS en comparaison au standard attendu. By "phenylalanine ammonia lyase activity" is meant the transformation of phenylalanine into frans-cinnamic acid by an enzyme Phenylalanine ammonia lyase. To determine if there is phenylalanine ammonia lyase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme phenylalanine ammonia lyase and phenylalanine under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.) · After a certain incubation time, the appearance of trans-cinnamic acid is observed in UPLC-MS compared to the expected standard.
Plusieurs enzymes ont déjà été décrites dans l'art antérieur. De préférence, l'enzyme provient d'une plante, par exemple une plante du genre Arobidopsis, Agastache, Ananas, Asparagus, Brassica, Bromheadia, Bambusa, Beta, Betula, Citrus, Cucumis, Came Ilia, Capsicum, Cassia, Catharanthus, Cicer, Citrullus, Coffea, Cucurbita, Cynodon, Daucus, Dendrobium, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Eucalyptus, Gallus, Ginkgo, Glycine, Hordeum, Helianthus, Ipomoea, Lactuca, Lithospermum, Lotus, Lycopersicon, Medicago, Malus, Manihot, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Olea, Oryza, Phaseolus, Pi nus, Populus, Pisum, Persea, Petroselinum, Phalaenopsis, Phyllostachys, Physcomitrella, Picea, Pyrus, Prunus, Quercus, Raphanus, Rehmannia, Rubus, Solanum, Sorghum, Sphenostylis, Stellaria, Stylosanthes, Triticum, Trifolium, Vaccinium, Vigna, Vitis, Zea, ou Zinnia. Par exemple, on peut citer celles d'Arabidopsis thaliana ou de Petroselinum crispum. Dans un mode de réalisation préféré, la PAL est de Citrus sinensis. Several enzymes have already been described in the prior art. Preferably, the enzyme is from a plant, for example a plant of the genus Arobidopsis, Agastache, Ananas, Asparagus, Brassica, Bromheadia, Bambusa, Beta, Betula, Citrus, Cucumis, Came Ilia, Capsicum, Cassia, Catharanthus, Cicer , Citrullus, Coffea, Cucurbita, Cynodon, Daucus, Dendrobium, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Eucalyptus, Gallus, Ginkgo, Glycine, Hordeum, Helianthus, Ipomoea, Lactuca, Lithospermum, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Eucalyptus, Gallus, Ginkgo, Glycine, Hordeum, Helianthus, Ipomoea, Lactuca, Lithospermum, Lycopersicon, Lotus, Medicantus, Medicembago, Malembiago, Malembry, Medicago , Nicotiana, Olea, Oryza, Phaseolus, Pi nus, Populus, Pisum, Persea, Petroselinum, Phalaenopsis, Phyllostachys, Physcomitrella, Picea, Pyrus, Prunus, Quercus, Raphanus, Rehmannia, Rubus, Solanum, Sorghum, Sphenostylis, Stellaria, Triticum, Trifolium, Vaccinium, Vigna, Vitis, Zea, or Zinnia. For example, mention may be made of those of Arabidopsis thaliana or of Petroselinum crispum. In a preferred embodiment, the PAL is from Citrus sinensis.
En outre, la phénylalanine ammonia lyase (PAL) peut présenter en outre une activité tyrosine ammonia lyase (TAL) et/ou une activité dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL) telle que décrite ci-dessous. In addition, phenylalanine ammonia lyase (PAL) may further exhibit tyrosine ammonia lyase (TAL) activity and / or dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL) activity as described below.
Dans un mode de réalisation particulier, la phénylalanine ammonia lyase (PAL) est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65, 77 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase. In a particular embodiment, the phenylalanine ammonia lyase (PAL) is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity.
Dans un mode de réalisation préféré, la PAL est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 65 et 77 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase. De manière tout particulièrement préférée, la PAL est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase. Dans un mode de réalisation particulier, la PAL de Citrus sinensis est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro XM_006481431.2 pour la séquence nucléique et sous le numéro XP_006481494.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 64 et 63, respectivement. In a preferred embodiment, PAL is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 65 and 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity. Very particularly preferably, PAL is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity. In a particular embodiment, the PAL of Citrus sinensis is described in the Genbank database of NCBI under the number XM_006481431.2 for the nucleic sequence and under the number XP_006481494.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQs ID Nos: 64 and 63, respectively.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la PAL de Citrus sinensis est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro XM_006488000.2 pour la séquence nucléique et sous le numéro XP_006488063.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 66 et 65, respectivement. In another particular embodiment, the PAL of Citrus sinensis is described in the Genbank database of NCBI under the number XM_006488000.2 for the nucleic acid sequence and under the number XP_006488063.1 for the protein sequence, and more particularly in the SEQ ID Nos: 66 and 65, respectively.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la PAL d’Arabidopsis tholiona est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro NM_115186.4 pour la séquence nucléique et sous le numéro N P_190894.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 78 et 77, respectivement. In another particular embodiment, the PAL of Arabidopsis tholiona is described in the Genbank database of NCBI under the number NM_115186.4 for the nucleic sequence and under the number N P_190894.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 78 and 77, respectively.
Éventuellement, si la biosynthèse à partir de la tyrosine et de la phénylalanine est envisagée, la PAL et la TAL peuvent être remplacées ou complétées par une phénylalanine/tyrosine ammonia lyase (PTAL). La PTAL appartient à la classe des EC 4.3.1.25. Optionally, if biosynthesis from tyrosine and phenylalanine is contemplated, PAL and TAL can be replaced or supplemented with a phenylalanine / tyrosine ammonia lyase (PTAL). PTAL belongs to the class of EC 4.3.1.25.
La C4H appartient à la classe des EC 1.14.13.11. Elle est capable de produire de l'acide p- coumarique à partir de l'acide cinnamique. C4H belongs to the class of EC 1.14.13.11. It is able to produce p-coumaric acid from cinnamic acid.
Par « activité trans-cinnamate 4-monooxygénase » est entendue la transformation de l'acide trans-cinnamique en acide p-coumarique par une enzyme trans-cinnamate 4- monooxygénase (CPR dépendante). Pour déterminer s'il y a une activité trans-cinnamate 4-monooxygénase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme trans-cinnamate 4-monooxygénase, d'acide cinnamique, de NADPH, d'H+ et d'Û2 dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition de 4-hydroxycinnamate (acide p- coumarique) est observée en UPLC-MS en comparaison au standard attendu. By "trans-cinnamate 4-monooxygenase activity" is meant the conversion of trans-cinnamic acid to p-coumaric acid by a trans-cinnamate 4-monooxygenase (CPR dependent) enzyme. To determine if there is trans-cinnamate 4-monooxygenase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme trans-cinnamate 4-monooxygenase, cinnamic acid , NADPH, H + and O2 under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of 4-hydroxycinnamate (p-coumaric acid) is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard.
Plusieurs enzymes ont déjà été décrites dans l'art antérieur. De préférence, l'enzyme provient d'une plante, par exemple une plante du genre Arobidopsis, Ammi, Avicennia, Camellia, Camptotheca, Catharanthus, Citrus, Glycine, Helianthus, Lotus, Mesembryanthemum, Physcomitreila, Phaseoius, Pi nus, Populus, Ruta, Saccharum, Solonum, Vitis, Vigna ou Zea. Dans un mode de réalisation préféré, la cinnamate 4- hydroxylase (C4H) est de Citrus sinensis ou d’Arabidopsis thaliana. Dans un mode de réalisation particulier, la cinnamate 4-hydroxylase (C4H) est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4- hydroxylase. Several enzymes have already been described in the prior art. Preferably, the enzyme is from a plant, for example a plant of the genus Arobidopsis, Ammi, Avicennia, Camellia, Camptotheca, Catharanthus, Citrus, Glycine, Helianthus, Lotus, Mesembryanthemum, Physcomitreila, Phaseoius, Pi nus, Populus, Ruta , Saccharum, Solonum, Vitis, Vigna or Zea. In a preferred embodiment, the cinnamate 4-hydroxylase (C4H) is from Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana. In a particular embodiment, the cinnamate 4-hydroxylase (C4H) is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
Dans un mode de réalisation préféré, la C4H est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase. In a preferred embodiment, C4H is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
Dans un mode de réalisation particulier, la C4H de Citrus sinensis est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro NMJD01288840.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro NP_001275769.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 68 et 67, respectivement. In a particular embodiment, the C4H of Citrus sinensis is described in the Genbank database of NCBI under the number NMJD01288840.1 for the nucleic sequence and under the number NP_001275769.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQs. ID Nos: 68 and 67, respectively.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la C4H de Citrus sinensis est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro NM_001288895.1 pour la séquence nucléique et sous le numéro NP_001275824.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 70 et 69, respectivement. In another particular embodiment, the C4H of Citrus sinensis is described in the Genbank database of NCBI under the number NM_001288895.1 for the nucleic sequence and under the number NP_001275824.1 for the protein sequence, and more particularly in the SEQ ID Nos: 70 and 69, respectively.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la C4H d'Arabidopsis thaliana est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro NM_128601.3 pour la séquence nucléique et sous le numéro N P_180607.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 80 et 79, respectivement. In another particular embodiment, the C4H of Arabidopsis thaliana is described in the Genbank database of NCBI under the number NM_128601.3 for the nucleic sequence and under the number N P_180607.1 for the protein sequence, and more particularly in SEQ ID Nos: 80 and 79, respectively.
En passant par l'acide caféique Via caffeic acid
Dans un mode de réalisation supplémentaire, la biosynthèse de l'ériodictyol peut également comprendre la synthèse de la L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) à partir de la tyrosine puis de l'acide caféique à partir de la L-DOPA (3,4-dihydroxy-L- phenylalanine). Pour cela, les enzymes suivantes sont nécessaires. Pour convertir la tyrosine en L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), deux sous-unités sont nécessaires, HpaB et HpaC. In a further embodiment, the biosynthesis of erodictyol can also comprise the synthesis of L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) from tyrosine followed by caffeic acid from L -DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine). For this, the following enzymes are required. To convert tyrosine to L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), two subunits are needed, HpaB and HpaC.
La HpaB est une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (HpaB). De préférence, cette enzyme est une enzyme produite par une bactérie, de préférence Escherichia coii. Dans un mode de réalisation particulier, la 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (HpaB) est une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 83 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase. HpaB is a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit. Preferably, this enzyme is an enzyme produced by a bacterium, preferably Escherichia coii. In a particular embodiment, 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase activity.
Dans un mode de réalisation particulier, la HpaB est de Escherichia coli. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro CAQ34705.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans la séquence SEQ ID No : 83. Une séquence nucléique codant pour cette enzyme est décrite dans la séquence SEQ ID No : 84. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence A0A140NG21. La HpaC est une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase. Le microorganisme peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase (HpaC). Par « activité p-coumarate 3 hydroxylase » est entendue la transformation de l'acide p- coumarique en acide caféique et/ou de la L-tyrosine en L-Dopa en utilisant un complexe enzymatique composé de HpaB (4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase oxydase) et de HpaC (4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase réductase). Pour déterminer s'il y a une activité p-coumarate 3 hydroxylase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé des enzymes HpaB, HpaC, d'acide p- coumarique ou de L-Tyrosine, de FAD et de NADH dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition de l'acide caféique ou de la L-Dopa est observée en HPLC-MS en comparaison au standard attendu. In a particular embodiment, the HpaB is from Escherichia coli. It is described in the Genbank database of NCBI under the number CAQ34705.1 for the protein sequence, and more particularly in the sequence SEQ ID No: 83. A nucleic sequence encoding this enzyme is described in the sequence SEQ ID No: 84. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140NG21. HpaC is a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase subunit. The microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC) subunit. By "p-coumarate 3 hydroxylase activity" is meant the conversion of p-coumaric acid to caffeic acid and / or L-tyrosine to L-Dopa using an enzyme complex composed of HpaB (4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase oxidase) and HpaC (4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase reductase). To determine if there is p-coumarate 3 hydroxylase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzymes HpaB, HpaC, p-coumaric acid or L- Tyrosine, FAD and NADH under optimal conditions (pH, temperature, ions ...). After a certain incubation time, the appearance of caffeic acid or L-Dopa is observed by HPLC-MS in comparison with the expected standard.
De préférence, cette enzyme est une enzyme produite par une bactérie, de préférence Escherichia coli. Preferably, this enzyme is an enzyme produced by a bacterium, preferably Escherichia coli.
Dans un mode de réalisation particulier, la 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase (HpaC) est une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 85 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase. In a particular embodiment, 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC) is an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase activity.
Dans un mode de réalisation particulier, la HpaC est de Escherichia coli. Elle est décrite dans la base de données Genbank de NCBI sous le numéro CAQ34704.1 pour la séquence protéique, et plus particulièrement dans la séquence SEQ ID No : 85. Une séquence nucléique codant pour cette enzyme est décrite dans la séquence SEQ ID No : 86. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss Prot sous le numéro de référence A0A140NG67. Ensemble, la HpaB et la HpaC sont capables de produire de la L-DOPA (3,4-dihydroxy-L- phenylalanine) à partir de la tyrosine. In a particular embodiment, the HpaC is from Escherichia coli. It is described in the Genbank database of NCBI under the number CAQ34704.1 for the protein sequence, and more particularly in the sequence SEQ ID No: 85. A sequence nucleic acid encoding this enzyme is described in the sequence SEQ ID No: 86. The protein is described in UniProtKB / Swiss Prot under the reference number A0A140NG67. Together, HpaB and HpaC are able to produce L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) from tyrosine.
Ainsi, le microorganisme peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (HpaB) et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase (HpaC). Thus, the microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) and a heterologous nucleic acid sequence encoding 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC).
Par ailleurs, cette voie nécessite également la présence d'une enzyme capable de synthétiser l'acide caféique à partir de la L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL). Cette enzyme appartient à la classe des EC 4.3.1.11. Moreover, this route also requires the presence of an enzyme capable of synthesizing caffeic acid from L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL). This enzyme belongs to the class of EC 4.3.1.11.
Par « activité dihydroxyphénylalanine ammonia lyase » est entendue la transformation de la L-Dopa en acide trans-caféique par une enzyme dihydroxyphénylalanine ammonia lyase. Pour déterminer s'il y a une activité dihydroxyphénylalanine ammonia lyase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme dihydroxyphénylalanine ammonia lyase et de L-dopa (levodopa) dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition d'acide trans-caféique est observée en UPLC-MS en comparaison au standard attendu. By "dihydroxyphenylalanine ammonia lyase activity" is meant the conversion of L-Dopa to trans-caffeic acid by a dihydroxyphenylalanine ammonia lyase enzyme. To determine if there is dihydroxyphenylalanine ammonia lyase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme dihydroxyphenylalanine ammonia lyase and L-dopa (levodopa) under the conditions optimal (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of trans-caffeic acid is observed in UPLC-MS in comparison with the expected standard.
En outre, la dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL) peut présenter en outre une activité tyrosine ammonia lyase (TAL) et/ou une activité phénylalanine ammonia lyase (PAL). Further, dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL) may additionally exhibit tyrosine ammonia lyase (TAL) activity and / or phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity.
Le microorganisme peut ainsi comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (HpaB), une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une sous-unité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase (HpaC) et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL). The microorganism can thus comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit, a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase subunit ( HpaC) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL).
De manière alternative à l'utilisation des HpaB et HpaC ou en combinaison avec celles-ci, il est possible d'utiliser une enzyme permettant de convertir la tyrosine en L-Dopa et une enzyme permettant de convertir l'acide p-coumarique en acide caféique. Il s'agit respectivement d'une 4-méthoxybenzoate O-déméthylase, également appelée 4- méthoxybenzoate monooxygénase (O-déméthylant) qui possède l'activité L-tyrosine hydroxylase appartenant à la classe des EC 1.14.99.15 et d'une p-coumarate-3-hydroxylase possédant l'activité p-coumarate 3 hydroxylase appartenant à la classe des EC 1.14.13.As an alternative to the use of HpaB and HpaC or in combination with them, it is possible to use an enzyme for converting tyrosine into L-Dopa and an enzyme for converting p-coumaric acid into acid caffeic. It is respectively a 4-methoxybenzoate O-demethylase, also called 4-methoxybenzoate monooxygenase (O-demethylant) which has the L-tyrosine hydroxylase activity belonging to the class of EC 1.14.99.15 and a p- coumarate-3-hydroxylase possessing p-coumarate 3-hydroxylase activity belonging to the class of EC 1.14.13.
Ces différentes enzymes font toutes deux partie de la famille des cytochromes P450 (CYP). Par « activité L-tyrosine hydroxylase » est entendue la transformation de l'acide p- coumarique en acide caféique et/ou de la L-tyrosine en L-Dopa en utilisant une enzyme p- coumarate 3 hydroxylase (CPR dépendante). Pour déterminer s'il y a une activité L-tyrosine hydroxylase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme p-coumarate 3 hydroxylase, d'acide p-coumarique ou de L-Tyrosine, les co-facteurs nécessaires dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition de l'acide caféique ou de la L- Dopa est observée en HPLC-MS en comparaison au standard attendu. These different enzymes are both part of the cytochrome P450 (CYP) family. By "L-tyrosine hydroxylase activity" is meant the conversion of p-coumaric acid to caffeic acid and / or L-tyrosine to L-Dopa using a p-coumarate 3 hydroxylase (CPR dependent) enzyme. To determine if there is L-tyrosine hydroxylase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme p-coumarate 3 hydroxylase, p-coumaric acid or of L-Tyrosine, the necessary co-factors under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of caffeic acid or L-Dopa is observed by HPLC-MS in comparison with the expected standard.
Par « activité p-coumarate 3 hydroxylase » est entendue la transformation de l'acide p- coumarique en acide caféique et/ou de la L-tyrosine en L-Dopa en utilisant une enzyme p- coumarate 3 hydroxylase (CPR dépendante). Pour déterminer s'il y a une activité p- coumarate 3 hydroxylase, un test enzymatique peut être effectué qui consiste en l'incubation in vitro d'un mélange composé de l'enzyme p-coumarate 3 hydroxylase, d'acide p-coumarique ou de L-Tyrosine, dans les conditions optimales (pH, température, ions...). Après un certain temps d'incubation, l'apparition de l'acide caféique ou de la L- Dopa est observée en HPLC-MS en comparaison au standard attendu. By "p-coumarate 3 hydroxylase activity" is meant the conversion of p-coumaric acid to caffeic acid and / or L-tyrosine to L-Dopa using a p-coumarate 3 hydroxylase (CPR dependent) enzyme. To determine if there is p-coumarate 3 hydroxylase activity, an enzymatic test can be performed which consists of the in vitro incubation of a mixture composed of the enzyme p-coumarate 3 hydroxylase, p-coumaric acid or L-Tyrosine, under optimal conditions (pH, temperature, ions, etc.). After a certain incubation time, the appearance of caffeic acid or L-Dopa is observed by HPLC-MS in comparison with the expected standard.
Le microorganisme recombinant peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-méthoxybenzoate O-déméthylase (CYP) capable de convertir la tyrosine en L-Dopa et également l'acide p coumarique en acide caféique. The recombinant microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase (CYP) capable of converting tyrosine into L-Dopa and also p coumaric acid into caffeic acid.
Dans un mode de réalisation, la 4-méthoxybenzoate O-déméthylase est une enzyme de bactérie, notamment de Rhodopseudomonas palustris, Pseudomonas putida, ou Escherichia coli, de plante, notamment de Beta vulgaris, de mammifère, notamment d’Oryctolagus cunicuius, ou de champignon, notamment de Rhodotorula glutinis. Dans un mode de réalisation particulier, la 4-méthoxybenzoate O-déméthylase est une enzyme de Rhodopseudomonas palustris, de Saccharothrix espanaensis, ou de Beta vulgaris. In one embodiment, 4-methoxybenzoate O-demethylase is an enzyme from bacteria, in particular from Rhodopseudomonas palustris, Pseudomonas putida, or Escherichia coli, from plants, in particular from Beta vulgaris, from mammals, in particular from Oryctolagus cunicuius, or from fungus, especially Rhodotorula glutinis. In a particular embodiment, 4-methoxybenzoate O-demethylase is an enzyme from Rhodopseudomonas palustris, Saccharothrix espanaensis, or Beta vulgaris.
