EP4055142A1 - Recombinant yeast capable of producing caffeic acid and/or ferulic acid - Google Patents

Recombinant yeast capable of producing caffeic acid and/or ferulic acid

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EP4055142A1
EP4055142A1 EP20816552.2A EP20816552A EP4055142A1 EP 4055142 A1 EP4055142 A1 EP 4055142A1 EP 20816552 A EP20816552 A EP 20816552A EP 4055142 A1 EP4055142 A1 EP 4055142A1
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EP
European Patent Office
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acid
gene encoding
shikimate
caffeic acid
recombinant yeast
Prior art date
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Pending
Application number
EP20816552.2A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Clémentine FOJCIK
André Le Jeune
Lorène TELOT
Cyril SAGUEZ
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Abolis Biotechnologies
Original Assignee
Abolis Biotechnologies
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Abstract

The present invention concerns a recombinant microorganism, preferably a recombinant yeast, capable of producing caffeic acid, comprising a heterologous gene coding for an enzyme of the hydrolase family capable of breaking, preferably hydrolysing, the caffeoyl-shikimate bond in order to produce caffeic acid from caffeoyl-shikimate. The microorganism, preferably said recombinant yeast, may also be capable of producing ferulic acid from the caffeic acid obtained. The present invention also concerns a method for producing caffeic acid and a method for producing caffeic acid and/or ferulic acid, using microorganisms, preferably yeasts, according to the invention. Finally, the invention also concerns the use of microorganisms, preferably yeasts, according to the invention in order to produce caffeic acid and/or ferulic acid.

Description

LEVURE RECOMBINANTE CAPABLE DE PRODUIRE DE L’ACIDE CAFEIQUE ET/OU DE RECOMBINANT YEAST CAPABLE OF PRODUCING CAFEIC ACID AND / OR
L’ACIDE FERULIQUE FERULIC ACID
DOMAINE DE L'INVENTION FIELD OF THE INVENTION
La présente invention concerne un micro-organisme recombinant, de préférence une levure recombinante, capable de produire de l’acide caféique comprenant un gène hétérologue codant pour une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate. Ledit micro-organisme, de préférence ladite levure recombinante, peut également être capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu. La présente invention concerne également une méthode de production d’acide caféique et une méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique, à l’aide des micro organismes, de préférences des levures, selon l’invention. Enfin, l’invention concerne également l’utilisation des micro-organismes, de préférence des levures, selon l’invention pour produire de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique. The present invention relates to a recombinant microorganism, preferably a recombinant yeast, capable of producing caffeic acid comprising a heterologous gene encoding an enzyme of the hydrolase family capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caffeoyl bond. -shikimate to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate. Said microorganism, preferably said recombinant yeast, may also be capable of producing ferulic acid from the resulting caffeic acid. The present invention also relates to a method of producing caffeic acid and a method of producing caffeic acid and / or ferulic acid, using microorganisms, preferably yeasts, according to the invention. Finally, the invention also relates to the use of the microorganisms, preferably yeasts, according to the invention to produce caffeic acid and / or ferulic acid.
ETAT DE LA TECHNIQUE STATE OF THE ART
L’acide férulique est un acide organique hydroxycinnamique présent dans de nombreuses plantes, et participant à la synthèse de la lignine. Cette molécule est utilisée dans de nombreuses applications. Dans le domaine cosmétique et thérapeutique, l’acide férulique est connu pour ses propriétés antioxydantes car réagissant avec les radicaux libres tels que les dérivés réactifs de l'oxygène. Des recherches sont également effectuées sur des applications dans la maladie d’Alzheimer, dans les maladies cardiovasculaires, dans le diabète, dans l’athérosclérose, dans les maladies coronariennes dans les pathologies inflammatoires ou encore dans les cancers. En dehors de ces applications en santé humaine, l’acide férulique est également utilisé en alimentaire pour ses propriétés antimicrobiennes de conservation, et en tant que précurseur dans la fabrication de la vanilline, un aromatisant souvent utilisé à la place de l'extrait naturel de vanille. La production d’acide férulique est ainsi un besoin ne cessant de croître, à mesure de la caractérisation de ses propriétés. Ferulic acid is an organic hydroxycinnamic acid found in many plants and involved in the synthesis of lignin. This molecule is used in many applications. In cosmetics and therapy, ferulic acid is known for its antioxidant properties because it reacts with free radicals such as reactive oxygen derivatives. Research is also being carried out on applications in Alzheimer's disease, in cardiovascular disease, in diabetes, in atherosclerosis, in coronary heart disease in inflammatory pathologies or in cancer. Apart from these applications in human health, ferulic acid is also used in food for its preservative antimicrobial properties, and as a precursor in the manufacture of vanillin, a flavoring often used in place of the natural extract of vanilla. The production of ferulic acid is thus an ever-increasing need, as its properties are characterized.
L’acide caféique est un précurseur de l’acide férulique, qui est synthétisé dans les plantes en tant également qu’intermédiaire de la synthèse de la lignine. Cette molécule est principalement utilisée pour ses propriétés anti-inflammatoires, antivirales, anti-cancéreuse et antioxydantes. Aujourd’hui, l’acide férulique est principalement récupéré par hydrolyse chimique de biomasses lignocellulosiques. Le rendement d’extraction de ce procédé est cependant relativement faible et entraîne par conséquent un coût de production de l’acide férulique au kilogramme particulièrement important. Caffeic acid is a precursor of ferulic acid, which is synthesized in plants as an intermediary in the synthesis of lignin. This molecule is mainly used for its anti-inflammatory, antiviral, anti-cancer and antioxidant properties. Today, ferulic acid is mainly recovered by chemical hydrolysis of lignocellulosic biomasses. The extraction yield of this process is however relatively low and consequently entails a particularly high production cost of the ferulic acid per kilogram.
La production d’acide férulique a de fait été envisagée chez Escherichia coli, mais bien que les taux de production des intermédiaires de la voie soient élevés, le rendement final de production d’acide férulique reste limité (Kang S. -Y. , Choi O., Lee K. J., Hwang B. Y., Uhm T. -B., Hong Y.S. 2012. Artificial biosynthesis of phenylpropanoic acids in a tyrosine overproducing Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories 11 :153.). Ferulic acid production has indeed been considered in Escherichia coli, but although production rates of pathway intermediates are high, the final ferulic acid production yield remains limited (Kang S. -Y., Choi O., Lee KJ, Hwang BY, Uhm T. -B., Hong YS 2012. Artificial biosynthesis of phenylpropanoic acids in a tyrosine overproducing Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories 11: 153.).
L'extraction de l'acide caféique est également réalisée à partir de matières végétales, ce qui de la même façon que pour l’acide férulique entraîne un faible rendement et des coûts de production élevée. Extraction of caffeic acid is also carried out from plant materials, which similar to ferulic acid results in low yield and high production costs.
Une voie de production de l’acide caféique a été décrite chez la levure (Liu L., Liu H., Zhang W., Yao M., Li B., Liu D., Yuan Y. 2019. Engineering the biosynthesis of caffeic Acid in Saccharomyces cerevisiae with heterologous enzyme combinations. Enginneering 5 : 287- 295). Elle consiste en la conversion directe de l’acide p-coumarique en acide caféique via une unique étape d’hydroxylation. Cependant, les hydroxylases utilisées lors de ces études, SAM5 (Zhang H., Stephanopoulos G. 2012. Engineering E. coli for caffeic acid biosynthesis from renewable sugars. Applied Microbiology and Biotechnology 97:3333-3341 ), COUM3H, HpaBC (Furuya T. & Kino K. 2014. Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid dérivatives. Appl Microbiol Biotechnol 98:1145-1154.) et Cyp199A2 (Furuya T. & Kino K. 2014. Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid dérivatives. Appl Microbiol Biotechnol 98:1145-1154), sont relativement peu efficaces chez la levure, présageant un faible rendement de production. A pathway for the production of caffeic acid has been described in yeast (Liu L., Liu H., Zhang W., Yao M., Li B., Liu D., Yuan Y. 2019. Engineering the biosynthesis of caffeic Acid in Saccharomyces cerevisiae with heterologous enzyme combinations. Enginneering 5: 287-295). It consists of the direct conversion of p-coumaric acid into caffeic acid via a single hydroxylation step. However, the hydroxylases used in these studies, SAM5 (Zhang H., Stephanopoulos G. 2012. Engineering E. coli for caffeic acid biosynthesis from renewable sugars. Applied Microbiology and Biotechnology 97: 3333-3341), COUM3H, HpaBC (Furuya T . & Kino K. 2014. Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid derivatives. Appl Microbiol Biotechnol 98: 1145-1154.) And Cyp199A2 (Furuya T. & Kino K. 2014. Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid derivative. Appl Microbiol Biotechnol 98: 1145-1154), are relatively ineffective in yeast, suggesting a low yield of production.
Ainsi, il subsiste le besoin d’améliorer les rendements de production d’acide caféique et d’acide férulique, tout en baissant les coûts de sa production. Thus, there remains the need to improve the production yields of caffeic acid and ferulic acid, while lowering the costs of its production.
Le concept inventif général commun à cette invention est une nouvelle méthode de synthèse de ces molécules en passant par une voie métabolique alternative ayant pour intermédiaire principal le caféoyl-shikimate dans un même micro-organisme, de préférence une même levure, recombinant. De manière surprenante, la Demanderesse a découvert qu’un micro-organisme recombinant, de préférence une levure recombinante, comprenant des gènes provenant de plantes, et plus particulièrement issus de la voie de biosynthèse de la lignine, permettait de produire de l’acide caféique et de l’acide férulique à partir notamment de glucose, permettant d’augmenter les rendements de production de ces composés et d’en baisser le coût. The general inventive concept common to this invention is a new method of synthesizing these molecules via an alternative metabolic pathway having as main intermediate caffeoyl-shikimate in the same recombinant microorganism, preferably the same yeast. Surprisingly, the Applicant has discovered that a recombinant microorganism, preferably a recombinant yeast, comprising genes originating from plants, and more particularly originating from the lignin biosynthetic pathway, made it possible to produce caffeic acid. and ferulic acid, in particular from glucose, making it possible to increase the production yields of these compounds and to reduce their cost.
EXPOSE DE L'INVENTION DISCLOSURE OF THE INVENTION
Selon un premier aspect, l’invention consiste en un micro-organisme recombinant, de préférence une levure recombinante, capable de produire de l’acide caféique, comprenant According to a first aspect, the invention consists of a recombinant microorganism, preferably a recombinant yeast, capable of producing caffeic acid, comprising
- Un gène hétérologue codant pour une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate. - A heterologous gene encoding an enzyme of the hydrolase family capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caffeoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate.
On entend par micro-organisme un organisme vivant de taille microscopique, notamment les bactéries ou champignons unicellulaires telles que les levures, ou toutes cellules procaryotes ou eucaryotes. By microorganism is meant a living organism of microscopic size, in particular bacteria or unicellular fungi such as yeasts, or any prokaryotic or eukaryotic cells.
Par « micro-organisme recombinant » est entendu selon l’invention un microorganisme qui a été modifiée génétiquement par l’introduction et optionnellement la modulation de l’expression et/ou le blocage et/ou l’inactivation de gènes. By "recombinant microorganism" is understood according to the invention a microorganism which has been genetically modified by the introduction and optionally the modulation of the expression and / or the blocking and / or the activation of genes.
Les levures sont des micro-organismes eucaryotes unicellulaires du règne fongique. Yeasts are unicellular eukaryotic microorganisms of the fungal kingdom.
Par « levure recombinante » est entendu selon l’invention une levure qui a été modifiée génétiquement par l’introduction et optionnellement la modulation de l’expression et/ou le blocage et/ou l’inactivation de gènes. By "recombinant yeast" is understood according to the invention a yeast which has been genetically modified by the introduction and optionally the modulation of the expression and / or the blocking and / or the activation of genes.
De manière préférée, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une caféoyl-shikimate estérase (CSE). Preferably, the enzyme capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate is a caféoyl-shikimate esterase (CSE).
