EP3654997A1 - Extrait aqueux d'un broyat de planaires - Google Patents

Extrait aqueux d'un broyat de planaires

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EP3654997A1
EP3654997A1 EP18731890.2A EP18731890A EP3654997A1 EP 3654997 A1 EP3654997 A1 EP 3654997A1 EP 18731890 A EP18731890 A EP 18731890A EP 3654997 A1 EP3654997 A1 EP 3654997A1
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EP
European Patent Office
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aqueous extract
organisms
aqueous
cells
ground material
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18731890.2A
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German (de)
English (en)
Inventor
Eric GHIGO
Eric Chabriere
Michel Drancourt
Vincent Bonniol
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Fondation Mediterranee Infection
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Fondation Mediterranee Infection
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Filing date
Publication date
Application filed by Aix Marseille Universite, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM, Fondation Mediterranee Infection filed Critical Aix Marseille Universite
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    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/82—Undefined extracts from animals from invertebrates

Definitions

  • Aqueous extract of a mash of planarians Aqueous extract of a mash of planarians.
  • the present invention relates to a preparation based on extract of platyhelminth organisms useful especially for the regeneration of mammalian human or animal cells.
  • planar is used to refer to a number of flatworms of the Plathelminths Branch. It mainly refers to non-exclusively parasitic freshwater Turbeilaridae, the Paludicola, but is also used for marine Turbeliaridae, diverer for all flatworms.
  • Plathelminths are flatworms, many of which are parasites.
  • This branch mainly includes worms that are elongated animals without appendices.
  • the best known worms of the class Turbellaria flatworms not exclusively parasitic
  • Planarians are therefore aquatic flatworms belonging to several species in the class Turbeilaridae. Planarians can be swimmers or creepers, and live in the sea or in fresh water, or in very humid soils (in tropical forest).
  • Planarians are organisms capable of perpetual regeneration, and any part of the body, because of the presence of a large amount of stem cells (20-30%) in its tissues compared to other living organisms for which the amount of stem cells is of the order of lppm.
  • the planar stem cells multiply and regenerate continuously, unlike the stem cells of more advanced organisms, which do not multiply or little. Biochemical factors allowing the multiplication of stem cells in a planarian remain unidentified.
  • WO 99/33479 describes therapeutic use for the treatment of autoimmune diseases of cercarial preparations, pathogenic parasites which naturally colonize humans and do not exhibit the property of regeneration, the preparations being obtained by recovering parasite eggs from hamster liver injected with said cercarial organisms.
  • an aqueous extract of planarian flatworms, non-parasitic and non-pathogenic in humans or animals, especially of the species Schmidtea mediterranea is capable of activating propagation.
  • human stem cells, which planar extract because of this cell regeneration activity can therefore be useful in many cosmetic or medical applications, including dermatological, or food.
  • non-parasitic and non-pathogenic in humans or animals is understood to mean that said organisms do not colonize humans or mammalian animals, whether through ingestion or through the skin, actively or passively, by altering pathologically, human cells or tissues or mammalian animals.
  • the present invention provides a useful aqueous extract in particular for the regeneration of mammalian human or animal cells, comprising an aqueous extract freed from any solid insoluble debris of mash of platyhelmint-like organisms having regenerative capacity, said organisms being non-parasitic and non-pathogenic planar-type waterworms in man or mammalian animal, said aqueous extract containing at least the intracellular components of cells of said organisms of a cell lysate of said cells of said whole organisms.
  • cellular state is meant here that the cells of said organisms are mechanically broken so that the intracellular components are released in said extract during the grinding of said organism, and said aqueous extract of ground is an aqueous extract of said crushed organisms. freed from any solid non-soluble debris, that is to say that one thus retains somehow that the "planar juice” resulting from the mechanical grinding containing only the intracellular components of the cells of said organisms of a cell lysate said cells of said organisms, but all components and not just peptides and proteins.
  • non-parasitic and non-pathogenic planar aquatic flatworms in humans include Schmidtea mediterranea, Dugesia japonica, Dendricoelum lacteum, Polycelis nigra, Polycelys held / Planaria torva.
  • said aqueous extract of ground material comprises a supernatant centrifugation said ground.
  • said aqueous extract of ground material further comprises a cell culture medium, preferably a culture medium capable of cultivating human or animal cells to be regenerated.
  • said aqueous extract of ground material comprises the ground material of 50 to 200 mg of whey / ml of aqueous solution, in particular for worms of 1 to 5 mg, said aqueous extract of ground material being further diluted preferably to more than l / 5th and less than 1 / lOOdoor, preferably diluted to l / 10th to l / 50th; including l / 2U th, preferably diluted in said cells of said culture medium.
  • the said aqueous extract of ground material comprises the ground material of 88 to 110 mg of whey / ml of aqueous solution, that is to say 40 to 50 to / ml, the said aqueous extract of ground material being in further diluted to 1 / 20th.
  • a spectrum of said extract of an aqueous millet by MALDI TOF type mass spectrometry comprises the 16 characteristic peaks (ie greater intensities (maximum S / N value) mentioned in Table 1 below. , wherein the different characteristic peaks are numbered in the first column, and the following parameters have the following meanings:
  • the present invention also provides a lyophilizate of an aqueous extract of groundnut according to the invention.
  • the present invention also provides a process for producing an aqueous extract of groundnut according to the invention characterized in that the steps are carried out in which: a) said living organisms, preferably which have been washed with water and have not not fed for at least one week, are placed in an aqueous liquid medium preferably containing a cell culture medium; b) the aqueous preparation obtained in step a) is milled, in particular by mechanical grinding, until the cells of said organisms are lysed, preferably the crushed material being between 5 and 10 ⁇ m in size (ie debris smaller than the size of cells of the said organisms); c) the insoluble debris is removed by centrifugation; and the supernatant is recovered, d) preferably, the centrifugation supernatant is diluted in an aqueous solution to more than 1/5 th and less than 1 / 100th, preferably diluted between 1 /
  • the present invention also relates to the use of an aqueous extract of ground or lyophilizate according to the invention for the manufacture of a composition useful for regenerating mammalian human or animal cells, especially stem or differentiated cells.
  • differentiated cells of the following types are mentioned: epithelial, fibroblast, keratinocyte, endothelial, neuronal or nervous.
  • the present invention also relates to the use of an aqueous extract of ground or lyophilizate according to the invention for the manufacture of a composition useful for regenerating mammalian human or animal stem cells, for example a composition useful for regenerating cells.
  • a composition useful for regenerating mammalian human or animal stem cells for example a composition useful for regenerating cells.
  • the present invention also relates to the use of an aqueous extract of ground or lyophilizate according to the invention for the manufacture of a cosmetic or dermatological composition in combination with suitable carriers and / or excipients, in particular a cosmetic or dermatological composition anti-aging formulated for a topical application in the form of a gel, lotion (in particular an aqueous solution or serum), cream, ointment, soap and paste (especially for a mask).
  • suitable carriers and / or excipients in particular a cosmetic or dermatological composition anti-aging formulated for a topical application in the form of a gel, lotion (in particular an aqueous solution or serum), cream, ointment, soap and paste (especially for a mask).
  • the present invention also relates to the use of an aqueous extract of ground or lyophilizate according to the invention for the manufacture of a food composition. More particularly, an anti-aging cosmetic product according to the invention is formulated for topical application in the form of a gel, lotion, cream, ointment, soap or paste.
