EP3880165A1 - Utilisation d'un compose organometallique en tant qu'agent de demethylation de l'adn - Google Patents

Utilisation d'un compose organometallique en tant qu'agent de demethylation de l'adn

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Publication number
EP3880165A1
EP3880165A1 EP19835442.5A EP19835442A EP3880165A1 EP 3880165 A1 EP3880165 A1 EP 3880165A1 EP 19835442 A EP19835442 A EP 19835442A EP 3880165 A1 EP3880165 A1 EP 3880165A1
Authority
EP
European Patent Office
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cells
organometallic compound
dna
formula
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19835442.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Stéphanie GRANDEMANGE
Antonio MONARI
Philippe Gros
Pierre François CARTRON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Lorraine
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Lorraine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite de Lorraine filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of EP3880165A1 publication Critical patent/EP3880165A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/58—Metal complex; Coordination compounds

Definitions

  • the present invention relates generally to the non-therapeutic use and the therapeutic use of compounds having a demethylating effect on DNA.
  • the invention also relates to the therapeutic use of these iron-based organometallic complexes as a medicament, for example for the treatment of proliferative pathologies, in particular of cancers.
  • Cancers are the second leading cause of death after cardiovascular disease in industrialized countries. Aside from direct DNA mutations of essential genes, the expansion of a cancer cell is frequently associated with epigenetic changes, that is, not directly encoded by the DNA sequence.
  • epigenetics indeed includes a whole set of modifications responsible for the regulation of gene expression which can be transmitted during cell division and which do not involve any change in the DNA sequence (Flintoft, 2017). This term thus groups together various processes, such as DNA methylation, post-translational modifications of histones and expression of non-coding RNA.
  • the regulation of gene expression is a phenomenon that influences most aspects of cell biology (embryogenesis, development, cell differentiation, as well as cell death) in multicellular organisms.
  • Deregulation of epigenetic changes, both in their maintenance and in their coordination, is frequently observed for various pathologies, such as inflammation, obesity, neurodegenerative and cardiovascular diseases, as well as cancers. Consequently, the search for molecules capable of regulating these processes is of major interest.
  • DNA methylation is an epigenetic process. It is the result of a methylation of cytosines to 5-methylcytosines in the CG dimers of DNA, in particular in the CpG islets. About 80% of these regions are methylated in the human genome.
  • the DNA methyltransferase (DNMTs) enzymes catalyze the addition of a methyl group originating from the donor Sadenosylmethionine on the carbon 5 of a cytosine.
  • DNMT1 which is an enzyme involved in the maintenance of epigenetic information (Leonhardt et al., 1992; Liu et al., 1998), takes as its model the half-methylated DNA strand during the replication while the enzymes DNMT3a and 3b can act on an unmethylated strand and therefore modify the epigenetic information (Okano et al., 1999).
  • DNMT2 does not show DNA methyltransferase activity. DNA methylation leads to repression of gene expression (Bird, 2002).
  • DNA demethylating agents also known by the English term “DNA hypomethylating agent”
  • DNA hypomethylating agent is based on strategies leading to indirect demethylation of DNA, in particular via inhibition enzymes responsible for the methylation thereof, namely the DNMTs described above.
  • tumor suppressor genes such as, for example, p16
  • p16 certain tumor suppressor genes
  • Inhibitors blocking DNA methyltransferase activity cause the hypomethylation of these tumor suppressor genes and thus have anticancer properties (Santini et al., 2001).
  • the different demethylating agents of DNA can be classified according to their mode of action into five different categories: 1) non-methylatable nucleoside analogs (decitabine, azacytidine), 2) inhibitors of catalytic activity (procainamide), 3) inhibitors of S-adenosylmethionine hydrolase (caldribine), 4) inhibitors of expression of DNMTs (MG98) and 5) inhibitors of the interaction of DNMTSs with their partners (UP peptide ).
  • Non-methylatable nucleoside analogs such as 5-azacytidine, Decitabine (DAC or 5-aza-2'-deoxycytidine), Zebularine (dZTP), 5-fluoro-2'- deoxycytidine (FdCyd), SGI-1 10 (modified decitabine) and CP-4200 (a derivative of 5-azacytidine) allow the capture of DNMTs on DNA having incorporated these analogs thus leading to their degradation.
  • these non-methylatable nucleoside analogs such as 5-azacytidine, or 5-aza-2’-deoxycytidine, in addition to having significant side effects, generally show high toxicity and low stability.
  • zebularin exhibits better stability (Zhou et al., 2002; Cheng et al., 2003) and lower toxicity (Cheng et al., 2004).
  • the inhibitors of the enzymatic activity of DNMTs are synthetic compounds which have an affinity for regions of DNA rich in CpG thus blocking the activity of DNMT1. These molecules have several advantages over nucleotide analogs because their use is not limited to highly proliferative cells since they directly inhibit DNMTs without requiring their incorporation into DNA.
  • DNMT synthesis such as antisense oligonucleotides and microRNAs (MG98) (Amato, 2007; Winquist et al., 2006) are based on the fact that hypermethylation is very often associated with an increase in l expression of DNMTs. Despite a strong enthusiasm for this strategy, at present, phase I or II clinical trials have revealed a lack of efficacy of these oligonucleotides.
  • the inhibitors of the interaction of DNMTs with their partners relate to peptide molecules which are capable of disturbing the association of DNMTs with some of their protein partners necessary for their functioning.
  • this approach therefore makes it possible to avoid (compared to the other modes of action mentioned above) the induction of a global hypomethylation which can be at the origin significant side effects.
  • specific inhibition of the DNMT3A / ISGF3y complex has been shown to restore sensitivity to temozolomide and thus reduce tumor growth of glioblastomas (Cheray et al., 2013, 2014; Hervouet et al., 2010).
  • complex 1 has the lowest DNA binding affinity among the three complexes tested, has no cleavage activity. DNA under UV-A or under green light.
  • Document FR 1 463 870 describes the use of organometallic complexes for the dyeing of keratin materials.
  • An object of the present invention is thus to propose new compounds which avoid, all or in part, the abovementioned drawbacks.
  • the Applicant has thus focused on the development of new demethylating compounds capable of interacting with DNA.
  • the Applicant has demonstrated that the compounds according to the invention had an antiproliferative action, in particular on cancer cells.
  • the compounds according to the invention are non-cytotoxic and thus exhibit a cytostatic effect.
  • the subject of the present invention is the non-therapeutic use, as DNA demethylation agent, of at least one organometallic compound comprising an iron atom linked to two terpyridine groups of general formula ( I) following: in which :
  • Y are each independently of the others a CH group or a nitrogen atom (the two Y groups can be identical or different);
  • Z denotes an oxygen atom, a sulfur atom or an NH group
  • the dotted line represents a C-C bond at the point of attachment of the aromatic cycle of formula (II) to (VI) to the terpyridine groups of the organometallic compound of formula (I);
  • X is a counterion
  • the present invention also relates to an organometallic compound comprising an iron atom linked to two terpyridine groups, having a general formula (I) defined above for its use as a medicament.
  • the present invention could be a pharmaceutical composition which could comprise, in a pharmaceutically acceptable carrier, at least one organometallic compound as defined above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for the rest of the description, unless otherwise specified, the indication of a range of values “from X to Y” or between “X to Y”, in the present invention, is understood to mean as including the X and Y values.
  • the present invention relates to the non-therapeutic use, as DNA demethylating agent, of at least one organometallic compound comprising an iron atom linked to two terpyridine groups of formula general (I) below:
  • Z denotes an oxygen atom, a sulfur atom or an NH group
  • the dotted line represents a C-C bond at the point of attachment of the aromatic cycle of formula (II) to (VI) to the terpyridine groups of the organometallic compound of formula (I);
  • X is a counterion
  • the terpyridine groups are ligands which are particularly suitable for the iron atom which make it possible to form a relatively stable organometallic compound and which would therefore be resistant even in a biological environment.
  • the particular configuration of the terpyridine ligands gives remarkable rigidity to the organometallic compound according to the invention.
  • the compounds of the invention may be in the form of salts, solvates and / or pharmaceutically acceptable prodrugs.
  • the pro-drugs are variants of the compounds of the invention which can be transformed in vivo into compounds of general formula (I) according to the invention.
  • the term “pharmaceutically acceptable salts or solvates” refers to salts or solvates which retain the desired biological activity as described above of the organometallic compounds of the invention and which expose to very little, even no unwanted toxicological effects.
  • alkyl designates a linear or branched, saturated or unsaturated hydrocarbon radical, advantageously having from 1 to 12 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyle, neopentyle, n-hexyle, etc. Groups having from 1 to 6 atoms and in particular from 1 to 4 carbon atoms are preferred.
  • R 1 to R 6 may correspond to a hydrogen atom.
  • organometallic compound of formula (I) can correspond to the following formula (IX):
  • R 1 , R 3 , R 4 , 6 6 may be identical and correspond to a hydrogen atom
  • organometallic compound of formula (I) can correspond to the following formula (X):
  • R 1 , R 3 , R 4 , R 6 are identical and correspond to a hydrogen atom
  • organometallic compound of formula (I) can correspond to the following formula (XI):
  • the two terpyridine groups of this compound AIM3 thus each carry a pyridine nucleus, the nitrogen atom making it possible to induce a nucleophilic effect.
  • the counterion X is chosen from: Cl, Br, I, the hexafluorophosphate of formula PF 6 , preferably the counterion is PF 6 .
  • the organometallic compound (s) are capable of causing direct demethylation of DNA.
  • organometallic compounds of formula (I) according to the invention can in particular be used in order to form biotechnology tools, for example as sequencing reagents where demethylation of DNA is required.
  • the compound or compounds of the invention can be used as a biotechnology tool, such as for example as a reagent for carrying out demethylation experiments in vitro on cells, generally tumor cells, originating from a sample taken from an animal. These experiments would make it possible, for example, to confirm the presence or not of DNA methylation phenomenon on certain genes, to block the cell proliferation of these cells and therefore to sensitize them to chemotherapy agents.
  • "By animal” according to the invention means mammals, birds, fish, insects, etc., as well as humans.
  • organometallic compound (s) of formula (I) according to the invention and in particular of the compounds AIM1 to AIM3 has previously been described in publications, such as the publication of EC Constable, AMW Cargill Thompson, Dalton Trans, 1992, 2947 -2950 for the compounds AIM1 and AIM3 and the publication by H. Krass, EA Plummer, JM Haider, PR Barker, NW Alcock, Z. Pikramenou, MJ, Hannon, DG Kurth, Angew. Chem. Int. Ed. 40 (2001) 3862-3865 for the compound AIM2.
  • the terpyridine ligands required for the synthesis of the organometallic compounds according to the invention were prepared using the Krohnke reaction between 2-acetylpyridine and an appropriate aryl aldehyde compound in the presence of ammonia.
  • the homoleptic complexes AIM1, AIM2 and AIM3 are obtained with a respective yield of 90, 69 and 83% by reacting the appropriate terpyridine ligand (2 equivalents) with FeCh in acetonitrile (scheme 1).
  • the organometallic compound (s) of formula (I) according to the invention having a demethylating action of DNA can also represent an active substance for therapeutic purposes, as will be described below.
  • the present invention thus relates to an organometallic compound comprising an iron atom linked to two terpyridine groups, having a general formula (I) as defined above for its use as a medicament.
  • organometallic compound (s) of formula (I) for non-therapeutic use are included here for therapeutic use (namely for their use as a medicament).
  • the organometallic compound (s) according to the invention can be used to treat diseases linked to cellular hyperproliferation, in particular cancers.
  • the organometallic compound (s) according to the invention can be used to treat glioblastomas, promyelocytic leukemias, cancers of the prostate, ovaries, lungs, breasts, digestive tracts, in particular the liver, pancreas , head and neck, colon, non-Hodgkin's lymphoma or melanoma, etc.
  • the compounds of the invention exhibit an antiproliferative effect with respect to tumor and healthy cells. These compounds cause an accumulation of cells in the G2 / M or G0 / G1 phase. Cell death can be observed but only after long treatments of minimum 96 hours. Thus, these compounds can be used to reduce tumor proliferation.
  • organometallic compound (s) can be used to treat tumors resistant to other anticancer agents.
  • organometallic compound (s) according to the invention could be used to treat other diseases linked to deregulation of epigenetic modifications, such as to treat inflammation, obesity, neurodegenerative diseases or cardiovascular diseases.
  • the present invention may be intended to form a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable carrier, at least one organometallic compound of formula (I) as defined above.
  • organometallic compound (s) of formula (I) for non-therapeutic use or for use as a medicament are included here for therapeutic use as a medicament.
  • the term “pharmaceutically acceptable carrier” designates substances such as excipients, vehicles, adjuvants, buffers which are conventionally used, in combination with one or more active principles (here, the organometallic compound or compounds according to the invention), for the preparation of a medicament.
  • active principles here, the organometallic compound or compounds according to the invention.
  • the choice of such supports essentially depends on the route of administration envisaged.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an excipient, a vehicle and / or an adjuvant chosen from the group consisting of pharmaceutically acceptable excipients, vehicles and / or adjuvants.
  • a person skilled in the art may in particular advantageously refer to the fourth edition 2002 of the European Pharmacopoeia, or even to the edition USP 25-NF 20 of the American Pharmacopoeia (U. S. Pharmacopeia).
  • the pharmaceutical composition can comprise one or more agents or vehicles chosen from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • the pharmaceutical composition can be a human or veterinary pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be in a liquid form, or, preferably, in a solid form.
  • a solid pharmaceutical composition is preferred, for example in the form of tablets, capsules or capsules.
  • a pharmaceutical composition is preferred in the form of an aqueous suspension.
  • a pharmaceutical composition can thus be presented in a form for oral administration, by inhalation, parenteral or injection such as for example by intravenous, intramuscular, subcutaneous, trans-dermal, intra-arterial, etc.
  • the oral forms are particularly preferred.
  • the intravenous, intramuscular, subcutaneous, and inhalation routes are preferred.
  • the compositions are generally in the form of liquid suspensions, which can be injected by means of syringes or infusions, for example.
  • the compounds are generally dissolved in an acceptable support which comprises saline, physiological, isotonic, buffered solutions, etc., compatible with pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • Agents or vehicles which can be used in liquid and / or injectable formulations are in particular methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils, acacia, etc.
  • injection rate and / or the dose injected can be adapted by a person skilled in the art depending on the patient, the pathology concerned, the mode of administration, etc.
  • the organometallic compound (s) according to the invention are administered in doses which can vary between 0.1 pg and 100 mg / kg of body weight, more generally between 0.01 and 10 mg / kg, typically between 0.1 and 10 mg / kg.
