EP3676286A1 - Protransduzin-d - verbesserter enhancer des gentransfers - Google Patents

Protransduzin-d - verbesserter enhancer des gentransfers

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Publication number
EP3676286A1
EP3676286A1 EP18769599.4A EP18769599A EP3676286A1 EP 3676286 A1 EP3676286 A1 EP 3676286A1 EP 18769599 A EP18769599 A EP 18769599A EP 3676286 A1 EP3676286 A1 EP 3676286A1
Authority
EP
European Patent Office
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ala
glu
pro
gly
ile
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18769599.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolf-Georg Forssmann
Rudolf Richter
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharis Biotec GmbH
Original Assignee
Pharis Biotec GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Pharis Biotec GmbH filed Critical Pharis Biotec GmbH
Publication of EP3676286A1 publication Critical patent/EP3676286A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present application relates to an improved enhancer of gene transfer, protanducin D (PTD-D), an enhancement of the transduction enhancers PTD-A and PTD-B, its polypeptide, an N-terminally protected polypeptide, a pharmaceutical composition containing the polypeptide A polypeptide for use in gene therapy, a method of enhancing the infection of a cell with a genetic engineering construct, a use of the polypeptide for amplification for transfection.
  • PTD-D protanducin D
  • HI viruses preincubated with various concentrations (1-100 pg / ml) of protransduce A show a multiple log-level increase in the rate of reporter cell infection compared to the gold standard "retronectin The mechanism of action was thought to be that EF-C forms fibrillar structures capable of binding, concentrating, and multiplying viruses, in addition to efficiently infecting virus particles Transduction of lentiviral and retroviral particles in various human cell types (T cells, glial cells, fibroblasts, hematopoietic cells)
  • Protransducin A is also the subject of EP 2 452 947 A1.
  • Cysteine is expected to belong to the group of polar neutral amino acids.
  • the cysteine represents an amino acid, its modification or even substitution by another amino acid, especially from another group of amino acids is not considered.
  • the amino acids Tyr, Asp, Ser, Gly, Gin, Thr are counted to the group of polar but neutral amino acids.
  • the skilled person would shy away from an exchange with amino acids from other groups because the effects on the secondary structure of the exchange-modified peptide can not be readily estimated.
  • one skilled in the art would not consider replacing the Cys of protanduzine with amino acids from the group of nonpolar hydrophobic amino acids.
  • a modified protanduzine which on the one hand has a comparable activity to PTD-A as a transduction enhancer, is more stable on storage and ensures easier handling when used as a transduction enhancer, which represents a serious advantage for GMP production.
  • polypeptide according to the invention has at least 80% or 90% sequence agreement, in particular 95% sequence identity to the sequence Z 1 Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z 2 .
  • Z 1 are each independently the N-terminal end of the polypeptide or independently of one another the amino acids Leu or Ser or the following peptides Ser-Asn, Ser-Asn-Asn, Ser-Asn-Asn-Ile, Ser-Asn-Asn Ile-Thr, Thr-Leu, Ile-Thr-Leu, Asn-Ile-Thr-Leu, Asn-Asn-Ile-Thr-Leu, or Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu,
  • Each Z 2 independently represents the C-terminal end of the polypeptide or independently of one another the amino acids Gly or Glu or the following peptides Glu-Val, Glu-Val-Gly, Glu-Val-Gly-Lys, Glu-Val-Gly-Lys-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met, Glu-Val-Gly-Lys-Ala Met-Tyr, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met- Tyr-Ala-Pro-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Ile, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro Ile-Glu, Glu-Val-G
  • the improvement achievable by the polypeptide according to the invention is accompanied by an increased stability of the transduction enhancer, which can be used for therapeutic purposes.
  • Efficient gene transduction into cells for therapeutic use may e.g. For example, reduce the amount of viral particles needed for gene transduction. Furthermore, the number of infection cycles necessary for efficient transduction can be reduced.
  • the polypeptide according to the invention as a transduction enhancer By means of the polypeptide according to the invention as a transduction enhancer, the duration of in vitro cultivation for the multiplication of the gene-modified cells, the amount of cells to be removed by the patient (eg by leukapheresis) can be reduced and, if appropriate, an efficient and non-toxic in vivo gene transduction-by reduction virus load in vivo. Furthermore, the rapid handling of an efficient transduction enhancer reduces the stress on the cells to be transduced.
  • the polypeptide according to the invention allows a better prediction of the activity as a transduction hen, even after prolonged storage of the substance.
