EP3781948A1 - Evaluation du risque de complication chez un patient suspecté d'avoir une infection ayant un score sofa inférieur à deux - Google Patents

Evaluation du risque de complication chez un patient suspecté d'avoir une infection ayant un score sofa inférieur à deux

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EP3781948A1
EP3781948A1 EP19726467.4A EP19726467A EP3781948A1 EP 3781948 A1 EP3781948 A1 EP 3781948A1 EP 19726467 A EP19726467 A EP 19726467A EP 3781948 A1 EP3781948 A1 EP 3781948A1
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EP
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expression product
gene
patient
expression
vegfr2
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Withdrawn
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EP19726467.4A
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German (de)
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Marie-Angélique CAZALIS
Karine Kaiser
Alexandre Pachot
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Biomerieux SA
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Biomerieux SA
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Publication date
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    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the present invention relates to the medical field in general, and in particular the field of prognosis in vitro. It relates more specifically to the assessment of the risk of complication in a patient suspected of having an infection with a SOFA score of less than two.
  • Sepsis is a complex syndrome involving several clinical phases. It remains associated with high mortality. Early recognition of patients at risk of adverse outcomes is a key determinant of prognosis.
  • SIRS is an inflammatory systemic response triggered by a variety of infectious causes or not.
  • SIRS conditions triggered by non-infectious causes include traumatic conditions, burns, pancreatitis, acute respiratory syndromes.
  • An inflammatory systemic response manifested by at least two of the following signs: a) temperature greater than 38 ° C or less than 36 ° C; b) heart rate greater than 90 beats per minute; c) respiratory rate greater than 20 breaths per minute; d) number of leukocytes greater than 12000 / mm 3 or less than 4000 / mm 3 , - sepsis is an inflammatory systemic response syndrome related to an infection,
  • septic shock is a severe sepsis associated with persistent hypotension and can be qualified by:
  • SOFA score Sequential Organ Failure Assessment Score
  • Sequential Organ Failure Assessment Score is used to track a person's status while in hospital to determine the extent of his or her deficiencies. organs (Vincent JF and Coll, 1996). Fe score is based on six different scores, one for each of the systems following: respiratory, cardiovascular, hepatic, coagulation, renal and neurological. The calculation method for each system is shown in Table 1 below:
  • the qSOFA (or quickSOFA) score was introduced in February 2016 as a simplified version of the SOFA score as an initial means of identifying patients at high risk of poor prognosis after infection (Eamon P. Raith, et al. , 2017).
  • QSOFA drastically simplifies the SOFA score by including only 3 clinical criteria.
  • the qSOFA can easily and quickly be calculated and repeated in patients. In Table 2, below, the calculation mode of qSOFA.
  • the qSOFA score therefore varies from 0 to 3 points.
  • Identify among patients suspected of having an infection and not serious (with a SOFA score of less than 2), the most at risk of complication, and as soon as possible and in the absence of sepsis, would allow to set up the as soon as possible a strategy to limit their risk of complication.
  • antibiotic prophylaxis could be given (Puisieux F et al., 1993, Jensen JU et al., 2011) or preventive treatment (K. Asehnoune et al., 2014) or targeted immunotherapy (Chahin A et al., 2015, Ali YM et al., 2014), or more simply, pathways for pathogens could be limited (ie removal of catheters as soon as possible ).
  • markers have already been described for the diagnosis of sepsis and sometimes for the assessment of the risk of complications in patients who already had sepsis.
  • markers include pro calcitonin (PCT) or reactive protein C (CRP).
  • biomarkers for their use in the diagnosis of sepsis or septic shock but also in the prognosis of evolution of sepsis already proven to be septic shock, according to the old definition.
  • biomarkers is the type II receptor for vascular endothelial growth factor (VEGFR2).
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor
  • the cohorts of patients described in the examples, concerning this marker for the prognosis of progression, are composed of patients admitted for at least 48 hours in an intensive care unit, hospital services specialized in the management of inanimate patients or particularly serious conditions requiring permanent monitoring. These patients have a SOFA score greater than or equal to three.
  • Wada and his team describe soluble receptors with angiogenic factors, such as sVEGFR2 or angiopoietin 2, a growth factor implicated in angiogenesis, as predictive of development of acute respiratory distress syndrome (ARDS) in critically ill patients.
  • angiogenic factors such as sVEGFR2 or angiopoietin 2, a growth factor implicated in angiogenesis
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • the patients included in the cohort of this publication are critically ill patients, already in the hospital setting, all of whom are under ventilatory mechanical respiration and who have either sepsis or severe trauma, or who are resuscitated following cardiac arrest. These patients have very high SOFA scores, ranging from four to almost ten. Again, these ventilated patients are not patients simply suspected of having an infection with a SOFA score of less than two, considered non-serious.
  • Fe VEGFR2 is one of the receptors for vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the family of mammalian VEGF is composed of four glycoproteins referenced from A to D and placental growth factor (P1GF) (Koch and Claesson-Welsh, 2012). Each is expressed in different iso forms due to alternative splicing and proteolitic cleavages.
  • P1GF placental growth factor
  • These VEGFs bind and activate three types of tyrosine kinase receptors, VEGFR 2, but also VEGFR 1 and 3 respectively called KDR, Flt1 and VEGFR3.
  • VEGFs also bind the NP1 and NP2 neuropilins, which act as co-factors for VEGFRs.
  • VEGFR2 also called KDR, (subsequently this gene will only be named VEGFR2) encodes the type 2 vascular endothelial growth factor receptor. It is a tyrosine protein kinase that acts as a cell surface receptor for VEGFA, VEGFC and VEGFD. It plays an essential role in the regulation of angiogenesis, vascular development, vascular permeability and embryonic hematopoiesis. This receptor promotes the proliferation, survival, migration and differentiation of endothelial cells but also the reorganization of the actin cytoskeleton. This receptor consists of an extracellular portion consisting of 7 immunoglobulin-like domains, a transmembrane region and an intracellular portion containing a tyrosine kinase domain (Shibuya, 2011).
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor
  • the method according to the invention has the advantage of being able to easily evaluate the risk of complication in a patient suspected of having an infection and not presenting the clinical signs of severity (score of SOFA less than two), by having a directly measurable marker, especially by automated analysis, and whose measurement can be made in a local laboratory, upon arrival at an emergency center, at his doctor or patient bed, and so do sorting related to the need to care for the most at-risk patients among all those patients suspected of having an infection.
  • the invention firstly relates to a method of in vitro or ex vivo evaluation of the risk of complication in a patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two, including the measurement of the level of expression, in a biological sample from said patient, of at least one expression product of the VEGFR2 gene.
  • the invention also relates to a method of stratification and treatment of a patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two, characterized in that it comprises the steps of:
  • a last object of the present invention is a kit for the in vitro or ex vivo measurement of the level of expression of at least one expression product of the VEGFR2 gene and at least one expression product of the uPAR gene, in a biological sample, comprising:
  • a calibrated control for containing the amounts of said at least one expression product of the VEGFR2 gene which correspond to known quantities of said at least one expression product of the VEGFR2 gene and
  • a calibrated control for containing the amounts of said at least one expression product of the uPAR gene which correspond to known quantities of said at least one expression product of the uPAR gene.
  • patients are patients suspected of having an infection and having a SOFA score of less than two. In other words, they are patients with no clinical signs of severity.
  • Patient suspected of having an infection is defined as a patient with known infection or suspected of being infected by a health care professional in clinical or paraclinical manifestations.
  • a health professional is any person who exercises his or her skills and medical judgment, provides a service related to the maintenance, improvement of the health of patients, or the treatment of individuals who are wounded, sick, disabled or disabled. an infirmity by providing them with care.
  • urinary infectious focus (low or high): urinary burns, pollakiuria or dysuria, pelvic pain, cough emission in the urinary meatus, unilateral lumbar pains;
  • an infectious digestive center abdominal pains, transit disorders
  • ALT / SGPT Alignment-Aminotransferase / Serum Glutamopyruvate Transferase
  • ASAT / SGOT Aspartate-Aminotransferase / Serum Glutamooxaloacetate Transferase
  • the health professional will be able to determine whether the patient is suspected of having an infection or not, using clinical or paraclinical manifestations.
  • the patient whose infection is suspected will have one or more clinical and / or paraclinical signs, for example those exemplified above.
  • the infection may be caused by the contamination of the patient by any infectious agent, such as a virus, a bacterium, a parasite, a fungus or a protozoan.
  • infectious agent such as a virus, a bacterium, a parasite, a fungus or a protozoan.
  • viruses such as HIV, SIV, IVF, HCV, HBV, HAV, HEV, VZV, CMV, EBV, HSV1, HSV2, bacteria such as Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Borrelia burgdorferi stricto sensu, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia spielmanii, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Salmonella, Klebsiella, Leugionella, Proteus, Klebsiella, Escherichia coli, Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Treponema pallidum yeasts such as Candida albicans, fungi such as Aspergillus fumigatus, Mucorales, etc. and protozoa such as leishmania, trichomonas vaginalis,
  • infections when the patient is suspected of an infection, it can affect any tissue or organ.
  • infections By way of examples, mention may be made of infections:
  • the infection is of bacterial origin.
  • the patient is characterized by his SOFA score which is strictly less than 2, in other words, a patient having a SOFA score of either 0 or 1.
  • SOFA score which is strictly less than 2
  • these are patients who do not have sepsis.
  • the patients according to the invention are therefore patients not presenting a serious clinical condition.
  • patients are not in intensive care and / or are not under ventilatory mechanical respiration.
  • the patients according to the invention who are not in a serious clinical condition, will be put in contact with health professionals, who will suspect an infection, for example in the following cases: as soon as they arrive at an emergency center, to the doctor himself or to the hospital to his bed, which is another particular embodiment.
  • Complication risk assessment means the identification of patients suspected of having an infection and having a SOFA score of less than two, who will see their condition deteriorate in the hours following the measurement of the level of expression of the marker and those who will not see their condition deteriorate during the hours that follow and therefore do not require management by a specialized hospital service.
  • organ failure means abnormal functioning of an organ that results in a clinical or biological abnormality of the organ (see below the calculation of the SOFA score).
  • organ failure include respiratory, cardiovascular, renal, neurological, hepatic failure or hemato logical failures.
  • organ failure definitions (Fagon et al., 1993):
  • a patient needs to enter the intensive care unit when his condition requires a continuous monitoring of the vital functions and, where appropriate, the recourse to methods of substitution (transfusion of blood derivatives, vascular filling, mechanical ventilation, catecholamine, hemodialysis, extracorporeal circulation, etc.).
  • substitution transfusion of blood derivatives, vascular filling, mechanical ventilation, catecholamine, hemodialysis, extracorporeal circulation, etc.
  • the ultimate goal of resuscitation is the restoration of homeostasis.
  • the presence of a risk of complication corresponds to the risk that the complication will occur, for example within 5 days, especially within 4 days, especially within 3 days after sample collection and when there are several samples. within 5 days, especially within 4 days, especially within 3 days after the first sample collection.
  • the method according to the invention comprises measuring the level of expression, in a biological sample from said patient, of at least one expression product of the VEGFR2 gene.
  • sample refers to a part or quantity, more specifically a small part or a small quantity, taken from one or more entities for analysis. This sample may possibly have undergone a prior treatment, involving for example mixing and dilution steps.
  • the sample in the context of the method of the invention is a biological sample from the patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two to whom it is desired to evaluate the risk of complication in the hours following the level measurement. expression of the marker (s).
  • a biological sample is chosen from those likely to contain a VEGFR2 expression product or any other marker described later.
  • the biological sample according to the present invention may be of different natures.
  • this sample is a biological fluid, for example selected from whole blood (as collected from the venous route, that is to say containing white and red cells, platelets and plasma), serum, plasma, bronchoalveolar lavage fluid, cerebrospinal fluid, also called cerebrospinal fluid, and urine.
  • the biological sample from the patient is a sample of whole blood, plasma, serum or any derivative.
  • the measurement of the expression level of the VEGFR2 gene (SEQ ID No. 1) consists in quantifying at least one expression product of this gene.
  • the expression product within the meaning of the invention is any biological molecule resulting from the expression of the VEGFR2 gene.
  • the expression product of the gene is an RNA transcript.
  • transcript is meant the RNAs, and in particular the messenger RNAs, derived from the transcription of the VEGFR2 gene. More specifically, transcripts are the RNAs produced by the splicing of the gene.
  • the measurement of the expression level of one or more RNA transcripts of the VEGFR2 gene can be performed.
  • VEGFR2 gene has three transcripts known to date, referenced in the Ensembl database (GRCh38.plO) and identified in Table 3 below.
  • transcripts KDR-201 SEQ ID NO: 2
  • KDR-202 KDR-202 and KDR-203 and their variants
  • variant an RNA having a sequence having at least 99% identity with one of said KDR-201, KDR-202, KDR-203 transcript sequences. Percent identity is determined using sequence alignment software, such as CLUSTALW (Thompson et al., 1994).
  • a variant will correspond, in particular, to a polymorphism of the VEGFR2 gene sequence.
  • the preferred VEGFR2 gene transcript is the KDR-201 transcript or a variant thereof having at least 99% identity with the sequence of said transcript, the expression of which will be determined alone or in combination with that of the other variants.
  • only the expression of the KDR-201 transcript or a variant thereof having at least 99% identity with the sequence of said transcript will be determined.
  • measuring the level of expression of an RNA transcript of a target gene may include a preliminary step of extracting total RNAs from a biological sample. This step is followed by a reverse transcription step of these different RNAs to obtain their complementary DNA (cDNA). Then the specific cDNAs of the target gene are amplified and then quantified.
  • cDNA complementary DNA
  • nucleic acid extraction and purification protocols well known to those skilled in the art.
  • the extraction of nucleic acids can be carried out by lysis of the cells present in the biological sample followed by purification or by extraction with phenol, chloroform and alcohol. These steps are well known to those skilled in the art and are described for example by Sambrook J and Russell DW (2017).
  • RNAs comprising the ribosomal RNAs, the transfer RNAs and the messenger RNAs.
  • a reverse transcription reaction is then carried out using a reverse transcriptase enzyme which makes it possible to obtain, from an RNA fragment, a complementary DNA fragment (cDNA).
  • a reverse transcriptase enzyme which makes it possible to obtain, from an RNA fragment, a complementary DNA fragment (cDNA).
  • cDNA complementary DNA fragment
  • this enzymatic step is carried out in the presence of nucleotide fragments comprising only thymine bases (polyT), which hybridize by complementarity on the polyA sequence of the different mRNAs in order to form a polyT-polyA complex which then serves as a starting point for the reverse transcription reaction carried out by the enzyme reverse transcriptase.
  • polyT thymine bases
  • an enzymatic amplification reaction is performed.
  • An enzymatic amplification reaction is a process that generates multiple copies of a nucleotide fragment by the action of at least one enzyme.
  • Such amplification reactions are well known to those skilled in the art and may be mentioned in particular the following techniques:
  • the specific reagent comprises at least 2 specific amplification primers in order to amplify a particular region of the DNA complementary to the mRNA derived from the target gene.
  • the enzymatic amplification is a PCR carried out after a reverse transcription reaction, it is called RT-PCR.
  • the level of expression of the target gene is determined by hybridization using at least one hybridization probe specific for the expression product of this target gene.
  • hybridization probe is meant a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleotide units, in particular from 6 to 35 nucleotide units, having hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleotide fragment.
  • the target nucleotide fragment can be a nucleotide sequence included in a messenger RNA or a nucleotide sequence included in a complementary DNA obtained by reverse transcription of said messenger RNA.
  • Hybridization techniques are well known to those skilled in the art, and mention may in particular be made of the Northern blot technique.
  • the quantification of the mRNAs, expression products of the target gene goes through a step of detecting the hybridization reaction between the hybridization probe and the target nucleotide fragment.
  • the amount of said at least one transcript of the VEGFR2 gene will be determined by at least one of the following characteristics, taken alone or in combination:
  • RT-PCR real-time PCR
  • Determining the quantity of several transcripts can be implemented sequentially or simultaneously, according to the methods conventionally known to those skilled in the art, as described above.
  • the measured expression product is a protein and / or a polypeptide which is the product of the translation of at least one of the transcripts described above or of a transcript not yet described.
  • measurement of the expression level of one or more proteins and / or polypeptides can be performed.