  • doses which can vary between 0.1 pg and 100 mg / kg of body weight, more generally between 0.01 and 10 mg / kg, typically between 0.1 and 10 mg / kg.
  • repeated injections can be made.
  • prolonged and / or delayed release systems may be advantageous.
  • solid pharmaceutical forms as pharmaceutical support can comprise, as vehicles, adjuvants or excipients, at least one diluting agent, a flavoring, a solubilizing agent, a lubricating agent. , a suspending agent, a disintegrating agent and an encapsulating agent, the identity and the function of these different classics being fully documented in the European Pharmacopoeia or in the Pharmacopoeia of the United States of America (USP).
  • USP European Pharmacopoeia or in the Pharmacopoeia of the United States of America
  • compositions in liquid form can also comprise water, optionally in admixture with propylene glycol or polyethylene glycol, and optionally also coloring agents, flavorings, stabilizers and thickening agents.
  • the method comprises a step during which said patient is administered a therapeutically effective amount of a purified dry extract of the or organometallic compounds according to the invention, or alternatively of the pharmaceutical composition described above.
  • treatment designates preventive, curative, palliative treatment, as well as the management of patients (reduction of suffering, improvement of lifespan, slowing down the progression of the disease , reduction of tumor growth, etc.).
  • the treatment can also be carried out in combination with other chemical or physical agents or treatments (chemotherapy, radiotherapy, gene therapy, etc.) ⁇
  • the treatments and drugs of the invention are particularly intended for humans.
  • organometallic compound (s) according to the invention and / or the pharmaceutical composition may, for example, be used in the treatment of cancers in combination with an anticancer treatment using radiation, such as radiotherapy.
  • organometallic compound (s) according to the invention and / or the pharmaceutical composition can for example be used in the treatment of cancers in combination with at least one other anticancer chemical agent, conditioned and administered in a combined, separate or sequential manner.
  • the other anticancer chemical agent can for example be cisplatin, carboplatin, taxoter, taxol, tomoxifene, doxorubicin or 5-fluorouracil and is advantageously taxol, 5-fluorouracil or else tomoxifene or doxorubicin .
  • the present invention thus makes it possible to inhibit in vivo, in vitro or ex vivo the proliferation of tumor cells, comprising bringing said tumor cells into contact with the pharmaceutical composition.
  • the tumor cells can in particular be those of the pathologies specified above.
  • FIG. 2 shows the evaluation of the demethylating power of the compounds AIM2 and AIM3 according to the invention in an in vitro system, (a) ELISA tests were carried out in order to measure the level of methylated cytosines present on a fragment of DNA after action of TET2 demethylase or AIM2 and AIM3 molecules; (b) the demethylating activity of AIM2 (2mM) and of the his-tagged-TET2 protein (10pg) was measured by an assay of the incorporation of radiolabelled methyl groups at the level of a biotynilized double stranded DNA previously methylated by the enzyme MSsI;
  • FIG. 3 represents the evaluation of the overall demethylating power of the molecules AIM2 and AIM3 in U251 cells: an ELISA test was carried out in order to measure the level of methylated cytosines present in the DNA of untreated U251 cells versus treated for 1 or 4h with 2mM of 5aza-2-deoxycytidine, AIM2 or AIM3;
  • FIG. 5 shows the evaluation of the overall demethylating power of the molecules AIM2 and AIM3 according to the invention on MDA-MB231 cells: a quantification by densitometry made it possible to obtain a quantitative value of the intensity of the bands present in the framed part of the gel (the calculation of the percentage of demethylation was calculated using the formula indicated);
  • FIG. 6 shows the influence of the AIM2 molecule according to the invention on the proliferation of MCF-10A breast epithelial cells and MDA-MB231 and Hs578T mammary tumor cells: the cells were seeded, after 24 hours of culture the cells were treated for 48 hours with varying concentrations of the AIIM2 molecule; the determination of the number of adherent cells was carried out by staining with violet crystal and quantified by a measurement of the absorbance at 595 nm; the results correspond to the average of 4 independent experiments, the standard errors to the average (SEM) are indicated and the significance of the data was calculated by comparing the treated vs untreated cells (Student test);
  • FIG. 7 shows the influence of the AIM3 molecule according to the invention on the proliferation of breast epithelial cells MCF-10A and mammary tumors
  • MDA-MB231 and Hs578T the cells were seeded, after 24 h of culture the cells were treated for 48 h with variable concentrations of the molecule AIIM3; the determination of the number of adherent cells was carried out by staining with violet crystal and quantified by a measurement of the absorbance at 595 nm; the results correspond to the average of 4 independent experiments, the standard errors to the average (SEM) are indicated - the significance of the data was calculated by comparing the treated vs untreated cells (Student test);
  • FIG. 8 is an analysis of the cell cycle of MCF-10A cells treated or not with 0.5 mM AIM2 or AIM3; the cells were seeded and treated with 0.5 mM AIM2 or AIM3 for 0, 16, 24, 48 and 72 h; after detachment the cells are fixed and permeabilized in a 70% cold ethanol solution; labeling with propidium iodide is then carried out in order to label the DNA and the fluorescence is quantified by flow cytometry;
  • FIG. 9 shows an analysis of the number of cells treated or not with 2mM AIM2 or AIM3.
  • the cells were seeded and treated with 2mM AIM2 or AIM3 for 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 and 192h. After detachment, the cells are counted using a Malassez type counting cell.
  • the medium of the NT or AIM2 or AIM3 cells is renewed every 72 hours.
  • AIM2 (72) + NT or AIM3 (72) + NT the culture medium contains the indicated molecule only for 72 hours and after that it is replaced by a medium without molecules in order to test the reversibility of the effect;
  • MDA-MB 231 treated with different concentrations of the AIM2 compound according to the invention and / or tamoxifen;
  • FIG. 12 shows a set of graphs showing the sensitivity of different breast tumor lines to AIM2, AIM3 compounds, conventional chemotherapy agents and their combinations;
  • FIG. 17 shows the inhibition of the proliferation of T47D R + doxo cells by the different molecules AIM1, AIM2, AIM3 and Ru after 48 and 72 hours of treatment;
  • FIG. 18 shows the inhibition of the proliferation of glioblastoma cells U251 and U87 by the different molecules AIM1, AIM2, AIM3 and Ru after 72 hours of treatment;
  • FIG. 19 shows the inhibition of the proliferation of T47D cells by the different molecules AIM1, AIM2, AIM3 and Ru after 48 hours of treatment;
  • daughter solutions can precipitate at 4 ° C. It is thus necessary to incubate them at 37 ° C for 10 min before their use.
  • the Applicant has carried out a molecular modeling of the demethylating capacity of the AIM3 compound according to the invention.
  • the energy profile linked to the demethylation reaction was carried out using quantum chemistry calculations.
  • a model system comprising a methylated cytosine and AIM3 was used.
  • the geometries of the reagents and products have been optimized using the density functional theory "DFT" using wB97XD as the exchange-correlation functional and LANL2DZ as the orbital base.
  • the transition state that is to say the maximum energy conformation
  • the energy profile of the reaction in space connecting the reactants and the products via the transition state was also estimated by analyzing the energy variation according to a reaction coordinate, i.e. the distance between methyl and the peripheral nitrogen of AIM3.
  • the effects of the solvent, water were taken into account using a model of the polarizable continuum "PCM”.
  • All molecular modeling calculations were carried out using Gaussian 09 software version D01 and using standard molecular modeling techniques, in particular detailed in numerous works such as “Chris J. Cramer Essential of Computational Chemistry Wiley eds”.
  • those skilled in the art can refer to the Gaussian 09 manual for a detailed illustration of the geometry optimization techniques that have been used.
  • the cell-free experiments consist in incubating methylated DNA (Qiagen, France) at 37 ° C. for 1 h with either 2 mM of molecules AIM2 and AIM3, or with the recombinant TET2 protein which is a protein known for its demethylating role and serving as positive control or either with water (Ctrl).
  • methylated DNA 500ng, ref # N4007 NEB, genomic DNA of HeLa cell hypermethylated in vitro by the enzyme M.Sssi
  • methylated DNA 500ng, ref # N4007 NEB, genomic DNA of HeLa cell hypermethylated in vitro by the enzyme M.Sssi
  • the DNA is then used to carry out a 5mC-ELISA test (Zymo Research) i.e. making it possible to measure the level of 5-methylcytosines (see below).
  • the cells of U251 gliomas or T98G glioblastomas were seeded at 2.10 6 respectively. 24 h after seeding, the cells were treated for 1 or 4 h with the molecules AIM2 or AIM3 at a rate of 0, 2, 5, 10 mM. After the treatment, the culture medium is replaced by a medium without molecules and the cells are kept in culture for 48 hours. The cells are then mechanically detached with a scraper in order to carry out a total DNA extraction via the use of the QiaCube automaton (Qiagen) and the QIAamp DNA Mini QIAcube Kit (Qiagen), without modification with the instructions provided by Qiagen .
  • QiaCube automaton Qiagen
  • Qiagen QIAamp DNA Mini QIAcube Kit
  • the DNA (100 ng) collected as indicated above is first denatured at 98 ° C for 5 min (use of the MyCycler BioRad thermocycler), before being deposited in the wells of the plate: 96 wells provided for this purpose (Kit 5mC-ELISA, Zymo) for 1 h of incubation at 37 ° C. The supernatant is then removed and the wells are washed 3 times with 200 ⁇ L of washing buffer (supplied by the kit). Then, 200 ⁇ L of washing buffer are incubated in each well for 30 min at 37 ° C.
  • the revelation / quantification step of 5- methylcytosines is carried out with the incubation (1 h, 37 ° C) of the anti-5mC antibody provided by the kit (ref / A3001-30), diluted to 1/2000. After 3 washes (200 ml of washing buffer provided by the kit), the primary antibody is revealed following the incubation (1 h, 37 ° C) of the coupled secondary antibody HRP (D5325-3-30). Finally, after 3 washes (200 ml of washing buffer supplied by the kit), the ELISA is revealed by adding 100 ml of "HRP developer" (supplied by the kit). The ELISA plate is read at 405-450 nm (Victor plate reader, Perkin Elmer). In parallel, a standard range is carried out with methylated DNA whose percentage of 5 mC is known (range: 0, 5, 10, 25, 50, 75, 100%).
  • TET2 (10pg) (positive control) was measured by an assay for the incorporation of methyl groups radiolabelled in a double-stranded DNA biotynilized and previously methylated by the enzyme M.SSsl.
  • a 96-well plate is pretreated beforehand with 10 mg / ml of BSA (bovine serum albumin) for 30 min.
  • BSA bovine serum albumin
  • the magnetic beads (10 mg / ml, Dynal) are washed three times with the TENT2M buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 2 mM EDTA, 0.01% Triton X-100, 2 M NaCl). The concentration of these beads is adjusted to 2.5 mg / ml with the TENT2M buffer and 1/10 of the volume with the non-radioactive form of AdoMet (100 mg / ml; Sigma).
  • the methylation reaction (40 mI) contains 200 U of the enzyme M.Sssi (NEB # M0226) 125 nM DNA oligonucleotides, 200ng DNA, and 900 nM tritium- labeled AdoMet (Amersham Bioscience, 1 mCi / ml) in the reaction medium (50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM EDTA, 10% glycerol, 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride).
  • the reactions are stopped by adding an equivalent volume of magnetic beads in suspension and gentle shaking for 15 min at room temperature.
  • the magnetic beads are separated using a magnet and washed successively with 300, 200, 150, and 100 mI TENT1 M (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.005% Triton X-100, 1 M NaCI ).
  • the magnetic beads are resuspended in 25 mI of TENT1 M in the presence of “putative demethylating agents” or with 100 ⁇ g of nuclear extract isolated using the kit, nuclear extract kit (Active Motif, # 40410).
  • the magnetic beads are separated using a magnet and washed successively with 300, 200, 150, and 100 mI of TENT1 M (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.005% Triton X- 100, 1 M NaCl). Then the level of incorporated tritium is measured in a scintillation counter.
  • the compound AIM2 exhibits a demethylating action of DNA.
  • the molecules AIM2 and AIM3 exhibit demethylating power after 1 h and 4 h of incubation clearly greater than that of 5aza-2-deoxycytidine which is the known and commonly used demethylating agent, but which requires a incorporation into DNA.
  • T98G glioblastoma cell line
  • T98G cells The experiment carried out on T98G cells consisted in treating the latter for 1 h with different concentrations of the compound AIM3 according to the invention, namely 0; 2; 5 and 10 mM.
  • the cells of the breast cancer line MDA-MB 231 are cultured in RPMI 1640 medium (Gibco) containing 2 mM L-Glutamine (Sigma), 0.1 mg / ml of gentamicin (Sigma) and 10% of fetal calf serum ( Sigma) decomplemented 30 minutes at 56 ° C. They are incubated at 37 ° C and 5% CO2.
  • the powder is taken up at 100 mM in DMSO (Sigma). This stock solution is aliquoted (2 mL) and stored at -80 ° C.
  • the powder (717.07 g / mol) is taken up at 1 mM in PBS (Fisher) containing
  • the powder (719.06 g / mol) is taken up at 5 mM in PBS containing 20% ethanol. This stock solution is stored at 4 ° C.
  • the cell layer is washed with 2mL of PBS, then trypsinized with 0.5mL of EDX 1X trypsin (Sigma) for 5 minutes at 37 ° C. The action of trypsin is then inhibited by the addition of 4 mL of culture medium.
  • the cell suspension is finally centrifuged at 200 G for 5 minutes and the pellet stored at -20 ° C.
  • the intensity of each strip is measured using the Quantity One software.
  • the data presented in FIG. 5 confirm that, like 5-azacytidine, the treatment of MDA-MB231 cells with the molecules AIM2 and AIM3 makes it possible to reduce the overall percentage of methylation of the genome.
  • EXAMPLE 8 Influence of the compounds AIM2 and AIM3 according to the invention on the proliferation of breast epithelial cells MCF-10A and mammary tumor MDA-MB231 and Hs578T (Fig. 6 and Fig. 71
  • the cells are seeded according to the densities indicated above (Table 4). After 24 hours of culture, the culture medium is replaced by medium containing or not containing the molecules AIM2 or AIM3 at concentrations of 0.5; 1; 1.5; 2 and 2.5 mM in four copies for 48 hours. After these 48 hours of treatment, the culture medium is removed and the cells are washed with a 1 ⁇ PBS solution. They are then fixed in 100 ⁇ l of culture medium containing 4% of paraformaldehyde and incubated for 20 min at room temperature. The cells are then rinsed with a 1X PBS solution.
  • the next step is to dissolve the purple crystal in order to obtain a colored solution which can be dosed.
  • 100 ⁇ l of a 10% acetic acid solution is added, then the plates are incubated with shaking until the total solubilization of the Violet Crystal.