  • the polypeptide of the invention also allows the production of larger peptide batches, which can be stored for a longer time, in comparison to PTD-A.
  • the polypeptide is at least 80% sequence-consistent, more preferably 90% sequence-to-sequence
  • polypeptide according to the invention is also understood to mean those related polypeptides which are formed by variation of the amino acids in the polypeptide chain of the polypeptide according to the invention but which still have a comparable and sufficient activity which can be determined, for example, in the following bioassay.
  • the transduction efficiency can be z. Using primary, activated CD4 + / CD8 + enriched T cells cultured for 3 days with CD3 / CD28 beats as target cells and lentiviral and retroviral vectors encoding Green Fluorescent Protein (GFP). PTD-D can z. B. are tested against PTD-A and retronectin as the gold standard of Transdutechnischsenhencer.
  • PTD-A and D is tested in an assay e.g. B. used in a concentration of 25 pg / ml.
  • the target cells are used in particular in a concentration of 10 3 to 10 6 cells / ml.
  • the batch is incubated and then the cells are washed. Then the cells z. B. cultured for a further 4 days.
  • the proportion of GFP + T cells is determined by means of flow centrifugation as well as cell number and vitality.
  • a homologous polypeptide is, in particular, a polypeptide which is related to the sequence of the polypeptide according to the invention and in which exchanges or deletions of amino acids have been carried out to the extent mentioned.
  • substitutions of amino acids having similar properties for example similar polarities, are possible.
  • exchanges of arginine and lysine, glutamic acid and aspartic acid, glutamine, asparagine and threonine, glycine, alanine and proline, leucine, isoleucine and valine, tyrosine, phenylalanine and tryptophan as well as serine and threonine are widely used.
  • Position 1 of the sequence preferably contains the amino acid glutamine.
  • Position 3 and 5 are preferably basic amino acids, preferably lysine.
  • positions 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12 are mostly neutral amino acids.
  • N- and / or C-terminal the sequence may be extended or shortened.
  • N-terminally the sequence of the monomer may be extended by C-terminal portions or the entire amino acid sequence N H2-Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu-COOH.
  • C-terminal the sequence of the monomer may be extended by N-terminal portions or the entire amino acid sequence NH 2 -Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly-COOH.
  • the polypeptides according to the invention have in common that they form insoluble aggregates in aqueous solutions.
  • the monomers consist of 4 to 25 amino acids, but preferably from 10 to 20 amino acids.
  • homologous molecules have in common that they form insoluble aggregates in aqueous solutions and increase the transduction of target cells with lentiviral or retroviral vectors.
  • the N-terminal end of the amino acid chain forming the polypeptide according to the invention is modified with a chemical group which is selected from the group consisting of one or two alkyl groups, such as methyl, ethyl, propyl or butyl groups, an acyl group such as an acetyl or propionyl group or the amino acid pyroglutamic acid, which forms the N-terminal end.
  • a chemical group which is selected from the group consisting of one or two alkyl groups, such as methyl, ethyl, propyl or butyl groups, an acyl group such as an acetyl or propionyl group or the amino acid pyroglutamic acid, which forms the N-terminal end.
  • the invention also provides a medicament containing at least one polypeptide according to the invention.
  • the invention also provides a polypeptide for use in gene therapy for the treatment of gene therapy-treatable diseases.
  • the subject matter of the present invention is also a method for enhancing the infection of a cell with a virus, comprising the steps:
  • the invention also provides the use of at least one polypeptide according to the invention for enhancing the infection of a cell with a virus.
  • a composition comprising at least one polypeptide according to the invention is likewise an object of the present invention.
  • polypeptide according to the invention can be carried out, for example, by the method according to Merrifilia with Fmoc-protected amino acids.
  • the acylation reactions take in each case 45 minutes, the cleavage of the Fmoc protective group with 20% piperidine takes 15 minutes.
  • protransducine A according to EP 2 452 947 A1 and protransduce D is that in protransduce-D according to the invention Cys 2 is substituted by alanine.
  • protransducin-B according to WO 2014/177635 Al to Protransduzin- D is that Protransduzin-D according to the invention Cys2 is substituted by alanine and N-terminal in exchange for synthetic L-glutamine (Gin), the synthetic L-pyroglutamic acid ( pGlu) is inserted.
  • the original glutamine is modified by a ring closure, the lactam.
