EP3728644A1 - Méthode de diagnostic d'une vaginose bactérienne par détection de methanobrevibacter smithii - Google Patents

Méthode de diagnostic d'une vaginose bactérienne par détection de methanobrevibacter smithii

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Publication number
EP3728644A1
EP3728644A1 EP18782480.0A EP18782480A EP3728644A1 EP 3728644 A1 EP3728644 A1 EP 3728644A1 EP 18782480 A EP18782480 A EP 18782480A EP 3728644 A1 EP3728644 A1 EP 3728644A1
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EP
European Patent Office
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dna
seq
sequence
methanobrevibacter smithii
specific
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18782480.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Raoult
Michel Drancourt
Florence Fenollar
Ghiles GRINE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Fondation Mediterranee Infection
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Fondation Mediterranee Infection
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aix Marseille Universite, Fondation Mediterranee Infection filed Critical Aix Marseille Universite
Publication of EP3728644A1 publication Critical patent/EP3728644A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR

Definitions

  • the present invention relates to a rapid microscopic microscopic diagnosis of bacterial vaginosis (hereinafter abbreviated as "BV"), that is to say by detection of a single microorganism and, where appropriate, non-quantitatively. More particularly, the present invention relates to a method for diagnosing the state of the vaginal bacterial flora with regard to the presence of a bacterial vaginosis (BV), where appropriate for monitoring the state of the vaginal bacterial flora and of its therapeutic management.
  • BV bacterial vaginosis
  • BV which is a frequent infection with adverse consequences for pregnancy and the fetus
  • BV has been defined from a microbiological point of view by a quasi-disappearance of the normal vaginal flora mainly composed of other bacteria, including Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. and genital mycoplasmas [Spiegel CA, CMR
  • BV is a frequent reason for medical consultation, it is particularly involved in susceptibility to sexually transmitted infections such as HIV, and for pregnancy in the premature birth and birth of children of low weight. Its prevalence in women, including during pregnancy, is between 8 and 23% [Guise JM, AJPM 2001] according to current methods of investigation.
  • the Nugent score identifies VB through a semi-quantitative morphological analysis of bacteria after Gram staining. It is therefore a subjective technique whose reproducibility has been called into question [Sha BE, CWY 2005; Schwebke JR, OG 1996].
  • the clinical criteria of Amsel vaginal pH greater than 4.5, homogenous homogeneous greyish leucorrhoea, nitrogenous odor after addition of 10% KOH, presence of clue-cells represent the second diagnostic approach [Amsel R AJM 1983]. Like Nugent's score, it is of delicate determination and not used in routine clinical practice.
  • Atopobium vaginae is the main new bacterial species characterized.
  • vaginalis being detected only in 49% and 71%, respectively, of patients with BV.
  • 16 patients (28%) with a relapse of BV after treatment had a G. vaginalis concentration below the given threshold (Table 3).
  • Forty patients (70%) with relapse of BV also had a concentration below the A. vaginae threshold.
  • PCR techniques were not sensitive enough because the molecular targets amplified too long fragments (430 bp ribosomal RNA fragment for A. vaginae and 291 base pairs for G. vaginae). vaginalis). With such a long targeted sequence, sensitivity in a PCR reaction is low.
  • the presence of a bacterial vaginosis or the failure of the current therapeutic treatment is determined if the DNA fragment concentrations of the two specific sequences of the bacteria Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis respectively in a sample Vaginal secretions of a patient containing at least 10 4 human cells / ml, are such that at least one of the following conditions a) and b) is complied with: a) the concentration Ca is a DNA fragment thereof; Atopobium vaginae is greater than or equal to 10 8 copies / ml, and b) the Cg concentration in said Gardnerella vaginalis DNA fragment is greater than or equal to 10 9 copies / ml.
  • a concentration of Atopobium vaginae bacterium greater than or equal to the threshold of 10 8 can detect about 90% of vaginoses.
  • the quantification of the bacterium Gardnerella vaginalis is complementary in the case where the concentration of Atopobium vaginae is below the threshold of 10 8 bacteria / ml, to detect vaginosis, because the detection threshold of G. vaginalis greater than or equal to 10 9 bacteria / mL alone would detect only about half of the vaginoses. Therefore, according to this method, it is necessary to quantify the DNA concentrations for both bacteria.
  • the development of bacterial vaginosis is confirmed if the Ca, Cg and Cl concentrations of at least three fragments of specific sequences present in a single copy in the DNA of A. vaginae bacteria (Ca ), G. vaginalis (Cg) and Lactobacillus sp. (Cl) in the DNA extracted from a sample of female vaginal secretions are such that the ratio of the concentrations CI / (Ca + Cg) decreases between the two samples taken successively in time at sufficient time interval, preferably at less than 1 month.
  • Ca, Cg and Cl concentrations of at least three fragments of specific sequences present in a single copy in the DNA of A. vaginae bacteria (Ca ), G. vaginalis (Cg) and Lactobacillus sp. (Cl) in the DNA extracted from a sample of female vaginal secretions are such that the ratio of the concentrations CI / (Ca + Cg) decreases between the two samples taken successively in time at sufficient time interval,
  • development of vaginosis is understood to mean an aggravation of an already detected vaginosis or, in certain cases, a risk of vaginosis, that is to say an imbalance or an abnormality of the vaginal flora may become pathological.
  • the concentration of bacteria of the genus Lactobacillus sp. comes in addition or confirmation in case the conditions of concentrations of A. vaginae and G. vaginalis are combined.
  • a bacterial vaginosis is determined if said concentrations are such that the following 3 conditions are met: a- concentration of Ca in said DNA fragment of specific sequence Atopobium vaginae greater than or equal to 10 8 copies / ml, b- concentration Cg in said fragment of DNA sequence specific Gardnereiia vaginalis greater than or equal to 10 9 copies / ml_, and c-concentration C1 in said DNA fragment sequence specific Lactobacillus sp. less than or equal to 10 7 copies / ml_.
  • Said Ca, Cg or Cl concentrations are determined by enzymatic amplification of PCR type in real time and quantification of the DNA of said DNA fragments of sequences specific for the bacteria Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis and, where appropriate, Lactobacillus sp, as well as, preferably, a human DNA fragment present in any human biological sample containing cells.
  • the purpose of the present invention is to simplify the implementation of laboratory diagnosis of BV by providing a single-plate test (ie by detection of a single microorganism) and if possible non-quantitative.
  • the inventors have expanded previous studies of the microbial flora of BV, to the study of archaea methanogens by molecular detection methods and detection by culture.
  • Methanobrevibacter smithii is associated with BV very specifically and significantly and any detection of this archaea makes diagnosis easy and reliable.
  • the present invention provides a method for in vitro diagnosis of the presence of bacterial vaginosis in a patient, characterized in that the following steps are carried out in which: a) an extraction of the total DNA contained in the vaginal secretion sampling sample by a method capable of extracting DNA from the archaea methanogens preferably comprising at least two stages of lysis of enzymatic and / or mechanical DNA, and b) determining the presence of bacterial vaginosis if the DNA extracted from said vaginal secretion sampling sample of said patient is detected, the presence of said specific sequence of human DNA and at least one nucleic acid sequence specific for said archaea methanogen Methanobrevibacter smithii, the concentrations of the DNA fragments of said specific sequence of human DNA and of said specific sequence of Methanobrevibact er smithii in said vaginal secretion sample being greater than or equal to 10 1 copies / ml each.
  • This threshold of 10 copies was determined by comparative tests with a dilution range as explained in Example 1 below.
  • the present invention therefore allows the diagnosis and in vitro monitoring of the state of the vaginal bacterial flora with regard to the presence of bacterial vaginosis, and where appropriate for monitoring its therapeutic treatment, by detecting the presence of the only methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii.
  • the presence of Methanobrevibacter smithii is determined by detecting the presence of at least one nucleic acid sequence specific for said methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii present in a single copy in said archaea Methanobrevibacter smithii contained in the DNA extracted from said sample. vaginal secretion collection of said patient, said specific sequence of Methanobrevibacter smithii having a size less than 150 nucleotides.
  • step b) the following steps are performed: b. l) carrying out the PCR-type enzymatic amplification of at least one of said specific sequence of said methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii in the DNA extracted from said vaginal secretion sample, and b.2) performing the detection of amplified fragments of said specific Methanobrevibacter smithii sequence, preferably by sequencing, by agarose gel electrophoresis or by means of labeled probes specific for said specific sequence of said Methanobrevibacter smithii methanogenic archaea, of sequences distinct from those of said amplification primers .
  • a method is carried out in which: a specific extraction protocol of the total DNA contained in the sample of vaginal origin is made.
  • This extraction protocol may be a simplified protocol including the extraction of Methanobrevibacter s / 77 / f / 7 DNA which archaea is of thick wall and difficult to extract the DNA or a standard protocol previously described. as set forth in Examples 1 to 3.
  • a method for extracting the total DNA contained in the sample of vaginal origin including the extraction of Methanobrevibacter smithii DNA in which the following steps are performed: 1) the said sample of vaginal secretions is mechanically lysed, preferably by sonication, in particular by an ultrasonic sonicator, for example a Branson 2510 sonicator (Branson, Rungis, France), power 4 (that is to say, with a power maximum), at 50% of the active cycle (i.e., for 30 seconds), and
  • enzymatic lysis of said sample is carried out, in particular by means of a DNA extractor such as the Qiagen EZ1 XL apparatus and the Qiagen EZ1® DNA Tissue kit.
  • a DNA extractor such as the Qiagen EZ1 XL apparatus and the Qiagen EZ1® DNA Tissue kit.
  • said specific sequence of said methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii has a size of 70 to 150 nucleotides, preferably 90 to 120 nucleotides.
  • real-time PCR amplification and quantification reactions are carried out, using specific hydrolysis probes respectively of each of said specific sequences of said bacteria and a specific sequence of a human gene present in any biological sample containing human cells, in the sample to be tested.
  • the real-time PCR technique consists of conventional PCR using forward and reverse sequence primers, and includes amplified product detection based on fluorescence emission measurement proportional to the amount of amplified genes with a so-called probe. "Hydrolysis”.
  • said probe is labeled with a fluorescence emitter or 5 'fluorophore and a 3' fluorescence emission blocking agent. This blocking agent absorbs the fluorescence emitted when the fluorophore and the blocking agent are close. When the fluorophore and the blocking agent are separated, the fluorescence emission is no longer absorbed by the blocking agent.