  • An absorbance is then read at 595 nm using a plate reader (VICTOR).
  • the concentration of the cells is presented in the table below.
  • the results obtained indicate that treatment with 0.5 mM AIM2 and AIM3 induces a blockage of the cell cycle in G1 phase.
  • the absence of cells in the subG1 phase indicates that these molecules do not exhibit cellular toxicity under these treatment conditions.
  • the effect of these molecules on cell proliferation was also evaluated as a function of the treatment time and no longer of the dose of molecule used.
  • the 2mM dose which is the one capable of causing DNA demethylation, was chosen.
  • the cells are seeded in 60mm boxes at a rate of 4 ml / box on the 1st day at the concentration indicated in the table below.
  • the organometallic complexes AIM2 and AIM3 at 2 mM or the solvent (0.04% ethanol) for the untreated cells are added to the culture medium.
  • the treated and untreated cells are detached by the action of trypsin.
  • the cells After inactivation of trypsin with culture medium containing 10% fetal calf serum, the cells are washed in PBS and counted after staining with Trypan Blue so as to count only the living cells (a fraction of 10 ml of the suspension is mixed with 10 ml of 0.4% Trypan blue (Thermo Scientific) The cells are counted using a Malassez counting cell (Marienfeld-Superior). at). Prior to treatment, the Al Ms molecules are preheated in a heating block (Thermo Scientific) at 37 ° C. with stirring for 10 minutes in order to guarantee total solubilization.
  • a heating block Thermo Scientific
  • the media are renewed every 72 hours with or without Al Ms.
  • the molecules AIM2 and AIM3 have a cytostatic action in the different cell lines used (MCF-10A, MDA-MB231 and Hs578).
  • a treatment with a dose of 2 mM inhibits the proliferation of healthy mammary epithelial cells (MCF10A), but also of breast cancer cells (MDA-MB231 and HS578T) (cf. curves square points compared to the untreated controls round).
  • MDF10A healthy mammary epithelial cells
  • MDA-MB231 and HS578T breast cancer cells
  • a 72h treatment was also carried out with 2mM of molecule, followed by a change of medium without adding any molecule.
  • MCF10A healthy mammary epithelial cells
  • EXAMPLE 1 1 Sensitizing effect of compounds according to the invention vis-à-vis chemotherapy in mammary tumor cells (Fiq.10 and Fig.1 1)
  • Breast cancer actually groups different subcategories based on the expression of 3 molecular markers: the estrogen receptor (ERa), the progesterone receptor (PR) and the transmembrane receptor belonging to the family of receptors for EGF (HER2). Some tumors are thus called triple negative, because they do not express any of the 3 molecular markers. This type of tumor poses many problems in their treatment because:
  • One of the major challenges in the treatment of breast cancer consists in trying to re-sensitize triple negative breast tumors to chemotherapy agents.
  • One of the aims is thus to restore the sensitivity of cells triple negative breast cancer, MDA-MB231, to a chemotherapy agent, tamoxifen.
  • tamoxifen is a selective estrogen receptor (ERa) modulator, that is to say that it binds specifically to estrogen receptors, but without activating a signaling pathway.
  • ERa selective estrogen receptor
  • the resistance of MDA-MB231 cells to tamoxifen has been shown to be due to a lack of expression of ERa.
  • Yoshida and his collaborators showed that the hypermethylation of 2 promoter regions (promoter A and B) upstream of the gene coding ERa is inversely correlated to the expression of ERa in MDA-MB231 cells.
  • the Applicant has studied whether the compounds according to the invention make it possible to demethylate the ERa promoter in MDA-MB231 cells, in order to re-induce its expression, and to resensitize cells to tamoxifen.
  • Chou-Talalay tests were carried out by determining the number of cells attached after treatments using the AIM2 compound and / or using tamoxifen.
  • MDA-MB231 cells were seeded in a 96-well plate at a cell density of 8,000 cells / well in a volume of 100 ⁇ L / well.
  • the experimental plate design is shown in Figure 10.
  • Treatment with AIM2 is done for 24 hours, followed by 48 hours of treatment with tamoxifen.
  • a marking with violet crystal is carried out in order to count the living cells.
  • the protocol is as follows:
  • the plate triplicates are averaged, and the results are expressed as a function of the untreated control which is set to 1 for each condition.
  • MDA-MB231 cells which are ER negative, are insensitive to tamoxifen.
  • a treatment with AIM2 induces a reduction in cell viability of the order of 50% from the lowest dose (2000 nM).
  • Pretreatment with AIM2 followed by treatment with tamoxifen also induces a decrease in cell viability, which seems greater than in the presence of the molecule AIM2 only.
  • the Applicant used the CompuSync software which is based on the Chou-Talalay method via the principle of effect median of the law of mass action.
  • fa and fu correspond respectively to the fractions of cells affected and not affected by the treatments
  • D and Dm correspond respectively to the dose used and the median dose
  • m corresponds to the shape of the dose-response curve.
  • the software then generates combination indices (Cl): - if the Cl at a given dose combination is less than 1, then there is a synergy of action between molecule A and molecule B
  • the breast cancer cells, MCF-7, MDA-MB231 and Hs578T, as well as a line of normal breast cells, MCF10A were seeded at a density of 1 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate. well. After 24 hours of inoculation, the cells are brought into contact with 2mM of AIM2 / 3 for 1 hour followed by 50mM of 5-fluorouracil or 50ng / ml of doxorubicin for 24 or 48 hours. Following these treatments, the media are removed and 0.5 mg / mL of MTT is added to each well.
  • the different cell lines are cultivated in an incubator at 37 ° C, 5% CC> 2 and 95% humidity according to the following nutrient media:
  • the different culture media are alternately supplemented with 0.1 mg / mL of Gentamicin (Sigma G1272) and 1% of Penicillin-Steptomycin (Sigma P4333).
  • the fetal calf serum (SVF) and the horse serum are decomplemented beforehand for 30 minutes at 56 ° C.
  • the doxorubicin-resistant line T47D is cultured in the presence of 12.5 ng doxorubicin / ml in order to maintain the resistance. However, doxorubicin is not added to the culture medium during the pre-treatment phases and the proliferation test.
  • the cells are seeded in 100 mm boxes (10 ml medium / box) for the Untreated conditions and in 150 mm boxes (20 ml medium / box) for the conditions treated according to the following quantities:
  • the cells are then treated 24 hours after seeding with the molecules
  • AIM2 or AIM3 at a concentration of 2 mM for 72 hours.
  • the cells are detached with 1 mL (10 mm dishes) or 2 ml (150 mm dishes) of trypsin - EDTA 1X for 5 minutes at 37 ° C (15 minutes of incubation are necessary to detach the MCF10A cells).
  • trypsin is then inhibited by 10 ml of culture medium and then the cell suspension is centrifuged at 200 G for 5 minutes.
  • Each pellet is taken up in 10 ml of medium and then the cells are counted using a Mallasez cell.
  • the cells are then seeded in 60 mm dishes (4 ml medium / dish) as follows and according to the experimental plan of Fig. 13:
  • the cells After washing with 2 ml of PBS, the cells are detached with 1 ml of 1X trysin-EDTA at 37 ° C for 10 minutes (20 minutes for the MCF10A line).
  • the tryspine is then inhibited by the addition of 4 ml of medium. Then the cells are pelletized at 200G for 5 minutes. The pellets are taken up in a precise volume of PBS depending on the size of the pellet.
  • the cells are correctly separated by several round trips to the P200 and counted using a Mallasez cell.
  • the different cell lines are cultivated in an incubator at 37 ° C, 5% CC> 2 and 95% humidity according to the following nutrient media:
  • the different culture media are alternately supplemented with 0.1 mg / mL of Gentamicin (Sigma G1272) and 1% of Penicillin-Steptomycin (Sigma P4333).
  • Fetal calf serum (SVF) and horse serum are decomplemented beforehand for 30 minutes at 56 ° C.
  • the doxorubicin resistant line T47D is cultured in the presence of 12.5 ng doxorubicin / ml in order to maintain the resistance, however doxorubicin is not added to the culture medium during the proliferation test.
  • Each cell line is seeded in 96-well plates (100 ml_ medium / well) according to the following conditions:
  • Each treatment condition is performed in a tripicat as shown in Figure 15.
  • the cells are treated with the molecules represented in FIG. 16 (AIM1, AIM2, AIM3 according to the invention and Ru as a comparative example) at 2 mM 24 h after seeding.
  • the medium from each well is removed and then washing is carried out with 100 ⁇ l of PBS.
  • the cells are then fixed with 100 ⁇ L of 4% paraformaldehyde for 20 minutes, followed by two washes with 500 ⁇ L of PBS.
  • the percentage of adhered cells is demonstrated by staining with violet crystal.
  • the wells are rinsed 3 times with distilled water and then properly dried by tapping on a sheet of absorbent paper.
  • the plate is placed under stirring until the total solubilization of the violet crystal crystals (approximately 10 minutes).
  • the absorbance is read using a plate reader at 595 nm (see Fig. 17 to 20).

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation non-thérapeutique, en tant qu'agent de déméthylation de l'ADN, d'au moins un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines. L'invention porte également sur un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines pour son utilisation comme médicament.

Description

UTILISATION D’UN COMPOSE ORGANOMETALLIQUE EN TANT QU’AGENT DE DÉMÉTHYLATION
DE L’ADN
DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION
La présente invention concerne de manière générale l’utilisation non- thérapeutique et l’utilisation thérapeutique de composés ayant un effet déméthylant de l’ADN.
Elle concerne ainsi tout d’abord, l’utilisation non-thérapeutique en tant qu’agent de déméthylation de l’ADN de complexes organométalliques à base de fer pour former par exemple des outils de biotechnologie, tels que des réactifs de séquençage.
Puis, l’invention porte également sur l’utilisation thérapeutique de ces complexes organométalliques à base de fer en tant que médicament, par exemple pour le traitement de pathologies prolifératives, en particuliers de cancers.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Les cancers sont la seconde cause de décès après les maladies cardiovasculaires dans les pays industrialisés. Hormis des mutations directes de l’ADN de gènes essentiels, l’expansion d’une cellule cancéreuse est fréquemment associée à des modifications épigénétiques, c’est-à-dire non directement codés par la séquence de l’ADN.
Le terme épigénétique regroupe en effet tout un ensemble de modifications responsables de la régulation de l'expression génique pouvant être transmises lors de la division cellulaire et qui n'impliquent aucun changement de la séquence d'ADN (Flintoft, 2017). Ce terme regroupe ainsi différents processus, tels que la méthylation de l’ADN, les modifications post-traductionnelles des histones et l’expression d’ARN non codant.
La régulation de l'expression génique est un phénomène qui influence la plupart des aspects de la biologie cellulaire (l'embryogenèse, le développement, la différenciation cellulaire, ainsi que la mort cellulaire) dans les organismes multicellulaires. Une dérégulation des modifications épigénétiques, tant au niveau de leur maintien que dans leur coordination, est fréquemment observée pour diverses pathologies, telles que l’inflammation, l’obésité, les maladies neurodégénératives et cardiovasculaires, ainsi que les cancers. Par conséquent, la recherche de molécules capables de réguler ces processus présente un intérêt majeur.
En particulier, la méthylation de l’ADN est un processus épigénétique. Elle est le résultat d’une méthylation de cytosines en 5-méthylcytosines dans les dimères C-G de l’ADN, en particulier dans les îlots CpG. Environ 80 % de ces régions sont méthylées dans le génome humain. Les enzymes DNA méthyltransférases (DNMTs) catalysent l’addition d’un groupement méthyle provenant du donneur Sadénosylméthionine sur le carbone 5 d’une cytosine. Parmi les DNA méthyltransférases, la DNMT1 qui est une enzyme impliquée dans le maintien de l’information épigénétique (Leonhardt et al., 1992 ; Liu et al., 1998), prend comme modèle le brin d’ADN hémi-méthylé lors de la réplication tandis que les enzymes DNMT3a et 3b peuvent agir sur un brin non méthylé et donc modifier l’information épigénétique (Okano et al., 1999). Par contre, la DNMT2 ne montre pas d’activité DNA méthyltransférase. La méthylation de l’ADN conduit à la répression de l’expression du gène (Bird, 2002). Il existe aussi une enzyme (peptidyl arginine deiminase 4) pouvant, en déiminant les résidus arginine de l’histone H3, interférer avec la méthylation (Cuthbert et al., 2004).
Jusqu'à ce jour, le développement d'agents déméthylants de l’ADN (également connus sous le terme anglais « DNA hypomethylating agent ») est basé sur des stratégies conduisant à une déméthylation indirecte de l’ADN et ce notamment via l’inhibition des enzymes responsables de la méthylation de celui-ci, à savoir les DNMTs décrites ci- dessus.
Par exemple, pour de nombreux cancers, il a été démontré que certains gènes suppresseurs de tumeurs, comme par exemple p16, étaient hyperméthylés (Herman et al., 1995). La conséquence de cette hyperméthylation est l’inactivation de ce gène régulateur du cycle cellulaire. Il a été démontré que les inhibiteurs bloquant l’activité DNA méthyltransférase provoquent l’hypométhylation de ces gènes suppresseurs de tumeurs et possèdent ainsi des propriétés anticancéreuses (Santini et al., 2001 ).
A l’heure actuelle, les différents agents déméthylants de l’ADN peuvent être classés en fonction de leur mode d’action en cinq catégories différentes :1 ) les analogues nucléosidiques non méthylables (décitabine, azacytidine), 2) les inhibiteurs de l’activité catalytique (procainamide), 3) les inhibiteurs de la S-adénosylméthionine hydrolase (caldribine), 4) les inhibiteurs de l’expression des DNMTs (MG98) et 5) les inhibiteurs de l’interaction des DNMTSs avec leurs partenaires (UP peptide).
1 ) Les analogues nucléosidiques non méthylables, tels que la 5-azacytidine, la Décitabine (DAC ou 5-aza-2’-déoxycytidine), la Zébularine (dZTP), le 5-fluoro-2’- deoxycytidine (FdCyd), le SGI-1 10 (Décitabine modifiée) et le CP-4200 (un dérivé de la 5- azacytidine) permettent la capture des DNMTs sur de l’ADN ayant incorporé ces analogues conduisant ainsi à leur dégradation. Cependant, ces analogues nucléosidiques non méthylables, comme la 5-azacytidine, ou la 5-aza-2’-déoxycytidine, en plus de présenter d’importants effets secondaires, montrent généralement une forte toxicité et une faible stabilité. La zébularine présente toutefois une meilleure stabilité (Zhou et al., 2002 ; Cheng et al., 2003) et une plus faible toxicité (Cheng et al., 2004).