  • Cryopreserved, CD4 + / CD8 + enriched T cells were used for transduction. These were thawed and cultured for 3 days with CD3 / CD28 beats. After removal of the beats after 3 days, the T cells were transduced with a GFP vector obtained by the producer cell line HG820 # 4E912 # 4.3. 2 different MOIs were used. The cells were then cultured for an additional 4 days. On day 7, the cell count and vitality of the cells were determined on a NC-200 nucleo counter. The proportion of GFP + T cells was determined by flow centrifugation.
  • the CD4 + / CD8 + T cells were thawed with a Barkey Plasmatherm device on day 0 and washed once with 1 x PBS.
  • Cells were spiked with cell culture medium X-vivo 15 + 2 mM Glutamax + 5% CTS Immune Cell Serum Replacement with addition of 450 IU / ml IL-7 and 50 IU / ml IL-15 at a density of 1 X 10 6 cells / ml were resuspended
  • 3 (three) CD3 / CD28 Dynabeads were added per cell and cultured until day 3.
  • the beats were removed with a MixMate from Eppendorf and a MaxSep magnet from Baxter. After concentration by centrifugation The cells were transduced with a GFP vector at a concentration of MOI 2 or MOI 4.
  • transduction with retronectin and with virus without additive was performed.
  • An untransduced control was used as a negative control.
  • the different protransduce peptides were dissolved with DMSO to 10 mg / ml (stock solution).
  • the stock solution was diluted with 1 ⁇ PBS to a concentration of 1 mg / ml and incubated for at least 10 minutes to allow PTD fibrils to form.
  • the viral supernatant was mixed with the medium and serum replacement to obtain the necessary concentration.
  • the various PTDs were added to give a concentration of 50 pg / ml.
  • the mixture was incubated for a minimum of 5 minutes at room temperature. After incubation, the cells were added so that a cell density of 5 x 10 5 cells / ml and a final PTD concentration of 25 ⁇ / ml was present. Cells were incubated in 6-well plates at 37 ° C, 5% CO 2 and high humidity for 16 +/- 4 hours to day 4.
  • GFP + T cells CD3 +
  • FACSVerse Flow Cytometer 1.5 ⁇ 10 6 viable cells were washed with 1 ⁇ PBS. After centrifugation, the cell pellet was taken up in 300 ⁇ L of 1X PBS and 3 ⁇ M FVS780 solution. Two FACS tubes were stained per test: Tube 1: GFP / FVS 780 / BV421-unstained (FMO control for CD3-BV421)
  • Tube 2 GFP / FVS 780 / CD3-BV421 [5 ⁇ ]

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Abstract

Polypeptid mit der Sequenz Z1-Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z2. Das Polypeptid wird zur retroviralen Transfektion/Transduktion eingesetzt.

Description

Protransduzin-D - verbesserter Enhancer des Gentransfers
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein verbesserter Enhancer des Gentransfers, Protransduzin D (PTD-D), eine Verbesserung der Transductionsenhancer PTD-A und PTD-B, sein Polypeptid, ein N-terminal geschütztes Polypeptid, ein Arz- neimittel enthaltend das Polypeptid, das Polypeptid zur Verwendung in der Gentherapie, ein Verfahren zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem gentechnischen Viruskonstrukt, eine Verwendung des Polypeptids zur Amplifizierung zur Transfection bzw. Transduction.
Die Einschleusung von Genmaterial zur Veränderung spezifischer Zellfunktionen ist seit der Klonierung der ersten humanen Gene und der rekombinanten Produktion ein unverzichtbares Tool der biologisch-medizinischen Grundlagen- und Anwendungsforschung geworden. Dabei gibt sich ein ständiger Fortschritt der Methoden der Gen- einschleußung, der zu einer Optimierung des Gentransfers führt.