Dans un mode de réalisation particulier, la 4-méthoxybenzoate O-déméthylase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 73 et 75 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité L-tyrosine hydrolase. In a particular embodiment, 4-methoxybenzoate O-demethylase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 73 and 75 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting L-tyrosine hydrolase activity.
La 4-méthoxybenzoate O-déméthylase peut également être de Beta vulgaris. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans dans les SEQ ID Nos : 74 et 73, respectivement. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss P rot sous le numéro de référence P0DKI2. The 4-methoxybenzoate O-demethylase can also be from Beta vulgaris. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in SEQ ID Nos: 74 and 73, respectively. The protein is described in UniProtKB / Swiss P rot under the reference number P0DKI2.
En outre, la 4-méthoxybenzoate O-déméthylase peut être de Saccharothrix espanaensis. Les séquences nucléiques codant cette enzyme et séquences protéiques sont décrites dans NCBI sous les numéros de référence NC_005296.1 et WP_011157377.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 76 et 75. La protéine est décrite dans UniProtKB/Swiss P rot sous le numéro de référence Q6N8N2. Additionally, the 4-methoxybenzoate O-demethylase can be from Saccharothrix espanaensis. The nucleic acid sequences encoding this enzyme and protein sequences are described in NCBI under the reference numbers NC_005296.1 and WP_011157377.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 76 and 75. The protein is described in UniProtKB / Swiss P rot under the reference number Q6N8N2.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme peut comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-méthoxybenzoate O-déméthylase et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL). In one embodiment, the microorganism may include a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase and a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL).
Le microorganisme recombinant peut donc comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une coumarate 3-hydroxylase (Coum3H) capable de convertir l'acide p-coumarique en acide caféique. The recombinant microorganism can therefore comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a coumarate 3-hydroxylase (Coum3H) capable of converting p-coumaric acid into caffeic acid.
Dans un mode de réalisation, la coumarate 3-hydroxylase est une enzyme de bactérie, notamment de Saccharothrix, In one embodiment, the coumarate 3-hydroxylase is an enzyme from bacteria, in particular from Saccharothrix,
Dans un mode de réalisation particulier, la 4-méthoxybenzoate O-déméthylase est sélectionnée l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 71 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité coumarate 3- hydroxylase. In a particular embodiment, the 4-methoxybenzoate O-demethylase is selected the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 71 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting coumarate 3-hydroxylase activity.
La séquence nucléique codant cette enzyme et séquence protéique est décrite dans NCBI sous les numéros de référence DQ357071.1 et ABC88666.1, respectivement, et plus particulièrement dans les SEQ ID Nos : 72 et 71. The nucleic acid sequence encoding this enzyme and protein sequence is described in NCBI under the reference numbers DQ357071.1 and ABC88666.1, respectively, and more particularly in SEQ ID Nos: 72 and 71.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme peut comprendre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une coumarate 3-hydroxylase et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL). Combinaison d'enzymes supplémentaire In one embodiment, the microorganism may comprise a heterologous nucleic acid sequence encoding a coumarate 3-hydroxylase and a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL). Additional enzyme combination
Ainsi, outre les enzymes nécessaires à la biosynthèse de l'hespéridine et/ou la diosmine à partir de la naringénine et/ou de l'apigénine telles que décrites précédemment, le microorganisme comprend de préférence les enzymes permettant la production de la naringénine et/ou de l'apigénine à partir de la tyrosine et/ou de la phénylalanine, de préférence à partir de la tyrosine. Thus, in addition to the enzymes necessary for the biosynthesis of hesperidin and / or diosmin from naringenin and / or apigenin as described above, the microorganism preferably comprises the enzymes allowing the production of naringenin and / or or apigenin from tyrosine and / or phenylalanine, preferably from tyrosine.
Ainsi, selon des modes de réalisation particuliers, le microorganisme comprend Thus, according to particular embodiments, the microorganism comprises
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase (UGT) capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et/ou la diosmétine, - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding a glucose in position 7 of hesperetin and / or diosmetin,
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable de transférer un rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O- glucoside et/ou la diosmétine-7-O-glucoside, - a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to position 6 of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O- glucoside,
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase (RHM) capable de produire de l'UDP-rhamnose, - a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose- reductase (RHM) capable of producing UDP-rhamnose,
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4', - a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 ',
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une enzyme F3'H, - a heterologous nucleic acid sequence encoding an F3'H enzyme,
- et optionnellement une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une enzyme FNS et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une enzyme CPR, et comprend en outre - And optionally a heterologous nucleic acid sequence encoding an FNS enzyme and a heterologous nucleic acid sequence encoding a CPR enzyme, and further comprises
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL), une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL), une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI). - a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL), a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL), a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI).
Dans une mode de réalisation, le microorganisme comprend In one embodiment, the microorganism comprises
-une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O- méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; de préférence une OMT de Citrus clementina, de Citrus sinensis, d’Arahidopsis tholiano ou d’Homo sapiens, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117, 119, 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O-méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117 et 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O-méthyltransférase, et manière tout particulièrement préférée une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O- méthyltransférase; et a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 '; preferably an OMT from Citrus clementina, Citrus sinensis, Arahidopsis tholiano or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and a methylation in position 4 ', preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, and very particularly preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine et comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 11, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase, et de manière tout particulièrement préférée une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 7, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec cette séquence et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of hydroxylating naringenin and / or apigenin in position 3 'and comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the '3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, and very particularly preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least less 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity; and
-facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, et de manière particulière parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; et -optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and in particular from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
-facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, en particulier pour une flavone synthase (FNS) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; et -optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavone synthase activity, in particular for a flavone synthase (FNS) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity; and
-une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) de Rhodotorula glutinis ou Flavobacterium johnsoniae ; en particulier une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 41 et 39 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; de préférence une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) from Rhodotorula glutinis or Flavobacterium johnsoniae; in particular a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 41 and 39 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity; preferably a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity ; and
-une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) d’Arabidopsis thaliana, Citrus dementina, Petroselinum crispum ou Streptomyces clavuligerus ; en particulier une 4CL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 123, 125, 45, 43, 47 et 49 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; de préférence une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 123, 125 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; de manière tout particulièrement préférée une 4CL comprenant u ne séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase, et a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) from Arabidopsis thaliana, Citrus dementina, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; in particular a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 123, 125, 45, 43, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4- activity coumarate-CoA ligase; very particularly preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, and
-une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) de Citrus sinensis, de Hordeum vulgore ou de Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53, 51, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, de préférence une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) of Citrus sinensis, of Hordeum vulgore or of Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53, 51, 55 and 57 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
-une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CH I) d’Arabidopsis thaliana ou Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHI comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 61 et 59 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase ; de préférence une CHI comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase . a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I) of Arabidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus, in particular a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 61 and 59 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity; preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity .
De préférence, dans ce mode de réalisation, le microorganisme comprend l'une des combinaisons d'enzymes UGT, RhaT et RHM décrites plus haut, en particulier Preferably, in this embodiment, the microorganism comprises one of the combinations of UGT, RhaT and RHM enzymes described above, in particular
- la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; et - flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; and
- la 6"-0-rhamnosyltransferase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase ; et - 6 "-O-rhamnosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting a 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
l'UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy- D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase selected from enzymes comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP activity -4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
De préférence, dans ce mode de réalisation, le microorganisme comprend en outre Preferably, in this embodiment, the microorganism further comprises
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) , en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65 et 77, de préférence SEQ ID NO : 65 et 77, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, et de manière plus particulièrement préférée une phénylalanine am monia lyase (PAL) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65 and 77, preferably SEQ ID NOs: 65 and 77, and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, and more particularly preferably a phenylalanine am monia lyase (PAL) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase ; et de manière tout particulièrement préférée une cinnamate 4- hydroxylase (C4H) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4- hydroxylase. - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; and very particularly preferably a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme comprend : -une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O- méthyltransférase (OMT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117 et 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O- méthyltransférase, et manière tout particulièrement préférée une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O-méthyltransférase; et In another embodiment, the microorganism comprises: - a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, and very particularly preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine et comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 7, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec cette séquence et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of hydroxylating naringenin and / or apigenin in position 3 'and comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the activity flavonoid 3'-monooxygenase, preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at less 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity; and
-facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence choisie parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; et -optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably chosen from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
-facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; et -optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO: 123, 125 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase de manière tout particulièrement préférée une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with these sequences and exhibiting a 4-coumarate-CoA ligase activity very particularly preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and the polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) comprenant une séquence choisi parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase . - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity.
De préférence, dans ce mode de réalisation, le microorganisme comprend l'une des combinaisons d'enzymes UGT, RhaT et RHM décrites plus haut, en particulier Preferably, in this embodiment, the microorganism comprises one of the combinations of UGT, RhaT and RHM enzymes described above, in particular
- la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; et - flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; and
- la 6"-0-rhamnosyltransferase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase ; et - 6 "-O-rhamnosyltransferase selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
l'UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy- D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-L-rhamnose-reductase selected from enzymes comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP activity -4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
De préférence, dans ce mode de réalisation, le microorganisme comprend en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H) comme décrites dans le mode de réalisation précédent. Preferably, in this embodiment, the microorganism further comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) as described. in the previous embodiment.
Facultativement, dans ces différents modes de réalisation, le microorganisme comprend en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S- adénosylméthionine synthétase (SAMT); en particulier de Saccharomyces cerevisiae, par exemple une SAMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosylméthionine synthétase. Optionally, in these various embodiments, the microorganism further comprises a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT); in particular of Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme comprend : In another particular embodiment, the microorganism comprises:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) d’Arabidopsis thaliana, de Scutellaria baicalensis ou d’Homo sapiens, de préférence d’Arabidopsis thaliana ou de Scutellaria baicalensis, de préférence une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; de manière particulière une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, et de préférence une UGT comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis, preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, and preferably a UGT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone activity 7 -O-beta-D-glucosyltransferase;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus ciementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus ciementina, de préférence une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase, et de préférence une RhaT comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RHM) de Citrus sinensis ou d'Arabidopsis thaliana, de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/U DP-4-kéto-L-rhamnose-réductase, en particulier une RHM comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase, et de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D- glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; de préférence de Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis ou Pilosella officinarum, en particulier Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis ou Pilosella officinarum, de préférence une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'- monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 et 19 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'- monooxygénase, en particulier une F3'H comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 5, 7, 17 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de manière plus particulièrement préférée une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 7 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus ciementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus ciementina, preferably a 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-O-rhamnosyltransferase activity, and preferably an RhaT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM) of Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and showing UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / U DP-4-keto-epimerase activity L-rhamnose reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this Sequenced and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity, and preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ I D NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4- activity. keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis or Pilosella officinarum, in particular Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis or Pilosella officinarum, preferably an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19 and 21 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably selected from among enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and having a flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, more particularly preferably an F3′H comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7 and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity;
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) ; de préférence une CPR de Saccharomyces cerevisiae, ou de plante, par exemple de Catharanthus rose us ou d'Arabidopsis thaliana ; de préférence une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, en particulier une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR); preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus rose us or of Arabidopsis thaliana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, in particular a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; de préférence une OMT d'Arabidopsis thaliana ou d’Homo sapiens, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O- méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O-méthyltransférase ; facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S-adénosylméthionine synthétase (SAMT) ; en particulier de Saccharomyces cerevisiae, par exemple une SAMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosylméthionine synthétase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaliana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; optionally, a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT); in particular of Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity; and
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) capable de transformer la naringénine en apigénine, l'ériodictyol en lutéoline et/ou l'hespérétine en diosmétine, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline; de préférence une FNS d’Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Pop u lus deltoïdes, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea médusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Péril la frutescens var crispa, Dahlia pinnata ou Erythranthe lewisii, en particulier d 'Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes ou Zea mays, de préférence de Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, et Petroselinum crispum; de préférence une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35 et 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase; optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin to apigenin, erodictyol to luteolin and / or hesperetin to diosmetin, preferably of converting eriodictyol to luteolin; preferably an SNF of Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Pop u lus deltoïdes, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminapelium, Aethusa cynica Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea médusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Peril la frutescens var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii, in particular Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes or Zea mays, preferably Lonicera japonica, Lonicera macrantelinumhoides, and Petrosum; preferably an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from among SEQ ID NOs: 33, 35 and 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity ;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) capable de produire de l'acide p-coumarique à partir de la tyrosine; de préférence de Rhodotorula glutinis ou Flavobacterium johnsoniae ; en particulier une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 39 et 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; de préférence une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) capable of producing p-coumaric acid from tyrosine; preferably Rhodotorula glutinis or Flavobacterium johnsoniae; in particular a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 39 and 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity; preferably a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity ;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable de produire de le coumaryl-CoA à partir de l'acide p- coumarique et de Coenzyme A ; de préférence d’Arabidopsis thaliana, Petroselinum crispum ou Streptomyces clavuligerus ; une 4CL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 43, 45, 47 et 49 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase, de préférence une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A; preferably Arabidopsis thaliana, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA activity ligase;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) capable de produire de la naringénine-chalcone à partir du 4-coumaroyl-CoA et de malonyl-CoA ; de préférence de Citrus sinensis, de Hordeum vulgare ou de Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 51, 53, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53 et 55 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, et de manière plus particulièrement préférée une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité chalcone synthase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CH I) capable de produire la naringénine à partir de la naringénine chalcone ; de préférence d’Arabidopsis thaliana ou Streptomyces clavuligerus, en particulier une CH I comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 59 et 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase, et de manière plus particulièrement préférée une CHI comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase . Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme comprend les séquences d'acides nucléiques hétérologues codant pour les enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS, CHI, et facultativement pour les enzymes CPR, FNS et SAMT, telles que décrites dans le mode de réalisation précédent et comprend en outre : une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL), en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65, 77 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4-hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase, capables de produire de l'acide p-coumarique à partir de la phénylalanine, en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase. Dans un troisième mode de réalisation particulier, le microorganisme comprend les séquences d'acides nucléiques hétérologues codant pour les enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, O MT, 4CL, CHS, CHI, et facultativement pour les enzymes CPR, FNS et SAMT, telles que décrites dans le mode de réalisation précédent et comprend en outre : a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA; preferably from Citrus sinensis, from Hordeum vulgare or from Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, and more particularly preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I) capable of producing naringenin from naringenin chalcone; preferably Arabidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus, in particular a CH I comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 59 and 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity, and more preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity. In another particular embodiment, the microorganism comprises the heterologous nucleic acid sequences encoding the enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS, CHI, and optionally for the enzymes CPR, FNS and SAMT , as described in the previous embodiment and further comprises: a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity, in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity, and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 4- cinnamate activity hydroxylase, capabl es to produce p-coumaric acid from phenylalanine, in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity. In a third particular embodiment, the microorganism comprises the heterologous nucleic acid sequences encoding the enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, O MT, 4CL, CHS, CHI, and optionally for the enzymes CPR, FNS and SAMT, as described in the previous embodiment and further comprises:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL) capable de produire de l'acide caféique à partir de la L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine); a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL) capable of producing caffeic acid from L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine);
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une sous-unité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (HpaB), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 83 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4-hydroxyphénylacetate 3- monooxygénase oxygénase, et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase (HpaC), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 85 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-méthoxybenzoate O-déméthylase capable de convertir la tyrosine en L-Dopa et également l'acide p coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 73 et 75 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité L-tyrosine hydroxylase; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une p-coumarate 3-hydroxylase capable de convertir l'acide p- coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID No : 71 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité d'une séquence avec une de ces séquences et présentant une activité p-coumarate 3 hydroxylase. a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit, preferably comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity, and a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase subunit ( HpaC), preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase activity; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine into L-Dopa and also p coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 73 and 75 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting L-tyrosine hydroxylase activity; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a p-coumarate 3-hydroxylase capable of converting p-coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID No: 71 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of a sequence with one of these sequences and exhibiting p-coumarate 3 hydroxylase activity.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme comprend les séquences d'acides nucléiques hétérologues codant pour les enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS, CHI, et facultativement pour les enzymes CPR, FNS et SAMT, telles que décrites dans le mode de réalisation précédent et comprend en outre : In another particular embodiment, the microorganism comprises the heterologous nucleic acid sequences encoding the enzymes UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS, CHI, and optionally for the enzymes CPR, FNS and SAMT , as described in the previous embodiment and further comprises:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) capable de produire de l'acide p-coumarique à partir de la tyrosine; de préférence de Rhodotorulo glutinis ou Flavobacterium johnsoniae ; en particulier une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 39 et 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; de préférence une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) capable of producing p-coumaric acid from tyrosine; preferably Rhodotorulo glutinis or Flavobacterium johnsoniae; in particular a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 39 and 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity; preferably a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity ;
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL), en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65, 77 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, de préférence une PAL comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4-hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4- hydroxylase, capables de produire de l'acide p-coumarique à partir de la phénylalanine, de préférence une C4H comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase; optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, preferably a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine, preferably a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity;
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (HpaB), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 83 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase, et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3- monooxygénase réductase (HpaC), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 85 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-méthoxybenzoate O-déméthylase capable de convertir la tyrosine en L-Dopa et également l'acide p coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 73 et 75 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité L-tyrosine hydrolase; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une p-coumarate 3-hydroxylase capable de convertir l'acide p-coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID No : 71 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité d'une séquence avec une de ces séquences et présentant une activité p-coumarate 3 hydroxylase ; optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit, preferably comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity, and a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase subunit reductase (HpaC), preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with the latter and exhibiting a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase activity; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine into L-Dopa and also p coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 73 and 75 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting L-tyrosine hydrolase activity; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a p-coumarate 3-hydroxylase capable of converting p-coumaric acid to caffeic acid, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID No: 71 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of a sequence with one of these sequences and exhibiting p-coumarate 3 hydroxylase activity;
facultativement, une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL) capable de produire de l'acide caféique à partir de la L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine). optionally, a heterologous nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL) capable of producing caffeic acid from L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine).
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme comprend : In another particular embodiment, the microorganism comprises:
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0-rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase (RH M) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose- reductase (RH M) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP- activity. glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 ou 123 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase, de préférence une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 or 123 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, preferably a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 7 et les polypeptides comprenant une séquence a ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7 and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; et - une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; et- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117 et 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O-méthyltransférase ,et de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O-méthyltransférase. - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting flavone synthase activity; and - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and- a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 'and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, and preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting O-methyltransferase activity.
De préférence, le microorganisme comprend en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S-adénosylméthionine synthétase (SAMT), en particulier une SAMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosylméthionine synthétase. Preferably, the microorganism further comprises a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT), in particular a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity.
L'origine des enzymes ou d'un ensemble d'enzymes pourra être choisie de sorte à ce que leur origine soit la même ou soit proche. Par exemple, les enzymes ou l'ensemble d'enzymes peuvent être issues de bactéries, par exemple de bactéries du même genre ou de la même espèce. Dans un autre exemple, les enzymes ou l'ensemble d'enzymes peuvent être issues de plantes, par exemple de plantes du même genre ou de la même espèce. En effet, ces origines communes permettent que les enzymes fonctionnent entre elles de manière optimale. The origin of the enzymes or of a set of enzymes may be chosen so that their origin is the same or is close. For example, the enzymes or the set of enzymes can be derived from bacteria, for example bacteria of the same genus or of the same species. In another example, the enzymes or the set of enzymes may be derived from plants, for example plants of the same genus or of the same species. Indeed, these common origins allow the enzymes to work together optimally.