2) Les inhibiteurs de l’activité enzymatique des DNMTs (tels que RG108, procaïne, nanaomycine et le procainamide) sont des composés synthétiques qui ont une affinité pour les régions d’ADN riches en CpG bloquant ainsi l’activité des DNMT1. Ces molécules présentent plusieurs avantages par rapport aux analogues nucléotidiques car leur utilisation n’est pas limitée aux cellules hautement prolifératives puisqu’elles inhibent directement les DNMTs sans nécessiter leur incorporation au sein de l’ADN.
3) Les inhibiteurs de la S-adénosylhomocystéine hydrolase entraînent quant à eux une baisse de S-adénosylméthionine qui est le donneur de méthyl permettant aux methyltransférases de catalyser la méthylation des cytosines de l’ADN (Cladribine, Fludarabine et Clofarabine) (Bonate et al., 2006; Jeha et al., 2004).
4) Les inhibiteurs de la synthèse des DNMTs, tels que les oligonucléotides antisens et les microARNs (MG98) (Amato, 2007; Winquist et al., 2006) reposent sur le fait qu’une hyperméthylation est très souvent associée à une augmentation de l’expression des DNMTs. Malgré un important engouement pour cette stratégie, à l’heure actuelle, les essais cliniques de phase I ou II ont révélé un manque d’efficacité de ces oligonucléotides.
5) Les inhibiteurs de l’interaction des DNMTs avec leurs partenaires concernent des molécules peptidiques qui sont capables de perturber l’association des DNMTs avec certains de leurs partenaires protéiques nécessaires à leur fonctionnement. Comme les complexes protéiques formés avec les DNMTs peuvent varier en fonction des gènes cibles, cette approche permet donc d’éviter (par rapport aux autres modes d’action cités précédemment) l’induction d’une hypométhylation globale qui peut être à l’origine d’importants effets secondaires. Il a par exemple été démontré que l’inhibition spécifique du complexe DNMT3A/ISGF3y permet de rétablir une sensibilité au témozolomide et ainsi réduire la croissance tumorale de glioblastomes (Cheray et al., 2013, 2014; Hervouet et al., 2010).
A ce jour, la recherche de molécules capables de moduler le niveau de méthylation de l’ADN est donc tournée uniquement vers les inhibiteurs des enzymes responsables de ce processus, à savoir les DNMTs.
On connaît également de l’état de la technique, la publication de Zohreh Naseri ét al. 201 1 , Pergamon Press, qui divulgue des complexes organométalliques comprenant le ligand 4’-(2-thiényl)-2,2’,6’,2”-terpyridine. Un solvaté d’un complexe de fer correspondant (Fe(thioterpy)2(N03)2.MeOH) est décrit en tant que composé 3 dans la publication. Toutefois, d’après les résultats présentés dans cette publication, ce complexe de fer 3 a une activité négligleable envers les microorganismes testés, ne démontre pas d’effet cytotoxique sur les lignées de cellules de leucémie et de fibrosarcome testées (tableau 7), et son activité de piégeage des ions superoxydes n’est pas remarquable.
La publication de Uttara et al. 2012, Journal of Inorganic Biochemistry, décrit des complexes terpyridiniques de fer photocytotoxiques (complexes 1 , 1 a, 2, 2a, 3 et 3a). D’après les résultats biologiques fournis, le complexe 1 présente l’affinité de liaison à l’ADN la plus faible parmi les trois complexes testés, n’a aucune activité de clivage de l’ADN sous UV-A ou sous lumière verte.
Le document FR 1 463 870 décrit l’utilisation de complexes organométalliques pour la teinture des matières kératiniques.
Dans ce contexte, il existe un besoin dans l’état de la technique de développer de nouveaux agents déméthylants de l’ADN à des fins thérapeutiques et non- thérapeutiques.
Il existe en particulier un besoin dans l’état de la technique de développer des nouveaux agents déméthylants de l’ADN qui soient efficaces, qui possèdent de préférence des effets indésirables réduits ou moindres par rapport aux agents déméthylants de l’art antérieur (de préférence, faible cytotoxicité cellulaire), tout en étant faciles à mettre en oeuvre et en ayant avantageusement un prix de revient modéré.
Un but de la présente invention est ainsi de proposer de nouveaux composés qui évitent, tout ou en partie, des inconvénients susmentionnés. OBJET DE L’INVENTION
La Demanderesse s’est ainsi attachée au développement de nouveaux composés déméthylants capables d’interagir avec l’ADN.
Elle a notamment mis au point une nouvelle classe d’agents déméthylants aptes à entraîner une déméthylation directe de l’ADN par de simples réactions chimiques et ce dans des systèmes acellulaires et cellulaires.
La Demanderesse a en effet démontré que certains composés organométalliques comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines permettaient une déméthylation directe de l’ADN.
Ces composés pouvaient notamment être utilisés que ce soit pour des applications non-thérapeutiques, par exemple, en tant que réactifs de réaction lorsque qu’une déméthylation de l’ADN est requise, soit pour des applications thérapeutiques.
Dans ce cas, la Demanderesse a démontré que les composés selon l’invention présentaient une action antiproliférative notamment sur des cellules cancéreuses. En outre, comme le montre les essais expérimentaux ci-dessous (en particulier les exemples 9 et 10), les composés selon l’invention sont non cytotoxiques et présentent ainsi un effet cytostatique.
A cet effet, la présente invention a pour objet l’utilisation non-thérapeutique, en tant qu’agent de déméthylation de l’ADN, d’au moins un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines de formule générale (I) suivante : dans laquelle :
R1 à R6, identiques ou différents sont choisis parmi : un atome d’hydrogène ; une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée de formule CnHhn+i avec n = 1 à 12 ; un groupe COOH ; un groupe SO3H ; un groupe PO3H ; un cycle aromatique de formule (II) à (VI) ci-dessous:
(II) (III) (IV) (V) (VI) où
Y sont chacun indépendemment des autres un groupe CH ou un atome d’azote (les deux groupes Y peuvent être identiques ou différents);
R7 est choisi parmi un groupe OCYH2Y+I avec y = 1 à 10 ; SCWH2W+I avecw= 1 à 10;
N(CmH2m+i)2 avec m= 1 à 6, COOH ; SO3H ou PO2H3 ;
Z désigne un atome d’oxygène, un atome de soufre ou un groupe NH ;
la ligne en pointillée représente une liaison C-C au niveau du point de rattachement du cycle aromatique de formule (II) à (VI) aux groupements terpyridines du composé organométallique de formule (I) ;
X est un contre-ion.
La présente invention a également pour objet un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines, ayant une formule générale (I) définie ci-dessus pour son utilisation comme médicament.
Enfin, la présente invention pourrait être une composition pharmaceutique qui pourrait comprendre, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un composé organométallique tel que défini ci-dessus. Pour le reste de la description, à moins qu’il n’en soit spécifié autrement, l’indication d’un intervalle de valeurs « de X à Y » ou entre « X à Y », dans la présente invention, s’entend comme incluant les valeurs X et Y.
DESCRIPTION DETAILLEE D’UN EXEMPLE DE RÉALISATION
La description qui va suivre, donnée à titre d’exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l’invention et comment elle peut être réalisée.
I. Utilisation non-thérapeutique du ou des composés de formule générale (I)
Tel que mentionné ci-dessus, la présente invention porte sur l’utilisation non- thérapeutique, en tant qu’agent de déméthylation de l’ADN, d’au moins un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines de formule générale (I) suivante :
dans laquelle :
R1 à R6, identiques ou différents sont indépendemment choisis parmi : un atome d’hydrogène ; une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée de formule CnHhn+i avec n = 1 à 12 ; un groupe COOH ; un groupe SO3H ; un groupe PO3H ; un cycle aromatique de formule (II) à (VI) ci-dessous:
(II) (III) (IV) (V) (VI) où Y sont chacun indépendemment des autres un groupe CH ou un atome d’azote, à savoir les deux groupes Y peuvent être identiques ou différents ;
R7 est choisi parmi un groupe OCYH2Y+I avec y = 1 à 10 ; SCWH2W+I avecw= 1 à 10; N(CmH2m+i)2 avec m = 1 à 6, COOH ; SO3H ; PO2H3 ;
Z désigne un atome d’oxygène, un atome de soufre ou un groupe NH ;
la ligne en pointillée représente une liaison C-C au niveau du point de rattachement du cycle aromatique de formule (II) à (VI) aux groupements terpyridines du composé organométallique de formule (I) ;
X est un contre-ion.
Selon l’invention, les groupes terpyridine sont des ligands particulièrement appropriés pour l’atome de fer qui permettent de former un composé organométallique relativement stable et qui serait, de ce fait, résistant même dans un environnement biologique. En outre, la configuration particulière des ligands terpyridine confère une rigidité remarquable au composé organométallique selon l’invention.
Les composés de l'invention peuvent être sous forme de sels, solvatés et/ou de pro-drogues pharmaceutiquement acceptables. Les pro-drogues sont des variants des composés de l'invention qui peuvent être transformés in vivo en composés de formule générale (I) selon l'invention.
Selon l’invention, le terme « sels ou solvatés pharmaceutiquement acceptables » se réfère à des sels ou des solvatés qui conservent l’activité biologique désirée telle que décrite ci-dessus des composés organométalliques de l’invention et qui exposent à très peu, voire aucun effet toxicologique non désiré.
Selon l'invention, le terme « alkyle » désigne un radical hydrocarboné linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, ayant avantageusement de 1 à 12 atomes de carbone, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, néopentyle, n-hexyle, etc. Les groupes ayant de 1 à 6 atomes et en particulier de 1 à 4 atomes de carbone sont préférés.
Selon un premier mode de réalisation préféré, R1 à R6 peuvent correspondent à un atome d’hydrogène.
Selon ce mode, le composé organométallique de formule (I) peut répondre à la formule (IX) suivante :
Ce composé de formule (IX) sera nommé ci-après AIM1.
Selon un deuxième mode de réalisation préféré, R1, R3, R4, 66 peuvent être identiques et correspondre à un atome d’hydrogène, et R2 et R5 peuvent être identiques et désigner un cycle aromatique de formule (II) tel que décrit ci-dessus avec Y=CH et correspondre ainsi à un benzène de formule (Vil) suivante :
(VII)
Selon ce mode, le composé organométallique de formule (I) peut répondre à la formule (X) suivante :
Ce composé de formule (IX) sera nommé ci-après AIM2.
Selon un troisième mode de réalisation préféré, R1, R3, R4, R6 sont identiques et correspondent à un atome d’hydrogène, et R2 et R5 sont identiques et désignent un cycle aromatique de formule (II) où un des Y=CH et l’autre Y= N et correspondent à un radical pyridine de formule (VIII) suivante : où la ligne en pointillée représente une liaison C-C entre le carbone porté par le radical pyridine et le carbone porté par le groupe terpyridine du composé organométallique de formule (I).
Selon ce mode, le composé organométallique de formule (I) peut répondre à la formule (XI) suivante :
Ce composé de formule (IX) sera nommé ci-après AIM3.
Les deux groupes terpyridines de ce composé AIM3 porte ainsi chacun un noyau pyridinique, l’atome d’azote permettant d’induire un effet nucléophile.
Selon un mode de réalisation de l’invention, le composé organométallique de formule (I) exclut le ou les composés où R1=R3=R4=R6=H et où R2=R5 est choisi parmi un cycle aromatique de formule (VI) dans lequel Z est un atome de soufre ou un cycle aromatique de formule (II) ou (III) avec Y=CH.
De préférence, le contre-ion X est choisi parmi : Cl , Br, I , l’hexafluorophosphate de formule PF6 , de préférence le contre-ion est le PF6 .
Avantageusement, le ou les composés organométalliques sont capables d’entraîner une déméthylation directe de l’ADN.
Sans être lié par une quelconque théorie, il semblerait que la déméthylation de l’ADN serait due soit à une attaque nucléophile des 5-méthylcytosines (5mC) entraînant ainsi leur déamination, et/ou soit à une oxydation médiée par le fer qui permettrait une conversion des 5mC en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC).
Ainsi, les composés organométalliques de formule (I) selon l’invention peuvent notamment être utilisés afin de former des outils de biotechnologie, par exemple en tant que réactifs de séquençage où une déméthylation de l’ADN est requise.
A titre d’exemple, le ou les composés de l’invention peuvent être utilisés en tant qu’outil de biotechnologies, comme par exemple en tant que réactif pour effectuer des expériences de déméthylation in vitro sur de cellules, généralement tumorales, issues d’un prélèvement effectué chez un animal. Ces expériences permettraient par exemple de confirmer la présence ou non de phénomène de méthylation de l’ADN sur certains gènes, de bloquer la prolifération cellulaire de ces cellules et donc de les sensibiliser à des agents de chimiothérapie. « Par animal » selon l’invention, on entend les mammifères, les oiseaux, les poissons, les insectes, etc., ainsi que l’être humain.
La synthèse du ou des composés organométalliques de formule (I) selon l’invention et en particulier des composés AIM1 à AIM3 a précédemment été décrite dans des publications, telles que la publication de E. C. Constable, A. M. W. Cargill Thompson, Dalton Trans, 1992, 2947-2950 pour les composés AIM1 et AIM3 et la publication de H. Krass, E.A. Plummer, J.M. Haider, P. R. Barker, N.W. Alcock, Z. Pikramenou, M.J., Hannon, D.G. Kurth, Angew. Chem. Int. Ed. 40 (2001 ) 3862-3865 pour le composé AIM2.
En particulier, la synthèse du ou des composés selon l’invention peut s’effectuer selon le procédé décrit ci-dessous.
Les ligands terpyridines requis pour la synthèse des composés organométalliques selon l’invention ont été préparés en utilisant la réaction de Krohnke entre la 2-acétylpyridine et un composé aryl aldéhyde approprié en présence d’ammoniac. Par exemple, les complexes homoleptiques AIM1 , AIM2 et AIM3 sont obtenus avec un rendement respectif de 90, 69 et 83% en faisant réagir le ligand terpyridine approprié (2 équivalents) avec du FeCh dans de l’acétonitrile ( schéma 1).
Schéma 1
En particulier, une solution comprenant FeCh (106 mg, 0,84 mmoles) et du méthanol (20 ml_) est additionnée à une solution comprenant le ligand terpyridine approprié (1 ,68 mmoles) et du méthanol (20 ml_). Le mélange est alors agité pendant 10 min. De l’éther éthylique (100 mL) est ensuite ajouté conduisant à un solide pourpre collecté par filtration, lavé à l’éther et séché sous vide.
AIM1. Rendement: 90%. RMN 1 H (200 MHz, CD3OD): d = 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 7.49 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 6.68 (m, 4H), 5.90 (d, J = 3.8 Hz,
8H) ppm. HRMS (ESI) calcd pour C3oH22FeN6Cl2 m/z = 261 .0627 [M - 2 Cl]2+. Trouvé: 261 .0683.