Untersuchungen zur Entwicklung von Transduktionsenhancern führten zur Entde- ckung von Protransduzin-A, ein Peptid aus einem viralen Hüllprotein des HIV-Virus, das überraschenderweise geeignet war, die lentivirale Transduktion von Genmaterial in den Zellkern über ein bis dahin nicht gekanntes Mass zu verbessern (Yolamanova et al Nature Nanotechnology). So konnte z. B. gezeigt werden, dass HI-Viren, welche mit verschiedenen Konzentrationen (1-100 pg/ml) Protransduzin-A (Synonym : EF- C) vorinkubiert wurden, eine um mehrere log-Stufen stärkere Infektionsrate bei Reporterzellen gegenüber dem Goldstandard„Retronectin" aufweisen. Als Wirkmechanismus wurde angenommen, dass EF-C fibrilläre Strukturen ausbildet, die in der Lage sind, Viren zu binden, zu konzentrieren und entprechend den Zelleintritt der Viren zu vervielfachen. EF-C verstärkt neben der Infektion von Viruspartikeln mit hoher Effizienz die Transduction von lentiviralen und retroviralen Partikeln in verschiedensten humanen Zelltypen (T-Zellen, Gliazellen, Fibroblasten, hämatopoietische
Stammzellen), welche in der Gentherapie Anwendung finden (Jan Münch et at. , Nature Nanotechnology, Bd . 8, Nr. 2, S. 130-136). Protransduzin-A ist auch Gegenstand der EP 2 452 947 AI . Cystein rechnet man zu der Gruppe der polaren neutralen Aminosäuren. Weiterhin stellt das Cystein, aufgrund seiner einzigartigen funktionellen Thiolgruppe, eine Aminosäure dar, deren Modifikation oder gar Ersetzung durch eine andere Aminosäure, insbesondere aus einer anderen Gruppe von Aminosäuren nicht in Betracht gezogen wird . Wie Cys werden die Aminosäuren Tyr, Asp, Ser, Gly, Gin, Thr zu der Gruppe der polaren aber neutralen Aminosäuren gerechnet. Von einem Austausch mit Aminosäuren aus anderen Gruppen würde der Fachmann aber zurückschrecken, weil die Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des durch Austausch modifizierten Peptids nicht ohne weiteres abzuschätzen sind. So würde der Fachmann nicht einen Austausch des Cys des Protransduzins gegen Aminosäuren aus der Gruppe der unpolar hydrophoben Aminosäuren in Betracht ziehen.
Überraschenderweise wurde aber gefunden, dass die Aminosäure Cys im Protrans- duzin durch Alanin ersetzt werden kann, ohne dass es zu einer signifikanten Veränderung der Wirksamkeit des modifizierten Polypeptids als Transduktionsenhancer kommt.
Erfindungsgemäß wird ein modifiziertes Protransduzin bereitgestellt, das auf der einen Seite eine vergleichbare Wirksamkeit wie das PTD-A als Transduktionsenhancer besitzt, bei Lagerung stabiler ist und eine einfachere Handhabung bei der Anwendung als Transduktionsenhancer gewährleistet, was einen gravierenden Vorteil für eine GMP Produktion darstellt.
Das erfindungsgemäße Polypeptid weist eine mindestens 80 % oder 90 % Sequenzübereinstimmung, insbesondere 95 % Sequenzübereinstimmung zu der Sequenz Z^Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z2 auf.
Dabei sind Z1 jeweils unabhängig voneinander das N-terminale Ende des Polypeptids oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Leu oder Ser oder die folgenden Peptide Ser-Asn, Ser-Asn-Asn, Ser-Asn-Asn-Ile, Ser-Asn-Asn-Ile-Thr, Thr-Leu, Ile-Thr-Leu, Asn-Ile-Thr-Leu, Asn-Asn-Ile-Thr-Leu, oder Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu,
Z2 jeweils unabhängig voneinander das C-terminale Ende des Polypeptids darstellen oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Gly oder Glu oder die folgenden Peptide Glu-Val, Glu-Val-Gly, Glu-Val-Gly-Lys, Glu-Val-Gly-Lys-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala- Met-Tyr-Ala-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met- Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu, Glu-Val-Gly- Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Glu-Gly, Ile-Glu-Gly, Pro-Ile-Glu-Gly, Pro- Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Met-Tyr-Ala- Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro- Pro-Ile-Glu-Gly, Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Val-Gly-Lys-Ala-Met- Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, oder Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu- Gly.
Die durch das erfindungsgemäße Polypeptid erzielbare Verbesserung geht mit einer erhöhten Stabilität des Transduktionsenhancers einher, der zu therapeutischen Zwecken eingesetzt werden kann. Eine effiziente Gentransduktion in Zellen zur therapeutischen Anwendung kann z. B. die benötigte Menge an viralen Partikeln, die zur Gentransduktion verwendet werden, reduzieren. Weiterhin kann die Anzahl der Infektionzyklen, die für eine effiziente Transduktion notwendig sind, reduziert werden. Durch das erfindungsgemäße Polypeptid als Transduktionsverstärker kann die Dauer der in vitro Kultivierung zur Vermehrung der genmodifizierten Zellen, die Menge der vom Patienten zu entnehmenden Zellen (z. B. durch Leukapherese) reduziert und ggf. eine effiziente und nicht toxische in vivo Gentransduktion - durch Reduktion der Virusbelastung in vivo - ermöglicht werden. Weiterhin reduziert die schnelle Handhabung eines effizienten Transduktionsverstärkers die Belastung der zu transduzie- renden Zellen.