  • the Taq polymerase causes a hydrolysis of the probe and thus a release of the nucleotides and the fluorophore in solution.
  • the fluorescence emission will therefore be proportional to the number of amplifiers.
  • the principle of real-time PCR is based on the ability of Taq polymerase during the elongation step to hydrolyze a probe hybridized on the DNA to be copied, this hydrolysis allowing the emission of fluorescence, which allows quantification.
  • two different targets can be quantified by introducing into the reaction mixture two primers and one probe directed against a first target, and two other primers and probe directed against the other target. Both probes are labeled with different fluorophores.
  • Specific sequence of said archaea is understood to mean a sequence of the genome of said archaea that is not found in any other living organism genome.
  • DNA fragment is meant a DNA or oligonucleotide fragment whose sequences are written hereinafter in the 5 '3' direction.
  • amplification and quantification reactions of a specific sequence of human DNA are carried out in the sample to be tested, comprising a specific sequence of human albumin.
  • said specific sequence of said methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii comprises or is included in one of the following fragments:
  • said specific sequence of human DNA in the test sample comprises the fragment of the 16283- 16423 of exon 12 of the Genebank M 12523.1 reference human albumin gene.
  • step b) a PCR type enzymatic amplification reaction of the DNA of at least one said specific sequence of said methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii is carried out in the DNA extracted from said samples to be tested, using at least one a set of primers able to amplify said specific sequence of said methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii, and b.2) it is checked whether the possible amplifications of the DNA extracted from said samples to be tested, include a said specific sequence by means of a hydrolysis probe comprising a sequence specific to said specific sequence of Methanobrevibacter smithii and flanked by the sequences of said primers.
  • co-amplification and quantification reactions are carried out using two sets of primers and specific hydrolysis probes respectively on the one hand of said specific sequence of archaea Methanobrevibacter smithii, and on the other hand a specific sequence of human DNA in the test sample, preferably a specific sequence of human albumin, and said specific sequence of human DNA comprising a sequence of said probe surrounded by sequences able to serve as said primers in a PCR type amplification reaction of said specific sequence of human DNA.
  • the presence of a bacterial vaginosis is determined if, in the DNA extracted from a patient vaginal secretion sample, the following 2 a) and b) conditions are met: a) the fragmented Ca concentration DNA of human albumin is greater than or equal to 10 1 copies / ml, and b) the Cm concentration in said specific DNA fragment of Methanobrevibacter smithii is greater than or equal to 10 1 copies / ml.
  • said specific sequence of said methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii is chosen from the following sequences including probe sequences (underlined) flanked by primer sequences (in bold) or their reverse and complementary sequences for antisense primers:
  • SEQ.ID. # 2 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTCCCGTCAGAATCGTTCC
  • amplification and quantification reactions are carried out by using sets of primers and hydrolysis probes specific for said archaea Methanobrevibacter smithii, and where appropriate a specific sequence of human DNA in the region.
  • sample to be tested such as a specific sequence of human albumin
  • said specific sequence comprises a probe sequence flanked by sequences able to serve as a primer in a PCR type amplification reaction of said specific sequences.
  • Probe is understood here to mean an oligonucleotide, more preferably 20 to 30 nucleotides, which hybridises specifically with said specific sequence and thus makes it possible to detect and quantify it specifically by measuring the increase in bound fluorescence of the PCR reaction.
  • the probe makes it possible to detect the amplified specific DNA and to quantify it.
  • primer is meant herein an oligonucleotide of preferably 15 to 25 nucleotides which specifically hybridizes with one of the two ends of the sequence that the DNA polymerase will amplify in the PCR reaction. More particularly, said sequence of exon 12 of the human DNA specific human albumin gene in the test sample comprises the sequence of the following sequence listing or the complementary sequence:
  • SEQ.ID.No. L 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTAAGAGTATAT ATTAT G C AAAACCT GTC AT G CCCAC ACATATATAT CTCTCCCTG G CATTGTTGTCTTT GCAGATGTCAGTGAAAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT-3 '
  • SEQ.ID.No. 5 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3'
  • SEQ.ID. # 8 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3 '
  • SEQ.ID. # 9 5'-CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3 '
  • SEQ.ID. # 12 5'-GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3 '
  • SEQ.ID. # 14 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3 '
  • SEQ.ID. # 15 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3 '
  • the present invention also relates to a diagnostic kit useful for the implementation of a method for diagnosing a vaginosis according to the invention, characterized in that it comprises at least:
  • a diagnostic kit comprises:
  • Oligonucleotides of Seq. ID. No. 3, 8 and 10 are therefore implemented, in fact, in the form of equimolar mixtures of oligonucleotides of different sequences, said oligonucleotides of different sequences responding for each sequence SEQ. ID. Nos. 38 and 10 to the various possible definitions of sequences Nos. 38 and 10, respectively, namely:
  • FIGS. 1A to 1C represent the electrophoresis detections agarose gel PCR amplification products of Methanobrevibacter smithii 16S rRNA gene (FIGS. 1A and 1B) and methanobrevibacter smithii mcrA gene (FIG.
  • FIGS. 2A and 2B show the detections by agarose gel electrophoresis of the PCR products of the 16S ribosomal RNA gene of Methanobrevibacter smithii (FIG. 2A) and the Methanobrevibacter smithii mcrA gene (FIG. 2B) in vaginal samples, in the presence of negative controls, according to an extraction method. andard DNA according to the present invention of Example 2.
  • EXAMPLE 1 Rapid extraction of Methanobrevibacter smithii DNA for standard PCR amplification from vaginal swabs.
  • DNA extraction was made from a suspension of Methanobrevibacter smithii calibrated at 2 colony-forming units (CFUs) according to the protocol below.
  • CFUs colony-forming units
  • a first sonication step was performed for 30 minutes using the Branson 2510 ultrasound sonicator (Branson, Rungis, France) power 4, at 50% of the active cycle, followed by a second step of enzymatic lysis of the wall of Methanobrevibacter smithii and DNA purification using Qiagen DNA bacteria V 1.066069118 card contained in the Qiagen EZ1 XL and the Qiagen EZ1® DNA Tissue kit following the supplier's instructions (Qiagen, Les Ulis, France).
  • Qiagen DNA bacteria V 1.066069118 card contained in the Qiagen EZ1 XL and the Qiagen EZ1® DNA Tissue kit following the supplier's instructions (Qiagen, Les Ulis, France).
  • PCR Polymerase Chain Reactions
  • PTC-200 automatic thermal cycler MJ Research, Waltham, MA, USA
  • 50 ⁇ L of MIX (mixture) PCR comprising: 25 ⁇ L amplification reagent. gold "(Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France); 17 ⁇ l of RNAse free distilled water (Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France); sense primer (5 'primer) 20 ⁇ M 1.5 ⁇ L; Reverse Primer 20 ⁇ M 1.5 ⁇ L and 5 ⁇ L of extracted DNA.
  • the PCR program depends on the primers used.
  • the program For amplification of the 16S RNA archaea gene the program comprises: a 1st step of 95 ° C for 15 minutes; 3 steps of 40 cycles 95 ° C for 30 seconds, 57 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 1 minute; and a last step 72 ° C for 5 minutes.
  • the program For the mcrA archaea methanogen gene, the program comprises: a 1st step of 95 ° C for 15 minutes; 03 steps of 40 cycles 95 ° C for 1 minute, 57 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 1 minute; and a last step 72 ° C for 5 minutes.
  • PCR products are subsequently migrated on a 1.5% agarose gel (BIO-RAD, Marnes-la-Coquette, France) for 20 minutes at 135 volts.
  • sequencing of the amplifiats is performed as follows: Sequencing reactions are performed using the "BigDye Terminator vl.l" sequencing kit according to the manufacturer's instructions (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). All PCR products were sequenced in both directions, using the same primers as used for PCR, in a PTC-200 automatic thermal cycler (MJ Research, Waltham, MA, USA) with an initial denaturation step of 1 min.
  • sequenced products were purified using Millipore MultiScreen 96-well plates (Merck, Molsheim, France) containing 5% Sephadex G-50 (Sigma-Aldrich, L'Isle Abeau Chesnes, France). The sequences are then analyzed on an ABI PRISM 31309 genetic analyzer (Applied Biosystems, Foster City, USA).
  • Figure IA shows 1.5% agarose gel electrophoresis in which the standard PCR amplification products were migrated from five E1 to E5 positive samples for the presence of Methanobrevibacter smithii showing a band at the expected molecular weight. 700 base pairs, in the presence of negative control which remained negative.
  • the right column labeled "M. size" corresponds to the molecular weight marker.
  • Figures IB and IC show two gels of 1.5% agarose in which the amplification products of different concentrations of Methanobrevibacter smithii DNA were transferred by standard PCR
  • the amplifications obtained show a band with the expected molecular weight of 700 base pairs for the product of amplification of the ribosomal 16S RNA gene and a band with an expected molecular weight of 560 base pairs for the amplification product of the mcrk gene, in the presence of a negative control which remained negative, the right column labeled "M.
  • M. smithii has an extremely solid cell wall that is poorly lysed by routinely used DNA extraction protocols that explain the failure of molecular detection of M. smithii routine.
  • Alternative protocols for cell wall lysis of M. smithii should be implemented, such as one of the two protocols respectively presented in the following comparative tests.
  • Method 1 The automated protocol involves the extraction of the DNA using the extractor EZ1 Advanced XL with the Qiagen DNA V 1.066069118 card and following the indications of the EZ1® DNA tissue kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) described by the manufacturer.
  • Method 2 the manual DNA extraction protocol uses the kit "NucleoSpin Tissue Mini Kit” (Macherey-Nagel, Hoerdt, France) according to the following steps: 0.3 g of glass powder (B106 mm, Sigma, Saint - Quentin Fallavier, France) are added to 250 ⁇ l of sample followed by mechanical lysis in a FastPrep BIO 101 apparatus (Qbiogene, France) for 2 min at a rate of 6.5. Then, 200 ⁇ l of lysis buffer and 20 ⁇ l of proteinase K (20 mg / ml) are added to the samples which are subsequently incubated for 12 hours at 56 ° C. After 12 hours of incubation, another mechanical lysis occurs at a rate of 6.5 for 2 minutes.
  • kit "NucleoSpin Tissue Mini Kit” Macherey-Nagel, Hoerdt, France
  • Method 3 A first sonication step was performed for 30 minutes using the Branson 2510 ultrasound sonicator (Branson, Rungis, France) power 4, at 50% of the active cycle, followed by a second step using the automated protocol EZ1 DNA extractor with Qiagen DNA bacteria V 1.066069118 card and Qiagen EZ1® DNA kit (Qiagen, Courtaboeuf, France).