AIM2. Rendement: 69%. RMN 1 H (200 MHz, DMSO-d6 ) 9.70 (s, 4H), 9.09 (d, J=8.5 Hz, 4H), 8.57 (d, J=7.4 Hz, 2H), 8.05 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 7.85 (t, J=7.2 Hz, 4H), 7.78 (t, J=7.0 Hz, 2H ,), 7.3 (d, J=5.1 Hz, 4H), 7.2 (t, J=6.3 Hz, 4H). HRMS (ESI) calcd pour
C42H3oFeN6Cl2 m/z = 337.0936 [M - 2 Cl]2+. Trouvé: 337.0902.
AIM3. Rendement: 83%. RMN 1 H (200 MHz, CD3CN): d = 9.27 (s, 2H), 9.08 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 8.65 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.38 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 7.97 (dt, J = 6.7 Hz, 1 .2 Hz, 2H), 7.22-7.10 (m, 4H) ppm. HRMS (ESI) calcd pour C^HzsFeNsCh m/z = 338.0888 [M - 2 Cl]2+. Trouvé: 338.0906.
I I . Utilisation thérapeutique du ou des composés de formule générale (I)
Comme cela a déjà été mentionné précédemment, le ou les composés organométalliques de formule (I) selon l’invention présentant une action déméthylante de l’ADN peuvent aussi représenter une substance active à des fins thérapeutiques, comme cela sera décrit ci-après. La présente invention porte ainsi sur un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines, ayant une formule générale (I) telle que définie ci-dessus pour son utilisation comme médicament.
Bien sûr les caractéristiques décrites ci-dessus pour le ou les composés organométalliques de formule (I) à usage non-thérapeutique sont reprises ici pour l’usage thérapeutique (à savoir pour leur utilisation en tant que médicament).
En particulier, selon un mode de réalisation de l’invention, le composé organométallique de formule (I) exclut le ou les composés où R1=R3=R4=R6=H et où R2=R5 est choisi parmi un cycle aromatique de formule (V) ou (VI) dans lequel Z est un atome de soufre ou un cycle aromatique de formule (II) ou (III) avec Y=CH.
De préférence, le ou les composés organométalliques selon l’invention peuvent être utilisés afin de traiter des maladies liées à une hyperprolifération cellulaire, en particulier des cancers.
En particulier, le ou les composés organométalliques selon l’invention peuvent être utilisés pour traiter des glioblastomes, des leucémies promyélocytaires, des cancers de la prostate, des ovaires, des poumons, des seins, des voies digestives, en particulier du foie, du pancréas, de la tête et du cou, du colon, des lymphomes non-Hodgkiniens ou des mélanomes, etc.
Les composés de l'invention présentent un effet antiprolifératif vis-à-vis de cellules tumorales et saines. Ces composés entraînent une accumulation des cellules en phase G2/M ou G0/G1. Une mort cellulaire peut être observée mais seulement après des traitements longs de minimum 96h. Ainsi ces composés peuvent être utilisés afin de réduire la prolifération tumorale.
En outre, le ou les composés organométalliques peuvent être utilisés pour traiter des tumeurs résistantes à d’autres agents anticancéreux.
De par la capacité déméthylante de ces composés, la Demanderesse a également découvert que le ou les composés organométalliques selon l’invention pouvaient être utilisés pour traiter d’autres maladies liées à une dérégulation des modifications épigénétiques, telles que pour traiter l’inflammation, l’obésité, les maladies neurodégénératives ou les maladies cardiovasculaires.
Egalement, la présente invention pourra être destinée à former une composition pharmaceutique comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un composé organométallique de formule (I) tel que défini ci-dessus.
Bien sûr les caractéristiques décrites ci-dessus pour le ou les composés organométalliques de formule (I) à usage non-thérapeutique ou pour l’utilisation en tant que médicament sont reprises ici pour l’usage thérapeutique en tant que médicament.
Dans le contexte de l'invention, le terme « support acceptable sur le plan pharmaceutique » désigne des substances telles que les excipients, les véhicules, les adjuvants, les tampons qui sont classiquement utilisés, en combinaison avec un ou des principes actifs (ici, le ou les composés organométalliques selon l’invention), pour la préparation d'un médicament. Le choix de tels supports dépend essentiellement de la voie d'administration envisagée.
En général, le support acceptable sur le plan pharmaceutique est un excipient, un véhicule et/ou un adjuvant choisi dans le groupe constitué par les excipients, les véhicules et/ou les adjuvants pharmaceutiquement acceptables.
Des techniques de préparation de compositions pharmaceutiques peuvent être aisément retrouvées par l'homme du métier, par exemple dans l'ouvrage Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mid. Publis. Co, Easton, PA, USA.
Des adjuvants, des véhicules et des excipients physiologiquement acceptables sont aussi décrits dans l'ouvrage intitulé "Handbook of Pharmaceutical Excipients, seconde édition, American Pharmaceutical Association, 1994".
Pour formuler une composition pharmaceutique, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne ou de la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique (USP).
L'homme du métier pourra notamment avantageusement se référer à la quatrième édition 2002 de la Pharmacopée Européenne, ou encore à l'édition USP 25-NF 20 de la Pharmacopée Américaine (U. S. Pharmacopeia).
Ainsi, la composition pharmaceutique peut comprendre un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, les solubilisants, les stabilisants, les conservateurs, etc.
La composition pharmaceutique peut être une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire.
La composition pharmaceutique peut se présenter sous une forme liquide, ou, de manière préférentielle, sous une forme solide.
Pour une administration orale, on préférera une composition pharmaceutique solide, par exemple sous la forme de comprimés, de capsules ou de gélules.
Sous la forme liquide, on préférera une composition pharmaceutique sous la forme d'une suspension aqueuse.
Une composition pharmaceutique peut ainsi se présenter sous une forme pour l'administration orale, par inhalation, parentérale ou injection comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, etc.
Selon un premier aspect, les formes orales sont particulièrement préférées. Selon un deuxième aspect, les voies intraveineuse, intramusculaire, sous- cutanée, et par inhalation sont préférées.
A titre d’exemple, pour les injections, les compositions sont généralement sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans un support acceptable qui comprend des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc.
Il est entendu que le débit d'injection et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie concernée, du mode d'administration, etc.
Typiquement, le ou les composés organométalliques selon l'invention sont administrés à des doses pouvant varier entre 0,1 pg et 100 mg/kg de poids corporel, plus généralement entre 0,01 et 10 mg/kg, typiquement entre 0,1 et 10 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées. D'autre part, pour des traitements chroniques, des systèmes à libération prolongée et/ou retardée peuvent être avantageux.
A titre d’exemple, pour une administration par voie orale, des formes pharmaceutiques solides en tant que support pharmaceutique peuvent comprendre, en tant que véhicules, adjuvants ou excipients, au moins un agent diluant, un arôme, un agent solubilisant, un agent lubrifiant, un agent de suspension, un agent désintégrant et un agent d'encapsulation, l'identité et la fonction de ces différents classiques étant documentés complètement dans la Pharmacopée Européenne ou dans la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique, (USP).
De tels composés sont par exemple le carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le talc, le lactose, la pectine, la dextrine, l'amidon, la gélatine, des matériaux cellulosiques, etc. Les compositions sous forme liquide peuvent comprendre également de l'eau, le cas échéant en mélange avec du propylèneglycol ou du polyéthylèneglycol, et éventuellement aussi des agents de coloration, des arômes, des stabilisants et des agents épaississants.
Généralement, afin de traiter un patient d’une pathologie liée à une dérégulation des modifications épigénétiques (telle que le cancer), la méthode comprend une étape au cours de laquelle on administre audit patient, une quantité thérapeutiquement efficace d’un extrait sec purifié du ou des composés organométalliques selon l’invention, ou encore de la composition pharmaceutique décrite ci-dessus.
Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, réduction de la croissance tumorale, etc.). Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements chimiques ou physiques (chimiothérapie, radiothérapie, thérapie génique, etc.)· Les traitements et médicaments de l'invention sont tout particulièrement destinés aux humains.
Ainsi, le ou les composés organométalliques selon l’invention et/ou la composition pharmaceutique pourront par exemple être utilisés dans le traitement des cancers en combinaison avec un traitement anticancéreux mettant en oeuvre des rayonnements, tel que la radiothérapie.
Egalement, le ou les composés organométalliques selon l’invention et/ou la composition pharmaceutique pourront par exemple être utilisés dans le traitement des cancers en combinaison avec au moins un autre agent chimique anticancéreux, conditionné et administré de façon combinée, séparée ou séquentielle. Par exemple, il serait possible de prévoir un pré-traitement avec un composé selon l’invention, suivi d’un traitement avec un agent anticancéreux.
L’autre agent chimique anticancéreux peut être par exemple le cisplatine, le carboplatine, le taxotère, le taxol, le tomoxifène, la doxorubicine ou encore le 5- fluorouracile et est avantageusement le taxol, le 5-fluorouracile ou encore le tomoxifène ou la doxorubicine.
La Demanderesse a en effet mis en évidence de manière surprenante que les composés selon l’invention permettaient de sensibiliser des cellules cancéreuses à des agents anticancéreux, voire d’agir en synergie avec eux (exemples 1 1 et 12).
La présente invention permet ainsi d’inhiber in vivo, in vitro ou ex vivo la prolifération de cellules tumorales, comprenant la mise en contact desdites cellules tumorales avec la composition pharmaceutique. Les cellules tumorales peuvent être notamment celles des pathologies spécifiées ci-dessus.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures annexées et les exemples suivants où :
- la Figure 1 : représente le résultat d’une expérience de modélisation moléculaire de la capacité déméthylante du composé AIM3 selon l’invention ;
- la Figure 2 : représente l’évaluation du pouvoir déméthylant des composés AIM2 et AIM3 selon l’invention dans un système in vitro, (a) des tests ELISA ont été réalisés afin de mesurer le taux de cytosines méthylées présent sur un fragment d’ADN après action de la déméthylase TET2 ou des molécules AIM2 et AIM3 ; (b) l’activité déméthylante de AIM2 (2mM) et de la protéine his-tagged-TET2 (10pg) a été mesurée par un dosage de l’incorporation de groupements méthyle radiomarqués au niveau d’un ADN double brin biotynilé et préalablement méthylé par l’enzyme MSsI ;
- la Figure 3 : représente l’évaluation du pouvoir déméthylant global des molécules AIM2 et AIM3 dans les cellules U251 : un test ELISA a été réalisé afin de mesurer le taux de cytosines méthylées présent au niveau de l’ADN de cellules U251 non traitées versus traitées pendant 1 ou 4h avec 2mM de 5aza-2-déoxycytidine, AIM2 ou AIM3 ;
- la Figure 4 : représente l’évaluation du pouvoir déméthylant global de la molécule AIM3 sur les cellules T98G et montre l’absence d’effet dose du pouvoir déméthylant de la molécule AIM3 suite à son incubation pendant 1 h (p=0.2578) ;
- la Figure 5 : représente l’évaluation du pouvoir déméthylant global des molécules AIM2 et AIM3 selon l’invention sur les cellules MDA-MB231 : une quantification par densitométrie a permis d’obtenir une valeur quantitative de l’intensité des bandes présentent dans la partie encadrée du gel (le calcul du pourcentage de déméthylation a été calculé à l’aide de la formule indiquée) ;
- la Figure 6 : représente l’influence de la molécule AIM2 selon l’invention sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires MCF-10A et tumorales mammaires MDA-MB231 et Hs578T : les cellules ont été ensemencées, après 24h de culture les cellules ont été traitées pendant 48h avec des concentrations variables de la molécule AIIM2 ; la détermination du nombre de cellules adhérentes a été réalisée par une coloration au cristal violet et quantifiée par une mesure de l’absorbance à 595 nm ; les résultats correspondent à la moyenne de 4 expériences indépendantes, les erreurs standard à la moyenne (SEM) sont indiquées et la significativité des données a été calculée en comparant les cellules traitées vs non traitées (test de Student) ;
- la Figure 7 : représente l’influence de la molécule AIM3 selon l’invention sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires MCF-10A et tumorales mammaires
MDA-MB231 et Hs578T : les cellules ont été ensemencées, après 24h de culture les cellules ont été traitées pendant 48h avec des concentrations variables de la molécule AIIM3 ; la détermination du nombre de cellules adhérentes a été réalisée par une coloration au cristal violet et quantifiée par une mesure de l’absorbance à 595 nm ; les résultats correspondent à la moyenne de 4 expériences indépendantes, les erreurs standard à la moyenne (SEM) sont indiquées- la significacité des données a été calculée en comparant les cellules traitées vs non traitées (test de Student) ;
- la Figure 8 : est une analyse du cycle cellulaire des cellules MCF-10A traitées ou non avec 0,5mM de AIM2 ou AIM3 ; les cellules ont été ensemencées et traitées avec 0,5mM d’AIM2 ou de AIM3 pendant 0, 16, 24, 48 et 72h ; après détachement les cellules sont fixées et perméabilisées dans une solution d’éthanol froid à 70% ; un marquage à l’iodure de propidium est ensuite réalisé afin de marquer l’ADN et la fluorescence est quantifiée par cytométrie en flux ;
- la Figure 9 : représente une analyse du nombre de cellules traitées ou non avec 2mM de AIM2 ou AIM3. Les cellules ont été ensemencées et traitées avec 2mM d’AIM2 ou de AIM3 pendant 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 et 192h. Après détachement les cellules sont dénombrées à l’aide d’une cellule de comptage de type Malassez. Le milieu des cellules NT ou AIM2 ou AIM3 est renouvelé toutes les 72h. Pour les cellules AIM2(72)+NT ou AIM3(72)+NT le milieu de culture contient la molécule indiquée uniquement pendant 72h et après cela il est remplacé par un milieu sans molécule afin de tester la réversibilité de l’effet ;
- la Figure 10 : correspond au plan expérimental de plaque de l’exemple 11 ; - la Figure 11 : est une représentation graphique de la viabilité cellulaire des
MDA-MB 231 traitées par différentes concentrations du composé AIM2 selon l’invention et/ou de tamoxifène ;
- la Figure 12 : représente un ensemble de graphique montrant la sensibilité de différentes lignées de tumeurs mammaires face aux composés AIM2, AIM3, des agents de chimiothérapies classiques et leurs combinaisons ;
- la Figure 13 : représente le plan d’expérience de l’exemple 13 ;
- la Figure 14 : représente l’inhibition de la prolifération par les molécules AIM2 et AIM3 qui est réversible dans certaines cellules ; de gauche à droite sont présentés les résultats concernant les cellules MDA-MB-231 (cellules cancéreuses mammaires triples négatives), MCF10A (cellules épithéliales mammaires saines) et T47R+Doxo (cellules cancéreuses mammaires résistantes à la doxorubicine) traitées avec AIM2 (panel du haut) ou AIM3 (panel du bas) pendant 72h de prétraitement puis réensemencées pour 72h supplémentaires ; les différentes conditions correspondent à : T= sans traitement préalable ni durant ces 72h ; AIM2/3+NT cellules prétraitées avec AIM2 ou AIM3 et ensuite sans traitement ; AIM2/3+AIM2/3 cellules prétraitées avec AIM2 ou AIM3 et ensuite remises en présence de AIM2 ou AIM3 pour 72h ;
- la Figure 15 : représente les conditions d’expérience de l’Exemple 14 ;
- la Figure 16 : représente les molécules testées de l’Exemple 14 ;
- la Figure 17 : représente l’inhibition de la prolifération des cellules T47D R+ doxo par les différentes molécules AIM1 , AIM2, AIM3 et Ru après 48 et 72h de traitement ;
- la Figure 18 : représente l’inhibition de la prolifération des cellules de glioblastomes U251 et U87 par les différentes molécules AIM1 , AIM2, AIM3 et Ru après 72h de traitement ;
- la Figure 19 : représente l’inhibition de la prolifération des cellules T47D par les différentes molécules AIM1 , AIM2, AIM3 et Ru après 48h de traitement ; et
- la Figure 20 : représente l’inhibition de la prolifération des cellules MDA- MB-231 par les différentes molécules AIM1 , AIM2, AIM3 et Ru après 48h de traitement. III. EXEMPLES
Afin de confirmer biologiquement ces données, une étude de l’influence des molécules AIM3 et AIM2 sur la méthylation de l’ADN a été réalisée dans des systèmes acellulaires et cellulaires.