Das erfindungsgemäße Polypeptid erlaubt aufgrund der besseren Stabilität eine bes- sere Vorhersage der Wirksamkeit als Transduktionsenhencers auch nach längerer Lagerung der Substanz.
Aufgrund der höheren Stabilität erlaubt das erfindungsgemäße Polypeptid im Vergleich zu PTD-A auch die Produktion größerer Peptidchargen, die länger gelagert werden können. Die geringere Reaktivität des erfindungsgemäßen Peptids im Ver- gleich zu PTD-A für zu dessen geringeren zytotoxischen Wirkung . Dies führt bei der Transduktions zu einer besseren Ausbeute an transduzierten Zellen. Insbesondere ist das Polypeptid mit einer mindestens 80 % Sequenzübereinstimmung, insbesondere 90 % Sequenzübereinstimmung zu der Sequenz
Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln
Gegenstand der Erfindung . Erfindungsgemäß werden unter der Bezeichnung erfindungsgemäßes Polypeptid auch solche verwandten Polypeptide verstanden, die durch Variation der Aminosäuren in der Polypeptidkette des erfindungsgemäßen Polypeptids entstehen, aber noch eine vergleichbare und hinreichende Wirksamkeit aufweisen, die sich beispielsweise in folgendem Bioassay bestimmen lässt. Die Transduktionseffizienz kann z. B. unter Verwendung von primären, aktivierten CD4+/CD8+ angereicherten T Zellen, die für 3 Tage mit CD3/CD28 Beats kultiviert werden als Targetzellen und lentiviralen und retroviralen Vektoren, die Green Fluoreszenz Protein (GFP) kodieren, getestet werden. PTD-D kann z. B. gegen PTD-A und Retronektin als Goldstandard der Transduktionsenhencer getestet werden. PTD-A und -D wird in einem Assay z. B. in einer Konzentration von 25 pg/ml eingesetzt. Die Targetzellen werden insbesondere in einer Konzentration von 103 bis 106 Zellen/ml eingesetzt. Für 8 bis 16 Stunden wird der Ansatz inkubiert und anschließend werden die Zellen gewaschen. Dann werden die Zellen z. B. für weitere 4 Tage kultiviert. An Tag 7 wird dann der Anteil der GFP+ T-Zellen mittels Durchflusszentri- fugation sowie die Zellzahl und die Vitalität bestimmt.
Ein homologes Polypeptid ist insbesondere ein mit der Sequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids verwandtes Polypeptid, bei dem im genannten Umfang Austausche oder Deletionen von Aminosäuren vorgenommen wurden. Insbesondere sind Austausche von Aminosäuren, die ähnliche Eigenschaften haben, beispielsweise ähn- liehe Polaritäten, möglich . So sind Austausche von Arginin und Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure, Glutamin, Asparagin und Threonin, Glycin, Alanin und Prolin, Leucin, Isoleucin und Valin, Thyrosin, Phenylalanin und Tryptophan sowie Serin und Threonin weit verbreitet.
In Position 1 der Sequenz findet sich bevorzugt die Aminosäure Glutamin. In Position 3 und 5 finden sich bevorzugt basische Aminosäuren, bevorzugt Lysin. In den Positionen 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, und 12 finden sich zumeist neutrale Aminosäuren. N- und/oder C-terminal kann die Sequenz verlängert oder verkürzt sein. N-terminal kann die Sequenz des Monomers um C-terminale Teile oder die gesamte Aminosäuresequenz N H2-Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu-COOH verlängert sein. C-terminal kann die Sequenz des Monomers um N-terminale Teile oder die gesamte Aminosäuresequenz NH2-Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly-COOH verlängert sein. Den erfindungsgemäßen Polypeptiden ist gemein, dass sie in wässrigen Lösungen unlösliche Aggregate bilden. Die Monomere bestehen aus 4 bis 25 Aminosäuren, bevorzugt aber aus 10 bis 20 Aminosäuren.