  • the topical compositions according to the invention may comprise various conventional excipients suitable for external topical administration, in particular dermatologically and cosmetologically acceptable excipients.
  • excipients suitable for formulation are well known to those skilled in the art and include, for example, penetration enhancers, moisturizers, thickeners, emollients and surfactants, emulsifiers; preservatives.
  • Topical administration are prepared by the known techniques, and for example, in the case of a cream, by dispersion of a fatty phase in an aqueous phase to obtain an oil-in-water emulsion, or conversely to prepare a water-in-oil emulsion.
  • the cosmetic product according to the invention is formulated in the form of a cream comprising, said aqueous extract and at least the following additional excipients: emulsifying agent, emollient agent, thickening agent, moisturizing agent and preserving agent and adjusting agent from Ph.
  • the cosmetic product according to the invention is formulated in the form of an aqueous solution (in particular saline water serum) or an aqueous gel comprising, as a homogeneous mixture in water, said aqueous extract and for the gel at least the following additional excipients of age! gelling agent, thickening agent, moisturizing agent and preserving agent and ph adjusting agent.
  • aqueous solution in particular saline water serum
  • aqueous gel comprising, as a homogeneous mixture in water, said aqueous extract and for the gel at least the following additional excipients of age! gelling agent, thickening agent, moisturizing agent and preserving agent and ph adjusting agent.
  • the preparations generally contain other excipients and / or auxiliaries and sometimes other active ingredients, for example dyes, coloring pigments, radical scavengers, perfumes, stabilizing agents.
  • Cosmetics can also include auxiliaries and sometimes others active ingredients, for example antioxidant vitamins such as vitamin E, vitamin C, antioxidants such as natural polyphenols, enzymes, plant active ingredients, natural anti-inflammatory substances, alcohols, polyols, esters, electrolytes, polar oils and nonpolar polymers, copolymers, phopholipids, dyes; perfumes; or skin scrubbing agents.
  • antioxidant vitamins such as vitamin E, vitamin C
  • antioxidants such as natural polyphenols, enzymes, plant active ingredients, natural anti-inflammatory substances, alcohols, polyols, esters, electrolytes, polar oils and nonpolar polymers, copolymers, phopholipids, dyes; perfumes; or skin scrubbing agents.
  • the invention also relates to a cosmetic process for treating 'skin to fight against the signs of skin aging, in particular wrinkles caused by facial muscle twitches, comprising applying to areas of the skin requiring such treatment, a topical cosmetic product according to the invention.
  • the subject of the present invention is therefore a cosmetic composition with an anti-aging effect on its skin comprising an aqueous or lyophilized extract according to the invention and suitable excipients for topical application in the form of a gel, lotion, cream, ointment or soap.
  • Figures 1A and 1C show growth at day 9 terTie human dental stem cells treated with extracts of planar Example 3A diluted l / 20 th ( Figure 1A; aqueous extract (Al), extract containing! PBS (A2) and extracts containing cell culture medium (A3) diluted l / 5th (figurelB) and l / 100th ( Figure 1C).
  • FIG. 2 represents microphotographs showing its growth of human stem cells treated with extract A diurned at 1/20 for 9 days (B2) and before treatment (B1). The cells are stained Giemsa.
  • FIG. 3 represents the absence of growth at the 9 th day of the human cells treated with whole planar groyne which has not been freed from the solid debris of Example 1.
  • FIG. 4 represents the growth of the human cells treated with the solubilized lyophilized extract of Example 3B.
  • Planar trees of the species Schmidtea mediterranea are maintained at 19 ° C in sterile filtered water on activated carbon / ceramic cartridge and 0.22 ⁇ m millipore filter membrane, without antibiotics. The water is changed every two to three days to eliminate waste such as planar droppings. Planarians are fed calf liver once a week. They are deprived of food 1 week before the experiments to purge them. Their average weight is 2.2mg / worm.
  • Human dental pulp stem cells are maintained under standard in vitro culture conditions in cell culture medium DMEM / F12 (GibCoBRL) supplemented with fetal calf serum (10%) and antibiotic compounds such as than penicillin and streptomycin. (5000 U / mS, 5000 ⁇ g / ml respectively), at a temperature of 37 ° C under a 5% CO 2 atmosphere. The cells are resolved once a week, after trypsinization (0.05%) to detach the adherent cells, by a 1/3 dilution in DMEM / F12 culture medium (GibCoBRL) supplemented with fetal calf serum (10).
  • DMEM / F12 GibCoBRL
  • fetal calf serum fetal calf serum
  • PBS buffer Phosphate Buffer Salts, IX
  • the planaires are ground with a plastic pestle, and then the extract is passed 10 times (round trip) through a syringe 23G, to break the cells, the debris mill being between 5 and 10 pm. lb) The extract is then centrifuged at 200 g for 5 minutes, at a temperature of
  • the centrifuged extract then has 2 phases, a dense phase at the bottom of the tube and a supernatant aqueous phase.
  • the supernatant aqueous phase is then removed (around 500 ⁇ 1) and stored frozen at -80 ° C, or frozen in liquid nitrogen (-196 ° C), as an de ⁇ aliquot before use.
  • An aqueous extract of planar broth centrifugation supernatant containing frozen culture medium is prepared according to Protocol A above, is placed in a 2 ml glass vial for lyophilization with cap placed at a temperature of -20 ° C. C overnight before lyophilization.
  • the freeze-drying is carried out in a COSMOS lyophilizer of the company CRYOTEC (France) for one night.
  • the lyophilisate is then stored at + 4 ° C in the dark until use. Before use, the lyophilisate is resuspended in 500 ⁇ l of sterile distilled water.
  • Example 3A Incubation of human stem cells with the aqueous extract obtained according to protocol A.
  • Supernatants for centrifugation of the planar broyast of the S. mediterranea species obtained in step 1b) of Example 1 are added to different final dilutions of 1/5, 1/8 and 1/100 th to stem cells.
  • the cells are then maintained under the following conditions: 37 ° C, 5% CO 2 atmosphere for 9 days. After 9 days the cells are listed and the growth determined.
  • FIGS. 1A to 1C show the growth of the human stem cells treated with extracts A1 to A3 diluted 1: 5 (FIG. 1A), the extract A3 (with culture medium) at 1: 20 (FIG. 1B), and the extract A3 (with culture medium) to 1 / 100th ( Figure 1C), for 9 days. (* P ⁇ 0.05). On the ordinate, the relative multiplication ratio of the cells with respect to a control without a groundnut extract was quantified.
  • FIG. 2 shows the growth of human stem cells treated with extract A containing culture medium (A3) diluted 1/20 for 9 days (A2) and control before treatment (Al). The cells are stained Giemsa.
  • a maximal increase is observed with more than 40% increase in the number of cells in the presence of aqueous extracts with water alone (Al) and containing PBS (A2) diluted to 1 / 20th compared to control culture without extract according to the invention.
  • Example 3B Incubation of human stem cells with lyophilized planar extract (according to Sequence B):
  • the lyophilizate (B) is resuspended in 500 ⁇ l of water and then added to a final dilution of 1/20 to human dental stem cells at a rate of 5 ⁇ 10 3 cells / well, 48-well plate, cultured in culture.
  • DMEM / F12 medium GibCoBRL
  • penicillin and streptomycin 5000U / ml, 5000Mg / ml respectively
  • the cells are then maintained under the following conditions: 37 ° C, 5% CO 2 atmosphere for 9 days.