La réaction opérée est décrite dans la Figure 1. L’acide caféique est un phénylpropanoïde et un acide-phénol présent chez les plantes, et agissant en tant qu’intermédiaire dans la biosynthèse de la lignine. La formule chimique brute de l’acide caféique est C9H8O4 et sa masse molaire est de 180,16g/mol. La structure chimique de l’acide caféique est : The reaction carried out is described in Figure 1. Caffeic acid is a phenylpropanoid and an acid-phenol present in plants, and acting as an intermediate in the biosynthesis of lignin. The crude chemical formula of caffeic acid is C9H8O4 and its molar mass is 180.16g / mol. The chemical structure of caffeic acid is:
[Chem 1] [Chem 1]
Par « gène hétérologue » est entendu que le gène a été introduit par génie génétique dans la cellule. Il peut y être présent sous forme épisomale ou chromosomique. L’origine du gène peut être différente de la cellule dans laquelle il est introduit. Cependant, le gène peut également provenir de la même espèce que la cellule dans laquelle il est introduit mais il est considéré comme hétérologue en raison de son environnement qui n’est pas naturel. Par exemple, le gène est hétérologue car il est sous le contrôle d’un promoteur autre que son promoteur naturel, il est introduit dans un endroit différent de celui-ci où il est situé naturellement. La cellule hôte peut contenir une copie du gène endogène préalablement à l’introduction du gène hétérologue ou elle peut ne pas contenir de copie endogène. Par ailleurs, la séquence d’acide nucléique peut être hétérologue dans le sens où la séquence codante a été optimisée pour l’expression dans le microorganisme hôte. By “heterologous gene” is understood that the gene has been introduced by genetic engineering into the cell. It can be present there in episomal or chromosomal form. The origin of the gene may be different from the cell into which it is introduced. However, the gene can also come from the same species as the cell into which it is introduced but it is considered heterologous due to its unnatural environment. For example, the gene is heterologous because it is under the control of a promoter other than its natural promoter, it is introduced in a place different from this one where it is naturally located. The host cell may contain a copy of the endogenous gene prior to the introduction of the heterologous gene, or it may not contain an endogenous copy. Additionally, the nucleic acid sequence may be heterologous in that the coding sequence has been optimized for expression in the host microorganism.
Par « produire de l’acide caféique » est entendu l’obtention de ce composé, incluant sa synthèse, grâce au micro-organisme recombinant, de préférence la levure recombinante, selon l’invention. Par « hydrolase » est entendu une enzyme capable de casser une liaison covalente, de préférence par hydrolyse. By "producing caffeic acid" is meant the obtaining of this compound, including its synthesis, by the recombinant microorganism, preferably the recombinant yeast, according to the invention. By “hydrolase” is meant an enzyme capable of breaking a covalent bond, preferably by hydrolysis.
Par « rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate » est entendu la décomposition chimique et enzymatique cassant une liaison covalente de ce composé par voie enzymatique, de préférence par hydrolyse, afin de permettre la production de shikimate et d’acide caféique. By "breaking, preferably hydrolyzing, the caffeoyl-shikimate bond" is understood the chemical and enzymatic decomposition breaking a covalent bond of this compound by enzymatically, preferably by hydrolysis, to allow the production of shikimate and caffeic acid.
Une caféoyl-shikimate estérase (CSE) est une enzyme capable d’hydrolyser la liaison caféoyl- shikimate. Elle existe par exemple dans la voie de biosynthèse de la lignine (Ha C.M., Escamilla-Trevino L, Yarce J.C.S., Kim H., Ralph J., Chen F., Dixon R. A. 2016. An essential rôle of caffeoyl shikimate esterase in monolignol biosynthesis in Medicago truncatula. Plant J. 86950:363-75 ; et Vanholme R., Cesarino I., Rataj K., Xiao Y., Sundin L., Goeminne G., Kim H., Cross J., Morreel K., Araujo P., Welsh L., Haustraete J., McClellan C., Vanholme B., Ralph J., Simpson G. G., Halpin C., Boerjan W. 2013. Caffeoyl shikimate esterase (CSE) is an enzyme in the lignin biosynthetic pathway in Arabidopsis. Science 341 :1103-6.). A caffeoyl-shikimate esterase (CSE) is an enzyme capable of hydrolyzing the caffeoyl-shikimate bond. It exists, for example, in the lignin biosynthesis pathway (Ha CM, Escamilla-Trevino L, Yarce JCS, Kim H., Ralph J., Chen F., Dixon RA 2016. An essential role of caffeoyl shikimate esterase in monolignol biosynthesis in Medicago truncatula. Plant J. 86950: 363-75; and Vanholme R., Cesarino I., Rataj K., Xiao Y., Sundin L., Goeminne G., Kim H., Cross J., Morreel K., Araujo P., Welsh L., Haustraete J., McClellan C., Vanholme B., Ralph J., Simpson GG, Halpin C., Boerjan W. 2013. Caffeoyl shikimate esterase (CSE) is an enzyme in the lignin biosynthetic pathway in Arabidopsis. Science 341: 1103-6.).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CSE est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote. Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a CSE is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) et présentant une activité caféoyl-shikimate estérase. According to one embodiment, the heterologous gene encoding a CSE is the CSE gene from Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of the CSE of Medicago truncatula (MtCSE) and exhibiting cafeoyl-shikimate esterase activity.
Medicago truncatula, ou luzerne tronquée, est une espèce de la famille des Fabaceae, de la sous-famille des Faboideae. Medicago truncatula, or truncated alfalfa, is a species of the Fabaceae family, of the Faboideae subfamily.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) et présentant une activité caféoyl- shikimate estérase. According to one embodiment, the heterologous gene encoding a CSE is the CSE gene of Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of the CSE of Arabidopsis thaliana (AtCSE) and exhibiting caffeoylshikimate esterase activity.
Arabidopsis thaliana ou Arabette des dames est une espèce de la famille des Brassicacées.Arabidopsis thaliana or Arabette des dames is a species of the Brassicaceae family.
Selon un mode de réalisation, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une chlorogénique acide estérase (ChlE). Une chlorogénique acide estérase (ChlE) est une enzyme ayant classiquement une activité d'hydrolyse de l'acide chlorogénique, et utilisé ici pour hydrolyser la liaison caféoyl-shikimate et ainsi produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate. According to one embodiment, the enzyme capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate is a chlorogenic acid esterase (ChlE). Chlorogenic acid esterase (ChlE) is an enzyme conventionally having chlorogenic acid hydrolysis activity, and used herein to hydrolyze the caffeoyl-shikimate bond and thereby produce caffeic acid from caffeoyl-shikimate.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1 :789353-790141 , GenBank, SEQ ID NO. 4) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1: 789353-790141, GenBank, SEQ ID NO. 4) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
Bifidobacterium animalis subsp. Lactis est une espèce de bactérie lactique isolée de matières fécales de poulet, de lapin et de l’homme, ainsi que du lait fermenté. Bifidobacterium animalis subsp. Lactis is a species of lactic acid bacteria isolated from the feces of chickens, rabbits and humans, as well as fermented milk.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1 , GenBank, SEQ ID NO. 15) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene from Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1, GenBank, SEQ ID NO. 15) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Ustilago maydis (UmChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
Ustilago maydis est un champignon pathogène causant notamment le charbon du maïs. Ustilago maydis is a pathogenic fungus causing smut in corn in particular.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1 : 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1: 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) or a gene encoding a sequence having at at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Lactobacillus johnsonii (LaChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
Lactobacillus johnsonii est une bactérie lactique faisant partie du microbiote vaginal sain. Lactobacillus johnsonii is a lactic acid bacteria that is part of the healthy vaginal microbiota.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1 :2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. Salinibacter ruber est une bactérie rouge halophile qui se développe dans un environnement très concentré en sel. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1: 2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) or a gene encoding a sequence having at at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of Salinibacter ruber ChlE (SrChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity. Salinibacter ruber is a halophilic red bacterium that thrives in an environment with a high salt content.
Par « pourcentage d’identité » entre deux séquences de gène au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d’identité entre les deux séquences à comparer est le plus élevé. The term “percentage identity” between two gene sequences within the meaning of the present invention is intended to denote a percentage of nucleotides or of identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed at random and over their entire length. The best alignment or optimal alignment is the alignment for which the percentage identity between the two sequences to be compared is the highest.
De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre : Preferably according to the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, further comprises:
- Un gène hétérologue codant pour une enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A. - A heterologous gene encoding an enzyme capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A.
De manière préférée, l’enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A est une 4-coumarate-CoA ligase (4CL). Preferably, the enzyme capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A is a 4-coumarate-CoA ligase (4CL).
Par capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A, est entendu selon l’invention qu’à partir de ces deux composés, l’enzyme est capable de produire du coumaroyl-CoA. Cette réaction enzymatique fait intervenir de ATR et peut se réaliser en une ou plusieurs étapes. By capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A, it is understood according to the invention that from these two compounds, the enzyme is capable of producing coumaroyl-CoA. This enzymatic reaction involves ATR and can be carried out in one or more steps.
Une 4-coumarate-CoA ligase (4CL) est une enzyme qui catalyse la formation de coumaroyl- CoA à partir de l’acide coumarique et du coenzyme A. A 4-coumarate-CoA ligase (4CL) is an enzyme that catalyzes the formation of coumaroyl-CoA from coumaric acid and coenzyme A.
De manière préférée selon l’invention le gène hétérologue codant pour une 4CL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote. Preferably, according to the invention, the heterologous gene encoding a 4CL is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism.
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour ladite 4CL est muté afin de diminuer l’affinité de ladite 4CL mutée pour l’acide caféique et d’accroître sa spécificité pour l’acide p-coumarique par rapport au gène parent codant pour une 4CL non mutée. Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding said 4CL is mutated in order to decrease the affinity of said mutated 4CL for caffeic acid and to increase its specificity for p-coumaric acid relative to the parent gene. encoding an unmutated 4CL.
Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10). Populus tomentosa ou peuplier blanc de chine est une espèce de la famille des Salicaceae.According to one embodiment, 4CL is 4CL from Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10). Populus tomentosa or Chinese white poplar is a species of the Salicaceae family.
Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa, l’acide aminé : According to one embodiment, in the case where the 4CL is the 4CL of Populus tomentosa, the amino acid:
- à la position 236 est une Alanine (Y236A) ou une Phénylalanine (Y236F) ; et/ou - at position 236 is an Alanine (Y236A) or a Phenylalanine (Y236F); and or
- à la position 240 est une Alanine (S240A) ; et/ou - at position 240 is an Alanine (S240A); and or
- à la position 305 est une Alanine (G305A) ; et/ou - at position 305 is an Alanine (G305A); and or
- à la position 329 est une Alanine (G329A) - at position 329 is an Alanine (G329A)
Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1 ). According to one embodiment, the 4CL is the 4CL of Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1).
Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana, l’acide aminé : According to one embodiment, in the case where the 4CL is the 4CL of Arabidopsis thaliana, the amino acid:
- à la position 264 est une Alanine (S264A) ; et/ou - at position 264 is an Alanine (S264A); and or
- à la position 329 est une Alanine (G329A) ; et/ou - at position 329 is an Alanine (G329A); and or
- à la position 353 est une Alanine (G353A). - at position 353 is an Alanine (G353A).
Une 4CL n’étant pas spécifique de l’acide p-coumarique et acceptant également comme substrat l’acide caféique, ce dernier libéré par la CSE est susceptible d’être de nouveau converti en caféoyl-CoA par la 4CL. Ces mutations sont réalisées pour pallier ce problème, et diminuer l’affinité de la 4CL pour l’acide caféique tout en améliorant sa spécificité pour l’acide p-coumarique. Since 4CL is not specific for p-coumaric acid and also accepts caffeic acid as a substrate, the latter released by CSE is likely to be converted back to caffeoyl-CoA by 4CL. These mutations are made to overcome this problem, and decrease the affinity of 4CL for caffeic acid while improving its specificity for p-coumaric acid.
Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Streptomyces coelicolor (CAB95894.1 , Genbank, SEQ ID NO. 12). According to one embodiment, the 4CL is the 4CL of Streptomyces coelicolor (CAB95894.1, Genbank, SEQ ID NO. 12).
Streptomyces coelicolor est une bactérie Gram positive du sol. Streptomyces coelicolor is a Gram positive soil bacterium.
De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre : Preferably according to the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, further comprises:
- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et - A heterologous gene encoding a Hydroxycinnamoyl-Transferase (HCT); and
- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et - A heterologous gene encoding a Coumarate 3 Hydroxylase (C3H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H). De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre : - A heterologous gene encoding a Tyrosine Amonia Lyase (TAL), and / or a heterologous gene encoding a Phenylalanine Amonia-Lyase (PAL) and a heterologous gene encoding a Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H). Preferably according to the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, further comprises:
- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ). - A heterologous gene encoding a Cytochrome P450 reductase (CPR1).
Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre : According to one embodiment of the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, further comprises:
- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et - A heterologous gene encoding a Hydroxycinnamoyl-Transferase (HCT); and
- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et - A heterologous gene encoding a Coumarate 3 Hydroxylase (C3H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H) ; et - A heterologous gene encoding a Tyrosine Amonia Lyase (TAL), and / or a heterologous gene encoding a Phenylalanine Amonia-Lyase (PAL) and a heterologous gene encoding a Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ). - A heterologous gene encoding a Cytochrome P450 reductase (CPR1).
Une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) est une enzyme de la famille des transférases, qui catalyse la réaction : 4-coumaroyl-CoA + shikimate ^ CoA + 4-coumaroylshikimate. A Hydroxycinnamoyl-Transferase (HCT) is an enzyme of the transferase family, which catalyzes the reaction: 4-coumaroyl-CoA + shikimate ^ CoA + 4-coumaroylshikimate.
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une HCT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding an HCT is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7).
Une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) est une enzyme impliquée dans la synthèse de la lignine, et qui catalyse la production de caféoyl shikimate à partir de coumaroyl shikimate. Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) is an enzyme involved in the synthesis of lignin, and which catalyzes the production of caféoyl shikimate from coumaroyl shikimate.
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une C3H est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a C3H is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5).
Une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ) est une oxydoréductase membranaire qui permet le transfert d'électrons du NADPH au cytochrome P450. A Cytochrome P450 reductase (CPR1) is a membrane oxidoreductase which allows the transfer of electrons from NADPH to cytochrome P450.
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CPR1 est un gène provenant d‘un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Catharanthus roseus (X69791.1 , GenBank, SEQ ID NO. 6). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a CPR1 is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Catharanthus roseus (X69791.1, GenBank, SEQ ID NO. 6).
Catharanthus roseus, ou pervenche de Madagascar, est une plante de la famille des Apocynaceae originaire de Madagascar. Une Tyrosine Amonia Lyase (TAL) est une enzyme qui transforme la tyrosine en acide p- coumarique avec libération d’ammoniac. Catharanthus roseus, or Madagascar periwinkle, is a plant of the Apocynaceae family native to Madagascar. Tyrosine Amonia Lyase (TAL) is an enzyme that converts tyrosine to p-coumaric acid with the release of ammonia.
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une TAL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Rhodotorula glutinis (KF765779.1 , GenBank, SEQ ID NO. 14). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a TAL is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Rhodotorula glutinis (KF765779.1, GenBank, SEQ ID NO. 14).
Rhodotorula glutinis est une levure rose du genre Rhodotorula. Rhodotorula glutinis is a pink yeast of the genus Rhodotorula.
Une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) est une enzyme qui catalyse la transformation de la phénylalanine en acide cinnamique, avec libération d'ammoniac. A Phenylalanine Amonia-Lyase (PAL) is an enzyme that catalyzes the transformation of phenylalanine into cinnamic acid, with the release of ammonia.
Une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H), ou T rans-cinnamate 4-monooxygénase, est une enzyme qui transforme l'acide trans-cinnamique (CA) en acide p-coumarique. A Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H), or T rans-cinnamate 4-monooxygenase, is an enzyme that converts trans-cinnamic acid (CA) into p-coumaric acid.
De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre : Preferably according to the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, further comprises:
- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou - A gene encoding a 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutated so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and or
- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent. - A gene encoding a mutated chorismate mutase (AR07) so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene.
De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre l’invalidation pour : Preferably according to the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, further comprises the invalidation for:
- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (AR010). - a gene encoding a Phenylpyruvate decarboxylase (AR010).
Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre : According to one embodiment of the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, further comprises:
- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou - A gene encoding a 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutated so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and or
- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou l’invalidation de : - A gene encoding a mutated chorismate mutase (AR07) so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and / or the invalidation of:
- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (AR010). Par « invalidation » est entendu la suppression ou l’inhibition de l’expression du gène, et ainsi la suppression ou l’inhibition de l’activité de l’enzyme. - a gene encoding a Phenylpyruvate decarboxylase (AR010). By "invalidation" is meant the suppression or inhibition of the expression of the gene, and thus the suppression or inhibition of the activity of the enzyme.
Une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04), ou DAHP synthase est une transférase qui intervient à la première étape de la voie du shikimate, et qui catalyse la réaction : phosphoénolpyruvate + D-érythrose-4-phosphate + H20 ^ 3-désoxy-D- arabinoheptulosonate-7-phosphate + phosphate. A 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04), or DAHP synthase is a transferase which occurs at the first step of the shikimate pathway, and which catalyzes the reaction: phosphoenolpyruvate + D-erythrose-4-phosphate + H20 ^ 3 -deoxy-D- arabinoheptulosonate-7-phosphate + phosphate.
Une chorismate mutase (AR07) est une isomérase qui intervient dans la voie du shikimate, et qui est connue pour catalyser une réaction péricyclique. Cette enzyme catalyse la réaction : chorismate ^ préphénate. A chorismate mutase (AR07) is an isomerase which is involved in the shikimate pathway, and which is known to catalyze a pericyclic reaction. This enzyme catalyzes the reaction: chorismate ^ prephenate.
AR04 et AR07 sont deux gènes impliqués dans la synthèse de novo des acides aminés aromatiques tels que la phénylalanine et de la tyrosine chez la levure. AR04 and AR07 are two genes involved in the de novo synthesis of aromatic amino acids such as phenylalanine and tyrosine in yeast.
De manière préférée, le gène AR04 (NP_009808, GenBank) est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 229 soit une Leucine (K229L). Preferably, the AR04 gene (NP_009808, GenBank) is mutated so that the amino acid at position 229 is Leucine (K229L).
De manière préférée, le gène AR07 (NP_015385, GenBank) est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 141 soit une Sérine (G141S). Preferably, the AR07 gene (NP_015385, GenBank) is mutated so that the amino acid at position 141 is a Serine (G141S).
Ces mutations de AR04 et AR07 ont pour effet d’optimiser une production accrue des acides aminés aromatiques chez la levure. These mutations in AR04 and AR07 have the effect of optimizing increased production of aromatic amino acids in yeast.
Une Phenylpyruvate decarboxylase (AR010) est une enzyme impliquée notamment dans la dégradation de la phénylalanine et de la tyrosine chez la levure. A Phenylpyruvate decarboxylase (AR010) is an enzyme involved in particular in the degradation of phenylalanine and tyrosine in yeast.
Conjointes, les mutations d’AR04 et AR07 et l’invalidation de AR010 sont réalisées pour optimiser une production accrue des acides aminés aromatiques tels la phénylalanine et la tyrosine. Together, mutations of AR04 and AR07 and invalidation of AR010 are performed to optimize increased production of aromatic amino acids such as phenylalanine and tyrosine.
Selon un mode de réalisation, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, est capable de produire de l’acide férulique. According to one embodiment, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, is capable of producing ferulic acid.
De manière préférée, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, est capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, et comprend en outre : Preferably, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, is capable of producing ferulic acid from caffeic acid. obtained, and further includes:
- Un gène hétérologue codant pour une caféoyl-O-méthyl transférase (COMT). - A heterologous gene encoding a caffeoyl-O-methyl transferase (COMT).
De manière encore plus préférée, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu comprend en outre : Even more preferably, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, capable of producing ferulic acid from the caffeic acid obtained further comprises:
- Un gène codant pour la S-Adénosylméthyltransférase (SAM2). - A gene encoding S-Adenosylmethyltransferase (SAM2).
L’acide férulique est un acide organique hydroxycinnamique présent dans de nombreuses plantes, et participant à la synthèse de la lignine. Ferulic acid is an organic hydroxycinnamic acid found in many plants and involved in the synthesis of lignin.
La formule chimique brute de l’acide férulique est C10H10O4 et ce composé a une masse molaire de 194,18 g/mol. The crude chemical formula of ferulic acid is C 10 H 10 O 4 and this compound has a molar mass of 194.18 g / mol.
La structure chimique de l’acide férulique est : [Chem 2] The chemical structure of ferulic acid is: [Chem 2]
Une S-Adénosylméthyltransférase, ou S-adénosylméthionine synthase 2 (SAM2) catalyse la formation de S-adénosylméthionine à partir de méthionine et dATP. La réaction comprend deux étapes catalysées par la même enzyme : la formation de S-adénosylméthionine et de triphosphate et l'hydrolyse ultérieure du triphosphate. Dans le cadre de l’invention, elle permet de transformer la méthionine en S-adenosylméthionine et en S- adenosilhomocysteine, ce qui permet la méthylation de l’acide caféique en acide férulique.An S-Adenosylmethyltransferase, or S-adenosylmethionine synthase 2 (SAM2) catalyzes the formation of S-adenosylmethionine from methionine and dATP. The reaction consists of two steps catalyzed by the same enzyme: the formation of S-adenosylmethionine and triphosphate and the subsequent hydrolysis of the triphosphate. In the context of the invention, it converts methionine into S-adenosylmethionine and S-adenosilhomocysteine, which allows the methylation of caffeic acid into ferulic acid.
De préférence, le gène de SAM2 est le gène SAM2 de S accharomyces cerevisiae et est une copie de celui compris naturellement (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11 ). Preferably, the SAM2 gene is the SAM2 gene of S. accharomyces cerevisiae and is a copy of that understood naturally (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11).
Une caféoyl-O-méthyl Transférase (COMT) est une enzyme qui catalyse la réaction : S- adénosyl-L-méthionine + acide caféique ^ S-adénosyl-L-homocystéine + acide férulique. De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour la COMT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g54160, GenBank, SEQ ID NO. 2). A caffeoyl-O-methyl transferase (COMT) is an enzyme which catalyzes the reaction: S-adenosyl-L-methionine + caffeic acid ^ S-adenosyl-L-homocysteine + ferulic acid. Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding COMT is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis thaliana (At5g54160, GenBank, SEQ ID NO. 2).
De manière préférée, ladite levure selon l’invention capable de produire de l’acide férulique comprend en outre l’invalidation du gène codant pour une ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1 ). Preferably, said yeast according to the invention capable of producing ferulic acid further comprises the invalidation of the gene encoding a ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1).
Une ferulic acid decarboxylase est une enzyme qui catalyse la décarboxylation d'acides carboxyliques aromatiques tels que l'acide férulique, l'acide p-coumarique ou l'acide cinnamique, produisant les dérivés vinyliques correspondants 4-vinylphénol, 4-vinylguaiacol et styrène, respectivement, qui jouent le rôle des métabolites aromatiques. A ferulic acid decarboxylase is an enzyme which catalyzes the decarboxylation of aromatic carboxylic acids such as ferulic acid, p-coumaric acid or cinnamic acid, producing the corresponding vinyl derivatives 4-vinylphenol, 4-vinylguaiacol and styrene, respectively, which play the role of aromatic metabolites.
De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, est une espèce de l’embranchement des Ascomycota, de préférence choisie parmi les genres Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora et/ou Zygosaccharomyces. Preferably according to the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, is a species of the branching of Ascomycota, preferably chosen from the genera Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora and / or Zygosaccharomyces.