Dans un mode de réalisation, les microorganismes comprennent une voie métabolique de biosynthèse de la tyrosine. Notamment, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour avoir une production augmentée de tyrosine par rapport à une souche sauvage. Notamment, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour que le flux de carbone soit redirigé vers la biosynthèse de tyrosine. En outre, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour réduire ou supprimer les rétro-inhibitions de la biosynthèse de tyrosine. Dans un autre mode de réalisation, les microorganismes comprennent une voie métabolique de biosynthèse de la phénylalanine. Notamment, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour avoir une production augmentée de phénylalanine par rapport à une souche sauvage. Notamment, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour que le flux de carbone soit redirigé vers la biosynthèse de phénylalanine. En outre, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour réduire ou supprimer les rétro-inhibitions de la biosynthèse de phénylalanine. In one embodiment, the microorganisms comprise a metabolic pathway for the biosynthesis of tyrosine. In particular, the microorganisms may have been modified to have an increased production of tyrosine compared to a wild strain. In particular, the microorganisms may have been modified so that the carbon flow is redirected towards the biosynthesis of tyrosine. In addition, the microorganisms may have been modified to reduce or eliminate feedback inhibitions of tyrosine biosynthesis. In another embodiment, the microorganisms comprise a metabolic pathway for the biosynthesis of phenylalanine. In particular, the microorganisms may have been modified to have an increased production of phenylalanine compared to a wild strain. In particular, the microorganisms may have been modified so that the carbon flow is redirected towards the biosynthesis of phenylalanine. In addition, the microorganisms may have been modified to reduce or eliminate feedback inhibitions of phenylalanine biosynthesis.
Dans un autre mode de réalisation, les microorganismes comprennent une voie métabolique de biosynthèse de la phénylalanine et de la tyrosine. Notamment, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour avoir une production augmentée de phénylalanine et de tyrosine par rapport à une souche sauvage. Notamment, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour que le flux de carbone soit redirigé vers la biosynthèse de phénylalanine et de tyrosine. En outre, les microorganismes peuvent avoir été modifiées pour réduire ou supprimer les rétro-inhibitions de la biosynthèse de phénylalanine et de tyrosine. In another embodiment, the microorganisms comprise a metabolic pathway for the biosynthesis of phenylalanine and tyrosine. In particular, the microorganisms may have been modified to have an increased production of phenylalanine and tyrosine compared to a wild strain. In particular, the microorganisms may have been modified so that the carbon flow is redirected towards the biosynthesis of phenylalanine and tyrosine. In addition, the microorganisms may have been modified to reduce or eliminate feedback inhibitions of phenylalanine and tyrosine biosynthesis.
Acide nucléique recombinant et Cassette d'expression Recombinant nucleic acid and expression cassette
Chaque séquence nucléique codant pour une enzyme telle que décrite précédemment est comprise dans une cassette d'expression. De préférence, les séquences nucléiques codantes ont été optimisées pour l'expression dans le microorganisme hôte. La séquence nucléique codante est liée de manière opérationnelle aux éléments nécessaires à l’expression du gène, notamment à la transcription et traduction. Ces éléments sont choisis de sorte à être fonctionnels dans le microorganisme recombinant hôte. Ces éléments peuvent comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les méthodes pour sélectionner ces éléments en fonction de la cellule hôte dans laquelle l'expression est souhaitée, sont bien connues de l'homme du métier. Each nucleic acid sequence encoding an enzyme as described above is included in an expression cassette. Preferably, the coding nucleic sequences have been optimized for expression in the host microorganism. The coding nucleic sequence is operably linked to the elements necessary for the expression of the gene, in particular for transcription and translation. These elements are chosen so as to be functional in the host recombinant microorganism. These elements can include, for example, transcription promoters, transcription activators, terminator sequences, initiation and termination codons. The methods for selecting these elements as a function of the host cell in which expression is desired are well known to those skilled in the art.
De préférence, le promoteur est un promoteur fort. Le promoteur peut éventuellement être inductible. Preferably, the promoter is a strong promoter. The promoter can optionally be inducible.
Par exemple, si le microorganisme est procaryote, le promoteur peut être sélectionné parmi les promoteurs suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Dans un mode de réalisation particulier, le promoteur est pLac. Si le microorganisme est eucaryote et en particulier une levure, le promoteur peut être sélectionné parmi les promoteurs suivants : le promoteur pTDH3, le promoteur pTEFl, le promoteur pTEF2, le promoteur pCCW12, le promoteur pH HF2, le promoteur pHTB2 et le promoteur pRPL18B. Des exemples de promoteurs inductibles utilisables chez la levure sont les promoteurs tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1, PH05. For example, if the microorganism is prokaryotic, the promoter can be selected from the following promoters: Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, the bacteriophage T3 or T7 RNA polymerase promoters, the polyhedrin promoter, the lambda phage PR or PL promoter. In a particular embodiment, the promoter is pLac. Yes the microorganism is eukaryotic and in particular a yeast, the promoter can be selected from the following promoters: the pTDH3 promoter, the pTEF1 promoter, the pTEF2 promoter, the pCCW12 promoter, the pH HF2 promoter, the pHTB2 promoter and the pRPL18B promoter. Examples of inducible promoters which can be used in yeast are the tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1, PH05 promoters.
Toutes ou une partie des cassettes d'expression com prenant les séquences nucléiques codant pour les enzymes telles que décrites ou une combinaison de certaines de celles-ci peuvent être comprises dans un vecteur d'expression commun ou dans différents vecteurs d'expression. All or part of the expression cassettes comprising the nucleic acid sequences encoding the enzymes as described or a combination of some of these can be included in a common expression vector or in different expression vectors.
la présente invention est donc relative à un vecteur comprenant deux séquences d'acide nucléique choisies parmi une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT), une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0-rhamnosyltransferase (RhaT) et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6- désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase (RHM), de préférence un vecteur comprend ces trois séquences. the present invention therefore relates to a vector comprising two nucleic acid sequences chosen from a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT), a heterologous nucleic acid sequence encoding for a 6 ″ -0-rhamnosyltransferase (RhaT) and a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM), preferably a vector comprises these three sequences.
En particulier, la présente invention est donc relative à un vecteur comprenant deux séquences d'acide nucléique choisies parmi In particular, the present invention therefore relates to a vector comprising two nucleic acid sequences chosen from
(i) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O- bêta-D-glucosyltransférase (UGT) d’Arabidopsis thaliana, de Scutellaria baicalensis ou d’Homo sapiens, de préférence d’Arabidopsis thaliana ou de Scutellaria baicalensis, de préférence une flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; de manière particulière une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 et 97 ou parmi SEQ ID Nos : 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase; (i) a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arabidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis , preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 and 97 or from SEQ ID Nos: 113 and 95 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavanone activity 7 -O-beta-D-glucosyltransferase;
(ii) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus clementina, de préférence une 6"- O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase, et de préférence une RhaT comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0- rhamnosyltransferase; et (ii) a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably a 6 "- O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-0-rhamnosyltransferase activity, and preferably a RhaT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
(iii) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/U DP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RH M) de Citrus sinensis ou d'Arabidopsis thaliana, de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D- glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase, en particulier une RHM comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP- glucose 4,6-déshydratase/U DP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP- 4-kéto-L-rhamnose-réductase, et de préférence un RH M comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP- 4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. En particulier, le vecteur peut comprendre deux séquences d'acide nucléique choisies parmi (iii) a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / U DP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L- rhamnose reductase (RH M) from Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4 activity -keto-L-rhamnose-reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / U DP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity, and preferably an RH M comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity. In particular, the vector can comprise two nucleic acid sequences chosen from among
(i) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-0- bêta-D-glucosyltransférase (UGT) d’Arabidopsis thaliana, de Scutelloria baicalensis ou d’Homo sapiens, de préférence d'Arabidopsis thaliana ou de Scutellaria baicalensis, de préférence une flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase ; de manière particulière une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase; (i) a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-0-beta-D-glucosyltransferase (UGT) of Arabidopsis thaliana, Scutelloria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis , preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity;
(ii) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus clementina, de préférence une 6"- O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase; et (ii) a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably a 6 "- O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
(iii) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/U DP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RH M) de Citrus sinensis ou d’Arabidopsis thaliana, de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D- glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase, en particulier une RHM comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP- glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP- 4-kéto-L-rhamnose-réductase. (iii) a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / U DP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L- rhamnose reductase (RH M) from Citrus sinensis or from Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D- activity glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 107, 109 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP- glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP- 4- activity keto-L-rhamnose-reductase.
De préférence, le vecteur comprend deux séquences d'acide nucléique choisies parmi Preferably, the vector comprises two nucleic acid sequences chosen from
(i) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-0- bêta-D-glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase ; de préférence une flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase; (i) a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-0-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity sequenced with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity;
(ii) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase; et (ii) a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
(iii) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RHM) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose (iii) a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose -reductase (RHM) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP activity glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose
3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme comprend les trois. Les séquences nucléiques codantes et les séquences des enzymes sont telles que décrites ci-dessus. Par comprendre une séquence d'acide nucléique est également entendu comprendre une cassette d'expression comprenant la séquence d'acide nucléique. In a preferred embodiment, the microorganism comprises all three. The coding nucleic sequences and the sequences of the enzymes are as described above. By comprising a nucleic acid sequence is also understood to include an expression cassette comprising the nucleic acid sequence.
Facultativement, le vecteur peut comprendre en outre une ou plusieurs séquences d'acide nucléique choisies parmi : une séquence d'acide nucléique codant pour une O- méthyltran siéra se (OMT), une séquence d'acide nucléique codant pour une F3'H, une séquence d'acide nucléique codant pour une CPR, une séquence d'acide nucléique codant pour une FNS, une séquence d'acide nucléique codant pour une SAMT, une séquence d'acide nucléique codant pour une TAL, une séquence d'acide nucléique codant pour une 4CL, une séquence d'acide nucléique codant pour une CHS, une séquence d'acide nucléique codant pour une CHI, une séquence d'acide nucléique codant pour une PAL, une séquence d'acide nucléique codant pour une C4H, une séquence d'acide nucléique codant pour une HpaB, et une séquence d'acide nucléique codant pour une DAL, chacune de ces enzymes étant telles que définies ci-dessus, ainsi que leurs combinaisons. Optionally, the vector may further comprise one or more nucleic acid sequences selected from: a nucleic acid sequence encoding an O-methyltran sera (OMT), a nucleic acid sequence encoding an F3'H, a nucleic acid sequence encoding a CPR, a nucleic acid sequence encoding an FNS, a nucleic acid sequence encoding a SAMT, a nucleic acid sequence encoding a TAL, a nucleic acid sequence encoding a 4CL, a nucleic acid sequence encoding a CHS, a nucleic acid sequence encoding a CHI, a nucleic acid sequence encoding a PAL, a nucleic acid sequence encoding a C4H, a nucleic acid sequence encoding an HpaB, and a nucleic acid sequence encoding a DAL, each of these enzymes being as defined above, as well as their combinations.
De préférence, le vecteur comprend en outre une ou plusieurs séquences choisies parmi une séquence d'acide nucléique codant pour une OMT, une séquence d'acide nucléique codant pour une F3'H, une séquence d'acide nucléique codant pour une CPR, une séquence d'acide nucléique codant pour une FNS, une séquence d'acide nucléique codant pour une TAL, une séquence d'acide nucléique codant pour une 4CL, une séquence d'acide nucléique codant pour une CHS, une séquence d'acide nucléique codant pour une CHI, une séquence d'acide nucléique codant pour une PAL et une séquence d'acide nucléique codant pour une C4H. Preferably, the vector further comprises one or more sequences chosen from a nucleic acid sequence encoding an OMT, a nucleic acid sequence encoding an F3'H, a nucleic acid sequence encoding a CPR, a nucleic acid sequence encoding an FNS, a nucleic acid sequence encoding a TAL, a nucleic acid sequence encoding a 4CL, a nucleic acid sequence encoding a CHS, a nucleic acid sequence encoding for a CHI, a nucleic acid sequence encoding a PAL and a nucleic acid sequence encoding a C4H.
En particulier, le vecteur peut comprendre en outre une ou plusieurs séquences d'acide nucléique choisies parmi : In particular, the vector can also comprise one or more nucleic acid sequences chosen from:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; de préférence de Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis ou Pilosella officinarum, en particulier Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis ou Pilosella officinarum de préférence une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, en particulier une F3'H comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 5, 7, 17 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, et de préférence une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 7, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec cette séquence et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis or Pilosella officinarum, in particular Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis or Pilosella officinarum preferably an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17, 19 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavonoid 3'-monooxygenase activity , and preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7, and polypeptides comprising a sequence having at least at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) ; de préférence une CPR de Saccharomyces cerevisiae, ou de plante, par exemple de Catharanthus roseus ou d'Arabidopsis thaliona ; de préférence une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, et de préférence une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR); preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaliona; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; de préférence une OMT d’Arabidopsis thaliana ou d’Homo sapiens, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117, 119, 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O- méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 117, 119 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O- méthyltransférase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaliana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and a methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117, 119 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting O-methyltransferase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) capable de transformer la naringénine en apigénine, l'ériodictyol en lutéoline et/ou l'hespérétine en diosmétine, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline; de préférence une FNS d'Arabidopsis thaliana, Lonicera joponica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angel ica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea médusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata ou Erythranthe lewisii, en particulier d'Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes ou Zea mays, de préférence de Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, et Petroselinum crispum; de préférence une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35 et 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin into apigenin, erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin, preferably of converting erodictyol into luteolin; preferably an SNF of Arabidopsis thaliana, Lonicera joponica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminapelium, Aethusa cynica arcelica, Cuminum cyminapelium, Aethusa cynica maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea medusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii, Lagohoishoon of Arabidica japonicera, in particular Lagohoishoonica, Arabidica japonicerais, in particular truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoides or Zea mays, preferably from Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, and Petroselinum crispum; preferably an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 33, 35 and 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting flavone synthase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S- adénosylméthionine synthétase (SAMT) ; en particulier de Saccharomyces cerevisiae, par exemple une SAMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosylméthionine synthétase ; a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT); in particular of Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) capable de produire de l'acide p-coumarique à partir de la tyrosine; de préférence de Rhodotorula glutinis ou Flavobacterium johnsoniae ; en particulier une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 39 et 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; de préférence une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) capable of producing p-coumaric acid from tyrosine; preferably Rhodotorula glutinis or Flavobacterium johnsoniae; in particular a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 39 and 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity; preferably a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity ;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable de produire de le coumaryl-CoA à partir de l'acide p- coumarique et de Coenzyme A ; de préférence d’Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Petroselinum crispum ou Streptomyces clavuligerus ; une 4CL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 43, 45, 47, 49, 123 et 125 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase, de préférence, une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 123, 125 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase, et en particulier une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A; preferably Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47, 49, 123 and 125 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 4-coumarate-CoA ligase activity, and in particular a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least minus 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) capable de produire de la naringénine-chalcone à partir du 4-coumaroyl-CoA et de malonyl-CoA ; de préférence de Citrus sinensis, de Hordeum vulgare ou de Streptomyces clovuligerus, en particulier une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 51, 53, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53 et 55 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, et de préférence une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA; preferably from Citrus sinensis, from Hordeum vulgare or from Streptomyces clovuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, and preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CH I) capable de produire la naringénine à partir de la naringénine chalcone ; de préférence d’Arabidopsis thaliana ou Streptomyces clovuligerus, en particulier une CH I comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 59 et 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase, et de préférence une CHI comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I) capable of producing naringenin from naringenin chalcone; preferably Arabidopsis thaliana or Streptomyces clovuligerus, in particular a CH I comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 59 and 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity, and preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL), en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65, 77 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, de préférence une PAL comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity, preferably a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase, capables de produire de l'acide p-coumarique à partir de la phénylalanine, et de préférence une C4H comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine, and preferably a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity;
une séquence d'acide nucléique codant pour une sous-unité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (H paB), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 83 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4-hydroxyphénylacetate 3- monooxygénase oxygénase, et une séquence d'acide nucléique codant pour une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase (HpaC), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 85 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase; ou une séquence d'acide nucléique codant pour une 4-méthoxybenzoate O-déméthylase capable de convertir la tyrosine en L-Dopa et également l'acide p coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 73 et 75 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité L-tyrosine hydrolase; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une p-coumarate 3-hydroxylase capable de convertir l'acide p- coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence SEQ ID Nos : 71 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité d'une séquence avec une de ces séquences et présentant une activité p-coumarate 3 hydroxylase, et a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (H paB) subunit, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity, and a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC) subunit ), preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4- activity hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase; or a nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine into L-Dopa and also p coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 73 and 75 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting L-tyrosine hydrolase activity; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a p-coumarate 3-hydroxylase capable of converting p-coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence SEQ ID Nos: 71 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% identity of a sequence with one of these sequences and exhibiting p-coumarate 3 hydroxylase activity, and
une séquence d'acide nucléique codant pour une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL). a nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL).
En particulier, le vecteur peut comprendre en outre une ou plusieu rs séquences d'acide nucléique choisies parmi : In particular, the vector can also comprise one or more nucleic acid sequences chosen from:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; de préférence de Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Caliistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, et Pilosella officinarum, de préférence une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 et 19 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, en particulier une F3'H comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 5, 7, 17 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Caliistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, and Pilosella officinarum, preferably an F3′H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from among enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) ; de préférence une CPR de Saccharomyces cerevisiae, ou de plante, par exemple de Catharanthus roseus ou d’Arabidopsis thaliana ; de préférence une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; de préférence une OMT d’Arabidopsis thaüana ou d’Homo sapiens, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O- méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence SEQ ID NO 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O-méthyltransférase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR); preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaliana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaüana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting O-methyltransferase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) capable de transformer la naringénine en apigénine, l'ériodictyol en lutéoline et/ou l'hespérétine en diosmétine, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline; de préférence une FNS d’Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, ou Zea mays, de préférence de Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, et Petroselinum crispum; de préférence une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35 et 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin into apigenin, erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin, preferably of converting erodictyol into luteolin; preferably an SNF of Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, or Zea mays, preferably of Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, and Petroselinum crispum; preferably an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35 and 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S- adénosylméthionine synthétase (SAMT) ; en particulier de Saccharomyces cerevisiae, par exemple une SAMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosylméthionine synthétase ; a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT); in particular of Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) capable de produire de l'acide p-coumarique à partir de la tyrosine; de préférence de Rhodotorula glutinis ou Flavobacterium johnsoniae ; en particulier une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 39 et 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; de préférence une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) capable of producing p-coumaric acid from tyrosine; preferably Rhodotorula glutinis or Flavobacterium johnsoniae; in particular a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 39 and 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity; preferably a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity ;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable de produire de le coumaryl-CoA à partir de l'acide p- coumarique et de Coenzyme A ; de préférence d’Arabidopsis thaliana, Petroselinum crispum ou Streptomyces clavuligerus ; une 4CL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 43, 45, 47 et 49 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A; preferably Arabidopsis thaliana, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) capable de produire de la naringénine-chalcone à partir du 4-coumaroyl-CoA et de malonyl-CoA ; de préférence de Citrus sinensis, de Hordeum vulgare ou de Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 51, 53, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53 et 55 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA; preferably from Citrus sinensis, from Hordeum vulgare or from Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CH I) capable de produire la naringénine à partir de la naringénine chalcone ; de préférence d’Arabidopsis thaliana ou Streptomyces clavuligerus, en particulier une CH I comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 59 et 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I) capable of producing naringenin from naringenin chalcone; of preference of Arabidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus, in particular a CH I comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 59 and 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL), en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65, 77 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase, capables de produire de l'acide p-coumarique à partir de la phénylalanine ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine;
une séquence d'acide nucléique codant pour une sous-unité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (HpaB), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 83 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4-hydroxyphénylacetate 3- monooxygénase oxygénase, et une séquence d'acide nucléique codant pour une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase (HpaC), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 85 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase; ou une séquence d'acide nucléique codant pour une 4-méthoxybenzoate O-déméthylase capable de convertir la tyrosine en L-Dopa et également l'acide p coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 73 et 75 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité L-tyrosine hydrolase; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une p-coumarate 3-hydroxylase capable de convertir l'acide p- coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence SEQ ID Nos : 71 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité d'une séquence avec une de ces séquences et présentant une activité p-coumarate 3 hydroxylase, et a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity, and a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC) subunit , preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate activity 3-monooxygenase reductase; or a nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine into L-Dopa and also p coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 73 and 75 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a L-tyrosine hydrolase activity; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a p-coumarate 3-hydroxylase capable of converting p-coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence SEQ ID Nos: 71 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% identity of a sequence with one of these sequences and exhibiting p-coumarate 3 hydroxylase activity, and
une séquence d'acide nucléique codant pour une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL). a nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL).