  • FIG. 4 the growth of human stem cells treated with extract B diluted 1/20 for 9 days is shown. (* P ⁇ 0.05) On the ordinate, the relative multiplication ratio of the cells was quantified with respect to a control without a groundnut extract
  • Example 4 maldi-tof type mass spectrum of the planar extract.
  • mass spectrometry is a physical analysis technique for detecting and identifying molecules of interest by measuring their mass. Its principle lies in the gas phase separation of charged molecules (ions) according to their mass / charge ratio (m / z). The applications of mass spectrometry are very large and mainly concern the identification of peptides or proteins, the analysis of their amino acid sequence or the demonstration of post-translational modifications.
  • Mass spectrometry under its MALDI-TOF variant has become essential in recent years in biology laboratories. Indeed, its assets are numerous: (1) speed of identification (in minutes); (2) precision of identification (without the need to know the type of microorganism sought); and (3) low cost per sample (less than 50 cents per sample),
  • Example 3A An aqueous extract sample to water alone Al diluted to l / 20th of Example 3A was loaded onto a HCCA matrix, the trichioracITA acid, water, and acetonitrile. The analysis is performed on a Maldi-Tof Microflex LT10 mass spectrometer. The results are collected with MALDI Biotyper RTC software. One pL of supernatant is deposited on the target plate of the spectrometer and then dried for 10 minutes. One ⁇ of saturated HCCA matrix solution is added over, dried for 10 minutes, and then a mass spectrum of the protein extract is made on a Microflex TM LT (Bruker).
  • the spectral acquisition method includes the following steps and features:
  • IS1 electrode 20.00 kV
  • IS2 electrode 18.05 kV
  • Focusing electrode 6 kV
  • Laser frequency 60Hz
  • Detector gain 8.8 X
  • Post-ion-extraction 120 ns
  • Mass range from 700 to 20000 Da.
  • the spectra are obtained via an automatic method controlled by the software FLEXCONTROL® of the manufacturer BRUKER DALTONICS® the parameters are the following for each spot:
  • the acquisition of the spectra is ultimately carried out via the BIOTYPER® software of the manufacturer BRUKER DALTONICS® which makes it possible to apply the automatic method described above to a series of samples taking into account the criteria mentioned above and a quality score. or validation score which represent the addition of 2 notes ni + n2 (and being a function of the number of peaks and n2 function of the signal / background noise ratio):

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Abstract

La présente invention concerne un extrait aqueux utile notamment pour la régénération de cellules humaines ou animales, notamment de mammifères, comprenant un extrait aqueux débarrassé de tout débris solide non soluble d'un broyât d'organismes planaires présentant une capacité de régénération, contenant au moins les composants intracellulaires des cellules desdits organismes d'un lysat cellulaire des dites cellules des dits organismes.

Description

Extrait aqueux d'un broyât de planaires.
La présente invention concerne une préparation à base d'extrait d'organismes plathelminthe utile notamment pour la régénération de cellules humaines ou animales mammifères.
Le terme de « planaire » est utilisé pour désigner un certain nombre de vers plats de l'embranchement des Plathelminthes. Il désigne principalement les Turbeilaridés non- exclusivement parasitaires d'eau douce, soit les Paludicola, mais est aussi utilisé pour les Turbeliaridés marins, voîre pour tous les vers plats. Les Plathelminthes sont des vers plats dont de nombreuses espèces sont des parasites. Cet embranchement regroupe principalement des vers qui sont des animaux allongés sans appendice. Les vers les plus connus de la classe des Turbellaria (vers plats non exclusivement parasites) sont les planaires, vers dont l'épaisseur du corps peut mesurer moins d'un millimètre. Les planaires sont des donc vers plats aquatiques appartenant à plusieurs espèces dans la classe des Turbeilaridés. Les planaires peuvent être nageuses ou rampantes, et vivre en mer ou en eau douce, ou encore dans les sols très humides (en forêt tropicale).
Les planaires sont des organismes capables de se régénérer perpétuellement, et n'importe quelle partie de son corps, du fait de la présence d'une grande quantité de cellules souches (20-30%) dans ses tissus comparés aux autres organismes vivants pour lesquels la quantité de cellules souches est de l'ordre de lppm. Les cellules souches de planaire se multiplient et se régénèrent continuellement, à la différence des cellules souches des organismes plus évolués, lesquelles ne se multiplient pas ou peu. Les facteurs biochimiques permettant la multiplication des cellules souche chez une planaire reste non-identifiés.
De par sa capacité de régénération, si une partie d'une planaire est séparée du reste de son corps, l'animal recrée dans son intégralité l'autre partie manquante. Ce phénomène de « fission transversale », également mis en jeu lors de la reproduction asexuée, existe chez d'autres animaux, métazoaires notamment, mais rares sont ceux qui peuvent rivaiiser avec les planaires dans ce domaine.
Dans l'article de Bocchinfuso et al. Dans Molecular & Cellular Proteomics vol 11 N°9, septembre 2012, pages 681 à 691, on décrit un extrait protéique non aqueux obtenu par lyse chimique de sécrétions muqueuses de vers Schmidtea medtterranea, Dans cet article, on envisage uniquement le traitement d'infection et de mucosopathîe telle que l'asthme et des maladies pulmonaires ou fibroses cystiques.
Dans l'article de Changxin Ma et al dans Journal of Genetics and Genomics vol 37 N°ll de novembre 2010, pages 713-723, on décrit là encore un extrait protéique non aqueux de l'espèce de planaire Dugesia japonica. Ces extraits organiques sont préparés aux seules fins d'étude protéomïque et identification d'un gène impliqué dans la régénération de nerf optique.
Dans WO 99/33479, on décrit i'utiîisation à des fins thérapeutiques pour le traitement des maladies auto-immunes de préparations à base de cercaires, des parasites pathogènes colonisant naturellement les humains et ne présentent pas la propriété de se régénérer, les préparations étant obtenues en récupérant les œufs de parasites à partir de foie de hamster auquel on a injecté lesdits organismes cercaires.
Dans l'article de Hydrobiologia vol 305 N°l-3 de juin 1995, pages 247-253, on décrit un extrait de Dugesia japonica obtenu en on récupérant uniquement les têtes des organismes Dugesia japonica concerné soumises à des traitements chimique et de sonication puis de dialyse pour récupérer des extraits moléculaires de taille de molécules inférieure à 10.000. Au final, on ne récupère que des protéines précipitées. D'autre part, des essais de croissance cellulaire ont été réalisés sur des cellules Neuro 2a et PC-12. Les résultats rapportés concluent au fait que ces extraits protéiques inhibent la croissance des cellules nerveuses voire également inhibent !a régénération des têtes desdits organismes planaires décapités alors qu'en l'absence de traitement par ces extraits planaires ASP une régénérescence est observée. On a découvert, selon !a présente invention, qu'un extrait aqueux de vers plats de planaire, non parasitaires et non pathogènes chez l'homme ou l'animal, notamment de l'espèce Schmidtea mediterranea, est capable d'activer la multiplication de cellules souches humaines, lequel extrait planaire du fait de cette activité de régénération cellulaire peut donc être utile dans de nombreuses applications cosmétique ou médicale, notamment dermatologique, ou encore alimentaire.