Weiterhin ist den homologen Molekülen gemein, dass sie in wässrigen Lösungen un- löslichen Aggregate bilden und die Transduktion von Targetzellen mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren steigern.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das N-terminale Ende der das erfindungsgemäße Polypeptid bildenden Aminosäurekette mit einer chemischen Gruppe modifiziert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer oder zwei Alkyl- gruppen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppen, eine Acylgruppe, wie eine Acetyl- oder Propionylgruppe oder der Aminosäure Pyroglutaminsäure, die das N-terminale Ende bildet.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfin- dungsgemäßes Polypeptid .
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Polypeptid zur Verwendung in der Gentherapie zur Behandlung von mit Gentherapie behandelbar Erkrankungen.
Ebenfalls ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus mit den Schritten :
- Bereitstellen des Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2 gelöst in einem organischen Lösungsmittel,
Zugabe des Polypeptids zu einer wässrigen Lösung, unter Bildung von unlösbaren Aggregaten des Polypeptids,
Vermischen der Lösung aus dem vorhergehenden Schritt und Kultivieren von Zellen in Anwesenheit mindestens eines erfindungsgemäßen Polypeptids.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus. Eine Zusammenstellung enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann beispielsweise mit der Methode nach Merrifi- eld mit Fmoc geschützten Aminosäuren durchgeführt werden.
Dabei wird mit Fmoc-geschützten Derivaten gearbeitet, also mit (9- fluorenylmethoxycarbonyl) -geschützten Aminosäuren in einer schrittweisen Festphasensynthese nach dem Merrifield-Prinzip, insbesondere auf einem mit Fmoc-L- Glutamin vorbeladenem Wang-Harz (0,59 mmol/g, 100 - 200 mesh) als festem Träger am Synthesizer ABI-433.
Die Aktivierung der Fmoc-L-Aminosäuren, die typischerweise in 10-fachem molaren Überschuss eingesetzt wurden, werden mit [(2-(lH-Benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3- tetramethyluronium-hexafluorophosphat] (HBTU, 100 mmol/1) unter Zusatz von 0.5 M 1-Hydroxy-benzotriazol (HOBt) und 2M Diisopropylethylamin (DIEA) in N-Methyl- 2-pyrrolidinon (NMP) bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Acylierungsreaktionen dauern im einzelnen 45 Minuten, die Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppe mit 20 %igem Piperidin dauert 15 Minuten.
Folgende Aminosäurederivate sowie dazugehörige orthogonal-säurelabile Seitenket- tenschutzgruppen werden zur Synthese eingesetzt:
Fmoc-L-Asn(Trt), Fmoc-L-Ala(Trt), L-pGlu, Fmoc-L-Gln(Trt), Fmoc-L-Ile, Fmoc-L- Lys(Boc), Fmoc-L-Met und Fmoc-L-Trp(Boc). Nach Abspaltung des Harzträgers vom Peptidylharz mit 94 %iger Trifluoressigsäure (TFA); 3%igem Ethandithiol (EDT) und 3 %igem entmineralisiertem Wasser wird das Rohpeptid in kaltem tert. Butylmethylether ausgefällt, das Rohpeptid als Sediment abzentrifugiert, der Überstand verworfen. Die anschließende chromatographische Aufreinigung des Rohpeptides erfolgt präpe- rativ per Gradientenelution.
Der Unterschied von Protransduzin-A gemäß EP 2 452 947 AI zu Protransduzin-D ist der, dass bei Protransduzin-D erfindungsgemäß Cys2 durch Alanin substituiert ist. Der Unterschied von Protransduzin-B gemäß WO 2014/177635 AI zu Protransduzin- D ist der, dass Protransduzin-D erfindungsgemäß Cys2 durch Alanin substituiert ist und N-terminal im Austausch zum synthetischen L-Glutamin (Gin), die synthetische L-Pyroglutaminsäure (pGlu) eingefügt wird . Das ursprüngliche Glutamin ist dabei durch einen Ringschluss, dem Lactam modifiziert. Beispiel :
Die Transduktionseffizienz wurde an aktivierten CD3+ T Zellen untersucht. Es wurden 5 verschiedene PTD Batche gegen verschiedene Kontrollen und gegen Retro- nektin getestet.