  • the 3 methods were compared according to the DNA concentrations present in the samples, measured using the ThermoSCIENTIFIC nanodrop 2000 assay and a quantitative PCR targeting 16S RNAr M. smithii.
  • Table 3 M. smithii qPCR results obtained with the 3 methods on the stool samples.
  • Method 3 combining mechanical sonication lysis followed by enzymatic lysis is the one that provides the best extraction yield, method 2 with two mechanical lysis methods is an intermediate method and method 1 with a single enzymatic lysis can not be validly used.
  • a second is placed in a specific transport medium (RI Urea-Arginine LYO 2, BioMérieux SA, Marcy l'Etoile, France) for the research of genital Mycoplasma (M. hominis and M. urealyticum).
  • a cytobrush is used for plating and staining of Gram.
  • One second for extraction of the DNA for molecular amplification is transported in 500 ⁇ l of MEM medium (Minimum Essential Medium, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). It is frozen at -80 ° C as soon as it arrives in the laboratory until it is used.
  • MEM medium Minimum Essential Medium, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
  • DNA extraction protocol uses the kit "NucleoSpin Tissue Mini Kit” (Macherey-Nagel, Hoerdt, France) modified in the following way: 0.3 g of glass powder (B106 mm, Sigma, St. Quentin Fa 11 a vie r, France) are added to 250 ⁇ l of sample followed by mechanical lysis in a FastPrep BIO 101 apparatus (Qbiogene, France, France) for 2 min at a rate of 6.5.
  • the inventors have selected targets on the methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii.
  • the retained targets are located on the sequence of the gene coding for 16S ribosomal RNA, the mcrA gene and the rpoB gene.
  • a sequence located in exon 12 of the human albumin gene is chosen to attest to the presence and amount of DNA in the test sample.
  • a sense and antisense primer pair are chosen on the previously defined target sequences using the Primer 3® program (http: //frodo.wi. Mit edu / primer3 / primer3_code. html).
  • the primers are described below. Each primer is analyzed on the N BCI website (http: // WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to ensure their specificity in si / ico.
  • SEQ.ID. # 5 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3 '
  • SEQ.ID. # 6 5'-CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3 '- For the mcrA gene:
  • SEQ.ID. # 8 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3 '
  • SEQ.ID. # 9 5'-CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3 '.
  • SEQ.ID. # 12 5'-GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3 '
  • SEQ.ID. # 15 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3 '
  • the DNA extracted from reference bacterial strains representative of the flora of the vaginal cavity according to the following list: Bacteroides nordii, Propionibacterium avidum, Clostridum irregular, Clostridum massiiioamazoniensis, Clostridum butyricum, Clostridum beijerinckii, Bacteroides thetaiotaomicron, Propionibacterium acnes, Finegoidia magna, Bacteroides fragiiis, Staphyiococcus au reus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coii, Klebsiella oxytoca, Streptococcus agaiactiae, Serratia marcescens, Enterococcus faecaiis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mitis, Sta
  • Figure 2A shows the revelation of 16S PCR products of ribosomal RNA archaea (vaginosis samples) by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • Pathways E.V1 to E.V11 vaginosis samples; T-: Negative control; and MT: size marker.
  • Figure 2B shows the revelation of PCR products targeting the methanogenic mcrA gene (vaginosis samples) by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • Pathways E. 1 to E.12 vaginosis samples; T-: Negative control; and MT: size marker.
  • EXAMPLE 4 Detection of Methanobrevibacter smithii in vaginal samples of patients by amplification and detection by PCR probe in real time.
  • the same collection of vaginal specimens tested in Example 3 was tested for the presence of Methanobrevibacter smithii by real-time PCR targeting the 16S RNA, A and RpoB genes.
  • the molecular detection of methanogenic archaea Methanobrevibacter smithii was carried out by real-time PCR after extraction of the DNA according to a protocol as described in Example 3 with the following primers and probes.
  • a mix of 20 ⁇ L was prepared with 10 ⁇ L of mix (Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France); distilled water (Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France), a 5 ⁇ M probe; sense primer (5 'primer) 20 ⁇ M 0.5 ⁇ L; an antisense primer (20 'primer) of 20 ⁇ M 0.5 ⁇ L, uracil dna glycosylase 0.5 ⁇ L and 5 ⁇ L of extracted DNA.
  • the PCR reactions are carried out in the Stratagene MX3000P apparatus (BIO-RAD, Marnes-la-Coquette, France) according to the following program: 50 ° C. at 2 minutes, 95 ° C. for 5 minutes, and 02 steps at 39 cycles ( 95 ° C during
  • the "CT” measures the number of cycles that provides a positive result, plus the CT is small plus the amount of amplified DNA is large.
  • the originality of the present invention is to be able to propose for the first time a simple tool for the diagnosis of BV based on the molecular detection of Methanobrevibacter smithii.
  • the specificity of the molecular detection described here leads to the understanding that the detection of one or more specific antigens of M. smithii by any appropriate method; as well as the detection of the presence of methane in the vaginal cavity or from a sampling of the vaginal cavity by any suitable method also constitute methods of diagnosis of bacterial vaginosis, could constitute a monopléxé and non-quantitative diagnostic test of the presence of M. smithii in a sample of the vaginal cavity within the scope of the present invention, in particular a method for detecting one or more antigens specific for M. smithii, in particular by immunodetection using specific antibodies or colorimetric method.
  • this diagnostic method of BV allows monitoring for assessment the therapeutic management of BV during pregnancy.
  • Ferris MJ Masztal A, KE Aldridge, Fortenberry JD, Fidel PL Jr, Martin DH. Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis. 2004 Feb 13; 4: 5.
  • Verhelst R Verstraelen H, Claeys G, Verschraegen G, Van Simaey L, De Ganck C, De Backer E, Temmerman M, Vaneechoutte M. Comparison between Gram stain and culture for the characterization of vaginal microflora: definition of a distinct grade that resembles grade I microflora and revised categorization of grade I microflora. BMC Microbiol. 2005 Oct 14; 5: 61. Vianna ME, Conrads G, Gomes BP, et al. T-RFLP-based mcrA methanogenic archaeal gene in association with oral infections and evidence of a novel Methanobrevibacter phylotype. Oral Microbiology and Immunology, 24 (5), pp. 417-422.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro au regard de la présence d'une vaginose bactérienne, caractérisée en ce que l'on détermine la présence d'une vaginose bactérienne si l'Archaea Methanobrevibacter smithii, est présente dans un échantillon de sécrétion vaginale de patiente en y détectant la présence d'au moins une séquence d'acide nucléique spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii.

Description

Méthode de diagnostic d'une vaginose bactérienne par détection de Methanobrevibacter smithii
La présente invention concerne un diagnostic microbiologique monopléxé rapide de la vaginose bactérienne (ci-après abrégé en « VB ») c'est à dire par détection d'un seul micro-organisme et le cas échéant de façon non quantitative. Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode de diagnostic de l'état de la flore bactérienne vaginale au regard de la présence d'une vaginose bactérienne (VB), le cas échéant pour le suivi de l'état de la flore bactérienne vaginale et de sa prise en charge thérapeutique. Pendant longtemps, la VB qui est une infection fréquente avec des conséquences néfastes pour la grossesse et le foetus, a été définie du point de vue microbiologique par une quasi- disparition de la flore vaginale normale composée principalement de I actoba ci I les au profit d'autres bactéries, notamment Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. et mycoplasmes génitaux [Spiegel CA, CMR
1991 ; Thorsen P, AJGO 1998] . La VB est un motif fréquent de consultation médicale, elle est notamment impliquée dans la susceptibilité aux infections sexuellement transmissibles comme le VIH, et pour les grossesses dans la prématurité et la naissance d'enfants de petit poids. Sa prévalence chez la femme, y compris durant la grossesse, se situe entre 8 et 23% [Guise JM, AJPM 2001] selon les méthodes actuelles d'investigation.
Actuellement, le diagnostic de la VB repose sur le score de Nugent et les critères d'Amsel . Le score de Nugent est la méthode la plus couramment rapportée dans la littérature, considérée par certains comme la technique de référence, même si elle n'est pas réalisée en routine dans les laboratoires de microbiologie clinique du fait du caractère fastidieux de sa mise en œuvre [Fredricks DN, N EJM 2005 ; Thomason JL, AJOG
1992 ; Ison CA, STD 2002 ; Nugent RP, JCM 1991]. Le score de Nugent identifie la VB grâce à une analyse morphologique semi-quantitative des bactéries après coloration de Gram. C'est donc une technique subjective dont la reproductibilité a été mise en cause [Sha BE, JCM 2005 ; Schwebke JR, OG 1996] . Les critères cliniques d'Amsel (pH vaginal supérieur à 4,5 ; leucorrhées grisâtres homogènes adhérentes; odeur azotée après adjonction de KOH à 10%; présence de clue-cells) représentent la seconde approche diagnostique [Amsel R AJM 1983]. Comme le score de Nugent, il est de détermination délicate et non utilisé en pratique clinique courante.