EXEMPLE 1 : Solubilisation des composés AIM2 et AIM3 selon l’invention pour leur utilisation sur cellules
Pour les différents essais décrits ci-dessous, les composés AIM2 et AIM3 selon l’invention ont été préalablement solubilisés de la manière suivante (Tableau 1 ):
Tableau 1
Pour le composé AIM2, les solutions filles peuvent précipiter à 4°C. Il est ainsi nécessaire de les incuber à 37°C pendant 10 min avant leur utilisation.
EXEMPLE 2 : Modélisation moléculaire de la capacité déméthylante du composé AIM3 selon l’invention
Afin de démontrer l’action déméthylante des composés organométalliques selon l’invention, la Demanderesse a réalisé une modélisation moléculaire de la capacité déméthylante du composé AIM3 selon l’invention.
A cet effet, le profil d’énergie lié à la réaction de déméthylation a été réalisé à l’aide des calculs de chimie quantique. Notamment un système modèle comprenant une cytosine méthylée et AIM3 a été utilisé. Les géométries des réactifs et des produits ont été optimisées à l’aide de la théorie de la fonctionnelle de la densité « DFT » en utilisant wB97XD comme fonctionnelle d’échange-corrélation et LANL2DZ comme base d’orbitales.
Par la suite l’état de transition, c’est à dire la conformation d’énergie maximale, a été aussi optimisé ce qui a permis d’estimer la barrière énergétique qui doit être surmonté pour pouvoir compléter la réaction dans ce cas de déméthylation. Le profil énergétique de la réaction dans l’espace reliant les réactifs et les produits via l’état de transition a aussi été estimé en analysant la variation d’énergie selon une coordonnée de réaction, c’est à dire la distance entre le méthyl et l’azote périphérique de AIM3. Les effets du solvant, l’eau, ont été pris en compte à l’aide d’un modèle du continuum polarisable « PCM ». Tous les calculs de modélisation moléculaire ont été réalisés via le logiciel Gaussian 09 version D01 et grâce aux techniques standards de modélisation moléculaire notamment détaillées dans des nombreux ouvrages comme par exemple « Chris J. Cramer Essential of Computational Chemistry Wiley eds ». De plus l’homme de métier pourra se référer au manuel de Gaussian 09 pour une illustration détaillée des techniques d’optimisation de géométrie qui ont été utilisées.
Comme le montre la FIG.1 , les résultats obtenus ont révélé que le composé AIM3 et les autres composés organométalliques de formule (I) pourraient entraîner une déméthylation directe de l’ADN via des réactions thermodynamiques favorables.
EXEMPLE 3 : Mesure du taux de 5-méthylacytosine (5mC) par ELISA (Fiq.2 (a))
Test acellulaire :
Les expériences acellulaires consistent à incuber de l’ADN méthylé (Qiagen, France) à 37°C pendant 1 h avec soit 2mM de molécules AIM2 et AIM3, soit avec la protéine TET2 recombinante qui est une protéine connue pour son rôle déméthylant et servant de contrôle positif ou soit avec de l’eau (Ctrl).
En particulier, l’ADN méthylé (500ng, ref#N4007 NEB, ADN génomique de cellule HeLa hyperméthylée in vitro par l’enzyme M.Sssi) est incubé pendant 1 h at 37°C soit en présence d’eau (Ctrl), soit en présence de AIM2 (2 mM) ou AIM3 (2 mM), soit en présence de 10 pg de protéine his-tagged-TET2.
L’ADN est ensuite utilisé pour réaliser un test 5mC-ELISA (Zymo Research) i.e. permettant de mesurer le niveau de 5-méthylcytosines (voir ci-dessous).
Test cellulaire :
Les cellules de gliomes U251 ou de glioblastomes T98G ont été ensemencées à 2.106 respectivement. 24 h après l’ensemencement, les cellules ont été traitées pendant 1 ou 4h avec les molécules AIM2 ou AIM3 à raison de 0, 2, 5, 10 mM. Après le traitement le milieu de culture est remplacé par un milieu sans molécule et les cellules sont maintenues 48h en culture. Les cellules sont ensuite détachées mécaniquement avec un grattoir afin de réaliser une extraction d’ADN total via l'utilisation de l’automate QiaCube (Qiagen) et du kit QIAamp DNA Mini QIAcube Kit (Qiagen), sans modification avec les instructions fournies par Qiagen.
5mC-ELISA (Zymo Research)
L’ADN (100ng) collecté comme indiqué ci-dessus est tout d’abord dénaturé à 98°C pendant 5min (utilisation du thermocycler MyCycler BioRad), avant d’être déposé dans les puits de la plaque : 96 puits prévus à cet effet (Kit 5mC-ELISA, Zymo) pour 1 h d’incubation à 37°C. Le surnageant est ensuite retiré et les puits sont lavés 3 fois avec 200 pL de tampon de lavage (fourni par le kit). Puis, 200 pL de tampon de lavage sont incubés dans chaque puits pour 30min à 37°C. L’étape de révélation/quantification des 5- méthylcytosines est réalisée avec l’incubation (1 h, 37°C) de l’anticorps anti-5mC fourni par le kit (ref/A3001-30), dilué au 1/2000. Après 3 lavages (200 mI_ de tampon de lavage fourni par le kit), l’anticorps primaire est révélé suite à l’incubation (1 h, 37°C) de l’anticorps secondaire couplé HRP (D5325-3-30). Enfin, après 3 lavages (200 mI_ de tampon de lavage fourni par le kit), la révélation de l’ELISA est réalisée par ajout de 100 mI_ de « HRP developer » (fourni par le kit). La lecture de la plaque ELISA est réalisée à 405-450 nm (Victor plate reader, Perkin Elmer). En parallèle, une gamme étalon est réalisée avec de l’ADN méthylé dont le pourcentage de 5mC est connu (gamme : 0, 5, 10, 25, 50, 75, 100%).
Comme le montre la Fig.2(a), la mesure du taux de méthylcytosines (test
ELISA) présentes au niveau de la sonde d’ADN a permis de révéler une baisse significative des méthylcytosines après un traitement avec les molécules AIM3 et AIM2.
EXEMPLE 4 : Dosage des groupements méthyl radiomarqués (Fig. 2(b))
De plus, l’activité déméthylante de AIM2 (2mM) et de la protéine his-tagged-
TET2 (10pg) (témoin positif) a été mesurée par un dosage de l’incorporation de groupements méthyle radiomarqués au niveau d’un ADN double brin biotynilé et préalablement méthylé par l’enzyme M.SSsl.
Protocole
Cette expérience DMB est réalisée comme décrit par Yokochi and Robertson
(2004).
Une plaque de 96 puits est préalablement pré-traitée avec 10 mg/ml de BSA (bovine sérum albumin) pendant 30 min.
Les billes magnétiques (10 mg/ml, Dynal) sont lavées trois fois avec le tampon TENT2M (20 mM Tris, pH 8.0, 2 mM EDTA, 0.01 % Triton X-100, 2 M NaCI). La concentration de ces billes est ajustée à 2,5 mg/ml avec le tampon TENT2M et 1/10 du volume avec la forme non radioactive de AdoMet (100 mg/ml ; Sigma).
La réaction de méthylation (40 mI) contient 200 U de l’enzyme M.Sssi (NEB#M0226) 125 nM d’oligonucléotides d’ADN, 200ng d’ADN, and 900 nM tritium- labeled AdoMet (Amersham Bioscience, 1 mCi/ml) dans le milieu réactionnel (50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM EDTA, 10% glycérol, 10 mM 2-mercaptoéthanol, 0,5 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle).
Après une incubation de 30 min à 37 °C, les réactions sont stoppées par l’ajout d’un volume équivalent de billes magnétiques en suspension et une agitation douce pendant 15 min à température ambiante. Les billes magnétiques sont séparées à l’aide d’un aimant et lavées successivement avec 300, 200, 150, and 100 mI TENT1 M (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.005% Triton X-100, 1 M NaCI). Les billes magnétiques sont resuspendues dans 25 mI de TENT1 M en présence des“agents déméthylant putatifs” ou avec 100 pg d’extrait nucléaire isolé à l’aide du kit, nuclear extract kit (Active Motif, # 40410). Après les incubations, les billes magnétiques sont séparées à l’aide d’un aimant et lavées successivement avec 300, 200, 150, and 100 mI de TENT1 M (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.005% Triton X-100, 1 M NaCI). Ensuite le taux de tritium incorporé est mesuré dans un compteur à scintillation.
Résultats (Fig.2(b))
Comme le montre la Fig.2(b), le composé AIM2 présente une action déméthylante de l’ADN.
EXEMPLE 5 : Expérience sur des cellules du glioblastome U251 (Fiq.3)
Parallèlement, dans le but de vérifier le pouvoir déméthylant de ces molécules organométalliques selon l’invention, des expériences sur des cellules de glioblastome U251 ont été réalisées.
Protocole
L’expérience réalisée sur les cellules U251 a consisté à traiter ces dernières pendant 1 ou 4h avec 2mM d’AIM2, AIM3 ou de 5aza-2-déoxycytidine qui est un agent déméthylant connu et couramment utilisé.
A la suite des traitements, l’ADN a été extrait et soumis à un test ELISA afin de déterminer le taux de cytosines méthylées (protocole, voir EXEMPLE 3).
Résultats :
Comme indiqué sur la Figure 3, les molécules AIM2 et AIM3 présentent un pouvoir déméthylant après 1 h et 4h d’incubation nettement supérieur à celui de la 5aza-2- déoxycytidine qui est l’agent déméthylant connu et couramment utilisé, mais qui nécessite une incorporation au sein de l’ADN.
EXEMPLE 6 : Expérience sur une autre ligne cellulaire de glioblastome T98G (Fiq.4)
Par ailleurs, l’action déméthylante de AIM3 a également été observée sur une autre lignée cellulaire de glioblastome, appelée T98G (Figure 4).
Protocole
L’expérience réalisée sur les cellules T98G a consisté à traiter ces dernières pendant 1 h avec différentes concentrations du composé AIM3 selon l’invention, à savoir 0 ; 2 ; 5 et 10 mM.
A la suite des traitements, l’ADN a été extrait et soumis à un test ELISA afin de déterminer le taux de cytosines méthylées (protocole, voir EXEMPLE 3).
Résultats :
Comme indiqué sur la Figure 4, dans ces cellules le pouvoir déméthylant de la molécule AIM3 est visible après 1 h de traitement à une concentration de 2mM. Néanmoins, une augmentation de la concentration de cette molécule (de l’ordre de 5 à 10 mM) n’augmente pas son pouvoir déméthylant. En effet, une dose de 2mM de AIM3 présente un effet déméthylant qui est similaire à celui d’une dose de 10 mM de AIM3.
EXEMPLE 7 : Expérience sur les cellules MDA-MB231 (Fiq.5)
Une expérience de digestion enzymatique a également été réalisée afin de déterminer le pourcentage de déméthylation global induit par les molécules AIM2 et AIM3 selon l’invention.
Protocole
1. Culture cellulaire
1.1. Conditions de culture et traitements
Les cellules de la lignée cancéreuse mammaire MDA-MB 231 sont cultivées en milieu RPMI 1640 (Gibco) contenant 2mM de L-Glutamine (Sigma), 0,1 mg/mL de gentamicine (Sigma) et 10% de sérum de veau foetal (Sigma) décomplémenté 30 minutes à 56°C. Elles sont incubées à 37°C et à 5% de CO2.
L’ensemencement s’effectue en boîtes de Pétri 6cm (4mL milieu/boîte) selon les conditions suivantes (tableau 2) :
Tableau 2
1.2. Conditions de reprise des molécules
5aza2déoxycytidine (Sigma A3656)
La poudre est reprise à 100 mM dans du DMSO (Sigma). Cette solution stock est aliquotée (2pL) et stockée à -80°C.
Les dilutions intermédiaires s’effectuent dans le milieu de culture.
AIM 2
La poudre (717,07 g/mol) est reprise à 1 mM dans du PBS (Fisher) contenant
20% d’éthanol. Cette solution mère est stockée à 4°C.
Les dilutions intermédiaires s’effectuent dans du PBS. AIM 3
La poudre (719,06 g/mol) est reprise à 5mM dans du PBS contenant 20% d’éthanol. Cette solution mère est stockée à 4°C.
Les dilutions intermédiaires s’effectuent dans du PBS
NB : Les solutions mères de AIM 2 et AIM3 précipitent à 4°C. Il suffit de les incuber 5 minutes à 37°C afin de les re-solubiliser.
1.3. Procédure de récolte des cellules
Le tapis cellulaire est lavé avec 2mL de PBS, puis trypsiné avec 0,5mL de trypsine EDTA 1X (Sigma) pendant 5 minutes à 37°C. L’action de la trypsine est ensuite inhibée par l’ajout de 4 mL de milieu de culture.
La suspension cellulaire est enfin centrifugée à 200 G pendant 5 minutes et le culot conservé à -20°C.