De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, est de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. Preferably according to the invention, said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, is of the species Saccharomyces cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae est une levure eucaryote unicellulaire, se présentant sous forme ovoïdes à arrondies, d’environ 6 à 12 pm de longueur et de 6 à 8 pm de largeur. Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryotic yeast, occurring in ovoid to rounded form, about 6 to 12 µm in length and 6 to 8 µm in width.
Selon un mode de réalisation où l’ensemble des gènes abordés ci-dessus sont respectivement introduits et/ou invalidés, les voies métaboliques de production de l’acide caféique et de l’acide férulique chez la levure selon l’invention sont illustrées en figure 2. According to one embodiment where all of the genes discussed above are respectively introduced and / or invalidated, the metabolic pathways for the production of caffeic acid and of ferulic acid in yeast according to the invention are illustrated in FIG. 2.
Selon un deuxième aspect, l’invention concerne un procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique, comprenant l’introduction de : According to a second aspect, the invention relates to a process for modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce caffeic acid, comprising the introduction of:
- Un gène hétérologue codant pour une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate. De manière préférée, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une caféoyl-shikimate estérase (CSE). - A heterologous gene encoding an enzyme of the hydrolase family capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate. Preferably, the enzyme capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate is a caféoyl-shikimate esterase (CSE).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CSE est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote. Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a CSE is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) et présentant une activité caféoyl-shikimate estérase. According to one embodiment, the heterologous gene encoding a CSE is the CSE gene from Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of the CSE of Medicago truncatula (MtCSE) and exhibiting cafeoyl-shikimate esterase activity.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) et présentant une activité caféoyl- shikimate estérase. According to one embodiment, the heterologous gene encoding a CSE is the CSE gene of Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of the CSE of Arabidopsis thaliana (AtCSE) and exhibiting caffeoylshikimate esterase activity.
Selon un mode de réalisation, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une chlorogénique acide estérase (ChlE). According to one embodiment, the enzyme capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate is a chlorogenic acid esterase (ChlE).
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1 :789353-790141 , GenBank, SEQ ID NO. 4) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1: 789353-790141, GenBank, SEQ ID NO. 4) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1 , GenBank, SEQ ID NO. 15) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1 : 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene from Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1, GenBank, SEQ ID NO. 15) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Ustilago maydis (UmChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1: 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) or a gene encoding a sequence having at at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Lactobacillus johnsonii (LaChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1 :2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1: 2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) or a gene encoding a sequence having at at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of Salinibacter ruber ChlE (SrChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de : Preferably according to the invention, said method of modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce caffeic acid further comprises the introduction of:
- Un gène hétérologue codant pour une enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A. - A heterologous gene encoding an enzyme capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A.
De manière préférée, l’enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A est une 4-coumarate-CoA ligase (4CL). Preferably, the enzyme capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A is a 4-coumarate-CoA ligase (4CL).
De manière préférée selon l’invention le gène hétérologue codant pour une 4CL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote. Preferably, according to the invention, the heterologous gene encoding a 4CL is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism.
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une 4CL est muté afin de diminuer l’affinité de ladite 4CL mutée pour l’acide caféique et d’accroître sa spécificité pour l’acide p-coumarique par rapport au gène parent codant pour une 4CL non mutée. Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a 4CL is mutated in order to decrease the affinity of said mutated 4CL for caffeic acid and to increase its specificity for p-coumaric acid relative to the parent gene. encoding an unmutated 4CL.
Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10). According to one embodiment, 4CL is 4CL from Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10).
Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa, l’acide aminé : According to one embodiment, in the case where the 4CL is the 4CL of Populus tomentosa, the amino acid:
- à la position 236 est une Alanine (Y236A) ou une Phénylalanine (Y236F) ; et/ou - à la position 240 est une Alanine (S240A) ; et/ou - at position 236 is an Alanine (Y236A) or a Phenylalanine (Y236F); and or - at position 240 is an Alanine (S240A); and or
- à la position 305 est une Alanine (G305A) ; et/ou - at position 305 is an Alanine (G305A); and or
- à la position 329 est une Alanine (G329A) - at position 329 is an Alanine (G329A)
Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1 ). According to one embodiment, the 4CL is the 4CL of Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1).
Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana, l’acide aminé : According to one embodiment, in the case where the 4CL is the 4CL of Arabidopsis thaliana, the amino acid:
- à la position 264 est une Alanine (S264A) ; et/ou - at position 264 is an Alanine (S264A); and or
- à la position 329 est une Alanine (G329A) ; et/ou - at position 329 is an Alanine (G329A); and or
- à la position 353 est une Alanine (G353A). - at position 353 is an Alanine (G353A).
Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Streptomyces coelicolor (CAB95894.1 , Genbank, SEQ ID NO. 12). According to one embodiment, the 4CL is the 4CL of Streptomyces coelicolor (CAB95894.1, Genbank, SEQ ID NO. 12).
De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de : Preferably according to the invention, said method of modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce caffeic acid further comprises the introduction of:
- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et - A heterologous gene encoding a Hydroxycinnamoyl-Transferase (HCT); and
- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et - A heterologous gene encoding a Coumarate 3 Hydroxylase (C3H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H). - A heterologous gene encoding a Tyrosine Amonia Lyase (TAL), and / or a heterologous gene encoding a Phenylalanine Amonia-Lyase (PAL) and a heterologous gene encoding a Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H).
De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de : Preferably according to the invention, said method of modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce caffeic acid further comprises the introduction of:
- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ). - A heterologous gene encoding a Cytochrome P450 reductase (CPR1).
Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de : According to one embodiment of the invention, said method of modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce caffeic acid further comprises the introduction of:
- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et - A heterologous gene encoding a Hydroxycinnamoyl-Transferase (HCT); and
- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et - Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H) ; et - A heterologous gene encoding a Coumarate 3 Hydroxylase (C3H); and - A heterologous gene encoding a Tyrosine Amonia Lyase (TAL), and / or a heterologous gene encoding a Phenylalanine Amonia-Lyase (PAL) and a heterologous gene encoding a Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ). - A heterologous gene encoding a Cytochrome P450 reductase (CPR1).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une HCT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding an HCT is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une C3H est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a C3H is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CPR1 est un gène provenant d‘un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Catharanthus roseus (X69791.1 , GenBank, SEQ ID NO. 6). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a CPR1 is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Catharanthus roseus (X69791.1, GenBank, SEQ ID NO. 6).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une TAL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Rhodotorula glutinis (KF765779.1 , GenBank, SEQ ID NO. 14). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a TAL is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Rhodotorula glutinis (KF765779.1, GenBank, SEQ ID NO. 14).
De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de : Preferably according to the invention, said method of modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce caffeic acid further comprises the introduction of:
- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou - A gene encoding a 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutated so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and or
- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent. - A gene encoding a mutated chorismate mutase (AR07) so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene.
De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’invalidation pour : Preferably according to the invention, said method of modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce caffeic acid further comprises the invalidation for:
- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (AR010). Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de : - a gene encoding a Phenylpyruvate decarboxylase (AR010). According to one embodiment of the invention, said process for modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce caffeic acid further comprises the introduction of:
- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou - A gene encoding a 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutated so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and or
- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou l’invalidation de : - A gene encoding a mutated chorismate mutase (AR07) so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and / or the invalidation of:
- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (ARO10). - a gene encoding a Phenylpyruvate decarboxylase (ARO10).
De manière préférée, le gène AR04 est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 229 soit une Leucine (K229L). Preferably, the AR04 gene is mutated so that the amino acid at position 229 is Leucine (K229L).
De manière préférée, le gène AR07 est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 141 soit une Sérine (G141S). Preferably, the AR07 gene is mutated so that the amino acid at position 141 is a Serine (G141S).
De manière préférée selon l’invention, ladite levure est une espèce de l’embranchement des Ascomycota, de préférence choisie parmi les genres Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora et/ou Zygosaccharomyces. Preferably according to the invention, said yeast is a species of the Ascomycota branch, preferably chosen from the genera Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora and / or Zygosaccharomyces.
De manière préférée selon l’invention, ladite levure est de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. Preferably according to the invention, said yeast is of the species Saccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide férulique. According to one embodiment, the invention relates to a method of modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce ferulic acid.
De manière préférée, l’invention concerne un procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, comprenant en outre l’introduction de : Preferably, the invention relates to a process for modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce ferulic acid from the caffeic acid obtained, further comprising the introduction of:
- Un gène hétérologue codant pour la caféoyl-O-méthyl Transférase (COMT). - A heterologous gene encoding caffeoyl-O-methyl transferase (COMT).
De manière préférée, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, comprend en outre l’introduction de : Preferably, said method of modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce ferulic acid from the caffeic acid obtained, further comprises the introduction of:
- Un gène codant pour la S-Adénosylméthyltransférase (SAM2). De préférence, le gène de SAM2 est le gène SAM2 de Saccharomyces cerevisiae et est une copie de celui compris naturellement (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11 ). - A gene encoding S-Adenosylmethyltransferase (SAM2). Preferably, the SAM2 gene is the SAM2 gene of Saccharomyces cerevisiae and is a copy of that understood naturally (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour la COMT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g54160, GenBank, SEQ ID NO. 2). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding COMT is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis thaliana (At5g54160, GenBank, SEQ ID NO. 2).
De manière préférée, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu selon l’invention comprend en outre l’invalidation du gène codant pour une ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1 ). Preferably, said process for modifying a microorganism, preferably a yeast, to produce ferulic acid from the caffeic acid obtained according to the invention further comprises the invalidation of the gene encoding a ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1).
Selon un troisième aspect, l’invention concerne une méthode de production d’acide caféique, comprenant une étape de : a. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, tels que définis selon l’invention dans un milieu de culture. According to a third aspect, the invention relates to a method for producing caffeic acid, comprising a step of: a. Culturing of the recombinant microorganisms, preferably the recombinant yeasts, as defined according to the invention in a culture medium.
De manière préférée, ladite méthode de production d’acide caféique comprend en outre une étape de : b. Récupération de l’acide caféique obtenu à l’étape a. Preferably, said method of producing caffeic acid further comprises a step of: b. Recovery of the caffeic acid obtained in step a.
Par récupération est entendu selon l’invention le fait d’isoler le composé cible, ici l’acide caféique et/ou l’acide férulique, du reste des autres composés. By recovery is understood according to the invention the fact of isolating the target compound, here caffeic acid and / or ferulic acid, from the rest of the other compounds.
Des exemples de méthodes de récupération de l’acide caféique et de l’acide férulique sont décrites dans la littérature, notamment dans Yin Y. et al., « Polydopamine-coated magnetic molecularly imprinted polymer for the sélective solid-phase extraction of cinnamic acid, ferulic acid and caffeic acid from radix scrophulariae sample », J Sep Sci. 2016 Apr;39(8):1480-8, et dans Ning Li. et al., “Séparation and purification of the antioxidant compounds, caffeic acid phenethyl ester and caffeic acid from mushrooms by molecularly imprinted polymer”, Food Chem. 2013 Aug 15; 139(1 -4): 1161 -7. Examples of methods for recovering caffeic acid and ferulic acid are described in the literature, in particular in Yin Y. et al., "Polydopamine-coated magnetic molecularly imprinted polymer for the selective solid-phase extraction of cinnamic acid , ferulic acid and caffeic acid from radix scrophulariae sample ”, J Sep Sci. 2016 Apr; 39 (8): 1480-8, and in Ning Li. Et al., “Separation and purification of the antioxidant compounds, caffeic acid phenethyl ester and caffeic acid from mushrooms by molecularly imprinted polymer”, Food Chem. 2013 Aug 15; 139 (1 -4): 1161 -7.