Une des limites de ces méthodes diagnostiques est l'absence d'identification de certains microorganismes impliqués dans la VB. D'une part, la détection microscopique des microorganismes par la coloration de Gram reposant sur la structure de leur paroi, les microorganismes sans paroi tels que des mycoplasmes ou de structure particulière de paroi tels que les archaea, ces derniers microorganismes ne peuvent pas être détectés par la coloration de Gram et donc leur présence n'est pas prise en compte par le score de Nugent. D'autre part, l'apport de la biologie moléculaire a permis d'identifier de nouvelles bactéries pouvant être impliquées dans la VB mais leur mise en évidence par les 2 méthodes diagnostiques existantes est impossible. Atopobium vaginae est la principale nouvelle espèce bactérienne caractérisée. Sa présence a été corrélée à la VB dans quelques articles sans toutefois qu'une appréciation quantitative fiable de sa place relative par rapport aux autres microorganismes ait été réalisée [Bradshaw CS, JID 2006, Rodriguez JM, IJSB 1999 ; Ferris MJ, BMCID 2004 ; Ferris MJ, JCM 2004 ; Verhelst R, BMCM 2004]
Dans l'article publié en 2006 par Bradshaw et col . [Bradshaw CS, JID 2006], il était notamment décrit une relation entre la détection des bactéries A. vaginae et G. vagina/is et la VB, mais ces résultats étaient insuffisants pour réaliser un diagnostic de VB et/ou un suivi de l'évolution d'une VB fiables. En effet, les données présentées dans ce travail permettaient le dépistage desdites bactéries et non pas leur réelle quantification. De plus, ce dépistage a montré une bonne sensibilité, A. vaginae et G. vaginaiis étant détectées respectivement chez 96% et 99% des patientes atteintes de VB. Cependant, sa spécificité est mauvaise car A. vaginae est détectée chez 12% des patientes présentant une flore normale et G. vaginalis chez 60%. Les auteurs ont alors tenté une approche dite « semi-quantitative » en classant les charges bactériennes comme faibles ou élevées par comparaison des CT (« Cycle Treshold ») médians de détection des microorganismes au sein de tous les échantillons analysés. Ainsi, les auteurs ont estimé une charge médiane de 4 x 105 copies pour G. vaginalis (médiane correspondant à 21 cycles) et 4 x 106 copies pour A. vaginae (médiane à 18 cycles). Les charges élevées de G. vaginalis (>4 x 105) et d'A. vaginae (>4 x 106) étaient significativement plus présentes chez les patientes présentant une VB par rapport aux patientes avec une flore normale. Cependant, ces valeurs présentaient encore une mauvaise sensibilité, A. vaginae et G. vaginalis étant seulement détectées respectivement chez 49% et 71% des patientes atteintes d'une VB. De plus, 16 patientes (28%) avec une rechute de VB après traitement présentaient une concentration en G. vaginalis en dessous du seuil donné (Table 3). Quarante patientes (70%) avec une rechute de VB présentaient aussi une concentration en dessous du seuil en A. vaginae.
L'approche « semi-quantitative » des auteurs n'est donc pas applicable en tant qu'outil diagnostique et de suivi immédiat des patients. En fait, les techniques utilisées pour obtenir ces résultats étaient insuffisantes sur plusieurs points. Tout d'abord, les techniques de PCR n'étaient pas suffisamment sensibles car les cibles moléculaires amplifiaient de trop longs fragments (fragment de l'ARN 16S ribosomique de 430 paires de base pour A. vaginae et de 291 paires de base pour G. vaginalis ). Avec une séquence ciblée aussi longue, la sensibilité lors d'une réaction de PCR est faible. En outre, les techniques de PCR en temps réel utilisaient pour la détection et quantification un marquage du produit d'amplification en SyberGreen, méthode beaucoup moins spécifique que celles qui utilisent des sondes d'hydrolyse marquées qui nécessitent une triple spécificité (deux amorces plus la sonde, pou r amplifier un fragment dont la taille n'excède pas 150 paires de bases).
Enfin, deux des inventeurs de la présente invention ont mis en place un test diagnostic de VB multiplexe basé sur la détection et la quantification moléculaires d'au moins les deux bactéries Atopobium vaginae et Gardnerella vaginalis dans les prélèvements vaginaux [Bretelle F, Clin Infect Dis. 2015;60 :860-7; Ménard JP,. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010; 29 : 1547-52; labor. Obstet Gynecol. 2010; 115 : 134-40; . Clin Infect Dis. 2008;47 : 33-43 et WO 2008/062136]
En conclusion, exceptée la méthode décrite dans ces dernières références et WO 2008/062136, les techniques actuelles de diagnostic de la VB, reposent sur des critères qui sont peu fiables.
Cependant, la mise en œuvre de ce test diagnostique multipléxé et quantitatif de WO 2008/062136 suppose un ensemble complexe d'opérations de préparation des réactifs puis de réalisation et d'interprétation.
Plus particulièrement, dans WO 2008/062136, on détermine la présence d'une vaginose bactérienne ou l'échec du traitement thérapeutique en cours si les concentrations de fragments d'ADN des deux séquences spécifiques des bactéries Atopobium vaginae et respectivement Gardnerella vaginalis dans un échantillon de prélèvement de sécrétions vaginales de patiente contenant au moins 104 cellules humaines/ml, sont telles que l'une au moins des 2 conditions a) et b) suivantes est respectée : a) la concentration Ca en dit fragment d'ADN û'Atopobium vaginae est supérieure ou égale à 108 copies/mL, et b) la concentration Cg en dit fragment d'ADN de Gardnerella vaginalis est supérieure ou égale à 109 copies/ml_.
Une concentration de bactérie Atopobium vaginae supérieure ou égale au seuil de 108 permet de détecter environ 90% des vaginoses. La quantification de la bactérie Gardnerella vaginalis vient en complément dans le cas où la concentration en Atopobium vaginae serait inférieure au seuil de 108 bactéries/ml, pour détecter une vaginose, car le seuil de détection de G. vaginalis supérieur ou égal à 109 bactéries/mL ne permettrait à lui seul de détecter qu'environ la moitié des vaginoses. C'est pourquoi, selon cette méthode, il est nécessaire de quantifier les concentrations d'ADN pour les deux bactéries.
D'autre part, on relève que le développement d'une vaginose bactérienne est confirmé si les concentrations Ca, Cg et Cl d'au moins trois fragments de séquences spécifiques présents en une seule copie dans l'ADN des bactéries A. vaginae (Ca), G. vaginalis (Cg) et respectivement Lactobacillus sp. (Cl) dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétions vaginales de patiente sont telles que le rapport des concentrations CI/(Ca+Cg) diminue entre les 2 échantillons prélevés successivement dans le temps à intervalle de temps suffisant, de préférence au moins 1 mois.
On entend ici par « développement d'une vaginose » une aggravation d'une vaginose déjà détectée ou, dans certains cas, un risque d'apparition d'une vaginose, c'est-à-dire d'un déséquilibre ou une anomalie de la flore vaginale risquant de devenir pathologique.
De même, l'échec du traitement en cours en fonction des concentrations des séquences spécifiques présentes en une seule copie dans l'ADN des bactéries est confirmé si le rapport des concentrations CI/(Ca + Cg) diminue ou n'augmente pas entre les 2 échantillons prélevés à intervalle de temps suffisant, de préférence au moins 1 mois.
Plus particulièrement, la concentration en bactéries du genre Lactobacillus sp. vient en complément ou confirmation dans le cas où les conditions de concentrations en A. vaginae et G. vaginalis sont réunies.
De préférence, on détermine une vaginose bactérienne si lesdites concentrations sont telles que les 3 conditions suivantes sont respectées : a- concentration Ca en dit fragment d'ADN de séquence spécifique û'Atopobium vaginae supérieure ou égale à 108 copies/mL, b- concentration Cg en en dit fragment d'ADN de séquence spécifique de Gardnereiia vaginalis supérieure ou égale à 109 copies/ml_, et c- concentration Cl en dit fragment d'ADN de séquence spécifique de Lactobacillus sp. inférieure ou égale à 107 copies/ml_.
Lesdites concentrations Ca, Cg ou Cl sont déterminées par amplification enzymatique de type PCR en temps réel et quantification de l'ADN desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques des bactéries respectivement Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis et le cas échéant Lactobacillus sp, ainsi que, de préférence, d'un fragment d'ADN humain présent dans tout prélèvement biologique humain contenant des cellules.
Le but de la présente invention est de simplifier la mise en œuvre du diagnostic de laboratoire de la VB en fournissant un test monopléxé (c'est à dire par détection d'un seul micro-organisme) et si possible non- quantitatif.
En continuant à investiguer les microorganismes associés spécifiquement à la VB, les inventeurs ont découvert de façon surprenante qu'une archaea méthanogène dénommée Methanobrevibacter smithii et elle-seule testée parmi toutes les autres archaea methanogènes présentes chez l'homme (explicitées à l'exemple 2), était détectée dans 100% des prélèvements vaginaux obtenus chez les patientes diagnostiquées par ailleurs avec une VB et dans 0% des prélèvements vaginaux obtenus chez des patientes sans VB selon la méthode de référence par quantification de Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis et le cas échéant Lactobacillus sp décrite dans WO 2008/062136. En effet, aucune autre archaea méthanogène n'a été détectée par les techniques reposant sur l'amplification et le séquençage du gène ribosomal 16S ARN, techniques qui permettent la détection de toute espèce d'archaea méthanogène.
Ce résultat était inattendu car même si la détection de cette archaea méthanogène avait été rapporté en 1990 dans deux prélèvements vaginaux collectés chez deux patientes présentant u ne VB, les prélèvements vaginaux collectés chez une autre patiente présentant une VB ne présentait pas toutefois d'archaea dans cette publication [Belay N, J Clin Microbiol. 1990;28:1666-8] . Ce travail était non seulement limité dans le nombre d'échantillons étudiés, mais était aussi limité dans la méthode d'identification laquelle était purement phénotypique par simple observation visuelle des colonies mise en œuvre et ne donnant pas 100% de positivité d'association à la VB en termes de spécificité, et ne permettait pas d'induire l'utilisation de la détection de M. smithii comme un test diagnostique de la VB. Les inventeurs ont démontré selon la présente invention la possibilité d'un diagnostic microbiologique fiable, rapide et simplifié de la VB, notamment simple à mettre en œuvre en routine dans les laboratoires d'analyse microbiologique clinique et dans les points-de-soins (« point-of- care ») [Drancourt M, in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 2016 Jul; 29(3) :429-47]
Pour ce faire, les inventeurs ont élargi les études précédentes de la flore microbienne de la VB, à l'étude des archaea méthanogènes par des méthodes de détection moléculaire et de détection par culture.
Dans l'état de l'art, les différentes archaea méthanogènes détectées chez l'homme l'ont été dans les microbiotes du tube digestif et de la cavité buccale. Parmi ces 15 espèces d'archaea méthanogènes, seules 7 ont été isolées et cultivées chez l'homme (tel qu'explicité au tableau A de l'exemple 2).
Cette étude rapportée dans les exemples ci-après, a montré de façon inattendue qu'une archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii pouvait être présente dans des prélèvements vaginaux et que seuls les prélèvements vaginaux de patientes présentant une VB étaient porteurs d'une archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, alors que l'archaea M. smithii n'était jamais détectée dans les prélèvements vaginaux de femmes indemnes de VB ; et que la détection de séquence spécifique de certains gènes présents en une seule copie tels que les gènes mcrA , rpoB et 16S ARN de Methanobrevibacter smithii pouvaient constituer un test diagnostic monopléxé et non-quantitatif de la présence de M. smithii dans un prélèvement de la cavité vaginale. Ainsi, selon la présente invention il a été démontré que la présence de
Methanobrevibacter smithii est associée à une VB de façon très spécifique et significativement et que toute détection de cette archaea rend le diagnostic facile et fiable.