De préférence, le vecteur peut comprendre en outre une ou plusieu rs séquences d'acide nucléique choisies parmi : Preferably, the vector can also comprise one or more nucleic acid sequences chosen from:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7, 11, 17, et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7, 17 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, et de manière tout particulièrement préférée une F3'H comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO: 7 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 11, 17, and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 3'-monooxygenase flavonoid activity, and very particularly preferably an F3'H comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavonoid 3'-monooxygenase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, et de manière tout particulièrement préférée, parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and very particularly preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117 et 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O- méthyitransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O-méthyltransférase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 'and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyitransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting flavone synthase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S- adénosylméthionine synthétase (SAMT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosylméthionine synthétase ; a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) capable de produire de l'acide p-coumarique à partir de la tyrosine et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable de produire de le coumaryl-CoA à partir de l'acide p- coumarique et de Coenzyme A et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 123, 125 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase, de préférencecomprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) capable of producing p-coumaric acid from tyrosine and comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and from Coenzyme A and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, preferably comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) capable de produire de la naringénine-chalcone à partir du 4-coumaroyl-CoA et de malonyl-CoA et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA and comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CH I) capable de produire la naringénine à partir de la naringénine chalcone et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 65 et 77 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I) capable of producing naringenin from naringenin chalcone and comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 65 and 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, preferably comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase, capables de produire de l'acide p-coumarique à partir de la phénylalanine. a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine.
Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une O-méthyltransférase, en particulier capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H), en particulier capable d'ajouter un hydroxyle en position 3' de la naringénine et/ou de l'apigénine ; ou In a particular embodiment, the vector comprises a nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase, in particular capable of methylating erodictyol and / or luteolin in position 4 'and a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H ), in particular capable of adding a hydroxyl at the 3 'position of naringenin and / or apigenin; or
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl- transférase (OMT), en particulier capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H), en particulier capable d'ajouter un hydroxyle en position 3' de la naringénine et/ou de l'apigénine ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase ; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl- transférase (OMT), en particulier capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS), capable de transformer la naringénine en apigénine, l'ériodictyol en lutéoline et/ou l'hespérétine en diosmétine, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline; ou a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT), in particular capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H), in particular capable of adding a hydroxyl at the 3 'position of naringenin and / or apigenin; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase; or a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT), in particular capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS), capable of converting naringenin into apigenin, erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin, preferably of converting eriodictyol into luteolin; or
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour flavone synthase (FNS) capable de transformer la naringénine en apigénine, l'ériodictyol en lutéoline et/ou l'hespérétine en diosmétine, de préférence de transformer l'ériotdictyol en lutéoline. a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of hydroxylating in the 3 'position naringenin and / or apigenin; a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase; and a heterologous nucleic acid sequence encoding flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin to apigenin, erodictyol to luteolin and / or hesperetin to diosmetin, preferably of converting eriotdictyol to luteolin.
Le vecteur peut ainsi comprendre plusieurs séquences d'acide nucléique choisies parmi celles-ci, notamment 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 séquences d'acide nucléique choisies parmi celles-ci. The vector can thus comprise several nucleic acid sequences chosen from among them, in particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleic acid sequences chosen from among them.
Le vecteur peut notamment comprendre des combinaisons de séquences codantes particulières telles que décrites ci-dessus. Les vecteurs comprennent des séquences codantes hétérologues dans la mesure où les séquences codantes peuvent être optimisées pour le microorganisme hôte, être sous le contrôle de promoteur hétérologue et/ou peuvent combiner des séquences codantes qui ne proviennent pas du même organisme d'origine et/ou qui ne sont pas présentes dans le même arrangement. The vector can in particular comprise combinations of particular coding sequences as described above. The vectors comprise heterologous coding sequences as long as the coding sequences can be optimized for the host microorganism, be under the control of a heterologous promoter and / or can combine coding sequences which are not from the same organism of origin and / or which are not present in the same arrangement.
Le vecteur peut être toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des acides nucléiques étrangers, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans le microorganisme hôte. Le vecteur peut être par exemple un plasmide, un phagemide, un cosmide, un chromosome artificiel, notamment un YAC, ou un BAC. The vector can be any DNA sequence into which it is possible to insert foreign nucleic acids, the vectors allowing the introduction of foreign DNA into the host microorganism. The vector can be for example a plasmid, a phagemid, a cosmid, an artificial chromosome, in particular a YAC, or a BAC.
Les vecteurs d'expression peuvent comprendre des séquences nucléiques codant pour des marqueurs de sélection. Les marqueurs de sélection peuvent être des gènes de résistance à un ou plusieurs antibiotiques ou des gènes d'auxotrophie. Le gène d'auxotrophie peut par exemple être URA3, LEU2, HIS3 ou TRP1. Le gène de résistance aux antibiotiques peut par exemple être de préférence un gène de résistance à l'ampicilline, à la kanamycine, à l'hygromycine, à la généticine et/ou la nourséothricine. Expression vectors can include nucleic acid sequences encoding selection markers. The selection markers can be genes for resistance to one or more antibiotics or genes for auxotrophy. The auxotrophy gene can for example be URA3, LEU2, HIS3 or TRP1. The antibiotic resistance gene may for example preferably be a resistance gene to ampicillin, kanamycin, hygromycin, geneticin and / or nureseothricin.
L’introduction de vecteurs dans un microorganisme hôte est un procédé largement connu de l’homme du métier. Plusieurs méthodes sont notamment décrites dans « Current Protocols in Molecular Biology », 13.7.1-13.7.10; ou encore dans Ellis T. et al., Intégrative Biology, 2011, 3(2), 109- 118. The introduction of vectors into a host microorganism is a method widely known to those skilled in the art. Several methods are described in particular in “Current Protocols in Molecular Biology”, 13.7.1-13.7.10; or in Ellis T. et al., Integrative Biology, 2011, 3 (2), 109-118.
Le microorganisme hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et l'acide nucléique, la cassette ou le vecteur peut être contenu dans celui-ci sous forme d'épisome ou sous forme intégré dans le génome du microorganisme hôte. The host microorganism may be transiently or stably transformed / transfected and the nucleic acid, cassette or vector may be contained therein as an episome or as integrated into the genome of the host microorganism.
Le vecteur d'expression peut également comprendre une ou plusieurs séquences permettant l'insertion ciblée du vecteur, de la cassette d'expression ou de l'acide nucléique dans le génome du microorganisme hôte. The expression vector can also comprise one or more sequences allowing the targeted insertion of the vector, of the expression cassette or of the nucleic acid into the genome of the host microorganism.
Toutes ou une partie des cassettes d'expression comprenant les séquences nucléiques codant pour les enzymes telles que décrites ci-dessus ou une combinaison de certaines de celles-ci peuvent être insérées dans le/un chromosome du microorganisme recombinant. A contrario, toutes ou une partie des cassettes d'expression comprenant les séquences nucléiques codant pour les enzymes telles que décrites ou une combinaison de certaines de celles-ci peuvent être conservées sous forme épisomale, notamment sous forme de plasmide. Éventuellement, le microorganisme peut comprendre plusieurs copies de séquences nucléiques codant pour une enzyme telle que décrite précédemment. Notamment, il peut comprendre 2 à 10 copies, par exemple 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 copies d'une séquence nucléique codant pour une enzyme telle que décrite précédemment. All or part of the expression cassettes comprising the nucleic acid sequences encoding the enzymes as described above or a combination of some of these can be inserted into the / a chromosome of the recombinant microorganism. Conversely, all or part of the expression cassettes comprising the nucleic acid sequences encoding the enzymes as described or a combination of some of these can be preserved in episomal form, in particular in the form of a plasmid. Optionally, the microorganism can comprise several copies of nucleic acid sequences encoding an enzyme as described above. In particular, it can comprise 2 to 10 copies, for example 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 copies of a nucleic acid sequence encoding an enzyme as described above.
La présente invention est relative à une méthode de préparation d'un microorganisme selon la présente invention comprenant l'introduction de séquences d'acide nucléique codant pour une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT), en particulier capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et la diosmétine ; pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT), en particulier capable de transférer un rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O-glucoside; et pour une UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP- 4-kéto-L-rhamnose-réductase (RHM), en particulier capable de produire de l'UDP- rhamnose dans le microorganisme et la sélection des microorganismes comprenant lesdites séquences nucléiques. The present invention relates to a method for preparing a microorganism according to the present invention comprising the introduction of nucleic acid sequences encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT), in particular capable of add glucose in position 7 of hesperetin and diosmetin; for a 6 "-O-rhamnosyltransferase (RhaT), in particular capable of transferring a rhamnose to the 6-position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside; and for a UDP -glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP- 4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM), in particular capable of producing UDP-rhamnose in the microorganism and the selection of microorganisms comprising said nucleic acid sequences.
La méthode peut comprendre en outre l'introduction une ou plusieurs séquences d'acide nucléique choisies parmi : The method can further comprise the introduction of one or more nucleic acid sequences chosen from:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine ; de préférence de Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis ou Pilosella officinarum, en particulier Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis ou Pilosella officinarum, de préférence une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'- monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 et 19 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavonoïde 3'- monooxygénase, en particulier une F3'H comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 5, 7 , 17 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 7 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) capable of hydroxylating in the 3 ′ position naringenin and / or apigenin; preferably Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis or Pilosella officinarum, in particular Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Callistephus chinensis, Gerbera hybrida, Citrus sinensis or Pilosella officinarum, preferably an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19 and 21 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity, preferably selected from among enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 11, 17 and 19 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavonoid 3'-monooxygenase activity, in particular an F3'H comprising a selected sequence from SEQ ID NOs: 5, 7, 17 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably an F3'H comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7 and exhibiting 3'-monooxygenase flavonoid activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) ; de préférence une CPR de Saccharomyces cerevisiae, ou de plante, par exemple de Catharonthus roseus ou d'Arabidopsis thaliono ; de préférence une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, en particulier une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR); preferably a CPR of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharonthus roseus or of Arabidopsis thaliono; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, in particular a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; de préférence une OMT d’Arabidopsis thaliana ou d’Homo sapiens, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O- méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence sélectionnée parmi l'enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O-méthyltransférase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) capable de transformer la naringénine en apigénine, l'ériodictyol en lutéoline et/ou l'hespérétine en diosmétine, de préférence de transformer l'ériodictyol en lutéoline; de préférence une FNS d’Arobidopsis thaüana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryzo sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, Zea moys, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicogo truncatula, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angel ica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea médusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata ou Erythranthe lewisii, en particulier d'Arabidopsis thaliana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes ou Zea mays, de préférence de Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, et Petroselinum crispum; de préférence une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35 et 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably an OMT from Arabidopsis thaliana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in position 4 ', preferably selected from the enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting O-methyltransferase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) capable of converting naringenin into apigenin, erodictyol into luteolin and / or hesperetin into diosmetin, preferably of converting erodictyol into luteolin; preferably an SNSF of Arobidopsis thaüana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryzo sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, Zea moys, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicogo truncatula, Cuminum cyminapelium, Aethusa euscynica maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus var scolymus, Saussurea medusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perilla frutescens var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii, Lagohoishoon of Arabidica japonicera, in particular Lagohoishoonica, Arabidica japonicerais, in particular truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoides or Zea mays, preferably from Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, and Petroselinum crispum; preferably an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 33, 35 and 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity ;
une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une S- adénosyl méthionine synthétase (SAMT) ; en particulier de Saccharomyces cerevisiae, par exemple une SAMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosyl méthionine synthétase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) capable de produire de l'acide p-coumarique à partir de la tyrosine; de préférence de Rhodotorula glutinis ou Flavobacterium johnsoniae ; en particulier une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 39 et 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; de préférence une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding an S-adenosyl methionine synthetase (SAMT); in particular of Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting S-adenosyl methionine synthetase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) capable of producing p-coumaric acid from tyrosine; preferably Rhodotorula glutinis or Flavobacterium johnsoniae; in particular a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 39 and 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity; preferably a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity ;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable de produire de le coumaryl-CoA à partir de l'acide p- coumarique et de Coenzyme A ; de préférence d’Arahidopsis thaliana, Petroselinum crispum ou Streptomyces clavuligerus ; une 4CL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 43, 45, 47 et 49 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase, et de préférence une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarate-CoA ligase (4CL) capable of producing coumaryl-CoA from p-coumaric acid and Coenzyme A; preferably Arahidopsis thaliana, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, and preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity sequenced with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) capable de produire de la naringénine-chalcone à partir du 4-coumaroyl-CoA et de malonyl-CoA ; de préférence de Citrus sinensis, de Hordeum vulgare ou de Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 51, 53, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53 et 55 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, et de manière plus particulièrement préférée une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité chalcone synthase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI) capable de produire la naringénine à partir de la naringénine chalcone ; de préférence d’Arobidopsis thaliana ou Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHI comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 59 et 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase, et de préférence une CHI comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) capable of producing naringenin-chalcone from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA; preferably from Citrus sinensis, from Hordeum vulgare or from Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53 and 55 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, and more particularly preferably a CHS comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequences and exhibiting chalcone synthase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI) capable of producing naringenin from naringenin chalcone; preferably Arobidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus, in particular a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 59 and 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity, and preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity;
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL), en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65, 77 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65, 77 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70 , 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase, capables de produire de l'acide p-coumarique à partir de la phénylalanine, en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase ; une séquence d'acide nucléique codant pour une sous-unité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase oxygénase (HpaB), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 83 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4-hydroxyphénylacetate 3- monooxygénase oxygénase, et une séquence d'acide nucléique codant pour une sous-unité 4-hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase (HpaC), de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 85 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec celle-ci et présentant une activité 4- hydroxyphénylacetate 3-monooxygénase réductase; ou une séquence d'acide nucléique codant pour une 4-méthoxybenzoate O-déméthylase capable de convertir la tyrosine en L-Dopa et également l'acide p coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 73 et 75 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité L-tyrosine hydrolase; ou une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une p-coumarate 3-hydroxylase capable de convertir l'acide p- coumarique en acide caféique, de préférence comprenant une séquence SEQ ID Nos : 71 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité d'une séquence avec une de ces séquences et présentant une activité P-coumarate 3 hydroxylase, et a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity, capable of producing p-coumaric acid from phenylalanine, in particular a C4H comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase (HpaB) subunit, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 83 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase activity, and a nucleic acid sequence encoding a 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase reductase (HpaC) subunit , preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 85 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity therewith and exhibiting 4-hydroxyphenylacetate activity 3-monooxygenase reductase; or a nucleic acid sequence encoding a 4-methoxybenzoate O-demethylase capable of converting tyrosine into L-Dopa and also p coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 73 and 75 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting L-tyrosine hydrolase activity; or a heterologous nucleic acid sequence encoding a p-coumarate 3-hydroxylase capable of converting p-coumaric acid into caffeic acid, preferably comprising a sequence SEQ ID Nos: 71 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% identity of a sequence with one of these sequences and exhibiting P-coumarate 3 hydroxylase activity, and
une séquence d'acide nucléique codant pour une dihydroxyphénylalanine ammonia-lyase (DAL). a nucleic acid sequence encoding a dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase (DAL).
Selon un mode de réalisation préféré, la méthode comprend l'introduction : According to a preferred embodiment, the method comprises the introduction:
(i) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-O-bêta- D-glucosyltransférase (UGT) d’Arahidopsis thaliana, de Scutellaria baicalensis ou d’Homo sapiens, de préférence d’Arabidopsis thaliana ou de Scutellaria baicalensis, de préférence une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; de manière particulière une flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase; (i) a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) from Arahidopsis thaliana, Scutellaria baicalensis or Homo sapiens, preferably Arabidopsis thaliana or Scutellaria baicalensis , preferably a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; in particular a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity;
(ii) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus clementina, de préférence une RhaT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase, en particulier une 6"-0-rhamnosyltransferase (RhaT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase; et (ii) a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) of the genus Citrus or of Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more preferably Citrus sinensis or Citrus clementina, preferably an RhaT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-0-rhamnosyltransferase activity, in particular a 6" -0-rhamnosyltransferase (RhaT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
(iii) une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase (RH M) de Citrus sinensis ou d'Arabidopsis thaliana, de préférence une RHM comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase, en particulier une RHM comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L- rhamnose-réductase ; (iii) a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose -reductase (RH M) of Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana, preferably an RHM comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4- activity keto-L-rhamnose reductase, in particular an RHM comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequenced and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity;
et d'au moins une séquence d'acide nucléique choisie parmi : - d'une séquence d'acide nucléique hétérologue coda nt pour une O- méthyltransférase (OMT) capable de méthyler l'ériodictyol et/ou la lutéoline en position 4' ; de préférence, une OMT de Citrus clementina, Citrus sinensis, d’Arabidopsis thaüana ou d’Homo sapiens, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117, 119, 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O-méthyltransférase, notamment avec l'ériodictyol et/ou la lutéoline comme substrat et une méthylation en position 4', de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 117 et 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité O-méthyltransférase, et manière tout particulièrement préférée une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité O- méthyltransférase; and at least one nucleic acid sequence chosen from: - a heterologous nucleic acid sequence coding for an O-methyltransferase (OMT) capable of methylating erodictyol and / or luteolin in the 4 'position; preferably, an OMT from Citrus clementina, Citrus sinensis, Arabidopsis thaüana or Homo sapiens, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117, 119, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, in particular with erodictyol and / or luteolin as substrate and methylation in the 4 'position , preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting an O-methyltransferase activity, and very particularly preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and showing activity O-methyltransferase;
- d'une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) capable d'hydroxyler en position 3' la naringénine et/ou l'apigénine et comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 11, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 7, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase, et de manière tout particulièrement préférée une enzyme comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 7, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90% ou au moins 95% d'identité avec cette séquence et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) capable of hydroxylating naringenin and / or apigenin in position 3 'and comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 11, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85 %, at least 90% or at least 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, and very particularly preferably an enzyme comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 7, and polypeptides comprising a sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or a u at least 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes com prenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, en particulier une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides com prenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) and comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95 % sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, in particular a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, en particulier une flavone synthase (FNS) et comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 , 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, in particular a flavone synthase (FNS) and comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 33, 35, 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity; and
- une séquence d'acide nucléique codant pour une S-adénosylméthionine synthétase (SAMT) ; en particulier de Saccharomyces cerevisiae, par exemple une SAMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 81 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité S-adénosylméthionine synthétase, et - a nucleic acid sequence encoding an S-adenosylmethionine synthetase (SAMT); in particular of Saccharomyces cerevisiae, for example a SAMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 81 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting S-adenosylmethionine synthetase activity, and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) de Rhodotorula glutinis ou Flavobacterium johnsoniae ; en particulier une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 41 et 39 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; de préférence une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) from Rhodotorula glutinis or Flavobacterium johnsoniae; in particular a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 41 and 39 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity; preferably a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) d’Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Petroselinum crispum ou Streptomyces clavuligerus ; en particulier, une 4CL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 123, 125, 45, 43, 47 et 49 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; de préférence une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 123, 125 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; de manière tout particulièrement préférée une 4CL comprenant u ne séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase, et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) from Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; in particular, a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 123, 125, 45, 43, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequenced with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; very particularly preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) de Citrus sinensis, de Hordeum vulgare ou de Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53, 51, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, de préférence une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) of Citrus sinensis, of Hordeum vulgare or of Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53, 51, 55 and 57 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI) d’Arabidopsis thaliana ou Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHI comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 61 et 59 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase ; de préférence une CHI comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase . De préférence, la méthode comprend l'introduction de toutes ces séquences. - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI) of Arabidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus, in particular a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 61 and 59 and polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity; preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity . Preferably, the method comprises the introduction of all of these sequences.