De manière préférée selon l’invention, l’acide caféique est produit à partir de glucose, d’acide p-coumarique, de p-coumaroyl-shikimate et/ou de caféoyl-shikimate, ajouté dans le milieu de culture avant ou à l’étape a. Preferably according to the invention, the caffeic acid is produced from glucose, p-coumaric acid, p-coumaroyl-shikimate and / or caféoyl-shikimate, added to the culture medium before or after step a.
De manière encore plus préférée, l’acide caféique est produit à partir de glucose. Selon un quatrième aspect, l’invention concerne une méthode de production d’acide férulique, comprenant une étape de : a. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, tels que définis selon l’invention dans un milieu de culture. Even more preferably, the caffeic acid is produced from glucose. According to a fourth aspect, the invention relates to a method for producing ferulic acid, comprising a step of: a. Culturing of the recombinant microorganisms, preferably the recombinant yeasts, as defined according to the invention in a culture medium.
De manière préférée, ladite méthode de production d’acide férulique comprend en outre une étape de : b. Récupération de l’acide férulique obtenu à l’étape a. Preferably, said method of producing ferulic acid further comprises a step of: b. Recovery of the ferulic acid obtained in step a.
Selon un mode de réalisation, ladite méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique, comprend une étape de : a. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, capable de produire de l’acide caféique telles que définis selon l’invention dans un milieu de culture, ou de a’. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu selon l’invention dans un milieu de culture ; l’étape a ou a’ étant de préférence suivie d’une étape de : b. Récupération de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique obtenu à l’étape a. ou a’. According to one embodiment, said method of producing caffeic acid and / or ferulic acid comprises a step of: a. Cultivation of recombinant microorganisms, preferably recombinant yeasts, capable of producing caffeic acid as defined according to the invention in a culture medium, or a ’. Cultivation of recombinant microorganisms, preferably recombinant yeasts, capable of producing ferulic acid from caffeic acid obtained according to the invention in a culture medium; step a or a ’preferably being followed by a step of: b. Recovery of caffeic acid and / or ferulic acid obtained in step a. or a ’.
De manière préférée selon l’invention, l’acide férulique est produit à partir de glucose, d’acide p-coumarique, de p-coumaroyl-shikimate et/ou de caféoyl-shikimate, ajouté dans le milieu de culture avant ou à l’étape a ou a’. Preferably according to the invention, ferulic acid is produced from glucose, p-coumaric acid, p-coumaroyl-shikimate and / or caféoyl-shikimate, added to the culture medium before or after 'step a or a'.
De manière préférée, l’acide férulique est produit à partir de glucose. Preferably, ferulic acid is produced from glucose.
Selon un cinquième aspect, l’invention concerne une méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique, comprenant une étape de : a. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu telles que définies selon l’invention dans un milieu de culture. According to a fifth aspect, the invention relates to a method for producing caffeic acid and / or ferulic acid, comprising a step of: a. Cultivation of the recombinant microorganisms, preferably the recombinant yeasts, capable of producing ferulic acid from the caffeic acid obtained as defined according to the invention in a culture medium.
De manière préférée, ladite méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique comprend en outre une étape de : b. Récupération de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique obtenu à l’étape a. De manière préférée selon l’invention, l’acide caféique et/ou l’acide férulique sont produits à partir de glucose, d’acide p-coumarique, de p-coumaroyl-shikimate et/ou de caféoyl-shikimate, ajouté dans le milieu de culture avant ou à l’étape a. Preferably, said method of producing caffeic acid and / or ferulic acid further comprises a step of: b. Recovery of the caffeic acid and / or of the ferulic acid obtained in step a. Preferably according to the invention, caffeic acid and / or ferulic acid are produced from glucose, p-coumaric acid, p-coumaroyl-shikimate and / or caféoyl-shikimate, added in the culture medium before or in step a.
De manière préférée, l’acide caféique et/ou l’acide férulique sont produits à partir de glucose. Preferably, caffeic acid and / or ferulic acid are produced from glucose.
Selon un sixième aspect, l’invention concerne l’utilisation du micro-organisme recombinant, de préférence la levure recombinante, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu selon l’invention pour produire de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique. According to a sixth aspect, the invention relates to the use of the recombinant microorganism, preferably the recombinant yeast, capable of producing ferulic acid from the caffeic acid obtained according to the invention to produce acid caffeic and / or ferulic acid.
Selon un septième aspect, l’invention concerne l’utilisation du micro-organisme recombinant, de préférence la levure recombinante, productrice d’acide caféique selon l’invention pour produire de l’acide caféique. According to a seventh aspect, the invention relates to the use of the recombinant microorganism, preferably the recombinant yeast, producing caffeic acid according to the invention to produce caffeic acid.
Selon un huitième aspect, l’invention concerne l’utilisation du micro-organisme recombinant, de préférence la levure recombinante, productrice d’acide férulique selon l’invention pour produire de l’acide férulique. According to an eighth aspect, the invention relates to the use of the recombinant microorganism, preferably the recombinant yeast, producing ferulic acid according to the invention to produce ferulic acid.
De manière préférée, l’acide férulique est produit à partir de l’acide caféique produit par ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, selon l’invention. Preferably, ferulic acid is produced from caffeic acid produced by said recombinant microorganism, preferably said recombinant yeast, according to the invention.
Selon un neuvième aspect, l’invention concerne au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprenant une séquence codante pour un gène hétérologue au micro-organisme hôte recombinant, de préférence à la levure hôte recombinante, codant une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate.According to a ninth aspect, the invention relates to at least one expression vector for the production of caffeic acid in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, comprising a coding sequence for a gene heterologous to the microorganism. recombinant host, preferably to the recombinant yeast host, encoding an enzyme of the hydrolase family capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate.
De manière préférée, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une caféoyl-shikimate estérase (CSE). De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CSE est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote. Preferably, the enzyme capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate is a caféoyl-shikimate esterase (CSE). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a CSE is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) et présentant une activité caféoyl-shikimate estérase. According to one embodiment, the heterologous gene encoding a CSE is the CSE gene from Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of the CSE of Medicago truncatula (MtCSE) and exhibiting cafeoyl-shikimate esterase activity.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) et présentant une activité caféoyl- shikimate estérase. According to one embodiment, the heterologous gene encoding a CSE is the CSE gene of Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of the CSE of Arabidopsis thaliana (AtCSE) and exhibiting caffeoylshikimate esterase activity.
Selon un mode de réalisation, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une chlorogénique acide estérase (ChlE). According to one embodiment, the enzyme capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate is a chlorogenic acid esterase (ChlE).
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1 :789353-790141 , GenBank, SEQ ID NO. 4) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1: 789353-790141, GenBank, SEQ ID NO. 4) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1 , GenBank, SEQ ID NO. 15) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene from Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1, GenBank, SEQ ID NO. 15) or a gene encoding a sequence having at least 55, 60 , 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Ustilago maydis (UmChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1 : 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1 :2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1: 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) or a gene encoding a sequence having at at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of ChlE from Lactobacillus johnsonii (LaChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity. According to one embodiment, the heterologous gene for a ChlE is the ChlE gene of Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1: 2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) or a gene encoding a sequence having at at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of Salinibacter ruber ChlE (SrChlE) and exhibiting chlorogenic acid esterase activity.
De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour un gène hétérologue codant pour une enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A. Preferably according to the invention, said at least one expression vector for the production of caffeic acid in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, further comprises a coding sequence for a heterologous gene coding for an enzyme capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A.
De manière préférée, l’enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A est une 4-coumarate-CoA ligase (4CL). Preferably, the enzyme capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A is a 4-coumarate-CoA ligase (4CL).
De manière préférée selon l’invention le gène hétérologue codant pour une 4CL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote. Preferably, according to the invention, the heterologous gene encoding a 4CL is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism.
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une 4CL est muté afin de diminuer l’affinité de ladite 4CL mutée pour l’acide caféique et d’accroître sa spécificité pour l’acide p-coumarique par rapport au gène parent codant pour une 4CL non mutée.. Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a 4CL is mutated in order to decrease the affinity of said mutated 4CL for caffeic acid and to increase its specificity for p-coumaric acid relative to the parent gene. encoding an unmutated 4CL.
Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10). According to one embodiment, 4CL is 4CL from Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10).
Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa, l’acide aminé : According to one embodiment, in the case where the 4CL is the 4CL of Populus tomentosa, the amino acid:
- à la position 236 est une Alanine (Y236A) ou une Phénylalanine (Y236F) ; et/ou - at position 236 is an Alanine (Y236A) or a Phenylalanine (Y236F); and or
- à la position 240 est une Alanine (S240A) ; et/ou - at position 240 is an Alanine (S240A); and or
- à la position 305 est une Alanine (G305A) ; et/ou - at position 305 is an Alanine (G305A); and or
- à la position 329 est une Alanine (G329A) Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1 ). - at position 329 is an Alanine (G329A) According to one embodiment, the 4CL is the 4CL of Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1).
Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana, l’acide aminé : According to one embodiment, in the case where the 4CL is the 4CL of Arabidopsis thaliana, the amino acid:
- à la position 264 est une Alanine (S264A) ; et/ou - at position 264 is an Alanine (S264A); and or
- à la position 329 est une Alanine (G329A) ; et/ou - at position 329 is an Alanine (G329A); and or
- à la position 353 est une Alanine (G353A). - at position 353 is an Alanine (G353A).
Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Streptomyces coelicolor (CAB95894.1 , Genbank, SEQ ID NO. 12). According to one embodiment, the 4CL is the 4CL of Streptomyces coelicolor (CAB95894.1, Genbank, SEQ ID NO. 12).
De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour : Preferably according to the invention, said at least one expression vector for the production of caffeic acid in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, further comprises a coding sequence for:
- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et - A heterologous gene encoding a Hydroxycinnamoyl-Transferase (HCT); and
- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et - A heterologous gene encoding a Coumarate 3 Hydroxylase (C3H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H). - A heterologous gene encoding a Tyrosine Amonia Lyase (TAL), and / or a heterologous gene encoding a Phenylalanine Amonia-Lyase (PAL) and a heterologous gene encoding a Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H).
De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour : Preferably according to the invention, said at least one expression vector for the production of caffeic acid in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, further comprises a coding sequence for:
- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ). - A heterologous gene encoding a Cytochrome P450 reductase (CPR1).
Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour : According to one embodiment of the invention, said at least one expression vector for the production of caffeic acid in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, further comprises a coding sequence for:
- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et - A heterologous gene encoding a Hydroxycinnamoyl-Transferase (HCT); and
- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et - A heterologous gene encoding a Coumarate 3 Hydroxylase (C3H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H) ; et - A heterologous gene encoding a Tyrosine Amonia Lyase (TAL), and / or a heterologous gene encoding a Phenylalanine Amonia-Lyase (PAL) and a heterologous gene encoding a Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ). De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une HCT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7). - A heterologous gene encoding a Cytochrome P450 reductase (CPR1). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding an HCT is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une C3H est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a C3H is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CPR1 est un gène provenant d‘un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Catharanthus roseus (X69791.1 , GenBank, SEQ ID NO. 6). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a CPR1 is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Catharanthus roseus (X69791.1, GenBank, SEQ ID NO. 6).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une TAL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Rhodotorula glutinis (KF765779.1 , GenBank, SEQ ID NO. 14). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding a TAL is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Rhodotorula glutinis (KF765779.1, GenBank, SEQ ID NO. 14).
De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour : Preferably according to the invention, said at least one expression vector for the production of caffeic acid in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, further comprises a coding sequence for:
- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou - A gene encoding a 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutated so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and or
- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent. - A gene encoding a mutated chorismate mutase (AR07) so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene.
De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence permettant l’invalidation de :Preferably according to the invention, said at least one expression vector for the production of caffeic acid in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, further comprises a sequence allowing the invalidation of:
- un gène codant pour la Phenylpyruvate decarboxylase (AR010). - a gene encoding Phenylpyruvate decarboxylase (AR010).
Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour : According to one embodiment of the invention, said at least one expression vector for the production of caffeic acid in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, further comprises a coding sequence for:
- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou - Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou l’invalidation de : - A gene encoding a 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutated so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and or - A gene encoding a mutated chorismate mutase (AR07) so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and / or invalidation of:
- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (ARO10). - a gene encoding a Phenylpyruvate decarboxylase (ARO10).