Plus précisément la présente invention fournit une méthode de diagnostic in vitro de la présence d'une vaginose bactérienne chez une patiente, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes suivantes dans lesquelles : a) on réalise une extraction de l'ADN total contenu dans l'échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale par une méthode apte à l'extraction de l'ADN des archaea méthanogènes comprenant de préférence au moins deux étapes de lyse d'ADN enzymatique et/ou mécanique, et b) on détermine la présence d'une vaginose bactérienne si l'on détecte dans l'ADN extrait dudit échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale de la dite patiente, la présence de ladite séquence spécifique d'ADN humain et d'au moins une séquence d'acide nucléique spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, les concentrations des fragments d'ADN de ladite séquence spécifique d'ADN humain et de la dite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii dans ledit échantillon de prélèvement de sécrétions vaginales étant supérieures ou égales chacunes à 101 copies/ml_.
Ce seuil de 10 copies a été déterminé par des essais comparatifs avec une gamme de dilution comme explicité à l'exemple 1 ci-après.
La présente invention permet donc le diagnostic et suivi in vitro de l'état de la flore bactérienne vaginale au regard de la présence d'une vaginose bactérienne, et le cas échéant pour le suivi de son traitement thérapeutique, en détectant la présence de la seule archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii. En particulier, on détermine la présence de Methanobrevibacter smithii en détectant la présence d'au moins une séquence d'acide nucléique spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii présente en une seule copie dans la dite archaea Methanobrevibacter smithii contenue dans l'ADN extrait dudit échantillon de prélèvement de sécrétions vaginales de la dite patiente, ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii présentant une taille inférieure à 150 nucléotides.
Plus particulièrement, à l'étape b), on réalise les étapes suivantes : b. l) on effectue l'amplification enzymatique du type PCR d'au moins une dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii dans l'ADN extrait dudit échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale, et b.2) on effectue la détection de fragments amplifiés de ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii de préférence par séquençage, par électrophorèse sur gel d'agarose ou à l'aide de sondes marquées spécifiques de la dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii de séquences distinctes de celles des dites amorces d'amplification. Plus particulièrement, on réalise une méthode dans laquelle : on réalise un protocole spécifique d'extraction de l'ADN total contenu dans le prélèvement d'origine vaginale. Ce protocole d'extraction peut être un protocole simplifié incluant l'extraction de d'ADN de Methanobrevibacter s/77 /f/7// laquelle archaea est de paroi épaisse et difficile à en extraire l'ADN ou bien un protocole standard antérieurement décrit tel qu'exposé dans les exemples 1 à 3.
Plus particulièrement, on réalise une méthode d'extraction de l'ADN total contenu dans le prélèvement d'origine vaginale incluant l'extraction de d'ADN de Methanobrevibacter smithii dans laquelle on réalise les seules étapes suivantes : 1) on effectue une lyse mécanique du dit échantillon de sécrétions vaginales, de préférence par sonication, notamment par un sonicateur à ultrasons par exemple un sonicateur Branson 2510 (Branson, Rungis, France) puissance 4 (c'est-à-dire à puissance maximale), à 50 % du cycle actif (c'est-à-dire pendant 30 secondes), et
2) on effectue une lyse enzymatique du dit échantillon, notamment à l'aide d'un extracteur d'ADN tel que l'appareil Qiagen EZ1 XL et le kit Qiagen EZ1® DNA Tissue.
De préférence, ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii présente une taille de 70 à 150 nucléotides de préférence de 90 à 120 nucléotides.
De préférence encore, on réalise des réactions d'amplification et quantification par PCR en Temps Réel, en mettant en œuvre des sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement de chacune desdites séquences spécifiques de dites bactéries et séquence spécifiq ue d'un gène humain présent dans tout prélèvement biologique contenant des cellules humaines, dans l'échantillon à tester.
La technique de PCR en temps réel, consiste en une PCR classique en utilisant des amorces de séquence directe et inverse, et comprend une détection du produit amplifié basée sur la mesure d'émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de gènes amplifiés avec une sonde dite « d'hydrolyse ». Pour cela, ladite sonde est marquée par un émetteur de fluorescence ou fluorophore en 5' et un agent bloquant l'émission de fluorescence en 3'. Cet agent bloquant absorbe la fluorescence émise lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont proches. Lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont séparés, l'émission de fluorescence n'est plus absorbée par l'agent bloquant. Lors de son passage, la Taq polymérase entraîne une hydrolyse de la sonde et donc une libération des nucléotides et du fluorophore en solution. L'émission de fluorescence sera donc proportionnelle au nombre d'amplifiat. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser une sonde hybridée sur l'ADN à copier, cette hydrolyse permettant l'émission de fluorescence, laquelle permet une quantification. Au cours de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introduisant dans le mélange réactionnel deux amorces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux autres amorces et sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec des fluorophores différents.
On entend par "séquence spécifique de ladite archaea", une séquence du génome de ladite archaea qu'on ne retrouve dans aucun autre génome d'organisme vivant. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5' 3'.
Plus particulièrement, on réalise des réactions d'amplification et de quantification d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, comprenant une séquence spécifique de l'albumine humaine.
Plus particulièrement encore, ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii comprend ou est comprise dans un des fragments suivants :
- le fragment des positions 334632 à 334687 du gène ARN 16S ribosomal de référence GenBank NC_009515.1.
- le fragment des positions 1734995 à 1735069 du gène mcrA de la protéine methyl-coenzyme M reductase alpha subunit de 157 acides aminés et de 16,942 Da de référence GenBank AAW80308.1.
- le fragment des positions 876305 à 876370 du gène rpo de la protéine RNA polymerase subunit B de M. smithii de 186 acides aminés et de 20,836 Da de référence GenBank ABYV02000000.
Plus particulièrement, ladite séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend le fragment des positions 16283- 16423 de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M 12523.1.
Plus particulièrement, à l'étape b), on met en œuvre les étapes suivantes dans lesquelles : b. l) on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, et b.2) on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique à l'aide d'une sonde d'hydrolyse comprenant une séquence spécifique de ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii et encadrée par les séquences des dites amorces.
Plus particulièrement, on réalise des réactions de co-amplification et de quantification en mettant en œuvre deux jeux d'amorces et sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement d'une part de ladite séquence spécifique de l'archaea Methanobrevibacter smithii, et d'autre part d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, de préférence une séquence spécifique de l'albumine humaine, et ladite séquence spécifique de l'ADN humain comprenant une séquence de dite sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme dites amorces dans une réaction d'amplification du type PCR de ladite séquence spécifique de l'ADN humain.
Plus particulièrement encore, on détermine la présence d'u ne vaginose bactérienne si, dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétion vaginale de patiente, les 2 conditions a) et b) suivantes sont respectées : a) la concentration Ca en fragment d'ADN de l'albumine humaine est supérieure ou égale à 101 copies/ml, et b) la concentration Cm en dit fragment d'ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii est supérieure ou égale à 101 copies/mL.
Plus particulièrement, ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii est choisie parmi les séquences suivantes incluant des séquences sondes (soulignées) encadrées par des séquences amorces (en gras) ou leurs séquences reverses et complémentaires pour les amorces anti-sens:
- pour la séquence 16S ARNr:
SEQ.ID. n°2 = 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTCCCGTCAGAATCGTTCC
AGTCAGCTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3' (cette séquence SEQ.ID. n°2 a été décrite dans l'article de Dridi B, . PLoS One 4(9) :e7063) ;
- pour la séquence du gène mcrA\
SEQ.ID. n°3 =
5’- GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGGARGCACCKAACAMCATGGACACWGTCCG TAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3' (cette séquence SEQ.ID. n°3 a été décrite dans l'article de Vianna Oral Microbiology and Immunology, 24(5), pp. 417-422).
- pour la séquence rpoB :
SEQ.ID. n°4 =
5'- AAGGGATTTGCACCCAACACATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG
GACCACAGTTAGGACCCTCTGG-3' (cette séquence SEQ. ID. n°4 a été décrite dans l'article de Dridi B, PLoS One 4:e7063).
Dans l'écriture de ces séquences, la spécificité large de certaines enzymes ou encore la dégénérescence du code génétiq ue implique qu'on doit indiquer quelquefois dans les séquences des lettres correspondant à plusieurs bases azotées différentes pour le même nucléotide présent à une position. Dans le cas dans notre séquence mcrk : R correspond à une purine soit A soit G; K (kéto) correspond à G ou T ; M correspond à A ou C et W (weak) correspond à A ou T. Avantageusement encore, on réalise des réactions d'amplification et de quantification en mettant en œuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hydrolyse spécifiques de ladite archaea Methanobrevibacter smithii, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, telle que une séquence spécifique de l'albumine humaine, et ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme amorce dans une réaction d'amplification du type PCR desdites séquences spécifiques.
On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter et de la quantifier de façon spécifique grâce à la mesure de l'accroissement de la fluorescence liée de la réaction de PCR.
La sonde permet de détecter l'ADN spécifique amplifié et de le quantifier.
On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymérase amplifiera dans la réaction de PCR. Plus particulièrement, ladite séquence de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend la séquence du listage de séquence suivante ou la séquence complémentaire:
SEQ.ID.n°l = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTAAGAG T AAT ATT G C AAAACCT GTC AT G CCCAC AC AAAT CTCTCCCTG G CATTGTTGTCTTT GCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT-3'
Plus particulièrement encore, on met en œuvre les jeux d'amorces et de sondes choisis le cas échéant parmi les séquences suivantes du listage de séquence annexé à la présente description, ou respectivement leurs séquences complémentaires : - pour le gène 16S ARNr :
Amorce 5': SEQ.ID.n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3'
Amorce 3': SEQ.ID.n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3'
Sonde: SEQ.ID.n°7 = 5'- CCGT CAG AAT CGTT CCAGT CAG -3' - pour le gène mcrA :
Amorce 5': SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3'
Amorce 3': SEQ.ID. n°9 = 5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3'
Sonde: SEQ.ID. n°10 = 5'- ARGCACCKAACAMCATGGACACWGT-3'
- pour le gène rpoB : Amorce 5': SEQ.ID. n°ll = 5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3'
Amorce 3': SEQ.ID. n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'
Sonde: SEQ.ID. n°13 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG-3'
- pour l'albumine humaine :
Amorce 5': SEQ.ID. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'
Amorce 3': SEQ.ID. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3'
Sonde: SEQ.ID. n°16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3'
La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic d'une vaginose selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins :
- des réactifs permettant l'extraction de l'ADN total contenu dans un échantillon d'origine vaginale, ainsi que
- un jeu d'amorces spécifiques d'au moins une sequence d'ADN spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii et de préférence, au moins une sonde spécifique de la dite sequence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, et
- des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR. Plus particulièrement, une trousse de diagnostic selon l'invention comprend :
- au moins un jeu d'amorces et de sondes de séquences choisies parmi les 3 jeux de séquences SEQ.ID. n°5 à 7, SEQ. ID. n°8 à 10 et SEQ.ID. n°l 1 à l3, et
- au moins un jeu d'amorces et de sonde de séquences SEQ. ID. n°14 à 16.