On entend ici par « non parasitaires et non pathogènes chez l'homme ou l'animal », que lesdits organismes ne colonisent pas les humains ou animaux mammifères que ce soît par ingestion ou à travers la peau, de façon active ou passive, en altérant de façon pathologique les cellules ou tissus humains ou animaux mammifères.
Plus précisément, la présente invention fournit un extrait aqueux utile notamment pour la régénération de cellules humaines ou animales mammifères, comprenant un extrait aqueux débarrassé de tout débris solide non soluble de broyât d'organismes du type plathelminthe présentant une capacité de régénération, lesdits organismes étant des vers plats aquatiques du type planaire non parasitaires et non pathogènes chez i'homme ou l'animal mammifère, le dit extrait aqueux contenant au moins les composants intracellulaires des cellules desdits organismes d'un lysat cellulaire des dites cellules des dits organismes entiers.
On entend ici par « (ysat cellulaire » que les cellules desdits organismes sont cassées mécaniquement de sorte que les composants intracellulaires sont libérés dans ledit extrait lors du broyage du dit organisme. Et, ledit extrait aqueux de broyât est un extrait aqueux des dits organismes broyés débarrassés de tout débris solide non soluble, c'est-à-dire qu'on ne retient donc en quelque sorte que le « jus de planaires » résultant du broyage mécanique contenant seulement les composants intracellulaires des cellules desdits organismes d'un lysat cellulaire desdites cellules desdits organismes, mais tous les composants et pas seulement les peptides et protéines.
Plus particulièrement, lesdits vers plats aquatiques du type planaire non parasitaires et non pathogènes chez l'homme comprennent Schmidtea mediterranea, Dugesia japonica, Dendricoelum lacteum, Polycelis nigra, Polycelys tenu/s ou Planaria torva.
Plus particulièrement encore, ledit extrait aqueux de broyât comprend un surnageant de centrîfugation dudit broyât.
Plus particulièrement encore, ledit extrait aqueux de broyât comprend en outre un milieu de culture cellulaire, de préférence un milieu de culture apte à cultiver des cellules humaines ou animales à régénérer.
Plus particulièrement encore, le dit extrait aqueux de broyât comprend le broyât de 50 à 200 mg de vers /mL de solution aqueuse, notamment pour des vers de 1 à 5 mg, ledit extrait aqueux de broyât étant en outre dilué de préférence à plus que l/5ième et moins que 1/lOOième, de préférence dilué au l/10ième à l/50ieme ; notamment au l/2Ûieme, de préférence encore dilué dans du dit milieu de culture des dites cellules.
En particulier, pour des vers de 2.2 mg en moyenne, le dit extrait aqueux de broyât comprend le broyât de 88 à 110 mg de vers /mL de solution aqueuse, soit de 40 à 50 vers/mL, ledit extrait aqueux de broyât étant en outre dilué au l/20ième. Plus particulièrement encore, un spectre de dît extrait aqueux de broyât par spectrométrie de masse dite de type MALDI TOF comprend les 16 pics caractéristiques majoritaires (c'est à dire de plus grandes intensités( valeur S/N maximales) mentionnés dans le tableau 1 suivant, dans lequel les différents pics caractéristiques sont numérotés dans la première colonne, et les paramètres suivants ont Ses significations suivantes :
- M/z : rapports (masse en Dalton/charge) en abscisse des différents pics caractéristiques du spectre,
- S/N : rapports (intensité du pic/intensité du bruit de fond) des différents pics caractéristiques du spectre, Tableau 1
La présente invention fournit également un lyophilisât d'un extrait aqueux de broyât selon l'invention. La présente invention fournit également un procédé de réalisation d'un extrait aqueux de broyât selon l'invention caractérisé qu'on réalise les étapes dans lesquelles : a) lesdits organismes vivants, de préférence qui ont été lavés à l'eau et n'ont pas été nourris pendant une semaine au moins, sont placés dans un milieu liquide aqueux contenant de préférence un milieu de culture cellulaire ; b) la préparation aqueuse obtenue à l'étape a) est broyée, notamment par broyage mécanique, jusqu'à obtenir la lyse des cellules des dits organismes, de préférence les débris de broyât étant de taille entre 5 et 10 pm (soit des débris de taille inférieure à la taille de cellules du dit organismes) ; c) on élimine les débris non solubles par centrifugation ; et on récupère le surnageant, d) de préférence, le surnageant de centrifugation est dilué dans une solution aqueuse à plus que 1/5 ième et moins que l/100ième, de préférence dilué entre 1/lQième et l/50ième , ladite solution comprenant de préférence encore des composants d'un milieu de culture cellulaire apte à cultiver des cellules humaines ou animales à régénérer .
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait aqueux de broyât ou lyophilisât selon l'invention pour la fabrication d'une composition utile pour régénérer des cellules humaines ou animales mammifères, notamment des cellules souches ou différentiées. On cite en particulier les cellules différentiées des types suivants : épithéliale, fibroblaste, kératinocyte, endothéliale, neuronale ou nerveuse.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait aqueux de broyât ou lyophilisât selon l'invention pour la fabrication d'une composition utile pour régénérer des cellules souches humaines ou animales mammifères, par exemple une composition utile pour régénérer des cellules souches humaines dentaires,
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait aqueux de broyât ou lyophilisât selon l'invention pour la fabrication d'une composition cosmétique ou dermatologique en combinaison avec des supports et/ou excipients appropriés, notamment une composition cosmétique ou dermatologique antivieillissement formulée pour une appiication topique sous forme de gel, lotion (notamment une solution aqueuse ou sérum), crème, pommade, savon et pâte (notamment pour masque).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait aqueux de broyât ou lyophilisât selon l'invention pour la fabrication d'une composition alimentaire. Plus particulièrement encore, un produit cosmétique antivieillissement selon l'invention est formulé pour une application topique sous forme de gel, lotion, crème, pommade, savon ou pâte.
Les compositions topiques selon l'invention peuvent comprendre divers excipients usuels adaptés à une administration topique externe, en particulier des excipients acceptables sur le plan dermatologique et cosmétologique. Ces excipients appropriés pour la formulation sont bien connus de l'homme du métier et comprennent par exemple des agents favorisant la pénétration, des agents hydratants, des agents épaississants, des agents émollients et des agents tensioactifs, des agents émulsifïants ; des agents conservateurs.
Ces formes d'administration par voie topique sont préparées par les techniques connues, et par exemple, dans le cas d'une crème, par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse pour obtenir une émulsion huile dans eau, ou inversement pour préparer une émulsion eau dans huile.
Dans un mode particulier de réalisation, le produit cosmétique selon l'invention est formulé sous forme de crème comprenant, ledit extrait aqueux et au moins les excipients suivants additionnels : agent émulsifiant, agent émollient, agent épaississant, agent hydratant et agents conservateur et agent ajusteur de Ph.
Dans un mode particulier de réalisation, le produit cosmétique selon l'invention est formulé sous forme de solution aqueuse (notamment sérum d'eau physiologique) ou de gel aqueux comprenant, en mélange homogène dans de l'eau, ledit extrait aqueux et pour le gel au moins les excipients suivants additionnels de ge! : agent gélifiant, agent épaississant, agent hydratant et agent conservateur et agent ajusteur de Ph.
Les préparations contiennent généralement d'autres excipients et/ou auxiliaires et parfois d'autres principes actifs, par exemple des colorants, pigments de coloration, capteurs de radicaux, parfums, agents stabilisants.