  • VEGFR2 derived from the KDR-201 transcript
  • iso form 1 SEQ ID No. 3
  • No. UniProt P35968-1 which is the transmembrane form
  • isoforms 2 SEQ ID No. No. 4
  • UniProt No. P35968-2 SEQ ID No. 5
  • No. UniProt P35968-3 which are the plasma forms, or soluble, secreted from the receptor.
  • All isoforms of VEGFR2 can be used, alone or in combination, as a marker (s) to assess the risk of complication, in a patient suspected of having an infection with a SOFA score of less than two.
  • the determination of the amount of one or more isoforms in a biological sample can be done according to techniques widely known to those skilled in the art to determine the amount, or dose, of one or more analytes in a biological sample.
  • immunoassay assays such as ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) and RIA (Radio Immunoassay), and mass spectrometric assays. which constitutes an embodiment of the invention.
  • the immunoassay assay is a method well known to those skilled in the art and widely used in the field of the analysis of biological samples. It allows to to quantify analytes in samples in particular form of proteins (antigens / antibodies), peptides and haptens, for example steroids or vitamins, involving immunological reactions between the analyte to be detected, in this case the one of the VEGFR2 isoforms, and one or more binding partner (s) to this analyte.
  • proteins antigens / antibodies
  • peptides and haptens for example steroids or vitamins
  • These immunoassay methods are based on measurements to quantify the signals emitted during the analysis of the biological sample.
  • the amount of signal detected is generally proportional to the quantity, or dose, of analyte to be measured (for example during a sandwich assay) or inversely proportional to the quantity or dose of analyte to be measured (for example assay in competition).
  • the term "immuno" in "immunoassay” for example is not to be considered in this application as strictly indicating that the binding partner is an immunological partner, such as an antibody. Indeed, those skilled in the art also use this term widely when the binding partner, also called ligand, is not an immunological partner but is for example a receptor for the analyte that we want to quantify.
  • VEGFR2 isoform binding partner mention may be made of antibodies, antibody fractions, nanofitins, aptamers (Ochsner UA et al., 2014) or any other molecule which is known to have an interaction with VEGFR2 to be investigated, such as lipopolysaccharides (Bucki R. et al., 2005)
  • the binding partner antibodies are, for example, either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies whose production is widely known to those skilled in the art.
  • Such antibodies for isoforms of VGEFR2 are commercially available, such as the following polyclonal antibodies: Human VEGF R2 / KDR / Flk the Biotinylated Antibody ref: BAF357 biothechne ® and the following monoclonal antibodies: Human VEGF R2 / KDR / Flk-l Antibody ref: MAB3573 biothechne ® .
  • antibody fragments By way of example of antibody fragments, mention may be made of the Fab, Fab ', F (ab') 2 fragments as well as the scFv (Single chain variable fragment) and dsFv (Double-stranded) chains. fragment variable). These functional fragments can in particular be obtained by genetic engineering.
  • the immunoassay for determining the amount of the isoform (s) of VEFGR2 preferably implements two binding partners of the VEGFR2 isoforms.
  • One of the two partners may be coupled to a label to form a conjugate or a tracer.
  • the other link partner can be captured on a solid support. This is called capture partner for the latter and detection partner for the first.
  • the measured signal emitted during the immunoassay is then proportional to the quantity, or dose, of the VEGFR2 isoform in the biological sample.
  • a mathematical model pre-established from a standard range should be used. This standard range will be obtained previously in a known manner. In a few words, obtaining a standard range consists in measuring the signal generated by increasing or known quantities or concentrations of the VEGFR2 isoform, in plotting the curve giving the signal as a function of the quantity or concentration, and in find a mathematical model that represents this relationship as faithfully as possible. The mathematical model will be used to extrapolate the amounts, or concentrations, of the unknown VEGFR2 isoform contained in the biological sample to be tested.
  • label used to form the conjugate is meant, in particular, any molecule containing a group reactive with a group of the binding partner, directly without chemical modification, or after chemical modification to include such a group, which molecule is capable of generating directly or indirectly a detectable signal.
  • a non-limiting list of these direct detection markers consists of:
  • enzymes that produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase;
  • chromophores such as fluorescent compounds, luminescent compounds, dyes
  • radioactive molecules such as 32P, 35S or 1251;
  • fluorescent molecules such as Alexa or phycocyanines
  • electrochemiluminescent salts such as organometallic derivatives based on acridinium or ruthenium.
  • Indirect detection systems can also be used, such as, for example, ligands capable of reacting with an anti-ligand. The ligand then corresponds to the marker to form, with the binding partner, the conjugate.
  • the ligand / anti-ligand couples are well known to those skilled in the art, which is the case, for example, in the following pairs: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complement of polynucleotide.
  • the anti-ligand can then be detectable directly by the direct detection markers described above or be itself detectable by another ligand / antiligand pair, and so on.
  • reagents allowing the visualization of the marking or the emission of a detectable signal by any type of suitable measuring device, such as for example a spectrophotometer, a spectrofluorimeter, a densitometer or a high definition camera.
  • the immunoassay may also include other steps known to those skilled in the art, such as washing steps and incubation steps.
  • the immunoassay may be a one-step or two-step assay, as is widely known to those skilled in the art.
  • a one-step immunoassay involves bringing the test sample simultaneously with the two binding partners
  • a two-step immunoassay involves placing the test sample in the presence of the two binding partners. part with the first binding partner, then the analyte complex-first bonding partner thus formed is brought into contact with the second binding partner.
  • Mass spectrometry which can be substituted for previously developed techniques such as immunoassays. It is implemented in a mass spectrometer. It is a powerful tool increasingly used for the analysis and quantification of different types of molecules in biological samples. In general, any type of molecule that can be ionized can be quantified according to its molecular mass using a mass spectrometer. Depending on the nature of the molecule Quantified, of protein or metabolic origin, some mass spectrometry technologies may be more suitable. Nevertheless, whatever the mass spectrometry method used for the quantification, the latter comprises a step of ionization of the target molecule into so-called molecular ions and a step of separation of the molecular ions obtained according to their mass. A mass spectrometer measures the ratio of mass to charge (m / z) of ionized molecules that is correlated to the target molecule to be analyzed.
  • RNA transcript when there are several measured expression products, they can be of the same nature but also of different natures. In other words, they can be of a molecular nature (RNA transcript, mRNA) and / or of a protein nature (protein, polypeptide).
  • the method of the invention may comprise or consist in the implementation of the steps of:
  • the measurement of the quantity of at least one expression product of the VEGLR2 gene is carried out as described above. For convenience, we will call biological sample from a patient for whom it is desired to evaluate the risk of complication, sample to be tested.
  • the amount of said at least one expression product or a value derived from that amount will be compared to a predetermined reference value, in order to evaluate the risk of complication.
  • a reference value is widely known to those skilled in the art. It consists in particular in implementing a method of assay identical or at least comparable to that used in the method of the invention, in biological samples of the two populations studied, and in determining the value of the test. (quantity) to discriminate between these two populations, in this case between that which will be complicated and that which will not get complicated.
  • a value derived from the quantity may for example be the absolute concentration, calculated by means of a calibration curve.
  • the predetermined reference value used to compare the quantity measured in the context of the invention will be determined from the same VEGFR2 gene expression product (s) as those quantified in the biological sample to be tested. .
  • the samples from which the reference values are determined may be of different types, and in particular of a biological nature as mentioned above with respect to the sample to be tested (biological fluids).
  • these reference biological samples are of the same nature as that of the biological sample to be tested or at least of a compatible nature to constitute a reference for the quantification of the expression product (s) of the selected VEGFR2 gene (s). ).
  • they will be biological samples corresponding to the same biological fluid as that of the test sample, such as whole blood, serum or plasma samples.
  • the reference sample (s) used are preferably from persons having the same characteristics or a majority of common characteristics, in particular of the same sex and / or of a similar or identical age and / or of the same ethnic origin, with those the subject or patient suspected of having an infection without sepsis where it is desired to evaluate the risk of complications.
  • the reference sample (s) used will be from patients suspected of having an infection and having a SOFA score of less than two at the time of biological sample collection. Their evolution towards a complication or not will nevertheless have been documented a posteriori to know if they belong to the population which was complicated or that which did not become complicated.
  • samples taken at the same time that is to say from the moment of characterization.
  • the patient is suspected of having an infection with a SOFA score of less than two, or at the latest 24 hours later.
  • the results of the analyte measurement tests depend to a large extent on the characteristics of the binding partner (s) used.
  • the results depend in particular on the characteristics of the partners used, such as the nature, the degree of affinity with the analyte or the size, the characteristics of the compositions, etc., and that these characteristics influence the measured values. It is therefore conceivable that it is not possible to give precise reference values and that the reference value (s) adapted to the test used can be determined in each case by simple routine experiments. The same goes for molecular detection.
  • the determination of the reference value according to the invention is done on a significant sample of patients, that is to say on a minimum number of samples to obtain statistically relevant results and therefore representative of the population studied.
  • reference value is either a discrete value or an interval of values corresponding to a zone of indeterminacy.
  • reference value is either a discrete value or an interval of values corresponding to a zone of indeterminacy.
  • ROC Receiver Operating Characteristic Curve
  • the values of the area under the ROC curve vary between 0.5 (no difference in the distribution of the dosage values between the two subgroups, the ROC curve corresponds to the bisector) and 1 (perfect separation of the dosage values of the two subgroups, the ROC curve passes through the point (0, 1)).
  • the area under the ROC curve is a quantitative expression of the position of the curve OCR relative to (0, 1) (Hanley, JA and McNeil, B.J., 1982, Zweig, MH and Campbell G., 1993).
  • Sensitivity represents the percentage of True Positives among all Positives, recognized as such. It expresses the aptitude of the test to detect really positive biological samples, which correspond to the pathology. In a "probabilistic" language, it corresponds to the probability of observing a Positive result knowing the positive sample.
  • Specificity represents the percentage of True Negatives among all Negatives recognized as such. It expresses the ability of the test not to diagnose positive really negative samples, which correspond to a healthy individual. In a "probabilistic" language, it corresponds to the probability of observing a Negative result knowing the Negative sample.
  • the patient suspected of having a tested infection is a patient at increased risk of complication.
  • the value of the amount of said at least one expression product of the VEGFR2 gene is greater than said reference value, it means that the patient suspected of having a tested infection is not a patient at increased risk of complication.
  • An at-risk patient is as defined above.
  • the determination of the risk of complication can also be implemented by measuring the amount of at least one expression product of the VEGFR2 gene in a biological sample to be tested at two different times.
  • the method may comprise or consist in the implementation of the steps consisting in:
  • the first Tl sampling will take place within 12 hours after the identification of the patient as suspected of having an infection without sepsis and the second sampling at time T2 will take place within 24 hours (T24) that follow the first sample at the instant Tl.
  • this particular embodiment of the invention comprises a step of calculating the variation between the quantity of the product of expression of the VEGFR2 gene at T2 and that at T1, giving a value D.
  • the calculation of the value D can be carried out by any calculation known to those skilled in the art to show a difference between a quantity at T1 and a quantity at T2.
  • the value D has the same magnitude as the quantity (VEGFR2 to T1) or (VEGFR2 to T2) determined.
  • the value D may correspond to the relative rate of variation and is calculated according to one of the following formulas (II) or (II):
  • VEGFR2 to T1-VEGFR2 to T2 TT VEGFR2 to T1-VEGFR2 to T2 "_ _ TT .
  • the value D is either a rate (II) or a percentage (II) '.
  • the value D can correspond to the difference in quantity per unit of time and is calculated according to the following formula (III):
  • the value D has as magnitude one unit of quantity per unit of time.
  • the method comprises a step of comparing the value D, obtained in the previous step, with a reference value determined from two populations of patients suspected of having an infection with a SOFA score of less than two, one being complicated and the other not.
  • the determination of the reference value is done as indicated above. In this context, it also requires two sampling times of the reference samples.
  • the method according to this embodiment makes it possible to conclude on the level of complication risk in the patient from which the biological sample is derived, a value D less than said reference value meaning that the patient tested is a patient at increased risk of complication. , and a value D greater than said reference value meaning that the patient being tested is not a patient at increased risk of complication.
  • An at-risk patient is as defined above.
  • the method of the invention can be improved by also measuring the level of expression of at least one expression product of at least one other gene, in addition to measuring the level of expression of at least one product of expression of the VEGFR2 gene.
  • the combination of at least two markers makes it possible to improve the specificity and the sensitivity of the method of evaluating the risk of complication.
  • an embodiment of the invention comprises or also consists of measuring the level of expression of at least one expression product of the uPAR gene.
  • the expression product (s) of uPAR within the meaning of the invention may or may be any biological molecule resulting from the expression of one of this gene.
  • the uPAR gene (urokinase-type plasminogen activator), also called PLAUR (it will only be named uPAR thereafter), encodes the urokinase plasminogen activator receptor and, given its role in the localization and promotion of The formation of plasmin probably influences many processes in the healthy and sick patient related to cell surface plasminogen activation and localized degradation of the extracellular matrix. It binds to both the pro-protein and mature forms of the urokinase plasminogen activator and allows the activation of the pro-enzyme associated with receptor by plasmin. Several transcription variants result from the alternative splicing of this gene (NCBI Reference Sequence Database, July 2008).
  • the Ensembl base (GRCh38.pl0) identified 16 transcripts derived from the transcription of the uPAR gene. These transcripts are identified in Table 2 below.
  • isoform 1 SEQ ID No. 11
  • No. UniProt Q03405-1 also called uPAR1 or GPI-anchored, which is the membrane form
  • isoforms 2 SEQ ID N 12
  • UniProt No. Q03405-2 and 3 (SEQ ID NO: 13)
  • UniProt No. Q03405-3 which are the plasma forms, or soluble forms, secreted from the receptor.
  • the soluble forms of uPAR are called suPAR.
  • said at least one transcript of the uPAR gene which is measured is chosen from the transcripts mentioned in Table 2 and their variants, the sequence of a variant having at least 99% identity with one of the sequences of said transcripts.
  • the percentage of identity is determined using sequence alignment software, such as CLUSTALW.
  • a variant will correspond, in particular, to a polymorphism of the sequence of the gene chosen.
  • all the isoforms, from the uPAR gene, referenced above, or not yet identified can be used as a marker to assess the risk of complications, in a patient suspected of have an infection with a SOFA score of less than two.
  • the iso-form binding partners of this marker are of the same nature as those described for VEGFR2.
  • Such antibodies for uPAR isoforms are commercially available, for example the following polyclonal antibody: Human biotinylated Antibody ref: BAF807 biotechne ® , and the following monoclonal antibodies: Human upar Antibody ref: MAB807 biotechne ® .
  • RNA transcript RNA transcript
  • mRNA protein
  • protein protein
  • the method of the present invention comprises or consists of performing the steps of:
  • the different steps of quantity measurements can be implemented sequentially or simultaneously.
  • the different steps of comparisons to the reference values can be implemented sequentially or simultaneously.
  • the method in the context of this embodiment makes it possible to conclude that there is an increased risk of complication in a patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two, when the value of the quantity of said at least one product of Expression of the VEGFR2 gene is less than the SVEGFR2 reference value and the value of the amount of said at least one expression product of the uPAR gene is greater than the reference value S U PAR.
  • the determination of the risk of complication can also be implemented by measuring the quantity of the expression products of the different markers in a biological sample to be tested at two different times.
  • another embodiment is a method which comprises or consists of the implementation of the steps of:
  • the different stages of calculation of variations and the different stages of comparisons with reference values with respect to the different markers can be implemented sequentially or simultaneously, insofar as, of course, the chronology T1, measure at T2, comparison to a reference value and establish a conclusion is respected for each marker.
  • the measurement of the amount uPAR can be carried out from a first sample taken at the time of identification of the patient as suspected of having an infection and measurement of the amounts of VEGFR2 from a starting point of one first sample taken 6 hours after the patient's identification as suspected of having an infection.
  • the first samples at time T1 can take place within 12 hours of identifying the patient as suspected of having an infection and the second samples at time T2 can take place within 24 hours (T24) following the first samples at the moment Tl.
  • sampling times, T1 and T2, for the uPAR marker may be identical to those of VEGFR2 but may also be different.
  • the method in the context of this embodiment makes it possible to conclude that there is an increased risk of complication in a patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two when the A V EGFR2 value is lower than said reference value.
  • AS U PAR the reference value for the patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two is not a patient at increased risk of complication, when the value A V EGFR2 is greater than said reference value ASVEGFR2 and when the AS U reference value is lower than the AS U reference value PAR.