De manière préférée, le gène AR04 est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 229 soit une Leucine (K229L). Preferably, the AR04 gene is mutated so that the amino acid at position 229 is Leucine (K229L).
De manière préférée, le gène AR07 est muté de façon à ce que l’acide aminéà la position 141 soit une Sérine (G141S). Preferably, the AR07 gene is mutated so that the amino acid at position 141 is a Serine (G141S).
Selon un mode de réalisation, ledit au moins un vecteur d’expression dans un micro organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, permet la production d’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, et comprend en outre une séquence codante pour : According to one embodiment, said at least one vector for expression in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, allows the production of ferulic acid from the caffeic acid obtained, and further comprises a sequence coding for:
- Un gène hétérologue codant pour la caféoyl-O-méthyl Transférase (COMT). - A heterologous gene encoding caffeoyl-O-methyl transferase (COMT).
De manière préférée, ledit au moins un vecteur d’expression dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, permettant la production d’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu comprend en outre une séquence codante pour : Preferably, said at least one expression vector in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, allowing the production of ferulic acid from the caffeic acid obtained further comprises a coding sequence for:
- Un gène codant pour la S-Adénosylméthyltransférase (SAM2). - A gene encoding S-Adenosylmethyltransferase (SAM2).
De manière préférée, ladite levure est une espèce de l’embranchement des Ascomycota, de préférence choisie parmi les genres Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora et/ou Zygosaccharomyces.Preferably, said yeast is a species of the Ascomycota branch, preferably chosen from the genera Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora and / or Zygosaccharomyces.
De manière préférée, ladite levure est de l’espèce Saccharomyces Cerevisiae. Preferably, said yeast is of the species Saccharomyces Cerevisiae.
De préférence, le gène de SAM2 est le gène SAM2 de Saccharomyces cerevisiae et est une copie de celui compris naturellement (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11 ). Preferably, the SAM2 gene is the SAM2 gene of Saccharomyces cerevisiae and is a copy of that understood naturally (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11).
De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour la COMT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis Thaliana (At5g54160, UniProtKB). De manière préférée, ledit au moins un vecteur d’expression dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, permettant la production d’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu comprend en outre une séquence permettant l’invalidation du gène codant pour une ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1 ). Preferably according to the invention, the heterologous gene encoding COMT is a gene originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably Arabidopsis Thaliana (At5g54160, UniProtKB). Preferably, said at least one vector for expression in a recombinant host microorganism, preferably a recombinant host yeast, allowing the production of ferulic acid from the caffeic acid obtained further comprises a sequence allowing the invalidation of the gene encoding a ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1).
L'invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, d’exemples de mise en oeuvre non limitatifs de l'invention, et à l'examen des figures annexées, sur lesquelles : The invention may be better understood on reading the detailed description which follows, of non-limiting examples of implementation of the invention, and on examining the appended figures, in which:
DESCRIPTION DES FIGURES DESCRIPTION OF FIGURES
[Fig. 1] illustre la réaction d’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la caféoyl-shikimate estérase (CSE) selon l’invention. [Fig. 1] illustrates the hydrolysis reaction of caféoyl-shikimate to caffeic acid and shikimate using the caféoyl-shikimate esterase (CSE) according to the invention.
[Fig. 2] illustre les voies métaboliques de production de l’acide caféique et de l’acide férulique chez la levure selon un mode de réalisation de l’invention. [Fig. 2] illustrates the metabolic pathways for the production of caffeic acid and ferulic acid in yeast according to one embodiment of the invention.
[Fig. 3] illustre la production d’acide caféique chez une levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention à partir de p-coumarique ou de glucose en passant par une CSE (méthode UHPLC-TQ), à 24h, 48h et 72h. [Fig. 3] illustrates the production of caffeic acid in a recombinant yeast according to one embodiment of the invention from p-coumaric or from glucose via CSE (UHPLC-TQ method), at 24h, 48h and 72h.
[Fig. 4] illustre la production des différents intermédiaires produits par la levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention, analysé par une méthode qualitative (méthode UHPLC-HRMS (Spectrométrie de masse haute résolution). [Fig. 4] illustrates the production of the various intermediates produced by recombinant yeast according to one embodiment of the invention, analyzed by a qualitative method (UHPLC-HRMS method (high resolution mass spectrometry).
[Fig. 5] illustre l’analyse des composés présents dans le surnageant de culture de levures recombinantes selon un mode de réalisation l’invention, la présence des composés étant déterminée par la méthode UHPLC-TQ. Le premier pic avec un temps de rétention de 2.1 min correspond à l’acide caféique et le second à 3,25 min à l’acide férulique. [Fig. 5] illustrates the analysis of the compounds present in the culture supernatant of recombinant yeasts according to one embodiment of the invention, the presence of the compounds being determined by the UHPLC-TQ method. The first peak with a retention time of 2.1 min corresponds to caffeic acid and the second at 3.25 min to ferulic acid.
[Fig. 6] est un chromatographe caractérisant la production d’acide férulique chez la levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention à partir de glucose. Le pic à 2,01 correspond à l’acide caféique et le pic à 3,15 correspond à l’acide férulique. [Fig. 6] is a chromatograph characterizing the production of ferulic acid in recombinant yeast according to an embodiment of the invention from glucose. The peak at 2.01 corresponds to caffeic acid and the peak at 3.15 corresponds to ferulic acid.
[Fig. 7] est un chromatogramme caractérisant l’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la CSE (provenant de Medicago truncatula, MtCSE) chez la levure levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention. Le pic avec un temps de rétention de 3,23 min correspond à l’acide caféique et le second à 3,78 min au caféoyl-shikimate. [Fig. 8] est un chromatogramme caractérisant l’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la ChlE (provenant de Lactobacillus johnsonii, LaChlE) chez la levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention. Le pic avec un temps de rétention de 3,19 min correspond à l’acide caféique. [Fig. 9] est un chromatogramme caractérisant la présence de caféoyl-shikimate dans les échantillons témoins. Le pic avec un temps de rétention de 3,88 min correspond au caféoyl- shikimate. [Fig. 7] is a chromatogram characterizing the hydrolysis of caféoyl-shikimate to caffeic acid and shikimate using CSE (from Medicago truncatula, MtCSE) in recombinant yeast according to one embodiment of the invention. The peak with a retention time of 3.23 min corresponds to caffeic acid and the second at 3.78 min to caféoyl-shikimate. [Fig. 8] is a chromatogram characterizing the hydrolysis of caféoyl-shikimate to caffeic acid and shikimate using ChlE (from Lactobacillus johnsonii, LaChlE) in recombinant yeast according to one embodiment of the invention. The peak with a retention time of 3.19 min corresponds to caffeic acid. [Fig. 9] is a chromatogram characterizing the presence of caféoyl-shikimate in the control samples. The peak with a retention time of 3.88 min corresponds to caffeoyl-shikimate.
EXEMPLES Exemple 1 : Matériels et méthodes : EXAMPLES Example 1: Materials and methods:
Les standards pour l’acide p-coumarique, l’acide caféique et l’acide férulique ont été obtenus chez le fournisseur Sigma-Aldrich. Standards for p-coumaric acid, caffeic acid and ferulic acid were obtained from the supplier Sigma-Aldrich.
Clonage des gènes : Les gènes AR04 (NP_009808, Genbank) et AR07 (NP_015385, Genbank) ont été amplifiés par PCR à partir de l’ADN génomique de S. cerevisiae, puis ont été mutés afin que leur produit soit résistant à la rétro-inhibition (FBR: Feed Back Résistance) (Gold et al. Microbial Cell Factories (2015)). 14:73, voir pages 11 à 16 et fichiers additionnels). Pour AR04, ceci correspond à la mutation K229L, et pour AR07 à la mutation G141S. Gene cloning: The AR04 (NP_009808, Genbank) and AR07 (NP_015385, Genbank) genes were amplified by PCR from the genomic DNA of S. cerevisiae, then were mutated so that their product was resistant to retro- inhibition (FBR: Feed Back Resistance) (Gold et al. Microbial Cell Factories (2015)). 14:73, see pages 11 to 16 and additional files). For AR04, this corresponds to the K229L mutation, and for AR07 to the G141S mutation.
Les gènes obtenus par synthèse ou PCR comprennent à l’extrémité 5’ et 3’, un site de restriction Bbs\ (GAAGAC) ou Bsa\ (GGTCTC), compatible avec le système de clonage utilisé. Tous les gènes, promoteurs et terminateurs ont été clonés par restriction dans le vecteur pSBK. Les promoteurs et terminateurs (Wargner et al., 2015) ont été amplifiés par PCR à partir de l’ADN génomique de la levure S. cerevisiae. The genes obtained by synthesis or PCR include at the 5 ’and 3’ end, a Bbs \ (GAAGAC) or Bsa \ (GGTCTC) restriction site, compatible with the cloning system used. All genes, promoters and terminators were restriction cloned into the pSBK vector. Promoters and terminators (Wargner et al., 2015) were amplified by PCR from the genomic DNA of the yeast S. cerevisiae.
Le vecteur pSBK comprend un marqueur de sélection de la levure : URA3, LEU2 ou TRP1. Tableau 1 : Les différents gènes utilisés pour réaliser une levure recombinante selon l’invention. Mutation de la 4CL : The vector pSBK comprises a yeast selection marker: URA3, LEU2 or TRP1. Table 1: The different genes used to produce a recombinant yeast according to the invention. Mutation of the 4CL:
Les mutants Y236A et Y236F de la 4CL de P. tomentosa ont été construits par PCR. Délétion des gènes : P. tomentosa 4CL mutants Y236A and Y236F were constructed by PCR. Gene deletion:
Les gènes AR010 (YDR380W) et FDC1 (YDR539W) ont été invalidés par délétion, c’est à dire par intégration en lieu et place du cadre de lecture ouvert, d’un ADN linéaire comprenant un marqueur de sélection borné par les régions amont et aval du gène. The AR010 (YDR380W) and FDC1 (YDR539W) genes were invalidated by deletion, i.e. by integration instead of the open reading frame, of a linear DNA comprising a selection marker bounded by the upstream regions and downstream of the gene.
Souches : Strains:
Le modèle levure utilisé dans cette étude est la souche FY1679-28A de Saccharomyces cerevisiae (Tettelin et al., 1995 - tableau 1 page 85), auxotrophe pour l’uracile, le tryptophane, et la leucine. Les constructions ont été réalisées dans la souche d ’Escherichia coli MH1 avant leur transfert chez la levure. The yeast model used in this study is Saccharomyces cerevisiae strain FY1679-28A (Tettelin et al., 1995 - Table 1 page 85), auxotrophic for uracil, tryptophan, and leucine. The constructions were carried out in the strain of Escherichia coli MH1 before their transfer to yeast.
Tableau 2 : Liste des souches utilisées Table 2: List of strains used
Conditions de culture : Culture conditions:
Les souches de levure ont été cultivées 72h à 30° C, en plaque 24 puits, sous agitation continue (200 RPM), dans 1 ml de milieu SD (Dutscher, Brumath, Fr) supplémenté ou non par du CSM (Complété Supplément Mixture; Formedium, UK). Le glucose est ajouté à 20 g/L. ou de l’acide p-coumarique a été ajouté dans le milieu à une concentration de 100 mg.l-1.The yeast strains were cultured for 72 hours at 30 ° C., in a 24-well plate, with continuous stirring (200 RPM), in 1 ml of SD medium (Dutscher, Brumath, Fr) supplemented or not with CSM (Completed Supplement Mixture; Formedium, UK). Glucose is added at 20 g / L. or p-coumaric acid was added to the medium at a concentration of 100 mg.l-1.