Les produits cosmétiques peuvent aussi comprendre des auxiliaires et parfois d'autres principes actifs, par exemple vitamines antioxydantes teiles que la vitamine E, la vitamine C, des agents antioxydants comme les polyphénols naturels, des enzymes, principes actifs végétaux, substances anti-inflammatoires naturelles, des alcools, polyols, esters, électrolytes, huiles polaires et non polaires, des polymères, copolymères, phopholipides, des colorants; des parfums; ou encore des agents de gommage de la peau.
L'invention a encore pour objet un procédé cosmétique de traitement 'de là peau pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, et en particulier les rides d'expression provoquées par les contractions musculaires faciales incontrôlées, consistant à appliquer sur les zones de la peau nécessitant un tel traitement, un produit cosmétique topique selon l'invention.
La présente invention a donc pour objet une composition cosmétique à effet antivieillissement sur Sa peau comprenant un extrait aqueux ou lyophilisé selon l'invention et des excipients appropriés pour une application topique cutanée sous forme de gel, lotion, crème, pommade ou savon.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description des exemples qui vont suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux figures suivantes.
- Les figures 1A à et 1C représentent la croissance au 9terTie jour des cellules souches dentaires humaines traitées par des extraits de planaires de l'exemple 3A dilués au l/20!eme (figure 1A ; extrait aqueux (Al), extrait contenant du PBS (A2) et extraits contenant du milieu de culture des cellules (A3) dilués au l/5ième ( figurelB) et au l/100ième (figure 1C).
- La figure 2 représente des microphotographies montrant Sa croissance des cellules souches humaine traité par de l'extrait A diîué au 1/20 pendant 9 jours (B2) et avant traitement (Bl). Les cellules sont colorées en Giemsa.
- La figure 3 représente l'absence de croissance au 9ieme jour des cellules humaines traitées par du broyât de planaire entier non débarrassé des débris solides de l'exemple 1.
- La figure 4 représente la croissance des cellules humaines traitées par de l'extrait lyophilisé solubilisé de l'exemple 3B.
1-Méthodes
1.1 PSanaires: Des planaires de l'espèce Schmidtea mediterranea sont maintenues à 19°C dans de l'eau stérile filtrée sur cartouche charbon actif/céramique et sur membrane filtrante 0.22 pm millipore, sans antibiotiques. L'eau est changée tous les deux à trois jours afin d'éliminer les déchets tels que les déjections de planaires. Les planaires sont nourries avec du foie de veaux, une fois par semaine. Ils sont privés de nourriture 1 semaine avant les expériences pour les purger. Leur poids moyen est 2.2mg/ver.
1.2 Cellules souches :
Des cellules souches de pulpe dentaire humaine (CLS 300702) sont maintenues selon les conditions standards de culture in vitro dans du milieu de culture cellulaire DMEM/F12 (de GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux foetal (10%) et des composés antibiotiques tel que pénicilline et streptomycine. (5000U/mS, 5000pg/ml respectivement), à une température de 37°C sous une atmosphère à 5% de C02. Les cellules sont dédoublées une fois par semaine, après trypsinisation (0,05%) pour décoller les cellules adhérentes, par une dilution au 1/3 dans du milieu de culture DMEM/F12 (GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux fœtal (10%) et un cocktail d'antibiotiques (Peni iiline-Streptomicine, Gentamicine, Vancomycine, Ciprofloxacine) (5000 U/mi, 5000pg/ml, 50pg/ml, lOpg/ml, 20pg/ml respectivement), après traitement à la trypsine 0.05 %, (GibCoBRL).
Exemple 1 : Préparation de l'extrait de planaire (protocole A): la) Les planaires (25 individus) sont prélevées et lavées deux fois avec du tampon PBS (Phosphate Buffer Salts, IX) à PH=7.2, à la température de la pièce, puis mises dans 550 pl d'eau (extrait Al) ou de PBS (extrait A2) ou de milieu de culture D E /F12 (GibCoBRL) (extrait A3), à une concentration de HOmg de planaires/mL soit 50 planaires/mL, à 4°C.
Les planaires sont broyées avec un pilon plastique, puis l'extrait est passé 10 fois (aller-retour) au travers d'une seringue 23G, afin de casser les cellules, les débris de broyât étant de taille entre 5 et 10 pm. lb) L'extrait est alors centrifugé à 200g pendant 5 minutes, sous une température de
4° C.
L'extrait centrifugé présente alors avec 2 phases, une phase dense au fond du tube et une phase aqueuse surnageant. La phase aqueuse surnageant est alors prélevée (environs 500μ1) et stockée congelée à une température de -80°C, ou congelée dans l'azote liquide (-196°C), sous forme d'aliquote de ΙΟΟμΙ avant utilisation.
Exemple 2. Préparation de l'extrait de planaire lyophilisé (protocole B):
Un extrait aqueux de surnageant de centrifugation de broyât de planaires contenant du milieu de culture, congelé sont préparés selon le protocole A ci-dessus, est mis dans une fiole en verre pour lyophilisation de 2 ml avec bouchon placé à une température de -20°C pendant une nuit avant lyophilisation. La lyophilisation est réalisée dans un lyophilisateur COSMOS de la société CRYOTEC (France) pendant une la nuit. Le lyophilisât est ensuite entreposé à +4°C à l'obscurité jusqu'à utilisation. Avant utilisation le lyophilisât est remis en suspension dans 500 μΐ d'eau distillé stérile.
2. Résultats de régénération de cellules.
Exemple 3A : Incubation des cellules souche humaines avec l'extrait aqueux obtenu selon le protocole A.
Des surnageants de centrifugation de broyât de planaire de l'espèce S. méditerranea obtenus à l'étape 1b) de l'exemple 1 sont ajoutés à différentes dilutions finales de l/5ième, l/20ième et 1/100 ième à des cellules souche dentaire humaine à raison de 5xl03 cellules / puits, de plaque de 48 puits, en culture dans du milieu D EM/F12 (GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/mi, 50Q0pg/m! respectivement), sous 37°C, et atmosphère 5% C02. Les cellules sont alors maintenues sous les conditions suivantes : 37°C, atmosphère 5% C02 pendant 9 jours. Après 9 jours les cellules sont énumérées et la croissance déterminée.
Sur les figures 1A à 1C on montre la croissance des cellules souches humaines traitées par des extraits Al à A3 dilués au l/5ième (figure 1A), l'extrait A3 (avec milieu de culture) au l/20ième (figure 1B), et l'extrait A3 (avec milieu de culture) au l/100ième (figure 1C), pendant 9 jours. (*P<0.05). En ordonnée, on a quantifié le ratio de multiplication relative des cellules par rapport à un contrôle sans extrait de broyât.
Sur la figure 2: on montre la croissance des cellules souches humaine traité par de l'extrait A contenant du milieu de culture (A3) dilué au 1/20 pendant 9 jours (A2) et contrôle avant traitement (Al). Les cellules sont colorées en Giemsa.
Il est observé une augmentation maximale avec plus de 50% d'augmentation du nombre de cellules en présence de l'extrait A3 contenant du milieu de culture dilué au l/20ième par rapport au contrôle culture sans extrait selon l'invention tandis que pour les dilutions de l/5l me et l/100ieme la croissance est inférieure ou égale au contrôle.