Les séquences SEQ. ID. N°1 à 16 décrites ci-dessus sont spécifiées dans le listage de séquences annexé à la présente description.
A la position correspondant à un nucléotide K, M, R, W ou T dans les séquences SEQ. ID. N° 3, 8 et 10, on trouve, dans les séquences cibles complémentaires, des nucléotides variables comme défini ci-dessus.
Les oligonucléotides de séquences SEQ. ID. N°3, 8 et 10, sont donc mis en œuvre, en fait, sous forme de mélanges équimolaires d'oligonucléotides de séquences différentes, lesdits oligonucléotides de séquences différentes répondant pour chaque séquence SEQ. ID. N°3 8 et 10 aux diverses définitions possibles des séquences respectivement N°3 8 et 10, à savoir :
- un mélange équimolaire de 32 séquences différentes pour SEQ. ID. N°3 pour lesquelles M (présent deux fois) est A ou C à chaque fois, R est A ou G, K est G ou T et W est A ou T,
- un mélange équimolaire de 2 séquences différentes pour SEQ. ID. N°8 pour lesquelles M est A ou C,
- un mélange équimolaire de 16 séquences différentes pour SEQ. ID. N°10 pour lesquelles M est A ou C, R est A ou G, K est G ou T et W est A ou T.
Ces mélanges équimolaires d'oligonucléotides sont obtenus en mettant en œuvre, lors de la synthèse oligonucléotidique, des mélanges équimolaires des différents nucléotides concernés. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de l'exemple de réalisation en référence au listage de séquence et aux figures suivantes, dans lesquelles : - les figures IA à IC représentent les détections par électrophorèse sur gel d'agarose des produits d'amplification PCR du gène 16S ARNr de Methanobrevibacter smithii (figures IA et IB) et du gène mcrA de Methanobrevibacter smithii (figure IC) dans des échantillons vaginaux, en présence de témoins négatifs, selon un procédé d'extraction simplifié de l'ADN selon la présente invention de l'exemple 1, et les figures 2A et 2B, représentent les détections par électrophorèse sur gel d'agarose des produits de PCR du gène 16S ARN ribosomal de Methanobrevibacter smithii (figure 2A) et du gène mcrA de Methanobrevibacter smithii (figure 2B) dans des échantillons vaginaux, en présence de témoins négatifs, selon un procédé d'extraction standard de l'ADN selon la présente invention de l'exemple 2.
EXEMPLE 1. Extraction rapide de l'ADN de Methanobrevibacter smithii pour amplification PCR standard à partir de prélèvements vaginaux. Dans cet exemple, l'extraction d'ADN a été faite à partir d'une suspension de Methanobrevibacter smithii calibrée à 102 unités formant colonies (colony-forming-units,CFUs) suivant le protocole ci-dessous.
Une première étape de sonication a été faite pendant 30 minutes en utilisant le sonicateur à ultrason Branson 2510 (Branson, Rungis, France) puissance 4, à 50 % du cycle actif , suivi d'une deuxième étape de lyse enzymatique de la paroi de Methanobrevibacter smithii et de la purification d'ADN en utilisant la carte V 1.066069118 Qiagen DNA bacteria contenue dans l'appareil Qiagen EZ1 XL et le kit Qiagen EZ1® DNA Tissue en suivant les instructions du fournisseur (Qiagen, Les Ulis, France). Dans cet exemple, une portion du gène ribosomal 16S de Methanobrevibacter smithii a été amplifiée par PCR standard à partir de prélèvements vaginaux en utilisant une méthode simplifiée d'extraction de l'ADN total, telle qu'explicité dans cet exemple.
Les réactions en chaîne de Polymérase (PCR) ont été réalisées dans un thermocycleur automatique PTC-200 (MJ Research, Waltham, MA, USA) incluant 50 pL de MIX (mélange) de PCR comportant : 25 pL de réactif d'amplification « amplitaq gold » (Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France) ; 17 pL d'eau distillée RNAse free (Sigma Aldrich, Saint- Quentin-Fallavier, France) ; amorce sens ( amorce 5')20 pM 1,5 pL ; Amorce Reverse 20 pM 1,5 pL et 5 pL d'ADN extrait. Le programme PCR dépend des amorces utilisées. Pour l'amplification du gène 16S RNA archaea le programme comprend : une 1ère étape de 95° C pendant 15 minutes ; 3 étapes de 40 cycles 95°C pendant 30 secondes, 57°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 minute ; et une dernière étape 72 °C pendant 5 minutes. Pour le gène mcrA archaea méthanogènes, le programme comprend : une 1ère étape de 95° C pendant 15 minutes ; 03 étapes de 40 cycles 95°C pendant 1 minute, 57°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 minute ; et une dernière étape 72 °C PENDANT 5 minutes. Les produits de PCR sont par la suite migrés sur un gel d'agarose 1,5 % (BIO-RAD, Marnes-la-Coquette, France) pendant 20 minutes à 135 volt. Pour confirmer qu'il s'agit bien de Methanobrevibacter smithii, un séquençage des amplifiats est réalisé comme suit : les réactions de séquençage sont effectuées en utilisant le kit de séquençage « BigDye Terminator vl.l « selon les instructions du fabricant (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tous les produits PCR ont été séquencés dans les deux directions, en utilisant les mêmes amorces que celles utilisées pour les PCR, dans un thermocycleur automatique PTC-200 (MJ Research, Waltham, MA, USA) avec une étape initiale de dénaturation de 1 min à 96°C suivie de 25 cycles de 10 secondes à 96°C, 5 secondes à 50°C et de 3 minutes à 60°C. Les produits séquencés ont été purifiés à l'aide des plaques Millipore MultiScreen à 96 puits (Merck, Molsheim, France) contenant 5% de Sephadex G-50 (Sigma-Aldrich, L'isle d'Abeau Chesnes, France). Les séquences sont par la suite analysées sur un analyseur génétique ABI PRISM 31309 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Après que tous les produits de la PCR ont été séquencés à l'aide du logiciel ChromasPro rhttp://technelvsium .com.au/wp/chromaspro/') les différents fragments sont assemblés et comparés aux séquences disponibles dans la base de données GenBank en utilisant le programme BLAST en ligne du NCBI. Les résultats montrent que l'ADN ainsi extrait est de qualité suffisante pour permettre de détecter M. smithii par PCR.
La figure IA présente une électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% dans lequel on a fait migrer les produits d'amplification par PCR standard de cinq échantillons El à E5 positifs pour la présence de Methanobrevibacter smithii montrant une bande au poids moléculaire attendu de 700 paires de bases, en présence de témoin négatif qui est resté négatif. La colonne de droite notée « M. taille » correspond au marqueur de poids moléculaire. Ensuite, pour mesurer la sensibilité de ce nouveau protocole d'extraction d'ADN, les inventeurs ont testé ce protocole sur différentes concentrations de Methanobrevibacter smithii (de 101 à 106CFU/mL. Les figures IB et IC présentent deux gels d'agarose à 1,5% dans lesquels on a fait migrer les produits d'amplification de différentes concentrations de l'ADN de Methanobrevibacter smithii par PCR standard. Les amplifiais obtenus montrent une bande au poids moléculaire attendu de 700 paires de bases pour le produit d'amplification du gène ribosomal 16S ARN et une bande au poids moléculaire attendu de 560 paires de bases pour le produit d'amplification du gène mcrk, en présence de témoin négatif qui est resté négatif. La colonne de droite notée « M. taille » correspond au marqueur de poids moléculaire. Sur la Figure IB, on montre la révélation des produits de PCR ciblant le gène ribosomal 16S ARN de Methanobrevibacter smithii par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies n° 1 à 6 correspondent à 101 - 106 CFUs de Methanobrevibacter smithii ; T- : Témoin négatif ; et MT : marqueur de taille. Sur la Figure IC, on montre la révélation des produits de PCR ciblant le gène mcrk de Methanobrevibacter smithii par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies n° 1 à 6 correspondent à 101 - 106 CFUs de Methanobrevibacter smithii ; T- : Témoin négatif ; et MT : marqueur de taille.
Exemple 2 : essais comparatifs d'extraction d'ADN
M. smithii possède une paroi cellulaire extrêmement solide qui est médiocrement lysée par les protocoles d'extraction d'ADN utilisés en routine diagnostique expliquant l'échec de détection moléculaire de M . smithii en routine. Il convient de mettre en œuvre des protocoles alternatifs de lyse de la paroi cellulaire de M. smithii tels que l'un des deux protocoles respectivement présentés dans les essais comparatifs suivants.
Trois méthodes d'extraction d'ADNs de méthanogènes ont été testées sur 10 suspensions de Methanobrevibacter smithii à 103 UFC et sur 10 échantillons de selles humaines. Les 3 méthodes ont été réalisées comme suit :
Méthode 1 : Le protocole automatisé implique l'extraction de l'ADN à l'aide de l'extracteur EZ1 Advanced XL avec la carte Qiagen ADN V 1.066069118 et suivant les indications du kit de tissu ADN EZ1® (Qiagen, Courtaboeuf, France) décrit par le fabricant.