Méthode analytique : Méthode UHPLC-TQ Préparation des échantillons : Des échantillons de 100 pL sont récupérés pour chaque expérience. 50 pL sont transférés dans une nouvelle plaque, auxquels sont ajoutés 50 pL de la solution d’étalon interne. Chaque échantillon est ensuite homogénéisé par aspiration- refoulement, puis centrifugé pendant 5 min à 3000 rpm à température ambiante. La concentration finale de l’étalon interne (Acide Protocatéchique) est de 0,5 mg/L. Analytical method: UHPLC-TQ method Preparation of samples: 100 µL samples are collected for each experiment. 50 µL are transferred to a new plate, to which are added 50 µL of the internal standard solution. Each sample is then homogenized by suction-discharge, then centrifuged for 5 min at 3000 rpm at room temperature. The final concentration of the internal standard (Protocatechic Acid) is 0.5 mg / L.
Analyse par UHPLC-TQ : Les échantillons ont été analysés par une UHPLC Vanquish-H (Thermo) couplée à un triple-quadripôle UHPLC-TQ (Thermo). La colonne est une colonne Waters Acquity UPLC@ USST3 (8 pm 2,1 X 100 mm) associée à une pré-colonne HSST3 1 ,8 pm 2,1 X 5 mm. Analysis by UHPLC-TQ: The samples were analyzed by a UHPLC Vanquish-H (Thermo) coupled to a triple-quadrupole UHPLC-TQ (Thermo). The column is a Waters Acquity UPLC @ USST3 column (8 µm 2.1 X 100 mm) associated with a 1.8 µm 2.1 X 5 mm HSST3 pre-column.
La phase mobile A est une solution de 0,1 % d’acide formique dans de l’eau de qualité LC/MS et la phase mobile B est une solution de 0,1 % d’acide formique dans de l’acétonitrile pur de qualité LC/MS. La température de la colonne est de 50° C et la température du passeur d'échantillons à 10°C. Mobile phase A is a solution of 0.1% formic acid in LC / MS grade water and mobile phase B is a solution of 0.1% formic acid in pure acetonitrile of LC / MS quality. The temperature of the column is 50 ° C and the temperature of the autosampler is 10 ° C.
Tableau 3 : conditions chromatographiques pour la détection des molécules d’intérêt : Table 3: chromatographic conditions for the detection of molecules of interest:
Les paramètres de la source électrospray sont : - voltage du spray mode positif à 4000V The parameters of the electrospray source are: - voltage of the positive mode spray at 4000V
- gaz rideau : à 50 Arb - curtain gas: at 50 Arb
- gaz auxiliaire à 15 Arb - auxiliary gas at 15 Arb
- température du tube de transfert à 300° C - temperature of the transfer tube at 300 ° C
- température du vaporisateur à 300° C Tableau 4 : Les ions suivis et les conditions de fragmentation pour les molécules d’intérêt : - vaporizer temperature at 300 ° C Table 4: The ions monitored and the fragmentation conditions for the molecules of interest:
Méthode UHPLC-HRMS (Spectrométrie de masse haute résolution) : Préparation des échantillons : Des échantillons de 100 pL sont récupérés pour chaque expérience. 50 pL sont transférés dans une nouvelle plaque, auxquels sont ajoutés 50 pL d’acétonitrile. Chaque échantillon est ensuite homogénéisé par aspiration-refoulement, puis centrifugé pendant 5 min à 3000 rpm à température ambiante. Analyse par UHPLC-HRMS : Les échantillons ont été analysés par une UHPLC Vanquish-H (Thermo) couplée à une UHPLC-HRMS. La colonne est une colonne Waters Acquity UPLC@ USST3 (8 pm 2,1 X 100 mm) associée à une pré-colonne HSST3 1 ,8 pm 2,1 X 5 mm. UHPLC-HRMS method (High resolution mass spectrometry): Preparation of the samples: Samples of 100 μL are collected for each experiment. 50 μl are transferred to a new plate, to which are added 50 μl of acetonitrile. Each sample is then homogenized by suction-discharge, then centrifuged for 5 min at 3000 rpm at room temperature. Analysis by UHPLC-HRMS: The samples were analyzed by UHPLC Vanquish-H (Thermo) coupled to UHPLC-HRMS. The column is a Waters Acquity UPLC @ USST3 column (8 µm 2.1 X 100 mm) associated with a 1.8 µm 2.1 X 5 mm HSST3 pre-column.
La phase mobile A est une solution de 0,1 % d’acide formique dans de l’eau de qualité LC/MS et la phase mobile B est une solution de 0,1 % d’acide formique dans de l’acétonitrile pur de qualité LC/MS. La température de la colonne est de 50° C et la température du passeur d’échantillons à 10°C. Mobile phase A is a solution of 0.1% formic acid in LC / MS grade water and mobile phase B is a solution of 0.1% formic acid in pure acetonitrile of LC / MS quality. The temperature of the column is 50 ° C and the temperature of the sample changer is 10 ° C.
Tableau 5 : Conditions chromatographiques pour la détection des molécules d’intérêts : Table 5: Chromatographic conditions for the detection of molecules of interest:
Les paramètres de la source électrospray sont : The parameters of the electrospray source are:
- voltage du spray mode positif à 3,10 kV - positive mode spray voltage at 3.10 kV
- gaz rideau à 50 Arb - gaz auxiliaire à 20 Arb - curtain gas at 50 Arb - auxiliary gas at 20 Arb
- température du capillaire à 350° C - capillary temperature at 350 ° C
- température de chauffage du gaz auxiliaire à 500° C - auxiliary gas heating temperature at 500 ° C
- S-lens RF à 55 V - S-lens RF at 55 V
- énergie de collision (NCE en rampe) : 20, 40, 60 - collision energy (NCE in ramp): 20, 40, 60
Tableau 6 : Ions suivis et les conditions de fragmentation pour les molécules d’intérêt : Exemple 2 : Production d’acide caféique à partir de glucose ou d’acide p-coumarique.Table 6: Ions monitored and the fragmentation conditions for the molecules of interest: Example 2: Production of caffeic acid from glucose or p-coumaric acid.
La production d'acide caféique à partir de glucose ou d’acide p-coumarique a été testée dans 4 souches, dont les différences portent sur le choix des 4CL mutées (soit Y236A soit Y236F) et des CSE utilisées (A. thaliana ou . truncatula). The production of caffeic acid from glucose or p-coumaric acid was tested in 4 strains, the differences of which relate to the choice of the mutated 4CL (either Y236A or Y236F) and of the CSEs used (A. thaliana or. truncatula).
La Figure 3 décrit les résultats de la production d’acide caféique à partir de p-coumarique ou de glucose en passant par une CSE (méthode UHPLC-TQ) à l’aide de la levure selon l’invention. Dans toutes les souches testées les gènes AR04K229L-AR07G141S-TAL-HCT-C3H- CPR1 ont été ajoutés et le gène AR010 a été invalidé par délétion. Ces souches divergent donc uniquement par les 4CL et CSE utilisées (L16A3 : 4CLY236A-AtCSE; L16B5 : 4CLY236A- MtCSE; L16C2 : 4CLY236F-AtCSE; L16D5 : 4CLY236F-MtCSE). Figure 3 depicts the results of the production of caffeic acid from p-coumaric or glucose via CSE (UHPLC-TQ method) using the yeast according to the invention. In all the strains tested, the AR04K229L-AR07G141S-TAL-HCT-C3H-CPR1 genes were added and the AR010 gene was invalidated by deletion. These strains therefore diverge only by the 4CL and CSEs used (L16A3: 4CLY236A-AtCSE; L16B5: 4CLY236A-MtCSE; L16C2: 4CLY236F-AtCSE; L16D5: 4CLY236F-MtCSE).
Les résultats présentés en Figure 3 montrent que l’association de ces différentes enzymes permet la production d’acide caféique. The results presented in Figure 3 show that the combination of these different enzymes allows the production of caffeic acid.
La meilleure condition est obtenue avec la mutation 4CL Y236A et la CSE de . truncatula (L16B5). The best condition is obtained with the 4CL Y236A mutation and CSE. truncatula (L16B5).
Exemple 3 : Production des différents intermédiaires. Example 3: Production of the various intermediates.
Les résultats présentés en Figure 4 montrent la caractérisation de la production des différents intermédiaires produits par la levure productrice d’acide caféique selon l’invention à partir de glucose ou d’acide p-coumarique, par une méthode qualitative (méthode UHPLC-HRMS). The results presented in Figure 4 show the characterization of the production of the various intermediates produced by the caffeic acid-producing yeast according to the invention from glucose or p-coumaric acid, by a qualitative method (UHPLC-HRMS method) .
Ces résultats permettent de montrer l’accumulation de chacun des intermédiaires, c’est à dire l’acide p-coumarique, le p-coumaroyl-shikimate, le caféoyl-shikimate et l’acide caféique (voir Figure 4). These results show the accumulation of each of the intermediates, i.e. p-coumaric acid, p-coumaroyl-shikimate, caféoyl-shikimate and caffeic acid (see Figure 4).
L’accumulation des différents intermédiaires démontre la possibilité de produire de l’acide caféique grâce à la levure selon l’invention, comme l’indique la présence de p-coumaroyl- shikimate et caféoyl-shikimate. The accumulation of the various intermediates demonstrates the possibility of producing caffeic acid using the yeast according to the invention, as indicated by the presence of p-coumaroyl-shikimate and caféoyl-shikimate.
Exemple 4 : Production d’acide férulique à partir d’acide p-coumarique Example 4: Production of ferulic acid from p-coumaric acid
La levure selon l’invention capable de produire de l’acide férulique possède la méthytransférase d’A rabidobsis thaliana (COMT) et est invalidée pour le gène FDC1. Cette souche a été incubée 72h en présence d’acide p-coumarique et la production d’acide caféique et d’acide férulique a été déterminée par la méthode UHPLC-TQ. The yeast according to the invention capable of producing ferulic acid possesses the methytransferase of A. rabidobsis thaliana (COMT) and is invalidated for the FDC1 gene. This strain was incubated 72 hours in the presence of p-coumaric acid and the production of caffeic acid and ferulic acid was determined by the UHPLC-TQ method.
Le chromatogramme montre une production d’acide caféique et d’acide férulique (FigureThe chromatogram shows the production of caffeic acid and ferulic acid (Figure
5). Le premier pic avec un temps de rétention de 2.1 min correspond à l’acide caféique et le second à 3,25 min à l’acide férulique. 5). The first peak with a retention time of 2.1 min corresponds to caffeic acid and the second at 3.25 min to ferulic acid.
Ces tests permettent de montrer que l’acide caféique, produit à partir d’acide p- coumarique, peut être efficacement converti en acide férulique, lorsqu’une méthyl- transférase est ajoutée à la souche productrice (Figure 5). These tests show that caffeic acid, produced from p-coumaric acid, can be efficiently converted to ferulic acid, when a methyl transferase is added to the producing strain (Figure 5).
Exemple 5 : Production d’acide férulique à partir de glucose : Example 5: Production of ferulic acid from glucose:
La levure selon l’invention capable de produire de l’acide férulique possède la méthytransférase d ’Arabidobsis thaliana (COMT) et est invalidée pour le gène FDC1. Cette souche a été incubée 72h en présence de glucose et la production d’acide férulique a été déterminée par la méthode UHPLC-TQ. The yeast according to the invention capable of producing ferulic acid possesses Arabidobsis thaliana methytransferase (COMT) and is invalidated for the FDC1 gene. This strain was incubated for 72 hours in the presence of glucose and the production of ferulic acid was determined by the UHPLC-TQ method.
Le chromatogramme montre une production d’acide caféique et d’acide férulique (FigureThe chromatogram shows the production of caffeic acid and ferulic acid (Figure
6). Le premier pic avec un temps de rétention de 2,01 min correspond à l’acide caféique et le second à 3,15 min à l’acide férulique. 6). The first peak with a retention time of 2.01 min corresponds to caffeic acid and the second at 3.15 min corresponds to ferulic acid.