De préférence, la méthode comprend en outre l'introduction : Preferably, the method further comprises introducing:
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL), en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65 et 77, de préférence SEQ ID NO : 65 et 77, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, et de manière plus particulièrement préférée une phénylalanine ammonia lyase (PAL) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65 and 77, preferably SEQ ID NOs: 65 and 77, and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, and more particularly preferably a phenylalanine ammonia lyase (PAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4-hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase ; et de manière tout particulièrement préférée une cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase. - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; and very particularly preferably a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
De préférence, la méthode comprend l'introduction de combinaisons de séquences codantes particulières telles que décrites ci-dessus. Preferably, the method comprises the introduction of combinations of particular coding sequences as described above.
Production de la diosmine et/ou de l'hespéridine Production of diosmin and / or hesperidin
La présente invention est relative à l'utilisation d'un microorganisme selon la présente invention pour la production de la diosmine et/ou de l'hespéridine. Dans un premier mode de réalisation préféré, elle est relative à l'utilisation d'un microorganisme selon la présente invention pour la production de la diosmine. Dans un deuxième mode de réalisation préféré, elle est relative à l'utilisation d'un microorganisme selon la présente invention pour la production de l'hespéridine. Dans un mode de réalisation préféré, elle est relative à l'utilisation d'un microorganisme selon la présente invention pour la production de la diosmine et de l'hespéridine. The present invention relates to the use of a microorganism according to the present invention for the production of diosmin and / or hesperidin. In a first preferred embodiment, it relates to the use of a microorganism according to the present invention for the production of diosmin. In a second preferred embodiment, it relates to the use of a microorganism according to the present invention for the production of hesperidin. In a preferred embodiment, it relates to the use of a microorganism according to the present invention for the production of diosmin and hesperidin.
La présente invention est également relative à une méthode de production de la diosmine et/ou de l'hespéridine comprenant la mise en culture d'un microorganisme selon la présente invention, notamment dans des conditions permettant ou favorables à la production de la diosmine et/ou de l'hespéridine et facultativement la récupération et/ou purification de la diosmine et/ou de l'hespéridine produite. The present invention also relates to a method of producing diosmin and / or hesperidin comprising the cultivation of a microorganism according to the present invention, in particular under conditions allowing or favorable to the production of diosmin and / or hesperidin and optionally the recovery and / or purification of the diosmin and / or hesperidin produced.
Les conditions de culture du microorganisme selon l’invention peuvent être adaptées selon les techniques classiques, bien connues de l’homme du métier. The conditions for culturing the microorganism according to the invention can be adapted according to conventional techniques, well known to those skilled in the art.
Le microorganisme est cultivé dans un milieu de culture approprié. Le terme « milieu de culture approprié » désigne d'une manière générale un milieu de culture apportant les nutriments essentiels ou bénéfiques à la maintenance et/ou à la croissance dudit microorganisme, tels que les sources carbonées ; les sources azotées telles que le sulfate d'ammonium ; les sources de phosphores, par exemple, le potassium phosphate monobasique ; les oligo-éléments, par exemple, les sels de cuivre, d'iodure, de fer, de magnésium, de zinc ou de molybdate ; les vitamines et autres facteurs de croissance tels que des acides aminés ou autres promoteurs de croissance. U n antimousse peut être ajouté selon les besoins. Selon l'invention, ce milieu de culture approprié peut être chimiquement défini ou complexe. Le milieu de culture peut ainsi être de composition identique ou similaire à un milieu synthétique, tel que défini par Verduyn et al., (Yeast. 1992. 8:501-17), adapté par Visser et al., (Biotechnology and bioengineering. 2002. 79:674-81), ou commercialement disponible tel que le milieu YN B (Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals ou Sigma-Aldrich). Notamment, le milieu de culture peut comprendre une source de carbone simple, tel le glucose, le fructose, le xylose, l'éthanol, le glycérol, le galactose, le saccharose, la cellulose, la cellobiose, l'amidon, les polymères de glucose, les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres. The microorganism is cultivated in an appropriate culture medium. The term “suitable culture medium” generally designates a culture medium providing nutrients which are essential or beneficial for the maintenance and / or growth of said microorganism, such as carbon sources; nitrogenous sources such as ammonium sulfate; sources of phosphorus, for example, potassium phosphate monobasic; trace elements, for example copper, iodide, iron, magnesium, zinc or molybdate salts; vitamins and other growth factors such as amino acids or other growth promoters. A defoamer can be added as needed. According to the invention, this suitable culture medium can be chemically defined or complex. The culture medium can thus be of identical or similar composition to a synthetic medium, as defined by Verduyn et al., (Yeast. 1992. 8: 501-17), adapted by Visser et al., (Biotechnology and bioengineering. 2002. 79: 674-81), or commercially available such as YN B medium (Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals or Sigma-Aldrich). In particular, the culture medium can comprise a simple carbon source, such as glucose, fructose, xylose, ethanol, glycerol, galactose, sucrose, cellulose, cellobiose, starch, polymers of glucose, molasses, or byproducts of these sugars.
De préférence, la production de diosmine et/ou d'hespéridine par le microorganisme selon l'invention est obtenue sans apport de naringénine, d'apigénine, d'ériodictyol, de lutéoline, d'hespérétine et/ou de diosmétine dans le milieu de culture, de préférence sans apport de naringénine, de d'apigénine, d'ériodictyol, de lutéoline, d'hespérétine et de diosmétine dans le milieu de culture. Preferably, the production of diosmin and / or hesperidin by the microorganism according to the invention is obtained without supplying naringenin, apigenin, erodictyol, luteolin, hesperetin and / or diosmetin in the medium of culture, preferably without addition of naringenin, apigenin, erodictyol, luteolin, hesperetin and diosmetin in the culture medium.
Selon l'invention, tout mode de culture permettant la production à l'échelle industrielle de molécules d'intérêt peut être envisagé. Avantageusement, la culture se fait en bioréacteurs, notamment en mode batch, fed-batch, chemostat et/ou culture continue. Une alimentation contrôlée en vitamines au cours du procédé peut également être bénéfique à la productivité (Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2002. 60:67-72). La culture est généralement conduite en bioréacteurs, avec de possibles étapes de précultures solides et/ou liquides en Erlenmeyers, avec un milieu de culture approprié. D'une manière générale, les conditions de culture des microorganismes selon l'invention sont aisément adaptables par l'homme du métier, en fonction du microorganisme. Par exemple, la température de culture est notamment comprise pour les levures entre 20°C et 40°C, de préférence entre 28°C et 35°C, et plus particulièrement d'environ 30°C pour 5 cerevisiae. According to the invention, any mode of culture allowing the production on an industrial scale of molecules of interest can be envisaged. Advantageously, the culture is carried out in bioreactors, in particular in batch, fed-batch, chemostat and / or continuous culture mode. Controlled vitamin supply during the process may also benefit productivity (Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2002. 60: 67-72). The culture is generally carried out in bioreactors, with possible steps of solid and / or liquid precultures in Erlenmeyer flasks, with an appropriate culture medium. In general, the culture conditions of the microorganisms according to the invention are easily adaptable by a person skilled in the art, depending on the microorganism. For example, the culture temperature is in particular for yeasts between 20 ° C and 40 ° C, preferably between 28 ° C and 35 ° C, and more particularly around 30 ° C for cerevisiae.
Le microorganisme selon la présente invention peut être cultivé pendant 1 à 30 jours, et de préférence de 1 à 10 jours. The microorganism according to the present invention can be cultured for 1 to 30 days, and preferably 1 to 10 days.
Un microorganisme selon la présente invention est capable de produire de la diosmine et/ou de l'hespéridine en une quantité minimale de 1 mg/l de milieu de culture, de préférence de 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mg/l de milieu de culture, éventuellement de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg/l de milieu de culture. A microorganism according to the present invention is capable of producing diosmin and / or hesperidin in a minimum amount of 1 mg / l of culture medium, preferably 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 , 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mg / l of culture medium, optionally 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 mg / l of culture medium.
DESCRIPTION DES FIGURES DESCRIPTION OF FIGURES
Figure 1 : Description des voies métaboliques de production d'hespéridine et de la diosmine. Figure 1: Description of the metabolic pathways of hesperidin and diosmin production.
Figure 2 : Production d'ériodictyol à partir de naringénine par la souche FL_405 (F3'H4 + CPR2). Souche témoin : CF235. Observation de la disparition du pic de naringénine et apparition d'un pic d'ériodictyol dans la souche FL-405. Figure 2: Production of erodictyol from naringenin by the strain FL_405 (F3'H4 + CPR2). Control strain: CF235. Observation of the disappearance of the naringenin peak and the appearance of an erodictyol peak in the FL-405 strain.
Figure 3 : Production de lutéoline à partir d'apigénine par la souche FL_405 (F3'H4 + CPR2). Souche témoin : CF235. Observation de la disparition du pic d'apigénine et apparition d'un pic de lutéoline dans la souche FL-405. Figure 3: Production of luteolin from apigenin by the strain FL_405 (F3′H4 + CPR2). Control strain: CF235. Observation of the disappearance of the apigenin peak and appearance of a luteolin peak in strain FL-405.
Figure 4 : Production d'Apigénine à partir de naringénine par la souche SC744 (FNSII1 + CPR2). Souche témoin : CF234. Observation de la disparition du pic de naringénine et apparition d'un pic d'apigénine dans la souche. Figure 4: Production of Apigenin from naringenin by strain SC744 (FNSII1 + CPR2). Control strain: CF234. Observation of the disappearance of the naringenin peak and appearance of an apigenin peak in the strain.
Figure 5 : Production de lutéoline à partir d'ériodictyol SC744 (FNSII1 + CPR2). Souche témoin : CF234. Observation de la disparition du pic d'ériodictyol et apparition d'un pic de lutéoline dans la souche. Figure 6 : Production d'ériodictyol et de lutéoline par la souche SC1500. Souche témoin : CF237. Observation des pics d'ériodictyol et de lutéoline. Figure 5: Production of luteolin from erodictyol SC744 (FNSII1 + CPR2). Control strain: CF234. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a luteolin peak in the strain. Figure 6: Production of erodictyol and luteolin by strain SC1500. Control strain: CF237. Observation of erodictyol and luteolin peaks.
Figure 7 : Production d'hespérétine à partir d'ériodictyol par les souches SC 1612 (MET + SAM) et SC 1614 (MET + SAM). Souche témoin : CF235. Observation de la disparition du pic d'ériodictyol et apparition d'un pic d'hespérétine dans les souches. Figure 7: Production of hesperetin from erodictyol by strains SC 1612 (MET + SAM) and SC 1614 (MET + SAM). Control strain: CF235. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a hesperetin peak in the strains.
Figure 8 : Production de diosmétine à partir de lutéoline par la souche SC 1612 (MET + SAM) et SC 1614 (MET + SAM). Souche témoin : CF235. Observation de la disparition du pic de lutéoline et apparition d'un pic de diosmétine dans les souches. Figure 8: Production of diosmetin from luteolin by strain SC 1612 (MET + SAM) and SC 1614 (MET + SAM). Control strain: CF235. Observation of the disappearance of the luteolin peak and appearance of a diosmetin peak in the strains.
Figure 9 : Production de diosmétine à partir d'hespérétine par la souche SC744 (FNSII + CPR). Souche témoin : CF234. Observation de la disparition du pic d'hespérétine et apparition d'un pic de diosmétine dans la souche. Figure 9: Production of diosmetin from hesperetin by strain SC744 (FNSII + CPR). Control strain: CF234. Observation of the disappearance of the hesperetin peak and appearance of a diosmetin peak in the strain.
Figure 10 : Production de d'hespérétine à partir d'ériodictyol par E. coli EC26 (MET + SAM). Souche témoin : E. coli MH1. Observation de la disparition du pic d'ériodictyol et apparition d'un pic d'hespérétine dans la souche. Figure 10: Production of hesperetin from erodictyol by E. coli EC26 (MET + SAM). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a hesperetin peak in the strain.
Figure 11 : Production de diosmétine à partir de lutéoline par E. coli EC26 (MET + SAM). Souche témoin : E. coli MH1. Observation de la disparition du pic de lutéoline et apparition d'un pic de diosmétine dans la souche. Figure 11: Production of diosmetin from luteolin by E. coli EC26 (MET + SAM). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the luteolin peak and appearance of a diosmetin peak in the strain.
Figure 12 : Production de diosmétine à partir d'hespérétine par E. coli EC30 (FNSII). Souche témoin : E. coli MH1. Observation de la disparition du pic d'hespérétine et apparition d'un pic de diosmétine dans la souche. Figure 12: Production of diosmetin from hesperetin by E. coli EC30 (FNSII). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the hesperetin peak and appearance of a diosmetin peak in the strain.
Figure 13 : Production d'hespérétine et de diosmétine par la souche SC1508. Souche témoin : CF237. Observation des pics d'hespérétine de de diosmétine. Figure 13: Production of hesperetin and diosmetin by strain SC1508. Control strain: CF237. Observation of hesperetin peaks in diosmetin.
Figure 14 : Production d'hespéridine à partir d'hespérétine par la souche FL 547 (GT + RHM + RHAT). Souche témoin : CF 233. Observation de la disparition du pic d'héspérétine et apparition du pic d'hespéridine. Figure 14: Production of hesperidin from hesperetin by strain FL 547 (GT + RHM + RHAT). Control strain: CF 233. Observation of the disappearance of the hesperetin peak and appearance of the hesperidin peak.
Figure 15 : Production de diosmine à partir de diosmétine par la souche FL 547 (GT + RHM + RHAT). Souche témoin : CF 233. Observation de la disparition du pic de disométine et apparition du pic de diosmine. Figure 15: Production of diosmin from diosmetin by strain FL 547 (GT + RHM + RHAT). Control strain: CF 233. Observation of the disappearance of the disometin peak and appearance of the diosmin peak.
Figure 16 : Production d'hespérédine à partir d'hespérétine par E. coli EC38, EC45 et EC47 (GT + RHM + RHAT). Souche témoin : E. coli MH1. Observation de la disparition du pic d'héspérétine et apparition du pic d'hespéridine. Figure 17 : Production de diosmine à partir de diosmétine par E. coli EC38, EC45 et EC47 (GT + RH M + RHAT). Souche témoin : E. coli MH1. Observation de la disparition du pic de diosmétine et apparition du pic de diosmine. Figure 16: Production of hesperedin from hesperetin by E. coli EC38, EC45 and EC47 (GT + RHM + RHAT). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the hesperetin peak and appearance of the hesperidin peak. Figure 17: Production of diosmin from diosmetin by E. coli EC38, EC45 and EC47 (GT + RH M + RHAT). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the diosmetin peak and appearance of the diosmin peak.
Figure 18 : Production d'hespéridine et de diosmine par les souches SC1509, SC1530, SC1529, SC1568 et SC2410. Souche témoin : CF237. Observation des pics d'hespéridine et de diosmine. Figure 18: Production of hesperidin and diosmin by strains SC1509, SC1530, SC1529, SC1568 and SC2410. Control strain: CF237. Observation of hesperidin and diosmin peaks.
Figure 19 : Production d'ériodictyol et de lutéoline par les souches SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC2428 et SC1500. Souche témoin: CF237. Figure 19: Production of erodictyol and luteolin by strains SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC2428 and SC1500. Control strain: CF237.
Figure 20 : Production d'hespérétine et d'homoériodictyol par les souches SC2147, SC2151, SC1612 et SC1614. Souche témoin: CF235. Figure 20: Production of hesperetin and homoeriodictyol by strains SC2147, SC2151, SC1612 and SC1614. Control strain: CF235.
Figure 21 : Production de diosmétine et de chrysoériol par les souches SC2147, SC2151, SC1612 et SC1614. Souche témoin: CF235. Figure 21: Production of diosmetin and chrysoeriol by strains SC2147, SC2151, SC1612 and SC1614. Control strain: CF235.
Figure 22 : Production de d'hespérétine à partir d'ériodictyol par E. coli EC41 (M ET + SAM). Souche témoin : E. coli MH1. Observation de la disparition du pic d'ériodictyol et apparition d'un pic d'hespérétine dans la souche. Figure 22: Production of hesperetin from erodictyol by E. coli EC41 (M ET + SAM). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a hesperetin peak in the strain.
Figure 23 : Production de d'hespérétine à partir d'ériodictyol par E. coli EC43 (M ET + SAM). Souche témoin : E. coli MH1. Observation de la disparition du pic d'ériodictyol et apparition d'un pic d'hespérétine dans la souche. Figure 23: Production of hesperetin from erodictyol by E. coli EC43 (M ET + SAM). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the erodictyol peak and appearance of a hesperetin peak in the strain.
Figure 24 : Production de diosmétine à partir de lutéoline par E. coli EC43 (MET + SAM). Souche témoin : E. coli MH1. Observation de la disparition du pic de lutéoline et apparition d'un pic de diosmétine dans la souche. Figure 24: Production of diosmetin from luteolin by E. coli EC43 (MET + SAM). Control strain: E. coli MH1. Observation of the disappearance of the luteolin peak and appearance of a diosmetin peak in the strain.
Figure 25 : Production d'hespérétine et de diosmétine par la souche SC2408. Souche témoin: CF237. Observation des pics d'hespérétine de de diosmétine. Figure 25: Production of hesperetin and diosmetin by strain SC2408. Control strain: CF237. Observation of hesperetin peaks in diosmetin.
Figure 26 : Production d'hespérétine et de diosmétine par la souche SC2409. Souche témoin: CF237. Observation des pics d'hespérétine de de diosmétine. Figure 26: Production of hesperetin and diosmetin by strain SC2409. Control strain: CF237. Observation of hesperetin peaks in diosmetin.
Figure 27 : Production d'hespérétine et de diosmétine par les souches SC2408, SC2409 et SC1508. Souche témoin: CF237. Figure 27: Production of hesperetin and diosmetin by strains SC2408, SC2409 and SC1508. Control strain: CF237.
Figure 28 : Production d'hespéridine et de diosmine par les souches SC1579, SC1584, SC1621 et SC1626. Figure 28: Production of hesperidin and diosmin by strains SC1579, SC1584, SC1621 and SC1626.
Figure 29 : Production de diosmétine à partir de naringénine par les souches SC2429 à SC2434, SC2436 à SC2444, SC2446 à SC2454, SC2456 à SC2464 et SC2466. [Tableau 1] DESCRIPTION DES SEQUENCES Figure 29: Production of diosmetin from naringenin by strains SC2429 to SC2434, SC2436 to SC2444, SC2446 to SC2454, SC2456 to SC2464 and SC2466. [Table 1] DESCRIPTION OF SEQUENCES
EXEMPLES EXAMPLES
Matériels et méthodes Materials and methods
Souches Strains
Les levures utilisées dans les exemples ont été obtenues à partir de Saccharomyces cerevisiae FY1679-28A (Tettelin et al., 1995 https://doi.org/10.1016/S1067-The yeasts used in the examples were obtained from Saccharomyces cerevisiae FY1679-28A (Tettelin et al., 1995 https://doi.org/10.1016/S1067-
2389(06)80008-7). Cette levure possède une quadri auxotrophie pour l'uracile, le tryptophane, l'histidine et la leucine. Les souches de bactéries utilisées dans les exemples ont été obtenues à partir de Escherichia coli MH1. 2389 (06) 80008-7). This yeast has a quadri auxotrophy for uracil, tryptophan, histidine and leucine. The strains of bacteria used in the examples were obtained from Escherichia coli MH1.