  • the determination of the risk of complication can also be implemented by using the calculation of a score related to the different markers used.
  • the method according to this particular embodiment comprises or consists of the implementation of the steps of:
  • the steps of measuring the quantities of the expression products of these markers are implemented as described above and can be implemented sequentially or simultaneously.
  • the score may be a combination of multiplication, ratio or threshold with different weightings of at least two markers.
  • the different quantized markers can also be combined by means of various mathematical algorithms well known to those skilled in the art.
  • the method according to this particular embodiment makes it possible to conclude that there is an increased risk of complication in a patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two, when the score of the combination is greater than the reference score and makes it possible to conclude that the patient suspected of having an infection with a SOFA score of less than two is not a patient at increased risk of complication, when the score of the combination is lower than the baseline score.
  • the steps of calculation and comparison of the score can be replaced by the establishment of a decision tree.
  • the decision tree is a decision support tool representing a set of choices in the graphical form of a tree.
  • the various possible decisions are located at the ends of the branches (the "leaves" of the tree), and are reached according to decisions taken at each stage.
  • transcript KDR-201 VEGFR2 ⁇ X picoM
  • a subject of the invention is a method of treating a patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two, characterized in that it comprises or consists, moreover, in the following stages:
  • identifying the patients present a risk of complication by implementing a method of in vitro or ex vivo evaluation of the risk of complication in a patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two according to the invention and
  • a patient identified as being at increased risk of complication may have appropriate health care management to reduce the risk of complication and, for example, to reduce the risk of developing sepsis, septic shock or risk. of death.
  • Examples of care management include an immunostimulatory treatment or a prophylactic antibiotic treatment, the two treatments can be combined and / or refer to a continuing care or resuscitation service to reduce the risk of complications, for example, to reduce the risk of developing sepsis, septic shock or even the risk of death in the days following the measurement of the level of expression of the marker (s).
  • immunostimulatory treatments suitable for preventing the risk of complications are, without limitation, treatment with GM-CSF, IL7, IFNy or anti-PD1.
  • prophylactic antibiotic treatments suitable for preventing pneumonia are described in particular in the Annales conses d'Aesthésie and Reanimation (30, 2011; 168-190).
  • a patient who is not at risk of complication can be referred quickly to a day-care service, such as an infectious disease department, rather than staying in a service with close monitoring that he will not need. .
  • another object of the invention is a kit for to predict the risk of complication in a patient suspected of having an infection with a SOFA score below two, comprising at least one specific binding partner of at least one expression product of the VEGFR2 gene and at least one specific binding partner of at least one expression product of the uPAR gene.
  • kits for measuring the level of expression, in vitro or ex vivo, of at least one expression product of the VEGFR2 gene and at least one expression product of the uPAR gene, in a biological sample comprising:
  • a calibrated control for containing the amounts of said at least one expression product of the VEGFR2 gene which correspond to known quantities of said at least one expression product of the VEGFR2 gene and
  • a calibrated control for containing the amounts of said at least one expression product of the uPAR gene which correspond to known quantities of said at least one expression product of the uPAR gene.
  • a control contains a known quantity of one or more expression products of the marker (s) cited in the present application.
  • the control contains a known quantity of one or more expression products of only one of the markers mentioned in the present application.
  • This control may be either a synthetic sample containing a calibrated quantity of expression product (s) of the gene (s) of interest, or a biological sample whose known quantity (s) of expression product (s) of the genes of interest.
  • said specific binding partner of an expression product of the kit according to the invention is at least one hybridization probe and / or at least one amplification primer, or at least one antibody, or at least one antibody fragment, or at least one affinity protein, or at least one aptamer.
  • the invention also covers the use of a kit according to the invention for carrying out the method of the invention, and in particular for predicting the risk of complication, in a patient suspected of having an infection having a SOFA score of less than two.
  • said specific binding partner of an expression product of the kit according to the invention is at least one hybridization probe and / or at least one amplification primer, or at least one antibody, or at least one antibody fragment, or at least one affinity protein, or at least one aptamer.
  • Figure 1 represents box plots (or box diagrams) which correspond to graphical representations of the expression levels of the sVEGFR2 and suPAR proteins in a sample taken immediately after admission to the emergency department (T0) according to the occurrence or not of complications in patients: A. Levels of expression of sVEGFR2 to T0; B. Levels of expressions of suPAR at T0; Figure 2 represents box plots (or box diagrams) which correspond to graphic representations of the expression levels of the sVEGFR2 and suPAR proteins in a sample taken six hours after the first sampling (T6) according to the occurrence or not of complications in patients: A. Levels of expression of sVEGFR2 to T6; B. Expression levels of suPAR to T6;
  • Figure 3 represents box plots (or box diagrams) that represent graphical representations of the variation in expression level of the sVEGFR2 marker between the first blood sample immediately after admission to the emergency department (T0) and the second six blood sample. hours after the first sampling (T6) according to the occurrence or not of complications in patients.
  • FIG. 4 represents the apparent ROC curve of the association between the combination sVEGFR2 and suPAR at T0 (first blood sample immediately after admission to the emergency department) and the probability of complication of the patients during the 72h following the first sampling T0.
  • Example 1 Obtaining and Preparing Blood Samples This retrospective observational study was conducted in patients aged 19 to 101 years (111 men, 122 women, median age: 53 years) newly admitted to the emergency department of 14 French and Belgian hospitals between 2015 and 2017 for the burden of a suspected infection. These patients are all hospitalized for suspected infection. The inclusion criteria were as follows:
  • o respiratory rate greater than 20 breaths per minute or PaCO 2 ⁇ 32 mmHg
  • o leukocyte count greater than 12000 / mm3 or less than 4000 / mm3.
  • the clinical exclusion criteria were:
  • the first blood sample was taken within the first 12 hours after the arrival of the patient in the emergency department (T0);
  • the second blood sample was taken between 4 and 8 hours (T6 ⁇ 2h) following the first blood sample (T0);
  • the mortality is evaluated at 28 days following the arrival of the patient in the emergency department.
  • the complication was determined by a adjudication committee composed of 3 independent physicians under study. This committee determines the complication according to several criteria; in particular, the appearance of new organ failures (increase of the score of SOFA), the death or the necessity of entering the intensive care unit. Of the 233 patients in this cohort, 36 patients (21%) will get complicated within 72 hours of admission (“COMPLICATION”) and 185 patients (79%) will not get complicated (“NON COMPLICATION”)
  • SVEGFR2 protein was assayed using antibody marketed by Biotechne ® (mAb anti Human VEGFR2 (KDR) ref: MAB3573, and Human VEGF R2 / KDR / Flk-l Antibody Antigen Affinity-Purified Goat IgG Polyclonal ref: AF357 ) and an ELISA test using the Vidas ® controller (bioMérieux). To do this, the ELISA test was constructed using the reagents of the Vidas ® BRAHMS PCT TM kit cartridge (bioMérieux, Cat No.30450) without the use of antibodies and control calibrators.
  • VIDAS ® is a multiparametric automaton of immunoanalyses. It is a closed system for unit testing, offering great flexibility. This machine is characterized by its robustness, flexibility, ease of use and is intended for small and medium size laboratories. It allows routine tests, confirmation and tests with high medical value.
  • the detection is done by the Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) technique in serum or plasma.
  • ELFA assay principle is the combination of immunoenzymatic reactions with fluorescence endpoint detection.
  • the enzyme used is alkaline phosphatase which catalyzes the hydrolysis reaction of the substrate, 4-methylumbelliferyl phosphate into a product; 4-methyl-umbellierone.
  • the product emits at a wavelength of 450 nm after excitation at 370 nm.
  • the results are analyzed automatically by VIDAS® and expressed in relative fluorescence intensity or RFV (Relative Fluorescent Value). This RFV value is determined by subtracting the background noise value (BKG) from the raw value obtained.
  • RFV Relative Fluorescent Value
  • the cones were sensitized with monoclonal antibody MAB3573 at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml. (Indirect coating with a first anti-mouse mAb at 10 ⁇ g / ml then anti-sVEGFR2 Ab at 2.5 mg / ml); 2. The contents of the fourth well of the Vidas ® BRAHMS PCT TM Kit Cartridge were replaced with 400 m ⁇ of revealing antibody (ref .: AF357), coupled with biotin, diluted to 1 ⁇ g / ml;
  • the ELISA reaction was performed using the Vidas ® controller and the Vidas ® BRAHMS PCT TM kit protocol;
  • the results were obtained as raw values after subtraction of the background noise (reading of the substrate before reaction).
  • a standard curve was established by assaying a range of concentrations of the marker in the form of recombinant protein (Recombinant Human VEGF R2 / KDR / Flk-l Fc Chimera Biotechne ® ref. 357-KD-050).
  • the standard curve was plotted by plotting the concentration of the marker on the abscissa and the signal read by Vidas ® (RFV or Relative Fluorescence Value).
  • the marker concentration present in the serum was calculated by plotting the concentration corresponding to the RFV signal read by Vidas ® .
  • suPAR Blood levels of suPAR were measured using frozen sera (samples stored at -80 ° C). The samples were analyzed using the CE / IVD labeled AUTO / CE marked suPARnostic ® ELISA kit, according to the manufacturer's instructions (Virogates, Birkeroed, Denmark).
  • the suPARnostic ® ELISA is based on a simplified monoclonal double-antibody sandwich ELISA, in which serum samples and peroxidase-conjugated anti-suPARs are first mixed and then incubated in anti-suPAR pre-coated micro-wells. .
  • the recombinant suPAR standards of the kit are calibrated and make it possible to calculate a standard curve.
  • the concentrations of suPAR are determined in ng / ml of plasma. The test was validated to measure suPAR levels between 0.6 and 22 ng / ml.
  • the predictive ability to measure the level of expression of markers was studied in relation to the occurrence or non-occurrence of complications in patients within 72 hours after the first T0 blood sample.
  • the Wilcoxon-Mann-Whitney test was used to characterize this association.
  • VEGFR2 and suPAR at T0 and T6 were measured as described above in blood samples of 233 patients suspected of having an infection with a SOFA score of less than two. The results are shown in Table 5 and Figures 1 and 2.
  • the level of expression of the markers studied makes it possible to discriminate the patients who will become complicated within 72 hours after the first blood sample at T0 of those who will not complicate.
  • patients with complications will have lower levels of SVEGFR2 expression than patients who do not suffer from any complication.
  • patients with complications they have higher levels of expression than patients who do not suffer from any complication.
  • the level of expression of sVEGFR2 at T0 and T6 was measured as described above in the plasma samples of 233 patients suspected of having an infection with a SOFA score of less than two. For each patient the variation was calculated according to the following formula:
  • OR 1: no association
  • OR ⁇ 1 an increase from 1st to 3rd quartile is associated with a decrease in the risk of complication
  • OR> 1 an increase from 1st to 3rd quartile is associated with an increased risk of complication
  • the IQR is the quartile gap.
  • the IQR is a measure of dispersion that is obtained by differentiating between the third and the first quartile.
  • IQR.OR was measured for blood samples from 233 patients suspected of having an infection with a SOFA score of less than two.
  • the logistic regression model was also performed to analyze the performance ratio performance of sVEGFR2 and suPAR.
  • the objective is to show that the ratio of markers is significantly associated with the risk of complication within 72 hours after the first sampling.
  • the value of the IQR.OR for the suPAR marker on the studied population is 1.49 with a p-value equal to 0.02.
  • patients with a high suPAR expression level (3rd quartile) have a significantly higher probability of complication (1.49 times) than patients with a low expression level (1st quartile).
  • the value of the IQR.OR for the ratio between sVEGFR2 and suPAR is 1.74 with a p-value equal to 0.0005.
  • patients with an expression ratio between sVEGFR2 and high suPAR (3rd quartile) have a significantly higher likelihood of complication (1.74 times) than patients with a low expression ratio (1st quartile).
  • RT-PCR Trends and Problems Journal of Molecular Endocrinology, 29: 23-39
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient suspecté d'avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, comprenant la mesure du niveau d'expression, dans un échantillon biologique issu dudit patient, d'au moins un produit d'expression du gène VEGFR2.

Description

EVALUATION DU RISQUE DE COMPLICATION CHEZ UN PATIENT SUSPECTE D’AVOIR UNE INFECTION AYANT UN SCORE SOFA INFERIEUR A
DEUX
La présente invention concerne le domaine médical en général, et en particulier le domaine du pronostic in vitro. Elle a trait plus spécifiquement à l’évaluation du risque de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux.
L’un des principaux risques de complication pour un patient ayant contracté une infection est de développer un syndrome septique. Le sepsis et le choc septique sont des urgences médicales qui touchent près de 18 millions de personnes à travers le monde. En Europe, le taux de mortalité annuel est de l’ordre de 30 à 40%. Ces malades nécessitent une prise en charge dans des services spécialisés avec des durées de séjour à l’hôpital s’étendant souvent au-delà d’un mois et engendrant des coûts associés très élevés.
Le sepsis est un syndrome complexe regroupant plusieurs phases cliniques. Il reste associé à une mortalité élevée. La reconnaissance précoce des patients à risque d'évolution défavorable est un des éléments déterminants du pronostic.
L’identification du sepsis s'est appuyée jusqu'en 2016 sur une classification datée de 1991 et réactualisée en 2001. Elle distinguait quatre phases considérées comme les phases d’aggravation progressive de l’infection et de la réponse inflammatoire à celle-ci : l’infection, le sepsis, le sepsis sévère et le choc septique. Ainsi le sepsis se définissait avant 2016 par la présence d’une infection associée à des manifestations d’inflammation systémique de l’organisme (Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique, SIRS). Un groupe d’experts avait proposé des critères de définitions des syndromes cliniques suivants ( International Sepsis Définitions Conférence, Crit. Care Med. 31 ; 2003 ) :
- le SIRS, est une réponse systémique inflammatoire déclenchée par une variété de causes infectieuses ou non. Parmi les états de SIRS déclenchés par des causes non infectieuses, on peut citer les états traumatiques, les brûlures, les pancréatites, les syndromes respiratoires aiguës. Une réponse systémique inflammatoire se manifestant par au moins deux des signes suivants : a) température supérieure à 38°C ou inférieure à 36°C ; b) rythme cardiaque supérieur à 90 battements par minute ; c) rythme respiratoire supérieur à 20 respirations par minute ; d) nombre de leucocytes supérieur à 12000/mm3 ou inférieur à 4000/mm3, - le sepsis est un syndrome de réponse systémique inflammatoire en relation avec une infection,
- un sepsis sévère est un sepsis associé à une hypotension artérielle et/ou hypoperfusion et/ou dysfonctionnement d’au moins un organe,
- le choc septique est un sepsis sévère associé à une hypotension persistante et peut être qualifié par :
o la présence d’un site infectieux identifié,
o une hypotension persistante malgré des remplissages adéquats et des traitements vasopresseurs.
Ces définitions présentaient plusieurs limites, notamment une focalisation excessive sur l'inflammation, ainsi qu’un modèle trompeur de sepsis qui se poursuivait via un continuum par un sepsis sévère puis par un choc septique. De plus, la spécificité et la sensibilité des critères du syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS) étaient insuffisantes. Un groupe international d’experts (SEPSIS-3), cherchant à simplifier et améliorer la classification des états septiques aigus, a souligné que des définitions et des terminologies multiples étaient utilisées pour la septicémie, le choc septique et pour les dysfonctionnements de certains organes, ce qui conduit à des anomalies de l'incidence et de la mortalité observée rapportées.
Ainsi, début 2016, la conférence de consensus internationale SEPSIS-3 a redéfini le sepsis comme étant une dysfonction d’organe menaçant le pronostic vital et causée par une réponse inappropriée de l’hôte à une infection. On distingue désormais uniquement le sepsis et le choc septique. Ces nouvelles définitions, qui mettent l'accent sur la notion de dysfonction d'organe menaçant le pronostic vital, utilise un score appelé score SOFA (score séquentiel d'insuffisance organique) et sa version simplifiée le qSOFA (quick SOFA), définis ci-après, pour déterminer l’association entre mortalité et défaillance d’organe. D’un point de vue clinique, le dysfonctionnement organique se caractérise soit par une infection associée à un score SOFA supérieur ou égal à 2, soit par une augmentation du score SOFA d’au moins 2 points.