Méthode 2 : le protocole d'extraction d'ADN manuelle utilise le kit «NucleoSpin Tissue Mini Kit» (Macherey-Nagel, Hoerdt, France) suivant les étapes suivantes : 0,3 g de poudre de verre (B106 mm, Sigma, Saint- Quentin Fallavier, France) sont ajoutés à 250 pL d'échantillon suivi d'une lyse mécanique dans un appareil FastPrep BIO 101 (Qbiogene, Strasbourg, France) pendant 2 min à vitesse 6,5. Ensuite, 200 pL de tampon de lyse et 20 pL de protéinase K (20 mg/mL) sont ajoutés aux échantillons qui sont par la suite incubés pendant 12 heures à 56°C. Après 12 heures d'incubation, vient une autre lyse mécanique à vitesse 6,5 pendant 2 minutes. Le lysat récupéré est traité selon les recommandations du fabriquant. L'ADN est élué dans 100 pL de tampon d'élution puis stocké à - 20°C. Méthode 3 : Une première étape de sonication a été faite pendant 30 minutes en utilisant le sonicateur à ultrason Branson 2510 (Branson, Rungis, France) puissance 4, à 50 % du cycle actif, suivi d'une deuxième étape en utilisant le protocole automatisé : extracteur ADN EZ1 avec la carte V 1.066069118 Qiagen DNA bacteria et le kit Qiagen EZ1® DNA (Qiagen, Courtaboeuf, France).
Les 3 méthodes ont été comparées selon les concentrations d'ADN présentent dans les échantillons, mesurées en utilisant le dosage en nanodrop 2000 ThermoSCIENTIFIC et une PCR quantitative ciblant 16S RNAr M. smithii.
RESULTAT
Tableau 1 concentrations d'ADN M. smithii obtenues avec les 3 méthodes mesurées avec le NANODROP 2000
Concentrations d'ADN ng/pL
N° échantillon Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3
1 5 22 19
2 10 32 36
3 12 31 47
4 13 26 33
5 9 28 46
6 6 25 23
7 8 27 35
8 15 42 22
9 12 28 48
10 13 33 32
Moyenne
10,3 29,4 34,1
. (ng/jiiL) .
Tableau 2 : résultats qPCR M. smithii obtenus avec les 3 méthodes sur les suspensions de M. smithii.
résultats obtenus avec qPCR (Ct) sur suspension de M.smithii
N° échantillon Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3
1 0 32,56 30,45
2 0 32.08 30.07
3 39.56 30.54 28.45
4 37,56 30,65 31,65 5 0 29,09 27,86
6 0 29.57 32.65
7 0 31 54 29.76
8 37,09 33.43 33.65
9 0 30.43 28.76
10 0 30.45 30.02
moyenne (et) 31,034 30,32
Tableau 3 : résultats qPCR M. smithii obtenus avec les 3 méthodes sur les échantillons de selles.
résultats obtenus avec qPCR (Ct) sur
échantillons de selles
N° échantillon Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3
1 0 39,65 37,05
2 0 34,9 34.56
3 0 38,87 37.45
4 0 39,56 39,89
5 0 37,78 33. 12
6 0 40,65 38.45
7 42,65 38,76 37.56
> 42
moyenne (et) 27,17 25,80
Interprétation : La méthode 3 combinant une lyse mécanique par sonication suivi d'une lyse enzymatique est celle qui apporte le meilleur rendement d'extraction, la méthode 2 avec deux méthodes de lyse mécanique est une méthode intermédiaire et la méthode 1 avec une seule lyse enzymatqiue ne peut pas être valablement utilisée.
EXEMPLE 3. Détection de séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii dans des prélèvements vaginaux de patientes par amplification et séquençage.
Un total de 77 des femmes enceintes, suivies pour leur grossesse, ont été recrutées à l'hôpital de La Conception à Marseille. Un consentement éclairé est la condition nécessaire à l'inclusion. Les prélèvements ont été réalisés au niveau du cul de sac vaginal postérieur sous spéculum stérile non lubrifié et sans antiseptique. Quatre prélèvements sont réalisés pour chaque femme : deux prélèvements par écouvillon coton sur tube sec (Copan innovation®, Brescia, Italie) et deux prélèvements par cytobrosse (Scrinet® 5,5 mm, laboratoire C.C. D. international, Paris, France). Un écouvillon coton standard est utilisé pour l'état frais et la culture bactérienne. Un second est placé dans un milieu de transport spécifique (RI Urée-Arginine LYO 2, BioMérieux SA, Marcy l'Etoile, France) pour la recherche des Mycoplasmes génitaux ( M . hominis et M. urealyticum ). Une cytobrosse est utilisée pour l'étalement sur lame et coloration de Gram. Une seconde pour l'extraction de l'ADN aux fins d'amplification moléculaire est transportée dans 500 pL de milieu de transport MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Elle est congelée à -80°C dés son arrivée au laboratoire jusqu'à son utilisation. Après analyses microbiologiques appropriées telles que précédemment décrites dans le brevet WO 2008/062136], 15 patientes ont été diagnostiquées avec une vaginose bactérienne selon les critères rappelés dans ce brevet et 62 patientes ont été diagnostiquées sans vaginose bactérienne.
La détection moléculaire de séquences spécifiques de l'archaea méthanogène M. smithii a été réalisée par PCR standard après une extraction de l'ADN selon un protocole standard . En pratique, le protocole d'extraction d'ADN utilise le kit « NucleoSpin Tissue Mini Kit » (Macherey- Nagel, Hoerdt, France) modifié de la façon suivante : 0,3g de poudre de verre (B106 mm, Sigma, Saint-Quentin Fa 11 a vie r, France) sont ajoutés à 250 pL d'échantillon suivi d'une lyse mécanique dans un appareil FastPrep BIO 101 (Qbiogene, Strasbourg, France) pendant 2 min à vitesse 6,5. Ensuite, 200 pL de tampon de lyse et 20 pL de protéinase K (20 mg/mL) sont ajoutés aux échantillons qui sont par la suite incubés pendant 12 heures à 56°C. Après 12 heures d'incubation, vient une autre lyse mécanique à vitesse 6,5 pendant 2 minutes. Le lysat récupéré est traité selon les recommandations du fabriquant. L'ADN est élué dans 100 pL de tampon d'élution puis stocké à - 20°C. L'analyse des données de la littérature, et des séquences déposées dans le site « GenBank »
(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/Genbank/GenbankSearch. html) permet de prendre connaissance des séquences disponibles pour chacun des microorganismes cibles. La spécificité des amorces, et des fragments des séquences cibles de chacun des microorganismes choisis sont testées pour leur spécificité sur le site Internet NBCI fhttp : //WWW. ncbi. nlm. nih.aov/BLAST/')·
Les inventeurs ont sélectionné des cibles sur l'archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii. Les cibles retenues sont localisées sur la séquence du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S, sur le gène mcrA et sur le gène rpoB. Une séquence située dans l'exon 12 du gène de l'albumine humaine est choisie afin d'attester de la présence et de la quantité d'ADN dans l'échantillon testé. Pour Methanobrevibacter smithii et l'albumine humaine une sonde, un couple amorce sens et anti-sens sont choisies sur les séquences cibles précédemment définies en utilisant le programme Primer 3® (http://frodo.wi. mit edu/primer3/primer3_code . html). Les amorces sont décrites ci- après. Chaque amorce est analysée sur le site Internet N BCI (http://WWW. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/) pour s'assurer de leur spécificité in si/ico.
Pour le gène 16S ARNr :
Amorce 5' : SEQ.ID. n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3'
Amorce 3' : SEQ.ID. n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3' - Pour le gène mcrA :
Amorce 5' :SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3'
Amorce 3' :SEQ.ID. n°9 = 5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3'.
Pour le gène rpoB :
Amorce 5' :SEQ.ID. n°l l = 5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3'
Amorce 3' : SEQ.ID. n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'
Pour l'albumine humaine : Amorce 5': SEQ.ID. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'
Amorce 3':SEQ.ID. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3'
Afin de tester la spécificité des amorces et du protocole de PCR, l'ADN extrait de souches bactériennes de référence représentatives de la flore de la cavité vaginale selon la liste suivante : Bacteroides nordii, Propionibacterium avidum, Clostridum irregular, Clostridum massiiioamazoniensis, Clostridum butyricum, Clostridum beijerinckii, Bacteroides thetaiotaomicron, Propionibacterium acnés, Finegoidia magna, Bacteroides fragiiis, Staphyiococcus au reus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coii, Klebsiella oxytoca, Streptococcus agaiactiae, Serratia marcescens, Enterococcus faecaiis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mitis, Staphyiococcus epidermidis, Morganeiia morganii, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae,Bacillus circula ns, Neisseria meninigitidis, Streptococcus pneumoniae, Staphyiococcus hominis, Acinetobacter baumanii, Haemophiius infiuenzae a servi à faire des PCR pour confirmer la spécificité des amorces utilisées.
Tous les témoins négatifs testés sont négatifs en PCR. Sur les 77 échantillons analysés, 62 échantillons qui correspondent à des prélèvements à partir de flore vaginale normale sont négatifs en PCR et 15 échantillons qui correspondent à des prélèvements de vaginose sont positifs en PCR. Les PCR sont suivies d'un séquençage des amplifiats. L'analyse des séquences obtenues a montré une identité de 100% avec le fragment homologue du gène 16S ARN ribosomal de référence de Methanobrevibacter smithii strain NVD (accession NCBI : LT223565) confirmant que seule cette archaea méthanogène a été retrouvée dans les échantillons vaginaux prélevés chez des femmes enceintes diagnostiquées avec une vaginose bactérienne (Figure 2A, Figure 2B et Tableau 1). En effet, il y a actuellement 15 archaea méthanogènes listées au tableau A ci-après détectées chez l'homme dont 7 espèces (en gras dans le tableau A) sont cultivées. Il était donc nécessaire d'utiliser une méthode de séquençage permettant d'identifier sans ambigüité que, parmi ces 15 espèces, seule l'archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii était détectée.
Tableau A.
Sur la figure 2A, on montre la révélation des produ its de PCR 16S ARN ribosomal archaea (échantillons de vaginose) par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies E.V1 à E.V11 : échantillons de vaginose ; T- : Témoin négatif ; et MT : marqueur de taille.
Sur la figure 2B, on montre la révélation des produits de PCR ciblant le gène mcrA méthanogène (échantillons de vaginose) par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies E. l à E.12 : échantillons de vaginose ; T- : Témoin négatif ; et MT : marqueur de taille.
Tableau 1. Détection de la présence de M. smithii par PCR standard ciblant les gènes 16S rARN et mcrA pour 77 échantillons. FN = Flore normale ; VB= Vaginose bactérienne.
EXEMPLE 4. Détection de Methanobrevibacter smithii dans des prélèvements vaginaux de patientes par amplification et détection par sonde par PCR en temps-réel. Dans cet exemple, la même collection de prélèvements vaginaux testés dans l'exemple 3, a été testée pour la présence de Methanobrevibacter smithii par PCR temps-réel ciblant les gènes 16S A R N r , mer A et rpoB.