Ces tests permettent de montrer que l’acide caféique produit à partir d’acide p-coumarique peut être efficacement converti en acide férulique, lorsqu’une méthyl-transférase est ajoutée à la souche productrice (Figure 6). These tests show that the caffeic acid produced from p-coumaric acid can be efficiently converted to ferulic acid, when a methyl transferase is added to the producing strain (Figure 6).
Exemple 6 : Test de l’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la CSE : Example 6: Test for hydrolysis of caféoyl-shikimate to caffeic acid and shikimate using CSE:
L’échantillon de caféoyl-shikimate a été préparé à partir du surnageant de culture d’une souche productrice. La libération d’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate a été testée à l’aide d’une souche contenant la CSE provenant de Medicago truncatula (MtCSE). The caféoyl-shikimate sample was prepared from the culture supernatant of a producer strain. The release of caffeic acid from caffeoyl-shikimate was tested using a strain containing CSE from Medicago truncatula (MtCSE).
Les résultats sont présentés en Figure 7, le premier pic avec un temps de rétention de 3,23 min correspondant à l’acide caféique et le second à 3,78 min au caféoyl-shikimate. The results are shown in Figure 7, the first peak with a retention time of 3.23 min corresponding to caffeic acid and the second at 3.78 min to caféoyl-shikimate.
Une production d’acide caféique à partir du caféoyl-shikimate en présence de la MtCSE est observée. Exemple 7 : Test de l’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la la ChLE : Production of caffeic acid from caffeoyl-shikimate in the presence of MtCSE is observed. Example 7: Test for the hydrolysis of caféoyl-shikimate to caffeic acid and shikimate using ChLE:
L’échantillon de caféoyl-shikimate a été préparé à partir du surnageant de culture d’une souche productrice. La libération d’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate a été testée à l’aide d’une souche contenant la ChlE de Lactobacillus johnsonii. The caféoyl-shikimate sample was prepared from the culture supernatant of a producer strain. The release of caffeic acid from caffeoyl-shikimate was tested using a strain containing Lactobacillus johnsonii ChlE.
Les résultats sont présentés en Figure 8. On observe un pic à un temps de rétention de 3,19 min correspondant à l’acide caféique, tout le caféoyl-shikimate ayant été consommé. Dans la Figure 9 représentant un échantillon témoin, on peut vérifier la présence de caféoyl- shikimate pour lequel on observe un pic à 3,88 min et l’absence d’acide caféique. Une production d’acide caféique à partir du caféoyl-shikimate est observée en présence de la LaChlE. The results are shown in Figure 8. A peak is observed at a retention time of 3.19 min corresponding to caffeic acid, all the caffeoyl-shikimate having been consumed. In Figure 9 representing a control sample, one can verify the presence of caffeoyl-shikimate for which a peak is observed at 3.88 min and the absence of caffeic acid. Caffeic acid production from caféoyl-shikimate is observed in the presence of LaChlE.

Claims

REVENDICATIONS
1. Levure recombinante capable de produire de l’acide caféique, caractérisée en ce qu’elle comprend : 1. Recombinant yeast capable of producing caffeic acid, characterized in that it comprises:
- Un gène hétérologue codant pour une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate. - A heterologous gene encoding an enzyme of the hydrolase family capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caffeoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate.
2. Levure recombinante selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une caféoyl-shikimate estérase (CSE). 2. Recombinant yeast according to claim 1, characterized in that the enzyme capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caféoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caféoyl-shikimate is a caféoyl-shikimate esterase (CSE).
3. Levure recombinante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le gène hétérologue codant pour la caféoyl-shikimate estérase (CSE) est le gène de la CSE de Medicago truncatula ou de Arabidopsis thaliana, de préférence de Medicago truncatula. 3. Recombinant yeast according to claim 2, characterized in that the heterologous gene encoding caffeoyl-shikimate esterase (CSE) is the CSE gene from Medicago truncatula or from Arabidopsis thaliana, preferably from Medicago truncatula.
4. Levure recombinante selon la revendication 3, caractérisée en ce que la CSE est choisie parmi les SEQ ID NOs. 9 et 3 ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d'identité avec la séquence d'acides aminés de la caféoyl-shikimate estérase (CSE) de Medicago truncatula ou d'Arabidopsis thaliana et présentant une activité caféoyl-shikimate estérase. 4. Recombinant yeast according to claim 3, characterized in that the CSE is chosen from SEQ ID NOs. 9 and 3 or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of the caffeoyl-shikimate esterase (CSE) of Medicago truncatula or of Arabidopsis thaliana and exhibiting caffeoyl-shikimate esterase activity.
5. Levure recombinante selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une chlorogénique acide estérase (ChlE). 5. Recombinant yeast according to claim 1, characterized in that the enzyme capable of breaking, preferably hydrolyzing, the caffeoyl-shikimate bond to produce caffeic acid from caffeoyl-shikimate is a chlorogenic acid esterase ( ChlE).
6. Levure recombinante selon la revendication 5, caractérisée en ce que le gène hétérologue codant pour la chlorogénique acide estérase (ChlE) est le gène de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis de Ustilago maydis, de Lactobacillus johnsonii ou de Salinibacter ruber, de préférence de Lactobacillus johnsonii. 6. Recombinant yeast according to claim 5, characterized in that the heterologous gene encoding chlorogenic acid esterase (ChlE) is the ChlE gene from Bifidobacterium animalis subsp. Lactis from Ustilago maydis, from Lactobacillus johnsonii or from Salinibacter ruber, preferably from Lactobacillus johnsonii.
7. Levure recombinante selon la revendication 6, caractérisée en ce que la ChlE est choisie parmi les SEQ ID NOs. 4 et 8 ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d'identité avec la séquence d'acides aminés de la chlorogénique acide estérase (ChlE) de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis, de Ustilago maydis, de Lactobacillus johnsonii ou de Salinibacter ruber et présentant une activité caféoyl-shikimate estérase. 7. Recombinant yeast according to claim 6, characterized in that the ChlE is chosen from SEQ ID NOs. 4 and 8 or a gene encoding a sequence having at least 55, 60, 70, 80, 85, 90 or 95% identity with the amino acid sequence of the chlorogenic acid esterase (ChlE) of Bifidobacterium animalis subsp. Lactis, Ustilago maydis, Lactobacillus johnsonii or Salinibacter ruber and exhibiting caffeoyl-shikimate esterase activity.
8. Levure recombinante selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite levure comprend en outre : - Un gène hétérologue codant pour une enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A. 8. Recombinant yeast according to any one of claims 1 to 7, characterized in that said yeast further comprises: - A heterologous gene encoding an enzyme capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A.
9. Levure recombinante selon la revendication 8, caractérisée en ce que l’enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A est une 4-coumarate-CoA ligase (4CL). 9. Recombinant yeast according to claim 8, characterized in that the enzyme capable of catalyzing the formation of the bond between coumaric acid and coenzyme A is a 4-coumarate-CoA ligase (4CL).
10. Levure recombinante selon la revendication 9, caractérisée en ce que le gène hétérologue codant pour la 4CL est le gène de la 4CL de Populus tomentosa, de Arabidopsis thaliana, ou de Streptomyces coelicolor, de préférence de Populus tomentosa. 10. Recombinant yeast according to claim 9, characterized in that the heterologous gene encoding 4CL is the 4CL gene from Populus tomentosa, from Arabidopsis thaliana, or from Streptomyces coelicolor, preferably from Populus tomentosa.
11. Levure recombinante selon les revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le gène hétérologue codant pour ladite 4CL est muté afin de diminuer l’affinité de ladite 4CL mutée pour l’acide caféique et d’accroître sa spécificité pour l’acide p-coumarique par rapport au gène parent codant pour une 4CL non mutée. 11. Recombinant yeast according to claims 9 or 10, characterized in that the heterologous gene encoding said 4CL is mutated in order to decrease the affinity of said mutated 4CL for caffeic acid and to increase its specificity for p acid. -coumaric relative to the parent gene encoding a non-mutated 4CL.
12. Levure recombinante selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisée en ce que ladite levure recombinante comprend en outre : 12. Recombinant yeast according to any one of claims 1 to 11, characterized in that said recombinant yeast further comprises:
- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et- A heterologous gene encoding a Hydroxycinnamoyl-Transferase (HCT); and
- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et - A heterologous gene encoding a Coumarate 3 Hydroxylase (C3H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H) ; et - A heterologous gene encoding a Tyrosine Amonia Lyase (TAL), and / or a heterologous gene encoding a Phenylalanine Amonia-Lyase (PAL) and a heterologous gene encoding a Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H); and
- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ). - A heterologous gene encoding a Cytochrome P450 reductase (CPR1).
13. Levure recombinante selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ladite levure recombinante comprend en outre : 13. Recombinant yeast according to any one of claims 1 to 12, characterized in that said recombinant yeast further comprises:
- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou - A gene encoding a 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutated so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and or
- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou l’invalidation de : - A gene encoding a mutated chorismate mutase (AR07) so that the product is resistant to feedback inhibition relative to the parent gene; and / or the invalidation of:
- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (ARO10). - a gene encoding a Phenylpyruvate decarboxylase (ARO10).
14. Levure recombinante selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre : 14. Recombinant yeast according to any one of claims 1 to 13, capable of producing ferulic acid from the caffeic acid obtained, characterized in that it further comprises:
- Un gène hétérologue codant pour une caféoyl-O-méthyl Transférase (COMT). - A heterologous gene encoding a caffeoyl-O-methyl transferase (COMT).
15. Levure recombinante selon la revendication 14, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre l’invalidation du gène codant pour une ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1 ) 15. Recombinant yeast according to claim 14, characterized in that it further comprises the invalidation of the gene encoding a ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1).
16. Levure recombinante selon l’une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que ladite levure est une espèce de l’embranchement des Ascomycota, de préférence choisie parmi les genres Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora et/ou Zygosaccharomyces, de manière encore plus préférée de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. 16. Recombinant yeast according to any one of claims 1 to 15, characterized in that said yeast is a species of the branching of Ascomycota, preferably chosen from the genera Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora and / or Zygosaccharomyces, even more preferably of the species Saccharomyces cerevisiae.
17. Méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique, comprenant une étape de : a. Mise en culture des levures recombinantes capable de produire de l’acide caféique telles que définies dans l’une quelconque des revendications 1 à 16 dans un milieu de culture, ou de a’. Mise en culture des levures recombinantes capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu telles que définies dans l’une quelconque des revendications 14 à 16 dans un milieu de culture ; l’étape a ou a’ étant de préférence suivie d’une étape de : b. Récupération de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique obtenu à l’étape a. ou a’. 17. A method of producing caffeic acid and / or ferulic acid, comprising a step of: a. Cultivation of recombinant yeasts capable of producing caffeic acid as defined in any one of claims 1 to 16 in a culture medium, or a '. Cultivation of recombinant yeasts capable of producing ferulic acid from the caffeic acid obtained as defined in any one of claims 14 to 16 in a culture medium; step a or a ’preferably being followed by a step of: b. Recovery of caffeic acid and / or ferulic acid obtained in step a. or a ’.
18. Méthode de production selon la revendication 17, caractérisée en ce que l’acide caféique et/ou l’acide férulique sont produits à partir de glucose, d’acide p- coumarique, de p-coumaroyl-shikimate et/ou de caféoyl-shikimate, ajouté dans le milieu de culture avant ou à l’étape a. 18. Production method according to claim 17, characterized in that the caffeic acid and / or ferulic acid are produced from glucose, p-coumaric acid, p-coumaroyl-shikimate and / or caffeoyl -shikimate, added to the culture medium before or in step a.
19. Utilisation de la levure recombinante selon l’une quelconque des revendications 1 à 16 pour produire de l’acide caféique. 19. Use of the recombinant yeast according to any one of claims 1 to 16 to produce caffeic acid.
20. Utilisation de la levure recombinante capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu selon l’une quelconque des revendications 14 à 16 pour produire de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique. 20. Use of the recombinant yeast capable of producing ferulic acid from caffeic acid obtained according to any one of claims 14 to 16 to produce caffeic acid and / or ferulic acid.
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