Fe score de SOFA (sequential organ failure assessment score) ou score d’évaluation séquentielle des défaillances d'organes est utilisé pour suivre le statut d'une personne pendant son séjour à l’hôpital afin de déterminer l'étendue de ses défaillances d’organes (Vincent JF and Coll, 1996). Fe score est basé sur six scores différents, un pour chacun des systèmes suivants : respiratoire, cardiovasculaire, hépatique, de coagulation, rénal et neurologique. Le mode de calcul pour chaque système est indiqué dans le tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1
Le score qSOFA (ou quickSOFA) a été introduit en février 2016 sous la forme d'une version simplifiée du score SOFA comme moyen initial d’identifier les patients à haut risque de mauvais pronostic après une infection (Eamon P. Raith, et al., 2017). Le qSOFA simplifie drastiquement le score SOFA en n'incluant que 3 critères cliniques. Le qSOFA peut ainsi facilement et rapidement être calculé et répété chez les patients. Dans le tableau 2, ci-dessous, le mode de calcul du qSOFA.
Tableau 2
Le score qSOFA varie donc de 0 à 3 points.
La présence de 2 points qSOFA au plus près du début de l'infection est associée à un plus grand risque de décès ou à un séjour prolongé en unité de soins intensifs.
Tout patient présentant un sepsis peut évoluer rapidement vers des formes beaucoup plus graves et mortelles, telles que le choc septique. Le challenge, dans la prise en charge de patients, va donc être d’intervenir le plus rapidement possible et ce avant même que le patient ne présente un sepsis pour éviter que ne s’installent une hypoxie tissulaire et un choc pouvant conduire à une situation irrémédiable.
Dans la pratique courante, la reconnaissance précoce, parmi les patients uniquement suspectés d’avoir une infection sans risque d’aggravation, de ceux qui sont à risque de se compliquer n’est pas toujours simple. Aucun outil n’est actuellement disponible. Dans ce contexte, un système de tri permettant d’identifier les malades présentant des risques de complications cliniques importants, en particulier si le patient se complique vers un sepsis, est un besoin médical récurrent.
Identifier parmi les patients suspectés d’avoir une infection et non grave (ayant un score SOFA inférieur à 2), les plus à risque de complication, et ce le plus tôt possible et en l’absence de sepsis, permettrait de mettre en place le plus tôt possible une stratégie pour limiter leur risque de complication. Par exemple, un traitement antibiotique en prophylaxie pourrait être administré (Puisieux F et al., 1993 ; Jensen JU et al., 2011) ou encore un traitement préventif (K. Asehnoune et al., 2014) ou encore une immunothérapie ciblée (Chahin A et al., 2015 ; Ali YM et al., 2014) , ou plus simplement, les voies d’entrée pour les pathogènes pourraient être limitées (i.e. retrait des cathéters dès que possible...). Ces mesures permettraient une meilleure prise en charge du patient conduisant à :
- une réduction de la durée d’hospitalisation en réanimation et à l’hôpital ce qui permet une diminution des coûts associés (Lambert ML SC et al., 2011);
- une diminution des complications septiques ; et
- une diminution du taux de mortalité.
Il existe donc un besoin urgent, non résolu depuis de nombreuses années, de trouver de bons outils, dont notamment de bons marqueurs, pour être capable d’évaluer le risque de complication, chez les patients suspectés d’avoir une infection mais n’ayant pas de signes de sévérité caractérisés par un score SOFA inférieur à deux, et ainsi permettre de les stratifier en fonction de leur risque de complication.
Différents marqueurs ont déjà été décrits pour l’aide au diagnostic du sepsis et parfois dans le cadre de l’évaluation du risque de complication chez des patients qui présentaient déjà un sepsis. Des exemples de tels marqueurs comprennent la pro calcitonine (PCT) ou la Protéine C Réactive (CRP).
Outre la procalcitonine, la demande WO 20l3/l52047divulgue plus d’une centaine de biomarqueurs pour leur utilisation dans le diagnostic d’un sepsis ou encore d’un choc septique mais également dans le pronostic d’évolution d’un sepsis déjà avéré vers un choc septique, selon l’ancienne définition. Parmi ces biomarqueurs figure le récepteur de type II au facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFR2). Néanmoins les cohortes de patients décrites dans les exemples, concernant ce marqueur pour le pronostic d’évolution, sont composées de patients admis pour au moins 48 heures dans une unité de soins intensifs, services hospitaliers spécialisés dans la prise en charge des patients inanimés ou particulièrement graves nécessitant une surveillance permanente. Ces patients ont un score SOFA supérieur ou égal à trois. Il s’agit de patients, dont l’état clinique est particulièrement grave, qui ne correspondent en rien à des patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux. Fes patients simplement suspectés d’avoir une infection et ayant un score SOFA inférieur à deux ne seront pas considérés comme graves, de prime abord, par des professionnels de santé. Fes patients décrits dans cette demande de brevet se rapprochant des patients suspectés d’avoir une infection et ayant un score SOFA inférieur à deux sont ceux des exemples 4 et 11. Or pour ces patients VEGFR2 n’est nullement décrit comme étant associé à un risque d’aggravation.
De manière identique, Wada et son équipe (Wada T et al., 2013) décrivent les récepteurs solubles aux facteurs angiogéniques, tels que sVEGFR2 ou encore l’Angiopoïétine 2, facteur de croissance impliqué dans l'angiogenèse, comme étant prédictifs d’un développement d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez des patients gravement malades. Fà encore, les patients inclus dans la cohorte de cette publication sont des patients gravement malades, déjà en structure hospitalière, étant tous sous respiration mécanique ventilatoire et ayant soit un sepsis, soit un traumatisme sévère, soit étant réanimés suite à un arrêt cardiaque. Ces patients ont des scores SOFA très élevés, allant de quatre à quasiment dix. Encore une fois, ces patients sous assistance respiratoire ne sont pas des patients simplement suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, considérés comme non graves.
Fe VEGFR2 est l’un des récepteurs du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Ce dernier est le principal facteur impliqué dans la néo-angiogenèse. Fa famille des VEGF de mammifères est composée de quatre glycoprotéines référencées de A à D et du facteur de croissance placentaire (P1GF) (Koch and Claesson-Welsh, 2012). Chacun d’eux est exprimé sous différentes iso formes dues à des épissages alternatifs et des clivages protéolitiques. Ces VEGFs lient et activent trois types de récepteurs à tyrosine kinase, le VEGFR 2, mais également les VEGFR 1 et 3 respectivement appelés KDR, Fltl et VEGFR3. Les VEGFs lient également les neuropilines NP1 et NP2 qui agissent comme des co-facteurs pour les VEGFRs.
Le gène VEGFR2, également appelé KDR, (par la suite ce gène sera uniquement nommé VEGFR2) code pour le récepteur de type 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire. C’est une tyrosine-protéine kinase qui agit comme un récepteur de surface cellulaire pour VEGFA, VEGFC et VEGFD. Il joue un rôle essentiel dans la régulation de l'angiogenèse, du développement vasculaire, de la perméabilité vasculaire et de l’hématopoïèse embryonnaire. Ce récepteur favorise la prolifération, la survie, la migration et la différenciation des cellules endothéliales mais également la réorganisation du cytosquelette d'actine. Ce récepteur est constitué d’une partie extracellulaire constituée de 7 domaines de type immunoglobuline, d’une région transmembranaire et d’une partie intracellulaire contenant un domaine tyrosine-kinase (Shibuya, 2011).
Ainsi, l’industrie pharmaceutique s’est beaucoup intéressée à ces récepteurs dans le cadre de traitements contre le cancer. Des molécules destinées à bloquer l’activation des VEGFR ont été développées permettant ainsi de contrôler l’angiogenèse et, par voie de conséquence, la prolifération tumorale.
Bien que le récepteur de type 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ou VEGFR2, trouve plusieurs applications dans le domaine médical, il n’a encore jamais été décrit comme marqueur de complication chez un patient simplement suspecté d’avoir une infection et ayant un score SOFA inférieur à deux, autrement dit chez un patient considéré comme n’étant pas gravement malade. Contre toute attente, la Demanderesse a montré que la mesure du niveau d’expression du gène VEGFR2 permettait, de manière très précoce, et ce même avant l’apparition de signe de sévérité, d’évaluer le risque de complication d’un patient suspecté d’avoir une infection.
De ce fait, l’invention présente donc une avancée importante dans le domaine de la stratification des patients. Le procédé selon l’invention possède l’avantage de pouvoir évaluer facilement le risque de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection et ne présentant pas les signes cliniques de sévérité (score de SOFA inférieur à deux), en disposant d’un marqueur directement mesurable, notamment par des automates d’analyse, et dont la mesure peut être faite dans un laboratoire de proximité, dès l’arrivée dans un centre d’urgence, chez son médecin traitant ou encore au lit du patient, et ainsi faire un tri lié à la nécessité de prendre en charge les patients les plus à risque parmi tous ces patients suspectés d’avoir une infection. Ainsi, l’invention a pour premier objet un procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, comprenant la mesure du niveau d’expression, dans un échantillon biologique issu dudit patient, d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2.
L’invention a également pour objet, un procédé de stratification et de traitement d’un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes consistant à :
- identifier les patients présentent un risque de complication en mettant en œuvre le procédé selon l’invention d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez ce patient et,
- adapter la gestion des soins de santé dudit patient identifié à l'étape précédente pour réduire le risque de complication.
Un autre objet de l’invention concerne un kit pour la mesure in vitro ou ex vivo du niveau d’expression d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et d’au moins un produit d’expression du gène uPAR chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, comprenant au moins un partenaire de liaison spécifique dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et au moins un partenaire de liaison spécifique dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR.
Enfin, un dernier objet de la présente invention est un kit pour la mesure in vitro ou ex vivo du niveau d’expression d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et au moins un produit d’expression du gène uPAR, dans un échantillon biologique, comprenant :
- des outils ou réactifs spécifiques permettant de mesurer les quantités dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR, dans ledit échantillon biologique, et
- un contrôle calibré pour contenir les quantités dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 qui correspondent à des quantités connues dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et
- un contrôle calibré pour contenir les quantités dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR qui correspondent à des quantités connues dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR.
Avant d’aller plus loin dans la description de l’invention, les définitions ci-après sont données afin d’en faciliter la compréhension. Au sens de l’invention, les patients sont des patients suspectés d’avoir une infection et ayant un score SOFA inférieur à deux. Autrement dit, ce sont des patients ne présentant pas de signes cliniques de sévérité.
On entend par patient suspecté d’avoir une infection un patient ayant une infection avérée ou étant suspecté d’avoir une infection par un professionnel de la santé sur des manifestions cliniques ou paracliniques.
Un professionnel de la santé est toute personne qui exerce ses compétences et son jugement médical, fournit un service lié au maintien, à l'amélioration de la santé de patients, ou au traitement des individus blessés, malades, souffrant d’un handicap ou d’une infirmité en leur prodiguant des soins.
A titre d’exemples nous pouvons citer les professionnels de la santé suivants : le médecin, l’infirmier ou encore la sage-femme.
A titre d’exemples de manifestations cliniques et de façon non exhaustive, nous pouvons citer :
- pour un foyer infectieux pulmonaire : douleur thoracique, dyspnée, toux orientant le professionnel de la santé vers un foyer pulmonaire;
- pour un foyer infectieux cutané : érythème ou autre lésion cutanée inflammatoire ;
- pour un foyer infectieux urinaire (bas ou haut) : brûlures mictionnelles, pollakiurie ou dysurie, douleurs pelviennes, émission de pue au niveau du méat urinaire, douleurs lombaires unilatérales ;
- pour un foyer infectieux neuro -méningé: céphalées, photophobie, myalgie-arthralgies, trouble de la conscience ;
- un foyer infectieux digestif : douleurs abdominales, troubles du transit ;
- température supérieure à 38°C ou inférieure à 36°C ;
- rythme cardiaque supérieur à 90 battements par minute ;
- rythme respiratoire supérieur à 20 respirations par minute ;
- nombre de leucocytes supérieur à 12000/mm3 ou inférieur à 4000/mm3.
A titre d’exemples de manifestations paracliniques et de façon non exhaustive, nous pouvons citer :
- la mesure de la Procalcitonine ;
- la Lactatémie ;
- la mesure de la protéine C réactive ; - le bilan hépatique ;
- la mesure de ALAT/SGPT (Alanine -Aminotransférase/Sérum Glutamopyruvate Transférase) et ASAT/SGOT (Aspartate- Aminotransférase/Sérum Glutamooxaloacétate Transférase) ;
- le bilan rénal (l’urée et la créatinine) ;
- fionogramme sanguin ;
- l’examen cytobactériologique des urines ;
- la gazométrie artérielle ;
- la coagulation.
Le professionnel de la santé saura à l’aide des manifestions cliniques ou paracliniques déterminer si le patient est suspecté d’avoir une infection ou pas. Le patient dont on suspecte l’infection présentera un ou plusieurs signes cliniques et/ou paracliniques, par exemple ceux exemplifiés ci-dessus.
Dans le cadre de l’invention, l’infection peut être provoquée par la contamination du patient par n’importe quel agent infectieux, tel qu’un virus, une bactérie, un parasite, un champignon ou encore un protozoaire.
A titre d’exemples d’agent infectieux nous pouvons citer les virus tels que virus du VIH, SIV, FIV, VHC, VHB, VHA, VHE, virus VZV, CMV, EBV, VHS1, VHS2, les bactéries telles que Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Borrelia burgdorferi stricto sensu, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia spielmanii, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, les salmonelles, Klebsiella, Leugionella, Proteus, Klebsiella, Escherichia coli, Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Treponema pallidum, les levures telles que Candida albicans, les champignons tels que Aspergillus fumigatus, les Mucorales, etc. et les protozoaires tels que la leishmania, le trichomonas vaginalis, le plasmodium, etc.
De même, lorsque que le patient est suspecté d’une infection, elle peut toucher n'importe quel tissu ou organe. A titre d’exemples, on peut citer les infections :
- des voies urinaires et des organes génitaux ;
- des organes abdominaux ;
- des plaies et des tissus mous ;
- de la peau ;
- par cathéter ; - du système nerveux central ;
- des valves cardiaques ;
- de l’appareil digestif dans sa globalité ou partiellement (estomac, duodénum, intestin grêle, colon, rectum et anus),
- de la vessie,
- de l'intestin (duodénum, intestin grêle, colon, rectum et anus) ;
- de la sphère ORL.
Selon un mode particulier de l’invention, l’infection est d’origine bactérienne.
Selon la présente invention, le patient est caractérisé par son score SOFA qui est strictement inférieur à 2, autrement dit, un patient ayant un score SOFA soit de 0, soit de 1. Autrement dit, selon la nouvelle définition de 2016 (SEPSIS-3), il s’agit de patients ne présentant pas de sepsis.
Les patients selon l’invention sont donc des patients ne présentant pas un état clinique grave. Par exemple, les patients ne sont pas en soins intensifs et/ou ne sont pas sous respiration mécanique ventilatoire.
Les patients selon l’invention, qui ne sont pas dans un état clinique grave, seront mis en contact avec les professionnels de santé, qui vont suspecter une infection, par exemple dans les cas suivants : dès leur arrivée dans un centre d’urgence, chez le médecin traitant lui- même ou encore à l’hôpital à son lit, ce qui constitue un autre mode de réalisation particulier.
Par évaluation du risque de complication, on entend l’identification parmi les patients suspectés d’avoir une infection et ayant un score SOFA inférieur à deux, ceux qui vont voir leur état se détériorer au cours des heures qui suivent la mesure du niveau d’expression du marqueur et ceux qui ne vont pas voir leur état se détériorer au cours des heures qui suivent et ne nécessitant pas, par conséquent, de prise en charge par un service hospitalier spécialisé.
Selon la présente invention la complication se caractérise par au moins un des évènements suivants :
- l’augmentation du score SOFA d’au moins un point, l’apparition d’au moins une défaillance d’organe, la nécessité d’entrée en réanimation, et
- le décès.
Dans le cadre de l’invention on entend par défaillance d’organe un fonctionnement anormal d’un organe qui se traduit par une anomalie clinique ou biologique de l’organe (cf. infra le calcul du score de SOFA). A titre d’exemples de défaillance d’organe, on peut citer la défaillance respiratoire, cardiovasculaire, rénale, neurologique, hépatique ou encore les défaillances hémato logiques.