Standards Les standards ont été acquis chez le fournisseur Extrasynthèse, France (Naringénine, Apigénine, Eriodictyol, Lutéoline, Hespérétine, Hespéridine, Diosmétine et Diosmine). Standards The standards were acquired from the supplier Extrasynthèse, France (Naringenin, Apigenin, Eriodictyol, Luteolin, Hesperetin, Hesperidin, Diosmetine and Diosmine).
Clonage des gènes Gene cloning
Les gènes optimisés pour s'exprimer dans la levure ont été synthétisés par Eurofins genomics, Ebersberg, Allemagne ou Biomatik, Cambridge, Canada ou Twist Biosciences, San Francisco, USA ou DC Biosciences, Dundee, UK. Par PCR, le gène cpr2 (SEQ ID NO : 26) de S. cerevisiae a été amplifié à partir de l'ADN génomique. The genes optimized for expression in yeast have been synthesized by Eurofins genomics, Ebersberg, Germany or Biomatik, Cambridge, Canada or Twist Biosciences, San Francisco, USA or DC Biosciences, Dundee, UK. By PCR, the cpr2 gene (SEQ ID NO: 26) of S. cerevisiae was amplified from genomic DNA.
Les gènes obtenus par synthèse ou par PCR comprennent à l'extrémité 5' et 3', un site de restriction Bbsl (GAAGAC) ou Bsal (GGTCTC). The genes obtained by synthesis or by PCR comprise, at the 5 'and 3' end, a BbsI (GAAGAC) or Bsal (GGTCTC) restriction site.
Tous les gènes, les promoteurs et les terminateurs ont été clonés restriction dans le vecteur pSBK pour l'expression dans la levure ou dans le vecteur pSBlK3 pour l'expression dans E. coli. Les promoteurs et terminateurs (Wargner et al., 2015 DOI: 10.1016/j.fgb.2015.12.001) ont été récupérés par PCR à partir de l'ADN génomique de la levure 5. cerevisiae ou de E. coli. All the genes, promoters and terminators were restriction cloned into the vector pSBK for expression in yeast or into the vector pSB1K3 for expression in E. coli. The promoters and terminators (Wargner et al., 2015 DOI: 10.1016 / j.fgb.2015.12.001) were recovered by PCR from the genomic DNA of the yeast 5. cerevisiae or of E. coli.
Le vecteur pSBK comprend un marqueur de sélection de la levure URA, ou LEU ou TRP ou HIS et le vecteur pSBlK3 comprend un marqueur de résistance à la kanamycine. The pSBK vector comprises a yeast selection marker URA, or LEU or TRP or HIS and the vector pSB1K3 comprises a kanamycin resistance marker.
Conditions de culture Culture conditions
Les souches ont été cultivées dans 1 ml de milieu minimum nitrogen base (Dutscher, Brumath, Fr) supplémenté de glucose à 20 g/l pour les levures et dans 1 ml de M9 supplémenté de glucose à 4 g.l 1 pour E. coli en plaque 24 puits (Starlab, Orsay, Fr) à 30°C pendant 72h sous agitation continu à 200 RPM. Dans certains cas, de la naringénine ou de l'apigénine a été ajoutée à une concentration de 100 mg.l 1 pour déterminer l'activité des F3'H, de la naringénine ou de l'ériodictyol a été ajoutée à une concentration de 100 mg.l 1 pour déterminer l'activité des FNSII, de l'ériodictyol ou de la lutéoline a été ajoutée à une concentration de 100 mg.l 1 pour déterminer l'activité des MET, de l'hespérétine ou de la diosmétine a été ajoutée à une concentration de 100 mg.l 1 pour déterminer l'activité des GT, et de l'hespérétine 7-O-glucioside et ou de la diosmétine 7-O-glucoside pour déterminer l'activité des RFIM et RFIAT. Chaque souche a été inoculée à DO 0,2 à partir d’une pré-culture de 24h cultivée dans les mêmes conditions. The strains were cultured in 1 ml of minimum nitrogen base medium (Dutscher, Brumath, Fr) supplemented with glucose at 20 g / l for the yeasts and in 1 ml of M9 supplemented with glucose at 4 gl 1 for E. coli in a 24-well plate (Starlab, Orsay, Fr) at 30 ° C. for 72 h with continuous stirring at 200 RPM. In some cases naringenin or apigenin was added at a concentration of 100 mg.l 1 to determine the activity of F3'H, naringenin or erodictyol was added at a concentration of 100 mg.l 1 to determine the activity of FNSII, erodictyol or luteolin was added at a concentration of 100 mg.l 1 to determine the activity of METs, hesperetin or diosmetin was added added at a concentration of 100 mg.l 1 to determine the activity of GTs, and hesperetin 7-O-glucioside and or diosmetin 7-O-glucoside to determine the activity of RFIM and RFIAT. Each strain was inoculated at OD 0.2 from a 24 hour pre-culture cultivated under the same conditions.
Méthode analytique Analytical method
Préparation des échantillons : Les cultures de 1 mL sont congelées à -80°C puis lyophilisées pendant 12h à 0,10 mbar. Les échantillons sont ensuite repris dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO), agités pendant 30 secondes à 1000 rpm puis centrifugés pendant 5 min à 3000 rpm à température ambiante. Après centrifugation, un volume connu de surnageant est ajouté à un volume connu d'un mélange d’étalons internes solubilisés dans du méthanol. Preparation of the samples: The 1 mL cultures are frozen at -80 ° C. then lyophilized for 12 h at 0.10 mbar. The samples are then taken up in 1 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO), stirred for 30 seconds at 1000 rpm and then centrifuged for 5 min at 3000 rpm at room temperature. After centrifugation, a known volume of supernatant is added to a known volume of a mixture of internal standards solubilized in methanol.
Les concentrations finales des étalons internes sont : · Diosmine C13 0,5 mg/L The final concentrations of the internal standards are: Diosmin C13 0.5 mg / L
• Diosmétine C13 0,015 mg/L. • Diosmetin C13 0.015 mg / L.
Analyse par UFIPLC-TQ : Les échantillons ont été analysés par une UHPLC Vanquish-H (Thermo) couplée à un triple-quadripôle Quantis (Thermo). La colonne est une colonne Waters Acquity UPLC@ USST3 (8 miti 2,1 X 100 mm) associée à une pré-colonne HSST3 1,8 miti 2,1 X 5 mm. Analysis by UFIPLC-TQ: The samples were analyzed by a UHPLC Vanquish-H (Thermo) coupled to a triple-quadrupole Quantis (Thermo). The column is a Waters Acquity UPLC @ USST3 column (8 miti 2.1 X 100 mm) associated with a HSST3 1.8 miti 2.1 X 5 mm pre-column.
La phase mobile A est une solution de 0,1 % d'acide formique dans de l'eau de qualité LC/MS et la phase mobile B est une solution de 0,1 % d'acide formique dans de l'acétonitrile pur de qualité LC/MS . La température de la colonne est de 50°C et la température du passeur d’échantillons à 10°C. Deux conditions chromatographiques ont pu être utilisés pour la détection des flavonoïdes d'intérêt : Mobile phase A is a solution of 0.1% formic acid in LC / MS grade water and mobile phase B is a solution of 0.1% formic acid in pure acetonitrile of LC / MS quality. The temperature of the column is 50 ° C and the temperature of the autosampler is 10 ° C. Two chromatographic conditions could be used for the detection of the flavonoids of interest:
[Tableau 2] Conditions chromatographiques méthode 1 [Tableau 3] Conditions chromatographiques méthode 2 [Table 2] Chromatographic conditions method 1 [Table 3] Chromatographic conditions method 2
Les ions suivis et les conditions de fragmentation pour les molécules d'intérêts sont :The ions monitored and the fragmentation conditions for the molecules of interest are:
[Tableau 4] Pour la méthode 1 [Table 4] For method 1
[Tableau 5] Pour la méthode 2 [Table 5] For method 2
F3'H Des constructions pour chacune des F3'H ont été réalisées dans un vecteur portant le marqueur de sélection URA (Tableau 6). Des constructions comportant chacune SAM2 et un seul des différents CPR ont été créés dans un vecteur portant le marqueur de sélection LEU (Tableau 7). Deux vecteurs comportant uniquement le marqueur de sélection URA ou LEU ont aussi été créé comme témoin. Les gènes marqueurs permettent de repérer et de sélectionner les cellules ayant intégré le gène d'intérêt. [Tableau 6] Liste des différentes constructions F3'H testées. F3′H Constructs for each of the F3′H were carried out in a vector carrying the URA selection marker (Table 6). Constructs each comprising SAM2 and only one of the different CPRs were created in a vector carrying the LEU selection marker (Table 7). Two vectors comprising only the URA or LEU selection marker were also created as a control. The marker genes make it possible to identify and select the cells which have integrated the gene of interest. [Table 6] List of the different F3′H constructions tested.
[Tableau 7] Listes des constructions réalisées avec les différents CPR Plusieurs souches ont été créées avec respectivement toutes les F3'H listées dans le tableau 6 pour qu'elles soient chacune testées avec toutes les constructions du tableau 7. [Table 7] Lists of constructions carried out with the different CPRs Several strains were created with respectively all the F3′H listed in Table 6 so that they were each tested with all the constructs of Table 7.
Ces différents assemblages permettent de vérifier l'activité enzymatique des F3'H et permettent également de déterminer les couples F3'H - CPR les plus efficaces. Par exemple, la souche FL 405 possède les constructions FL 26 et FL 401. These different assemblies make it possible to verify the enzymatic activity of F3′H and also make it possible to determine the most effective F3′H - CPR pairs. For example, strain FL 405 has the constructs FL 26 and FL 401.
La souche témoin (sans les gènes) possédant les constructions TT URA et TT LEU est nommée CF235. The control strain (without the genes) having the TT URA and TT LEU constructs is called CF235.
FNSII Pour chacune des FNSII suivantes, des constructions dans un vecteur TRP ont été effectués (Tableau 8). Les mêmes vecteurs avec le marqueur de sélection LEU contenant chacun SAM2 et un CPR différent ont été utilisés pour tester les FNSII (Tableau 9). FNSII For each of the following FNSII, constructs in a TRP vector were performed (Table 8). The same vectors with the LEU selection marker each containing SAM2 and a different CPR were used to test FNSII (Table 9).
[Tableau 8] Constructions comportant les différentes FNSII testées. [Table 8] Constructions comprising the different FNSII tested.
[Tableau 9] Listes des constructions réalisées avec les différents CPR [Table 9] Lists of constructions carried out with the different CPRs
Plusieurs souches ont été créées avec respectivement chacune des constructions des FNSII listées dans le tableau 8 et chacune des constructions des CPR du tableau 9. Several strains were created with, respectively, each of the FNSII constructs listed in Table 8 and each of the CPR constructs in Table 9.
Ces différents assemblages permettent de vérifier l'activité enzymatique des FNSII et permettent également de déterminer les FNSII les plus efficaces. These different assemblies make it possible to verify the enzymatic activity of the FNSII and also make it possible to determine the most effective FNSII.
Par exemple, la souche SC 744 possède les constructions FL 620 et FL 401. For example, strain SC 744 has the constructs FL 620 and FL 401.
La souche témoin (sans les gènes) possédant les constructions TT TRP et TT LEU est nommé CF234. The control strain (without the genes) possessing the TT TRP and TT LEU constructs is named CF234.
Des constructions similaires ont été réalisées pour tester les FNSII des SEQ ID Nos : 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159. LEVURE JUSQU'A ERIODICTYOL/LUTEOLINE Similar constructions were made to test the FNSIIs of SEQ ID Nos: 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159. YEAST UP TO ERIODICTYOL / LUTEOLINE
Des souches comportant la voie jusqu'à l'ériodictyol et la lutéoline ont également été testées : - la souche SC1500 comprend les constructions FL 26, FL 602, FL 808 et FL 822; Strains comprising the pathway to erodictyol and luteolin were also tested: the strain SC1500 comprises the constructions FL 26, FL 602, FL 808 and FL 822;
- la souche SC2424 comprenant les constructions FL 1031 + FL 602 + FL 822 + TT HIS ; the strain SC2424 comprising the constructions FL 1031 + FL 602 + FL 822 + TT HIS;
- la souche SC2425 comprenant les constructions FL 26 + FL 602 + FL 822 + TT HIS ; the strain SC2425 comprising the constructions FL 26 + FL 602 + FL 822 + TT HIS;
- la souche SC2426 comprenant les constructions FL 31 + FL 602 + FL 822 + TT HIS ; the strain SC2426 comprising the constructions FL 31 + FL 602 + FL 822 + TT HIS;
- la souche SC2427 comprend les constructions FL 1031, FL 602, FL 808 et FL 822 ; et - la souche SC2428 comprenant les constructions FL 31 + FL 602 + FL 808 + FL 822. the strain SC2427 comprises the constructions FL 1031, FL 602, FL 808 and FL 822; and - strain SC2428 comprising the constructions FL 31 + FL 602 + FL 808 + FL 822.
[Tableau 10] Listes des constructions utilisées des souches comportant la voie jusqu'à l'ériodictyol et la lutéoline [Table 10] Lists of the constructs used of the strains comprising the pathway to erodictyol and luteolin
La souche témoin (sans les gènes) possédant les constructions TT LIRA, TT TRP, TT HIS et TT LEU est nommé CF237. The control strain (without the genes) possessing the constructions TT LIRA, TT TRP, TT HIS and TT LEU is named CF237.
MET : MET:
Afin de tester chacune des MET, des constructions ont été effectuées et sont présentées dans le tableau 11. Les gènes marqueurs permettent de repérer et de sélectionner les cellules ayant intégré le gène d'intérêt. In order to test each of the METs, constructions were carried out and are presented in Table 11. The marker genes make it possible to identify and select the cells which have integrated the gene of interest.
[Tableau 11] Listes des constructions réalisées pour tester les différentes MET [Table 11] Lists of constructions carried out to test the different TEMs
Quatre souches SC1612, SC1614, SC2147 et SC2151 ont été créés, avec FL 121 et FL 266 pour SC1612, FL 121 et FL 268 pour SC1614, FL 475 et FL 121 pour SC2147 et FL 469 et FL 121 pour SC2151 pour la conversion de l'ériodictyol en hespérétine afin de déterminer quelle MET est la plus efficace. La souche témoin (sans les gènes) possédant les constructions TT LEU et TT URA est nommée CF235. Four strains SC1612, SC1614, SC2147 and SC2151 were created, with FL 121 and FL 266 for SC1612, FL 121 and FL 268 for SC1614, FL 475 and FL 121 for SC2147 and FL 469 and FL 121 for SC2151 for the conversion of l eriodictyol to hesperetin to determine which MET is most effective. The control strain (without the genes) having the TT LEU and TT URA constructs is called CF235.
F3'H, MET, FNS, CPR : PRODUCTION DE DIOSMETINE A PARTIR DE NARINGENINE F3'H, MET, FNS, CPR: PRODUCTION OF DIOSMETIN FROM NARINGENIN
[Tableau 12] Liste des constructions utilisées pour tester les enzymes dans Saccharomyces cerevisiae (SC) [Table 12] List of constructs used to test the enzymes in Saccharomyces cerevisiae (SC)
Les souches suivantes ont été construites : The following strains were constructed:
SC2429 : FL 1111 + FL 1031 + FL 121 SC2451 : FL 1113 + FL 26 + FL 121 SC2430 : FL 1112 + FL 1031 + FL 121 SC2452 : FL 1114 + FL 26 + FL 121 SC2431 : FL 1113 + FL 1031 + FL 121 25 SC2453 : FL 1115 + FL 26 + FL 121 SC2432 : FL 1114 + FL 1031 + FL 121 SC2459 : FL 1111 + FL 26 + TT LEU SC2433 : FL 1115 + FL 1031 + FL 121 SC2460 : FL 1112 + FL 26 + TT LEU SC2439 : FL 1111 + FL 1031 + TT LEU SC2461 : FL 1113 + FL 26 + TT LEU SC2440 : FL 1112 + FL 1031 + TT LEU SC2462 : FL 1114 + FL 26 + TT LEU SC2441 : FL 1113 + FL 1031 + TT LEU 30 SC2463 : FL 1115 + FL 26 + TT LEU SC2442 : FL 1114 + FL 1031 + TT LEU SC2454 : FL 1116 + FL 26 + FL 121 SC2443 : FL 1115 + FL 1031 + TT LEU SC2456 : FL 1118 + FL 26 + FL 121 SC2434 : FL 1116 + FL 1031 + FL 121 SC2457 : FL 1119 + FL 26 + FL 121 SC2436 : FL 1118 + FL 1031 + FL 121 SC2458 : FL 1120+ FL 26 + FL 121 SC2437 : FL 1119 + FL 1031 + FL 121 35 SC2464 : FL 1116 + FL 26 + TT LEU SC2438 : FL 1120+ FL 1031 + FL 121 SC2466 : FL 1118 + FL 26 + TT LEU SC2444 : FL 1116 + FL 1031 + TT LEU SC2467 : FL 1119 + FL 26 + TT LEU SC2446 : FL 1118 + FL 1031 + TT LEU SC2468 : FL 1120 + FL 26 + TT LEU SC2447 : FL 1119 + FL 1031 + TT LEU SC2429: FL 1111 + FL 1031 + FL 121 SC2451: FL 1113 + FL 26 + FL 121 SC2430: FL 1112 + FL 1031 + FL 121 SC2452: FL 1114 + FL 26 + FL 121 SC2431: FL 1113 + FL 1031 + FL 121 25 SC2453: FL 1115 + FL 26 + FL 121 SC2432: FL 1114 + FL 1031 + FL 121 SC2459: FL 1111 + FL 26 + TT LEU SC2433: FL 1115 + FL 1031 + FL 121 SC2460: FL 1112 + FL 26 + TT LEU SC2439: FL 1111 + FL 1031 + TT LEU SC2461: FL 1113 + FL 26 + TT LEU SC2440: FL 1112 + FL 1031 + TT LEU SC2462: FL 1114 + FL 26 + TT LEU SC2441: FL 1113 + FL 1031 + TT LEU 30 SC2463: FL 1115 + FL 26 + TT LEU SC2442: FL 1114 + FL 1031 + TT LEU SC2454: FL 1116 + FL 26 + FL 121 SC2443: FL 1115 + FL 1031 + TT LEU SC2456: FL 1118 + FL 26 + FL 121 SC2434: FL 1116 + FL 1031 + FL 121 SC2457: FL 1119 + FL 26 + FL 121 SC2436: FL 1118 + FL 1031 + FL 121 SC2458: FL 1120+ FL 26 + FL 121 SC2437: FL 1119 + FL 1031 + FL 121 35 SC2464: FL 1116 + FL 26 + TT LEU SC2438: FL 1120+ FL 1031 + FL 121 SC2466: FL 1118 + FL 26 + TT LEU SC2444: FL 1 116 + FL 1031 + TT LEU SC2467: FL 1119 + FL 26 + TT LEU SC2446: FL 1118 + FL 1031 + TT LEU SC2468: FL 1120 + FL 26 + TT LEU SC2447: FL 1119 + FL 1031 + TT LEU
SC2448 : FL 1120 + FL 1031 + TT LEU SC2448: FL 1120 + FL 1031 + TT LEU
SC2449 : FL 1111 + FL 26 + FL 121 SC2449: FL 1111 + FL 26 + FL 121
SC2450 : FL 1112 + FL 26 + FL 121 La souche témoin (sans les gènes) possédant les constructions TT LIRA, TT TRP, TT HIS et TT LEU est nommé CF237. SC2450: FL 1112 + FL 26 + FL 121 The control strain (without the genes) possessing the constructions TT LIRA, TT TRP, TT HIS and TT LEU is named CF237.