Il est observé une augmentation maximale avec plus de 40% d'augmentation du nombre de cellules en présence des extraits aqueux à l'eau seule (Al) et contenant du PBS ( A2) dilués au l/20ième par rapport au contrôle culture sans extrait selon l'invention.
En revanche, sur la figure 3 on montre l'absence de croissance au 9leme jour des cellules humaines traitées par du broyât de planaire entier non centrifugé, c'est-à-dire non débarrassé des débris solides obtenu à l'exemple la). Exemple 3B: Incubation des cellules souches humaines avec l'extrait de planaire lyophilisé (selon Se protocole B):
Le lyophilisât (B) est remis en suspension dans 500 μΙ d'eau, puis ajouté a une dilution finale de 1/20 à des cellules souche dentaire humaine à raison de 5x103 cellules / puits, de plaque de 48 puits, en culture dans du milieu DMEM/F12 (GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/ml, 5000Mg/ml respectivement), sous 37°C, et atmosphère 5% C02. Les cellules sont alors maintenues sous les conditions suivantes : 37°C, atmosphère 5% C02 pendant 9 jours.
Apres 9 jours les cellules sont énumérées et la croissance déterminée. Après 9 jours, il est observé une augmentation du nombre de cellule en présence de l'extrait B d'environ 27.7% comme montré sur la figure 4.
Sur la figure 4, on montre la croissance des cellules souches humaines traitées par de l'extrait B dilué au 1/20 pendant 9 jours. (*P<0.05) En ordonnée, on a quantifié le ratio de multiplication relative des cellules par rapport à un contrôle sans extrait de broyât
Exemple 4 : spectre de masse de type maldi-tof de l'extrait planaire. De façon connue, la spectrometrie de masse est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur masse. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Les applications de la spectrométrie de masse sont très vastes et concernent principalement l'identification de peptides ou de protéines, l'analyse de ieur séquence en acides aminés ou encore la mise en évidence de modifications post-traductionnelles.
La spectrométrie de masse sous sa variante MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight) s'est imposée ces dernières années dans les laboratoires de biologie. En effet, ses atouts sont nombreux : (1) rapidité de l'identification (en quelques minutes) ; (2) précision de l'identification (sans nécessité préalable de connaître le type de microorganisme recherché) ; et (3) faible coût par échantillon (moins de 50 centimes d'euros par échantillon),
Parmi les fabricants de spectromètre de masse, deux systèmes MALDI-TOF complets sont disponibles à la vente, commercialisés par la société Bruker Daltonics (Allemagne).
1. Un échantillon d'extrait aqueux à l'eau seule Al dilué au l/20ieme de l'exemple 3A a été déposé sur une matrice HCCA, de l'acide trichioracétique, eau, et acétonitrile. L'analyse est effectuée sur un spectromètre de masse Maldi-Tof Microflex LT10. Les résultats sont collectés avec le logiciel MALDI Biotyper RTC. Un pL de u surnageant est déposé sur la plaque cible du spectromètre puis séché 10 minutes. Un μΙ de solution de matrice HCCA saturée est ajouté par-dessus, séché 10 minutes, puis un spectre de masse de l'extrait protéique est réalisé sur un Microflex™ LT (Bruker).
2. La méthode d'acquisition des spectres comprend les étapes et caractéristiques suivantes :
- introduire la plaque (cible Microflex modèle de référence 224989 dénommé MSP 96) contenant les dépôts dans le spectromètre de masse Microflex LT,
- démarrer l'ordinateur associé au spectromètre pour lancer Ses analyses, et
- lancer l'acquisition des spectres de masse MALDI-TOF. Les paramètres appliqués au spectromètre de masse sont les suivants :
- mode linéaire positif, Electrode IS1 : 20,00 kV, Electrode IS2 : 18,05 kV, Electrode de focalisation : 6 kV, Fréquence du laser : 60Hz, Gain du détecteur : 8,8 X, Post-ion- extraction (PIE) : 120 ns, Gamme de masse : de 700 à 20000 Da. Les spectres sont obtenus via une méthode automatique contrôlée par le logiciel FLEXCONTROL® du fabricant BRUKER DALTONICS® les paramètres sont les suivants pour chaque spot :
- nombres séries de 40 tirs: 6 sur des positions différentes du spot (6x40=240 spectres),
- afin que les tirs aient balayé l'ensemble de l'échantillon de façon homogène l'acquisition se fait sur 6 positions différentes selon une géométrie hexagonale,
- pré-tirs : 10 tirs à 40% de ia puissance maximum laser servent à dessaler l'échantillon (contamination par les sels minéraux), - puissance laser : 30 % à 45 % régulée via le logiciel FLEXCONTROL®,
- sélection du spectre : sur une gamme de masse de 2000 à 20 000 Da.
L'acquisition des spectres est au final réalisée via le logiciel BIOTYPER® du fabricant BRUKER DALTONICS® qui permet d'appliquer la méthode automatique décrite ci-dessus à une série d'échantillons en prenant en compte les critères mentionnés précédemment et un score de qualité ou score de validation qui représentent l'addition de 2 notes ni + n2 (ni étant fonction du nombre de pics et n2 fonction du rapport signal/bruit de fond) :
- ni est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques du spectre n, avec : ni = 0 pour n < 8, ni = 1 pour 8 < n < 27, ni = 2 pour 27 < n < 43, ni = 3 pour 43 < n < 78, ni = 4 pour 78 < n < 86, ni = 5 pour 86 < n < 110, ni = 6 pour 110 < n, et - n2 est la note attribuée en fonction de la valeur du rapport signal/bruit (Rmax) du pic de plus grande intensité du spectre, avec n2 = 0 pour Rmax < 6,8, n2 = 1 pour 6,8 < Rmax < 26,8, n2 = 2 pour 26,8 < Rmax < 52,6, n2 = 3 pour 52,6 < Rmax < 208,6, n2 = 4 pour 208,2 < Rmax < 398,6, n2 = 5 pour 398,6 < Rmax < 1 092,2, n2 = 6 pour 1 092,2 < Rmax. Un spectre est pris en compte si son score de validation (nl+n2) est supérieur à 2.
On obtient le spectre complet du tableau 2 suivant dont les pics les plus importants sont donnés au tableau 1 ci-avant. Dans le tableau 2, ies valeurs données sont des valeurs moyennes sur 3 extraits et 3 mesures par extrait. « SD » est L'écart type (« standard déviation » en anglais).