Concernant les anomalies cliniques ou biologiques, on peut citer à titre d’exemples les définitions selon Fagon des défaillances d'organe (Fagon et al., 1993) :
- défaillance respiratoire (au moins un des critères suivants) :
o PaC02 < 60 mmHg avec FI02 = 0,21
o ventilation artificielle
- défaillance cardiovasculaire (au moins un des critères suivants en l'absence d'hypovolémie) :
o pression artérielle systolique < 90 mmHg avec signes d'hypoperfusion périphérique
o utilisation de drogues inotropes ou vasopressives pour maintenir une pression artérielle systolique > 90 mmHg
- défaillance cardiovasculaire (au moins un des critères suivants en l'absence d'hypovolémie) :
o pression artérielle systolique < 90 mmHg avec signes d'hypoperfusion périphérique
o utilisation de drogues inotropes ou vasopressives pour maintenir une pression artérielle systolique > 90 mmHg
- défaillance rénale (au moins un des critères suivants en l’absence d'insuffisance rénale chronique) :
o Créatininémie > 300 pmol/L
o Diurèse < 500 mL/24 h ou < 180 mL /8 h
o Nécessité d’une épuration extra-rénale
- défaillance neurologique (au moins un des critères suivants) :
o Score de Glasgow < 6 (en l'absence de sédation) o Apparition brutale d’un syndrome confusionnel
- défaillance hépatique (au moins un des critères suivants) :
o bilirubine > 100 qmol/L
o phosphate alcaline > x3
- défaillance hématologique (au moins un des critères suivants) :
o Hématocrite < 20%
o Leucocytose < 2 000/mm3 o Plaquettes < 40 000/mm3 .
Dans le cadre de la présente invention, on entend qu’un patient a besoin d’entrer en réanimation lorsque son état nécessite un suivi continu des fonctions vitales et, le cas échéant, le recours à des méthodes de suppléance (transfusion de dérivés sanguins, remplissage vasculaire, ventilation mécanique, catécho lamines, hémodialyse, circulation extracorporelle, etc.). L'objectif final de la réanimation est la restauration de l'homéostasie.
La présence d’un risque de complication correspond au risque que la complication intervienne, par exemple dans les 5 jours, en particulier dans les 4 jours, notamment dans les 3 jours qui suivent le prélèvement d’échantillon et lorsqu’il y a plusieurs prélèvements dans les 5 jours, en particulier dans les 4 jours, notamment dans les 3 jours qui suivent le premier prélèvement d’échantillon.
Le procédé selon l’invention comprend la mesure du niveau d’expression, dans un échantillon biologique issu dudit patient, d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2.
D’une manière générale, le terme « échantillon » se réfère à une partie ou à une quantité, plus particulièrement une petite partie ou une petite quantité, prélevée à partir d’une ou plusieurs entités aux fins d’analyse. Cet échantillon peut éventuellement avoir subi un traitement préalable, impliquant par exemple des étapes de mélange et de dilution.
L'échantillon dans le cadre du procédé de l'invention est un échantillon biologique provenant du patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux à qui on souhaite évaluer le risque de complication dans les heures qui suivent la mesure du niveau d’expression du ou des marqueurs. En particulier, un tel échantillon biologique est choisi parmi ceux susceptibles de contenir un produit d’expression de VEGFR2 ou tout autre marqueur décrit par la suite.
F'échantillon biologique selon la présente invention peut être de différentes natures. En particulier, cet échantillon est un fluide biologique, par exemple choisi parmi le sang total (tel que collecté de la voie veineuse, c'est-à-dire contenant les cellules blanches et rouges, les plaquettes et le plasma), le sérum, le plasma, le liquide de lavage broncho-alvéolaire, le liquide céphalo-rachidien, également appelé liquide cérébro-spinal, et les urines. De préférence, l'échantillon biologique issu du patient est un échantillon de sang total, plasma, sérum ou tout dérivé.
Selon la présente invention, la mesure du niveau expression du gène VEGFR2 (SEQ ID N°l) consiste à quantifier au moins un produit d'expression de ce gène. Le produit d’expression au sens de l’invention est toute molécule biologique issue de l’expression du gène de VEGFR2. A titre d’exemple, nous pouvons citer un transcrit ARN, une protéine ou un polypeptide.
Selon un mode de réalisation de l’invention, le produit d’expression du gène est un transcrit ARN. Par « transcrit », on entend les ARN, et en particulier les ARN messagers, issus de la transcription du gène VEGFR2. Plus précisément, les transcrits sont les ARN produits par l’épissage du gène. Ainsi dans ce mode de réalisation la mesure du niveau expression d’un ou plusieurs transcrits ARN du gène VEGFR2 peut être effectuée.
Le gène VEGFR2 a trois transcrits connus à ce jour, référencés dans la base Ensembl (GRCh38.plO) et identifiés dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3
Selon un mode de réalisation, l’expression d’un, de deux ou de trois transcrits choisis parmi les transcrits KDR-201 (SEQ ID N°2), KDR-202 et KDR-203 et leurs variants est mise en œuvre. Par variant on entend un ARN ayant une séquence présentant au moins 99% d’identité avec l’une desdites séquences des transcrits KDR-201, KDR-202, KDR-203. Le pourcentage d’identité est déterminé grâce à un logiciel d’alignement de séquences, tel que CLUSTALW (Thompson et al., 1994). Un variant correspondra, en particulier, à un polymorphisme de la séquence du gène VEGFR2. Le transcrit du gène VEGFR2 préféré est le transcrit KDR-201 ou à un de ses variants présentant au moins 99% d’identité avec la séquence dudit transcrit, dont l’expression sera déterminée seule ou en association avec celle des autres variants. De préférence, seule l’expression du transcrit KDR-201 ou d’un de ses variants présentant au moins 99% d’identité avec la séquence dudit transcrit sera déterminée.
Toute méthode de mesure du niveau d’expression de transcrit d’ARN bien connue de l’homme du métier peut être utilisée pour la mise en œuvre de l’invention.
En règle générale, la mesure du niveau d’expression d’un transcrit d’ARN d’un gène cible peut comprendre une étape préliminaire d’extraction des ARN totaux d'un échantillon biologique. Cette étape est suivie d’une étape de transcription inverse de ces différents ARN afin d'obtenir leur ADN complémentaire (ADNc). Ensuite les ADNc spécifiques du gène cible sont amplifiés puis quantifiés.
L’extraction est mise en œuvre par tous les protocoles d’extraction et de purification d’acides nucléiques bien connus de l’homme du métier. A titre indicatif, l’extraction d’acides nucléiques peut être réalisée par lyse des cellules présentes dans l’échantillon biologique suivie d’une purification ou encore par extraction par du phénol, du chloroforme et de l’alcool. Ces étapes sont bien connues de l’homme du métier et sont décrites par exemple par Sambrook J et Russell DW (2017).
Ces étapes permettent d’extraire de l'échantillon biologique les ARN totaux, comprenant les ARN ribosomaux, les ARN de transfert et les ARN messagers.
On réalise ensuite une réaction de transcription inverse à l'aide d'une enzyme transcriptase inverse qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment complémentaire d'ADN (ADNc). La réalisation d'une telle étape est bien connue de l'homme du métier (Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401). Lorsque l’on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADN complémentaires des ARN messagers, on réalise cette étape enzymatique en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s’hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des différents ARNm afin de former un complexe polyT -polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription inverse réalisée par l'enzyme transcriptase inverse. On obtient alors différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique.
Ensuite, dans le but d’amplifier spécifiquement les ADNc spécifiques du gène cible une réaction d'amplification enzymatique est réalisée. Une réaction d'amplification enzymatique est un processus générant de multiples copies d’un fragment nucléotidique par l’action d’au moins une enzyme. De telles réactions d’amplification sont bien connues de l’homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes :
- PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US4683195, US4683202 et US4800159 ;
- LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP0201184 ;
- RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet W090/01069 ; - 3 SR (Self Sustained Sequence Réplication) avec la demande de brevet W090/06995 ;
- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet W091/02818 ;
- TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US5399491 et
- LAMP (Loop mediated isothermal amplification) avec le brevet US6410278.
On parle alors d’amplicons pour désigner les polynucléotides générés par une technique d’amplification enzymatique. Préférentiellement, lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification spécifiques afin d'amplifier une région particulière de l'ADN complémentaire de l'ARNm issu du gène cible. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription inverse, on parle de RT-PCR.
Suite à cette étape d’amplification, le niveau d’expression du gène cible est déterminé par hybridation à l’aide d’au moins une sonde d’hybridation spécifique du produit d’expression de ce gène cible.
Par sonde d’hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 6 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique cible. Dans la présente invention, le fragment nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager.
Les techniques d’hybridation sont bien connues de l’homme du métier, et on peut citer notamment la technique du Northern blot.
La quantification des ARNm, produits d’expression du gène cible, passe par une étape de détection de la réaction d'hybridation, entre la sonde d’hybridation et fragment nucléotidique cible.
Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l’aide d’un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques (Keller G. H., 1993; Kricka, 1999). Cette étape de détection ne donnera pas lieu, dans la majorité des cas, à un résultat visible lors du procédé de l’invention par celui qui met en œuvre l’invention. Selon un mode de réalisation, la quantité dudit au moins un transcrit du gène VEGFR2 sera déterminée par au moins une des caractéristiques suivantes, pris seules ou en combinaison :
par amplification enzymatique quantitative, de préférence par PCR en temps réel (RT-
PCR quantitative ou QPCR) ;
à l’aide d’au moins une sonde d'hybridation et/ou
à l’aide d’au moins une amorce d’amplification.
La détermination de la quantité de plusieurs transcrits peut être mise en œuvre séquentiellement ou simultanément, selon les procédés classiquement connus de l’homme du métier, tels que décrits précédemment.
Dans un autre mode de réalisation de l’invention, le produit d'expression mesuré est une protéine et/ou un polypeptide qui est le produit de la traduction d'au moins un des transcrits décrits ci-dessus ou d’un transcrit non encore décrit. Ainsi, dans ce mode de réalisation, la mesure du niveau expression d’une ou plusieurs protéines et/ou polypeptides peut être effectuée.
A ce jour trois iso formes de VEGFR2 issues du transcrit KDR-201 sont connues, dont l’iso forme 1 (SEQ ID N°3), N°UniProt P35968-1, qui est la forme transmembranaire et les isoformes 2 (SEQ ID N°4) , N°UniProt P35968-2, et 3 (SEQ ID N°5), N°UniProt P35968-3, qui sont les formes plasmatiques, ou solubles, sécrétées du récepteur. Ces dernières se nomment sVEGFR2.
Toutes les iso formes de VEGFR2 peuvent être utilisées, seules ou en combinaison, en tant que marqueur(s) pour évaluer le risque de complication, chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux.
La détermination de la quantité d’une ou plusieurs isoformes dans un échantillon biologique peut se faire selon les techniques largement connues de l’homme du métier pour déterminer la quantité, ou dose, d’un ou plusieurs analytes dans un échantillon biologique. A titre d’exemples, on peut citer les dosages par immunoessais, tels qu’ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) et RIA (Radio Immuno Assay), et les dosages par spectrométrie de masse, ce qui constitue un mode de réalisation de l’invention.
Le dosage par immunoessai est une méthode bien connue de l’homme du métier et largement utilisée dans le domaine de l’analyse d’échantillons biologiques. Il permet de quantifier des analytes dans des échantillons sous forme notamment de protéines (antigènes/anticorps), de peptides et d’haptènes, comme par exemple les stéroïdes ou les vitamines, impliquant des réactions immunologiques entre l’analyte à détecter, dans le cas présent l’une des isoformes de VEGFR2, et un ou des partenaire(s) de liaison à cet analyte. Ces méthodes d’immunoessai sont basées sur des mesures permettant de quantifier les signaux émis au cours de l’analyse de l’échantillon biologique. La quantité de signaux détectée est généralement proportionnelle à la quantité, ou dose, d'analyte à mesurer (par exemple lors d’un dosage en sandwich) ou inversement proportionnelle à la quantité, ou dose, d'analyte à mesurer (par exemple dosage en compétition). Bien entendu, le terme « immuno » dans « immunoessai » par exemple, n’est pas à considérer dans la présente demande comme indiquant strictement que le partenaire de liaison est un partenaire immunologique, tel qu’un anticorps. En effet, l’homme du métier utilise également largement ce terme lorsque le partenaire de liaison, aussi appelé ligand, n’est pas un partenaire immunologique mais est par exemple un récepteur à l’analyte que l’on veut quantifier. Ainsi, il est connu de parler du dosage ELISA (« Enzyme-Linked Immunosorbent Assay » littéralement « dosage d’immunoadsorption par enzyme liée ») pour des dosages qui utilisent des partenaires de liaison non immunologiques, appelés plus largement en anglais « Ligand Binding Assay », que l’on pourrait traduire par « Dosage utilisant la liaison à un ligand », alors que le terme « immuno » est inclus dans l’acronyme ELISA. Par souci de clarté, les Demanderesses utiliseront dans toute la demande le terme « immuno » pour tout dosage utilisant un partenaire de liaison, même quand il n’est pas un partenaire immunologique.
A titre d’exemple, comme partenaire de liaison aux isoformes de VEGFR2, on peut citer les anticorps, les fractions d’anticorps, les nanofitines, les aptamères (Ochsner U.A. et al., 2014) ou toute autre molécule qui est connue pour avoir une interaction avec la VEGFR2 à rechercher, telle que les lipopolysaccharides (Bucki R. et al., 2005)
Les anticorps partenaires de liaison sont par exemple soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux dont l’obtention est largement connue de l’homme du métier. De tels anticorps pour les iso formes de VGEFR2 sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l’anticorps polyclonal suivant : Human VEGF R2/KDR/Flk- l Biotinylated Antibody ref : BAF357 biothechne® et l’anticorps monoclonal suivant : Human VEGF R2/KDR/Flk-l Antibody ref : MAB3573 biothechne®.
A titre d'exemple de fragments d'anticorps, on peut citer les fragments Fab, Fab', F(ab')2 ainsi que les chaînes scFv (Single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable fragment). Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique.
L’immunoessai pour déterminer la quantité de la ou des iso formes de VEFGR2 met en œuvre de préférence deux partenaires de liaison des isoformes de VEGFR2. L’un des deux partenaires peut être couplé à un marqueur pour former un conjugué ou un traceur. L’autre partenaire de liaison peut être capturé sur un support solide. On parle alors de partenaire de capture pour ce dernier et partenaire de détection pour le premier.
Comme indiqué précédemment, le signal mesuré émis lors de l’immunoessai est alors proportionnel à la quantité, ou dose, de l’iso forme VEGFR2 dans l’échantillon biologique.
Pour corréler le signal obtenu à la quantité, ou à la concentration dans l’échantillon biologique, il convient d’utiliser un modèle mathématique préétabli à partir d’une gamme étalon. Cette gamme étalon sera obtenue préalablement de façon connue. En quelques mots, l’obtention d’une gamme étalon consiste à mesurer le signal généré par des quantités ou concentrations croissantes et connues de l’isoforme VEGFR2, à tracer la courbe donnant le signal en fonction de la quantité, ou concentration, et à trouver un modèle mathématique qui représente la manière la plus fidèle possible cette relation. Le modèle mathématique sera utilisé pour déterminer par extrapolation les quantités, ou concentrations, de l’isoforme VEGFR2 inconnues, contenues dans l’échantillon biologique à tester.
Par marqueur utilisé pour former le conjugué, on entend, notamment, toute molécule contenant un groupement réactif avec un groupement du partenaire de liaison, directement sans modification chimique, ou après modification chimique pour inclure un tel groupement, laquelle molécule est capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs de détection directe consiste en :
- les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la b-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ;
- les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, ;
- les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 1251 ;
- les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines ; et
- les sels électrochmiluminescents tels que des dérivés organo- métalliques à base d’acridinium ou de ruthénium. Des systèmes indirects de détection peuvent aussi être utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Le ligand correspond alors au marqueur pour constituer, avec le partenaire de liaison, le conjugué.
Les couples ligand/anti- ligand sont bien connus de rhomme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide.
L’anti-ligand peut alors être détectable directement par les marqueurs de détection directe décrits précédemment ou être lui-même détectable par un autre couple ligand/anti- ligand, et ainsi de suite.
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d’amplification du signal est bien connue de l’homme du métier, et l’on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR2781802 ou WO 95/08000 de la Demanderesse.
Selon le type de marquage utilisé, l’homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage ou l’émission d’un signal détectable par tout type d’appareil de mesure approprié, comme par exemple un spectrophotomètre, un spectrofluorimètre, un densitomètre ou encore une caméra haute définition.