E. COU JUSQU'A HESPERETINE/DIOSMETINE [Tableau 13] Liste des constructions utilisées pour tester les enzymes dans E. coli E. NECK TO HESPERETINE / DIOSMETINE [Table 13] List of constructs used to test enzymes in E. coli
LEVURE JUSQU'A HESPERETINE/DIOSMETINE YEAST TO HESPERETINE / DIOSMETIN
Trois souches comportant la voie jusqu'à hespérétine/diosmétine ont également été testées. La souche SC1508 comprend les constructions FL 121 + FL 268 + FL 602 + FL 808 du tableau 14. La souche SC2408 comprend les constructions FL 121 + FL 469 + FL 602 + FL 808 du tableau 14. La souche SC2409 comprend les constructions FL 121 + FL 475 + FL 602 + FL 808 du tableau 14. Three strains comprising the pathway to hesperetin / diosmetin were also tested. The strain SC1508 comprises the constructions FL 121 + FL 268 + FL 602 + FL 808 of table 14. The strain SC2408 comprises the constructions FL 121 + FL 469 + FL 602 + FL 808 of table 14. The strain SC2409 comprises the constructions FL 121 + FL 475 + FL 602 + FL 808 from table 14.
[Tableau 14] Listes des constructions utilisées dans les exemples. [Table 14] Lists of constructions used in the examples.
La souche témoin (sans les gènes) possédant les constructions TT LEU, TT URA, TT TRP et The control strain (without the genes) having the constructions TT LEU, TT URA, TT TRP and
TT HIS est nommée CF237. TT HIS is named CF237.
GT Afin de tester chacune des GT, des constructions ont été effectuées et sont présentées dans le tableau 15. Les gènes marqueurs permettent de repérer et de sélectionner les cellules ayant intégré le gène d'intérêt. GT In order to test each of the GTs, constructions were carried out and are presented in Table 15. The marker genes make it possible to identify and select the cells which have integrated the gene of interest.
[Tableau 15] Listes des constructions utilisées pou r tester les différentes GT [Table 15] Lists of constructions used to test the different GTs
Les différentes constructions avec les différents GT vont permettre de vérifier l'activité enzymatique des GT et permettre également de déterminer les GT les plus efficaces. The different constructions with the different GTs will make it possible to verify the enzymatic activity of the GTs and also make it possible to determine the most efficient GTs.
La souche témoin (sans les gènes) possédant la construction TT URA est nommée CF233. The control strain (without the genes) having the TT URA construct is called CF233.
RHM RHM
Afin de tester chacune des RHM, des constructions ont été effectuées et sont présentées dans le tableau 16. In order to test each of the RHMs, constructions were carried out and are presented in Table 16.
[Tableau 16] Listes des constructions utilisées pou r tester les différentes RHM. [Table 16] Lists of constructions used to test the different RHMs.
Les différentes constructions avec les différents RHM vont permettre de vérifier l'activité enzymatique des RH M et permettre également de déterminer les RHM les plus efficaces. The different constructions with the different RHMs will make it possible to verify the enzymatic activity of the RH M and also make it possible to determine the most effective RHMs.
La souche témoin (sans les gènes) possédant la construction TT URA est nommée CF233. The control strain (without the genes) having the TT URA construct is called CF233.
RHAT RHAT
Afin de tester chacune des RHAT, des constructions ont été effectuées et sont présentées dans le tableau 17. In order to test each of the RHATs, constructions were carried out and are presented in Table 17.
[Tableau 17] Listes des constructions utilisées pou r tester les différentes RHAT [Table 17] Lists of constructions used to test the different RHATs
Les différents assemblages effectués avec les différentes RHAT vont permettre de vérifier l'activité enzymatique des RHAT et également permettre de déterminer les RHAT les plus efficaces. La souche témoin (sans les gènes) possédant la construction TT URA est nommée CF233. The different assemblies carried out with the different RHATs will make it possible to verify the enzymatic activity of the RHATs and also make it possible to determine the most effective RHATs. The control strain (without the genes) having the TT URA construct is called CF233.
E.COLI JUSQU'A HESPERIDINE/DIOSMINE E. COLI TO HESPERIDINE / DIOSMINE
[Tableau 18] Liste de la souche créée pour tester la voie dans E. coli [Table 18] List of the strain created to test the pathway in E. coli
LEVURE JUSQU'A HESPERIDINE/DIOSMINE YEAST TO HESPERIDINE / DIOSMINE
Neuf souches comportant la voie complète ont également été créées. Nine strains with the complete pathway were also created.
La souche SC1509 comprend les constructions FL 121 + FL 511 + FL 602 + FL 808. The strain SC1509 comprises the constructs FL 121 + FL 511 + FL 602 + FL 808.
La souche SC1530 comprend les constructions FL 121 + FL 603 + FL 602 + FL 808. La souche SC1529 comprend les constructions FL 121 + FL 554 + FL 602 + FL 808. The strain SC1530 comprises the constructs FL 121 + FL 603 + FL 602 + FL 808. The strain SC1529 comprises the constructs FL 121 + FL 554 + FL 602 + FL 808.
La souche SC1568 comprend les constructions FL 121 + FL 556 + FL 602 + FL 808. Strain SC1568 comprises the constructs FL 121 + FL 556 + FL 602 + FL 808.
La souche SC2410 comprend les constructions FL 121 + FL 1100 + FL 602 + FL 808. La souche SC1579 comprend les constructions FL 401 + FL 547 + FL 602 + FL 828. The strain SC2410 comprises the constructs FL 121 + FL 1100 + FL 602 + FL 808. The strain SC1579 comprises the constructs FL 401 + FL 547 + FL 602 + FL 828.
La souche SC1584 comprend les constructions FL 401 + FL 554 + FL 602 + FL 828. La souche SC1621 comprend les constructions FL 401 + FL 556 + FL 602 + FL 828. The strain SC1584 comprises the constructs FL 401 + FL 554 + FL 602 + FL 828. The strain SC1621 comprises the constructs FL 401 + FL 556 + FL 602 + FL 828.
La souche SC1626 comprend les constructions FL 401 + FL 603 + FL 602 + FL 828. The strain SC1626 comprises the constructs FL 401 + FL 603 + FL 602 + FL 828.
[Tableau 19] Listes des constructions utilisées pour créer les souches jusqu'à hespéridine/diosmine. [Table 19] Lists of constructs used to create strains up to hesperidin / diosmin.
La souche témoin (sans les gènes) possédant les constructions TT LEU, TT URA, TT TRP et TT HIS est nommée CF237. RESULTATS The control strain (without the genes) possessing the constructions TT LEU, TT URA, TT TRP and TT HIS is called CF237. RESULTS
F3'H F3'H
Les tableaux 20 et 21 ci-dessous présente la production d'ériodictyol (tableau 20) et de lutéoline (tableau 21) obtenue en cultivant les souches comprenant les F3'H listées dans le tableau 6 et les constructions du tableau 7 , en présence respectivement de naringénine et d'apigénine. Tables 20 and 21 below show the production of erodictyol (Table 20) and luteolin (Table 21) obtained by cultivating the strains comprising the F3′H listed in Table 6 and the constructions of Table 7, in the presence respectively naringenin and apigenin.
[Tableau 20] Concentration en Eriodictyol (en mg.l-1) [Table 20] Eriodictyol concentration (in mg.l -1 )
LQ : inférieur à la limite de quantification. LOQ: below the limit of quantification.
Les différentes souches sont bien capables de produire de l'ériodictyol à partir de la naringénine, en concentrations différentes suivant les F3'H et le CPR utilisés (voir Figure 2). The different strains are well capable of producing erodictyol from naringenin, in different concentrations depending on the F3′H and the CPR used (see FIG. 2).
[Tableau 21] Concentration en Lutéoline (en mg.l _1) [Table 21] Luteolin concentration (in mg.l _1 )
LQ : inférieur à la limite de quantification. LOQ: below the limit of quantification.
Les différentes souches sont bien capables de produire de la lutéoline à partir d'apigénine, en concentrations différentes suivant les F3'H et le CPR utilisés (voir Figure 3). FNS The different strains are well capable of producing luteolin from apigenin, in different concentrations depending on the F3′H and the CPR used (see FIG. 3). SNSF
Les tableaux 22 et 23 ci-dessous présente la production d'apigénine (tableau 22) et de lutéoline (tableau 23) obtenue en cultivant les souches comprenant les FNSII listées dans le tableau 8 et les constructions du tableau 9, en présence respectivement de naringénine et d'ériodictyol. [Tableau 22] Concentration en Apigénine (en mg.l 1) Tables 22 and 23 below show the production of apigenin (Table 22) and luteolin (Table 23) obtained by culturing the strains comprising the FNSII listed in Table 8 and the constructions of Table 9, in the presence respectively of naringenin and erodictyol. [Table 22] Apigenin concentration (in mg.l 1 )
[Tableau 23] Concentration en Lutéoline (en mg.l-1) [Table 23] Luteolin concentration (in mg.l -1 )
Les différentes souches sont bien capables de produire de l'apigénine et de la lutéoline à partir de naringénine et d'ériodictyol, en concentrations différentes suivant le FNS utilisé (Figures 4 et 5). The different strains are well capable of producing apigenin and luteolin from naringenin and erodictyol, in different concentrations depending on the SNSF used (Figures 4 and 5).
Des résultats similaires ont été obtenus avec les FNSII des SEQ ID Nos : 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159. Similar results were obtained with the FNSII of SEQ ID Nos: 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159.
F3'H, MET, FNS, CPR : PRODUCTION DE DIOSMETINE A PARTIR DE NARINGENINE F3'H, MET, FNS, CPR: PRODUCTION OF DIOSMETIN FROM NARINGENIN
Les résultats pour la production de diosmétine à partir de naringénine par les souches SC2429 à SC2434, SC2436 à SC2444, SC2446 à SC2454, SC2456 à SC2464 et SC2466 à SC2468 sont présentés dans la figure 29. The results for the production of diosmetin from naringenin by strains SC2429 to SC2434, SC2436 to SC2444, SC2446 to SC2454, SC2456 to SC2464 and SC2466 to SC2468 are shown in Figure 29.
Toutes les souches sont capables de produire de la diosmétine à partir de naringénine. La production de diosmétine est largement augmentée par l'ajout d'une CPR. All strains are capable of producing diosmetin from naringenin. The production of diosmetin is greatly increased by the addition of a CPR.
LEVURE JUSQU'A ERIODICTYOL/LUTEOLINE Les souches SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC1500 et SC2428 possèdent toutes les enzymes de la voie jusqu'à l'ériodyctiol et la lutéoline et sont capables de produire de la lutéoline et de l'ériodictyol à partir de glucose. YEAST UP TO ERIODICTYOL / LUTEOLINE Strains SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC1500 and SC2428 have all the enzymes from the pathway to erodyctiol and luteolin and are capable of producing luteolin and erodictyol at from glucose.
Les résultats de la souche SC1500 correspondent à la figure 6, où les pics de l'ériodictyol et de la lutéoline sont observés. Des résultats similaires sont obtenus pour les souches SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, et SC2428. La production d'ériodictyol et de lutéoline pour chacune des souches SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC1500 et SC2428 est présentée sur la figure 19. The results of strain SC1500 correspond to Figure 6, where the peaks of erodictyol and luteolin are observed. Similar results are obtained for the strains SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, and SC2428. The production of erodictyol and luteolin for each of the strains SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC1500 and SC2428 is shown in Figure 19.
Il est à noter que l'ajout des enzymes PAL et C4H à la voie de biosynthèse permet d'obtenir des concentrations d'ériodictyol et de lutéoline nettement plus importantes Celles-ci peuvent être jusqu'à 6 fois plus importantes que les concentrations obtenues avec les souches contenant les mêmes enzymes à l'exception de PAL et C4H (cf. figure 19, par exemple en comparant la souche SC2425 sans PAL/C4H et la souche SC1500 avec PAL/C4H ou la souche SC2426 sans PAL/C4H et la souche SC2428 avec PAL/C4H). MET It should be noted that the addition of the PAL and C4H enzymes to the biosynthetic pathway makes it possible to obtain significantly higher concentrations of erodictyol and luteolin.These can be up to 6 times greater than the concentrations obtained with the strains containing the same enzymes with the exception of PAL and C4H (cf. figure 19, for example by comparing the strain SC2425 without PAL / C4H and the strain SC1500 with PAL / C4H or the strain SC2426 without PAL / C4H and the strain SC2428 with PAL / C4H). MET
Les résultats pour la production de l'hespérétine et de diosmétine à partir d'ériodictyol et de lutéoline par les souches SC1612, SC1614, SC2147 et SC2151 sont présentés respectivement dans les figures 7 , 8, 20 et 21. Les souches de levure SC1612, SC1614, SC2147 et SC2151 sont bien capables de produire de l'hespérétine et/ou la diosmétine. The results for the production of hesperetin and diosmetin from erodictyol and luteolin by the strains SC1612, SC1614, SC2147 and SC2151 are presented respectively in Figures 7, 8, 20 and 21. The yeast strains SC1612, SC1614, SC2147 and SC2151 are well capable of producing hesperetin and / or diosmetin.
A partir d'ériodictyol, les souches SC2147, SC2151 et SC1612 sont capables de produire spécifiquement de l'hespérétine, c'est-à-dire de méthyler spécifiquement l'hydroxyle en position 4' de l'ériodictyol (Figure 20). La souche SC1614 produit quant à elle un mélange d'hespérétine et d'homoériodictyol. From erodictyol, strains SC2147, SC2151 and SC1612 are capable of specifically producing hesperetin, that is to say of specifically methylating the hydroxyl in position 4 'of erodictyol (FIG. 20). The strain SC1614 for its part produces a mixture of hesperetin and homoeriodictyol.
De manière remarquable, la souche SC2151 est par ailleurs capable de produire de l'ordre de 40 mg/L d'hespérétine (Figure 20). Les souches SC2147, SC1612 et SC1614 sont quant à elles capables de produire de la diosmétine à partir de lutéoline (Figure 21). Remarkably, strain SC2151 is moreover capable of producing around 40 mg / L of hesperetin (FIG. 20). The strains SC2147, SC1612 and SC1614 are for their part capable of producing diosmetin from luteolin (Figure 21).
FNSII FNSII
Les résultats pour la production de la diosmétine à partir de l'hespérétine par la souche SC744 sont présentés sur la figure 9. The results for the production of diosmetin from hesperetin by strain SC744 are shown in Figure 9.
La souche de levure SC744 est bien capable de produire de la diosmétine à partir d'hespérétine. The yeast strain SC744 is well capable of producing diosmetin from hesperetin.
E. COU JUSQU'A HESPERETINE/DIOSMETINE E. NECK TO HESPERETINE / DIOSMETIN
Les résultats pour la production de l'hespérétine à partir d'ériodictyol par la souche EC26, EC41 et EC43 sont présentés dans les figure 10, 22 et 23 et la production de diosmétine à partir de lutéoline par les souches EC26 et EC43 sont présentés dans les figures 11 et 24. Les souches E. coli EC26, EC41 et EC43 sont bien capables de produire de l'hespérétine et/ou de la diosmétine. Les résultats pour la production de diosmétine à partir d'hespérétine par la souche EC30 sont présentés sur la figure 12. The results for the production of hesperetin from erodictyol by the strain EC26, EC41 and EC43 are shown in Figures 10, 22 and 23 and the production of diosmetin from luteolin by the strains EC26 and EC43 are shown in Figures 11 and 24. The E. coli strains EC26, EC41 and EC43 are well capable of producing hesperetin and / or diosmetin. The results for the production of diosmetin from hesperetin by strain EC30 are shown in Figure 12.
La souche E. coli EC30 est bien capable de produire de la diosmétine à partir d'hespérétine. The E. coli EC30 strain is well capable of producing diosmetin from hesperetin.
LEVURE JUSQU'A HESPERETINE/DIOSMETINE YEAST TO HESPERETINE / DIOSMETIN
Les résultats pour la production d'hespérétine et de diosmétine à partir de glucose des souches SC1508, SC2408 et SC2409 sont présentés sur les figures 13, 25 et 26. The results for the production of hesperetin and diosmetin from glucose of strains SC1508, SC2408 and SC2409 are shown in Figures 13, 25 and 26.
Les souches de levure SC1508, SC2408 et SC2409 possédant toutes les enzymes de la voie jusqu'à l'hespérétine et la diosmétine sont capables de produire de l'hespérétine et/ou de la diosmétine à partir de glucose (Figure 27). De manière remarquable, la souche SC2408 produit de l'ordre de 25 mg/L d'hespérétine et environ 5 mg/L de diosmétine. The yeast strains SC1508, SC2408 and SC2409 possessing all the enzymes of the pathway up to hesperetin and diosmetin are capable of producing hesperetin and / or diosmetin from glucose (Figure 27). Remarkably, strain SC2408 produces on the order of 25 mg / L of hesperetin and approximately 5 mg / L of diosmetin.
GT GT
[Table 24] Concentration en hespérétine, hespérétine 7-O-Glucoside et en hespéridine suivant les GT utilisées (en mg.l 1) [Table 24] Concentration of hesperetin, hesperetin 7-O-Glucoside and hesperidin according to the GTs used (in mg.l 1 )
// quantité non déterminée [Table 25] Concentration en diosmétine, diosmétine 7-O-Glucoside et en diosmine suivant les GT utilisées (en mg.l 1) // quantity not determined [Table 25] Concentration of diosmetin, diosmetin 7-O-Glucoside and diosmin according to the GTs used (in mg.l 1 )
Les différentes souches sont bien capables de produire de rhespéridine et/ou de la diosmine à partir d'hespérétine et de diosmétine, en concentrations différentes suivant les GT utilisées. The different strains are well capable of producing resperidin and / or diosmin from hesperetin and diosmetin, in different concentrations depending on the GTs used.
RHM RHM
[Table 26] Concentration en hespérétine, en hespérétine 7-O-Glucoside et en hespéridine suivant les RHM utilisées (en mg.l 1) [Table 26] Concentration of hesperetin, hesperetin 7-O-Glucoside and hesperidin according to the RHMs used (in mg.l 1 )
[Table 27] Concentration en diosmétine, en diosmétine 7-O-Glucoside et en diosmine suivant les RHM utilisées (en mg.l 1) [Table 27] Concentration of diosmetin, diosmetin 7-O-Glucoside and diosmin according to the RHMs used (in mg.l 1 )
Les différentes souches sont bien capables de produire de rhespéridine et de la diosmine à partir d'hespérétine et de diosmétine, en concentrations différentes suivant les RHM utilisées. The different strains are well capable of producing rhesperidin and diosmin from hesperetin and diosmetin, in different concentrations depending on the RHMs used.
RHAT RHAT
[Table 28] Concentration en hespérétine, hespérétine 7-O-Glucoside et en hespéridine suivant les RHAT utilisées (en mg.l 1) [Table 28] Concentration of hesperetin, hesperetin 7-O-Glucoside and hesperidin according to the RHATs used (in mg.l 1 )
[Table 29] Concentration en diosmétine, diosmétine 7-O-Glucoside et en diosmine suivant les RHAT utilisées ( en mg/mol) [Table 29] Concentration of diosmetin, diosmetin 7-O-Glucoside and diosmin according to the RHATs used (in mg / mol)
Les différentes souches sont bien capables de produire de l'hespéridine et de la diosmine à partir d'hespérétine et de diosmétine, en concentrations différentes suivant les GT, les RHM et les RHAT utilisées. The different strains are well capable of producing hesperidin and diosmin from hesperetin and diosmetin, in different concentrations depending on the GTs, RHMs and RHATs used.
Les résultats pour la production de l'hespéridine et de la diosmine à partir d'hespérétine et de diosmétine par la souche FL 547 sont présentés respectivement dans les figures 14 etThe results for the production of hesperidin and diosmin from hesperetin and diosmetin by strain FL 547 are shown in Figures 14 and respectively.
15. Les levures testées avec les différentes constructions sont bien capables de produire de l'hespéridine et de la diosmine. 15. The yeasts tested with the different constructs are well capable of producing hesperidin and diosmin.
E.COLI JUSQU'A HESPERIDINE/DIOSMINE Les résultats pour la production d'hespéridine à partir d'hespérétine par les souches EC38, EC45 et EC47 sont présentés dans la figure 16. E.COLI TO HESPERIDINE / DIOSMINE The results for the production of hesperidin from hesperetin by the strains EC38, EC45 and EC47 are presented in figure 16.