Zur Transduktion wurden kryokonservierte, CD4+/CD8+ angereicherte T-Zellen verwendet. Diese wurden aufgetaut, und für 3 Tage mit CD3/CD28 Beats kultiviert. Nach der Entfernung der Beats nach 3 Tagen wurden die T-Zellen mit einem GFP Vektor, der Mittels der Produzenten Zelllinie HG820#4E912#4.3 gewonnen wurde, transduziert. Es wurden 2 verschiedene MOIs verwendet. Die Zellen wurden dann für weitere 4 Tage kultiviert. An Tag 7 wurde die Zellzahl und die Vitalität der Zellen an einem Nucleo counter NC-200 bestimmt. Der Anteil der GFP+ T-Zellen wurde mittels Durchflusszentrifugation bestimmt.
Prästimulation, Entfernung der Beads, Transduktion, Expansion
Die CD4+/CD8+ T Zellen wurden mit einem Barkey Plasmatherm Gerät an Tag 0 aufgetaut und einmal mit 1 x PBS gewaschen. Die Zellen wurden unter Zugabe von Zellkuturmedium X-vivo 15 + 2 mM Glutamax + 5% CTS„Immune Cell Serum Re- placement" unter Zugabe von 450 IU/ml IL-7 und 50 IU/ml IL-15 bei einer Dichte von 1 X 106 viablen Zellen / ml resuspendiert. Zur Aktivierung der Zellen wurden pro Zelle 3 (drei) CD3/CD28 Dynabeads hinzugegeben und bis zum Tag 3 kultiviert.
An Tag 3 wurden die Beats mit einem MixMate von Eppendorf und einem MaxSep Magneten von Baxter entfernt. Nach der Aufkonzentrierung durch Zentrifugation wurden die Zellen mit einem GFP Vektor bei einer Konzentration von MOI 2 oder MOI 4 transduziert. Für die Kontrollen wurde eine Transduktion mit Retronectin und mit Virus ohne Zusatz durchgeführt. Eine nicht-transduzierte Kontrolle wurde als Negativkontrolle verwendet. Die verschiedenen Protransduzin Peptide wurden mit DMSO auf 10 mg/ml gelöst (Stock Lösung). Die Stock Lösung wurden mit 1 x PBS auf eine Konzentration von 1 mg/ml verdünnt und für mindestens 10 min inkubiert, damit sich PTD Fibrillen ausbilden können. Der virale Überstand wurde mit dem Medium und Serum Replace- ment gemischt, um die notwendige Konzentration zu erhalten. Anschließend wurden die verschiedenen PTDs hinzugegeben, sodass eine Konzentration von 50 pg/ml erhalten wurde. Die Mixtur wurde für eine Minimum von 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen hinzugegeben, sodass eine Zelldichte von 5 x 105 Zellen/ml und eine finale PTD Konzentration von 25 μΙ/ml vorhanden war. Die Zellen wurden in 6 - Well Platten bei 37°C, 5% C02 und bei hoher Luftfeuchtigkeit für 16 +/-4 Stunden bis zum Tag 4 inkubiert.
An Tag 4 wurden Zellzahl und Viabilität bestimmt was bei den PTD 's verbesserte Ergebnisse gegenüber bisheriger Analoga ergibt. Die Zellen wurden in T-25 Kulturflaschen mit 5 mL Zell Kulturmedium überführt und bei 37°C, 5% C02 und bei hoher Luftfeuchtigkeit inkubiert. An Tag 5 wurden 10 ml frisches Zellkulturmedium hinzugegeben.
An Tag 7 wurde das Volumen des Kulturmediums jeder Kulturflasche bestimmt. Anschließend wurde die Zellzahl, die Viabilität und die Transduktionsrate mittels FACS Analyse bestimmt.
Bestimmen der Zellzahl und der Viabilität
Die Zellzahl und die Viabilität wurde mittels eines NucleoCounter NC-200 unter Verwendung von einmal verwendbaren Vial-Kassetten bestimmt.
Bestimmung der GFP Expression durch Durchflusszytometrie Die Anzahl der GFP+ T-Zellen (CD3+) wurde mittels eines FACSVerse Flow Cytome- ters bestimmt. Zur Messung wurden l,5xl06 viable Zellen mit 1 x PBS gewaschen. Nach Zentrifugation wurde das Zellpellet in 300 μΙ 1 x PBS und 3 μΙ FVS780 Lösung aufgenommen. Pro Test wurden zwei FACS Tubes angefärbt: Tube 1 : GFP/FVS 780/ BV421-ungefärbt (FMO Kontrolle für CD3-BV421)
Tube 2 : GFP/FVS 780/ CD3-BV421 [5μΙ]
Je Tube werden 1 x 106 Zellen hinzugefügt und für 15 min bei RT in der Dunkelheit inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen mit Färbepuffer BSA versetzt und zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in 350μΙ Färbepuffer BSA aufgenom- men und innerhalb von 180 min mittels Durchflusszytometrie analysiert. Für die Kalkulation der absoluten Zahl an GFP+ Zellen in einer T-25 Kulturflasche wurden die Ergebnisse gegen die nicht-transduzierte Kontrolle korrigiert.