L’immunoessai peut également comprendre d’autres étapes connues de l’homme du métier, telles que des étapes de lavage et des étapes d’incubation.
L’immunoessai peut être un essai en une étape ou en deux étapes, comme cela est largement connu de l’homme du métier. En quelques mots, un immunoessai en une étape comprend la mise en présence de l’échantillon à tester simultanément avec les deux partenaires de liaison, alors qu’un immunoessai en deux étapes comprend la mise en présence de l’échantillon à tester d’une part avec le premier partenaire de liaison, puis le complexe analyte-premier partenaire de liaison ainsi formé est mis en présence du deuxième partenaire de liaison.
La spectrométrie de masse, qui peut se substituer aux techniques précédemment développées que sont notamment les immunoessais. Elle est mise en œuvre dans un spectromètre de masse. C’est un outil puissant de plus en plus utilisé pour l’analyse et la quantification de différents types de molécules dans des échantillons biologiques. De façon générale, tout type de molécule pouvant être ionisé peut être quantifiée en fonction de sa masse moléculaire à l’aide d’un spectromètre de masse. Selon la nature de la molécule à quantifié, d’origine protéique ou métabolique, certaines technologies de spectrométrie de masse peuvent être plus adaptées. Néanmoins, quelle que soit la méthode de spectrométrie de masse utilisée pour la quantification, cette dernière comprend une étape d’ionisation de la molécule cible en ions dits moléculaires et une étape de séparation des ions moléculaires obtenus en fonction de leur masse. Un spectromètre de masse mesure le rapport de la masse sur la charge (m/z) de molécules ionisées qui est corrélé à la molécule cible à analyser.
Il s’agit d’une méthode largement connue de l’homme du métier et décrite dans la demande de brevet WO 2016/181066 déposée par la Demanderesse.
Dans le cadre de l’invention, lorsqu’il y a plusieurs produits d’expression mesurés, ils peuvent être de même nature mais également de différentes natures. Autrement dit, ils peuvent être de nature moléculaire (transcrit ARN, ARNm) et/ou de nature protéique (protéine, polypeptide).
Que le produit d’expression du gène soit un ARN ou une protéine, le procédé de l’invention peut comprendre ou consister en la mise en œuvre des étapes consistant à :
- mesurer la quantité d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique du patient,
- comparer la quantité dudit au moins un produit d’expression déterminée pour ledit échantillon biologique ou une valeur dérivée de cette quantité, à une valeur de référence prédéterminée, et
- établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat de la comparaison.
Les différentes étapes du procédé ci-dessus sont mises en œuvre séquentiellement.
La mesure de la quantité d’au moins un produit d’expression du gène VEGLR2, est mise en œuvre comme décrit précédemment. Par commodité, on appellera échantillon biologique issu d’un patient pour lequel on souhaite évaluer le risque de complication, échantillon à tester.
Dans la deuxième étape du procédé, la quantité dudit au moins un produit d’expression ou une valeur dérivée de cette quantité va être comparée à une valeur de référence prédéterminée, afin d’évaluer le risque de complication.
La détermination d’une valeur de référence est largement connue de l’homme du métier. Elle consiste notamment à mettre en œuvre une méthode de dosage identique, ou pour le moins comparable, à celle mise en œuvre dans le procédé de l’invention, dans des échantillons biologiques des deux populations étudiées, et à déterminer la valeur du test (quantité) permettant de faire une discrimination entre ces deux populations, dans le cas présent entre celle qui va se compliquer et celle qui ne va pas se compliquer.
Une valeur dérivée de la quantité peut par exemple être la concentration absolue, calculée grâce à une courbe de calibration.
La valeur de référence prédéterminée, utilisée pour comparer la quantité mesurée dans le cadre de l’invention, sera déterminée à partir du ou des mêmes produits d’expression du gène VEGFR2 que ceux ou celui quantifïé(s) dans l’échantillon biologique à tester.
Les échantillons à partir desquels sont déterminées les valeurs de référence, encore nommés « échantillons de référence », peuvent être de différentes natures, et notamment de nature biologique tel que mentionné ci-dessus s’agissant de l’échantillon à tester (fluides biologiques). Avantageusement, ces échantillons biologiques de référence sont de même nature que celle de l’échantillon biologique à tester ou tout du moins d’une nature compatible pour constituer une référence quant à la quantification du ou des produits d’expression du gène VEGFR2 sélectionné(s). Par exemple, ce seront des échantillons biologiques correspondant au même fluide biologique que celui de l’échantillon à tester, comme des échantillons de sang total, de sérum ou de plasma. Le ou les échantillons de référence utilisés sont, de préférence, issus de personnes ayant les mêmes caractéristiques ou une majorité de caractéristiques communes, notamment du même sexe et/ou d’un âge similaire ou identique et/ou de même origine ethnique, avec celles du sujet ou patient suspecté d’avoir une infection sans sepsis chez qui on souhaite évaluer le risque de complication.
En revanche, le ou les échantillons de référence utilisés seront issus de patients suspectés d’une infection et ayant un score SOFA inférieur à deux au moment du prélèvement d’échantillon biologique. Leur évolution vers une complication ou non aura néanmoins été documentée a posteriori pour savoir s’ils appartiennent à la population qui s’est compliquée ou à celle qui ne s’est pas compliquée.
Pour la détermination de la valeur de référence et la quantification dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans l’échantillon à tester, on utilisera de préférence des échantillons prélevés au même moment, c’est-à-dire dès la caractérisation du patient comme étant suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, ou au plus tard 24h après.
On sait que, de façon générale, les résultats des tests de mesure d’analytes dépendent en grande partie des caractéristiques du ou des partenaires de liaison utilisés. Ainsi, dans le cas de la quantification de protéines ou polypeptides à l’aide d’un partenaire de liaison, tels que les anticorps, les résultats dépendent en particulier des caractéristiques des partenaires utilisés, tels que la nature, le degré d’affinité avec l’analyte ou la taille, des caractéristiques des compositions, etc..., et que ces caractéristiques influent sur les valeurs mesurées. On conçoit donc qu'il n'est pas possible de donner des valeurs de référence précises et que la ou les valeurs de référence adaptées à test utilisé peuvent être déterminées dans chaque cas par de simples expériences de routine. Il en va de même avec la détection moléculaire.
La détermination de la valeur de référence selon l’invention se fait sur un échantillonnage de patients significatif, c’est-à-dire sur un nombre d’échantillons minimal pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et donc représentatifs de la population étudiée.
L’homme du métier saura déterminer la valeur de référence avec laquelle la quantité dudit au moins un produit d’expression déterminée pour ledit échantillon biologique ou la valeur dérivée de cette quantité utilisée pour la comparaison doit être comparée, en fonction de la comparaison à effectuer. Il faut bien comprendre que l’on appelle ici valeur de référence soit une valeur discrète, soit un intervalle de valeurs correspondant à une zone d’indétermination. Bien évidemment, lorsque la valeur mesurée est incluse dans l’intervalle d'indétermination, ou est très proche de la valeur de référence dans le cas d'une valeur discrète, on ne peut pas conclure définitivement et il convient de conduire des investigations supplémentaires.
La détermination de la valeur de référence, ou valeur du test (quantité), permettant de faire une discrimination entre ces deux populations peut être calculée grâce à la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic Curve). Cette courbe est un graphe obtenu en portant en abscisse la fraction de faux positifs, c’est-à-dire la Spécificité comme définie ci-après, et en ordonnée la fraction de vrais positifs, c’est-à-dire la Sensibilité comme définie ci-après, pour différentes valeurs de seuil fixées. Elle représente tous les couples Sensibilité/Spécificité lorsque le seuil de décision varie sur l’étendue des valeurs observées du test. Une façon globale de quantifier l’efficacité diagnostique d’un test est d’exprimer sa performance par l’aire sous la courbe ROC. Par convention, cette aire est toujours > 0,5. Les valeurs de l’aire sous la courbe ROC varient entre 0,5 (pas de différence de distribution des valeurs de dosage entre les deux sous-groupes ; la courbe ROC correspond à la bissectrice) et 1 (parfaite séparation des valeurs de dosage des deux sous-groupes ; la courbe ROC passe par le point (0, 1)). L’aire sous la courbe ROC est une expression quantitative de la position de la courbe ROC par rapport au point (0, 1) (Hanley, J.A. and McNeil, B. J, 1982 ; Zweig, M. H. and Campbell G., 1993).
La sensibilité représente le pourcentage de Vrais Positifs parmi la totalité des Positifs, reconnus comme tels. Elle exprime l'aptitude du test à détecter les échantillons biologiques réellement positifs, qui correspondent à la pathologie. Dans un langage « probabiliste », elle correspond à la probabilité d’observer un résultat Positif sachant l’échantillon Positif.
La spécificité représente le pourcentage de Vrais Négatifs parmi la totalité des Négatifs, reconnus comme tels. Elle exprime l'aptitude du test à ne pas diagnostiquer positifs des échantillons réellement négatifs, qui correspondent à un individu sain. Dans un langage « probabiliste », elle correspond à la probabilité d’observer un résultat Négatif sachant l’échantillon Négatif.
Selon le procédé de l’invention, lorsque la valeur de la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 est inférieure à la valeur de référence, alors le patient suspecté d’avoir une infection testé est un patient à risque accru de complication. Au contraire, lorsque la valeur de la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 est supérieure à ladite valeur de référence, cela signifie que le patient suspecté d’avoir une infection testé n’est pas un patient à risque accru de complication. Un patient à risque accru est tel que défini précédemment.
La détermination du risque de complication peut également être mise en œuvre en mesurant la quantité d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans un échantillon biologique à tester à deux temps différents.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé peut comprendre ou consister en la mise en œuvre des étapes consistant à :
- mesurer une première quantité d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique patient issu d’un premier prélèvement au temps Tl,
- mesurer une deuxième quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique patient issu d’un second prélèvement au temps T2,
- calculer la variation entre la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 à T2 et la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 à Tl, donnant une valeur D, - comparer la valeur D obtenue à la précédente étape, à une valeur de référence déterminée à partir de deux populations de patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, l’une s’étant compliquée et l’autre pas.
- établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat de la comparaison.
De préférence, le premier prélèvement au temps Tl aura lieu dans les 12 heures qui suivent l’identification du patient comme étant suspecté d’avoir une infection sans sepsis et le deuxième prélèvement au temps T2 aura lieu dans les 24 heures (T24) qui suivent le premier prélèvement à l’instant Tl.
Après détermination de la deuxième quantité, ce mode de réalisation particulier de l’invention comprend une étape de calcul de la variation entre la quantité du produit d’expression du gène VEGFR2 à T2 et celle à Tl, donnant une valeur D.
Le calcul de la valeur D peut être effectué par tout calcul connu de l’homme du métier permettant de mettre en évidence une différence entre une quantité à Tl et une quantité à T2.
A titre d’exemples, on peut citer les trois façons suivantes de calculer la valeur D :
- selon la formule suivante (I) :
(VEGFR2 à Tl) - (VEGFR2 à T2) (I).
Dans ce cas, la valeur D a la même grandeur que la quantité (VEGFR2 à Tl) ou (VEGFR2 à T2) déterminée.
- la valeur D peut correspondre au taux de variation relative et est calculée selon l’une des formules suivantes (II) ou (II)’ :
VEGFR2 à T1-VEGFR2 à T2 TT. VEGFR2 à T1-VEGFR2 à T2 „ _ _ TT. ,
- VEGFR2 à ; - Tl (II) OU - VEGFR2 à ; - Tl X 100 (II)’
Dans ce cas, la valeur D est soit un taux (II) soit un pourcentage (II)’.
- la valeur D peut correspondre à la différence de quantité par unité de temps et est calculée selon la formule suivante (III) :
VEGFR2 à T2-VEGFR2 à Tl
T2-T1 (III)
Dans ce cas, la valeur D a comme grandeur une unité de quantité par unité de temps.
Le procédé comprend une étape de comparaison de la valeur D, obtenue à la précédente étape, à une valeur de référence déterminée à partir de deux populations de patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, l’une s’étant compliquée et l’autre pas.
La détermination de la valeur de référence se fait comme indiqué précédemment. Dans ce cadre, elle nécessite également deux temps de prélèvement des échantillons de référence.
Le procédé selon ce mode de réalisation permet de conclure sur le niveau de risque de complication chez le patient duquel est issu l’échantillon biologique, une valeur D inférieure à ladite valeur de référence signifiant que le patient testé est un patient à risque accru de complication, et une valeur D supérieure à ladite valeur de référence signifiant que le patient testé n’est pas un patient à risque accru de complication. Un patient à risque accru est tel que défini précédemment.
Le procédé de l’invention peut être amélioré en mesurant également le niveau d’expression d’au moins un produit d’expression d’au moins un autre gène, en outre de la mesure du niveau d’expression d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2. Ainsi, la combinaison d’au moins deux marqueurs permet d’améliorer la spécificité et la sensibilité du procédé d’évaluation du risque de complication.
Ainsi, un mode de réalisation de l’invention comprend ou consiste également à la mesure du niveau d’expression d’au moins un produit d’expression du gène uPAR.
Toutes les indications et préférences mentionnées ci-dessus s’agissant de la quantification du ou des produits d’expression du gène VEGFR2 sélectionné(s) s’appliquent indifféremment au gène uPAR, que ce soit pour la quantification dans un échantillon à tester ou dans un échantillon de référence.
Tout comme pour VEGFR2, le ou les produits d’expression de uPAR (SEQ ID N°6) au sens de l’invention, peut ou peuvent être toute molécule biologique issue de l’expression de l’un de ce gène. A titre d’exemple nous pouvons citer un transcrit ARN, une protéine ou un polypeptide.
Le gène uPAR (urokinase-type plasminogen activator), également appelé PLAUR (il sera uniquement nommé uPAR par la suite), code pour le récepteur de l'activateur du plasminogène urokinase et, compte tenu de son rôle dans la localisation et la promotion de la formation de plasmine, influence probablement de nombreux processus chez le patient sain et malade liés à l’activation du plasminogène de surface cellulaire et à la dégradation localisée de la matrice extracellulaire. Il se lie à la fois à la pro-protéine et aux formes matures de l’activateur du plasminogène urokinase et permet l’activation de la pro-enzyme liée au récepteur par la plasmine. Plusieurs variants de transcription résultent de l'épissage alternatif de ce gène (NCBI Reference Sequence Database, Juillet 2008).
La base Ensembl (GRCh38.pl0) a recensé 16 transcrits issus de la transcription du gène uPAR. Ces transcrits sont identifiés dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 4
Trois isoformes de ce récepteur sont recensées, l’isoforme 1 (SEQ ID N°l l), N°UniProt Q03405-1, également appelé uPARl ou encore GPI-ancré, qui est la forme membranaire, et les isoformes 2 (SEQ ID N°l2), N°UniProt Q03405-2, et 3 (SEQ ID N°l3), N°UniProt Q03405-3, qui sont les formes plasmatiques, ou solubles, sécrétées du récepteur. Les formes solubles de uPAR se nomment suPAR. Tout comme pour le gène VEGFR2, dans le cadre de la présente invention, ledit au moins un transcrit du gène uPAR qui est mesuré, est choisi parmi les transcrits mentionnés dans le tableau 2 et leurs variants, la séquence d’un variant présentant au moins 99% d’identité avec Tune des séquences desdits transcrits. Le pourcentage d’identité est déterminé grâce à un logiciel d’alignement de séquences, tel que CLUSTALW. Un variant correspondra, en particulier, à un polymorphisme de la séquence du gène choisi.
De manière identique, dans le cadre de la présente invention, toutes les isoformes, issues du gène uPAR, référencées ci-dessus, ou non encore identifiées, peuvent être utilisées en tant que marqueur pour évaluer le risque de complication, chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux.
Les partenaires de liaison aux iso formes de ce marqueur sont de mêmes natures que ceux décrits pour VEGFR2.
De tels anticorps pour les iso formes de uPAR sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l’anticorps polyclonal suivant : Human uPAR Biotinylated Antibody ref : BAF807 biotechne®, et les anticorps monoclonaux suivants : Human uPAR Antibody ref : MAB807 biotechne®.
De manière identique, pour le ou les marqueurs cités en combinaison avec VEGFR2, lorsqu’il y a plusieurs produits d’expression mesurés, ils peuvent être de même nature mais également de différentes natures. Autrement dit, ils peuvent être de nature moléculaire (transcrit ARN, ARNm) et/ou de nature protéique (protéine, polypeptide).