1.4. Planning
Tableau 3
2. Lyse et extraction de l’ADN
2.1. Lyse cellulaire
Chaque culot est repris dans 100pL de PBS, auxquels sont ajoutés dans l’ordre :
100 pL eau
- 150 pL SDS 0,1 %
50 pL Protéinase K à 10mg/mL (Sigma)
La lyse s’effectue à 37°C toute la nuit. 2.2. Extraction de l’ADN
Ajouter au lysat 2 volumes de phénol/chloroforme 5 : 1
Vortexer 30 secondes
Centrifuger à 16 000 G pendant 5 minutes à température ambiante
Récupérer la phase aqueuse (surnageant)
Ajouter 1 volume de chloroforme/isoamylalcool 23 : 1
Centrifuger à 16 000 G pendant 5 minutes à température ambiante
Récupérer la phase aqueuse (surnageant)
Ajouter 1/10 du volume d’acétate de sodium 3M
Puis 1 volume d’éthanol absolu froid
Vortexer 10 secondes
Laisser précipiter une nuit à -20°C
Centrifuger à 12 000 G pendant 15 minutes à 4°C
Laver le culot avec 500 pL d’éthanol 70%
Centrifuger à 12 000 G pendant 5 minutes à 4°C
Laisser sécher le culot (couvercle du tube ouvert) jusqu’à ce qu’il devienne translucide
Dissoudre le culot dans de l’eau stérile (100 pL environ, volume à ajuster en fonction de la taille du culot obtenu)
Doser l’ADN à 260 nm
Conserver l’ADN à -20°C
3. Digestions enzymatiques avec MSPI et Hpall (Fisher, ER0541 et ER051 1 )
1 pg d’ADN de chaque condition est digéré avec MSPI et Hpall selon le protocole suivant :
2 pL Buffer TANGO 10X
1 pg ADN
Eau qsp 16 pL
2 pL Hpall ou Mspl (=20 U)
Incuber à 37°C toute la nuit, puis 20 minutes à 80 °C (inactivation enzymes)
4. Migration de l’ADN digéré sur gel d’agarose
Ajouter 4pL de bleu de dépôt 6X à chaque volume de digestion (20pL)
(Bleu dépôt 6X : 10mM TrisHCI pH 7,6, 60mM EDTA, 60% glycérol, 0,03% bromophénol bleu, 0,03% xylène cyanol FF)
Faire migrer la totalité de chaque digestion sur un gel d’agarose 1 % + 2pL BET 10mg/mL à 90V pendant 40 minutes.
L’intensité de chaque bande est mesurée à l’aide du logiciel Quantity One.
Calcul % de déméthylation de l’ADN : (Hpall - Mspl)Traité x 100 / (Hpall - Mspl )NOP Traité Résultats :
Les données présentées figure 5 confirment que, comme la 5-azacytidine, le traitement de cellules MDA-MB231 avec les molécules AIM2 et AIM3 permet de réduire le pourcentage globale de méthylation du génome.
EXEMPLE 8 : Influence des composés AIM2 et AIM3 selon l’invention sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires MCF-10A et tumorales mammaires MDA-MB231 et Hs578T (Fig.6 et Fig.71
Protocole cristal violet
Tableau 4
Les cellules sont ensemencées selon les densités indiquées ci-dessus (Tableau 4). Après 24h de culture, le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant ou non les molécules AIM2 ou AIM3 aux concentrations de 0,5 ; 1 ; 1 ,5 ; 2 et 2,5 mM en quatre exemplaires pendant 48h. Après ces 48h de traitement le milieu de culture est enlevé et les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X. Elles sont ensuite fixées dans 100pL de milieu de culture contenant 4% de paraformaldéhyde et incubées 20 min à température ambiante. Les cellules sont ensuite rincées avec une solution de PBS 1X. Puis elles sont colorées 30 min à l’aide de 100pL d’une solution de Cristal Violet 0,1 % (dilution au 1/5 dans H2O de la solution stock : 0.5% cristal violet 2% éthanol). Les cellules sont ensuite lavées 3 fois avec 100pL d’FhO.
L’étape suivante consiste à solubiliser le cristal violet afin d’obtenir une solution colorée qui pourra être dosée. Ainsi, 100pL d’une solution d’acide acétique à 10% est ajoutée, puis les plaques sont incubées sous agitation jusqu’à la solubilisation totale du Cristal Violet. Une lecture de l’absorbance est ensuite réalisée à 595 nm grâce à un lecteur de plaque (VICTOR).
Résultats :
Au niveau biologique, il a été déterminé que les molécules AIM2 et AIM3 présentaient une action antiproliférative sur des cellules épithéliales mammaires normales (MCF-10A) et sur des cellules tumorales mammaires (MDA-MB231 et Hs578T) (Figure 6 et 7). Ces résultats permettent de définir la concentration médiane inhibitrice (IC50) des molécules AIM2 (Figure 6) et AIM3 (Figure 7). L’IC50 de la molécule AIM2 dans les cellules MCF-10A est comprise entre 0,5 et 1 mM et dans les cellules MDA-MB231 entre 1 et 1 ,5mM ; l’IC50 de la molécule AIM3 dans les cellules MCF-10A est comprise entre 1 et 1 ,5mM et dans les cellules MDA-MB231 entre 1 ,5 et 2mM. EXEMPLE 9 : Influence des composés AIM2 et AIM3 selon l’invention sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires MCF-10A par cytométrie en flux (Fiq.8) : absence de toxicité cellulaire
Dans le but de définir cette action antiproliférative, une étude du cycle cellulaire des cellules épithéliales mammaires MCF-10A par cytométrie en flux a également été réalisée (Figure 8).
Protocole : cycle cellulaire
1. Ensemencer les cellules dans des boîtes 60mm.
La concentration des cellules est présentée dans le tableau en dessous.
Tableau 5
2. Traiter les cellules selon le temps de traitement.
3. Récupérer le milieu de chaque boîte dans un tube de 15ml.
4. Laver les cellules avec 2mL de PBS.
5. Récupérer le PBS dans le tube.
6. Ajouter 1 mL de trypsine 1 c dans chaque boîte et les incuber dans l’incubateur pendant
5 minutes pour les MDA-MB231 et les Hs578T, et 15 minutes pour les MCF-10A.
7. Inhiber la trypsine avec le milieu et récupérer les cellules dans le tube.
8. Bien re-suspendre les cellules et faire un comptage à l’aide d’un TC10™ Automated Cell Counter (Bio-Rad).
9. Prendre 1x106 cellules dans un nouveau tube de 15ml, centrifuger à 500 G pendant 5 minutes.
10. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec 2ml de PBS.
1 1. Centrifuger à 500 G pendant 5 minutes.
12. Aspirer le surnageant, reprendre le culot dans 300mI de PBS et bien séparer les cellules avec une pipette 200mI.
13. Ajouter 700mI de l’éthanol absolu froide au goutte à goutte tout en vortexant dans le tube.
14. Mettre les cellules dans le frigo à -20°C au moins 30 minutes pour assurer une perméabilisation et une fixation correcte.
15. Prendre 500pL de cellules (5x105 cellules) de chaque suspension et centrifuger à
800G pendant 10 minutes.
16. Aspirer délicatement le surnageant. 17. Reprendre chaque culot dans 500 mI de DNA stainning solution contenant 10mI de RNase A et 2mI d’iodure de propidium(IP,50 pg/ml). Les culots non marqués sont repris dans 500pL de PBS.
18. Incubation 10 minutes à l’obscurité.
19. Lecture au FACS.
Résultats :
Comme le montre la Fig.8, les résultats obtenus indiquent qu’un traitement avec 0,5 mM d’AIM2 et AIM3 induit un blocage du cycle cellulaire en phase G1. L’absence de cellules en phase subG1 indique que ces molécules ne présentent pas de toxicité cellulaire dans ces conditions de traitement.
EXEMPLE 10 : Influence sur la prolifération cellulaire (essai PARP clivée par Western L’absence de mort cellulaire a été confirmée par des expériences au cours desquelles il a été vérifié l’absence de la protéine PARP clivée par western blot
L’effet de ces molécules sur la prolifération cellulaire a également été évalué en fonction du temps de traitement et non plus de la dose de molécule utilisée. La dose de 2mM, qui est celle capable d’entraîner une déméthylation de l’ADN, a été choisie.
Protocole :
Les cellules sont ensemencées dans des boîtes de 60mm à raison de 4 mL/boîte le 1er jour à la concentration indiquée dans le tableau ci-dessous.
Tableau 6
6 heures après leur ensemencement, les complexes organométalliques AIM2 et AIM3 à 2mM ou le solvant (0.04% d’éthanol) pour les cellules non traitées sont ajoutés dans le milieu de culture. A l’issue du temps de traitement choisi, 24, 48, 72, 96, 120, 144 heures, les cellules traitées et non traitées sont détachées par action de la trypsine. Après inactivation de la trypsine avec du milieu de culture contenant 10% de sérum de veau foetal, les cellules sont lavées dans du PBS et comptées après coloration au Bleu Trypan afin de ne compter que les cellules vivantes (une fraction de 10mI de la suspension est mélangée avec 10mI de bleu de Trypan à 0,4% (Thermo Scientific). Le comptage des cellules est effectué à l’aide d’une cellule de comptage Malassez (Marienfeld-Superior). a). Préalablement au traitement, les molécules Al Ms sont préchauffées dans un bloc chauffant (Thermo Scientific) à 37°C sous agitation pendant 10 minutes afin de garantir une solubilisation totale.
b). Pour les traitements supérieurs à 72 heures, les milieux sont renouvelés toutes les 72 heures avec ou sans Al Ms.
c). Dans le test de réversibilité de la prolifération (courbes rouges sur la figure), le traitement est arrêté après 72 heures et les milieux sont renouvelés sans ajout de molécules AIMs.
Résultats :
Ainsi, les molécules AIM2 et AIM3 présentent une action cytostatique dans les différentes lignées cellulaires utilisées (MCF-10A, MDA-MB231 et Hs578).
Comme indiqué figure 9, un traitement avec une dose de 2 mM inhibe la prolifération des cellules épithéliales mammaires saines (MCF10A), mais également des cellules cancéreuses mammaires (MDA-MB231 et HS578T) (cf. courbes points carré par rapport aux contrôles non traités rond). Par contre, dans le but de déterminer la réversibilité de ces traitements, il a également été réalisé un traitement de 72h avec 2mM de molécule, suivi par un changement de milieu sans rajout de molécule. Dans cette expérience, il apparaît que le changement de milieu permet aux cellules de proliférer de nouveau et ce de manière beaucoup plus marquée concernant les cellules épithéliales mammaires saines (MCF10A). Ce résultat permet de conforter les observations précédentes démontrant la non-cytotoxicité de ces molécules et donc leur effet cytostatique.
EXEMPLE 1 1 : Effet sensibilisant des composés selon l’invention vis-à-vis de chimiothérapie dans des cellules tumorales mammaires (Fiq.10 et Fig.1 1 )
Le cancer du sein regroupe en réalité différentes sous-catégories basées sur l'expression de 3 marqueurs moléculaire : le récepteur aux oestrogènes (ERa), le récepteur à la progestérone (PR) et le récepteur transmembranaire appartenant à la famille des récepteurs à l'EGF (HER2). Certaines tumeurs sont ainsi nommées triples négatives, car elles n'expriment aucun des 3 marqueurs moléculaires. Ce type de tumeur pose de nombreux problèmes dans leur traitement du fait :
- de leur insensibilité aux agents de chimiothérapie couramment utilisés dans le traitement du cancer du sein
- de l'absence de traitement ciblé pour ces tumeurs.
Un des enjeux majeurs dans le traitement du cancer du sein consiste à tenter de re-sensibiliser des tumeurs mammaires triples négatives aux agents de chimiothérapie. Un des buts visés consiste ainsi à restaurer la sensibilité de cellules cancéreuses mammaires triples négatives, les MDA-MB231 , à un agent de chimiothérapie, le tamoxifène.
D'un point de vue mécanistique, le tamoxifène est un modulateur sélectif des récepteurs aux oestrogènes (ERa), c'est-à-dire qu'il se fixe spécifiquement sur les récepteurs aux oestrogènes, mais sans activer de voie de signalisation. La résistance des cellules MDA-MB231 face au tamoxifène a été montrée comme étant due à une absence d'expression d'ERa. En 2000, Yoshida et ses collaborateurs ont montré que l'hyperméthylation de 2 régions promotrices (promoteur A et B) en amont du gène codant ERa est inversement corrélée à l'expression d'ERa dans les cellules MDA-MB231.
De plus, un traitement à l'aide d'un agent déméthylant (la 5-azadésoxycytidine) a permis de ré-induire l'expression d'ERa dans les cellules MDA-MB231 (lien : the synergie inhibitory effect of 5-aza-2-deoxycytidine and tamoxifen on estrogen receptor alpha négative breast cancer œil Unes in vitro).
Les résultats de l'utilisation sur cellules de la 5aza étant très prometteurs, des essais cliniques ont été réalisés pour le traitement de certaines leucémies associées à une hyperméthylation de gènes spécifiques. Bien que la survie globale des patients soit nettement améliorée, il n'en reste pas moins que l'utilisation de la 5-azadésoxycytidine soit associée à de lourds effets secondaires (neutropénie, thrombocytopénie, anémie, pyrexie), du fait de l'absence de spécificité de l'action de cette molécule. Une partie des travaux menés en cancérologie est ainsi de générer et d'étudier de nouveaux agents déméthylants présentant une spécificité d'action améliorée.
C'est dans ce contexte que les composés selon l’invention ont été développés dont le composé AIM2 qui présente comme le montre les essais ci-dessus une action déméthylante, à la fois in vitro et in cellulo.
Face à ce mode d'action, la Demanderesse a étudié si les composés selon l’invention permettaient de déméthyler le promoteur d'ERa dans les cellules MDA-MB231 , afin de réinduire son expression, et de resensibiliser les cellules au tamoxifène.
Dans un 1 er temps, la synergie d'action entre notre molécule AIM2 et le tamoxifène a été étudié.
Des tests de Chou-Talalay ont été réalisés en déterminant le nombre de cellules attachées après traitements à l'aide du composé AIM2 et/ou à l'aide de tamoxifène.
Protocole : Expérience de synergisme AIM2/Tamoxifène Chou Talalav
Pour cela, des cellules MDA-MB231 ont été ensemencées en plaque 96 puits à une densité cellulaire de 8 000 cellules/puits dans un volume de 100pL/puits. Le plan expérimental de plaque est présenté sur la figure 10. Le traitement à AIM2 se fait pendant 24h, suivi de 48h de traitement au tamoxifène. A la fin des traitements, un marquage au cristal violet est réalisé afin de dénombrer les cellules vivantes.