La détection moléculaire de l'archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii a été réalisée par PCR temps réel après une extraction de l'ADN selon un protocole tel que décrit dans l'exemple 3 avec les amorces et sondes suivantes.
Après extraction d'ADN, un ensemble de réactions en chaîne polymérase à temps réel ont été réalisées comme suit. Un mix de 20 pL (mélange réactionnel) a été préparé avec 10 pL de mix (Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France) ; de l'eau distillée (Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France), une sonde 5 pM ; une amorce sens (amorce 5') 20 pM 0,5 pL ; une amorce anti-sens (amorce 3') 20 pM 0,5 pL, de l'uracile dna glycosylase 0,5 pL et 5 pL d'ADN extrait. Les réactions de PCR sont réalisées dans l'appareil Stratagene MX3000P (BIO- RAD, Marnes-la-Coquette, France) suivant le programme suivant : 50°C à 2 minutes, 95°C pendant 5 minutes, 02 étapes à 39 cycles (95°C pendant
5 secondes et 60°C pendant 30 secondes). Tous les témoins négatifs testés sont négatifs en PCR réel. Sur les 77 échantillons analysés, 62 échantillons qui correspondent à des prélèvements à partir de flore vaginale normale sont négatifs en PCR temps réel (Ct > 39) et 15 échantillons qui correspondent à des prélèvements de vaginose sont positifs en PCR temps réel (Ct < 39)
(Tableau 2). Le « CT », mesure le nombre de cycles qui fournit un résultat positif, plus le CT est petit plus la quantité d'ADN amplifiée est grande.
Tableau 2. Détection de la présence de M. smithii par PCR temps réel ciblant le gène ribosomal 16S ARN pour 77 échantillons. FN = Flore normale ; VB= Vaginose bactérienne. N/A= Non amplifié (Ct > 39), Ct= Cycle seuil.
Les résultats selon la présente invention démontrent que la détection de Methanobrevibacter smithii est parfaitement discriminante pour le diagnostic de vaginose bactérienne.
L'originalité de la présente invention est de pouvoir proposer pour la première fois un outil simple pour le diagnostic de la VB basé sur la détection moléculaire de Methanobrevibacter smithii.
Par ailleurs, la spécificité de la détection moléculaire ici décrite conduit à comprendre que la détection d'un ou de plusieurs antigènes spécifiques de M. smithii par toute méthode appropriée; ainsi que la détection de la présence de méthane dans la cavité vaginale ou à partir d'un prélèvement de la cavité vaginale par toute méthode appropriée constituent aussi des méthodes de diagnostic de la vaginose bactérienne, pourrait constituer un test diagnostic monopléxé et non-quantitatif de la présence de M. smithii dans un prélèvement de la cavité vaginale entrant dans le champ de la présente invention, en particulier une méthode de détection d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de M. smithii notamment par immunodétection à l'aide d'anticorps spécifiques ou méthode colorimétrique.
On comprend également que cette méthode diagnostique de la VB permet le suivi pour l'évaluation la prise en charge thérapeutique de la VB durant la grossesse.
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Claims

REVEN DICATIONS
1. Méthode de diagnostic in vitro de la présence d'une vaginose bactérienne chez une patiente, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes suivantes dans lesquelles : a) on réalise une extraction de l'ADN total contenu dans l'échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale par une méthode apte à l'extraction de l'ADN des archaea méthanogènes comprenant de préférence au moins deux étapes de lyse d'ADN enzymatique et/ou mécanique, et b) on détermine la présence d'une vaginose bactérienne si l'on détecte dans l'ADN extrait dudit échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale de la dite patiente, la présence de ladite séquence spécifique d'ADN humain et d'au moins une séquence d'acide nucléique spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, les concentrations des fragments d'ADN de ladite séquence spécifique d'ADN humain et de la dite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii dans ledit échantillon de prélèvement de sécrétions vaginales étant supérieures ou égales chacune à 101 copies/mL.
2. Méthode selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on détermine la présence de Methanobrevibacter smithii en détectant la présence d'au moins une séquence d'acide nucléique spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii présente en une seule copie dans la dite archaea Methanobrevibacter smithii, ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii présentant une taille inférieure à 150 nucléotides.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce q ue l'étape b), comprend les étapes suivantes dans lesq uelles: b. l) on effectue l'amplification enzymatique du type PCR d'au moins une dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii dans l'ADN extrait dudit échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale, et b.2) on effectue la détection de fragments amplifiés de ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii de préférence par séquençage, par électrophorèse sur gel d'agarose ou à l'aide de sondes marquées spécifiques de la dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii de séquences distinctes de celles des dites amorces d'amplification.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'on réalise des réactions d'amplification et de quantification d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'ADN extrait de l'échantillon à tester, comprenant une séquence spécifique de l'albumine humaine.
5. Méthode selon l'une des revendications 2 à 4 caractérisée en ce que ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii comprend ou est comprise dans un des fragments suivants :
- le fragment des positions 334632 à 334687 du gène ARN 16S ribosomal de référence GenBank NC 009515.1 ;
- le fragment des positions 1734995 à 1735069 du gène mcrA de la protéine methyl-coenzyme M reductase alpha subunit de 157 acides aminés et de 16,942 Da de référence GenBank AAW80308.1 ;
- le fragment des positions 876305 à 876370 du gène rpo de la protéine RNA polymerase subunit B de M. smithii de 186 acides aminés et de 20,836 Da de référence GenBank ABYV02000000.
6. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend le fragment des positions 16283-16423 de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M 12523.1.
7. Méthode selon l'une des revendications 3 à 6 caractérisé en ce qu'à l'étape b), on met en œuvre les étapes suivantes dans lesquelles : b. l) on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, et b.2) on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique à l'aide d'une sonde d'hydrolyse comprenant une séquence spécifique de ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii et encadrée par les séquences des dites amorces.
8. Méthode selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'on réalise des réactions de co-amplification et de quantification en mettant en œuvre deux jeux d'amorces et sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement d'une part de ladite séquence spécifique de l'archaea Methanobrevibacter smithii, et d'autre part d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, de préférence une séquence spécifique de l'albumine humaine, et ladite séquence spécifique de l'ADN humain comprenant une séquence de dite sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme dites amorces dans une réaction d'amplification du type PCR de ladite séquence spécifique de l'ADN humain.
9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on détermine la présence d'une vaginose bactérienne si, dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétion vaginale de patiente, les 2 conditions a) et b) suivantes sont respectées : a) la concentration Ca en fragment d'ADN de l'albumine humaine est supérieure ou égale à 101 copies/ml, et b) la concentration Cm en dit fragment d'ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii est supérieure ou égale à 101 copies/mL.
10. Méthode selon l'une des revendication 3 à 9 caractérisé en ce qu'à l'étape a), on réalise une méthode d'extraction de l'ADN total contenu dans le prélèvement de sécrétion vaginale incluant l'extraction de d'ADN de Methanobrevibacter smithii comprenant les étapes suivantes dans lesquelles : a. l) on effectue uné étape de lyse mécanique, de préférence de sonication, de l'échantillon de sécrétion vaginale, et a.2) on effectue une lyse enzymatique dudit échantillon.
11. Méthode selon l'une des revendication 3 à 10 caractérisé en ce que ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii est choisie parmi les séquences suivantes incluant des séquences sondes (soulignées) encadrées par des séquences amorces (en gras) ou leurs séquences reverses et complémentaires pour les amorces anti-sens:
- pour la séquence 16S ARNr ; SEQ.ID. n°2 =
5'CCGGGTATCTAATCCGGTTCCCGTCAGAATCGTTCC
AGTCAGCTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3' ; - pour la séquence du gène mcrA ; SEQ.ID. n°3 =
5 - GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGGARGCACCKAA
CAMCATGGACACWGTCCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA-3' ; et
- pour la séquence rpoB ; SEQ.ID. n°4 =
5'- AAGGGATTTGCACCCAACACATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG
GACCACAGTTAGGACCCTCTGG-3'.
12. Méthode selon l'une des revendications 8 à 11 caractérisé en ce que ladite séquence de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend la séquence du listage de séquence suivante ou la séquence complémentaire:
SEQ.ID. n°l = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTAAGAG T AAT ATT G C AAAACCT GTC AT G CCCAC AC AAAT CTCTCCCTG G CATTGTTGTCTTT GCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT-3'
13. Méthode selon l'une des revendications 11 à 12 caractérisé en ce qu'on met en œuvre les jeux d'amorces et de préférence de sondes choisis le cas échéant parmi les séquences suivantes du listage de séquence annexé à la présente description, ou respectivement leurs séquences complémentaires :
Pour le gène 16S ARNr :
Amorce 5': SEQ.ID. n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3'
Amorce 3': SEQ.ID. n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3'
Sonde: SEQ.ID. n°7 = 5'- CCGT CAG AAT CGTT CCAGT CAG -3' - Pour le gène mcrk :
Amorce 5':SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3'
Amorce 3':SEQ.ID.n°9 =5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3'
Sonde: SEQ.ID. n°10 = 5'- ARGCACCKAACAMCATGGACACWGT-3'
Pour le gène rpoB : Amorce 5':SEQ.ID.n°ll = 5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3'
Amorce 3': SEQ.ID. n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'
Sonde: SEQ.ID. n°13 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG-3'
Pour l'albumine humaine :
Amorce 5': SEQ.ID. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'
Amorce 3':SEQ.ID. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3'
Sonde: SEQ.ID. n°16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3'
14. Trousse de diagnostic pour la mise en œuvre d'u ne méthode de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins :
- des réactifs permettant l'extraction de l'ADN total contenu dans un échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale incluant l'ADN de
Methanobrevibacter smithii, ainsi que
- un jeu d'amorces spécifiques d'au moins une séquence d'ADN spécifiques de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii et de préférence, au moins une sonde spécifique de la dite séquence spécifiques de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, et
- des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR.
15. Trousse de diagnostic selon la revendication 14 comprenant :
- au moins un jeu d'amorces et de sondes de séquences choisies parmi les 3 jeux de séquences SEQ.ID. n°5 à 7, SEQ. ID. n°8 à 10 et
SEQ.ID. n°l 1 à l3, et
- au moins un jeu d'amorces et de sonde de séquences SEQ. ID. n°14 à 16.
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