Selon un mode de réalisation, lorsque le marqueur uPAR est utilisé, le procédé de la présente invention comprend ou consiste en la mise en œuvre des étapes consistant à :
- mesurer la quantité d’au moins un produit d’expression de VEGFR2 dans ledit échantillon biologique du patient,
- mesurer la quantité d’au moins un produit d’expression de uPAR dans ledit échantillon biologique du patient,
- comparer la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 déterminée pour ledit échantillon biologique ou une valeur dérivée de cette quantité, à une valeur de référence SVEGFR2 prédéterminée ; et
- comparer la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR déterminée pour ledit échantillon biologique ou une valeur dérivée de cette quantité, à une valeur de référence SUPAR prédéterminée, - établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat des comparaisons.
Les différentes étapes de mesures de quantité peuvent être mises en œuvre séquentiellement ou simultanément. De même, les différentes étapes de comparaisons aux valeurs de référence peuvent être mises en œuvre séquentiellement ou simultanément.
Les étapes de détermination des quantités des produits d’expression de ces marqueurs et détermination de la valeur de référence pour chaque marqueur sont mises en œuvre comme décrit précédemment.
De même, les étapes de comparaisons aux valeurs de référence sont mises en œuvre comme décrit précédemment.
Le procédé dans le cadre de ce mode de réalisation, permet de conclure à un risque accru de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, lorsque la valeur de la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 est inférieure à la valeur de référence SVEGFR2 et la valeur de la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR est supérieure à la valeur de référence SUPAR. Ce même procédé permet de conclure que le patient testé, suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, n’est pas un patient à risque accru de complication lorsque la valeur de la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 est supérieure à la valeur de référence SVEGFR2 et la valeur de la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR est inférieure à la valeur de référence SUPAR.
Comme indiqué précédemment, la détermination du risque de complication peut également être mise en œuvre en mesurant la quantité des produits d’expression des différents marqueurs dans un échantillon biologique à tester à deux temps différents. Aussi, un autre mode de réalisation est un procédé qui comprend ou consiste en la mise en œuvre des étapes consistant à :
- mesurer une première quantité d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique patient issu d’un premier prélèvement au temps Tl,
- mesurer une deuxième quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique patient issu d’un second prélèvement au temps T2, - mesurer une première quantité d’au moins un produit d’expression du gène uPAR dans ledit échantillon biologique patient issu d’un premier prélèvement au temps Tl,
- mesurer une deuxième quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR dans ledit échantillon biologique patient issu d’un second prélèvement au temps T2,
- calculer la variation entre la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 à T2 et la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 à Tl, donnant une valeur AVEGFR2,
- calculer la variation entre la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR à T2 et la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR à Tl, donnant une valeur AUPAR,
- comparer la valeur AVEGFR2 à une valeur de référence déterminée AS\TGI R2 à partir de deux populations de patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, l’une s’étant compliquée et l’autre pas,
- comparer la valeur AUPAR à une valeur de référence déterminée ASUPAR à partir de deux populations de patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, l’une s’étant compliquée et l’autre pas,
- établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat des comparaisons.
Toutes les étapes de mesures de quantité, de calculs de variations et comparaisons avec des valeurs de référence sont mises en œuvre comme décrit précédemment.
Tes différentes étapes de mesures de quantité, les différentes étapes de calculs de variations et les différentes étapes de comparaisons avec des valeurs de référence par rapport aux différents marqueurs peuvent être mises en œuvre séquentiellement ou simultanément, dans la mesure où bien entendu la chronologie mesure à Tl, mesure à T2, comparaison à une valeur de référence et établissement d’une conclusion est respectée pour chaque marqueur. Par exemple la mesure de la quantité uPAR peut être réalisée à partir d’un premier prélèvement effectué au moment l’identification du patient comme étant suspecté d’avoir une infection et la mesure des quantités de VEGFR2 à partir d’un partir d’un premier prélèvement effectué 6 heures après l’identification du patient comme étant suspecté d’avoir une infection. Comme précédemment, les premiers prélèvements au temps Tl peuvent avoir lieu dans les 12 heures qui suivent T identification du patient comme étant suspecté d’avoir une infection et les deuxièmes prélèvements au temps T2 peuvent avoir lieu dans les 24 heures (T24) qui suivent les premiers prélèvements à l’instant Tl.
Les temps de prélèvement, Tl et T2, pour le marqueur uPAR peuvent être identiques à ceux de VEGFR2 mais peuvent également être différents.
Le procédé dans le cadre de ce mode de réalisation, permet de conclure à un risque accru de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, lorsque la valeur AVEGFR2 est inférieure à ladite valeur de référence ASVEGFR2 et lorsque la valeur AUPAR est supérieure à la valeur de référence ASUPAR. Ce même procédé permet de conclure que le patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux n’est pas un patient à risque accru de complication, lorsque la valeur AVEGFR2 est supérieure à ladite valeur de référence ASVEGFR2 et lorsque la valeur de référence ASUPAR est inférieure à la valeur de référence ASUPAR.
Fa détermination du risque de complication peut également être mise en œuvre en utilisant le calcul d’un score lié aux différents marqueurs utilisés. Aussi , le procédé selon ce mode de réalisation particulier comprend ou consiste en la mise en œuvre des étapes consistant à:
- mesurer la quantité d’au moins un produit d’expression VEGFR2 dans ledit échantillon biologique du patient,
- mesurer la quantité d’au moins un produit d’expression uPAR dans ledit échantillon biologique du patient,
- calculer un score d’une combinaison à partir des quantités déterminées aux étapes précédentes,
- comparer le score de la combinaison à un score de référence prédéterminée, et
- établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat de la comparaison.
Fes étapes de mesures des quantités des produit d’expression de ces marqueurs sont mises en œuvre comme décrit précédemment et peuvent être mises œuvres séquentiellement ou simultanément. Le score selon peut-être une combinaison type multiplication, ratio ou seuil avec pondération différente de au moins deux marqueurs.
Les différents marqueurs quantifiés peuvent également être combinés au moyen de divers algorithmes mathématiques bien connus de l'homme du métier.
Le score de référence, ou valeur seuil, peut être une multiplication des valeurs de références déterminées pour chacun des marqueurs, une division de ces valeurs de références lorsque la combinaison est un ratio ou encore une équation de type y=ax+by intégrant des pondérations différentes pour chaque marqueur.
Le procédé selon ce mode de réalisation particulier permet de conclure à un risque accru de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, lorsque le score de la combinaison est supérieur au score de référence et permet de conclure que le patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux n’est pas un patient à risque accru de complication, lorsque le score de la combinaison est inférieur au score de référence.
Selon un autre mode de réalisation préférentiel du procédé ci-dessus, les étapes de calcul et comparaison du score peuvent être remplacées par l’établissement d’un arbre décisionnel.
L’arbre de décision selon le procédé de l’invention est un outil d’aide à la décision représentant un ensemble de choix sous la forme graphique d’un arbre. Les différentes décisions possibles sont situées aux extrémités des branches (les « feuilles » de l’arbre), et sont atteints en fonction de décisions prises à chaque étape.
L’homme du métier saura aisément construire ce type d’arbre décisionnel. Voici à titre d’exemple la construction d’un arbre décisionnel :
Si :
- concentration en transcrit KDR-201 (VEGFR2) < X picoM, et
- concentration en transcrit PLAUR-203 (uPar) > Y picoM.
Alors le patient est considéré comme étant à risque de complication.
L'invention concerne en outre un procédé de traitement de patients basés sur l’évaluation du risque fournie par les méthodes décrites ci-dessus. Ainsi l’invention a également pour objet, un procédé de traitement d’un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, caractérisé en ce qu’il comprend ou consiste, en outre, en des étapes consistant à :
- identifier les patients présentent un risque de complication en mettant en œuvre un procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux selon l’invention et,
- adapter la gestion des soins de santé dudit patient identifié à l'étape précédente pour réduire le risque de complication.
Un patient identifié comme étant à risque accru de complication peut avoir une gestion des soins de santé adaptée dans le but de réduire le risque de complication et, par exemple, afin de réduire le risque de développer un sepsis, un choc septique ou encore le risque de mort.
A titre d’exemples de gestion des soins, on peut citer un traitement immunostimulant ou encore un traitement antibiotique prophylactique, les deux traitements pouvant être associés et/ou orienter vers un service de soins continus ou de réanimation afin de réduire le risque de complication, par exemple réduire le risque de développer un sepsis, un choc septique ou même le risque de mort dans les jours qui suivent la mesure du niveau d’expression du ou des marqueurs.
Des exemples de traitements immunostimulants appropriés pour prévenir le risque de complication sont , sans limitation, le traitement par GM-CSF, IL7, IFNy ou encore anti-PDl.
Des exemples de traitements antibiotiques prophylactiques appropriés pour prévenir la pneumonie sont décrits en particulier dans les Annales Françaises dAnesthésie et de Réanimation (30 ; 2011 ; 168-190).
Inversement, un patient ne présentant pas de risque de complication pourra être orienté rapidement vers un service d’hospitalisation de jour, par exemple un service d’infectiologie, plutôt que de rester dans un service avec un monitoring rapproché dont il n’aura pas besoin.
Pour la mise en œuvre des procédés de l’invention, lorsqu’on utilise comme marqueurs au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et au moins un produit d’expression du gène uPAR, l’invention a pour autre objet un kit pour prédire le risque de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, comprenant au moins un partenaire de liaison spécifique d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et au moins un partenaire de liaison spécifique d’au moins un produit d’expression du gène uPAR.
En particulier, l’invention concerne les kits pour la mesure du niveau d’expression, in vitro ou ex vivo, d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et au moins un produit d’expression du gène uPAR, dans un échantillon biologique, comprenant :
- des outils ou réactifs spécifiques permettant de mesurer les quantités dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR, dans ledit échantillon biologique, et
- un contrôle calibré pour contenir les quantités dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 qui correspondent à des quantités connues dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et
- un contrôle calibré pour contenir les quantités dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR qui correspondent à des quantités connues dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR.
Un contrôle contient une quantité connue en un ou plusieurs produits d’expression du ou des marqueurs cités dans la présente demande. De préférence, le contrôle contient une quantité connue en un ou plusieurs produits d’expression d’un seul des marqueurs cités dans la présente demande.
Ce contrôle peut être soit un échantillon synthétique contenant une quantité calibrée en produit(s) d’expression du ou des gènes d’intérêt, ou un échantillon biologique dont on connaît la ou les quantités en produit(s) d’expression du ou des gènes d’intérêt.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit partenaire de liaison spécifique d’un produit d’expression du kit selon l’invention est au moins une sonde d' hybridation et/ou au moins une amorce d’amplification, ou au moins un anticorps, ou au moins un fragment d’anticorps, ou au moins une protéine d’affinité, ou au moins un aptamère.
L’invention couvre également l’utilisation d’un kit selon l’invention pour réaliser le procédé de l’invention, et en particulier pour prédire le risque de complication, chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux.
Tous les modes de réalisation qui sont mentionnés ci-dessus concernant les procédés, objets de la présente invention, toutes les caractéristiques et leurs combinaisons s’appliquent au kit selon l’invention et à son utilisation. Selon un mode de réalisation particulier, ledit partenaire de liaison spécifique d’un produit d’expression du kit selon l’invention est au moins une sonde d' hybridation et/ou au moins une amorce d’amplification, ou au moins un anticorps, ou au moins un fragment d’anticorps, ou au moins une protéine d’affinité, ou au moins un aptamère.
L’invention sera mieux comprise à l’aide des exemples suivants qui sont donnés à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu’à l’aide des figures 1 à 4, dans lesquelles :
la Figure 1 représente des boîtes à moustaches (ou diagrammes en boîte) qui correspondent à des représentations graphiques des niveaux d’expression des protéines sVEGFR2 et suPAR dans un prélèvement effectué dès l’admission aux urgences (T0) en fonction de la survenue ou non de complications chez des patients : A. Niveaux d’expressions de sVEGFR2 à T0; B. Niveaux d’expressions de suPAR à T0 ; la Figure 2 représente des boîtes à moustaches (ou diagrammes en boîte) qui correspondent à des représentations graphiques des niveaux d’expression des protéines sVEGFR2 et suPAR dans un prélèvement effectué six heures après le premier prélèvement (T6) en fonction de la survenue ou non de complications chez des patients : A. Niveaux d’expressions de sVEGFR2 à T6 ; B. Niveaux d’expressions de suPAR à T6 ;
La Figure 3 représente des boîtes à moustaches (ou diagrammes en boîte) qui correspondent des représentations graphiques de la variation du niveau d’expression du marqueur sVEGFR2 entre le premier prélèvement sanguin dès l’admission aux urgences (T0) et le second prélèvement sanguin six heures après le premier prélèvement (T6) en fonction de la survenue ou non de complications chez des patients. la Figure 4 représente la courbe ROC apparente de l’association entre la combinaison sVEGFR2 et suPAR à T0 (premier prélèvement sanguin dès l’admission aux urgences) et la probabilité de complication des patients pendant les 72h suivant le premier prélèvement T0.
EXEMPLES
Exemple 1 : Obtention et préparation des échantillons sanguins Cette étude observationnelle rétrospective a été conduite chez des patients de 19 à 101 ans (111 hommes, 122 femmes, âge médian: 53 ans) fraîchement admis dans le service des urgences de 14 centres hospitaliers français et belges entre 2015 et 2017 pour la prise en charge d’une infection suspectée. Ces patients sont tous hospitalisés pour une suspicion d’infection. Les critères d’inclusion étaient les suivants :
- patients âgés de 18 ans ou plus ;
- patients présentant un seul site d’infection aiguë suspectée ou confirmée par le clinicien sur des manifestations cliniques ou paracliniques ;
- patients admis aux urgences présentant au moins deux critères parmi les suivants:
o température supérieure à 38°C ou inférieure à 36°C ;
o rythme cardiaque supérieur à 90 battements par minute ;
o rythme respiratoire supérieur à 20 respirations par minute ou PaC02< 32 mmHg ;
o nombre de leucocytes supérieur à l2000/mm3 ou inférieur à 4000/mm3.
- patients ayant un score SOFA inférieur à 2 ;
- patients présentant des symptômes depuis moins de 72h à leur arrivée aux urgences ;
- personnes affiliées à un régime de sécurité sociale ou bénéficiaire d’un tel régime ; et
- patients consentant à sa participation à l’étude.
Les critères cliniques d’exclusion étaient les suivants :
- patients arrivés dans un service d’urgences depuis plus de 12 heures ;
- patients présentant un choc septique à son arrivée aux urgences (défaillance d’organe et hypotension persistante malgré un remplissage vasculaire adéquat (jusqu’à 20ml/kg sur lh) et/ou la nécessité d’utilisation de catécho lamines) ;
- patients présentant une défaillance aiguë d’organes à l’arrivée aux urgences d’origine autre que septique ;
- patients hospitalisé dans la semaine précédant l’inclusion ; - patients immunodéprimés (HIV, Transplantés, patients sous chimiothérapie, patients recevant un traitement >20 mg/jour de Prednisolone ou équivalent) ;
- patients avec une pathologie connue parmi les pathologies non- infectieuses potentiellement associée à un SIRS ;
- patients avec un sepsis diagnostiqué dans les 30 jours avant la date d’inclusion ;
- patients ayant été déjà inclus dans l’étude ;
- personnes refusant de signer le formulaire de consentement écrit ;
- personnes majeures faisant l’objet d’une protection légale ;
- femmes enceintes, parturientes ou qui allaites ;
- personnes faisant l’objet d’une mesure de sauvegarde de justice.
- personne privée de libertés par une décision judiciaire ou administrative et personne hospitalisée sans consentement en vertu des articles L.3212-1 et 3213- 1 qui ne relèvent pas de l’article L.l 122-8 du Code de la Santé Publique.
233 patients ont été inclus dans l’étude. Tous ces patients remplissaient les critères suivants :
- le premier prélèvement sanguin a été réalisé au maximum dans les 12 premières heures suivant l’arrivée du patient dans le service d’urgence (T0) ;
- le second prélèvement sanguin a été réalisé entre 4 et 8 heures(T6±2h) suivant le premier prélèvement sanguin (T0) ;
- l’évaluation de la complication a été observée par un comité d’adjudication dans les 72 heures (T72) suivant le premier prélèvement sanguin (T0) ; et
- la mortalité est évaluée à 28 jours suivant l’arrivée du patient dans le service d’urgence.