Le protocole est le suivant :
- aspirer les puits
- laver les puits avec 100pL de PBS
- ajouter 50 pL de cristal violet 0,1 % et laisser incuber 30 minutes à température ambiante
- rincer 3 fois à l'eau distillée
- ajouter 100 pL d'acide acétique 10% par puits et laisser incuber sous agitation
10 minutes
- mesurer l'absorbance à 595 nm dans un VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer).
Les triplicats de plaque sont moyennés, et les résultats sont exprimés en fonction du contrôle non traité qui est fixé à 1 pour chaque condition.
Résultats :
Les résultats montrent que les cellules MDA-MB231 , qui sont ER négatives, sont insensibles au tamoxifène. Un traitement avec AIM2 induit une diminution de la viabilité cellulaire de l’ordre de 50% dès la dose la plus faible (2 000 nM). Un prétraitement par AIM2 suivi d’un traitement au tamoxifène induit également une diminution de la viabilité cellulaire, qui semble plus importante qu’en présence de la molécule AIM2 uniquement. Afin de savoir si cette diminution de la viabilité cellulaire dans la condition AIM2+Tam s’explique par une synergie entre les 2 molécules, le Demanderesse a utilisé le logiciel CompuSync qui se base sur la méthode de Chou- Talalay via le principe d'effet médian de la loi d'action de masse.
L'équation sur laquelle se base le logiciel est la suivante : fa/fu=l(D/Dm)Jm où :
fa et fu correspondent respectivement aux fractions de cellules affectées et non affectées par les traitements;
D et Dm correspondent respectivement à la dose employée et la dose médiane
(IC50)
m correspond à la forme de la courbe dose-réponse.
Il suffit de rentrer dans le logiciel 3 jeux de données :
- les valeurs correspondant à l'effet de la molécule A à la dose donnée - les valeurs correspondant à l'effet de la molécule B à la dose donnée
- les valeurs correspondant à l'effet de la molécule A et de la molécule B à la combinaison de doses données.
Le logiciel génère alors des indices de combinaison (Cl) : - si le Cl à une combinaison de dose donnée est inférieur à 1 , alors il y a synergie d'action entre la molécule A et la molécule B
- si le Cl à une combinaison de dose donnée est supérieur à 1 , alors il y a antagonisme entre la molécule A et la molécule B.
Les résultats (exprimés sous la forme de combinaison index, ou Cl) sont présentés dans le tableau 7 ci-dessous :
Tableau 7
Comme les résultats le montrent, toutes les combinaisons de doses (sauf la combinaison 10 000 nM de AIM2 et 750 nM de TAM) permettent d’observer une synergie (Cl<1 ) entre le tamoxifène et AIM2.
Ces résultats permettent donc de conclure qu’un pré-traitement à l’aide d’AIM2 permet de sensibiliser les cellules MDA-MB231 au tamoxifène, qui sont de base insensibles. EXEMPLE 12 : Test MTT (viabilité) pour démontrer l’effet des composés selon l’invention sur la sensibilité aux agents anticancéreux (Fiq.12)
Par la suite, sur la base de la resensibilisation des cellules MDA-MB231 au tamoxifène en présence d’AIM2, la Demanderesse a étudié si un traitement avec les composés AIM2 et AIM3 permettait d’augmenter la sensibilité de différentes lignées de tumeurs mammaires face à différents agents de chimiothérapie classiquement employés : le 5-fluorouracile et la doxorubicine.
Protocole :
Pour cela, les cellules cancéreuses mammaires, les MCF-7, MDA-MB231 et Hs578T, ainsi qu’une lignée de cellules mammaires normales, les MCF10A, ont été ensemencées à une densité de 1 x104 cellules/puits dans une plaque à 96 puits. Après 24h d’ensemencement, les cellules sont mises en contact avec 2mM d’AIM2/3 pendant 1 heure suivi de 50mM de 5-fluorouracile ou 50ng/mL de doxorubicine pendant 24 ou 48 heures. Suite à ces traitements, les milieux sont enlevés et 0.5mg/mL de MTT est ajouté dans chaque puits. Après 3 heures d’incubation à 37°C, 100pL de SDS 25% est ajouté dans chaque puits et les plaques sont incubées à 37 °C toute la nuit. L’absorbance est mesurée à 570nm. Les résultats présentés correspondent à la moyenne ± l’erreur standard à la moyenne issue de trois expériences indépendantes. Les différences entre les cellules traitées à différents temps sont significatives pour un p<0,05.
Résultats :
Les résultats montrent qu’un traitement de 24h à AIM2/3 n’a aucun effet significatif sur la viabilité, peu importe la lignée de cancer du sein pris en compte. Néanmoins, lorsque le traitement à AIM2/3 est suivi d’un traitement au 5Fu ou à la doxorubicine, la viabilité cellulaire diminue de manière significative, et ce dans toutes les lignées. Cet effet apparaît dès 24 heures de traitement, mais s’accentue encore plus lors des traitements de 48 heures.
Ces résultats suggèrent donc que les composés selon l’invention sensibilisent les cellules tumorales mammaires aux agents de chimiothérapie, indiquant une possible utilisation thérapeutique de ces molécules.
EXEMPLE 13 : Test de prolifération à la suite d’un pré-traitement avec AIM2 ou AIM3 2uM 72h (Fig.13 et Fig.141
Condition de culture :
Les différentes lignées cellulaires sont cultivées dans un incubateur à 37°C, 5% CC>2 et 95 % d’humidité selon les milieux nutritifs suivants :
Tableau 8
Les différents milieux de culture sont supplémentés alternativement par 0,1 mg/mL de Gentamicine (Sigma G1272) et 1 % de Penicilline-Steptomycine (Sigma P4333).
Le sérum de veau foetal (SVF) et le sérum de cheval sont préalablement décomplémentés pendant 30 minutes à 56°C. La lignée T47D résistante à la doxorubicine est cultivée en présence de 12,5 ng doxorubicine/mL afin de maintenir la résistance. Cependant, la doxorubicine n’est pas ajoutée au milieu de culture pendant les phases de pré-traitement et le test de prolifération.
Pré-traitement des lignées cellulaires
Les cellules sont ensemencées dans des boîtes 100 mm (10 mL milieu/boîte) pour les conditions NonTraitées et dans des boîtes 150 mm (20 mL milieu/ boîte) pour les conditions traitées selon les quantités suivantes :
Tableau 9
Les cellules sont ensuite traitées 24h après ensemencement avec les molécules
AIM2 ou AIM3 à une concentration de 2 mM pendant 72h.
Ensemencement cellulaire suite au pré-traitement avec AIM
Les cellules sont décollées avec 1 mL (boîtes 10 mm) ou 2mL (boîtes 150 mm) de trypsine - EDTA 1X pendant 5 minutes à 37°C (15 minutes d’incubation sont nécessaires pour décoller les cellules MCF10A).
L’action de la trypsine est ensuite inhibée par 10 mL de milieu de culture puis la suspension cellulaire est centrifugée à 200G pendant 5 minutes.
Chaque culot est repris dans 10 mL de milieu puis les cellules sont dénombrées à l’aide d’une cellule de Mallasez.
Les cellules sont ensuite ensemencées dans des boîtes 60 mm (4mL milieu/boîte) comme suit et selon le plan d’expérience de la Fig.13 :
Tableau 10
Dénombrement cellulaire
Chaque jour pendant 72h, 3 boîtes issues d’un type cellulaire et d’un traitement donné sont dénombrées.
Après un lavage avec 2 mL de PBS, les cellules sont décollées avec 1 mL de trysine-EDTA 1X à 37°C pendant 10 minutes (20 minutes pour la lignée MCF10A).
La tryspine est ensuite inhibée par l’ajout de 4 mL de milieu. Puis les cellules sont culotées à 200G pendant 5 minutes. Les culots sont repris dans un volume précis de PBS dépendant de la taille du culot.
Les cellules sont correctement séparées par plusieurs allers-retours à la P200 et dénombrées à l’aide d’une cellule de Mallasez.
Comme le montre la Fig.14, les résultats obtenus indiquent que l'inhibition de prolifération observée suite au traitement avec AIM2 et AIM3 est réversible dans les cellules MCF10A et pas dans les cellules MDA-MB-231. Une réversibilité est également observée dans les cellules T47D R+doxo traitées avec AIM2 mais pas avec AIM3. EXEMPLE 14 : Etude de l’effet du traitement des molécules AIM1 , AIM2, AIM3 et Ru (Fiq.16) à 2uM sur différentes lignées cellulaires pendant 48h ou 72h
Condition de culture
Les différentes lignées cellulaires sont cultivées dans un incubateur à 37°C, 5% CC>2 et 95 % d’humidité selon les milieux nutritifs suivants :
Tableau 11
Les différents milieux de culture sont supplémentés alternativement par 0,1 mg/mL de Gentamicine (Sigma G1272) et 1 % de Penicilline-Steptomycine (Sigma P4333).
Le sérum de veau foetal (SVF) et le sérum de cheval (horse sérum en anglais) sont préalablement décomplémentés pendant 30 minutes à 56°C.
La lignée T47D résistante à la doxorubicine est cultivée en présence de 12,5 ng doxorubicine/mL afin de maintenir la résistance, cependant la doxorubicine n’est pas ajoutée au milieu de culture pendant le test de prolifération. Plan d’expériences
Chaque lignée cellulaire est ensemencée dans des plaques 96 puits (100mI_ milieu/puits) selon les conditions suivantes :
Tableau 12
Chaque condition de traitement est effectuée en tripicat comme indiqué sur la Figure 15.
Les cellules sont traitées avec les molécules représentées à la Figure 16 (AIM1 , AIM2, AIM3 selon l’invention et Ru en tant qu’exemple comparatif) à 2 mM 24h après l’ensemencement.
Après 48h ou 72h de traitement, le milieu de chaque puits est retiré puis un lavage est effectué avec 100 pL de PBS.
Les cellules sont ensuite fixées avec 100 pL de paraformaldéhyde 4% pendant 20 minutes, suivi de deux lavages avec 500 pL de PBS.
Essai au Cristal Violet
Le pourcentage de cellules adhérées est mis en évidence par une coloration au cristal violet.
100 pL de cristal violet à 0,1 % (dilution au 1/5 dans H20 de la solution stock : 0.5% cristal violet 2% éthanol filtré 0,22pM) est ajouté dans chaque puits.
Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, les puits sont rincés 3 fois avec de l’eau distillée puis correctement séchés par tapotement sur une feuille de papier absorbant.
100pL d’acide acétique 10% est ensuite ajouté à chaque puits.
La plaque est placée sous agitation jusqu'à la solubilisation totale des cristaux de cristal violet (environ 10 minutes).
La lecture de l’absorbance est effectuée à l’aide d’un lecteur de plaque à 595 nm (voir Fig.17 à 20).
Résultats
L’ensemble de ces résultats représentés aux Fig. 17 à 20, indique que les molécules AIM2 et AIM3 induisent une inhibition significative de la prolifération des différents types cellulaires testés. La molécule AIM1 est également capable d’entraîner une baisse de la prolifération cellulaire même si celle-ci est moins marquée que pour les molécules AIM2 et AIM3. Par contre, la molécule (exemple comparatif) appelée Ru (qui correspond à la molécule AIM2 dont le Fer a été remplacé par du ruthénium) n’entraîne pas d’inhibition de la prolifération dans les conditions testées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation non-thérapeutique, en tant qu’agent de déméthylation de l’ADN, d’au moins un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines de formule générale (I) suivante :
dans laquelle :
R1 à R6, identiques ou différents sont choisis parmi : un atome d’hydrogène ; une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée de formule CnHhn+i avec n = 1 à 12 ; un groupe COOH ; un groupe SO3H ; un groupe PO3H ; un cycle aromatique de formule (II) à (VI) ci-dessous:
(II) (III) (IV) (V) (VI) où
Y sont chacun indépendemment des autres un groupe CH ou un atome d’azote; R7 est choisi parmi un groupe OCYH2Y+I avec y = 1 à 10 ; SCWH2W+I avecw= 1 à 10;
N(CmH2m+i)2 avec m= 1 à 6, COOH ; SO3H ou PO2H3 ;
Z désigne un atome d’oxygène, un atome de soufre ou un groupe NH ;
la ligne en pointillée représente une liaison C-C au niveau du point de rattachement du cycle aromatique de formule (II) à (VI) aux groupements terpyridines du composé organométallique de formule (I) ;
X est un contre-ion.
2. Utilisation non-thérapeutique selon la revendication 1 , dans laquelle R1 à R6 correspondent à un atome d’hydrogène.
3. Utilisation non-thérapeutique selon la revendication 1 , dans laquelle R1, R3, R4, 66 sont identiques et correspondent à un atome d’hydrogène, et R2 et R5 sont identiques et désignent un benzène de formule (Vil) suivante:
4. Utilisation non-thérapeutique selon la revendication 1 , dans laquelle R1, R3, R4, 66 sont identiques et correspondent à un atome d’hydrogène, et R2 et R5 sont identiques et désignent un radical pyridine de formule (VIII) suivante :
(VIII)
où la ligne en pointillée représente une liaison C-C entre le carbone porté par le radical pyridine et le carbone porté par le groupe terpyridine du composé organométallique de formule (I).
5. Utilisation non-thérapeutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le contre-ion X est choisi parmi : Cl , Br ou I
6. Utilisation non-thérapeutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit composé organométallique est capable d’entraîner une déméthylation directe de l’ADN.
7. Composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines, ayant une formule générale (I) définie selon l’une quelconque de revendications 1 à 6 pour son utilisation comme médicament.
8. Composé organométallique selon la revendication 7, pour son utilisation dans le traitement des maladies liées à une hyperprolifération cellulaire.
9. Composé organométallique selon la revendication 7 ou 8, pour son utilisation dans le traitement de cancers.
10. Composé organométallique l’une des revendications 7 à 9, pour son utilisation dans le traitement des glioblastomes, des leucémies promyélocytaires, des cancers de la prostate, des ovaires, des poumons, des seins, des voies digestives, en particulier du foie, du pancréas, de la tête et du cou, du colon, des lymphomes non- Hodgkiniens ou des mélanomes.
1 1. Composé organométallique selon l’une des revendications 7 à 10, pour son utilisation dans le traitement des tumeurs résistantes au cisplatine, le 5-fluorouracile, le tomoxifène ou encore la doxorubicine ou à d'autres composés anticancéreux.
12. Composé organométallique selon la revendication 7 ou 8, pour son utilisation dans le traitement de l’inflammation, de l’obésité, de maladies neurodégénératives ou de maladies cardiovasculaires.
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DE102012216381A1 (de) * 2012-09-14 2014-05-28 Beiersdorf Ag Verwendung von 4–(4–Hydroxyphenyl)–2–Butanon als demethylierendes Agens

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