Ces souches sont bien capables de produire de l'hespéridine à partir d'hespérétine. These strains are well capable of producing hesperidin from hesperetin.
Les résultats pour la production de diosmine à partir de diosmétine par les souche EC38, EC45 et EC47 sont présentés sur la figure 17. The results for the production of diosmin from diosmetin by the strain EC38, EC45 and EC47 are shown in Figure 17.
Ces souches sont bien capables de produire de la diosmine à partir de diosmétine. These strains are well capable of producing diosmin from diosmetin.
LEVURE JUSQU'A HESPERIDINE/DIOSMINE YEAST TO HESPERIDINE / DIOSMINE
Les résultats pour la production d'hespéridine et de diosmine à partir de glucose par les souches SC1509, SC1530, SC1529, SC1568 et SC2410 sont présentés sur la figure 18. Les résultats pour la production d'hespéridine et de diosmine par les souches SC1579, SC1584, SC1621 et SC1626 sont présentés sur la figure 28. The results for the production of hesperidin and diosmin from glucose by the strains SC1509, SC1530, SC1529, SC1568 and SC2410 are shown in Figure 18. The results for the production of hesperidin and diosmin by the strains SC1579, SC1584, SC1621 and SC1626 are shown in Figure 28.
Toutes les souches possédant toutes les enzymes de la voie sont capables de produire de l'hespéridine et/ou de la diosmine. All the strains possessing all the enzymes of the pathway are capable of producing hesperidin and / or diosmin.

Claims

REVENDICATIONS
1. Microorganisme recombinant comprenant : 1. Recombinant microorganism comprising:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7- O-bêta-D-glucosyltransférase (UGT) capable d'ajouter un glucose en position 7 de l'hespérétine et/ou la diosmétine ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase (UGT) capable of adding glucose at position 7 of hesperetin and / or diosmetin; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase (RhaT) capable de transférer un rhamnose en position 6 du glucose de l'hespérétine-7-O-glucoside et/ou la diosmétine-7-O- glucoside; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-0-rhamnosyltransferase (RhaT) capable of transferring a rhamnose to the 6 position of the glucose of hesperetin-7-O-glucoside and / or diosmetin-7-O-glucoside ; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose - a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose
4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4- kéto-L-rhamnose-réductase (RHM) capable de produire de l'UDP-rhamnose. 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase (RHM) capable of producing UDP-rhamnose.
2. Microorganisme selon la revendication 1, dans lequel la flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase est une enzyme de Citrus sinensis, de Citrus clementina, d’Arabidopsis thaliana, de Scutellaria boicolensis ou d’Homo sapiens, de préférence de Citrus sinensis ou de Scutellaria baicalensis. 2. Microorganism according to claim 1, wherein the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase is an enzyme from Citrus sinensis, Citrus clementina, Arabidopsis thaliana, Scutellaria boicolensis or Homo sapiens, preferably Citrus. sinensis or Scutellaria baicalensis.
3. Microorganisme selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 et 101 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 et 97 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase. 3. Microorganism according to claim 1 or 2, wherein the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase is selected from the enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 and 101 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113, 115, 91, 93, 95 and 97 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity.
4. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-3, dans lequel la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase. 4. Microorganism according to any one of claims 1-3, wherein the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase is selected from the enzymes. comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone activity 7- O-beta-D-glucosyltransferase, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity.
5. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans lequel la 6"-0- rhamnosyltransferase est une enzyme du genre Citrus ou de Pétunia hybrida, de préférence Citrus sinensis, Citrus maxima, ou Citrus clementina, de manière encore plus préférée Citrus sinensis ou Citrus clementina. 5. Microorganism according to any one of claims 1-4, wherein the 6 "-O-rhamnosyltransferase is an enzyme of the genus Citrus or Petunia hybrida, preferably Citrus sinensis, Citrus maxima, or Citrus clementina, even more so. preferred Citrus sinensis or Citrus clementina.
6. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-5, dans lequel la 6"-0- rhamnosyltransferase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 103, 105 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase, de préférence la 6"-0- rhamnosyltransferase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase. 6. Microorganism according to any one of claims 1-5, wherein the 6 "-O-rhamnosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 103, 105 and polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a 6 "-0-rhamnosyltransferase activity, preferably the 6" -0-rhamnosyltransferase is selected from the enzymes comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity.
7. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-6, dans lequel l'UDP- glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto- L-rhamnose-réductase est de Citrus sinensis ou d'Arabidopsis thaliana. 7. Microorganism according to any one of claims 1-6, wherein UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4- keto-L-rhamnose reductase is from Citrus sinensis or Arabidopsis thaliana.
8. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-6, dans lequel l'UDP- glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto- L-rhamnose-réductase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 107, 109 et 111 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6- désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase, de préférence l'UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4- kéto-L-rhamnose-réductase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D- glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase. 8. Microorganism according to any one of claims 1-6, wherein UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4- keto L-rhamnose reductase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 107, 109 and 111 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D- activity glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase, preferably UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4- keto-L-rhamnose-reductase is selected from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d 'sequence identity with this sequence and showing UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase activity .
9. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-8, dans lequel 9. Microorganism according to any one of claims 1-8, wherein
- la flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D- glucosyltransférase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; et - the flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; and
- la 6"-0-rhamnosyltransferase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0-rhamnosyltransferase ; et - 6 "-O-rhamnosyltransferase is selected from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
l'UDP-glucose 4,6-déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5- épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose-réductase est sélectionnée parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase. UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase is selected from enzymes comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose 4,6-dehydratase / UDP activity -4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
10. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-9, le microorganisme comprend en outre : 10. Microorganism according to any one of claims 1-9, the microorganism further comprises:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL);
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumarine- CoA ligase (4CL) ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumarin-CoA ligase (4CL);
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une naringénine- chalcone synthase (CHS) ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a naringenin chalcone synthase (CHS); and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI). a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI).
11. Microorganisme selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend : 11. Microorganism according to claim 10, characterized in that it comprises:
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) de Rhodotorula glutinis ou Flavobacterium johnsoniae ; en particulier une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 41 et 39 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; de préférence une TAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) from Rhodotorula glutinis or Flavobacterium johnsoniae; in particular a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 41 and 39 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a tyrosine ammonia lyase activity; preferably a TAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity ;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl- CoA ligase (4CL) d’Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Petroselinum crispum ou Streptomyces clavuligerus ; de préférence, une 4CL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 123, 125, 43, 45, 47 et 49 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; en particulier une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NOs: 123, 125 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase, et de préférence une 4CL comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase ; a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) from Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Petroselinum crispum or Streptomyces clavuligerus; preferably, a 4CL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 123, 125, 43, 45, 47 and 49 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequenced with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; in particular a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity, and preferably a 4CL comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) de Citrus sinensis, de Hordeum vulgare ou de Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 53, 51, 55 et 57 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone synthase, de préférence une CHS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) of Citrus sinensis, of Hordeum vulgare or of Streptomyces clavuligerus, in particular a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 53, 51, 55 and 57 and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone synthase activity, preferably a CHS comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI) d’Arabidopsis thaliana ou Streptomyces clavuligerus, en particulier une CHI comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 61 et 59 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité chalcone isomérase, de préférence une CHI comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase. - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI) of Arabidopsis thaliana or Streptomyces clavuligerus, in particular a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 61 and 59 and polypeptides comprising a sequence having at least 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting chalcone isomerase activity, preferably a CHI comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone isomerase activity.
12. Microorganisme selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend : 12. Microorganism according to claim 10 or 11, characterized in that it comprises:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl- CoA ligase (4CL) comprenant une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO: 123, 125 et 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; et une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 123, 125 and 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85 , 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; and a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity in sequence with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase. a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity.
13. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend : 13. Microorganism according to any one of claims 10 to 12, characterized in that it comprises:
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity sequenced with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl- CoA ligase (4CL) comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 4-coumarate-CoA ligase ; une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; et a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % sequence identity with this sequence and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity; a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting chalcone synthase activity; and
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CH I) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase . a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CH I) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity.
14. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H). 14. Microorganism according to any one of claims 1 to 13, characterized in that it further comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H).
15. Microorganisme selon la revendication 14, caractérisé en ce que le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) de Callistephus chinensis, Péri lia frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis ou Pilosella officinarum, en particulier de Callistephus chinensis, Perilla frutescens var. crispa, Pétunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana ou Pilosella officinarum, de préférence une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7, 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 et 121 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase, de préférence sélectionnée parmi les enzymes de SEQ ID NOs: 7, 11, 17, et 121 et les polypeptides ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase. 15. Microorganism according to claim 14, characterized in that the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) from Callistephus chinensis, Peri lia frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana, Citrus clementina, Osteospermum hybrid cultivar, Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces avermitilis or Pilosella officinarum, in particular Callistephus chinensis, Perilla frutescens var. crispa, Petunia x hybrida, Gerbera hybrida, Citrus sinensis, Arabidopsis thaliana or Pilosella officinarum, preferably an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19 , 21 and 121 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably selected from among the enzymes of SEQ ID NOs: 7, 11, 17, and 121 and the polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid activity 3'- monooxygenase.
16. Microorganisme selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'-monooxygénase (F3'H) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 7, 17, et 121 et les polypeptides ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'- monooxygénase, et de préférence une F3'H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 7 et les polypeptides ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase. 16. Microorganism according to claim 14 or 15, characterized in that the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3′-monooxygenase (F3′H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 7, 17, and 121 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, and preferably an F3'H comprising a selected sequence from SEQ ID NO: 7 and polypeptides having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity.
17. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl-transférase (OMT). 17. Microorganism according to any one of claims 1 to 16, characterized in that it further comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT).
18. Microorganisme selon la revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl- transférase (OMT)de Citrus, en particulier Citrus clementina ou Citrus sinensis, d'Homo sapiens ou d’Arahidopsis thaliana, de préférence une enzyme comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 119, 117, 87 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité O-méthyltransférase. 18. Microorganism according to claim 17, characterized in that the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT) from Citrus, in particular Citrus clementina or Citrus sinensis, from Homo sapiens or from 'Arahidopsis thaliana, preferably an enzyme comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 119, 117, 87 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity.
19. Microorganisme selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl- transférase (OMT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 119, 117 et 89 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité O- méthyltransférase, de préférence une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 119 et 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant l'activité O- méthyltransférase. 19. Microorganism according to claim 17 or 18, characterized in that it further comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 119, 117 and 89 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity, preferably a sequence chosen from SEQ ID NOs : 119 and 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting O-methyltransferase activity.
20. Microorganisme selon l'une quelconques des revendications 1 à 19, comprenant en outre 20. A microorganism according to any one of claims 1 to 19, further comprising
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) , en particulier une PAL comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 63, 65 et 77, de préférence SEQ ID NO : 65 et 77, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase, et de manière plus particulièrement préférée une phénylalanine ammonia lyase (PAL) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL), in particular a PAL comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 63, 65 and 77, preferably SEQ ID NOs: 65 and 77, and the polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting a phenylalanine ammonia lyase activity, and more particularly preferably a phenylalanine ammonia lyase (PAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H), en particulier une C4H comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 67, 69, 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase ; et de manière tout particulièrement préférée une cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4-hydroxylase. - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H), in particular a C4H comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 67, 69, 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity; and very particularly preferably a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity.
21. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, comprenant en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une flavone synthase (FNS). 21. Microorganism according to any one of claims 1 to 20, further comprising a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS).
22. Microorganisme selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) d’Arabidopsis thaüana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoïdes, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus varscolymus, Saussurea medusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perillafrutescens var crispa, Dahlia pinnata ou Erythranthe lewisii, de préférence de Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, et Petroselinum crispum ; de préférence une FNS comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 et 159 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ I D NOs: 33, 35 et 37 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavone synthase, de préférence une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase. 22. Microorganism according to claim 21, characterized in that it comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) of Arabidopsis thaüana, Lonicera japonica, Lonicera macranthoides, Medicago truncatula, Oryza sativa, Petroselinum crispum, Populus deltoids, Zea mays, Callistephus chinensis, Apium graveolens, Medicago truncatula, Cuminum cyminum, Aethusa cynapium, Angelica archangelica, Conium maculatum, Camellia sinensis, Cynara cardunculus varscolymus, Saussurea medusa, Plectranthus barbatus, Scutellaria baicalensis, Dorcoceras hygrometricum, Antirrhinum majus, Perillafrutescens var crispa, Dahlia pinnata or Erythranthe lewisii, preferably from Lonicera japonelinhoides, Lonicumeraides crispa; preferably an FNS comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably from enzymes comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 33, 35 and 37 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavone synthase activity, preferably a flavone synthase (FNS) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting flavone synthase activity .
23. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, comprenant en outre 23. Microorganism according to any one of claims 1 to 22, further comprising
une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome
P450 réductase (CPR) ; et/ou P450 reductase (CPR); and or
une séquence d'acide nucléique hétérologue ou endogène codant pour une a heterologous or endogenous nucleic acid sequence encoding a
S-adénosylméthionine synthétase (SAMT). S-adenosylmethionine synthetase (SAMT).
24. Microorganisme selon la revendication 23, caractérisé en ce que le microorganisme comprend une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) de Saccharomyces cerevisiae, ou de plante, par exemple de Catharanthus roseus ou d'Arabidopsis thaliana ; de préférence une CPR comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 25, 23, 27, 29 et 31 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, de préférence parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 23, 25 et 29 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase, et de manière particulière parmi les enzymes comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cytochrome P450 réductase. 24. Microorganism according to claim 23, characterized in that the microorganism comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) of Saccharomyces cerevisiae, or of a plant, for example of Catharanthus roseus or of Arabidopsis thaliana; preferably a CPR comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 25, 23, 27, 29 and 31 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with a of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, preferably from enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 23, 25 and 29 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting cytochrome P450 reductase activity, and in particular among enzymes comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity.
25. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que le microrganisme comprend : 25. Microorganism according to any one of claims 1 to 24, characterized in that the microorganism comprises:
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une phénylalanine ammonia lyase (PAL) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 65 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité phénylalanine ammonia lyase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a phenylalanine ammonia lyase (PAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 65 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting phenylalanine ammonia lyase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cinnamate 4- hydroxylase (C4H) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 79 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité cinnamate 4- hydroxylase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 79 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting cinnamate 4-hydroxylase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 41 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité tyrosine ammonia lyase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a tyrosine ammonia lyase (TAL) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting tyrosine ammonia lyase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprenant une séquence sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 45 ou 123 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant une activité 4- coumarate-CoA ligase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 45 or 123 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting 4-coumarate-CoA ligase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone synthase (CHS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 53 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone synthase; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone synthase (CHS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 53 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting chalcone synthase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une chalcone isomérase (CHI) comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 61 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité chalcone isomérase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a chalcone isomerase (CHI) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 61 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting chalcone isomerase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavonoïde 3'- monooxygénase (F3'H) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 7, 17 et 121, et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec l'une de ces séquences et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase, de préférence une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 7 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant l'activité flavonoïde 3'-monooxygénase ; - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3'-monooxygenase (F3'H) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 7, 17 and 121, and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80 , 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity, preferably a sequence chosen from SEQ ID NO: 7 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7 and exhibiting the flavonoid 3'-monooxygenase activity;
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavone synthase (FNS) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 37 et un polypeptide comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavone synthase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavone synthase (FNS) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 37 and a polypeptide comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity of sequence with this sequence and exhibiting flavone synthase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une cytochrome P450 réductase (CPR) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 25 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquences et présentant une activité cytochrome P450 réductase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a cytochrome P450 reductase (CPR) comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 25 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% of sequence identity with this sequence and exhibiting cytochrome P450 reductase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une O-méthyl- transférase (OMT) comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs 117 et 119 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec l'une de ces séquences et présentant l'activité O-méthyl-transférase, de préférence une OMT comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO 117 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité avec cette séquence et présentant l'activité O-méthyl-transférase, et - une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une flavanone 7-0- bêta-D-glucosyltransférase comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 113 et 95 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec une de ces séquences et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase, de préférence comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 113 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité flavanone 7-O-bêta-D-glucosyltransférase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding an O-methyl-transferase (OMT) comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs 117 and 119 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95 % identity with one of these sequences and exhibiting O-methyl-transferase activity, preferably an OMT comprising a sequence chosen from SEQ ID NO 117 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with this sequence and exhibiting O-methyl-transferase activity, and - a heterologous nucleic acid sequence encoding a flavanone 7-0-beta-D-glucosyltransferase comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 113 and 95 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with one of these sequences and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity, preferably comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 113 and polypeptides comprising a sequence having at least at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with that sequence and exhibiting flavanone 7-O-beta-D-glucosyltransferase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une 6"-0- rhamnosyltransferase comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 103 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité 6"-0- rhamnosyltransferase ; et - a heterologous nucleic acid sequence encoding a 6 "-O-rhamnosyltransferase comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 103 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% d sequence identity with this sequence and exhibiting 6 "-O-rhamnosyltransferase activity; and
- une séquence d'acide nucléique hétérologue codant pour une UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase comprenant une séquence choisie parmi la SEQ ID NO: 107 et les polypeptides comprenant une séquence ayant au moins 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 % d'identité de séquence avec cette séquence et présentant une activité UDP-glucose 4,6- déshydratase/UDP-4-kéto-6-désoxy-D-glucose 3,5-épimerase/UDP-4-kéto-L-rhamnose- réductase. - a heterologous nucleic acid sequence encoding a UDP-glucose 4,6- dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose- reductase comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 107 and polypeptides comprising a sequence having at least 60, 70, 80, 85, 90 or 95% sequence identity with this sequence and exhibiting UDP-glucose activity 4,6 - dehydratase / UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase / UDP-4-keto-L-rhamnose-reductase.
26. Microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-25, dans lequel le microorganisme est une levure ou une bactérie, de préférence une levure du genre Saccharomyces, en particulier Saccharomyces cerevisiae ou une bactérie comme Escherichio coli. 26. Microorganism according to any one of claims 1-25, in which the microorganism is a yeast or a bacterium, preferably a yeast of the genus Saccharomyces, in particular Saccharomyces cerevisiae or a bacterium such as Escherichio coli.
27. Utilisation d'un microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-26 pour produire de la diosmine et/ou de l'hespéridine. 27. Use of a microorganism according to any one of claims 1-26 for producing diosmin and / or hesperidin.
28. Méthode de production de la diosmine et/ou de l'hespéridine comprenant la culture d'un microorganisme selon l'une quelconque des revendications 1-26 et la récolte de la diosmine et de l'hespéridine. 28. A method of producing diosmin and / or hesperidin comprising culturing a microorganism according to any one of claims 1-26 and harvesting diosmin and hesperidin.
29. Utilisation selon la revendication 27 ou méthode selon la revendication 28, pour la production d'hespéridine. 29. Use according to claim 27 or a method according to claim 28, for the production of hesperidin.
30. Utilisation selon la revendication 27 ou méthode selon la revendication 28, pour la production de diosmine. 30. Use according to claim 27 or a method according to claim 28, for the production of diosmin.
31. Utilisation selon la revendication 27 ou méthode selon la revendication 28, pour la production d'hespéridine et de diosmine. 31. Use according to claim 27 or method according to claim 28, for the production of hesperidin and diosmin.
32. Utilisation selon la revendication 27, 29, 30 ou 31 ou méthode selon la revendication 28-31, caractérisée en ce qu'il n'y a pas d'apport de naringénine, d'apigénine, d'ériodictyol, de lutéoline, d'hespérétine et/ou de diosmétine dans le milieu de culture. 32. Use according to claim 27, 29, 30 or 31 or method according to claim 28-31, characterized in that there is no contribution of naringenin, apigenin, erodictyol, luteolin, hesperetin and / or diosmetin in the culture medium.
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