La complication a été déterminée par un comité d’adjudication composé de 3 médecins indépendants à l’étude. Ce comité détermine la complication en fonction de plusieurs critères ; notamment, l’apparition de nouvelles défaillances d’organes (augmentation du score de SOFA), le décès ou encore la nécessité d’entrée en réanimation. Parmi les 233 patients de cette cohorte, 36 patients (21%) vont se compliquer dans les 72h suivant leur admission (« COMPLICATION ») et 185 patients (79%) ne vont pas se compliquer (« NON COMPLICATION»)
Exemple 2 : Dosage de la forme soluble du récepteur du VEGF (sVEGFR2)
Les plasmas humains ont été collectés à T0 et T6 à partir de patients décrit ci-dessus dans l’exemple 1.
La protéine sVEGFR2 a été dosée à l'aide des anticorps commercialisés par Biotechne® (Ac monoclonal anti Human VEGFR2 (KDR) ref : MAB3573, et Human VEGF R2/KDR/Flk-l Antibody Antigen Affinity-purifîed Polyclonal Goat IgG ref : AF357) et d'un test ELISA utilisant l'automate Vidas® (bioMérieux). Pour ce faire, le test ELISA a été construit en utilisant les réactifs de la cartouche du kit Vidas® B.R.A.H.M.S. PCT™ (bioMérieux, Cat. No.30450) sans utiliser les anticorps et les calibrateurs contrôles.
Le VIDAS® est un automate multiparamétrique d’immunoanalyses. Il s’agit d’un système fermé pour tests unitaires, offrant une grande flexibilité. Cet automate se caractérise par sa robustesse, sa flexibilité, sa facilité d’utilisation et est destiné aux laboratoires de petite et moyenne taille. Il permet de réaliser des tests de routine, de confirmation et des tests à forte valeur médicale.
La détection se fait par la technique ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) dans le sérum ou le plasma. Le principe de dosage ELFA correspond à la combinaison de réactions immunoenzymatiques à une détection en point final en fluorescence. L’enzyme utilisée est la phosphatase alcaline qui catalyse la réaction d’hydrolyse du substrat, le 4-méthyl-ombelliferyl phosphate en un produit ; le 4-méthyl-ombellierone. Le produit émet à une longueur d’onde de 450 nm après excitation à 370 nm. Les résultats sont analysés automatiquement par le VIDAS® et exprimés en intensité de fluorescence relative ou RFV (pour « Relative Fluorescent Value »). Cette valeur de RFV est déterminée en soustrayant la valeur du bruit de fond (BKG) à la valeur brute obtenue.
Les réactifs ont été utilisés tels que décrits dans la notice, avec les modifications suivantes :
1. Les cônes ont été sensibilisés avec l'anticorps monoclonal MAB3573 à une concentration de 2.5 pg/ml. (coating indirect avec un premier Ac anti-souris à l0pg/ml puis Ac anti-sVEGFR2 à 2.5 m g/ml) ; 2. Le contenu du quatrième puits de la cartouche du kit Vidas® B.R.A.H.M.S. PCT™ a été remplacé par 400 mΐ d'anticorps de révélation (ref. : AF357), couplé à la biotine, dilué à 1 pg/ml ;
3. Les échantillons de plasmas (200m1) ont été utilisés directement purs ;
4. La réaction ELISA a été réalisée à l'aide de l'automate Vidas® et du protocole du kit Vidas® B.R.A.H.M.S. PCT™;
5. Les résultats ont été obtenus sous forme de valeurs brutes après soustraction du bruit de fond (lecture du substrat avant réaction). Une courbe étalon a été établie en dosant une gamme de concentrations du marqueur sous forme de protéine recombinante (Recombinant Human VEGF R2/KDR/Flk-l Fc Chimera. Biotechne® ref : 357-KD-050). La courbe étalon a été tracée en reportant en abscisse la concentration du marqueur et en ordonnée le signal lu par Vidas® (RFV ou Relative Fluorescence Value). La concentration de marqueur présente dans le sérum a été calculée en reportant la concentration correspondant au signal RFV lu par Vidas®.
Exemple 3 : Dosage de la forme soluble du récepteur de uPA (suPAR) par ELISA
Du sérum humain a été collecté à T0 et T6 à partir de patients décrits dans l’exemple
1.
Les taux sanguins de suPAR ont été mesurés à l’aide de sérums congelés (échantillons conservés à -80°C). Les échantillons ont été analysés en utilisant le kit ELISA commercial suPARnostic® AUTO Flex marqué CE/IVD, selon les instructions du fabricant (Virogates, Birkeroed, Danemark). Le test suPARnostic® ELISA est basé sur un test ELISA sandwich double anticorps monoclonal simplifié, dans lequel les échantillons de sérums et les anti- suPAR conjugués à la peroxydase sont d’abord mélangés puis incubés dans des micro-puits pré-enrobés anti-suPAR. Les standards suPAR recombinants du kit sont calibrés et permettent de calculer une courbe étalon. Les concentrations de suPAR sont déterminées en ng / ml de plasma. Le test a été validé pour mesurer les niveaux de suPAR entre 0,6 et 22 ng / ml.
Exemple 5 : Analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées grâce au logiciel R version 3.4.0 . Les différences observées ont été considérées comme significatives pour des valeurs de p, ou p- value, inférieures à 0.05. Association entre le niveau d’expression des marqueurs sVEGFR2 et suPAR et la survenue ou non de complication
La capacité prédictive de la mesure du niveau d’expression des marqueurs a été étudiée au regard de la survenue ou non de complications chez les patients dans les 72 heures qui suivent le premier prélèvement sanguin à T0. Le test de Wilcoxon-Mann-Whitney a été utilisé pour caractériser cette association.
Les niveaux d’expression de VEGFR2 et suPAR à T0 et T6 ont été mesurés, comme décrit ci-dessus dans les échantillons sanguins de 233 patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux. Fes résultats sont présentés dans le tableau 5 et sur les Figures 1 et 2.
Tableau 5
Fes résultats présentés aux Figures 1 et 2 donne, en ordonnées, le niveau d’expression de sVEGFR2 (en pg/mF) et suPAR (en ng/rnL) à T0 et T6, en fonction de la survenue ou non de complications chez des patients.
Ces résultats montrent une association significative (p<0.05) entre le niveau d’expression des marqueurs sVEGFR2 et suPAR à T0 et à T6 et la complication dans les 72 heures qui suivent le premier prélèvement sanguin à T0. Fa protéine sVEGFR2 montre de meilleurs performances à T0 et T6 que suPAR.
Fe niveau d’expression des marqueurs étudiés permet donc de discriminer les patients qui vont se compliquer dans les 72 heures qui suivent le premier prélèvement sanguin à T0 de ceux qui ne vont pas compliquer.
Plus précisément, les patients chez qui des complications vont survenir, présentent des niveaux d’expression de SVEGFR2 plus faibles que les patients qui ne vont souffrir d’aucune complication. Concernant suPAR les patients chez qui des complications vont survenir, présentent des niveaux d’expression plus élevés que les patients qui ne vont souffrir d’aucune complication. Association entre la variation du niveau d’expression de sVEGFR2 et la survenue ou non de complication
Au-delà de l’association entre le niveau d’expression de sVEGFR2 et la survenue de complication, l’association entre la différence de niveau d’expression de sVEGFR2 mesurée dans deux prélèvements successifs, réalisés entre 4 et 8 heures d’intervalle, et la survenue de complication dans les 72 heures qui suivent le premier prélèvement de a été observée.
Le niveau d’expression de sVEGFR2 à T0 et T6 a été mesuré, comme décrit ci-dessus dans les échantillons de plasmas de 233 patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux. Pour chaque patient la variation a été calculée selon la formule suivante :
. SVEGFR2 à TO-sVEGFR2 à T6
A = -
SVEGFR2 à T 0
Les résultats sont présentés à la Figure 3 donnant, en ordonnées, le résultat de variation entre T0 et T6 (A selon la formule ci-dessus), en fonction de la survenue ou non de complications chez des patients, patients dont le suivi clinique a montré qu’ils ont ensuite vu leur état se détériorer (« COMPLICATION ») et patients dont le suivi clinique a montré qu’ils ne vont pas se détériorer (« NON COMPLICATION »).
Ces résultats montrent que la variation entre T0 et T6 du niveau d’expression de sVEGFR2 est différentiellement associée (p-value=0,0l) à la complication des patients dans les 72 heures qui suivent le premier prélèvement.
Plus précisément, les patients qui ont vu leur état se détériorer présentent une variation du niveau d’expression de sVEGFR2 entre T0 et T6 plus élevée que les patients qui ne vont souffrir d’aucune complication.
Association entre le niveau d’expression de sVEGFR2 et suPAR et la probabilité de complication
L’association des variables sVEGFR2 et suPAR avec le statut du patient (dans le cas présent «COMPLICATION ») a été testée au moyen d’une régression logistique. La force de l’association a été estimée avec le calcul des Odd Ratios (ORs), qui est le ratio de la probabilité que le patient ait au moins une complication sur la probabilité que le patient n’ait pas de complication.
Pour chaque variable quantitative : niveau d’expression de sVEGFR2 et suPAR, l’Odd Ratio est interprété de la façon suivante :
OR = 1 : pas d’association OR < 1 : une augmentation du ler au 3ème quartile est associée à une diminution du risque de complication
OR > 1 : une augmentation du ler au 3ème quartile est associée à une augmentation du risque de complication L’IQR est l’écart inter quartile. L’IQR est une mesure de dispersion qui s'obtient en faisant la différence entre le troisième et le premier quartile.
L’IQR.OR a été mesuré pour les échantillons sanguins de 233 patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux.
Le modèle de régression logistique a également été réalisé pour analyser les performances du ratio des niveaux d’expression de sVEGFR2 et suPAR. L’objectif étant de montrer que le ratio des marqueurs est signifîcativement associé avec le risque de complication dans les 72 heures qui suivent le premier prélèvement.
Les résultats sont donnés dans le tableau 6 ci-après.
Tableau 6
La valeur de l’IQR.OR pour le marqueur sVEGFR2 sur la population étudiée est de 0.36 avec une p-value égale à 0.0001. Ainsi, les patients avec un niveau d’expression de sVEGFR2 faible (lème quartile) ont une probabilité de complication signifîcativement plus élevée (2.76 fois) que les patients avec un niveau d’expression élevé (3ème quartile).
La valeur de l’IQR.OR pour le marqueur suPAR sur la population étudiée est de 1,49 avec une p-value égale à 0.02. Ainsi, les patients avec un niveau d’expression de suPAR élevé (3ème quartile) ont une probabilité de complication signifîcativement plus élevée (1,49 fois) que les patients avec un niveau d’expression faible(ler quartile).
La valeur de l’IQR.OR pour le ratio entre sVEGFR2 et suPAR est de 1,74 avec une p- value égale à 0.0005. Ainsi, les patients avec un ratio d’expression entre sVEGFR2 et suPAR élevé (3ème quartile) ont une probabilité de complication signifîcativement plus élevée (1.74 fois) que les patients avec un ratio d’expression bas (ler quartile).
Analyse de la performance prédictive sVEGFR2 et suPAR seuls et en combinaison Afin d’analyser la performance prédictive (sensibilité/spécificité) des marqueurs sVEGFR2 et suPAR seuls et en combinaison à T0, les aires sous la courbe (AUC : Area Under Curve) ont été calculées ainsi que la spécificité maximum, la valeur négative prédictive (NPV) maximum et la valeur positive prédictive maximum ont été évaluées pour une sensibilité minimum imposée à 0,90. Fes résultats sont est représentée dans le tableau 5 et la Figure 4.
Tableau 5
Les marqueurs montrent de très bonnes performances globales à T0. Néanmoins sVEGFR2 montre de meilleurs performances globales à T0 (AUC=0.70). De plus les résultats montrent que la combinaison des marqueurs sVEGFR2 et suPAR permettent d’augmenter les performances globales du test pronostic (cf. Figure 4).
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, comprenant la mesure du niveau d’expression, dans un échantillon biologique issu dudit patient, d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit d’expression du gène est un transcrit ARN.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit d’expression est une protéine ou un polypeptide.
4. Procédé selon Tune quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’il comprend la mise en œuvre des étapes consistant à :
mesurer la quantité d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique du patient,
comparer la quantité dudit au moins un produit d’expression déterminée pour ledit échantillon biologique ou une valeur dérivée de cette quantité, à une valeur de référence prédéterminée, et
établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat de la comparaison.
5. Procédé selon Tune quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’il comprend la mise en œuvre des étapes consistant à :
mesurer une première quantité d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique patient issu d’un premier prélèvement au temps Tl,
mesurer une deuxième quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique patient issu d’un second prélèvement au temps T2, calculer la variation entre la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 à T2 et la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 à Tl, donnant une valeur D,
comparer la valeur D obtenue à la précédente étape, à une valeur de référence déterminée à partir de deux populations de patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, l’une s’étant compliquée et l’autre pas,
établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat de la comparaison.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant également la mesure du niveau d’expression d’au moins un produit d’expression du gène uPAR.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend la mise en œuvre des étapes consistant à :
mesurer la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique du patient,
mesurer la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR dans ledit échantillon biologique du patient,
comparer la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 déterminée pour ledit échantillon biologique ou une valeur dérivée de cette quantité, à une valeur de référence SVEGFR2 prédéterminée ; et
comparer la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR déterminée pour ledit échantillon biologique ou une valeur dérivée de cette quantité, à une valeur de référence SUPAR prédéterminée ;
établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat des comparaisons.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend la mise en œuvre des étapes consistant à : mesurer une première quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique patient issu d’un premier prélèvement au temps Tl,
mesurer une deuxième quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique patient issu d’un second prélèvement au temps T2,
mesurer une première quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR dans ledit échantillon biologique patient issu d’un premier prélèvement au temps Tl,
mesurer une deuxième quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR dans ledit échantillon biologique patient issu d’un second prélèvement au temps T2,
calculer la variation entre la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 à T2 et la quantité d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 à Tl, donnant une valeur AVEGFR2,
calculer la variation entre la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR à T2 et la quantité d’au moins un produit d’expression du gène uPAR à Tl, donnant une valeur AUPAR,
comparer la valeur AVEGFR2 à une valeur de référence déterminée ASVEGFR2 à partir de deux populations de patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, l’une s’étant compliquée et l’autre pas, comparer la valeur AUPAR à une valeur de référence déterminée ASUPAR à partir de deux populations de patients suspectés d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, l’une s’étant compliquée et l’autre pas,
établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat des comparaisons.
9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend la mise en œuvre des étapes consistant à :
mesurer la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 dans ledit échantillon biologique du patient, mesurer la quantité dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR dans ledit échantillon biologique du patient,
calculer un score d’une combinaison à partir des quantités déterminées aux étapes précédentes,
comparer le score de la combinaison à un score de référence prédéterminé, et établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat de la comparaison.
10. Procédé de traitement d’un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes consistant à :
identifier les patients présentent un risque de complication en mettant en œuvre un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 et,
adapter la gestion des soins de santé dudit patient identifié à l'étape précédente pour réduire le risque de complication.
11. Kit pour la mesure in vitro ou ex vivo du niveau d’expression d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et d’au moins un produit d’expression du gène uPAR chez un patient suspecté d’avoir une infection ayant un score SOFA inférieur à deux, comprenant au moins un partenaire de liaison spécifique dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et au moins un partenaire de liaison spécifique dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR.
12. Kit pour la mesure in vitro ou ex vivo du niveau d’expression d’au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et d’au moins un produit d’expression du gène uPAR, dans un échantillon biologique, comprenant :
des outils ou réactifs spécifiques permettant de mesurer les quantités dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR dans ledit échantillon biologique, et
un échantillon contrôle qui est un échantillon calibré pour contenir les quantités dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR qui correspondent à des quantités connues dudit au moins un produit d’expression du gène VEGFR2 et dudit au moins un produit d’expression du gène uPAR.
13. Kit selon la revendication 11 ou 12, dans lequel le partenaire de liaison spécifique d’un produit d’expression est (i) au moins une sonde d' hybridation et/ou au moins une amorce d’amplification, ou (ii) au moins un anticorps, ou au moins un fragment d’anticorps, ou au moins une protéine d’affinité, ou au moins un aptamère.
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