Tableau 2
7183,03 ^ 47 10858543,09 6841857,42 3292,91 67,60 8023804,80 4939263,05
7166,12 461,61 6005883,09 4377180,05 3287,64 64,69 21028204,39 18579686,40
7141,72 462,27 8454369,88 12773497,18 3281,38 60,64 39552460,76 10292440,16
462,44 15980137,91 13198728,24 3270,41 61,20 27608241,56 25175542,96
7117,16 460,20 1943880,50 1297607,73 3266,57 59,35 32971928,57 33706720,32
7098,11 474,95 28478914,80 34393160,51 3254,19 57,99 34350370,49 22244064,03
7089,16 479,62 40768433,01 42971633,85 3247,96 54,01 4762134,58 326311,48
7068,69 472,09 3149404,57 1069351,59 3241,32 52,81 32161482,27 11525336,81
7057,38 475,83 4015369,66 840859,73 3233,71 54,58 17714314,79 16497325,56
7049,75 475,55 3557870,44 341332,63 3226,47 61,79 12597550,05 10527254,42
7046,15 475,01 3404514,08 572811,01 3220,27 61,87 23157503,92 22260709,69
7029,85 469,40 16173381,98 27409009,49 3211,59 60,41 13984204,26 11618435,63
7019,69 465,68 29617067,96 31933238,72 3204,70 59,28 25670846,92 16627993,03
6999,99 447,67 10403410,49 4241581,40 3200,53 58,57 20927873,65 21034473,80
6994,31 450,26 12077581,56 3743384,83 3194,07 54,09 31205066,12 20661811,88
6971,95 439,31 19264755,03 20608829,34 3188,63 49,63 32337486,19 25789203,35
6958,98 433,46 7134836,63 5304127,76 3174,78 59,59 18909334,60 13050314,39
6948,13 440,32 9541839,49 15202317,68 3167,91 57,35 29177573,97 j 14227675,90
6927,62 429,41 19426439,15 15239899,38 3161^ 58,43 21266164,12 22024188,90
6905,24 428,66 8416940,87 2205389,06 3158,11 55,76 3118499,37 986032,68
6896,02 426,82 5501032,42 1797378,54 3153,84 58,89 10676838,04 ^9693794^23]
6873,20 404,03 5662071,47 988813,38 3146,48 tJ50 8. 10925248,09 11451894,61
6862,21 407,24 5647756,06 486820,14 3142,74 60,26 17515360,23 9749913,47
6849,90 398,50 4232957,36 2380406,49 3137,51 63,50 19040043,26 8184719,68
6843,00 j 401,23 2871706,78 8206,17 3 3 / 34 69,72 36645311,93 30081428,92
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4340,051 80,17 10485992,55 8832780,02 1700,78 43,54 28016393,48 14108489,57 4335,06 79,30 14438570,33 10175943,67 1691,13 36,63 35108988,32 35671765,16
4326,04 76,61 40250972,75 19662581,27 1684,97 33,17 32720714,56 29517546,61
4315,14 72,10 33715945,96 3980366,15 1681,39 31,64 40372346,30 37580574,64
4298,40 74,40 15668005,20 15471228,20 1677,66 31,03 10083221,90 9842889,10
4289,65 74,24 8610064,57 5271904,89 1674,82 32,41 14077675,84 3264717,85
4280,78 79,99 29282616,75 17913297,45 1670,18 29,22 38364245,24 28421815,74
4266,41 73,95 23544094,70 16612720,28 1661,53 25,56 35186159,98 12526902,94
4257,35 73,57 29823758,86 21326317,62 1657,27 22,51 21962778,79 22758040,35
4247,19 75,13 26445601,36 22554207,34 1646,81 20,91 39561118,20 9611280,36
4239,75 73,05 46558890,10 24606139,74 1639,69 17,75 70362502,17 19800253,72
4228,99 81,27 30750371,83 33572037,23 1623,91 23,94 71989697,44 77097377,73
4216,43 68,69 20839097,87 23402073,32 1616,75 28,13 18078945,11 6801902,60
4209,16 64,38 39509777,67 7701342,16 1613,73 28,51 12601310,15 11732186,68
41.93 32f 66,02 21453874,22 15504858,45 1608,26 29,70 22665641,25 7346444,49
4187,78 62,93 10221980,88 7242193,29 1603,34 28,69 30073688,45 5063255,00
4180,66 64,92 22215591,07 19471886,67 1600,06 28,50 19817910,18 16742721,02
4171,79 58,00 18221938,19 13521735,12 1594,77 25,19 29767782,34 12651483,21
4161,37 59,73 30059237,97 10207324,43 1 1591,46 26,19 25160053,37 14053755,90
4152,96 59,60 7764954,52 9278003,06 1587,81 23,15 32740069,22 7752483,37
4148,18 60,38 14096581,90 8740782,19 1577,50 27,34 44155964,40 22113236,10
4141,87 61,11 19969477,54 17033711,27 1574,17 29,27 2618412,92 2739445,25
4138,49 62,69 33808733,57 8197165,45 1572,48 29,96 8283974,26 435382,92
4125,52 57,49 14230924,48 11146310,35 1567,70 30,87 35268646,70 27272113,56
4117,36 53,64 2510469,06 1338616,50 1563,74 32,74 57311974,32 16437414,62
4110,47 47,29 29363728,48 28985033,06 1554,30 25,87 38180847,23 9009048,90
4095,25 41,10 17924303,60 16359894,32 1544,06 26,58 40809046,72 10263841,48
4089,58 39,38 31900280,25 2189534,16 1539,87 26,59 31718484,43 17607978,22
4076,74 42,75 27372504,36 16862469,84 1535,18 28,11 46717446,35 33662799,97
4070,79 40,55 22315462,87 23339463,51 1529,10 31,37 15159581,47 22717428,35
4061,63 45,74 6871552,62 1628836,56 1527,41 31,23 44339825,44 5458202,03
4059,72 45,45 8231697,72 561907,51 1518,83 32,72 23140434,72 11530542,73
4051,95 45,87 16775790,26 14682853,10 1513,63 34,93 22581528,40 19821543,03
4043,49 42,30 18316937,80 6741009,85 1510,00 36,67 13460381,12 3185724,52
4036,73 43,09 8888168,60 10919111,80 1507,90 36,01 22338977,67 14662503,91
4031,86 41,98 14706107,89 12156976,32 1504,83 38,62 37857106,76 7398153,07
4019,71 43,17 30001635,10 18160662,06 1498,30 34,99 23455026,94 14999137,06
4011,99 38,67 12380634,05 5890032,36 1471,78 10,77 154656464,21 139271192,43
4004,09 39,69 18799524,41 21337495,93 1458,56 0,93 90080868,28 40953029,86
3996,81 43,38 37417358,56 14956624,57 1448,81 0,79 40436778,17 10521402,98
3977,66 29,53 33685146,18 25920132,08 1446,08 1,39 5336848,90 4681017,31
3971,37 25,42 12181406,39 6032114,93 1442,99 3,38 29626710,32 31254997,18
3965,97 26,86 11790909,60 7959273,44 1436,03 5,97 72212769,22 12704723,32
3961,78 23,70 11675027,43 6899033,74 1425,05 11,07 48305773,28 25252135,06
3955,38 21,64 9503238,05 2548075,31 1420,39 10,81 44522025,94 45324620,71
3944,59 17,11 40925363,15 8707644,10 1414,14 10,10 38770175,08 58152491,82
3932,58 18,91 25949184,21 11860229,70 1407,93 4,65 77562603,59 55895325,59 3915,27 18,11 26412628,26 17215837,21 1403,12 1,24 35073914,18 12491904,33
3905,31 16,15 15089827,13 12462343,31 1388,74 4,16 89732035,58 11915766,84
3900,10 13,98 22203847,90 12790395,82 1381,90 1,94 36924967,60 30283407,95
3889,08 9,65 18495973,81 24340959,77 1380,40 1,31 34664243,09 35268757,89
3879,43 5,07 51177131,99 9758836,59 1374,98 6,55 3189606,98 756150,71
3869,82 8,40 38583244,10 30653038,16 1369,88 10,39 32520115,84 27236740,14
3860,10 0,80 18030165,78 5567109,91 1366,68 11,29 43834473,71 30662758,00
3848,48 6,70 13855277,63 4316262,15 1358,08 7,28 59090476,39 36152386,44
3842,37 4,29 15558318,67 5493452,66 1351,25 8,21 74618701,10 37123567,08
3834,76 3,35 11577397,75 8918070,40 1344,03 3,30 26923014,64 27446679,17
3829,12 4,75 23050578,64 7734076,75 1338,35 3,56 45757983,03 3986455,48
3820,79 2,38 30841222,29 3141004,91 1333,94 5,01 39154116,34 8667291,47
3812,19 7,60 7598710,04 5937924,71 1327,25 3,25 35680822,22 3853203,88