Sequenzprotokoll
<110> Pharis Biotec GmbH
<120> Protransduzin-D - verbesserter Enhancer des Gentransfers
<130> 182448WO
<150> EP17188384.6
<151> 2017-08-29
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<170> Patentin version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> human
<400> 1
Gin Ala Lys Ile Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin
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<212> PRT
<213> human
<400> 2
Ser Asn Asn Ile
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> human
<400> 3
Ser Asn Asn Ile Thr <212> PRT
<213> human
<400> 4
Asn Ile Thr Leu
<210> 5
<211 > 5
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<213> human
<400> 5
Asn Asn Ile Thr Leu
<210> 6
<211 > 6
<212> PRT
<213> human
<400> 6
Ser Asn Asn Ile Thr Leu
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<213> human
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Glu Val Gly Lys
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<211 > 5
<212> PRT
<213> human
<400> 8
Glu Val Gly Lys Ala
<210> 9 <211 > 6
<212> PRT
<213> human
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Glu Val Gly Lys Ala Met
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<213> human
<400> 10
Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr
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<212> PRT
<213> human
<400> 11
Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala
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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro
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<400> 13
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<212> PRT
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<400> 14
Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile
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<213> human
<400> 15
Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu <210> 16
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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly
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Pro Ile Glu Gly
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<213> human
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Pro Pro Ile Glu Gly <210> 19
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Ala Pro Pro Ile Glu Gly
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<212> PRT
<213> human
<400> 20
Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly
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<212> PRT
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Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly
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Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly <210> 23
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<400> 24
Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly <210> 25
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Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly
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<400> 26
Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

Claims

Patentansprüche
Polypeptid mit einer mindestens 80 % oder 90 % Sequenzübereinstimmung, insbesondere 95 % Sequenzübereinstimmung zu der Sequenz
Z^Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z2 wobei
Z1 das N-terminale Ende des Polypeptids darstellt oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Leu oder Ser oder die folgenden Peptide
Ser-Asn, Ser-Asn-Asn, Ser-Asn-Asn-Ile, Ser-Asn-Asn-Ile-Thr, Thr-Leu, Ile- Thr-Leu, Asn-Ile-Thr-Leu, Asn-Asn-Ile-Thr-Leu, oder Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu sind,
Z2 das C-terminale Ende des Polypeptids darstellt oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Gly oder Glu oder die folgenden Peptide
Glu-Val, Glu-Val-Gly, Glu-Val-Gly-Lys, Glu-Val-Gly-Lys-Ala, Glu-Val-Gly-Lys- Ala-Met, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala, Glu- Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr- Ala-Pro-Pro-Ile-Glu, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Glu- Gly, Ile-Glu-Gly, Pro-Ile-Glu-Gly, Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Met-Tyr- Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Gly-Lys-Ala- Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu- Gly, oder Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly sind .
Polypeptid gemäß Anspruch 1 mit einer mindestens 90 % Sequenzübereinstimmung, insbesondere 95 % Homologie zu der Sequenz
Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln
Polypeptid nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das N- terminale Ende mit einer chemischen Gruppe modifiziert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer oder zwei Alkylgruppen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppen, eine Acylgruppe, wie eine Acetyl- oder Propionylgruppe oder die Aminosäure Pyroglutaminsäure das N-terminale Ende bildet.
Arzneimittel enthaltend ein Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3.
Polypeptid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung in der Gentherapie zur Behandlung von mit Gentherapie behandelbar Erkrankungen.
Verfahren zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus mit den Schritten :
Bereitstellen des Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 gelöst in einem organischen Lösungsmittel,
Zugabe des Polypeptids zu einer wässrigen Lösung, unter Bildung von unlösbaren Aggregaten des Polypeptids,
Vermischen der Lösung aus dem vorhergehenden Schritt und
Kultivieren von Zellen in Anwesenheit des Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3.
7. Verwendung des Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus.
8. Zusammenstellung enthaltend ein Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6656906B1 (en) * 1998-05-20 2003-12-02 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
EP2452947A1 (de) * 2010-11-16 2012-05-16 Münch, Jan Eine Viralinfektion steigerndes Peptid
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