3808,30 7,00 11293631,97 4795503,58 1323,35 2,86 37751869,64 2452787,33
3801,75 5,27 21038007,51 15286189,62 1320,95 0,49 34482975,59 1749809,66
3793,79 5,06 18961775,35 13751410,74 1316,80 1,37 10396138,14 6810361,34
3790,47 5,51 20305269,38 18159323,54 1312,93 1,86 53676390,81 25869702,20
3784,15 3,69 11322006,85 9187316,57 1306,92 6,48 47506102,23 1971607,94
3780,44 1,05 19718682,86 6171115,73 1300,99 6,45 28227492,69 9821166,98
3771,48 4,33 4604201,77 3334039,91 1299,72 6,83 31811940,40 8197514,94
3763,07 6,49 31505321,38 20870410,51 1294,91 7,21 20838316,31 11141120,38
3756,01 4,74 27786964,11 22867189,49 1289,17 6,20 42867890,50 18552533,14
3748,77 6,34 4086444,48 1576380,13 1285,04 4,27 49059615,19 14248882,44
3739,01 3,19 34198092,81 32052236,68 1282,00 2,75 41860201,65 32757873,62
3730,76 9,15 21113246,74 7579176,73 1275,82 2,67 35067732,33 31922106,43
3720,99 13,71 30012847,89 29347983,55 1273,99 2,30 47317853,29 41105587,82
3708,93 14,18 12152550,72 8097962,82 1268,37 4,66 19566412,02 16320587,04
3704,13 14,88 25989389,84 2416799,68 1259,12 8,59 109923932,10 18133902,92
3696,44 17,37 3469796,56 3549517,63 1252,95 6,76 54738932,66 60212880,81
3693,88 16,51 19459441,25 12378760,59 1247,56 1,60 14417418,59 13735264,29
3681,29 10,06 27935096,29 7974994,36 1242,22 2,95 41553114,16 28582701,00
3671,57 11,65 23609986,91 5175207,70 1239,26 2,52 57398324,08 18729637,28
3666,47 14,43 9661023,89 14192233,65 1234,34 4,59 53774436,49 34118311,02
3660,26 11,71 29084285,26 2147309,89 1228,21 0,24 83321749,38 12519601,00
3653,86 12,77 5739320,30 4707533,46 1221,31 1,67 63564527,51 31521726,74
3647,72 17,05 12419233,69 4457564,18 1216,96 3,52 60178620,27 24339697,06
3641,61 16,65 18260770,54 20542984,89 1210,51 2,35 36346810,13 7334799,47
3639,59 16,95 25774278,16 24683868,50 1208,30 1,32 36004719,04 13099228,96
3623,21 25,82 26932197,35 27155932,40 1205,31 3,28 21179465,98 9588045,22
3617,37 23,74 47999375,90 16186311,04 1200,84 6,47 61510491,41 32154185,38

Claims

REVENDICATIONS
1. Extrait aqueux utile notamment pour la régénération de cellules humaines ou animales mammifères, comprenant un extrait aqueux débarrassé de tout débris solide non soluble d'un broyât d'organismes du type plathelmînthe présentant une capacité de régénération, Îesdits organismes étant des vers plats aquatiques du type planaire non parasitaires et non pathogènes chez l'homme ou l'animal mammifère, le dit extrait aqueux contenant au moins les composants intracellulaires des cellules desdits organismes d'un lysat cellulaire des dites cellules des dits organismes entiers.
1. Extrait aqueux selon la revendication 1 caractérisé en ce que les dits organismes sont de l'espèce Schmtdtea mediterranea.
3. Extrait aqueux selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que ledit extrait aqueux de broyât comprend un surnageant de centrifugation dudit broyât.
4. Extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que ledit extrait aqueux de broyât comprend en outre un milieu de culture cellulaire, de préférence un milieu de culture apte à cultiver des cellules humaines ou animales à régénérer.
5. Extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le dît extrait aqueux de broyât comprend le broyât de 50 à 200 mg de vers par mL de solution aqueuse ; de préférence de 75 à 150 mg de vers par mL de solution aqueuse , le dit extrait aqueux de broyât étant en outre dilué de préférence à plus que l/5ième et moins que l/100ième, de préférence dilué entre l/10ième et l/50ième.
6. Extrait aqueux selon la revendication 5 caractérisé en ce que le dit extrait aqueux de broyât comprend le broyât de 110 mg de vers par mL de solution aqueuse ; le dit extrait aqueux de broyât étant en outre dilué à 1/20 ième.
7. Extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'un spectre de ladite préparation par spectrométrie de masse dite de type MALDI TOF comprend les 16 pics majoritaires caractéristiques mentionnés dans le tableau 1 suivant, dans lequel les différents pics caractéristiques sont numérotés dans la première colonne, et les paramètres suivants ont les significations suivantes :
- M/z : rapports (masse en Dalton/charge) en abscisse des différents pics caractéristiques du spectre,
- S/N : rapports (intensité du pic/intensité du bruit de fond) des différents pics caractéristiques du spectre.
Tableau 1
8. Lyophilisât d'un extrait aqueux de broyât selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Procédé de préparation d'un extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé qu'on réalise les étapes dans lesquelles : a) les dits organismes vivants, de préférence qui ont été lavés à l'eau et n'ont pas été nourris pendant une semaine au moins, sont placés dans un milieu liquide aqueux contenant de préférence un milieu de culture cellulaire ; b) la préparation aqueuse obtenue à l'étape a) est broyée jusqu'à obtenir la lyse des cellules des dits organismes, de préférence les débris de broyât étant de taille entre 5 et 10 pm, c) on élimine les débris non solubles par centrifugation ; et récupère le surnageant, et d) de préférence, le surnageant de centrifugation est dilué dans une solution aqueuse à plus que l/5ième et moins que l/10Qièrne, de préférence dilué entre l/10ième et l/50ième , ladite solution comprenant de préférence encore des composants d'un milieu de culture cellulaire apte à cultiver des cellules humaines ou animales à régénérer.
10. Utilisation d'un extrait aqueux ou lyophilisât selon l'un des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'une composition utile pour régénérer des cellules humaines ou animales mammifères.
11. Utilisation d'un extrait aqueux ou lyophilisât selon la revendication 10 pour la fabrication d'une composition utile pour régénérer des cellules souches humaines ou animales mammifères. 12, Utilisation d'un extrait aqueux ou lyophilisât selon l'un des revendications 10 ou
11 en combinaison avec des supports et/ou excipients appropriés pour la fabrication d'une composition alimentaire, cosmétique ou dermatologique.
13. Composition cosmétique à effet antivieillissement sur la peau comprenant un extrait aqueux ou iyophilisé selon l'une des revendications 1 à 8 et des excipients appropriés pour une application topique cutanée sous forme de gel, lotion, crème, pommade ou savon.
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